TW202202514A - 多聚體ＩｇＡ抗體之製造法及多重特異性多聚體ＩｇＡ抗體 - Google Patents

多聚體ＩｇＡ抗體之製造法及多重特異性多聚體ＩｇＡ抗體 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用以製造三聚體及四聚體IgA抗體之方法，其包含混合二聚體IgA抗體及單體IgA抗體。

Description

多聚體IgA抗體之製造法及多重特異性多聚體IgA抗體
本發明係關於多聚體IgA抗體，較佳是多重特異性多聚體IgA抗體之製造法、及多重特異性多聚體IgA抗體。
屬於生體內產生量最多的抗體之IgA抗體係針對流行性感冒等以黏膜組織為目標之呼吸器感染症作為生體防禦之最前線防禦因子進行作用機能。此分泌型IgA抗體(SIgA)已知形成二聚體以上的多聚體，特別是四聚體SIgA係比IgG或單體IgA具有更高的功能活性。
發明者等先前的研究中，係藉由將單株IgG抗體之可變區域序列以外的恆定區域置換成IgA之框架，而獲得保持該單株抗體之抗原辨識部位且經變換成IgA的抗體，並開發出製造使前述抗體人為地分泌型化及四聚體化而成的單株四聚體SIgA的技術(專利文獻1)。然而，以該技術製作之四聚體SIgA所具有的8個Fab區域全部含有相同的可變區域，因而僅對單一的抗原決定區(Epitope)具有反應性。
目前，正在針對抗體中存在的複數個Fab分別搭載有不同可變區域之多重特異性抗體進行實用化。關於多重特異性抗體，其不僅在抗體醫藥方面，在研究用工具及診斷藥的開發等各式各樣領域中的應用亦為備受期待的技術。然而，其製造方法複雜，為了製作1個多重特異性抗體會伴隨著巨大的勞力，因而限定了被實用化的多重特異性抗體的種類。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第6564777號
本發明係以提供簡便且高效率地製造多聚體IgA抗體(特別是多重特異性多聚體IgA抗體)的方法為目的。
本發明者等經過精心研究的結果，發現藉由在試驗管內混合分別以各自之培養細胞製作的二聚體IgA抗體、單體IgA抗體、以及分泌片(Secretory component，以下亦稱為「SC」)，而可簡便且高效率地製造雙重特異性三聚體及四聚體IgA抗體，進而完成本發明。進一步，發現即便在未混合分泌片之情形下，雖然效率相較於有混合之情形會降低，但仍同樣地可製造雙重特異性三聚體及四聚體IgA抗體。本發明之技術不僅適用雙重特異性三聚體及四聚體抗體，亦適用於單一特異性三聚體及四聚體抗體、及三重特異性以上的多重特異性三聚體及四聚體抗體的製造。
亦即，本發明係提供下述[1]至[18]。
[1]一種三聚體及四聚體IgA抗體的製造方法，係包含：混合二聚體IgA抗體、及單體IgA抗體。
[2]如[1]記載之製造方法，係更包含：混合分泌片。
[3]如[1]或[2]記載之製造方法，係製造至少雙重特異性之三聚體及四聚體IgA抗體，其中，前述二聚體IgA抗體包含第1抗原結合部位，前述單體IgA抗體包含第2抗原結合部位。
[4]如[3]記載之製造方法，係更混合：包含第3抗原結合部位之其他單體IgA抗體。
[5]如[3]記載之製造方法，其中，前述二聚體IgA抗體之4個Fab區域分別包含第1抗原結合部位，前述包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體之2個Fab區域分別包含第2抗原結合部位。
[6]如[4]記載之製造方法，其中，前述二聚體IgA抗體之4個Fab區域分別包含第1抗原結合部位，前述包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體之2個Fab區域分別包含第2抗原結合部位，前述其他單體IgA抗體之2個Fab區域分別包含第3抗原結合部位。
[7]如[2]至[6]中任一項記載之製造方法，其中，前述分泌片係野生型SC或SC變異體。
[8]如[1]至[7]中任一項記載之製造方法，係包含：更混合選自由分子伴護蛋白質(Molecular chaperone protein)、雙硫鍵異構酶(Disulfide bond isomerase)、氧化型麩胱甘肽(Glutathione)、及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質。
[9]如[1]至[8]中任一項記載之製造方法，其中，前述二聚體IgA抗體及前述單體IgA抗體分別為各自以培養細胞製作出的重組IgA抗體。
[10]如[1]至[9]中任一項記載之製造方法，係更包含：將所製造之三聚體IgA抗體及四聚體IgA抗體從其他IgA抗體分離。
[11]如[10]記載之製造方法，係更包含：將所製造之三聚體IgA抗體與四聚體IgA抗體分離。
[12]一種至少雙重特異性之三聚體或四聚體IgA抗體，係包含：含有第1抗原結合部位之第1 Fab區域、及含有第2抗原結合部位之第2 Fab區域。
[13]如[12]記載之抗體，係更包含：分泌片。
[14]如[12]記載之抗體，係由「包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體1分子」及「包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體1分子或2分子」所成的聚合物。
[15]如[13]記載之抗體，係由「包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體1分子」、「包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體1分子或2分子」及「分泌片」所成的聚合物。
[16]如[12]至[15]中任一項記載之抗體，係包含：4個第1 Fab區域、及至少2個第2 Fab區域。
[17]如[13]、[15]及[16]中任一項記載之抗體，其中，前述分泌片係野生型SC或SC變異體。
[18]一種醫藥組成物，係包含：[12]至[17]中任一項記載之抗體。
本發明之多聚體IgA抗體，係藉由在1個抗體分子中，搭載源自1個二聚體IgA抗體之4個Fab區域及源自單體IgA抗體之2個或4個Fab區域，而可具有 一種或二種以上的Fab區域。因此，根據本發明，可獲得多聚體IgA抗體，特別是多重特異性多聚體IgA抗體。本發明之多聚體IgA抗體及多重特異性多聚體IgA抗體，係具有對各抗原之高抗原結合性或中和活性。再者，本發明之方法中，二聚體IgA抗體彼此、單體IgA抗體彼此係無法進行聚合，因此，使用包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體及包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體時，藉由本發明之方法製造的三聚體及四聚體IgA抗體係以100%機率成為多重特異性抗體。本發明係藉由將二聚體IgA抗體及單體IgA抗體的至少2個蛋白質僅以體外(in-vitro)混合之簡便的方法，而製造多聚體抗體，特別是多重特異性多聚體抗體，尤其是多重特異性三聚體及四聚體抗體，更尤其是雙重特異性三聚體及四聚體抗體者，可用來作為使用抗體之研究用工具或遞送工具、診斷藥、醫藥品開發之平台。本發明係藉由更混合SC而提升多聚體抗體的製造效率。
SC:分泌片
圖1係顯示本案之雙重特異性四聚體IgA抗體的製造之一例的示意圖。
圖2-1係表示野生型SC之胺基酸序列、及SC12缺失變異體的胺基酸序列。
圖2-2係表示野生型SC之鹼基序列。
圖2-3係表示SC12缺失變異體之鹼基序列。
圖3係顯示SC12之IgA抗體多聚體化促進能力的圖。圖中，「mA1+dA1+SC12」(以實線表示)係顯示混合單體IgA1抗體及二聚體IgA1抗體以及SC12的結果。「mA1+SC12」係顯示混合單體IgA1抗體及SC12的結果。「dA1+SC12」係 顯示混合二聚體IgA1抗體及SC12的結果。「Tri/Tet IgA」係顯示在細胞內作出的三聚體及四聚體IgA1抗體(對照)。
圖4係顯示SC12與SC-wt之IgA抗體四聚體形成促進能力的比較之圖。圖中，「mA1+mC-dA1+SC12」係顯示混合單體IgA1抗體、螢光標識mCherry融合型二聚體IgA1抗體、及SC12的結果。「mA1+mC-dA1+SC-wt」係顯示混合單體IgA1抗體、螢光標識mCherry融合型二聚體IgA1抗體、及野生型SC的結果。「mC-mA1+dA1+SC12」係顯示混合螢光標識mCherry融合型單體IgA1抗體、二聚體IgA1抗體、及SC12的結果。「mC-mA1+dA1+SC-wt」係顯示混合螢光標識mCherry融合型單體IgA1抗體、二聚體IgA1抗體、及野生型SC的結果。
圖5A係顯示根據有無添加劑(Supple)所致之在SC12存在下的IgA抗體多聚體形成效率之圖。圖中，「mA1+mC-dA1+SC12」係顯示混合單體IgA1抗體、螢光標識mCherry融合型二聚體IgA1抗體、及SC12的結果。「mA1+mC-dA1+SC12+Supple」係顯示混合單體IgA1抗體、螢光標識mCherry融合型二聚體IgA1抗體、SC12、及添加劑的結果。「mC-mA1+dA1+SC12」係顯示混合螢光標識mCherry融合型單體IgA1抗體、二聚體IgA1抗體、及SC12的結果。「mC-mA1+dA1+SC12+Supple」係顯示混合螢光標識mCherry融合型單體IgA1抗體、二聚體IgA1抗體、SC12、及添加劑的結果。
