WO2021193553A1 - 多量体ＩｇＡ抗体の作製法及び多重特異性多量体ＩｇＡ抗体 - Google Patents

多量体ＩｇＡ抗体の作製法及び多重特異性多量体ＩｇＡ抗体 Download PDF

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泰造 上下
耕史郎 田畑
忠樹 鈴木
長谷川　秀樹
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東興薬品工業株式会社
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    • C12Y306/04—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; involved in cellular and subcellular movement (3.6.4)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a multispecific IgA antibody, preferably a multispecific multimeric IgA antibody, and a multispecific multimeric IgA antibody.
  • IgA antibody which is the most produced antibody in the body, functions as a front-line defense factor for the body's defense against respiratory infections targeting mucosal tissues such as influenza.
  • This secretory IgA antibody forms a multimer of a dimer or more, and it has been clarified that the tetramer SIgA has higher functional activity than IgG or monomeric IgA.
  • Multispecific antibodies in which different variable regions are mounted on a plurality of Fabs existing in the antibody have been put into practical use.
  • Multispecific antibodies are technologies that are expected to be applied not only in antibody drugs but also in various fields such as the development of research tools and diagnostic agents.
  • the production method is complicated, and a great deal of labor is required to produce one multispecific antibody, so that the types of multispecific antibodies that have been put into practical use are limited.
  • An object of the present invention is to provide a method for easily and efficiently producing a multimeric IgA antibody, particularly a multispecific multispecific IgA antibody.
  • the present inventors mixed a dimeric IgA antibody, a monomeric IgA antibody, and a secretory component (hereinafter, also referred to as “SC”) prepared in separate cultured cells in vitro.
  • SC secretory component
  • bispecific trimer and tetramer IgA antibodies can be produced easily and efficiently, and the present invention has been completed.
  • bispecific trimer and tetramer IgA antibodies can be produced in the same manner when the secretory components are not mixed, although the efficiency is lower than when they are mixed.
  • the techniques of the present invention include not only bispecific trimers and tetramers, but also monospecific trimers and tetramers, and trispecific or higher multispecific trimers and tetramers. It can also be applied to the production of body antibodies.
  • the present invention comprises [1] a method for producing a trimer and a tetramer IgA antibody, which comprises mixing a dimeric IgA antibody and a monomeric IgA antibody. [2] The method according to [1], which comprises further mixing secretory components. [3] At least bispecific trimeric and tetrameric IgA antibodies, wherein the dimeric IgA antibody comprises a first antigen binding site and the monomeric IgA antibody comprises a second antigen binding site. The method according to [1] or [2], wherein [4] The method according to [3], wherein another monomeric IgA antibody containing a third antigen binding site is further mixed.
  • the four Fab regions of the dimer IgA antibody each contain a first antigen-binding site, and the two Fab regions of a monomeric IgA antibody containing the second antigen-binding site each contain a second antigen.
  • the four Fab regions of the dimer IgA antibody each contain a first antigen-binding site, and the two Fab regions of a monomeric IgA antibody containing the second antigen-binding site each contain a second antigen.
  • the method according to [4], wherein the two Fab regions of the other monomeric IgA antibody contain a binding site, each containing a third antigen binding site.
  • antibody [15] A polymer of one molecule of a dimeric IgA antibody containing a first antigen-binding site, one or two molecules of a monomeric IgA antibody containing a second antigen-binding site, and a secretory component.
  • the multimeric IgA antibody of the present invention carries four Fab regions derived from one dimeric IgA antibody and two or four Fab regions derived from a monomeric IgA antibody in one antibody molecule. Thereby, it is possible to have one kind or two or more kinds of Fab regions. Therefore, according to the present invention, a multimeric IgA antibody, particularly a multispecific multimeric IgA antibody, can be obtained.
  • the multimeric IgA antibody and the multispecific multispecific IgA antibody of the present invention have high antigen-binding or neutralizing activity for each antigen.
  • the dimer IgA antibody and the monomeric IgA antibody cannot be polymerized with each other in the method of the present invention, the dimer IgA antibody containing the first antigen binding site and the second antigen binding site
  • the trimer and tetramer IgA antibodies produced by the method of the present invention have a 100% probability of becoming multispecific antibodies.
  • the present invention comprises a simple method of simply mixing at least two proteins, a dimeric IgA antibody and a monomeric IgA antibody, in-vitro to a multimeric antibody, particularly a multispecific multimeric antibody, particularly a multispecific.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows an example of the production of the bispecific tetramer IgA antibody of this application.
  • the amino acid sequence of wild-type SC and the amino acid sequence of SC12-deficient mutant are shown.
  • the base sequence of wild-type SC is shown.
  • the nucleotide sequence of the SC12 deletion mutant is shown.
  • “mA1 + dA1 + SC12” shows the result of mixing the monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, and the SC12.
  • “MA1 + SC12” indicates the result of mixing the monomeric IgA1 antibody and SC12.
  • DA1 + SC12 indicates the result of mixing the dimer IgA1 antibody and SC12.
  • Tri / Tet IgA indicates a trimer and tetramer IgA1 antibody (control) produced intracellularly. It is a graph which shows the comparison of the IgA antibody tetramer formation promoting ability of SC12 and SC-wt.
  • mA1 + mC-dA1 + SC12 indicates the result of mixing the monomeric IgA1 antibody, the fluorescently labeled mCherry fusion dimer IgA1 antibody, and SC12.
  • “MA1 + mC-dA1 + SC-wt” shows the result of mixing the monomeric IgA1 antibody, the fluorescently labeled mCherry fusion dimer IgA1 antibody, and the wild-type SC.
  • “MC-mA1 + dA1 + SC12” shows the result of mixing the fluorescently labeled mCherry fusion type monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, and SC12.
  • “MC-mA1 + dA1 + SC-wt” shows the result of mixing the fluorescently labeled mCherry fusion type monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, and the wild type SC.
  • MC-mA1 + dA1 + SC12 shows the result of mixing the fluorescently labeled mCherry fusion type monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, and SC12.
  • MC-mA1 + dA1 + SC12 + Simple shows the result of mixing the fluorescently labeled mCherry fusion type monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, SC12, and the additive. It is a graph which shows the IgA antibody multimer formation efficiency in the presence of a wild-type SC with and without an additive (Supple).
  • mA1 + mC-dA1 + SC-wt shows the result of mixing the monomeric IgA1 antibody, the fluorescently labeled mCherry fusion dimer IgA1 antibody, and the wild-type SC.
  • MA1 + mC-dA1 + SC-wt + Supple shows the result of mixing the monomeric IgA1 antibody, the fluorescently labeled mCherry fusion dimer IgA1 antibody, the wild type SC, and the additive.
  • MC-mA1 + dA1 + SC-wt shows the result of mixing the fluorescently labeled mCherry fusion type monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, and the wild type SC.
  • MC-mA1 + dA1 + SC-wt + Supple shows the result of mixing the fluorescently labeled mCherry fusion type monomeric IgA1 antibody, the dimer IgA1 antibody, the wild type SC, and the additive. It is a graph which shows the IgA multimer formation promoting effect by each additive. It is a graph which shows the multimer formation efficiency by the difference (IgA1 and IgA2m2) of the constant region of IgA antibody. It is a graph which shows the difference of the multimer formation efficiency by the length of a reaction time.
  • Hetero indicates a combination of a monomer IgA2m2 (mA2) and a dimer IgA1 (dA1) having different specificities
  • Homo indicates a combination of mA2 and dA1 having the same specificity
  • Antibody is a protein called immunoglobulin (Ig) and has the ability to specifically bind to an antigen.
  • the antibody has a basic unit consisting of a total of four polypeptide chains, two heavy chains (H chain) and two light chains (L chain) arranged in a Y shape, and has one or more basic units. Units gather to form one antibody molecule.
  • the four polypeptide chains have a constant region with relatively little change in amino acid sequence (heavy chain constant region: CH1, CH2, CH3, and light chain constant region: CL), and a large change in amino acid sequence. There are variable regions (heavy chain variable region: VH, and light chain variable region: VL).
  • Multimer means an antibody containing two or more of the above basic units. As will be described later, the antibodies produced by the production method of the present application are trimer and tetramer antibodies. Thus, as used herein, “multimer” means a trimer or tetramer, or a mixture of trimers and tetramers.
  • the "Fab region” is a region containing an antigen-binding site, which is composed of a heavy chain VH and CH1 domain and a light chain VL and CL domain.
  • Multispecificity means that an antibody can specifically bind to two or more different epitopes (antigen determinants).
  • Bispecificity means that an antibody can specifically bind to two different epitopes.
  • Trispecificity means that an antibody can specifically bind to three different epitopes.
  • quadruple specificity, quintuple specificity, hexaspecific specificity, seven-fold specificity, and octuple specificity mean that antibodies are associated with 4, 5, 6, 7, and 8 different epitopes, respectively. It means that it can be specifically bound.
  • multispecific antibodies contain two or more antigen binding sites (paratopes), each specific for a different epitope.
  • the "different epitope” may be a different epitope on the same antigen, or may be an epitope on a different antigen.
  • Unispecificity means that an antibody has one or more antigen binding sites that bind to the same epitope of the same antigen.
  • Antigen binding site means a region on an antibody molecule that binds to an epitope.
  • Antigen binding sites include heavy chain VHs and light chain VLs.
  • the first, second, third, and fourth antigen binding sites are regions consisting of different amino acid sequences that bind to epitopes on different antigens or different epitopes on the same antigen. Means.
  • IgA is one of the antibody (immunoglobulin) isotypes. In the present specification, it is also referred to as "IgA antibody” or "IgA type antibody”. Human IgA is classified into two subclasses, IgA1 and IgA2, depending on the difference in the constant region. IgA2 is further divided into three allotypes, IgA2m1, IgA2m2, and IgA2 (n). IgA is mainly present as monomeric IgA in serum (serotype IgA), and IgA1 is a major component.
  • Multimer IgA When secreted into the mucosa, it exists as a dimer or more multimer IgA (secretory IgA or SIgA), and IgA2 occupies about half.
  • Multimer IgA is obtained by polymerizing two or more molecules of IgA with a J chain (Joining chain) or a J chain and SC. Some multimers IgA contain SC and some do not.
  • Dimer IgA generally refers to a molecule with a heavy chain: light chain: J chain ratio of 4: 4: 1.
  • SC secretory component
  • pIgR multimeric immunoglobulin receptor
  • D1 is essential for binding to multimeric IgA, and in particular, a structure similar to the CDR (complementarity determining region) of the variable region of immunoglobulin present in D1 plays an important role in binding to multimeric IgA. Carry.
  • PIgR is a type I transmembrane protein that belongs to the immunoglobulin superfamily and is expressed on the cell membrane on the basement membrane side of mucosal epithelial cells, and consists of an extracellular domain, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region.
  • pIgR specifically recognizes and binds to a multimer IgA molecule containing a J chain produced by plasma cells existing in the lamina intestinal, takes it into epithelial cells, and transports it to the apical side while being bound. ..
  • the proteolytic enzyme of epithelial cells cleaves between the extracellular domain of pIgR and the transmembrane region, and the multimer IgA is secreted into the luminal mucosal layer in a state of being bound to the extracellular domain portion of pIgR. (Secretory IgA or SIgA).
  • the extracellular domain of pIgR after cleavage corresponds to SC.
  • an IgA antibody containing SC in the molecule is referred to as a "secretory IgA antibody".
  • the "J chain” is a polypeptide having an N-linked sugar chain and having a molecular weight of about 15 kDa.
  • the J chain is highly conserved among organisms and is essential for the multimeric IgA to interact with pIgR.
  • a method for producing a trimer and tetramer IgA antibody which comprises mixing a dimer IgA antibody and a monomeric IgA antibody.
  • the manufacturing method of the present application also referred to as "the manufacturing method of the present application”
  • a method for producing a trimer and tetramer IgA antibody which comprises mixing a dimeric IgA antibody, a monomeric IgA antibody, and an SC.
  • one dimer IgA antibody and two monomeric IgA antibodies are polymerized to produce one tetramer IgA antibody.
  • one dimer IgA antibody, two monomeric IgA antibodies, and SC are polymerized to produce one tetramer IgA antibody (FIG. 1). .. Further, according to the production method of the present application, one dimer IgA antibody and one monomeric IgA antibody are polymerized to produce one trimer IgA antibody. Furthermore, according to the production method of the present application, one dimer IgA antibody, one monomeric IgA antibody, and SC are polymerized to produce one trimer IgA antibody.
  • the dimeric IgA antibody and the monomeric IgA antibody to be mixed may each contain different variable regions, or may contain the same variable region. If all variable regions of the dimeric IgA antibody and the monomeric IgA antibody are the same, the resulting trimeric and tetrameric IgA antibodies are monospecific antibodies.
  • the dimeric IgA antibody and the monomeric IgA antibody contain two or more different variable regions, a double to octuple, multispecific antibody is obtained. For example, double with a dimeric IgA antibody in which all four Fab regions contain a first antigen binding site and a monomeric IgA antibody in which both of the two Fab regions contain a second antigen binding site. Specific trimeric and tetrameric IgA antibodies may be obtained.
  • a dimeric IgA antibody in which all four Fab regions contain a first antigen-binding site, a first monomeric IgA antibody in which both of the two Fab regions contain a second antigen-binding site, and 2 A trispecific tetramer IgA antibody may be obtained using a second monomeric IgA antibody in which both of the Fab regions contain a third antigen binding site.
  • IgA antibodies and triple or tetraspecific tetrameric IgA antibodies may be obtained.
  • the desired double or hexafold multispecific trimeric IgA antibody and the desired double are obtained.
  • eight-fold multispecific tetramer IgA antibody can be obtained.
