KR20210042325A - 조작된 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물이 적어도 2개의 Fc 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 유전자 조작 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 조성물 및 방법에 관한 것이다.
Description
많은 치료 항체는 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 Fc 도메인의 효과기 기능을 통해 선천적 면역계의 요소를 보충함으로써 작용한다. 개선된 치료 단백질에 대한 요구가 지속적으로 제기되고 있다.
본 발명은 항원 결합 도메인의 표적 특이성을 적어도 2개의 Fc 도메인과 조합하여 고유의 생물학적 활성을 갖는 새로운 치료제를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은, 상이한 표적 특이성을 갖는 다중 항원 결합 도메인(즉, 이중 특이적, 삼중 특이적, 또는 다중 특이적 단백질) 및 다중 폴리펩티드 사슬로부터의 다중 Fc 도메인을 가지며 여러 폴리펩티드 사슬로 구성된 작제물의 구축을 가능하게 한다. 항원 결합 도메인의 수, 표적 특이성, 및 간격은 표적 항원에 대한 작제물의 결합 특성(예컨대, 결합 친화력)을 변경하도록 조정될 수 있고, Fc 도메인의 수는 항원-결합 세포를 사멸시키는 효과기 기능의 크기를 제어하도록 조정될 수 있다. 돌연변이(즉, 본원에 기재된 바와 같은 이종이량체화 및/또는 동종이량체화 돌연변이)는 생성되는 원치 않는, 대안적으로 조립된 단백질 복합체의 수를 감소시키기 위해 작제물의 폴리펩티드에 도입된다. 일부 경우에, 이종이량체화 또는 동종이량체화 돌연변이는 (바람직하게는 CH3 도메인에서) Fc 도메인 단량체에 도입되고, 차별적으로 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 폴리펩티드 사슬이 원하는 작제물로 조립되도록 제어하기 위해, 작제물로 조립되는 상이한 폴리펩티드 사슬 사이에 배치된다. 이러한 돌연변이는 특정 Fc 도메인 단량체의 원하는 페어링을 선택적으로 안정화하고, 다른 Fc 도메인 단량체의 원치 않는 페어링을 선택적으로 불안정하게 한다. 일부 경우에, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 Fc 단량체 중 적어도 2개가 상이한 이종이량체화 돌연변이를 포함하는(이에 따라 서열이 서로 다른) 다중 Fc 도메인 단량체를 함유하는 제1 폴리펩티드, 예컨대 상이한 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개 이상의 Fc 단량체를 갖는 더 긴 폴리펩티드, 및 각각 적어도 하나의 Fc 단량체를 함유하는 적어도 2개의 추가 폴리펩티드(추가 폴리펩티드의 Fc 단량체는 서로 상이한 이종이량체화 돌연변이(및 이에 따라 상이한 서열)를 함유함), 예컨대 각각 상이한 이종이량체화 돌연변이를 갖는 단일 Fc 도메인 단량체를 함유하는 2개의 더 짧은 폴리펩티드에 의해 형성되는 "직교" Fc-항원 결합 도메인 작제물이다. 추가 폴리펩티드의 이종이량체화 돌연변이는 제1 폴리펩티드의 적어도 Fc 단량체의 이종이량체화 돌연변이와 양립할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명은 신규 치료제를 생성하기 위해 2개 이상의 항원 결합 도메인(예컨대, 치료 항체의 항원 결합 도메인)을 적어도 2개의 Fc 도메인과 조합하는 것을 고려한다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인들은 동일하다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인들은 상이하다. 이러한 작제물을 생성하기 위해, 본 발명은 적어도 2개의, 예컨대 다중의 Fc 도메인을 갖는 작제물의 조립을 위한 다양한 방법을 제공하며, 이들의 동종이량체화 및 이종이량체화를 제어하여, 제한된 수의 폴리펩티드 사슬로부터 개별 크기의 분자를 조립하기 위해, 이러한 폴리펩티드 또한 본 발명의 대상이다. 이들 작제물의 특성은 실질적으로 균질한 약학 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 약학 조성물에서의 이러한 균질성은 약학 조성물의 안전성, 효능, 균일성, 및 신뢰성을 보장하기 위해 바람직하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적어도 2개의 Fc 도메인을 갖는 신규 치료 작제물은 단일 Fc 도메인을 갖는 치료 단백질보다 더 큰 생물학적 활성을 갖는다.