圖5B係顯示根據有無添加劑(Supple)所致之在野生型SC存在下的IgA抗體多聚體形成效率之圖。圖中，「mA1+mC-dA1+SC-wt」係顯示混合單體IgA1抗體、螢光標識mCherry融合型二聚體IgA1抗體、及野生型SC的結果。「mA1+mC-dA1+SC-wt+Supple」係顯示混合單體IgA1抗體、螢光標識mCherry融合型二聚體IgA1抗體、野生型SC、及添加劑的結果。「mC-mA1+dA1+SC-wt」係顯示混合 螢光標識mCherry融合型單體IgA1抗體、二聚體IgA1抗體、及野生型SC的結果。「mC-mA1+dA1+SC-wt+Supple」係顯示混合螢光標識mCherry融合型單體IgA1抗體、二聚體IgA1抗體、野生型SC、及添加劑的結果。
圖6係顯示根據各添加劑所致之IgA多聚體形成促進效果的圖。
圖7係顯示根據IgA抗體的恆定區域的差異(IgA1及IgA2m2)所致之多聚體形成效率的圖。
圖8係顯示根據反應時間的長短所致之多聚體形成效率差異的圖。
圖9係使用不同的具有2種特異性之單體及二聚體IgA抗體，顯示根據SC的有無所致之三聚體/四聚體IgA抗體形成效率的差異。圖中，「Hetero」表示具有不同特異性之單體IgA2m2(mA2)與二聚體IgA1(dA1)之組合，「Homo」表示具有相同特異性之mA2與dA1之組合。
1.用語
本說明書中所使用之用語在沒有特別定義之限制下，具有該技術領域通常使用的意義。
「抗體」係被稱為免疫球蛋白(Ig)之蛋白質，具有與抗原特異性結合之能力。抗體係具有由配置成Y字型之2條重鏈(H鏈)及2條輕鏈(L鏈)之總計4條多肽鏈之基本單元，集合1個以上的基本單元而形成1個抗體分子。在該4條多肽鏈中，存在胺基酸序列變化相對較少的恆定區域(重鏈之恆定區域：CH1、CH2、CH3、及輕鏈之恆定區域：CL)、及胺基酸序列變化較大的可變區域(重鏈之可變區域：VH、及輕鏈之可變區域：VL)。
所謂「多聚體」意指包含2個以上之上述基本單元之抗體。如後所述，藉由本案之製造方法所製作之抗體係三聚體及四聚體抗體。因此，在本案說明書中使用時，「多聚體」意指三聚體或四聚體、或三聚體及四聚體之混合物。
「Fab區域」係包含由重鏈之VH及CH1域(domain)與輕鏈之VL及CL域所構成的抗原結合部位之區域。
所謂「多重特異性」係意指抗體可與2個以上之不同的抗原決定區(抗原決定基)特異性結合。所謂「雙重特異性」係意指抗體可與2個不同的抗原決定區特異性結合。所謂「三重特異性」係意指抗體可與3個不同的抗原決定區特異性結合。同樣地，所謂四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性、及八重特異性係意指抗體可分別與4個、5個、6個、7個及8個不同的抗原決定區特異性結合。一般而言，多重特異性抗體係各自包含對不同的抗原決定區之特異性二種類以上的抗原結合部位(paratope)。在此，「不同的抗原決定區」可為相同抗原上之不同的抗原決定區，或不同抗原上的抗原決定區。
所謂「單一特異性」係意指抗體具有與相同抗原之相同抗原決定區結合之1個或複數個抗原結合部位。
「抗原結合部位」係意指與抗原決定區結合之抗體分子上的區域。抗原結合部位包含重鏈之VH及輕鏈之VL。在本說明書中，所謂第1、第2、第3、及第4抗原結合部位，係意指與不同抗原上的抗原決定區或相同抗原上的不同的抗原決定區結合之分別由不同胺基酸序列所構成之區域。
「IgA」係抗體(免疫球蛋白)之同型(Isotype)之一。在本說明書中，亦稱為「IgA抗體」或「IgA型抗體」。人類IgA係根據恆定區域的不同而分類成IgA1及IgA2之2個子類。進一步，IgA2係分成IgA2m1、IgA2m2、及IgA2(n)之3種 異型(Allotype)。IgA係在血清中主要以單體IgA存在(血清型IgA)，IgA1係主要構成要素。分泌至黏膜時，以二聚體以上的多聚體IgA存在(分泌型IgA或SIgA)，IgA2佔約一半左右。多聚體IgA係2分子以上的IgA藉由J鏈(Joining chain)或J鏈及SC聚合而成者。在多聚體IgA中，存在含有及不含有SC者。一般而言，二聚體IgA係指重鏈：輕鏈：J鏈之比率為4：4：1之分子。
「SC(或分泌片)」係分子量約70kDa之經糖鏈修飾的多肽，源自多聚體免疫球蛋白受體(pIgR)之細胞外域。具有從N末端算起之5個類免疫球蛋白域，分別標記為D1至D5。其中，D1係與多聚體IgA之結合所必須者，特別是，類似於存在於D1之免疫球蛋白的可變區域之CDR(互補性決定區域)的結構，係擔任與多聚體IgA結合之重要角色。
pIgR係屬於表現在黏膜上皮細胞之基底膜側的細胞膜上之免疫球蛋白超家族(Superfamily)之I型膜貫通型蛋白質，由細胞外域、膜貫通區域及細胞質內區域構成。pIgR係特異性辨識存在於黏膜固有層之漿細胞所產生之包含J鏈的多聚體IgA分子並結合，攝入至上皮細胞中，直接結合並向頂端部(apical)側輸送。在此，藉由上皮細胞之蛋白質分解酵素，切斷pIgR之細胞外域及膜貫通區域之間，多聚體IgA以與pIgR之細胞外域部分結合的狀態向內腔側黏膜層分泌(分泌型IgA或SIgA)。切斷後之pIgR的細胞外域相當於SC。在本說明書中使用時，將SC包含於分子內之IgA抗體稱為「分泌型IgA抗體」。
「J鏈」係具有N結合型糖鏈之分子量約15kDa的多肽。J鏈係在生物間高度地保存，在多聚體IgA與pIgR相互作用上為不可或缺者。
2.多聚體IgA抗體之製造方法
在本發明之第一態樣中提供三聚體及四聚體IgA抗體的製造方法(以下，亦稱為「本案之製造方法」)，該製造方法包含混合二聚體IgA抗體及單體IgA抗體。本案之製造方法的另一態樣提供三聚體及四聚體IgA抗體的製造方法，該製造方法包含混合二聚體IgA抗體、單體IgA抗體及SC。根據本案之製造方法，1個二聚體IgA抗體及2個單體IgA抗體係聚合而製造1個四聚體IgA抗體。進一步，根據本案之製造方法，1個二聚體IgA抗體、2個單體IgA抗體及SC係聚合而製造1個四聚體IgA抗體(圖1)。再者，根據本案之製造方法，1個二聚體IgA抗體及1個單體IgA抗體係聚合而製造1個三聚體IgA抗體。更進一步，根據本案之製造方法，1個二聚體IgA抗體、1個單體IgA抗體及SC係聚合而製造1個三聚體IgA抗體。
進行混合之二聚體IgA抗體及單體IgA抗體，係可分別包含不同的可變區域，或包含相同的可變區域。二聚體IgA抗體及單體IgA抗體之全部可變區域相同時，所得之三聚體及四聚體IgA抗體係單一特異性抗體。二聚體IgA抗體及單體IgA抗體包含2種以上不同的可變區域時，可獲得雙重乃至八重之多重特異性抗體。例如，使用4個Fab區域全部包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體、及2個Fab區域之兩者皆包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體，亦可獲得雙重特異性三聚體及四聚體IgA抗體。例如，使用4個Fab區域全部包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體、2個Fab區域之兩者皆包含第2抗原結合部位之第1單體IgA抗體、及2個Fab區域之兩者皆包含第3抗原結合部位之第2單體IgA抗體，可獲得三重特異性四聚體IgA抗體。例如，使用4個Fab區域之2個包含第1抗原結合部位，剩餘2個包含第2抗原結合部位之雙重特異性二聚體IgA抗體、2個Fab區域之兩者皆包含第3抗原結合部位之第1單體IgA抗體、及2個Fab區域之兩者皆包含第4抗原結合部位之第2單體IgA抗體，可獲得三重特異性三聚體IgA抗體、及三重或四重特 異性四聚體IgA抗體。如此，藉由變更進行混合之二聚體IgA抗體及單體IgA抗體所含有的可變區域，可獲得期望的雙重乃至六重之多重特異性三聚體IgA抗體、及期望的雙重乃至八重之多重特異性四聚體IgA抗體。因此，本發明之較佳態樣中係提供至少雙重特異性之三聚體及四聚體IgA抗體之製造方法，該製造方法包含「將包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體及包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體混合」、或包含「將包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體、包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體、及SC混合」。
本案之製造方法中，二聚體IgA抗體彼此不聚合，再者，單體IgA抗體彼此亦不聚合。因此，在將「包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體」及「包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體」混合時，或在將「包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體」、「包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體」及「SC」混合時，可以100%機率獲得至少雙重特異性之三聚體及四聚體IgA抗體
所混合的二聚體IgA抗體及/或單體IgA抗體，較佳為其重鏈恆定區域之第458號胺基酸殘基為疏水性胺基酸。疏水性胺基酸可列舉例如：異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、甘胺酸，較佳例可舉出異白胺酸。如此之IgA抗體的重鏈恆定區域可為由天然序列構成者，或藉由基因重組技術而使第458號的胺基酸殘基經改變成疏水性胺基酸者。根據本發明，相較於僅使用重鏈恆定區域之第458號的胺基酸殘基為疏水性胺基酸以外之IgA1抗體時，使用重鏈恆定區域之第458號的胺基酸殘基為異白胺酸之IgA2m2抗體時，多聚體IgA抗體的形成效率上昇(實施例5)。IgA1的恆定區域之胺基酸序列示於序列編號1，IgA2m2的恆定區域之胺基酸序列示於序列編號2。