  • a preferred embodiment of the present invention comprises mixing a dimeric IgA antibody comprising a first antigen binding site and a monomeric IgA antibody comprising a second antigen binding site, or a first antigen binding site.
  • a method for producing at least bispecific trimeric and tetrameric IgA antibodies which comprises mixing a dimer IgA antibody containing, a monomeric IgA antibody containing a second antigen binding site, and an SC.
  • the dimeric IgA antibodies do not polymerize with each other, and the monomeric IgA antibodies do not polymerize with each other. Therefore, when a dimer IgA antibody containing a first antigen-binding site and a monomeric IgA antibody containing a second antigen-binding site are mixed, or a dimer IgA antibody containing a first antigen-binding site When SC is mixed with a monomeric IgA antibody containing a second antigen-binding site, at least bispecific trimeric and tetrameric IgA antibodies can be obtained with a 100% probability.
  • the 458th amino acid residue in the heavy chain constant region of the dimeric IgA antibody and / or the monomeric IgA antibody to be mixed is a hydrophobic amino acid.
  • the hydrophobic amino acid include isoleucine, leucine, methionine, tryptophan, and glycine, and preferred examples include isoleucine.
  • the heavy chain constant region of such an IgA antibody may consist of a natural sequence, or the amino acid residue at position 458 may be modified to a hydrophobic amino acid by a gene recombination technique.
  • the present invention when an IgA2m2 antibody in which the 458th amino acid residue in the heavy chain constant region is isoleucine is used, only the IgA1 antibody in which the 458th amino acid residue in the heavy chain constant region is other than a hydrophobic amino acid is used.
  • the formation efficiency of the multimer IgA antibody was increased as compared with the case of using (Example 5).
  • the amino acid sequence of the constant region of IgA1 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the constant region of IgA2m2 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • SC either a wild-type SC or an SC mutant may be used.
  • SC mutant include an SC mutant containing at least domain D1, and for example, a mutant lacking one or more domains of SC domains D2 to D5 or a part of a region of D2 to D5.
  • SC variant containing at least domains D1 and D2, a deleted variant of SC domains D4 and D5, and a variant lacking all of SC domains D3 to D5 (referred to herein as "SC12").
  • SC12 a variant lacking all of SC domains D3 to D5
  • SC wild-type SC
  • SC12 SEQ ID NO: 4
  • SC variants include, for example, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. %, At least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and at least 99% of polypeptides consisting of amino acid sequences having sequence identity.
  • SC may or may not be used, and SC is preferably used. The use of SC improves the efficiency of trimer and / or tetramer IgA antibody formation.
  • the origin of the IgA antibody used in the production method of the present application is not particularly limited, and examples thereof include human antibody, non-human mammalian antibody, rodent-derived antibody, and bird-derived antibody.
  • the antigen to which the IgA antibody specifically binds is not particularly limited.
  • Appropriate IgA antibodies may be selected to produce the desired trimer IgA antibody and / or tetrameric IgA antibody.
  • the subclass of IgA antibody used in the production method of the present application may be either IgA1 or IgA2, or both IgA1 and IgA2 may be used.
  • both IgA1 and IgA2 may be used.
  • a dimeric IgA1 antibody and a monomeric IgA2 antibody may be used.
  • any allotype of IgA2 may be used.
  • the IgA antibody used in the production method of the present application may be a natural IgA antibody or a recombinant IgA antibody.
  • the "recombinant antibody” includes an antibody obtained by modifying a natural antibody sequence and an antibody artificially produced by a gene recombination technique regardless of the presence or absence of the sequence modification.
  • a recombinant IgA antibody obtained by converting a non-IgA type antibody into an IgA type may be used.
  • non-IgA type antibodies include IgG antibody, IgM antibody, IgE antibody, IgD antibody, and IgY antibody.
  • the origin of the non-IgA type antibody is not particularly limited, and examples thereof include human antibody, non-human mammalian antibody, rodent-derived antibody, and bird-derived antibody.
  • recombinant IgA antibodies made by transplanting the variable region of an IgG antibody into the backbone framework of an IgA antibody or by transplanting only the CDR of an IgG antibody into the CDR of an IgA antibody may be used.
  • the recombinant IgA antibody includes a chimeric recombinant IgA antibody that combines a variable region of an antibody derived from one animal species and a constant region of an IgA antibody derived from another animal species, and a complementarity determining region of an antibody derived from a certain animal species.
  • CDRs complementarity determining region of an antibody derived from a certain animal species.
  • Genetically modified technology is well known in the art.
  • the "IgA antibody” means an antibody having an amino acid sequence derived from at least a part of the IgA antibody.
  • the dimeric IgA antibody used in the production method of the present application preferably does not contain SC.
  • the dimeric IgA antibody used in the production method of the present application contains a J chain.
  • the dimeric IgA antibody and the monomeric IgA antibody to be mixed may be prepared by a method known in the art.
  • the dimeric IgA antibody and the monomeric IgA antibody may be separately prepared in cultured cells.
  • the dimeric IgA antibody may be prepared, for example, by co-expressing the heavy chain protein, light chain protein and J chain constituting the IgA antibody in one host cell.
  • the monomeric IgA antibody may be prepared, for example, by co-expressing the heavy chain protein and the light chain protein constituting the IgA antibody in one host cell.
  • host cells include mammalian cells, insect cells, bacteria, yeast and the like.
  • mammalian cells include, but are not limited to, 293F cells, CHO cells and the like.
  • insect cell include, but are not limited to, an Sf9 cell line, an Sf21 cell line, and the like.
  • Step of co-expressing the above proteins in one host cell.
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding these proteins may be introduced into the cell.
  • Expression vectors and introduction methods are well known in the art.
  • a phage vector, a viral vector, a plasmid vector or the like can be used, and a vector suitable for the host is appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the cells are cultured to express the desired protein. Cell culture conditions are appropriately selected by those skilled in the art.
  • molecular chapelon protein disulfide bond isomerase, oxidized glutathione, and oxidized glutathione, and At least one substance selected from the group consisting of reduced glutathione may be further mixed.
  • Molecular chaperone proteins are proteins that contribute to the folding of protein molecules.
  • Molecular chaperone proteins include Hsp60 family, Hsp70 family, Hsp90 family, Hsp100 family, low molecular weight Hsp family, isomerases, and cofactors thereof, and examples thereof include Dnak, DnaJ, GrpE, GroE, GroEL, and GroES. Two or more molecular chaperone proteins may be used.
  • Disulfide bond isomerases are enzymes that contribute to disulfide bonds between amino acid residues. Oxidized glutathione creates the oxidative conditions necessary to form disulfide bonds. The use of at least one of these substances promotes tetramer formation of IgA antibodies.
  • At least two substances selected from the group consisting of molecular chapelone protein, disulfide bond isomerase, oxidized glutathione, and reduced glutathione may be further mixed, and more preferably, molecular chapelone.
  • the protein, disulfide bond isomerase and oxidized glutathione are further mixed.
  • at least one substance selected from the group consisting of a molecular chaperone protein and a disulfide bond isomerase may be further mixed.
  • a dimer IgA antibody and a monomeric IgA antibody or a dimer IgA antibody, a monomeric IgA antibody, and an SC, or a dimeric IgA antibody, a monomeric IgA antibody, and a molecular chapelon.
  • Mixing of at least one substance selected from the group consisting of oxidized glutathione and reduced glutathione may be carried out in a buffer solution adjusted to pH 6 to 10, preferably pH 7 to 8.
  • the buffer solution include, but are not limited to, a phosphate buffer solution, a Tris-hydrochloric acid buffer solution, a Good's buffer solution, and the like.
  • An appropriate temperature at the time of mixing can be appropriately determined by those skilled in the art, and is, for example, 25 ° C. to 45 ° C., preferably 30 ° C. to 43 ° C., more preferably 35 ° C. to 40 ° C., for example, around 37 ° C.
  • the mixing time is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art based on other conditions such as reaction volume, and is, for example, 6 hours or more, 12 hours or more, 24 hours or more, or 48 hours or more. It may be about 24 hours to 72 hours.
  • the mixing ratio of dimer IgA antibody and monomeric IgA antibody is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the trimeric and tetrameric IgA antibodies thus produced are separated from other IgA antibodies (dimeric IgA antibody and monomeric IgA antibody that have not been multimerized) based on their molecular size and other characteristics.
  • the trimeric IgA antibody and the tetrameric IgA antibody can also be separated from each other.
  • the production method of the present application may further include a step of separating the trimer IgA antibody and the tetramer IgA antibody from other IgA antibodies.
  • trimer and tetramer IgA antibodies produced by the production method of the present application can be confirmed by a known method such as ELISA method, size exclusion chromatography, affinity chromatography and the like.
  • Most of the multimeric IgA antibodies produced by the production method of the present application are tetrameric IgA antibodies. Therefore, according to the production method of the present application, a mixture of a trimeric IgA antibody and a tetrameric IgA antibody containing a higher proportion of the tetramer IgA antibody than the trimeric IgA antibody can be obtained.
  • Multispecific Multimeric IgA Antibodies In a second aspect of the invention, at least double, comprising a first Fab region containing a first antigen binding site and a second Fab region containing a second antigen binding site. Specific trimeric or tetrameric IgA antibodies are provided (hereinafter, also referred to as “multispecific multimeric IgA antibodies of the present application”). As a further aspect of the multispecific multimeric IgA antibody of the present application, at least a dual, comprising a first Fab region containing a first antigen binding site, a second Fab region containing a second antigen binding site, and SC. Specific trimeric or tetrameric IgA antibodies are provided. The multispecific multimeric IgA antibody of the present application is preferably obtained by the above-mentioned production method of the present application.
  • the multispecific multimeric IgA antibody is preferably a polymer of one dimeric IgA antibody and one or two monomeric IgA antibodies.
  • the multispecific multimeric IgA antibody is more preferably a polymer of one dimeric IgA antibody, one or two monomeric IgA antibodies, and SC.
  • one dimeric IgA antibody and one or two monomeric IgA antibodies are trimeric or tetrameric via SC.
  • the dimeric IgA antibody comprises a first antigen binding site and the monomeric IgA antibody comprises a second antigen binding site.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application comprises four first Fab regions and at least two second Fab regions.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application comprises four first Fab regions, at least two second Fab regions, and SC.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application is a bispecific trimeric IgA antibody containing four first Fab regions and two second Fab regions, or four first Fab regions.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application is a bispecific trimeric IgA antibody containing four first Fab regions, two second Fab regions and SC, or four third.
  • Bispecific tetramer IgA antibody containing 1 Fab region, 4 2nd Fab regions and SC, or 4 1st Fab regions, 2 2nd Fab regions, 2 3rd Fab regions And SC may be a trispecific tetrameric IgA antibody.
  • the four first Fab regions are derived from a dimeric IgA antibody and the two or four second or third Fab regions are derived from a monomeric IgA antibody.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application may be either IgA1 or IgA2, or may contain both.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application may contain both IgA1 or IgA2.
  • the multispecific multimeric IgA antibody may contain four Fab regions from the dimer IgA1 and two or four Fab regions from the monomeric IgA2.
  • the IgA2 contained in the multispecific multimeric IgA antibody of the present application may be IgA2m1, IgA2m2, or IgA2 (n).
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application may have a hydrophobic amino acid at the 458th amino acid residue in the heavy chain constant region.
  • hydrophobic amino acid examples include isoleucine, leucine, methionine, tryptophan, and glycine, and preferred examples include isoleucine.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application may be a recombinant IgA antibody.
  • the multispecific multimeric IgA antibody of the present application is a polymer of one dimeric IgA antibody and one or two monomeric IgA antibodies, or one dimeric IgA antibody and one.
  • any or all of the dimeric IgA antibody and the monomeric IgA antibody may be recombinant IgA antibodies.
  • the IgA antibody and SC constituting the multispecific multispecific IgA antibody of the present application are as described in "2. Method for producing multispecific IgA antibody" above.
  • composition of the present application a pharmaceutical composition containing the multispecific multimeric IgA antibody of the present application is provided (hereinafter, also referred to as “pharmaceutical composition of the present application”).
  • the pharmaceutical composition of the present application preferably contains the multispecific multimeric IgA antibody of the present application or a mixture of the multispecific multimeric IgA antibody as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present application can be used, for example, for the treatment, prevention, diagnosis, etc. of a disease.
  • the target disease for which the pharmaceutical composition of the present application is used is not particularly limited, and examples thereof include infectious diseases, such as infectious diseases caused by pathogens such as parasites, bacteria, fungi, viruses, and abnormal prions, and malignant tumors. Further examples of infections include influenza virus infection, RS virus infection, Ebola virus infection, severe febrile thrombocytopenia syndrome (SFTS), severe acute respiratory syndrome (SARS), Middle East respiratory syndrome (MERS), acquired. Mucosal infections such as immunodeficiency syndrome (AIDS) can be mentioned.
  • the multispecific multimeric IgA antibody contained in the pharmaceutical composition of the present application has an antigen-binding site suitable for the purpose of use of the pharmaceutical composition.
  • a multispecific multimeric IgA that specifically binds to two different proteins (for example, causative protein, marker protein, etc.) related to one target disease.
  • Antibodies can be used.
  • the multispecific multimeric IgA antibody contained in the pharmaceutical composition of the present application may specifically bind to the HA protein and NA protein of influenza virus, respectively.
  • the multispecific multimeric IgA antibody contained in the pharmaceutical composition of the present application may specifically bind to a protein specific to a target cell and a protein effective for treatment.
  • antigens or epitopes that can be targeted by the multispecific multimeric IgA antibody contained in the pharmaceutical composition of the present application include, but are not limited to, multiple epitopes of the Evolavirus glycoprotein and SFTS virus glycoprotein. Examples thereof include Gn protein and Gc protein, lymphocyte marker proteins such as CD3 and CD8, and cancer-specific antigens.