제1 양태에서, 본 발명은 강화된 효과기 기능을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 특징으로 하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 적어도 2개의 항원 결합 도메인, 예컨대 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 항원 결합 도메인, 및 링커에 의해 제2 Fc 도메인에 연결된 제1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원 결합 도메인은 상이한 표적 특이성을 갖는다. 일부 경우에, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 선택적인 제3 링커; 및 선택적인 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 이종이량체화 선택성 모듈과 제2 이종이량체화 선택성 모듈은 상이한, 폴리펩티드에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 동종이량체화 선택성 모듈 또는 제1 또는 제2 이종이량체화 선택성 모듈과 동일한 이종이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제3 링커; 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제3 링커; 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 및 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체를 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제3 링커; 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 및 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체를 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 돌출부-형성 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고 돌출부-형성 돌연변이를 포함하지 않는 상기 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 역전하 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이들은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이들은 단일 아미노산 변화이다.
일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 글리신 스페이서이다. 일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30, 4 내지 20, 8 내지 30, 8 내지 20, 12 내지 20, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어진다.
일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A이다.
일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P이다.
일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 가지며, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는다.
일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환은 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이이거나 또는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 각각의 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 내 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결된 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리펩티드의 두 카피를 포함하는 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드의 각각의 카피는 동일하게, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 상기 폴리펩티드의 두 카피는 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체에서 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결된 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는, 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 IgG1 Fc 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이는 Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 단량체는 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제1 특이성 또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 제2 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드 복합체는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드에 추가로 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제3 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되고, 제2 및 제3 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 상이한 IgG1 Fc 도메인 단량체에 연결된다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제2 특이성 또는 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 제3 특이성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드 복합체는 단일 Fc 도메인 및 상이한 특이성의 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 복합체에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 강화된 효과기 기능을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 선택적인 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 선택적인 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하고, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 돌출부-형성 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고 돌출부-형성 돌연변이를 포함하지 않는 상기 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 역전하 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이들은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이들은 단일 아미노산 변화이다.
일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 글리신 스페이서이다. 일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30, 4 내지 20, 8 내지 30, 8 내지 20, 12 내지 20, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어진다.
일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A이다.
일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P이다.
일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 가지며, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는다.
일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환은 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이이거나 또는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 폴리펩티드는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드에 추가로 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 의해 연결되지 않은 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제3 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는, 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 단량체 또는 제3 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이는 Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하고 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하고 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 단량체 또는 제3 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드 복합체는 단일 Fc 도메인 및 상이한 특이성의 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 복합체에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 강화된 효과기 기능을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 조건 하에서 상기 구현예 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 10개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 10개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 10개, 8개, 6개, 또는 4개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 약학 조성물의 폴리펩티드의 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 미만은 Fc 도메인 단량체에 적어도 하나의 푸코스 변형을 갖는다.
본 발명의 모든 양태에서, Fc 도메인 단량체들의 일부 또는 전부(예를 들어, 10개, 8개, 6개, 또는 4개 이하의 단일 아미노산 치환을(예를 들어, CH3 도메인에서만) 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인 단량체)는 다른 아미노산 치환 또는 변형에 더하여 E345K 및 E430G 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 가질 수 있다. E345K 및 E430G 아미노산 치환은 Fc 도메인 다량체화를 증가시킬 수 있다.