SC可使用野生型SC或SC變異體之任一者。SC變異體可舉出例如含有至少域D1之SC變異體，可舉出例如，缺失SC之域D2至D5中的1個以上之域或D2至D5之區域之一部分的變異體。較佳可列舉：包含至少域D1及D2之SC變異體、缺失SC之域D4及D5的變異體、SC之域D3至D5全部缺失的變異體(本說明書中，亦稱為「SC12」)等。就SC而言，更佳是使用野生型SC(序列編號3)或SC12(序列編號4)或者是該等的變異體，又更佳是使用SC12或其變異體。所述之SC變異體可列舉例如：相對於序列編號3或序列編號4所示之胺基酸序列，由具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列一致性的胺基酸序列所構成之多肽。在本案之製造方法中，可使用SC，亦可不使用SC，較佳是使用SC。使用SC時，提升三聚體及/或四聚體IgA抗體的形成效率。
本案之製造方法中使用之IgA抗體的來源沒有特別的限定，可列舉例如：人類抗體、非人類哺乳動物抗體、源自齧齒類之抗體、源自鳥類之抗體等。
IgA抗體所特異性結合之抗原沒有特別的限定。為了製造期望的三聚體IgA抗體及/或四聚體IgA抗體可選擇適當的IgA抗體。
本案之製造方法中使用之IgA抗體的子類可為IgA1或IgA2之任一者，或使用IgA1及IgA2兩者。較佳是使用IgA1及IgA2兩者。例如，亦可使用二聚體IgA1抗體及單體IgA2抗體。進一步，也可使用IgA2之任一種異型。
本案之製造方法中使用之IgA抗體可為天然的IgA抗體，或重組IgA抗體。在此，所謂「重組抗體」係包含天然的抗體序列經改變的抗體、及無論有無序列改變，藉由基因重組技術人為地製作而成的抗體。例如，亦可使用非 IgA型抗體經變換成IgA型的重組IgA抗體。非IgA型抗體可列舉例如：IgG抗體、IgM抗體、IgE抗體、IgD抗體、IgY抗體。非IgA型抗體之來源並沒有特別的限定，可列舉例如：人類抗體、非人類哺乳動物抗體、源自齧齒類之抗體、源自鳥類之抗體等。例如，可使用藉由將IgG抗體的可變區域移植至IgA抗體的骨幹框架，或僅將IgG抗體的CDR移植至IgA抗體的CDR而製作出的重組IgA抗體。進一步，在重組IgA抗體中，亦包含組合源自某種動物種之抗體的可變區域及源自其他動物種的IgA抗體之恆定區域的嵌合體重組IgA抗體、將源自某種動物種之抗體的互補性決定區域(CDR)移植至源自其他動物種的IgA抗體之CDR而成的重組抗體。基因重組技術是所屬技術領域所熟知。
因此，在本說明書中，所謂「IgA抗體」係意指具有至少一部為源自IgA抗體之胺基酸序列的抗體。
本案之製造方法中使用之二聚體IgA抗體較佳是不包含SC。再者，本案之製造方法中使用之二聚體IgA抗體包含J鏈。
進行混合之二聚體IgA抗體及單體IgA抗體係可以所屬技術領域已知的方法製作即可。例如，二聚體IgA抗體及單體IgA抗體係可分別各自以培養細胞所製作出者。二聚體IgA抗體係例如可藉由使構成該IgA抗體之重鏈蛋白質、輕鏈蛋白質及J鏈在1個宿主細胞內共同表現而製作。單體IgA抗體也例如可藉由使構成該IgA抗體之重鏈蛋白質及輕鏈蛋白質在1個宿主細胞內共同表現而製作。
宿主細胞可列舉：哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌、酵母等。哺乳動物細胞不是受到限定者，可列舉293F細胞、CHO細胞等。昆蟲細胞不是受到限定者，可列舉Sf9細胞株、Sf21細胞株等。
使上述蛋白質(二聚體IgA抗體之情形為重鏈蛋白質、輕鏈蛋白質及J鏈；單體IgA抗體之情形為重鏈蛋白質及輕鏈蛋白質)在1個宿主細胞內共同表現之步驟，只要例如藉由將包含編碼該等蛋白質之核酸的表現載體導入至該細胞內進行即可。表現載體及導入方法是所屬技術領域所熟知。表現載體可使用：嗜菌體載體、病毒載體、質體載體等，適合宿主之載體可由所屬技術領域具有通常知識者適當地選擇。表現載體導入後，培養細胞而表現目標蛋白質。細胞培養條件可由所屬技術領域具有通常知識者適當地選擇。
本案之製造方法中除了二聚體IgA抗體及單體IgA抗體、或二聚體IgA抗體、單體IgA抗體及SC以外，可更混合選自由分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽、及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質。分子伴護蛋白質係有助於蛋白質分子摺疊之蛋白質。分子伴護蛋白質有：Hsp60家族、Hsp70家族、Hsp90家族、Hsp100家族、低分子量Hsp家族、異構酶類、及該等的輔助因子等，可列舉例如：Dnak、DnaJ、GrpE、GroE、GroEL、GroES等，亦可使用2種以上的分子伴護蛋白質。雙硫鍵異構酶係有助於胺基酸殘基間之雙硫鍵的酵素。氧化型麩胱甘肽係作出為了形成雙硫鍵所必須的氧化條件。藉由使用該等物質之至少1者，可促進IgA抗體的四聚體形成。本案之製造方法中，較佳是更混合選自由分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽、及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少2種物質，更佳是，更混合分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶及氧化型麩胱甘肽。再者，本案之製造方法中，較佳是，更混合選自由分子伴護蛋白質及雙硫鍵異構酶所構成之群組中之至少1種物質。
本案之製造方法中，二聚體IgA抗體及單體IgA抗體之混合；二聚體IgA抗體、單體IgA抗體及SC之混合；二聚體IgA抗體、單體IgA抗體、以及選 自由分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽、及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質之混合；或二聚體IgA抗體、單體IgA抗體、SC、以及選自由分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽、及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質之混合，只要在調整成pH6至10，較佳是pH7至8之緩衝液中進行即可。緩衝液例如非受到限定者、可列舉：磷酸緩衝液、Tris鹽酸緩衝液、古德氏(Good’s)緩衝液等。混合時之適當的溫度可由所屬技術領域具有通常知識者適當地決定，例如25℃至45℃，較佳是30℃至43℃，更佳是35℃至40℃，例如37℃前後。混合時間沒有特別的限定，可根據反應容量等其他條件由所屬技術領域具有通常知識者適當地決定，例如可為6小時以上、12小時以上、24小時以上、或48小時以上，較佳是24小時至72小時左右。二聚體IgA抗體及單體IgA抗體之混合比率，或二聚體IgA抗體、單體IgA抗體及SC之混合比率，或二聚體IgA抗體、單體IgA抗體、以及選自由分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質之混合比率，或二聚體IgA抗體、單體IgA抗體、SC、以及選自由分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質之混合比率沒有特別的限定，可由所屬技術領域具有通常知識者適當地決定。
如此製造之三聚體及四聚體IgA抗體係可根據其分子尺寸等特性，從其他IgA抗體(未多聚體化之二聚體IgA抗體及單體IgA抗體)分離，進一步，三聚體IgA抗體與四聚體IgA抗體亦可互相分離。三聚體及四聚體IgA抗體從其他IgA抗體的分離係可使用例如：尺寸排除色層分析法、超過濾、離子交換色層分析法、質量分析等。因此，本案之製造方法可更含有將三聚體IgA抗體及四聚體IgA抗體從其他IgA抗體分離之步驟。
再者，由本案之製造方法所製造之三聚體及四聚體IgA抗體之特異性之確認係可藉由ELISA法、尺寸排除色層分析法、親和性色層分析法等已知的方法進行。由本案之製造方法製造之多聚體IgA抗體大多為四聚體IgA抗體。因此，根據本案之製造方法，相較於三聚體IgA抗體，可以高比率含有四聚體IgA抗體，可獲得三聚體IgA抗體與四聚體IgA抗體之混合物。
3.多重特異性多聚體IgA抗體
本發明之第二態樣中提供至少雙重特異性之三聚體或四聚體IgA抗體(以下，亦稱為「本案之多重特異性多聚體IgA抗體」)，該三聚體或四聚體IgA抗體包含：包含第1抗原結合部位之第1 Fab區域、及包含第2抗原結合部位之第2 Fab區域。本案之多重特異性多聚體IgA抗體的另一態樣提供至少雙重特異性之三聚體或四聚體IgA抗體，該三聚體或四聚體IgA抗體包含：包含第1抗原結合部位之第1 Fab區域、包含第2抗原結合部位之第2 Fab區域及SC。本案之多重特異性多聚體IgA抗體較佳是藉由上述本案之製造方法而得。