  • the pharmaceutical composition of the present application can be formulated and administered in a dosage form such as a powder or a liquid.
  • the pharmaceutical composition of the present application may further contain excipients, additives, thickeners and the like known in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be administered by spraying onto the nasal mucosa, administration by inhalation into the lower respiratory tract using a nebulizer, or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be intended for humans, or non-human mammals such as domestic animals such as horses, cows, goats, sheep and pigs, pet animals such as dogs and cats, chimpanzees. , Gorilla, chimpanzee and other primates, mice, rats, guinea pigs and other rodents and the like.
  • non-human mammals such as domestic animals such as horses, cows, goats, sheep and pigs, pet animals such as dogs and cats, chimpanzees. , Gorilla, chimpanzee and other primates, mice, rats, guinea pigs and other rodents and the like.
  • any of the heavy chain, light chain, SC, and J chain of the multispecific multimeric IgA antibody contained in the pharmaceutical composition of the present application is derived from the target animal of the pharmaceutical composition (the target animal type). ) It is preferable to include an amino acid sequence. More preferably, the heavy chain, light chain, SC, and J chain of the multispecific multimeric IgA antibody contained in the pharmaceutical composition of the present application are all derived from the target animal of the pharmaceutical composition (target animal). Contains the amino acid sequence (which is the type).
  • the target animal type means the IgA heavy chain and the IgA light chain of the target animal in which the constant region of the heavy chain and the light chain of the multispecific multimeric IgA antibody is the target.
  • the target animal type means that the SC and J chains of the multispecific multimeric IgA antibody have the amino acid sequences of the SC and J chains of the target animal. do.
  • the amino acid sequences of IgA heavy chain, IgA light chain, SC and J chain may contain mutations as long as they have the antigen-binding activity of interest.
  • ⁇ 1 heavy chain which is a constant region of human IgA1
  • HC ⁇ 1 heavy chain
  • primer is a human IgA1 antibody constant using an appropriate primer set that amplifies the IgA1 antibody constant region containing sites recognized by the restriction enzymes XhoI and HindIII.
  • the region gene was amplified by PCR.
  • the PCR conditions were 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C.
  • ⁇ 1HC which contains a site recognized by XhoI and HindIII and is an IgG1 antibody constant region excluding the signal sequence, is removed.
  • PCR was performed with the appropriate primer set for this.
  • the PCR conditions were 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds for 30 cycles.
  • the PCR product was purified using MonoFas DNA Purification Kit I (GL Sciences Inc., Tokyo, Japan).
  • the purified ⁇ 1HC and ⁇ 1HC were removed from the T.I.
  • the expression vector of Tiller et al. was treated with XhoI (New England Biolabs) and HindIII-HF (New England Biolabs) at 37 ° C. with restriction enzymes.
  • Purification of restriction enzyme products was performed using MonoFas DNA Purification Kit I.
  • Ligation of restriction enzyme-treated DNA was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (Thermo Fisher Scientific), and the entire amount was transformed into Competent Quick DH5 ⁇ at 42 ° C.
  • the plasmid extraction was performed by PureYield TM plasmid Miniprep System (Promega).
  • the extracted plasmid was sequenced using Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer.
  • the sequencing reaction was carried out using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceting Kit, and the purification was carried out by the BigDye Terminator TM Kit. As mentioned above, all the operations were carried out according
  • the ⁇ 2m2 HC which is an allotype of human IgA2, is codon-optimized for humans from the sequences (Accession number, ⁇ 2m2 HC is M60192 and AJ012264) registered in IMGT / GENE-DB, and artificially synthesized (GeneArt Strings DNA). Fragments).
  • ⁇ 2m2 HC is M60192 and AJ012264 registered in IMGT / GENE-DB, and artificially synthesized (GeneArt Strings DNA). Fragments).
  • the codons of the last amino acid alanine in the variable region and the first amino acid serine in the constant region were reorganized to prepare a NheI cleavage site.
  • F045-092 Cloning of antibody variable region genes into ⁇ 1, ⁇ 2m2 HC, and ⁇ LC expression vectors F045-092, known as an antibody clone that broadly binds to hemagglutinin (HA) of influenza virus (H3N2), was used. F045-092 is codon-optimized for humans using sequences registered in Nucleotide (Acclusion number has AB649270 for heavy chain and AB649271 for light chain), and ⁇ 1 HC (heavy chain) and ⁇ 2m2 HC (heavy chain), respectively. And ⁇ LC ( ⁇ chain) were adjusted so that they could be incorporated into an expression vector and artificially synthesized (GeneArt Strings DNA Fragments).
  • PCR was performed using a primer set in which a recognition sequence for the restriction enzyme AgeI was added to the 5'and 3'ends and PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio) to specifically amplify the sequence of the fluorescent protein mCherry. .. Then, each IgA ⁇ mutant and mCherry were treated with restriction enzymes using the restriction enzyme AgeI (New England Biolabs) under the optimum conditions, and then subjected to agarose gel electrophoresis to digest the target product by the restriction enzymes. Only the band was recovered.
  • AgeI New England Biolabs
  • the plasmid DNA extraction was performed by PureYield plasmid Miniprep System (Promega), and the sequence sequence was analyzed by using the Sanger method.
  • mCherry was added to the 5'side of the sequence encoding IgA1 ⁇ and IgA2m2 ⁇ .
  • IgA ⁇ mutants fused with this fluorescent protein mCherry were used as mC-A1 antibody and mC-A2 antibody, respectively. All the operations performed followed the attached instructions.
  • J chain and secretory component (SC) J chain (GenBank accession no. NM_144646) is artificially added with the XhoI recognition sequence and Kozak sequence on the 5'side of the coding sequence and the NotI recognition sequence on the 3'side. It was artificially synthesized by a gene synthesis service (Eurofin Genomics). Then, using XhoI (New England Biolabs) and NotI-HF (New England Biolabs), restriction enzyme treatment was performed under the optimum conditions, and the pCXSN vector, which is an expression vector for cultured mammalian cells under the same conditions, was also used. Restriction enzyme treatment was performed.
  • Ligation of restriction enzyme-treated DNA was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (Thermo Fisher Scientific), and a part of the DNA was transformed into Competent Quick DH5 ⁇ at 42 ° C.
  • the plasmid extraction was performed by PureYield TM plasmid Miniprep System (Promega).
  • the extracted plasmid was sequenced using Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer.
  • the sequencing reaction was carried out using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceting Kit, and the purification was carried out by the BigDye Terminator TM Kit. As mentioned above, all the operations were carried out according to the attached manual.
  • the wild-type SC uses 1809 bp (including the signal sequence) from the 5'end of pIgR (GenBank accession no. NM_002644), and the XhoI recognition sequence and the kozak sequence, 3 on the 5'side of the SC sequence.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 7) containing a Hind III recognition sequence, a Trombin cleavage sequence, and 6x His tag on the'side was artificially synthesized using GeneArt® Strings DNA Fragments (Life Technologies). The synthesized DNA fragment was subjected to PCR using PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio, Kusatsu, Japan) to purify the DNA.
  • restriction enzyme treatment was performed using XhoI and HindIII under the optimum conditions, and the pCXSN vector, which is an expression vector for cultured mammalian cells, was also treated with restriction enzymes under the same conditions.
  • Ligation of restriction enzyme-treated DNA was performed using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (Thermo Fisher Scientific), and a part of the DNA was transformed into Competent Quick DH5 ⁇ at 42 ° C.
  • the plasmid extraction was performed by PureYield TM plasmid Miniprep System (Promega). The extracted plasmid was sequenced using Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer.
  • the sequencing reaction was carried out using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceting Kit, and the purification was carried out by the BigDye Terminator TM Kit. As mentioned above, all the operations were carried out according to the attached manual. All the operations performed followed the attached instructions.
  • the gene sequence encoding SC-wt is shown in Figure 2-2.
  • the purified DNA fragment was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (Takara Bio, Kusatsu, Japan), and was ring-shaped by T4 DNA ligase (Takara Bio, Kusatsu, Japan).
  • T4 polynucleotide kinase Takara Bio, Kusatsu, Japan
  • T4 DNA ligase Takara Bio, Kusatsu, Japan
  • the plasmid DNA SEQ ID NO: 8 encoding the cyclized deletion mutant was subjected to E. coli.
  • COL DH5 ⁇ Competent Cells (Takara Bio, Kusatsu, Japan) were transformed at 42 ° C.
  • Plasma DNA extraction was performed by PureYield plasmid Miniprep System. The extracted plasmid was sequenced using Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer.
  • the sequencing reaction was carried out using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceting Kit, and the purification was carried out by the BigDye Terminator TM Kit. As mentioned above, all the operations were carried out according to the attached manual. All the operations performed followed the attached instructions.
  • the gene sequence encoding the SC12 deletion mutant is shown in FIG. 2-3.
  • the constituent molecules of the monomeric IgA antibody are heavy chain and light chain, and the dimeric IgA antibody is composed of heavy chain, light chain and J chain. ..
  • the plasmid DNA expressing the molecules constituting the monomer and dimeric IgA antibody was added to Expi293F human cell (Thermo Fisher Scientific) 2.9 x 10 6 cells / mL, which is a mammalian cultured cell derived from human kidney cells. They were co-introduced using the Expression System Kit (Thermo Fisher Scientific, Western, plasmid, USA). Then, the cells were cultured with shaking at 37 ° C., 8% CO 2 , and 120 rpm, and the cell culture solution was collected one week later.
  • mC-A1 and mC-A2 antibodies Since the mC-A1 and mC-A2 antibodies do not have a light chain, the plasmid DNA encoding each heavy chain and J chain can be fed from human kidney cells, respectively.
  • Expi293F human cell (Thermo Fisher Scientific) 2.9 x 10 6 cells / mL was introduced with Expi293 Expression System Kit (Thermo Fisher Scientific) using cultured cells. Then, the cells were cultured with shaking at 37 ° C., 8% CO 2 , and 120 rpm, and the cell culture solution was collected one week later.
  • the recombinant IgA antibody and mC-A1 / 2 purified and recovered cell culture solution were centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes to remove debris such as cells, and only the culture supernatant was recovered. In addition, this centrifugation operation was performed twice in total. Then, the supernatant was filtered using a glass fiber filter and a stericup (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Purification of recombinant IgA antibody and mC-A1 / 2 was carried out using CaptureSelect IgA Infinity Matrix (Thermo Fisher Scientific), which specifically recognizes the constant region of human IgA antibody. The purification method was carried out according to the instructions.
  • the purification method is briefly described below.
  • the column is equilibrated with 10 CV PBS and the filtered culture supernatant is loaded onto the column.
  • the column was washed with 10 CV PBS, the antibody was eluted with 5 CV 0.1 M Glycine-HCl (pH 3.0) and the eluate was neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 8.0).
  • Antibody enrichment was performed using Amicon® Ultra Centrifugal Filter Devices (Millipore) according to the instructions.
  • the plasmid DNA encoding SC12 was added to Expi293F human cell (Thermo Fisher Scientific) 2.9x10 6 cells / mL, which is a mammalian cultured cell derived from human kidney cells. The gene was introduced using. Then, the cells were cultured with shaking at 37 ° C., 8% CO 2 , and 120 rpm, and the cell culture solution was collected one week later. Then, the collected cell culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes to remove debris such as cells, and only the culture supernatant was collected. In addition, this centrifugation operation was performed twice in total.
  • SC12 in the culture supernatant was purified using an affinity column packed with Ni Sepharose excel (GE Healthcare) that recognizes the C-terminal His tag of each protein.
  • the equilibrium solution is 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7.4
  • the wash solution is 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4
  • the eluent is 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4 was used.
  • the equilibration solution was passed through 5 CV (column volume) to equilibrate the column, and then the culture supernatant was passed through.
  • Example 1 Extracellular IgA antibody formation
  • HC heavy chains
  • LC light chains
  • JC J chains
  • SC co-expressing
  • the IgA antibody's ability to promote trimeric and tetramer formation possessed by this SC is the trimeric and tetramer IgA antibody (Tri /) formed by the interaction of four types of proteins coexisting in the cell. It was evaluated by measuring Tet IgA). Therefore, it was evaluated whether SC functions as a promoter of multimeric IgA antibody formation from each isolated protein produced from different cells under extracellular conditions rather than the intracellular environment.
  • SC12 composed of domains 1 and 2 of SC was shown to have higher intracellular trimer and tetramer formation promoting ability than SC-wt, in this example, it was designated as SC. SC12 was used.
  • the HPLC system used was Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies), and the column used was KW404-4F (shodex).
  • a phosphate buffer pH 7.4 was used as the eluent, and the flow rate was 0.2 mL / min.
  • 9 ⁇ L of each IgA antibody mixture was used.
  • the chromatogram was analyzed using OpenLAB CDS ChemStation Edition (Agilent Technologies).
  • mA1 + dA1 + SC12 indicates the result of mixing the monomeric IgA antibody, the dimer IgA antibody, and SC12.
  • MA1 + SC12 indicates the result of mixing the monomeric IgA antibody and SC12.
  • DA1 + SC12 indicates the result of mixing the dimer IgA antibody and SC12.
  • trimer / tetramer IgA antibody can be formed extracellularly as well as intracellularly. Furthermore, it was shown that the monomers and dimers do not polymerize with each other. Therefore, it was found that the trimer / tetramer IgA antibody is formed by the polymerization of the dimer IgA antibody and the monomeric IgA antibody.
  • Example 2 Comparison of multimeric IgA antibody formation in the presence of SC12 and SC-wt
  • a multimeric IgA antibody was formed by mixing SC, a monomer, and a dimeric IgA antibody extracellularly, indicating that SC contributes to the formation of the multimeric IgA antibody. ..