정의:
본원에 사용된 용어 "Fc 도메인 단량체"는 적어도 힌지 도메인 및 제2 및 제3 항체 불변 도메인(CH2 및 CH3) 또는 이의 기능성 단편(예를 들어, 적어도 힌지 도메인 또는 이의 기능성 단편, CH2 도메인 또는 이의 기능성 단편, 및 CH3 도메인 또는 이의 기능성 단편)(예를 들어, (i) 다른 Fc 도메인 단량체와 이량체화되어 Fc 도메인을 형성할 수 있고, (ii) Fc 수용체에 결합될 수 있는 단편)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 바람직한 Fc 도메인 단량체는 아미노 말단에서 카복시 말단까지 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, 및 IgG1 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 따라서, Fc 도메인 단량체, 예컨대 인간 IgG1 Fc 도메인 단량체는 E316에서 G446 또는 K447까지, P317에서 G446 또는 K447까지, K318에서 G446 또는 K447까지, K318에서 G446 또는 K447까지, S319에서 G446 또는 K447까지, C320에서 G446 또는 K447까지, D321에서 G446 또는 K447까지, K322에서 G446 또는 K447까지, T323에서 G446 또는 K447까지, K323에서 G446 또는 K447까지, H324에서 G446 또는 K447까지, T325에서 G446 또는 K447까지, 또는 C326에서 G446 또는 K447까지 확장될 수 있다. Fc 도메인 단량체는 IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD(예컨대, IgG)를 포함하는 임의의 면역글로불린 항체 동형일 수 있다. 추가로, Fc 도메인 단량체는 IgG 아형(예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4)(예컨대, 인간 IgG1)일 수 있다. 인간 IgG1 Fc 도메인 단량체는 본원에 기재된 실시예에 사용된다. 인간 IgG1의 전체 힌지 도메인은 EU 넘버링 E316에서 P230 또는 L235까지 확장되고, CH2 도메인은 A231 또는 G236에서 K340까지 확장되고, CH3 도메인은 G341에서 K447까지 확장된다. 힌지 도메인의 마지막 아미노산의 위치에 대한 다른 견해가 있다. 이는 P230 또는 L235이다. 본원의 많은 예에서, CH3 도메인은 K347을 포함하지 않는다. 따라서, CH3 도메인은 G341에서 G446까지일 수 있다. 본원의 많은 예에서, 힌지 도메인은 E216 내지 L235를 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어 힌지가 CH1 도메인 또는 CD38 결합 도메인에 대한 카복시 말단인 경우에 해당된다. 일부 경우에, 예를 들어 힌지가 폴리펩티드의 아미노 말단에 있는 경우, EU 넘버링 221의 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. Fc 도메인 단량체는 항원 인식 영역, 예컨대 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 작용할 수 있는 면역글로불린의 어떤 부분도 포함하지 않는다. Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인과 Fc 수용체 간의 상호작용을 변경하는 야생형(예컨대, 인간) Fc 도메인 단량체 서열로부터의 10개만큼의 변화(예컨대, 1~10개, 1~8개, 1~6개, 1~4개의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실)를 포함할 수 있다. Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인 단량체 간의 상호작용을 변경하는 야생형 Fc 도메인 단량체 서열로부터의 10개만큼의 변화(예컨대, 단일 아미노산 변화)(예컨대, 1~10개, 1~8개, 1~6개, 1~4개의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실)를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 IgG1 CH3 도메인 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG와 비교하여 CH3 도메인에는 최대 10개, 8개, 6개, 또는 5개의 단일 아미노산 치환이 있다. 적합한 변화의 예는 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc 도메인"은 Fc 수용체에 결합할 수 있는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체를 지칭한다. 야생형 Fc 도메인에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 2개의 CH3 항체 불변 도메인 간의 상호작용뿐만 아니라 2개의 이량체화 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 이량체화된다.
본 발명에서, "Fc-항원 결합 도메인 작제물"이란 용어는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 Fc 도메인을 형성하고 적어도 하나의 "항원 결합 도메인"을 포함하는 회합된 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 동일하거나 상이한 서열을 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 Fc 도메인을 가질 수 있고, 이 중 2개는 IgG1 또는 IgG1-유래 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 세 번째 것은 IgG2 또는 IgG2-유래 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 다른 예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 Fc 도메인을 가질 수 있고, 이 중 2개는 "돌출부-함몰부 쌍"을 포함하고, 세 번째 것은 "돌출부-함몰부 쌍"을 포함하지 않으며, 예를 들어 세 번째 Fc 도메인은 돌출부-함몰부 쌍이 아닌 하나 이상의 정전기 스티어링 돌연변이를 포함하거나, 세 번째 Fc 도메인은 야생형 서열을 갖는다(즉, 돌연변이를 포함하지 않는다). Fc 도메인은 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, 또는 FcγRIV에 결합하는 최소 구조를 형성한다. 일부 경우에, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 Fc 단량체 중 적어도 2개가 상이한 이종이량체화 돌연변이를 포함하는(즉, Fc 단량체 각각이 상이한 돌출부-형성 돌연변이를 갖거나, 각각이 상이한 정전기 스티어링 돌연변이를 갖거나, 하나의 단량체가 돌출부-형성 돌연변이를 갖고 하나의 단량체가 정전기 스티어링 돌연변이를 가짐) 다중 Fc 도메인 단량체를 함유하는 제1 폴리펩티드를, 각각 적어도 하나의 Fc 단량체를 함유하는 적어도 2개의 추가 폴리펩티드(추가 폴리펩티드의 Fc 단량체는 서로 상이한 이종이량체화 돌연변이를 함유함, 즉 추가 폴리펩티드의 Fc 단량체가 상이한 돌출부-형성 돌연변이를 갖거나 상이한 정전기 스티어링 돌연변이를 갖거나, 하나의 단량체가 돌출부-형성 돌연변이를 갖고 하나의 단량체가 정전기 스티어링 돌연변이를 가짐)에 연결하여 형성되는 "직교" Fc-항원 결합 도메인 작제물이다. 