該多重特異性多聚體IgA抗體較佳是由1個二聚體IgA抗體與1個或2個單體IgA抗體所成之聚合物。該多重特異性多聚體IgA抗體更佳是由1個二聚體IgA抗體、1個或2個單體IgA抗體、及SC所成之聚合物。例如，1個二聚體IgA抗體與1個或2個單體IgA抗體，係經由SC而三聚體化或四聚體化。例如，該二聚體IgA抗體包含第1抗原結合部位，該單體IgA抗體包含第2抗原結合部位。在較佳例中，本案之多重特異性多聚體IgA抗體包含4個第1 Fab區域、及至少2個第2 Fab區域。更佳例中，本案之多重特異性多聚體IgA抗體包含4個第1 Fab區域、至少2個第2 Fab區域及SC。又更佳例中，本案之多重特異性多聚體IgA抗體可為包含4個第1 Fab區域及2個第2 Fab區域之雙重特異性三聚體IgA抗體，或包含4個第1 Fab區域及4個第2 Fab區域之雙重特異性四聚體IgA抗體，或包含4個第1 Fab區域、2個第2 Fab區域及2個第3 Fab區域之三重特異性四聚體IgA抗體。又更佳例中，本案之多重特異性多聚體IgA抗體可為包含4個第1 Fab區域、2個第2 Fab區域及SC之雙重特異性三聚體IgA抗體，或包含4個第1 Fab區域、4個第2 Fab區域及SC之雙重特異性四聚體IgA抗體，或包含4個第1 Fab區域、2個第2 Fab區域、2個第3 Fab區域及SC之三重特異性四聚體IgA抗體。又更佳例中，前述4個第1 Fab區域源自二聚體IgA抗體，前述2個或4個第2或第3 Fab區域源自單體IgA抗體。
本案之多重特異性多聚體IgA抗體可包含IgA1或IgA2之任一者，或包含該兩者。較佳是，本案之多重特異性多聚體IgA抗體可包含IgA1或IgA2之兩者。更佳是，該多重特異性多聚體IgA抗體可包含源自二聚體IgA1之4個Fab區域、及源自單體IgA2之2個或4個Fab區域。再者，本案之多重特異性多聚體IgA抗體所含有的IgA2可為IgA2m1、IgA2m2、或IgA2(n)。
本案之多重特異性多聚體IgA抗體可為其重鏈恆定區域之第458號的胺基酸殘基是疏水性胺基酸。疏水性胺基酸可列舉例如：異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、甘胺酸，較佳例可舉出異白胺酸。
本案之多重特異性多聚體IgA抗體可為重組IgA抗體。例如，本案之多重特異性多聚體IgA抗體，係由1個二聚體IgA抗體與1個或2個單體IgA抗體所成之聚合物時，或由1個二聚體IgA抗體、1個或2個單體IgA抗體與SC所成之聚合物時，該二聚體IgA抗體及該單體IgA抗體之任一者、或全部可為重組IgA抗體。
構成本案之多重特異性多聚體IgA抗體之IgA抗體及SC係如記載於上述「2.多聚體IgA抗體之製造方法」者。
4.醫藥組成物
本發明之第三態樣係提供包含本案之多重特異性多聚體IgA抗體之醫藥組成物(以下，亦稱為「本案之醫藥組成物」)。本案之醫藥組成物較佳是包含本案之多重特異性多聚體IgA抗體、或該多重特異性多聚體IgA抗體之混合物作為有效成分。
本案之醫藥組成物係可為了例如疾病之治療、預防或診斷等而使用。使用本案之醫藥組成物之對象疾病沒有特別的限定，例如，感染症，可列舉例如：由寄生蟲、細菌、真菌、病毒、異常病原性蛋白顆粒(Prion)等病原體所引起之感染症、及惡性腫瘤等。感染症之進一步例可列舉：流行性感冒病毒感染症、RS病毒感染症、伊波拉病毒(Ebola virus)感染症、發熱伴血小板減少症候群(SFTS)、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、中東呼吸道症候群(MERS)、後天性免疫不全症候群(AIDS)等黏膜感染症。
本案之醫藥組成物所含有的多重特異性多聚體IgA抗體，係具有適合於該醫藥組成物之使用目的的抗原結合部位。例如，使用於疾病之診斷、預防、治療等情形中，例如，可使用與1個對象疾病關聯之2個不同蛋白質(例如，致病蛋白質(Causative protein)、標記蛋白質等)特異性結合之多重特異性多聚體IgA抗體。例如，本案之醫藥組成物所含有的多重特異性多聚體IgA抗體，係可為分別與流行性感冒病毒之HA蛋白質及NA蛋白質特異性結合者。再者，例如，本案之醫藥組成物所含有的多重特異性多聚體IgA抗體，係可為分別與標的細胞之特異蛋白質及對治療有效的蛋白質特異性結合者。可成為本案之醫藥組成物所含有的多重特異性多聚體IgA抗體之標的的抗原或抗原決定區之例不是受到受到特別限定者，可列舉：伊波拉病毒之糖蛋白質的複數個抗原決定區、屬於SFTS 病毒之糖蛋白質的Gn蛋白質及Gc蛋白質、CD3或CD8等淋巴球之標記蛋白質、及癌症特異抗原等。
本案之醫藥組成物可製劑化成粉劑、液劑等劑型而投予。本案之醫藥組成物可更含有製藥領域中已知的賦形劑、添加劑、增黏劑等。例如，本案之醫藥組成物係可藉由以對鼻腔黏膜上的噴霧進行之投予、使用噴霧器之對下呼吸道的吸入所進行之投予等進行投予。
本案之醫藥組成物可為以人類作為對象者，或以非人類哺乳動物，例如，馬、牛、山羊、綿羊、豬等家畜動物；狗、貓等寵物；黑猩猩、大猩猩、食蟹猴等靈長類；小鼠、大鼠、天竺鼠等齧齒類等作為對象者。
本案之醫藥組成物所含有的多重特異性多聚體IgA抗體之重鏈、輕鏈、SC及J鏈之任一者，較佳是包含源自該醫藥組成物的對象動物之(作為對象之動物型)胺基酸序列。更佳是，本案之醫藥組成物所含有的多重特異性多聚體IgA抗體之重鏈、輕鏈、SC及J鏈皆包含源自該醫藥組成物之對象動物之(作為對象之動物型)胺基酸序列。在此，關於重鏈及輕鏈，所謂「作為對象之動物型」係指多重特異性多聚體IgA抗體之重鏈及輕鏈的恆定區域具有作為對象之動物的IgA重鏈及IgA輕鏈的恆定區域之胺基酸序列。關於SC及J鏈，所謂「作為對象之動物型」係意指多重特異性多聚體IgA抗體之SC及J鏈具有作為對象之動物之SC及J鏈的胺基酸序列。IgA重鏈、IgA輕鏈、SC及J鏈之胺基酸序列只要具有作為目的之抗原結合活性的條件下亦可含有變異。
[實施例]
以下，使用實施例進一步說明本發明，但不是限定於本發明之實施例者。
[材料及調製]
1.表現IgA之質體載體的製作
屬於人類IgA1之恆定區域之α 1重鏈(HC)的表現載體係如下述般製作出。PCR係使用PrimeSTARTM(註冊商標)MAX DNA Polymerase(Takara Bio,Kusatsu,Japan)並實施。簡潔而言，將pFUSE-CHIg-hA1(InvivoGen)作為模板，引子係使用將包含限制酵素之XhoI與HindIII所辨識之位點的IgA1抗體恆定區域擴增之適當的引子對，將人類IgA1抗體恆定區域基因以PCR進行擴增。PCR條件係以98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 10秒實施30個循環。接著，將T.Tiller等(J Immunol Methods,329,112-24,2008)所報告之人類γ 1HC的表現載體作為模板，使用包含XhoI與HindIII所辨識之位點，並去除訊號序列的IgG1抗體恆定區域之用以去除γ 1HC的適當引子對實施PCR。PCR條件係以98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒實施30個循環。PCR產物之精製係使用MonoFas DNA精製套組I(GL Sciences Inc.，Tokyo，Japan)進行。經精製之α 1HC及去除γ 1HC的T.Tiller等的表現載體使用XhoI(New England Biolabs)、HindIII-HF(New England Biolabs)在37℃進行限制酵素處理。限制酵素產物之精製係使用MonoFas DNA精製套組I進行。經限制酵素處理之DNA接合係使用DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Thermo Fisher Scientific)進行，將全量在42℃對Competent Quick DH5 α進行轉形。質體抽取係藉由PureYieldTM Plasmid Miniprep System(Promega)進行。經抽取之質體係使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer實施定序。定序反應係使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行，精製係藉由BigDye XTerminatorTM Kit進行。以上，全部操作皆根據所附的說明書實施。
屬於人類IgA2異型之α 2m2 HC，係將登錄於IMGT/GENE-DB之序列(登錄號(Accession number)：α 2m2 HC為M60192及AJ012264)進行人類用密碼子最佳化，進行人工合成(GeneArt Strings DNA Fragments)。此時，為了容易進行可變區域之選殖(cloning)，改編可變區域之最後胺基酸丙胺酸及恆定區域之最初胺基酸絲胺酸之密碼子，製作出NheI切斷位點。以NheI-HF(New England Biolabs)及HindIII-HF處理過的合成序列、及使用相同限制酵素處理過的α 1 HC，係使用MonoFas DNA精製套組I精製。經限制酵素處理之DNA接合係使用DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Thermo Fisher Scientific)進行，將一部份在42℃對Competent Quick DH5 α進行轉形。質體抽取係藉由PureYieldTM Plasmid Miniprep System(Promega)進行。經抽取之質體係使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer實施定序。定序反應係使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行，精製係藉由BigDye XTerminatorTM Kit進行。以上，全部操作皆根據所附的說明書實施。