  • previous studies by the inventors have shown that SC12 has a higher ability to promote trimer / tetramer formation than SC-wt under intracellular conditions. Therefore, in order to search for a method for efficiently producing a trimer / tetramer IgA antibody under extracellular conditions, the tetramer formation promoting ability of SC12 and SC-wt was compared.
  • the trimer / tetramer IgA produced in the reaction solution was detected by the ELISA method.
  • the ELISA method was performed as follows. 50 ⁇ l of recombinant HA (derived from A / Sydney / 5/1997 (H3N2), 5 ⁇ g HA / mL) was immobilized overnight at 4 ° C. on a 96-well half plate, and then 1% BSA-PBS was added to room temperature for 1 hour. Blocking was performed. Then, a 3-fold serial dilution series of 200-fold diluted antibody samples was prepared, added to each well, and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • the IgA antibodies used in this experiment are mC-A1 and IgA antibodies having a Fab region containing the variable region of F045-092, and these antibodies have the same constant region but different variable regions. That is, the method for producing a multimeric IgA antibody of the present application is a variable region-independent type, and it is possible to produce a double or more specificity, preferably a double or triple specificity IgA antibody having different specificities. Furthermore, it was shown that even if the dimer IgA antibody and the monomeric IgA antibody have different variable regions, the multimer IgA antibody can be formed.
  • Example 3 Identification of factors involved in promoting multimer formation 1
  • Example 2 revealed that SC12 has a higher ability to promote multimer formation of IgA antibody than SC-wt. Therefore, in order to further enhance multimer formation, the addition of protein components other than SC and IgA antibodies was examined.
  • the final concentrations of SC12, SC-wt, mA1 and dA1 and mC-mA1 and mC-dA1 prepared as described above were 0.5 mg / mL, respectively, and the additive (Suple) was added to a phosphate buffer solution (pH 7.4). It was mixed in and reacted at 37 ° C. for 6 hours using a rotator. Supple contains chaperone proteins DnaK Mix (5 ⁇ M DnaK, 1 ⁇ M DnaJ, 1 ⁇ M GrpE) and GroE Mix (0.5 ⁇ M GroEL, 1 ⁇ M GroES), disulfide bond isomerase DsbC (375 ⁇ g / mL), and oxidized glutathione. .. Trimer / tetramer IgA produced in the reaction solution was detected by the ELISA method in the same manner as in Example 2.
  • FIGS. 5A and 5B The results are shown in FIGS. 5A and 5B.
  • an increase in the OD value which is an index of trimer / tetramer IgA formation, was observed by adding Supple to both the mixed solution of "mA1 + mC-dA1" and "mC-mA1 + dA1".
  • the OD value increased more than twice in both mixed solutions.
  • the addition of Supple was found to significantly increase the OD value to the same extent as SC12 (Fig. 5B).
  • Example 4 Identification of factors involved in promoting multimer formation 2
  • the contribution of each factor to multimer formation was evaluated by reacting mC-mA1 and dA1 alone in the presence of SC12 with each of the four major constituent factors contained in Supple.
  • the reaction and detection were carried out in the same manner as in Example 3 except that DnaK Mix, GroE Mix, GSSG, or DsbC was added alone as an additive.
  • Example 5 Identification of factors involved in promoting multimer formation 3
  • IgA antibodies are classified into two subclasses, IgA1 and IgA2, according to the difference in constant region, and IgA2 is further divided into three allotypes, IgA2m1, IgA2m2, and IgA2 (n).
  • Patent Document 1 the efficiency of trimer / tetramer IgA antibody formation was different under intracellular conditions due to the difference in these constant regions.
  • the mC-A1 and mC-A2 prepared as described above were reacted by adding SC12 to the combination of the monomer and the dimer IgA antibody in the same manner as in Example 3, and then adding Supple to react, and then the trimer / Tetramer IgA formation was evaluated.
  • Example 6 Identification of factors involved in promoting multimer formation 4
  • the reaction time was examined as a factor affecting the multimerization of IgA antibody.
  • mC-mA1 and dA1 were reacted in phosphate buffer (pH 7.4) at 37 ° C. Samples were collected 6 hours, 12 hours, and 24 hours after the start of the reaction and evaluated for trimer / tetramer IgA formation by ELISA.
  • Example 7 Evaluation of bispecific IgA antibody using different subtypes of HA
  • Example 2 by mixing the monomer and dimer of the mCherry fusion IgA antibody in the presence of SC-wt and SC12, a trimer / tetramer IgA antibody with different variable regions is formed. It revealed that. Furthermore, in Example 5, the difference in multimer formation efficiency due to the difference in the subclass of IgA antibody was also clarified. Therefore, in this example, a trimer formed by the method of the present application using two types of influenza virus protein HA with different subtypes to which a detection tag is added and an IgA antibody clone having specificity for each HA. The bispecificity of the / tetrameric IgA antibody was verified.
  • H1 and H3 which are antibody clones having specificity for H1 and H3 subtypes of influenza A. These clones were isolated from subjects in clinical trials of the nasal influenza vaccine.
  • the variable regions derived from these antibodies were cloned into the expression vectors of ⁇ 1 HC, ⁇ 2m2 HC, and ⁇ LC by the same method as described above, and converted into influenza virus A / California / 7/2009 (H1N1) (H1 / HA).
  • Antibodies and dimeric IgA1 antibodies were prepared.
  • the gene sequence of the heavy chain variable region of 18-18K (H1) is shown in SEQ ID NO: 9
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10
  • the gene sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the gene sequence of the heavy chain variable region of 15-19L (H3) is shown in SEQ ID NO: 13
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14
  • the gene sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 15
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • SC and SC12 were also prepared as described above.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 12 hours using a thermal cycler. Trimer / tetramer IgA produced in the reaction solution was detected by the ELISA method.
  • the ELISA method was performed as follows. Recombinant H3 / HA-Strept (A / New York / 39/2012 (H3N2) derived, 5 ⁇ g HA / mL) with 40 ⁇ l strept tag added to a 384-well plate was solid-phased at 4 ° C. overnight and then 1% BSA. -PBS was added and blocking was performed at room temperature for 1 hour. Then, a 2-fold serial dilution series of 100-fold diluted antibody samples was prepared, added to each well, and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • H1 / HA-His (derived from A / California / 7/2009 (H1N1), 1 ⁇ g HA / mL) with a 40 ⁇ l His tag added was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. I let you.
  • 40 ⁇ l of 6000-fold diluted mAb-HRP-DirecT (MBL) was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • a color reaction was carried out using Immobilon Western Chemilum HRP Substrate (MERCK), and the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured.
  • MERCK Immobilon Western Chemilum HRP Substrate
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of IgA1 constant region SEQ ID NO: 2; Amino acid sequence of IgA2m2 constant region SEQ ID NO: 3; Amino acid sequence of wild-type SC SEQ ID NO: 4; Amino acid sequence of SC12 SEQ ID NO: 5; Amino acid sequence of wild-type SC containing signal sequence, thrombin site, His tag SEQ ID NO: 6; Amino acid sequence of SC12 containing signal sequence, thrombin site, His tag SEQ ID NO: 7; Nucleotide sequence of wild-type SC containing signal sequence, thrombin site, His tag SEQ ID NO: 8; Nucleotide sequence of SC12 containing signal sequence, thrombin site, His tag SEQ ID NO: 9; Nucleotide sequence of heavy chain variable region of 18-18K (H1 specific) SEQ ID NO: 10; Amino acid sequence of heavy chain variable region of 18-18K (H1 specific) SEQ ID NO: 11; Nucleotide

Abstract

二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造するための方法が提供される。

Description

多量体ＩｇＡ抗体の作製法及び多重特異性多量体ＩｇＡ抗体
　本発明は、多量体ＩｇＡ抗体、好ましくは多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の作製法、及び多重特異性多量体ＩｇＡ抗体に関する。
　生体内において最も産生量の多い抗体であるＩｇＡ抗体はインフルエンザ等の粘膜組織を標的とした呼吸器感染症に対する生体防御の最前線防御因子として機能している。この分泌型ＩｇＡ抗体（ＳＩｇＡ）は二量体以上の多量体を形成しており、特に四量体ＳＩｇＡは、ＩｇＧや単量体ＩｇＡより機能活性が高いことが明らかになっている。
　発明者らの以前の研究では、モノクローナルＩｇＧ抗体の可変領域配列以外の定常領域をＩｇＡのフレームに置き換えることにより、該モノクローナル抗体の抗原認識部位を保持しつつＩｇＡに変換した抗体を得、該抗体を人為的に分泌型化及び四量体化させたモノクローナル四量体ＳＩｇＡを作製する技術を開発した（特許文献１）。しかしながら、この技術で作製した四量体ＳＩｇＡの持つ８つのＦａｂ領域は全て同一の可変領域を持っており、単一のエピトープに対する反応性しか有していない。
　現在、抗体に存在する複数のＦａｂにそれぞれ異なる可変領域を搭載した多重特異性抗体が実用化されている。多重特異性抗体は、抗体医薬だけでなく、研究用ツールや診断薬の開発など、さまざまな分野での応用が期待されている技術である。しかしながら、その製造方法は複雑であり、１つの多重特異性抗体を作製するためには多大な労力を伴うことから、実用化されている多重特異性抗体の種類は限定的である。
特許第６５６４７７７号
　本発明は、多量体ＩｇＡ抗体、特に多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を簡便かつ効率よく製造する方法を提供することを目的とした。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、それぞれ別々の培養細胞で作製した二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体、及び分泌片（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、以下「ＳＣ」ともいう）を試験管内で混合することによって、簡便且つ効率よく二重特異性三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造できることを見出し、本発明を完成させた。さらに、分泌片を混合しない場合も、混合した場合より効率は落ちるが、同様に二重特異性三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造できることを見出した。本発明の技術は、二重特異性三量体及び四量体抗体だけでなく、単一特異性三量体及び四量体抗体、及び三重特異性以上の多重特異性三量体及び四量体抗体の製造にも適用できる。
　すなわち、本発明は
［１］二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造するための方法、