추가 폴리펩티드의 이종이량체화 돌연변이는 제1 폴리펩티드의 적어도 Fc 단량체의 이종이량체화 돌연변이와 양립 가능하게 회합한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 도메인"은 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 회합된 폴리펩티드 세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, "항원 결합 도메인"은 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 최소 서열이다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 당업계에 공지된 다양한 면역검정, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA를 사용하여 항원에 대한 항체 특이성을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, "항원 결합 도메인"은 항체의 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들어 표 1A 또는 1B에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR, 표 2에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR, 또는 표 2에 기재된 항체의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은, 선택적으로 VL 도메인과 함께, VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체의 Fab 단편 또는 scFv이다. 항원 결합 도메인은 또한, 피브로넥틴 기반 결합 단백질(예를 들어, 피브로넥틴 III형 도메인(FN3) 모노바디)과 같은 표적에 특이적으로 결합하는 합성 유전자 조작 펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 표적 특이성을 갖는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 갖는다. 즉 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 이중 특이적, 삼중 특이적, 또는 다중 특이적이다. 일부 구현예에서, 상이한 표적 특이성의 항원 결합 도메인은 상이한 표적 분자, 예컨대 상이한 단백질 또는 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 상이한 표적 특이성의 항원 결합 도메인은 동일한 단백질의 상이한 부분, 예컨대 동일한 단백질의 상이한 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역"(CDR)은 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 일반적으로 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 및 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 Kabat에 의해 정의된 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인의 대략 잔기 24~34(CDR-L1), 50~56(CDR-L2), 및 89~97(CDR-L3), 및 중쇄 가변 도메인의 31~35(CDR-H1), 50~65(CDR-H2), 및 95~102(CDR-H3); 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"(즉, 경쇄 가변 도메인의 대략 잔기 26~32(CDR-L1), 50~52(CDR-L2), 및 91~96(CDR-L3), 및 중쇄 가변 도메인의 26~32(CDR-H1), 53~55(CDR-H2), 및 96~101(CDR-H3); 문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])로부터의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 Kabat에 따라 정의된 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 모두로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
"프레임워크 영역"(이하 FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각각의 가변 도메인은 일반적으로 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 식별되는 4개의 FR을 갖는다. CDR이 Kabat에 따라 정의된 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략 잔기 1~23(LCFR1), 35~49(LCFR2), 57~88(LCFR3), 및 98~107(LCFR4)에 위치하며, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기의 대략 잔기 1~30(HCFR1), 36~49(HCFR2), 66-94(HCFR3), 및 103~113(HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄의 대략 잔기 1~25(LCFR1), 33~49(LCFR2), 53~90(LCFR3), 및 97~107(LCFR4)에 위치하며, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기의 대략 잔기 1~25(HCFR1), 33~52(HCFR2), 56~95(HCFR3), 및 102~113(HCFR4)에 위치한다. 일부 경우에, CDR이 Kabat에 의해 정의된 CDR 및 초가변 루프의 것들 모두로부터의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 그에 따라 조정된다.
"Fv" 단편은 완전 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 밀접하게 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어지며, 이는 본질적으로, 예를 들어 scFv에서, 공유 결합일 수 있다. 이 구성에서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원 결합 부위를 정의한다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인, 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은, 일반적으로 힌지 시스테인에 의해 카복시 말단 근처에 공유 결합된 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다.