人類輕鏈(LC)係在抗體的各同型間共通，因而使用由T.Tiller等所報告之λ LC表現載體。
2.對於抗體可變區域基因之α 1、α 2m2 HC及λ LC表現載體的選殖
使用作為對流行性感冒病毒(H3N2)之血球凝集素(HA)廣域地結合之抗體殖株(clone)被熟知之F045-092。F045-092係將登錄於Nucleotide之序列(登錄號(Accession number)：重鏈為AB649270，輕鏈為AB649271)進行人類用密碼子最佳化，以分別組入至α 1 HC(重鏈)、α 2m2 HC(重鏈)及λ LC(λ鏈)之表現載體的方式進行調整及人工合成(GeneArt Strings DNA Fragments)。將經AgeI-HF(全 部鏈)及NheI-HF(重鏈)、XhoI(λ鏈)(New England Biolabs)處理過之合成序列、及經相同限制酵素處理過之α 1 HC、α 2m2 HC及λ LC之表現載體，使用MonoFas DNA精製套組I進行精製。經限制酵素處理之DNA接合係使用DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Thermo Fisher Scientific)進行，將一部份在42℃對Competent Quick DH5 α進行轉形。質體抽取係藉由PureYieldTM Plasmid Miniprep System(Promega)進行。經抽取之質體係使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer實施定序。定序反應係使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行，精製係藉由BigDye XTerminatorTM Kit進行。以上，全部操作皆根據所附的說明書實施。
3.螢光標識IgA1(mC-A1)及IgA2m2抗體(mC-A2)的表現質體DNA之製作
將缺失屬於IgA抗體之不同子類的α 1及α 2m2之重鏈中至第241號的半胱胺酸為止的由CH2及CH3構成之IgA1△及IgA2m2△突變體，使用附加了限制酵素位點之特異性引子對及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio,Kusatsu,Japan)藉由PCR而作出。再者，使用於5’及3’末端附加了限制酵素AgeI之辨識序列的引子對及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio)進行PCR，特異性地增幅屬於螢光蛋白質之mCherry的序列。之後，將各IgA△突變體、及mCherry使用限制酵素AgeI(New England Biolabs)以合適條件實施限制酵素處理後，藉由進行瓊脂糖凝膠電泳，僅回收經限制酵素消化後之目的產物的條帶。將經回收之目的產物使用MonoFas DNA精製套組I(GL Sciences Inc.,Tokyo,Japan)進行精製，將該精製之編碼IgA△變異體之DNA片段、及編碼mCherry之DNA片段以1：3(=IgA1△：mCherry)混合，添加等量的DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Thermo Fisher Scientific)，在16℃反應30分鐘進行接合。將經環化之IgA△及mCherry在42℃於E.coli DH5 α Competent Cells(Takara Bio,Kusatsu,Japan)進行轉形。質體DNA抽取係藉由PureYield Plasmid Miniprep System(Promega)進行，使用桑格(Sanger)法進行定序序列之解析。mCherry係附加於編碼IgA1△及IgA2m2△之序列的5’側。再者，此螢光蛋白質mCherry所融合的IgA△變異體係分別作為mC-A1抗體、以及mC-A2抗體。實施之操作係全部根據所附的說明書。
4.J鏈及分泌片(SC)之選殖
將J鏈(GenBank accession no.NM_144646)藉由人工基因合成服務(Eurofins Genomics)人工合成出於編碼序列之5’側附加了XhoI辨識序列及Kozak序列，進一步於3’側附加有NotI辨識序列者。之後，使用XhoI(New England Biolabs)及NotI-HF(New England Biolabs)，以合適的條件實施限制酵素處理，以相同條件亦將屬於哺乳類培養細胞用之表現載體的pCXSN載體實施限制酵素處理。經限制酵素處理之DNA接合係使用DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Thermo Fisher Scientific)進行，將一部份在42℃對Competent Quick DH5 α進行轉形。質體抽取係藉由PureYieldTM Plasmid Miniprep System(Promega)進行。經抽取之質體係使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer實施定序。定序反應係使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行，精製係藉由BigDye XTerminatorTM Kit進行。以上，全部操作皆根據所附的說明書實施。
野生型SC(SC-wt)係使用pIgR(GenBank accession no.NM_002644)之從5’末端算起的1809bp(包含訊號序列)，將其SC序列的5’側包含XhoI辨識序列及kozak序列，3’側包含HindIII辨識序列、Thrombin切斷序列、6x His標識(tag)之DNA片段(序列編號7)，使用GeneArt(註冊商標)Strings DNA Fragments(Life Technologies)進行人工合成。將合成出的DNA片段使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio,Kusatsu,Japan)實施PCR，進行DNA精製。之後，在合適條件下使用XhoI及HindIII進行限制酵素處理，以相同條件亦對屬於哺乳類培養細胞用之表現載體之pCXSN載體實施限制酵素處理。經限制酵素處理之DNA接合係使用DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Thermo Fisher Scientific)進行，將一部份在42℃對Competent Quick DH5 α進行轉形。質體抽取係藉由PureYieldTM Plasmid Miniprep System(Promega)進行。經抽取之質體係使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer實施定序。定序反應係使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行，精製係藉由BigDye XTerminatorTM Kit進行。以上，全部操作皆根據所附的說明書實施。實施之操作係全部根據所附的說明書。編碼SC-wt之基因序列示於圖2-2。
5.SC12缺失變異體之表現質體DNA的製作
將具有5個域之SC作為模板，使用特異性引子及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio,Kusatsu,Japan)，考慮最佳的引子對及鹼基長以合適條件進行PCR，藉此擴增出編碼SC之域1及2的序列。再者，SC之各域係根據Beth等地先前研究(eLife,5,e10640,2016)而決定。PCR反應後，進行瓊脂糖凝膠電泳，確認目標的鹼基長經特異性擴增，將PCR產物使用MonoFas DNA精製套組I(GL Sciences Inc.,Tokyo,Japan)進行DNA精製。再者，經精製之DNA片段係使用T4 polynucleotide kinase(Takara Bio,Kusatsu,Japan)進行磷酸化，藉由T4 DNA ligase(Takara Bio,Kusatsu,Japan)進行自我接合成環狀。接合之操作結束後，將經環化之編碼缺失變異體的質體DNA(序列編號8)在42℃對E.coli DH5 α Competent Cells(Takara Bio,Kusatsu,Japan)進行轉形。質體DNA抽取係藉由PureYield Plasmid Miniprep System進行。經抽取之質體係使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer實施定序。定序反應係使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit進行，精製係藉由BigDye XTerminatorTM Kit進行。以上，全部操作皆根據所附的說明書實施。實施之操作係全部根據所附的說明書。編碼SC12缺失變異體之基因序列示於圖2-3。
6.單體IgA抗體及二聚體IgA抗體之表現