［２］さらに分泌片を混合することを含む、［１］記載の方法、
［３］前記二量体ＩｇＡ抗体が第１の抗原結合部位を含み、前記単量体ＩｇＡ抗体が第２の抗原結合部位を含む、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体が製造される、［１］又は［２］記載の方法、
［４］第３の抗原結合部位を含む別の単量体ＩｇＡ抗体をさらに混合する、［３］記載の方法、
［５］前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含む、［３］記載の方法、
［６］前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含み、前記別の単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第３の抗原結合部位を含む、［４］記載の方法、
［７］前記分泌片が野生型ＳＣ又はＳＣ変異体である、［２］～［６］のいずれか１項記載の方法、
［８］分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合することを含む、請求項［１］～［７］のいずれか１項記載の方法、
［９］前記二量体ＩｇＡ抗体及び前記単量体ＩｇＡ抗体がそれぞれ別々に培養細胞で作製された組換えＩｇＡ抗体である、［１］～［８］のいずれか１項記載の方法、
［１０］製造された三量体ＩｇＡ抗体及び四量体ＩｇＡ抗体を他のＩｇＡ抗体から分離することをさらに含む、［１］～［９］のいずれか１項記載の方法、
［１１］製造された三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体を分離することをさらに含む、［１０］記載の方法。
［１２］第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、及び第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域を含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体、
［１３］さらに分泌片を含む、［１２］記載の抗体、
［１４］第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子との重合物である、［１２］記載の抗体、
［１５］第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子と、分泌片との重合物である、［１３］記載の抗体、
［１６］４つの第１のＦａｂ領域、及び少なくとも２つの第２のＦａｂ領域を含む、［１２］～［１５］のいずれか１項記載の抗体、
［１７］前記分泌片が野生型ＳＣ又はＳＣ変異体である、［１３］、［１５］および［１６］のいずれか１項記載の抗体、および
［１８］［１２］～［１７］のいずれか１項記載の抗体を含む医薬組成物
を提供する。
　本発明の多量体ＩｇＡ抗体は、１つの抗体分子の中に、１つの二量体ＩｇＡ抗体に由来する４つのＦａｂ領域及び単量体ＩｇＡ抗体に由来する２つ又は４つのＦａｂ領域を搭載することにより、一種類または二種類以上のＦａｂ領域を有することができる。したがって、本発明によれば、多量体ＩｇＡ抗体、特に多重特異性多量体ＩｇＡ抗体が得られる。本発明の多量体ＩｇＡ抗体および多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、各抗原に対する高い抗原結合性又は中和活性を有する。また、本発明の方法において二量体ＩｇＡ抗体同士、単量体ＩｇＡ抗体同士は重合することが出来ないことから、第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体及び第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体を用いる場合、本発明の方法により製造される三量体及び四量体ＩｇＡ抗体は１００％の確率で多重特異性抗体となる。本発明は、二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体の少なくとも２つのタンパク質をイン・ビトロで混合するだけという簡便な方法により、多量体抗体、特に多重特異性多量体抗体、特に多重特異性三量体及び四量体抗体、特に二重特異性三量体及び四量体抗体を作製するものであり、抗体を用いた研究用ツールやデリバリーツール、診断薬、医薬品の開発のプラットフォームとして有用である。本発明では、さらにＳＣを混合することにより、多量体抗体の製造効率が向上する。
本願の二重特異性四量体ＩｇＡ抗体の製造の一例を示す模式図である。 野生型ＳＣのアミノ酸配列、及びＳＣ１２欠失変異体のアミノ酸配列を示す。 野生型ＳＣの塩基配列を示す。 ＳＣ１２欠失変異体の塩基配列を示す。 ＳＣ１２のＩｇＡ抗体多量体化促進能を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」（実線で示される）は、単量体ＩｇＡ１抗体と二量体ＩｇＡ１抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ１抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、二量体ＩｇＡ１抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「Ｔｒｉ／Ｔｅｔ　ＩｇＡ」は、細胞内で作出した三量体及び四量体ＩｇＡ１抗体（コントロール）を示す。 ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔのＩｇＡ抗体四量体形成促進能の比較を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。 添加剤（Ｓｕｐｐｌｅ）の有無による、ＳＣ１２存在下でのＩｇＡ抗体多量体形成効率を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ１２＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、ＳＣ１２、及び添加剤を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、ＳＣ１２、及び添加剤を混合した結果を示す。 添加剤（Ｓｕｐｐｌｅ）の有無による、野生型ＳＣ存在下でのＩｇＡ抗体多量体形成効率を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、野生型ＳＣ、及び添加剤を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、野生型ＳＣ、及び添加剤を混合した結果を示す。 各添加剤によるＩｇＡ多量体形成促進効果を示すグラフである。 ＩｇＡ抗体の定常領域の違い（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ２）による多量体形成効率を示すグラフである。 反応時間の長さによる多量体形成効率の違いを示すグラフである。 異なる２種類の特異性を有した単量体及び二量体ＩｇＡ抗体を用いて、ＳＣの有無による三量体／四量体ＩｇＡ抗体形成効率の違いを示すグラフである。図中、「Ｈｅｔｅｒｏ」は異なる特異性を有する単量体ＩｇＡ２ｍ２（ｍＡ２）と二量体ＩｇＡ１（ｄＡ１）の組み合わせを示し、「Ｈｏｍｏ」は同一の特異性を有するｍＡ２とｄＡ１の組み合わせを示す。
１．用語
　本明細書において使用される用語は、特に定義されない限り、当該技術分野で一般に使用される意味を有する。
　「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）と呼ばれるタンパク質であり、抗原に特異的に結合する能力を有する。抗体は、Ｙ字型に配置された２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）の計４本のポリペプチド鎖からなる基本単位を有し、１個以上の基本単位が集まって１つの抗体分子が形成される。該４本のポリペプチド鎖には、アミノ酸配列の変化が比較的少ない定常領域（重鎖の定常領域：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び軽鎖の定常領域：ＣＬ）、及びアミノ酸配列の変化が大きい可変領域（重鎖の可変領域：ＶＨ、及び軽鎖の可変領域：ＶＬ）が存在する。
　「多量体」とは、上記の基本単位を２個以上含む抗体をいう。後述するように、本願の製造方法によって作製される抗体は、三量体及び四量体抗体である。したがって、本願明細書において使用される場合、「多量体」は、三量体又は四量体、又は三量体及び四量体の混合物を意味する。
　「Ｆａｂ領域」は、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインとからなる、抗原結合部位を含む領域である。
　「多重特異性」とは、抗体が２つ以上の異なるエピトープ（抗原決定基）に特異的に結合することができることを意味する。「二重特異性」とは、抗体が２つの異なるエピトープに特異的に結合することができることを意味する。「三重特異性」とは、抗体が３つの異なるエピトープに特異的に結合することができることを意味する。同様に、四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性、及び八重特異性とは、抗体がそれぞれ４つ、５つ、６つ、７つ、及び８つの異なるエピトープに特異的に結合することができることを意味する。一般的に、多重特異性抗体は、各々が異なるエピトープに特異的な二種類以上の抗原結合部位（パラトープ）を含む。ここで、「異なるエピトープ」は、同じ抗原上の異なるエピトープであってもよく、または異なる抗原上のエピトープであってもよい。
　「単一特異性」とは、抗体が同じ抗原の同じエピトープに結合する、１つ又は複数の抗原結合部位を有することを意味する。
　「抗原結合部位」は、エピトープに結合する抗体分子上の領域を意味する。抗原結合部位は、重鎖のＶＨ及び軽鎖のＶＬを含む。本明細書において、第１の、第２の、第３の、及び第４の抗原結合部位とは、異なる抗原上のエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する、それぞれ異なるアミノ酸配列からなる領域を意味する。
　「ＩｇＡ」は、抗体（免疫グロブリン）のアイソタイプの１つである。本明細書においては、「ＩｇＡ抗体」又は「ＩｇＡ型抗体」ともいう。ヒトのＩｇＡは、定常領域の違いによりＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスに分類される。さらにＩｇＡ２は、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、およびＩｇＡ２（ｎ）の３つのアロタイプに分けられる。ＩｇＡは、血清中では主に単量体ＩｇＡとして存在しており（血清型ＩｇＡ）、ＩｇＡ１が主要構成要素である。粘膜に分泌されると、二量体以上の多量体ＩｇＡとして存在し（分泌型ＩｇＡ又はＳＩｇＡ）、ＩｇＡ２が約半分程度を占める。多量体ＩｇＡは、２分子以上のＩｇＡがＪ鎖（Ｊｏｉｎｉｎｇ　ｃｈａｉｎ）又はＪ鎖及びＳＣにより重合したものである。多量体ＩｇＡには、ＳＣを含むものと含まないものが存在する。二量体ＩｇＡは、一般に、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の割合が４：４：１である分子を指す。
　「ＳＣ（又は分泌片）」は、分子量約７０ｋＤａの糖鎖修飾されたポリペプチドであり、多量体免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）の細胞外ドメインに由来する。Ｎ末端から５つの免疫グロブリン様ドメインを有し、それぞれＤ１～Ｄ５と名付けられている。このうちＤ１が多量体ＩｇＡとの結合に必須であり、特にＤ１に存在する免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）に類似した構造が、多量体ＩｇＡとの結合に重要な役割を担う。
　ｐＩｇＲは、粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現している、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型の膜貫通型タンパク質であり、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞質内領域からなる。ｐＩｇＲは、粘膜固有層に存在する形質細胞が産生したＪ鎖を含む多量体ＩｇＡ分子を特異的に認識して結合し、上皮細胞中に取り込み、結合したまま頂端部（apical）側へ輸送する。ここで、上皮細胞のタンパク質分解酵素により、ｐＩｇＲの細胞外ドメインと膜貫通領域との間が切断され、多量体ＩｇＡがｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分と結合した状態で内腔側粘膜層へ分泌される（分泌型ＩｇＡ又はＳＩｇＡ）。切断後のｐＩｇＲの細胞外ドメインがＳＣに相当する。本明細書において使用する場合、ＳＣを分子内に含むＩｇＡ抗体を「分泌型ＩｇＡ抗体」という。
　「Ｊ鎖」は、Ｎ結合型糖鎖を有する分子量約１５ｋＤａのポリペプチドである。Ｊ鎖は、生物間で高度に保存されており、多量体ＩｇＡがｐＩｇＲと相互作用するうえで不可欠である。
２．多量体ＩｇＡ抗体の製造方法
　本発明の第一の態様において、二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の製造方法が提供される（以下、「本願の製造方法」ともいう）。本願の製造方法のさらなる態様として、二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣを混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の製造方法が提供される。本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、２つの単量体ＩｇＡ抗体とが重合して、１つの四量体ＩｇＡ抗体が製造される。さらに、本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、２つの単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣとが重合して、１つの四量体ＩｇＡ抗体が製造される（図１）。また、本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つの単量体ＩｇＡ抗体とが重合して、１つの三量体ＩｇＡ抗体が製造される。またさらに、本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つの単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣとが重合して、１つの三量体ＩｇＡ抗体が製造される。
　混合する二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体は、それぞれ異なる可変領域を含んでいてもよく、又は同一の可変領域を含んでいてもよい。二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体の全ての可変領域が同一である場合、得られる三量体及び四量体ＩｇＡ抗体は単一特異性抗体である。二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体が２種以上の異なる可変領域を含む場合、二重ないし八重の、多重特異性抗体が得られる。例えば、４つのＦａｂ領域の全てが第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体を用いて、二重特異性三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を得てもよい。例えば、４つのＦａｂ領域の全てが第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第２の抗原結合部位を含む第１の単量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第３の抗原結合部位を含む第２の単量体ＩｇＡ抗体とを用いて、三重特異性四量体ＩｇＡ抗体を得てもよい。例えば、４つのＦａｂ領域の２つが第１の抗原結合部位を含み、残りの２つが第２の抗原結合部位を含む二重特異性二量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第３の抗原結合部位を含む第１の単量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第４の抗原結合部位を含む第２の単量体ＩｇＡ抗体とを用いて、三重特異性三量体ＩｇＡ抗体、及び三重又は四重特異性四量体ＩｇＡ抗体を得てもよい。このように、混合する二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体に含まれる可変領域を変更することにより、所望の二重ないし六重の多重特異性三量体ＩｇＡ抗体、及び所望の二重ないし八重の多重特異性四量体ＩｇＡ抗体を得ることができる。したがって、本発明の好ましい態様では、第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体及び第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、又は第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣを混合することを含む、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の製造方法が提供される。
　本願の製造方法においては、二量体ＩｇＡ抗体同士は重合せず、また、単量体ＩｇＡ抗体同士も重合しない。したがって、第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体とを混合した場合、又は第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣを混合した場合は、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体が１００％の確率で得られる
　混合する二量体ＩｇＡ抗体及び／又は単量体ＩｇＡ抗体は、その重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸であることが好ましい。疎水性アミノ酸として、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、グリシンが挙げられ、好ましい例として、イソロイシンが挙げられる。このようなＩｇＡ抗体の重鎖定常領域は、天然配列からなるものであってもよく、又は遺伝子組み換え技術によって第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に改変されたものであってもよい。本発明によると、重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであるＩｇＡ２ｍ２抗体を用いた場合、重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸以外であるＩｇＡ１抗体のみを用いた場合と比べて、多量体ＩｇＡ抗体の形成効率が上がった（実施例５）。ＩｇＡ１の定常領域のアミノ酸配列を配列番号１に、ＩｇＡ２ｍ２の定常領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　ＳＣとしては、野生型ＳＣ又はＳＣ変異体のいずれを用いてもよい。ＳＣ変異体としては、例えば、少なくともドメインＤ１を含むＳＣ変異体が挙げられ、例えば、ＳＣのドメインＤ２～Ｄ５のうち１以上のドメイン又はＤ２～Ｄ５の領域の一部を欠失した変異体が挙げられる。好ましくは、少なくともドメインＤ１およびＤ２を含むＳＣ変異体、ＳＣのドメインＤ４及びＤ５の欠失変異体、ＳＣのドメインＤ３～Ｄ５の全てを欠失した変異体（本明細書において、「ＳＣ１２」という）等が挙げられる。さらに好ましくは、ＳＣとして、野生型ＳＣ（配列番号３）又はＳＣ１２（配列番号４）あるいはそれらの変異体が用いられ、またさらに好ましくはＳＣ１２又はその変異体が用いられる。かかるＳＣ変異体としては、例えば、配列番号３又は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本願の製造方法では、ＳＣを用いても、用いなくてもよく、好ましくはＳＣを用いる。ＳＣを用いると、三量体及び／又は四量体ＩｇＡ抗体の形成効率が向上する。
　本願の製造方法において使用されるＩｇＡ抗体の由来は、特に限定されず、例えば、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。
　ＩｇＡ抗体が特異的に結合する抗原は、特に限定されない。所望の三量体ＩｇＡ抗体及び／又は四量体ＩｇＡ抗体を作製するために適当なＩｇＡ抗体を選択すればよい。
　本願の製造方法において使用されるＩｇＡ抗体のサブクラスは、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２のいずれであってもよく、又はＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方を使用してもよい。好ましくは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方を使用してもよい。例えば、二量体ＩｇＡ１抗体と単量体ＩｇＡ２抗体を使用してもよい。さらに、ＩｇＡ２のいずれのアロタイプを用いてもよい。