본원에 사용된 용어 "항체 불변 도메인"은 항체의 불변 영역 도메인(예를 들어, CL 항체 불변 도메인, CH1 항체 불변 도메인, CH2 항체 불변 도메인, 또는 CH3 항체 불변 도메인)에 상응하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 "촉진"이라는 용어는 조장하고 유리하게 하는 것, 예컨대 다른 별개의 Fc 도메인 단량체보다 서로 간에 결합 친화도가 더 높은 2개의 Fc 도메인 단량체에서 Fc 도메인의 형성을 유리하게 하는 것을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, 결합하여 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 도메인 단량체는 이들 각자의 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 양립성 아미노산 변형(예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 유전자 조작 함몰부, 및/또는 정전기 스티어링 돌연변이)을 가질 수 있다. 양립성 아미노산 변형은 이러한 아미노산 변형이 결여되거나 비양립성 아미노산 변형을 갖는 다른 Fc 도메인 단량체와 비교하여 이러한 Fc 도메인 단량체의 서로 간의 선택적 상호작용을 촉진하거나 유리하게 한다. 이는 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서의 아미노산 변형으로 인해, 아미노산 변형이 결여된 다른 Fc 도메인 단량체보다 서로를 향해 더 높은 친화도를 갖는 Fc 도메인 단량체 때문에 발생한다.
본원에 사용된 용어 "이량체화 선택성 모듈"은 2개의 도메인 단량체 간의 유리한 페어링(pairing)을 용이하게 하는 Fc 도메인 단량체의 서열을 지칭한다. "상보적" 이량체화 선택성 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 서로 간의 선택적 상호작용을 촉진하거나 유리하게 하는 이량체화 선택성 모듈이다. 상보적 이량체화 선택성 모듈은 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있다. 예시적인 상보적 이량체화 선택성 모듈은 본원에 기재되어 있으며, 표 4의 유전자 조작 돌출부-형성 및 함몰부-형성 돌연변이 또는 표 5의 정전기 스티어링 돌연변이로부터 선택된 상보적 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자 조작 함몰부"는 원래의 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 부피를 가져 CH3 항체 불변 도메인에 3차원 함몰부를 생성하는, 상이한 아미노산 잔기를 가진 CH3 항체 불변 도메인에 있는 원래의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 치환을 지칭한다. "원래의 아미노산 잔기"라는 용어는 야생형 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 코드에 의해 인코딩되는 자연 발생적 아미노산 잔기를 지칭한다. 유전자 조작 함몰부는, 예를 들어 표 4의 함몰부-형성 치환 돌연변이 중 임의의 하나 이상에 의해 형성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자 조작 돌출부"는 원래의 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 부피를 가져 CH3 항체 불변 도메인에 3차원 돌출부를 생성하는 상이한 아미노산 잔기를 가진 CH3 항체 불변 도메인에 있는 원래의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 치환을 지칭한다. "원래의 아미노산 잔기들"이라는 용어는 야생형 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 코드에 의해 인코딩되는 자연 발생적 아미노산 잔기들을 지칭한다. 유전자 조작 함몰부는, 예를 들어 표 4의 돌출부-형성 치환 돌연변이 중 임의의 하나 이상에 의해 형성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "돌출부-함몰부 쌍"은 제1 Fc 도메인 단량체가 이의 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 함몰부를 포함하는 한편 제2 Fc 도메인 단량체가 이의 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 돌출부를 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 Fc 도메인을 나타낸다. 돌출부-함몰부 쌍에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있는 유전자 조작 돌출부는 CH3 항체 불변 도메인간 계면에서의 정상적인 이량체 회합을 크게 교란시키지 않으면서 제2 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부와 상호작용하도록 위치한다. 돌출부-함몰부 쌍은, 예를 들어 표 4의 임의의 하나 이상의 함몰부-형성 치환 돌연변이와 임의의 하나 이상의 돌출부-형성 치환 돌연변이의 상보적 쌍을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체가 이들 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 형성을 촉진하는 상이한 역전하 돌연변이(예를 들어, 표 5의 돌연변이 참조)를 함유하는, 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭한다. 3개의 Fc 도메인, 즉 1개의 카복실 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "분지" Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서, 아미노 말단 "분지" Fc 도메인 각각은 이종이량체 Fc 도메인("분지 이종이량체 Fc 도메인"이라고도 함)일 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단과 관련하여 본원에 사용된 용어 "구조적으로 동일한"은 동일한 비율과 구성의 동일한 폴리펩티드 서열의 조립인 작제물을 지칭하며, 글리코실화와 같은 번역후 변형을 지칭하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "동종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체가 동일한 역전하 돌연변이(예를 들어, 표 5 및 표 6의 돌연변이 참조)를 함유하는, 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭한다. 3개의 Fc 도메인, 즉 1개의 카복실 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "분지" Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서, 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인은 동종이량체 Fc 도메인("줄기 동종이량체 Fc 도메인"이라고도 함)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이종이량체화 선택성 모듈"은 양립성 이종이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에서 이루어질 수 있는 유전자 조작 돌출부, 유전자 조작 함몰부, 및 특정 역전하 아미노산 치환을 지칭한다. 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 Fc 도메인 단량체는 결합하여 이종이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 이종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 4 및 표 5에 나타내어져 있다.