單體IgA抗體之構成分子係重鏈、輕鏈，二聚體IgA抗體係由重鏈、輕鏈、J鏈所構成。將表現構成單體及二聚體IgA抗體之分子的質體DNA，在屬於源自人類腎臟細胞的哺乳培養細胞之Expi293F human cell(Thermo Fisher Scientific)2.9x 106cells/mL，使用Expi293 Expression System Kit(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)分別進行共同導入。之後，以37℃、8% CO2、120rpm進行振盪培養，一週後回收細胞培養液。
7.mC-A1及mC-A2抗體之表現
mC-A1及mC-A2抗體不具有輕鏈，因此，將編碼各重鏈及J鏈之質體DNA分別在屬於源自人類腎臟細胞之哺乳培養細胞之Expi293F human cell(Thermo Fisher Scientific)2.9 x 106cells/mL，使用Expi293 Expression System Kit(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)進行共同導入。之後，以37℃、8% CO2、120rpm進行振盪培養，一週後回收細胞培養液。
8.重組IgA抗體及mC-A1/2之精製
將經回收之細胞培養液藉由3000rpm、20分鐘之離心去除細胞等廢物，僅回收培養上清液。再者，此離心操作合計進行2次。之後，使用玻璃纖維過濾器及過濾瓶(Stericup)(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)進行上清液過濾。重組IgA抗 體、及mC-A1/2之精製係使用特異性辨識人類IgA抗體之恆定區域之CaptureSelect IgA Affinity Matrix(Thermo Fisher Scientific)實施。精製方法係根據說明書實施。簡潔的精製方法記述於以下。管柱係以10CV的PBS平衡化，將經過濾之培養上清液注入管柱。以10CV之PBS洗淨管柱，以5CV的0.1M Glycine-HCl(pH 3.0)將抗體溶出，溶出液係以1M Tris-HCl(pH 8.0)中和。抗體之濃縮係使用Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal Filter Devices(Millipore)根據說明書實施。
9.以凝膠過濾色層分析法進行之單體及二聚體IgA抗體的分離
在將單體及二聚體IgA抗體濃縮後，藉由凝膠過濾色層分析法進行區分。重組IgA抗體之區分係使用Superose6 10/300 GL(GE Healthcare)，再者，mC-A1/2係使用Superose 12 10/300 GL，根據說明書實施凝膠過濾色層分析法。色層分析法之條件，係將PBS以流速0.5mL/分鐘、管柱平衡化1.5CV、溶出0.2mL/Fraction(計1.5CV)進行實施。將含有單體及二聚體IgA抗體之區分使用Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal Filter Devices濃縮。濃度係以NanoDrop測定。
10.重組SC12之表現與精製
將編碼SC12之質體DNA，在屬於源自人類腎臟細胞之哺乳培養細胞的Expi293F human cell(Thermo Fisher Scientific)2.9x106cells/mL，使用Expi293 Expression System Kit(Thermo Fisher Scientific)進行基因導入。之後，以37℃、8% CO2、120rpm進行振盪培養，一週後回收細胞培養液。之後，經回收之細胞培養液以3000rpm、20分鐘之離心去除細胞等廢物，僅回收培養上清液。再者，此離心操作合計進行2次。培養上清中之SC12，係使用填充了辨識各蛋白質之C末端側的His標識的Ni Sepharose excel(GE Healthcare)之親和性管柱進行精製。簡潔地記述時，平衡化溶液係使用20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、pH7.4，洗淨液係使用20mM 磷酸鈉、0.5M NaCl、10mM咪唑、pH7.4，溶出液係使用20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、500mM咪唑、pH7.4。通入平衡化溶液5CV(管柱體積)將管柱平衡化後，通入培養上清液。洗淨係以洗淨液20CV進行，溶出係以溶出液5CV實施，以平衡化溶液5CV再平衡化。SC12之濃縮係使用Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal Filter Devices(Millipore)根據說明書實施。
[實施例1：細胞外之多聚體IgA抗體的形成]
根據發明者等的先前研究(專利文獻1)，已知藉由使構成三聚體及四聚體分泌型IgA抗體(tSIgA)之重鏈(HC)與輕鏈(LC)、J鏈(JC)及分泌片(SC)於哺乳類培養細胞共同表現，可高效率地產生tSIgA。進一步，因有無SC而使tSIgA的形成效率有差異，故暗示SC係作為培養細胞內IgA抗體之三聚體及四聚體形成的促進因子進行作用。該SC所具有之IgA抗體的三聚體及四聚體形成促進能力，係經由測定藉由細胞內共同存在之4種蛋白質進行相互作用而形成之三聚體及四聚體IgA抗體(Tri/Tet IgA)來評估。因此，不是在如細胞內般的限定環境，而是在細胞外條件，評估SC是否作為從各個細胞所產生之各單離蛋白質的多聚體IgA抗體形成之促進因子而發揮作用。此外，由SC之域1及2所構成之SC12，係顯示細胞內之三聚體及四聚體形成促進能力高於SC-wt，因此，本實施例中係使用SC12作為SC。
以使如上述般製作之SC12、單體IgA1抗體(mA1)及二聚體IgA1抗體(dA1)的最終濃度分別成為1.25mg/mL之方式，在磷酸緩衝液(pH7.4)中混合，使用旋轉器以37℃反應一週。之後，使用Cosmos spin filter H(Nacalai Tesque Inc.)進行抗體樣品之前處理，將在反應液中生成之Tri/Tet IgA藉由尺寸排除色層分析法(SEC)以分子尺寸分離後，利用UV(280nm)檢測出，進行抗體聚合度之評估。HPLC系統係使用Agilent 1260 Infinity(Agilent Technologies)，管柱係使用KW404- 4F(shodex)。溶離液中使用磷酸緩衝液pH7.4，以流速0.2mL/min之條件實施。再者，IgA抗體混合液係分別使用9μL。層析圖係使用OpenLAB CDS ChemStation Edition(Agilent Technologies)進行解析。
將結果示於圖3。圖中，「mA1+dA1+SC12」顯示混合單體IgA抗體、二聚體IgA抗體及SC12之結果。「mA1+SC12」顯示混合單體IgA抗體及SC12之結果。「dA1+SC12」顯示混合二聚體IgA抗體及SC12之結果。對照組係使用以專利文獻1記載之方法在細胞內作出的三聚體及四聚體IgA抗體(Tri/Tet IgA)。
其結果，在「mA1+SC12」及「dA1+SC12」的組合中，沒有檢測到三聚體/四聚體IgA抗體之峰。另一方面，藉由混合「mA1+dA1+SC12」之3種蛋白質，分子量較dA1大，再者，以與細胞內條件作出之「Tri/Tet IgA」同等的檢測時間檢測到多聚體IgA抗體之峰。由以上結果顯示，三聚體/四聚體IgA抗體形成中，除了SC12的存在以外，mA1及dA1的共存亦為必須。再者，已知即便在細胞外亦與細胞內同樣地可形成三聚體/四聚體IgA抗體。再者，顯示單體彼此、二聚體彼此係不聚合。因此，可知三聚體/四聚體IgA抗體係藉由將二聚體IgA抗體及單體IgA抗體予以聚合而形成。
[實施例2：SC12與SC-wt存在下之多聚體IgA抗體形成的比較]
依據實施例1，藉由在細胞外混合SC、單體及二聚體IgA抗體而形成多聚體IgA抗體，故暗示SC有助於多聚體IgA抗體形成。再者，在發明人等之先前研究中，在細胞內條件中，相較於SC-wt，SC12顯示較高的三聚體/四聚體形成促進能力。因此，為了探索在細胞外條件中高效率地產生三聚體/四聚體IgA抗體之方法，比較SC12與SC-wt之四聚體形成促進能力。
以使如上述般製作之SC12、SC-wt、mA1及dA1，以及將屬於螢光蛋白質之mCherry置換成相當於IgA抗體之Fab區域之mCherry融合IgA抗體(mC-A1)的單體(mC-mA1)及二聚體(mC-dA1)之最終濃度成為0.5mg/mL之方式，在磷酸緩衝液(pH7.4)中混合，使用旋轉器以37℃反應6小時，將在反應液中生成之三聚體/四聚體IgA藉由ELISA法檢測出。
ELISA法係如下述般進行。在96孔盤中將50μl之重組HA(源自A/Sydney/5/1997(H3N2)，5μgHA/mL)以4℃進行整晚固相化後，添加1%BSA-PBS以室溫進行1小時間阻斷(blocking)。之後，製作200倍稀釋後之抗體樣品的3倍階段稀釋系列，添加至各孔中，以37℃反應2小時。以PBST洗淨後，將經由HA抗原在盤中捕捉到的抗體，以5ng/mL之Direct-Blot HRP anti-mCherry(BioLegend)及37℃反應1小時。以PBST洗淨後，使用Immobilon Western Chemilum HRP Substrate(MERCK)，進行發色反應，測定在450nm波長中之吸光度。再者，解析係以使對照之OD值成為1.5之方式算出各盤之係數，將該係數乘上各樣品藉此實施盤間的校正。