　本願の製造方法において使用されるＩｇＡ抗体は、天然のＩｇＡ抗体であってもよく、又は組み換えＩｇＡ抗体であってもよい。ここで、「組み換え抗体」とは、天然の抗体配列を改変した抗体、および配列改変の有無にかかわらず、遺伝子組み換え技術により人為的に作製した抗体を包含する。例えば、非ＩｇＡ型抗体をＩｇＡ型に変換した組み換えＩｇＡ抗体を用いてもよい。非ＩｇＡ型抗体としては、例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＹ抗体が挙げられる。非ＩｇＡ型抗体の由来は、特に限定されず、例えば、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。例えば、ＩｇＧ抗体の可変領域をＩｇＡ抗体のバックボーンフレームワークに移植することによって、又はＩｇＧ抗体のＣＤＲのみをＩｇＡ抗体のＣＤＲに移植することによって作製された組み換えＩｇＡ抗体を使用してもよい。さらに、組み換えＩｇＡ抗体には、ある動物種由来の抗体の可変領域と別の動物種の由来のＩｇＡ抗体の定常領域を組み合わせたキメラ組み換えＩｇＡ抗体、ある動物種由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物種の由来のＩｇＡ抗体のＣＤＲに移植した組換え抗体も包含される。遺伝子組み換え技術は、当該分野でよく知られている。
　したがって、本明細書において「ＩｇＡ抗体」とは、少なくとも一部がＩｇＡ抗体に由来するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。
　本願の製造方法において使用される二量体ＩｇＡ抗体は、好ましくはＳＣを含まない。また、本願の製造方法において使用される二量体ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖を含む。
　混合する二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体は、当該分野において既知の方法によって作製すればよい。例えば、二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体は、それぞれ別々に培養細胞で作製されたものであってもよい。二量体ＩｇＡ抗体は、例えば、該ＩｇＡ抗体を構成する重鎖タンパク質、軽鎖タンパク質及びＪ鎖を１つの宿主細胞内で共発現させることによって作製してもよい。単量体ＩｇＡ抗体は、例えば、該ＩｇＡ抗体を構成する重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質を１つの宿主細胞内で共発現させるよって作製してもよい。
　宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。昆虫細胞としては、限定するものではないが、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株等が挙げられる。
　上記のタンパク質（二量体ＩｇＡ抗体の場合、重鎖タンパク質、軽鎖タンパク質及びＪ鎖；単量体ＩｇＡ抗体の場合、重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質）を１つの宿主細胞内で共発現させる工程は、例えば、これらのタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを該細胞内に導入することによって行えばよい。発現ベクター及び導入方法は当該分野でよく知られている。発現ベクターとしては、ファージベクター、ウイルスベクター、プラスミドベクター等を使用することができ、宿主に適当なベクターが当業者により適宜選択される。発現ベクター導入後、細胞を培養して目的のタンパク質を発現させる。細胞培養条件は当業者によって適宜選択される。
　本願の製造方法においては、二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体及びＳＣに加えて、分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合してもよい。分子シャペロンタンパク質は、タンパク質分子のフォールディングに寄与するタンパク質である。分子シャペロンタンパク質としては、Ｈｓｐ６０ファミリー、Ｈｓｐ７０ファミリー、Ｈｓｐ９０ファミリー、Ｈｓｐ１００ファミリー、低分子量Ｈｓｐファミリー、イソメラーゼ類、及びこれらの補助因子などがあり、例えば、Ｄｎａｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ等が挙げられ、２種以上の分子シャペロンタンパク質を用いてもよい。ジスルフィド結合イソメラーゼは、アミノ酸残基間のジスルフィド結合に寄与する酵素である。酸化型グルタチオンは、ジスルフィド結合を形成するために必要な酸化的条件を作り出す。これらの物質の少なくとも１つを用いることにより、ＩｇＡ抗体の四量体形成が促進される。本願の製造方法において、好ましくは、分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも２つの物質をさらに混合してもよく、さらに好ましくは、分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ及び酸化型グルタチオンをさらに混合する。また、本願の製造方法において、好ましくは、分子シャペロンタンパク質及びジスルフィド結合イソメラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合してもよい。
　本願の製造方法において、二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣ、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ＳＣ、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質の混合は、ｐＨ６～１０、好ましくはｐＨ７～８に調整した緩衝液中で行えばよい。緩衝液としては、例えば、限定するものではないが、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。混合時の適当な温度は、当業者により適宜決定することができるが、例えば２５℃～４５℃、好ましくは３０℃～４３℃、より好ましくは３５℃～４０℃、例えば３７℃前後である。混合時間は、特に限定されず、反応容量等の他の条件に基づき当業者により適宜決定することができるが、例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、又は４８時間以上であってもよく、好ましくは２４時間～７２時間程度であってもよい。二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体の混合比率、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣの混合比率、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質の混合比率、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ＳＣ、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質の混合比率は、特に限定されず、当業者により適宜決定することができる。
　かくして製造された三量体及び四量体ＩｇＡ抗体は、その分子サイズ等の特性に基づいて、他のＩｇＡ抗体（多量体化しなかった二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体）から分離することができ、さらに、三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体も互いに分離することができる。三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の他のＩｇＡ抗体からの分離には、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析等を用いることができる。したがって、本願の製造方法は、三量体ＩｇＡ抗体及び四量体ＩｇＡ抗体を他のＩｇＡ抗体から分離する工程をさらに含んでいてもよい。
　また、本願の製造方法によって製造された三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の特異性の確認は、ＥＬＩＳＡ法、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の既知の方法により行うことができる。本願の製造方法によって製造される多量体ＩｇＡ抗体は、その多くが四量体ＩｇＡ抗体である。したがって、本願の製造方法によれば、三量体ＩｇＡ抗体と比べて四量体ＩｇＡ抗体を高い割合で含む、三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体の混合物が得られる。
３．多重特異性多量体ＩｇＡ抗体
　本発明の第二の態様において、第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、及び第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域を含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体が提供される（以下、「本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体」ともいう）。本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体のさらなる態様として、第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域、及びＳＣを含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体が提供される。本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、好ましくは、上記した本願の製造方法によって得られる。
　該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、好ましくは、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体との重合物である。該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、さらに好ましくは、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣとの重合物である。例えば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体は、ＳＣを介して三量体化又は四量体化されている。例えば、該二量体ＩｇＡ抗体は第１の抗原結合部位を含み、該単量体ＩｇＡ抗体は第２の抗原結合部位を含む。好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域、及び少なくとも２つの第２のＦａｂ領域を含む。さらに好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域、少なくとも２つの第２のＦａｂ領域、及びＳＣを含む。またさらに好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域及び２つの第２のＦａｂ領域を含む二重特異性三量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域及び４つの第２のＦａｂ領域を含む二重特異性四量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域、２つの第２のＦａｂ領域、及び２つの第３のＦａｂ領域を含む三重特異性四量体ＩｇＡ抗体であってもよい。またさらに好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域、２つの第２のＦａｂ領域及びＳＣを含む二重特異性三量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域、４つの第２のＦａｂ領域及びＳＣを含む二重特異性四量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域、２つの第２のＦａｂ領域、２つの第３のＦａｂ領域及びＳＣを含む三重特異性四量体ＩｇＡ抗体であってもよい。またさらに好ましい例において、前記４つの第１のＦａｂ領域は二量体ＩｇＡ抗体に由来し、前記２つ又は４つの第２又は第３のＦａｂ領域は単量体ＩｇＡ抗体に由来する。
　本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２のいずれであってもよく、又はその両方を含んでいてもよい。好ましくは、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２の両方を含んでいてもよい。さらに好ましくは、該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、二量体ＩｇＡ１由来の４つのＦａｂ領域、及び単量体ＩｇＡ２由来の２つ又は４つのＦａｂ領域を含んでいてもよい。また、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体に含まれるＩｇＡ２は、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、又はＩｇＡ２（ｎ）であってもよい。
　本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、その重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸であってもよい。疎水性アミノ酸として、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、グリシンが挙げられ、好ましい例として、イソロイシンが挙げられる。
　本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、組み換えＩｇＡ抗体であってもよい。例えば、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体が、１つの二量体ＩｇＡ抗体と１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体との重合物である場合、又は１つの二量体ＩｇＡ抗体と１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体とＳＣとの重合物である場合、該二量体ＩｇＡ抗体及び該単量体ＩｇＡ抗体のいずれか、又は全てが組み換えＩｇＡ抗体であってもよい。
　本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を構成するＩｇＡ抗体及びＳＣについては、上記「２．多量体ＩｇＡ抗体の製造方法」に記載したとおりである。
４．医薬組成物
　本発明の第三の態様において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を含む医薬組成物が提供される（以下、「本願の医薬組成物」ともいう）。本願の医薬組成物は、好ましくは、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体、又は該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の混合物を有効成分として含む。
　本願の医薬組成物は、例えば、疾患の治療、予防、又は診断等のために使用することができる。本願の医薬組成物を使用する対象疾患は、特に限定されず、例えば、感染症、例えば、寄生虫、細菌、真菌、ウイルス、異常プリオン等の病原体による感染症、及び悪性腫瘍等が挙げられる。感染症のさらなる例として、インフルエンザウイルス感染症、ＲＳウイルス感染症、エボラウイルス感染症、重症熱性血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の粘膜感染症が挙げられる。
　本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、該医薬組成物の使用目的に適当な抗原結合部位を有する。例えば、疾患の診断、予防、治療等に用いる場合、例えば、１つの対象疾患に関連する２つの異なるタンパク質（例えば、原因タンパク質、マーカータンパク質等）に特異的に結合する、多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を用いることができる。例えば、本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質にそれぞれ特異的に結合するものであってもよい。また、例えば、本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、標的細胞に特異的なタンパク質及び治療に有効なタンパク質にそれぞれ特異的に結合するものであってもよい。本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の標的となり得る抗原又はエピトープの例として、限定するものではないが、エボラウイルスの糖タンパク質の複数のエピトープ、ＳＦＴＳウイルスの糖タンパク質であるＧｎタンパク質及びＧｃタンパク質、ＣＤ３やＣＤ８などのリンパ球のマーカータンパク質、及び癌特異抗原等が挙げられる。
　本願の医薬組成物は、粉剤、液剤等の剤型に製剤化して投与することができる。本願の医薬組成物は、製薬分野で既知の賦形剤、添加剤、増粘剤等をさらに含んでいてもよい。例えば、本願の医薬組成物は、鼻腔粘膜上への噴霧による投与、ネブライザーを用いた下気道への吸入による投与等により投与してもよい。
　本願の医薬組成物は、ヒトを対象とするものであってもよく、又は非ヒト哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物、チンパンジー、ゴリラ、カニクイザル等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類等を対象とするものであってもよい。
　本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の重鎖、軽鎖、ＳＣ、及びＪ鎖のいずれかは、当該医薬組成物の対象動物に由来する（対象とする動物型である）アミノ酸配列を含むことが好ましい。さらに好ましくは、本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の重鎖、軽鎖、ＳＣ、及びＪ鎖はいずれも、当該医薬組成物の対象動物に由来する（対象とする動物型である）アミノ酸配列を含む。ここで、重鎖及び軽鎖に関し「対象とする動物型である」とは、多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域が対象とする動物のＩｇＡ重鎖及びＩｇＡ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列を有していることを意味する。ＳＣ及びＪ鎖に関し「対象とする動物型である」とは、多重特異性多量体ＩｇＡ抗体のＳＣ及びＪ鎖が対象とする動物のＳＣ及びＪ鎖のアミノ酸配列を有していることを意味する。ＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖、ＳＣ及びＪ鎖のアミノ酸配列は、目的とする抗原結合活性を有している限り変異を含んでいてもよい。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明の実施例に限定されるものではない。
［材料及び調製］
１．ＩｇＡ発現プラスミドベクターの作製
　ヒトＩｇＡ１の定常領域であるα１重鎖（ＨＣ）の発現ベクターは下記の通り作製した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ（登録商標）　ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）を使用して、実施した。簡潔に記述すると、鋳型としてｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＡ１　（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、プライマーは制限酵素であるＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩが認識するサイトを含むＩｇＡ１抗体定常領域を増幅する適切なプライマーセットを用いて、ヒトＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子をＰＣＲを行い増幅した。ＰＣＲ条件は９８℃　１０秒、５５℃　５秒、７２℃　１０秒で３０サイクルで実施した。続いて、Ｔ．　Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）が報告したヒトγ１ＨＣの発現ベクターを鋳型とし、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩが認識するサイトを含み、シグナル配列を除くＩｇＧ１抗体定常領域であるγ１ＨＣを除去するための適切なプライマーセットを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は９８℃　１０秒、５５℃　５秒、７２℃　３０秒で３０サイクルで実施した。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ　ＤＮＡ精製キットＩ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて行った。精製されたα１ＨＣとγ１ＨＣを除去したＴ．　Ｔｉｌｌｅｒらの発現ベクターはＸｈｏＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で制限酵素処理した。制限酵素産物の精製は、ＭｏｎｏＦａｓ　ＤＮＡ精製キットＩを用いて行った。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、全量をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ　Ｋｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。