본원에 사용된 용어 "동종이량체화 선택성 모듈"은 동종이량체 Fc 도메인을 형성하도록 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화를 촉진하는 CH3 도메인 사이의 계면의 하전 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치의 Fc 도메인 단량체에서의 역전하 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어, 동종이량체화 선택성 모듈을 형성하는 역전하 돌연변이는 CH3 도메인 사이의 계면의 하전 잔기의 고리 내에 있는, (EU 넘버링에 따른) 위치 356, 357, 370, 392 , 399, 및/또는 409로부터의 적어도 2개의 아미노산에 있을 수 있다. 동종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 4 및 표 5에 나타내어져 있다. 따라서, D356은 K 또는 R로 변경될 수 있고; E357은 K 또는 R로 변경될 수 있고; K370은 D 또는 E로 변경될 수 있고; K392는 D 또는 E로 변경될 수 있고; D399는 K 또는 R로 변경될 수 있고; K409는 D 또는 E로 변경될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결"은 화학적 접합, 재조합 수단, 및 화학 결합(예컨대, 펩티드 결합, 이황화 결합, 및 아미드 결합)을 포함하는 수단에 의한 둘 이상의 요소, 성분, 또는 단백질 도메인(예컨대, 폴리펩티드)의 조합 또는 부착을 기술하는 데 사용된다. 예를 들어, 2개의 단일 폴리펩티드는 화학적 접합, 화학 결합, 펩티드 링커, 또는 임의의 다른 공유 결합 수단을 통해 연결되어 하나의 연속 단백질 구조를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인 및 Fc 도메인 단량체 모두를 인코딩하는 연속 핵산 서열로부터 발현됨으로써 Fc 도메인 단량체에 연결된다. 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인 단량체에 연결되며, 펩티드 링커의 N-말단은 화학 결합, 예컨대 펩티드 결합을 통해 항원 결합 도메인의 C-말단에 연결되고, 펩티드 링커의 C-말단은 화학 결합, 예컨대 펩티드 결합을 통해 Fc 도메인 단량체의 N-말단에 연결된다.
본원에 사용된 "회합"이라는 용어는 폴리펩티드(또는 하나의 단일 폴리펩티드 내의 서열)가 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)을 형성하도록 위치되게 하는 폴리펩티드(또는 하나의 단일 폴리펩티드 내의 서열) 간의 상호작용, 예컨대 수소 결합, 소수성 상호작용, 또는 이온성 상호작용을 기술하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 4개의 폴리펩티드, 예컨대 각각 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 2개의 폴리펩티드 및 각각 1개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 2개의 폴리펩티드는 회합하여 (예를 들어, 도 50 및 도 51에 도시된 바와 같이) 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 형성한다. 4개의 폴리펩티드는 이들의 각각의 Fc 도메인 단량체를 통하여 회합할 수 있다. 폴리펩티드 간의 회합은 공유 상호작용을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 요소, 예컨대 단백질 도메인 간의 연결을 지칭한다. 링커는 공유 결합 또는 스페이서일 수 있다. "결합"이라는 용어는 화학 결합, 예컨대 아미드 결합 또는 이황화 결합, 또는 화학 반응으로부터 생성되는 임의의 종류의 결합, 예컨대 화학적 접합을 지칭한다. "스페이서"라는 용어는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 공간 및/또는 가요성을 제공하기 위해 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 발생하는 모이어티(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체) 또는 아미노산 서열(예를 들어, 3~200개의 아미노산, 3~150개의 아미노산, 또는 3~100개의 아미노산 서열)을 지칭한다. 아미노산 스페이서는 (예를 들어, 이격된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 폴리펩티드 백본을 통해 연결된) 폴리펩티드의 1차 서열의 부분이다. 예를들어, Fc 도메인을 형성하는 2개의 힌지 영역 또는 2개의 Fc 도메인 단량체 간의 이황화 결합의 형성은 링커로 간주되지 않는다. 따라서, D356은 K 또는 R로 변경될 수 있고; E357은 K 또는 R로 변경될 수 있고; K370은 D 또는 E로 변경될 수 있고; K392는 D 또는 E로 변경될 수 있고; D399는 K 또는 R로 변경될 수 있고; K409는 D 또는 E로 로 변경될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "글리신 스페이서"는 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬로 연결하는 글리신만을 함유하는 링커를 지칭한다. 