結果示於圖4。在SC12或SC-wt之存在下，相較於使mC-mA1與dA1反應時，使mA1與mC-dA1反應時，OD值顯示較高值。再者，比較SC12與SC-wt時，雖然在使用mC-mA1時沒有差異，但在使用mC-dA1時，顯現出SC12存在下之OD值顯示較高值之結果。由以上結果可知，SC12具有較高的IgA抗體之多聚體形成的促進能力。進一步，本實驗所使用之IgA抗體，係具有包含F045-092之可變區域的Fab區域之IgA抗體及mC-A1，該等抗體雖然具有相同之恆定區域，但可變區域不同。亦即，本案之多聚體IgA抗體之製造方法係可變區域非依存型，可製造特異性不同之雙重以上的特異性，較佳是雙重至三重特異性之IgA抗體， 進一步顯示即便二聚體IgA抗體及單體IgA抗體具有不同的可變區域，也可形成多聚體IgA抗體。
[實施例3：與多聚體形成促進相關之因子的鑑定1]
由實施例2已知，相較於SC-wt，SC12係具有較高的IgA抗體之多聚體形成促進能力。因此，為了更增強多聚體形成，而進行SC及IgA抗體以外之蛋白質成分添加的檢討。
將最終濃度分別為0.5mg/mL的上述般製作之SC12、SC-wt、mA1及dA1、以及mC-mA1及mC-dA1、以及添加劑(Supple)在磷酸緩衝液(pH7.4)中混合，使用旋轉器以37℃反應6小時反應。Supple係含有伴護蛋白DnaK Mix(5μM DnaK，1μM DnaJ，1μM GrpE)及GroE Mix(0.5μM GroEL，1μM GroES)、雙硫鍵異構酶DsbC(375μg/mL)、及氧化麩胱甘肽GSSG(30mM)。將反應液中生成之三聚體/四聚體IgA，與實施例2同樣地藉由ELISA法檢測出。
結果示於圖5A及B。在SC12存在下，「mA1+mC-dA1」及「mC-mA1+dA1」之任一混合液中藉由添加Supple，可確認到屬於三聚體/四聚體IgA形成指標之OD值上昇(圖5A)。再者，任一混合液中，OD值皆上昇二倍以上。進一步，在SC-wt存在下亦同樣地，藉由添加Supple確認到與SC12同等程度之大幅的OD值上昇(圖5B)。
[實施例4：與多聚體形成促進相關之因子的鑑定2]
使Supple所含有之4個大的構成因子分別單獨在SC12的存在下與mC-mA1及dA1反應，評估各因子對多聚體形成之貢獻。反應及檢測係除了單獨添加作為添加劑之DnaK Mix、GroE Mix、GSSG或DsbC以外，其餘與實施例3同樣地進行。
結果示於圖6。添加有作為分子伴護蛋白作用之DnaK Mix或GroE Mix時，確認到同等程度之OD值。另一方面，屬於雙硫鍵異構酶之DsbC，係在4個構成因子中確認到最高的OD值之增強。然而，在作出為了形成雙硫鍵所必需之氧化條件的氧化型麩胱甘肽GSSG添加條件下，係在4個因子中顯示最低的三聚體/四聚體IgA形成促進效率。由以上結果可知，本實驗所使用之Supple係對促進IgA抗體之三聚體化/四聚體化有用。
[實施例5：與多聚體形成促進相關之因子的鑑定3]
就有助於IgA抗體之多聚體化的因子而言，著眼於IgA抗體之恆定區域。IgA抗體係根據恆定區域之不同而分類成IgA1及IgA2之2個子類，更進一步IgA2係分成IgA2m1、IgA2m2、IgA2(n)之3種異型。在發明人等的先前研究(專利文獻1)中，根據該等之恆定區域的不同，細胞內條件下之三聚體/四聚體IgA抗體形成效率有差異。因此，評估在細胞外條件是否同樣地由於IgA抗體子類的不同而使多聚體形成效率有差異。亦即，將由IgA抗體之恆定區域的不同所致之多聚體形成效率，使用不同子類之IgA1及IgA2m2進行比較。
將如上述般製作之mC-A1及mC-A2，與實施例3同樣地，在單體及二聚體IgA抗體的組合中添加SC12，進一步亦添加Supple進行反應後，進行三聚體/四聚體IgA形成的評估。
結果示於圖7。相較於組合IgA1抗體之單體及二聚體的情形，IgA2m2抗體與IgA1抗體的組合中，確認到OD值之增強。由以上結果可知，IgA2m2具有較高的四聚體形成能力。
[實施例6：與多聚體形成促進相關之因子的鑑定4]
就提供IgA抗體之多聚體化之因子而言，實施反應時間的檢討。在SC12及Supple之存在下，將mC-mA1及dA1在磷酸緩衝液(pH7.4)中以37℃反應。反應開始之6小時、12小時及24小時後回收樣品，利用ELISA法評估三聚體/四聚體IgA形成。
結果示於圖8。雖然沒有確認到較大的變化，但藉由延長反應時間可確認到OD值之增強。由以上結果可知，藉由探索合適的反應時間，可更增加多聚體IgA抗體的形成效率。
[實施例7：使用不同亞型之HA的雙重特異性IgA抗體之評估]
由實施例2已知，藉由將mCherry融合型IgA抗體之單體及二聚體在SC-wt及SC12的存在下混合，會形成可變區域不同的三聚體/四聚體IgA抗體。進一步，由實施例5亦已知，由於IgA抗體子類的不同而導致多聚體形成效率之不同。因此，在本實施例中，使用附加了檢測標識之2種不同亞型之流行性感冒病毒蛋白質HA、及對各個HA具有特異性之IgA抗體殖株，驗證藉由本案方法所形成之三聚體/四聚體IgA抗體的雙重特異性。
抗體殖株係使用屬於對流行性感冒A型之H1及H3亞型具有特異性之抗體殖株的18-18K(H1)及15-19L(H3)。該等殖株，係實施經鼻流行性感冒疫苗之臨床試驗，從受試者分離者。將該等源自抗體之可變區域藉由與上述同樣的方法，在α 1 HC、α 2m2 HC及λ LC之表現載體中進行選殖，製作出對流行性感冒病毒A/California/7/2009(H1N1)(H1/HA)具有特異性之抗體殖株18-18K的二聚體IgA1抗體、對A/NewYork/39/2012(H3N2)(H3/HA)具有特異性之抗體殖株15-19L的單體IgA2m2抗體及二聚體IgA1抗體。將18-18K(H1)之重鏈可變區域之基因序列示於序列編號9，胺基酸序列示於序列編號10，輕鏈可變區域之基因序列 示於序列編號11，胺基酸序列示於序列編號12。將15-19L(H3)之重鏈可變區域之基因序列示於序列編號13，胺基酸序列示於序列編號14，輕鏈可變區域之基因序列示於序列編號15，胺基酸序列示於序列編號16。SC及SC12亦如上述般製作。
將18-18K之二聚體IgA1抗體、15-19L之單體IgA2m2抗體及二聚體IgA1抗體、及SC或SC12以使各蛋白質的最終濃度成為0.3mg/mL之方式在磷酸緩衝液(pH7.4)中混合。具體而言，在已混合18-18K之二聚體IgA1抗體及15-19L之單體IgA2m2抗體的Hetero群、及已混合15-19L之單體IgA2m2抗體及二聚體IgA1抗體之Homo群中分別添加已加入了SC-wt或SC12之混合液、或SC-wt及SC12皆未添加之混合液，進一步以使還原型麩胱甘肽(富士Film和光純藥股份有限公司)最終濃度成為0.03mM之方式添加，使用熱循環儀以37℃反應12小時。將反應液中生成之三聚體/四聚體IgA藉由ELISA法檢測出。
ELISA法係如下述般進行。在384孔盤將40μl之附加了strept標識之重組H3/HA-Strept(源自A/NewYork/39/2012(H3N2)，5μgHA/mL)以4℃進行整晚固相化後，添加1%BSA-PBS在室溫進行1小時阻斷。之後，製作100倍稀釋後之抗體樣品的2倍階段稀釋系列，添加至各孔中，以37℃反應2小時。以PBST洗淨後，將40μl之附加了His標識的重組H1/HA-His(源自A/California/7/2009(H1N1)，1μgHA/mL)添加至各孔，以37℃反應1小時。以PBST洗淨後，將40μl之6000倍稀釋的mAb-HRP-DirecT(MBL)添加至各孔中，以37℃反應1小時。以PBST洗淨後，使用Immobilon Western Chemilum HRP Substrate(MERCK)，進行發色反應，測定在450nm波長中之吸光度。
結果示於圖9。在組合了具有不同特異性之抗體殖株的Hetero群中，相較於SC非存在下，在SC存在下確認到OD值之增強。進一步，與目前為止 的結果同樣地在SC12存在下，相較於SC-wt，確認到OD值之進一步增強。另一方面，在組合了具有相同特異性之單體IgA2m2(mA2)及二聚體IgA1(dA1)的Homo群中，在SC-wt或SC12存在下，皆未檢測到能與SC非存在下之Hetero群匹敵的OD值。
由以上結果可知，對H1/HA之結合能力的獲得，不是由三聚體/四聚體IgA抗體之形成本身所導致者，而是由對H3/HA顯示特異性之抗體殖株15-19L的dA1與對H1/HA顯示特異性之抗體殖株18-18K的mA2之二種IgA抗體分子去形成一個三聚體/四聚體IgA抗體分子所導致者。再者，SC非存在下之IgA1與IgA2m2之IgA異型的組合中，亦形成三聚體/四聚體IgA抗體。更進一步，可知藉由在SC-wt或SC12存在下使IgA抗體進行反應，可高效率地製作具有雙重特異性之三聚體/四聚體IgA抗體。
[序列表自由本文]
SEQ ID NO：1：IgA1恆定區域之胺基酸序列
SEQ ID NO：2：IgA2m2恆定區域之胺基酸序列
SEQ ID NO：3：野生型SC之胺基酸序列
SEQ ID NO：4：SC12之胺基酸序列
SEQ ID NO：5：含有訊號序列、凝血酶位點、His標識之野生型SC的胺基酸序列
SEQ ID NO：6：含有訊號序列、凝血酶位點、His標識之SC12的胺基酸序列
SEQ ID NO：7：含有訊號序列、凝血酶位點、His標識之野生型SC的核苷酸序列
SEQ ID NO：8：含有訊號序列、凝血酶位點、His標識之SC12的核苷酸序列
SEQ ID NO：9：18-18K的重鏈可變區域之核苷酸序列(H1特異)
SEQ ID NO：10：18-18K的重鏈可變區域之胺基酸序列(H1特異)
SEQ ID NO：11：18-18K的輕鏈可變區域之核苷酸序列(H1特異)