　ヒトＩｇＡ２のアロタイプであるα２ｍ２　ＨＣは、ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ－ＤＢに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは、α２ｍ２　ＨＣ　がＭ６０１９２及びＡＪ０１２２６４）をヒト用にコドン最適化を行い、人工合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。その時に可変領域のクローニングを容易にするため、可変領域の最後のアミノ酸アラニンと定常領域の最初のアミノ酸セリンのコドンを改編し、ＮｈｅＩ切断サイトを作製した。ＮｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦで処理した合成配列と、同一の制限酵素で処理したα１　ＨＣは、ＭｏｎｏＦａｓ　ＤＮＡ精製キットＩを用いて精製した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ　Ｋｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。
　ヒト軽鎖（ＬＣ）は、抗体の各アイソタイプ間で共通であるため、Ｔ．　Ｔｉｌｌｅｒらによって報告されたλ ＬＣ発現ベクターを使用した。
２．抗体可変領域遺伝子のα１、α２ｍ２ ＨＣ、及びλ ＬＣ発現ベクターへのクローニング
　インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）のヘマグルチニン（ＨＡ）に対して広域に結合する抗体クローンとして知られているＦ０４５－０９２を使用した。Ｆ０４５－０９２はＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは重鎖がＡＢ６４９２７０，　軽鎖がＡＢ６４９２７１）をヒト用にコドン最適化を行い、それぞれα１　ＨＣ（重鎖）、α２ｍ２　ＨＣ（重鎖）、及びλ ＬＣ（λ鎖）の発現ベクターへ組み込めるように調整し人工合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。ＡｇｅＩ－ＨＦ（全ての鎖）及び　ＮｈｅＩ－ＨＦ（重鎖）、ＸｈｏＩ（λ鎖）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した合成配列と、同一の制限酵素で処理したα１　ＨＣ、α２ｍ２　ＨＣ、及びλＬＣの発現ベクターは、ＭｏｎｏＦａｓ　ＤＮＡ精製キットＩを用いて精製した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ　Ｋｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。
３．蛍光標識ＩｇＡ１（ｍＣ－Ａ１）、及びＩｇＡ２ｍ２抗体（ｍＣ－Ａ２）の発現プラスミドＤＮＡの作製
　ＩｇＡ抗体の異なるサブクラスであるα１及びα２ｍ２の重鎖における２４１番目のシステインまでを欠損させたＣＨ２及びＣＨ３から構成されたＩｇＡ１Δ及びＩｇＡ２ｍ２Δ変異体を、制限酵素サイトを付加した特異的プライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲにより作出した。また、５’及び３’末端に制限酵素ＡｇｅＩの認識配列を付加したプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）を用いてＰＣＲを行い、蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙの配列を特異的に増幅させた。その後、各ＩｇＡΔ変異体、及びｍＣｈｅｒｒｙを制限酵素ＡｇｅＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて至適条件で制限酵素処理を実施した後、アガロースゲル電気泳動を行うことで、制限酵素によって消化された目的産物のバンドのみを回収した。回収した目的産物をＭｏｎｏＦａｓ　ＤＮＡ精製キットＩ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて精製し、その精製したＩｇＡΔ変異体をコードしたＤＮＡ断片及び、ｍＣｈｅｒｒｙをコードしたＤＮＡ断片を１：３　（＝　ＩｇＡ１Δ：　ｍＣｈｅｒｒｙ）で混合し、等量のＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、１６℃で３０分反応させライゲーションを行った。環化されたＩｇＡΔとｍＣｈｅｒｒｙをＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ　（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）に４２℃で形質転換した。プラスミドＤＮＡ抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行い、サンガー法を用いてシークエンス配列の解析を行った。ｍＣｈｅｒｒｙは、ＩｇＡ１Δ及びＩｇＡ２ｍ２Δをコードする配列の５’側に付加した。また、この蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙが融合したＩｇＡΔ変異体をそれぞれｍＣ－Ａ１抗体、並びにｍＣ－Ａ２抗体とした。実施した操作は全て添付された説明書に従った。
４．Ｊ鎖及び分泌片（ＳＣ）のクローニング
　Ｊ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　ＮＭ＿１４４６４６）を、コーディング配列の５’側にＸｈｏＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列を、さらに３’側にＮｏｔＩ認識配列を付加したものを人工遺伝子合成サービス（ユーロフィンジェノミクス）により人工合成した。その後、ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、至適の条件で制限酵素処理を実施し、同一の条件で哺乳類培養細胞用の発現ベクターであるｐＣＸＳＮベクターもまた制限酵素処理を実施した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ　Ｋｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。
　野生型ＳＣ（ＳＣ－ｗｔ）は、ｐＩｇＲ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　ＮＭ＿００２６４４）の５’末端から１８０９ｂｐ（シグナル配列を含む）を使用し、そのＳＣ配列の５’側にＸｈｏＩ認識配列とｋｏｚａｋ配列、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断配列、６ｘ　Ｈｉｓ　ｔａｇを含むＤＮＡフラグメント（配列番号７）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて人工合成を行った。合成したＤＮＡフラグメントをＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲを実施し、ＤＮＡ精製を行った。その後、至適の条件下でＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素処理を行い、同一の条件で哺乳類培養細胞用の発現ベクターであるｐＣＸＳＮベクターもまた制限酵素処理を実施した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ　Ｋｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。実施した操作は全て添付された説明書にしたがった。ＳＣ－ｗｔをコードする遺伝子配列を図２－２に示す。
５．ＳＣ１２欠失変異体の発現プラスミドＤＮＡの作製
　５つのドメインを持つＳＣを鋳型として、特異的なプライマーとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）を使用し、最適なプライマーセット及び塩基長を考慮し至適条件でＰＣＲを行うことで、ＳＣのドメイン１及び２をコードする配列を増幅させた。また、ＳＣの各ドメインはＢｅｔｈらの先行研究（ｅＬｉｆｅ, ５, ｅ１０６４０, ２０１６）に従って決定した。ＰＣＲ反応後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的の塩基長が特異的に増幅されていることを確認し、ＰＣＲ産物をＭｏｎｏＦａｓ　ＤＮＡ精製キットＩ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡ精製を行った。また、精製したＤＮＡフラグメントは、Ｔ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）を用いてリン酸化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）により環状にセルフライゲーションさせた。ライゲーションの操作が終了後、環化された欠失変異体をコードしたプラスミドＤＮＡ（配列番号８）をＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）に４２℃で形質転換した。プラスミドＤＮＡ抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍにより行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ　Ｋｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。実施した操作は全て添付された説明書にしたがった。ＳＣ１２欠失変異体をコードする遺伝子配列を図２－３に示す。
６．単量体ＩｇＡ抗体、及び二量体ＩｇＡ抗体の発現
　単量体ＩｇＡ抗体の構成分子は重鎖、軽鎖であり、二量体ＩｇＡ抗体は重鎖、軽鎖、Ｊ鎖から構成されている。単量体及び二量体ＩｇＡ抗体を構成する分子を発現するプラスミドＤＮＡを、ヒト腎臓細胞由来の哺乳培養細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　２．９　ｘ　１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに、Ｅｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｋｉｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，　ＵＳＡ）を用いて、それぞれ共導入した。その後、３７℃、８％　ＣＯ２、１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、一週間後に細胞培養液を回収した。
７．ｍＣ－Ａ１、及びｍＣ－Ａ２抗体の発現
　ｍＣ－Ａ１及びｍＣ－Ａ２抗体は、軽鎖を有していないため、各重鎖とＪ鎖をコードしたプラスミドＤＮＡをそれぞれ、ヒト腎臓細胞由来の哺乳培養細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　２．９　ｘ　１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬにＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｋｉｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，　ＵＳＡ）を用いて、共導入した。その後、３７℃、８％　ＣＯ２、１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、一週間後に細胞培養液を回収した。
８．組換えＩｇＡ抗体、及びｍＣ－Ａ１／２の精製
　回収した細胞培養液を、３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により細胞などのデブリを取り除き、培養上清のみを回収した。また、この遠心の操作は計２回行った。その後、グラスファイバーフィルター及びステリカップ（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ，　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、上清のろ過を行った。組換えＩｇＡ抗体、及びｍＣ－Ａ１／２の精製はヒトＩｇＡ抗体の定常領域を特異的に認識するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ　ＩｇＡ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。精製方法は説明書に従い実施した。簡潔に精製方法を以下に記述する。カラムは１０ＣＶのＰＢＳで平衡化され、濾過した培養上清をカラムにロードする。１０ＣＶのＰＢＳでカラムを洗浄し、５ＣＶの０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ　３．０）で抗体を溶出し、溶出液は１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０）で中和した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、説明書に従って実施した。
９．ゲル濾過クロマトグラフィーによる単量体及び二量体ＩｇＡ抗体の分離
　単量体及び二量体ＩｇＡ抗体の濃縮後、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。組換えＩｇＡ抗体の分画には、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６　１０／３００　ＧＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、また、ｍＣ－Ａ１／２はＳｕｐｅｒｏｓｅ　１２　１０／３００　ＧＬを用いて、説明書に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。クロマトグラフィーの条件は、ＰＢＳを流速０．５ｍＬ／分、カラム平衡化１．５　ＣＶ、溶出０．２　ｍＬ／Ｆｒａｃｔｉｏｎ（計１．５　ＣＶ）で実施した。単量体、及び二量体ＩｇＡ抗体を含むフラクションをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓを用いて濃縮した。濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。
１０．組換えＳＣ１２の発現と精製
　ＳＣ１２をコードするプラスミドＤＮＡを、ヒト腎臓細胞由来の哺乳培養細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２．９ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬにＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、遺伝子導入した。その後、３７℃、８％　ＣＯ２、１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、一週間後に細胞培養液を回収した。その後、回収した細胞培養液を３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により細胞などのデブリを取り除き、培養上清のみを回収した。また、この遠心の操作は計２回行った。培養上清中のＳＣ１２は、各タンパク質のＣ末端側のＨｉｓタグを認識するＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｅｘｃｅｌ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充填されたアフィニティカラムを用いて精製した。簡潔に記述すると、平衡化溶液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、洗浄液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４、溶出液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。平衡化溶液５ＣＶ（カラム体積）を通し、カラムの平衡化をした後、培養上清を通した。洗浄は、洗浄液２０ＣＶで行い、溶出は溶出液５ＣＶで実施し、平衡化溶液５ＣＶで再平衡化した。ＳＣ１２の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、説明書に従って実施した。
［実施例１：細胞外における多量体ＩｇＡ抗体の形成］
　発明者らの先行研究（特許文献１）により、三量体及び四量体分泌型ＩｇＡ抗体（ｔＳＩｇＡ）を構成する重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）、Ｊ鎖（ＪＣ）及び分泌片（ＳＣ）を哺乳類培養細胞へ共発現させることで、効率良くｔＳＩｇＡが産生されることが明らかにされた。さらに、ＳＣの有無によってｔＳＩｇＡの形成効率に差があることから、ＳＣは培養細胞内においてＩｇＡ抗体の三量体及び四量体形成の促進因子として機能していることが示唆された。このＳＣが有するＩｇＡ抗体の三量体及び四量体形成促進能は、細胞内に共在した４種類のタンパク質が相互作用することで形成された三量体及び四量体ＩｇＡ抗体（Ｔｒｉ／Ｔｅｔ　ＩｇＡ）を測定することで評価された。そこで、細胞内という限定的な環境ではなく、細胞外条件において、ＳＣが、別々の細胞から産生された各単離タンパク質からの多量体ＩｇＡ抗体形成の促進因子として機能するかを評価した。なお、ＳＣのドメイン１及び２から構成されるＳＣ１２は、細胞内における三量体及び四量体形成促進能がＳＣ－ｗｔよりも高いことが示されたことから、本実施例では、ＳＣとしてＳＣ１２を用いた。
　上記の通り作製した、ＳＣ１２、単量体ＩｇＡ１抗体（ｍＡ１）及び二量体ＩｇＡ１抗体（ｄＡ１）の最終濃度がそれぞれ１．２５ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、ローテーターを用いて３７℃で一週間反応させた。その後、コスモスピンフィルターＨ（ナカライテクス）を用いて抗体サンプルの前処理を行い、反応液中に生成されたＴｒｉ／Ｔｅｔ　ＩｇＡをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子サイズにより分離後、ＵＶ（２８０ｎｍ）により検出し、抗体の重合度の評価を行った。ＨＰＬＣシステムはＡｇｉｌｅｎｔ　１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カラムはＫＷ４０４－４Ｆ（ｓｈｏｄｅｘ）を使用した。溶離液にはリン酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎの条件で実施した。また、ＩｇＡ抗体混合液はそれぞれ９μＬ使用した。クロマトグラムはＯｐｅｎＬＡＢ　ＣＤＳ　ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解析を行った。
　結果を図３に示す。図中、「ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ抗体と二量体ＩｇＡ抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、二量体ＩｇＡ抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。コントロールとして、特許文献１に記載の方法を用いて細胞内で作出した三量体及び四量体ＩｇＡ抗体（Ｔｒｉ／Ｔｅｔ　ＩｇＡ）を使用した。
　その結果、「ｍＡ１＋ＳＣ１２」及び「ｄＡ１＋ＳＣ１２」の組合せでは、三量体／四量体ＩｇＡ抗体のピークは検出されなかった。一方で、「ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」の３種類のタンパク質を混合させることで、ｄＡ１よりも分子量が大きく、また細胞内条件で作出した「Ｔｒｉ／Ｔｅｔ　ＩｇＡ」と同等の検出時間で、多量体ＩｇＡ抗体のピークが検出された。以上の結果により、三量体／四量体ＩｇＡ抗体形成にはＳＣ１２の存在に加え、ｍＡ１とｄＡ１の共存が必要であることが示された。さらに、細胞外においても細胞内と同様に三量体／四量体ＩｇＡ抗体の形成が可能なことが明らかとなった。さらに、単量体同士、二量体同士では重合しないことが示された。したがって、三量体／四量体ＩｇＡ抗体は、二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体が重合することによって形成されることが分かった。