SEQ ID NO：12：18-18K的輕鏈可變區域之胺基酸序列(H1特異)
SEQ ID NO：13：15-19L的重鏈可變區域之核苷酸序列(H3特異)
SEQ ID NO：14：15-19L的重鏈可變區域之胺基酸序列(H3特異)
SEQ ID NO：15：15-19L的輕鏈可變區域之核苷酸序列(H3特異)
SEQ ID NO：16：15-19L的輕鏈可變區域之胺基酸序列(H3特異)
<110> 東興藥品工業股份有限公司(TOKO YAKUHIN KOGYO CO.,LTD.) 國立感染症研究所長代表之日本國(JAPAN as represented by DIRECTOR GENERAL of National Institute of Infectious Diseases)
<120> 多聚體IgA抗體之製造法及多重特異性多聚體IgA抗體
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<140> TW 110110021
<141> 2021-03-19
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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Figure 110110021-A0202-12-0036-1
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<213> 智人
<400> 2
Figure 110110021-A0202-12-0038-3
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<210> 3
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<212> PRT
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<211> 224
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> SC12
<400> 4
Figure 110110021-A0202-12-0042-9
Figure 110110021-A0202-12-0043-10
<210> 5
<211> 618
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> wild-type SC containing signal sequence,thrombin site,His tag
<400> 5
Figure 110110021-A0202-12-0043-11
Figure 110110021-A0202-12-0044-12
Figure 110110021-A0202-12-0045-13
Figure 110110021-A0202-12-0046-14
<210> 6
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> SC12 containing signal sequence,thrombin site,His tag
<400> 6
Figure 110110021-A0202-12-0046-15
Figure 110110021-A0202-12-0047-16
<210> 7
<211> 1857
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> wild-type SC containing signal sequence,thrombin site,His tag
<400> 7
Figure 110110021-A0202-12-0047-17
Figure 110110021-A0202-12-0048-18
<210> 8
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> SC12 containing signal sequence,thrombin site,His tag
<400> 8
Figure 110110021-A0202-12-0049-19
<210> 9
<211> 390
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
Figure 110110021-A0202-12-0049-20
<210> 10
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Figure 110110021-A0202-12-0050-21
<210> 11
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
Figure 110110021-A0202-12-0050-22
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Figure 110110021-A0202-12-0051-23
<210> 13
<211> 417
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
Figure 110110021-A0202-12-0051-25
<210> 14
<211> 139
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Figure 110110021-A0202-12-0052-26
<210> 15
<211> 399
<212> DNA
<213> 智人
<400> 15
Figure 110110021-A0202-12-0052-27
<210> 16
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Figure 110110021-A0202-12-0053-28
SC:分泌片

Claims (18)

  1. 一種三聚體及四聚體IgA抗體的製造方法，係包含：混合二聚體IgA抗體及單體IgA抗體。
  2. 如請求項1所述之製造方法，係更包含：混合分泌片。
  3. 如請求項1或2所述之製造方法，係製造至少雙重特異性的三聚體及四聚體IgA抗體，其中，前述二聚體IgA抗體包含第1抗原結合部位，前述單體IgA抗體包含第2抗原結合部位。
  4. 如請求項3所述之製造方法，係更混合：包含第3抗原結合部位之其他單體IgA抗體。
  5. 如請求項3所述之製造方法，其中，前述二聚體IgA抗體之4個Fab區域分別包含第1抗原結合部位，前述包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體之2個Fab區域分別包含第2抗原結合部位。
  6. 如請求項4所述之製造方法，其中，前述二聚體IgA抗體之4個Fab區域分別包含第1抗原結合部位，前述包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體之2個Fab區域分別包含第2抗原結合部位，前述其他單體IgA抗體之2個Fab區域分別包含第3抗原結合部位。
  7. 如請求項2至6中任一項所述之製造方法，其中，前述分泌片係野生型SC或SC變異體。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之製造方法，係包含：更混合選自分子伴護蛋白質、雙硫鍵異構酶、氧化型麩胱甘肽、及還原型麩胱甘肽所構成之群組中之至少1種物質。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之製造方法，其中，前述二聚體IgA抗體及前述單體IgA抗體分別為各自以培養細胞所製作的重組IgA抗體。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之製造方法，係更包含：將所製造之三聚體IgA抗體及四聚體IgA抗體從其他IgA抗體分離。
  11. 如請求項10所述之製造方法，係更包含：將所製造之三聚體IgA抗體與四聚體IgA抗體分離。
  12. 一種至少雙重特異性之三聚體或四聚體IgA抗體，係包含：包含第1抗原結合部位之第1 Fab區域、及包含第2抗原結合部位之第2 Fab區域。
  13. 如請求項12所述之抗體，係更包含：分泌片。
  14. 如請求項12所述之抗體，係由包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體1分子、及包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體1分子或2分子所成的聚合物。
  15. 如請求項13所述之抗體，係由包含第1抗原結合部位之二聚體IgA抗體1分子、包含第2抗原結合部位之單體IgA抗體1分子或2分子、及分泌片所成的聚合物。
  16. 如請求項12至15中任一項所述之抗體，係包含：4個第1 Fab區域、及至少2個第2 Fab區域。
  17. 如請求項13、15及16中任一項所述之抗體，其中，前述分泌片係野生型SC或SC變異體。
  18. 一種醫藥組成物，係包含：如請求項12至17中任一項所述之抗體。
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