［実施例２：ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔ存在下における多量体ＩｇＡ抗体形成の比較］
　実施例１により、細胞外において、ＳＣ、単量体及び二量体ＩｇＡ抗体を混合することにより多量体ＩｇＡ抗体が形成したことから、ＳＣは多量体ＩｇＡ抗体形成に寄与することが示された。また、発明者らの以前の研究では、細胞内条件においてＳＣ－ｗｔと比べ、ＳＣ１２は三量体／四量体形成促進能が高いことが示された。そこで、細胞外条件において効率良く三量体／四量体ＩｇＡ抗体を産生する方法を探索するために、ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔの四量体形成促進能を比較した。
　上記の通り作製した、ＳＣ１２、ＳＣ－ｗｔ、ｍＡ１及びｄＡ１、並びに蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙをＩｇＡ抗体のＦａｂに相当する領域に置換したｍＣｈｅｒｒｙ融合ＩｇＡ抗体（ｍＣ－Ａ１）の単量体（ｍＣ－ｍＡ１）及び二量体（ｍＣ－ｄＡ１）の最終濃度がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、ローテーターを用いて３７℃で６時間反応させ、反応液中に生成された三量体／四量体ＩｇＡをＥＬＩＳＡ法によって検出した。
　ＥＬＩＳＡ法は以下のように行った。９６ウェルハーフプレートに５０μｌの組換えＨＡ（Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７（Ｈ３Ｎ２）由来，５μｇＨＡ／ｍＬ）を４℃で一晩固相化した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを加え室温、１時間ブロッキングを行った。その後、２００倍希釈した抗体サンプルの３倍段階希釈系列をつくり、各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、ＨＡ抗原を介してプレートに捕捉された抗体を、５ｎｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ－Ｂｌｏｔ　ＨＲＰ　ａｎｔｉ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍ　ＨＲＰ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＥＲＣＫ）を用いて、発色反応をさせ、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定した。また、解析はコントロールのＯＤ値が１．５になるようにプレートごとに係数を算出し、その係数を各サンプルに乗算することでプレート間の補正を実施した。
　結果を図４に示す。ＳＣ１２又はＳＣ－ｗｔの存在下で、ｍＡ１とｍＣ－ｄＡ１を反応させた時は、ｍＣ－ｍＡ１とｄＡ１を反応させた時と比べ、ＯＤ値は高い値を示した。また、ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔを比較すると、ｍＣ－ｍＡ１を用いた場合では差がないものの、ｍＣ－ｄＡ１を用いた際、ＳＣ１２存在下においてＯＤ値が高い値を示す結果となった。以上の結果から、ＳＣ１２は、ＩｇＡ抗体の多量体形成の促進能が高いことが明らかにされた。さらに、本実験で用いたＩｇＡ抗体は、Ｆ０４５－０９２の可変領域を含むＦａｂ領域を有するＩｇＡ抗体とｍＣ－Ａ１であり、これらの抗体は同一の定常領域をもつものの、可変領域が異なる。つまり、本願の多量体ＩｇＡ抗体の製造方法は、可変領域非依存型であり、特異性の異なる二重以上の特異性、好ましくは二重ないしは三重特異性のＩｇＡ抗体を作製可能であること、さらに、二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体が異なる可変領域を有していても、多量体ＩｇＡ抗体を形成可能であることが示された。
［実施例３：多量体形成促進に関わる因子の同定１］
　実施例２により、ＳＣ１２は、ＳＣ－ｗｔと比べて、ＩｇＡ抗体の多量体形成促進能が高いことが明らかになった。そこで、更に多量体形成を増強させるためにＳＣ及びＩｇＡ抗体以外のタンパク質成分添加の検討を行った。
　上記の通り作製した、ＳＣ１２、ＳＣ－ｗｔ、ｍＡ１及びｄＡ１、並びにｍＣ－ｍＡ１及びｍＣ－ｄＡ１をそれぞれ最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、及び添加剤（Ｓｕｐｐｌｅ）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、ローテーターを用いて３７℃で６時間反応させた。Ｓｕｐｐｌｅは、シャペロンタンパク質ＤｎａＫ　Ｍｉｘ（５μＭ　ＤｎａＫ、１μＭ　ＤｎａＪ、１μＭ　ＧｒｐＥ）及びＧｒｏＥ　Ｍｉｘ（０．５μＭ　ＧｒｏＥＬ、１μＭ　ＧｒｏＥＳ）、ジスルフィド結合イソメラーゼＤｓｂＣ（３７５μｇ／ｍＬ）、及び酸化グルタチオンＧＳＳＧ（３０ｍＭ）を含有した。反応液中に生成された三量体／四量体ＩｇＡを、実施例２と同様にＥＬＩＳＡ法によって検出した。
　結果を図５Ａ及びＢに示す。ＳＣ１２存在下では、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１」及び「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１」のどちらの混合液においてもＳｕｐｐｌｅを加えることで、三量体／四量体ＩｇＡ形成の指標であるＯＤ値の上昇が認められた（図５Ａ）。また、どちらの混合液においても、ＯＤ値が二倍以上上昇した。さらに、ＳＣ－ｗｔ存在下においても同様に、Ｓｕｐｐｌｅを加えることでＳＣ１２と同程度ほどの大幅なＯＤ値の上昇が認められた（図５Ｂ）。
［実施例４：多量体形成促進に関わる因子の同定２］
　Ｓｕｐｐｌｅに含まれる４つの大きな構成因子をそれぞれ単独でＳＣ１２の存在下でｍＣ－ｍＡ１とｄＡ１を反応させることで、各因子の多量体形成への寄与を評価した。反応および検出は、添加剤としてＤｎａＫ　Ｍｉｘ、ＧｒｏＥ　Ｍｉｘ、ＧＳＳＧ、またはＤｓｂＣを単独で添加する以外は実施例３と同様に行った。
　結果を図６に示す。分子シャペロンとして働くＤｎａＫ　Ｍｉｘ又はＧｒｏＥ　Ｍｉｘを添加した場合、同程度のＯＤ値が認められた。一方で、ジスルフィド結合イソメラーゼであるＤｓｂＣは、４つの構成因子の中で最も高いＯＤ値の増強が認められた。しかしながら、ジスルフィド結合を形成するために必要な酸化的条件を作り出す酸化型グルタチオンＧＳＳＧ添加条件では、４つの因子の中で三量体／四量体ＩｇＡ形成促進効率が最も低かった。以上の結果により、本実験で使用したＳｕｐｐｌｅは、ＩｇＡ抗体の三量体化／四量体化を促進するために有用であることが明らかとなった。
［実施例５：多量体形成促進に関わる因子の同定３］
　ＩｇＡ抗体の多量体化に寄与する因子として、ＩｇＡ抗体の定常領域に着眼した。ＩｇＡ抗体は、定常領域の違いによりＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスに分類され、さらにＩｇＡ２はＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ）の３つのアロタイプに分けられる。発明者らの先行研究（特許文献１）では、これらの定常領域の違いにより、細胞内条件において三量体／四量体ＩｇＡ抗体形成効率が異なった。そこで、細胞外条件においても同様にＩｇＡ抗体サブクラスの違いにより多量体形成効率に差が認められるかを評価した。すなわち、ＩｇＡ抗体の定常領域の違いによる多量体形成効率を、異なるサブクラスであるＩｇＡ１とＩｇＡ２ｍ２を用いて比較した。
　上記の通り作製したｍＣ－Ａ１およびｍＣ－Ａ２を、実施例３と同様に、単量体と二量体ＩｇＡ抗体の組み合わせにＳＣ１２を加え、さらにＳｕｐｐｌｅも加え反応させた後、三量体／四量体ＩｇＡ形成の評価を行った。
　結果を図７に示す。ＩｇＡ１抗体の単量体及び二量体を組み合わせた場合と比べ、ＩｇＡ２ｍ２抗体とＩｇＡ１抗体の組み合わせでは、ＯＤ値の増強が認められた。以上の結果により、ＩｇＡ２ｍ２は四量体形成能が高いことが明らかとなった。
［実施例６：多量体形成促進に関わる因子の同定４］
　ＩｇＡ抗体の多量体化に与える因子として、反応時間の検討を実施した。ＳＣ１２及びＳｕｐｐｌｅの存在下で、ｍＣ－ｍＡ１とｄＡ１をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で反応させた。反応開始の６時間、１２時間、及び２４時間後にサンプルを回収し、ＥＬＩＳＡ法にて、三量体／四量体ＩｇＡ形成を評価した。
　結果を図８に示す。大きな変化は認められないものの、反応時間を伸ばすことでＯＤ値の増強認められた。以上の結果から、至適な反応時間を探索することで、更なる多量体ＩｇＡ抗体の形成効率の増加が見込まれる。
［実施例７：異なる亜型のＨＡを用いた二重特異性ＩｇＡ抗体の評価］
　実施例２では、ｍＣｈｅｒｒｙ融合型ＩｇＡ抗体の単量体及び二量体をＳＣ－ｗｔ及びＳＣ１２の存在下で混合することにより、可変領域の異なる三量体／四量体ＩｇＡ抗体が形成されることを明らかにした。更に、実施例５では、ＩｇＡ抗体のサブクラスの違いによる多量体形成効率の違いについても明らかにした。そこで、本実施例では、検出タグを付加した亜型の異なる２種類のインフルエンザウイルスタンパク質ＨＡと、それぞれのＨＡに特異性を有するＩｇＡ抗体クローンを用いて、本願の方法により形成された三量体／四量体ＩｇＡ抗体の二重特異性を検証した。
　抗体クローンとして、インフルエンザＡ型のＨ１及びＨ３亜型に対して特異性を有する抗体クローンである、１８－１８Ｋ（Ｈ１）及び１５－１９Ｌ（Ｈ３）を使用した。これらのクローンは、経鼻インフルエンザワクチンの臨床試験を実施し、被験者から分離されたものである。これらの抗体由来の可変領域を上記と同様の方法によって、α１　ＨＣ、α２ｍ２　ＨＣ、及びλ　ＬＣの発現ベクター中にクローニングし、インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（Ｈ１／ＨＡ）に対して特異性を有する抗体クローン１８－１８Ｋの二量体ＩｇＡ１抗体、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）（Ｈ３／ＨＡ）に対して特異性を有する抗体クローン１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体及び二量体ＩｇＡ１抗体を作製した。１８－１８Ｋ（Ｈ１）の重鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に、軽鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。１５－１９Ｌ（Ｈ３）の重鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４に、軽鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。ＳＣ及びＳＣ１２も、上記の通り作製した。
　１８－１８Ｋの二量体ＩｇＡ１抗体、１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体及び二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ又はＳＣ１２を各タンパク質の最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合した。具体的には、１８－１８Ｋの二量体ＩｇＡ１抗体と１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体を混合したＨｅｔｅｒｏ群、及び１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体と二量体ＩｇＡ１抗体を混合したＨｏｍｏ群にそれぞれ、ＳＣ－ｗｔ又はＳＣ１２を加えた混合液、又はＳＣ－ｗｔ及びＳＣ１２のいずれも加えない混合液を、さらに還元型グルタチオン（富士フイルム和光純薬株式会社）を最終濃度０．０３ｍＭになるように添加し、サーマルサイクラーを用いて３７℃で１２時間反応させた。反応液中に生成された三量体／四量体ＩｇＡをＥＬＩＳＡ法によって検出した。
　ＥＬＩＳＡ法は以下のように行った。３８４ウェルプレートに４０μｌのｓｔｒｅｐｔタグを付加した組換えＨ３／ＨＡ－Ｓｔｒｅｐｔ（Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）由来，５μｇＨＡ／ｍＬ）を４℃で一晩固相化した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを加え室温、１時間ブロッキングを行った。その後、１００倍希釈した抗体サンプルの２倍段階希釈系列をつくり、各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、４０μｌのＨｉｓタグを付加した組換えＨ１／ＨＡ－Ｈｉｓ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来，１μｇＨＡ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、４０μｌの６０００倍希釈したｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ　（ＭＢＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍ　ＨＲＰ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＥＲＣＫ）を用いて、発色反応をさせ、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定した。
　結果を図９に示す。異なる特異性を有した抗体クローンを組み合わせたＨｅｔｅｒｏ群では、ＳＣ非存在下と比べ、ＳＣ存在下でＯＤ値の増強が認められた。さらに、これまでの結果と同様にＳＣ１２存在下ではＳＣ－ｗｔと比べ、ＯＤ値の更なる増強が認められた。一方で、同一の特異性を有した単量体ＩｇＡ２ｍ２（ｍＡ２）及び二量体ＩｇＡ１（ｄＡ１）を組み合わせたＨｏｍｏ群では、ＳＣ－ｗｔ又はＳＣ１２存在下においても、ＳＣ非存在下のＨｅｔｅｒｏ群に匹敵するＯＤ値は検出されなかった。
　以上の結果から、Ｈ１／ＨＡへの結合能の獲得は、三量体／四量体ＩｇＡ抗体の形成自体によるものではなく、Ｈ３／ＨＡに特異性を示す抗体クローン１５－１９ＬのｄＡ１とＨ１／ＨＡに特異性を示す抗体クローン１８－１８ＫのｍＡ２の二種類のＩｇＡ抗体分子が、一つの三量体／四量体ＩｇＡ抗体分子を形成したことによるものであることが示された。また、ＳＣ非存在下のＩｇＡ１とＩｇＡ２ｍ２のＩｇＡアロタイプの組み合わせにおいても、三量体／四量体ＩｇＡ抗体が形成された。さらにＳＣ－ｗｔ又はＳＣ１２存在下でＩｇＡ抗体を反応させることで、より効率良く二重特異性を有した三量体／四量体ＩｇＡ抗体を作製することができることが明らかとなった。
SEQ ID NO:1; Amino acid sequence of IgA1 constant region
SEQ ID NO:2; Amino acid sequence of IgA2m2 constant region
SEQ ID NO:3; Amino acid sequence of wild-type SC
SEQ ID NO:4; Amino acid sequence of SC12
SEQ ID NO:5; Amino acid sequence of wild-type SC containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:6; Amino acid sequence of SC12 containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:7; Nucleotide sequence of wild-type SC containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:8; Nucleotide sequence of SC12 containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:9; Nucleotide sequence of heavy chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:10; Amino acid sequence of heavy chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:11; Nucleotide sequence of light chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:12; Amino acid sequence of light chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:13; Nucleotide sequence of heavy chain variable region of 15-19L(H3 specific)
SEQ ID NO:14; Amino acid sequence of heavy chain variable region of 15-19L(H3 specific)
SEQ ID NO:15; Nucleotide sequence of light chain variable region of 15-19L(H3 specific)
SEQ ID NO:16; Amino acid sequence of light chain variable region of 15-19L(H3 specific)

Claims (18)

  1. 　二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造するための方法。
  2. 　さらに分泌片を混合することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記二量体ＩｇＡ抗体が第１の抗原結合部位を含み、前記単量体ＩｇＡ抗体が第２の抗原結合部位を含む、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体が製造される、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　第３の抗原結合部位を含む別の単量体ＩｇＡ抗体をさらに混合する、請求項３記載の方法。
  5. 　前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含む、請求項３記載の方法。
  6. 　前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含み、前記別の単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第３の抗原結合部位を含む、請求項４記載の方法。
  7. 　前記分泌片が野生型ＳＣ又はＳＣ変異体である、請求項２～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合することを含む、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記二量体ＩｇＡ抗体及び前記単量体ＩｇＡ抗体がそれぞれ別々に培養細胞で作製された組換えＩｇＡ抗体である、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　製造された三量体ＩｇＡ抗体及び四量体ＩｇＡ抗体を他のＩｇＡ抗体から分離することをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　製造された三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体を分離することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
  12. 　第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、及び第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域を含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体。
  13. 　さらに分泌片を含む、請求項１２記載の抗体。
  14. 　第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子との重合物である、請求項１２記載の抗体。
  15. 　第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子と、分泌片との重合物である、請求項１３記載の抗体。
  16. 　４つの第１のＦａｂ領域、及び少なくとも２つの第２のＦａｂ領域を含む、請求項１２～１５のいずれか１項記載の抗体。
  17. 　前記分泌片が野生型ＳＣ又はＳＣ変異体である、請求項１３、１５及び１６のいずれか１項記載の抗体。
  18. 　請求項１２～１７のいずれか１項記載の抗体を含む医薬組成物。
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