글리신 스페이서는 적어도 4, 8, 또는 12개의 글리신(예를 들어, 4~30, 8~30, 또는 12~30개의 글리신; 예를 들어, 12~30개, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 글리신)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 글리신 스페이서는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 27)의 서열을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "알부민-결합 펩티드"는 혈청 알부민에 대한 친화도를 가지며 이에 결합하도록 기능하는 12 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 지칭한다. 알부민-결합 펩티드는 상이한 기원, 예를 들어 인간, 마우스, 또는 랫트의 것일 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 Fc 도메인 단량체의 C-말단에 융합되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 혈청 반감기를 증가시킨다. 알부민-결합 펩티드는 Fc 도메인 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 직접 또는 링커를 통해 융합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정제 펩티드"는 폴리펩티드의 정제, 단리, 또는 동정에 사용될 수 있는 임의의 길이의 펩티드를 지칭한다. 정제 펩티드는, 예를 들어 세포 용해 혼합물로부터의 폴리펩티드의 정제 및/또는 폴리펩티드의 단리를 돕기 위해 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드는 정제 펩티드에 대해 특이적 친화도를 갖는 다른 모이어티에 결합한다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 매트릭스, 수지, 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 부착된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결될 수 있는 정제 펩티드의 예는 본원에 더 상세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "다량체"는 본원에 기재된 적어도 2개의 회합된 Fc 작제물 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드, 및 이의 단편 또는 부분을 지칭하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 가닥 또는 안티-센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 단일 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리펩티드로 번역된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단량체가 아미드 결합을 통해 함께 연결되는 아미노산 잔기인 단일 중합체를 말한다. 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합, 또는 합성에 의해 생성된 임의의 아미노산 서열을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 위치"는 단백질 또는 단백질 도메인에서의 아미노산의 위치 번호를 의미한다. 아미노산 위치는 표시된 경우(예를 들어, CDR 및 FR 영역에 대해) Kabat 넘버링 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed 5, 1991)을 사용하여 넘버링되며, 그렇지 않으면 EU 넘버링이 사용된다.
도 37a 내지 도 37d는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 인간 IgG1 Fc 도메인을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 변형"은 기준 서열(예컨대, 야생형, 비돌연변이, 또는 비변형 Fc 서열)과 비교하여, 약물동력학(PK) 및/또는 약물력학(PD) 특성, 혈청 반감기, 효과기 기능(예컨대, 세포 용해(예컨대, 항체-의존성 세포-매개 독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포 독성 활성(CDC)), 식균 작용(예컨대, 항체 의존성 세포성 식균 작용(ADCP) 및/또는 보체-의존성 세포 독성(CDCC)), 면역 활성, 및 T-세포 활성), Fc 수용체에(예컨대, Fc-감마 수용체(FcγR)(예컨대, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), 및/또는 FcγRIIIB(CD16b)), Fc-알파 수용체(FcαR), Fc-엡실론 수용체(FcεR), 및/또는 신생아의 Fc 수용체(FcRn)에) 대한 친화도, 보체 연쇄반응(compliment cascade)(예컨대, C1q)에 관여하는 단백질에 대한 친화도, 번역후 변형(예컨대, 글리코실화, 시알릴화), 응집 특성(예컨대, 이량체(예컨대, 동종이량체 및/또는 이종이량체) 및/또는 다량체를 형성하는 능력), 및 (예컨대, CH1 및 CL 간의 상호작용을 변경, 안정성을 변경, 및/또는 온도 및/또는 pH에 대한 감수성을 변경하는) Fc 작제물의 생물물리학적 특성에 영향을 끼칠 수 있고, 면역성 질환 및 염증성 질환의 치료 효능 개선을 촉진할 수 있는 Fc 도메인 폴리펩티드 서열의 변경을 지칭한다. 아미노산 변형은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 단일 아미노산의 변형이다. 다른 구현예에서, 아미노산 변형은 다수의(예컨대, 하나 초과의) 아미노산의 변형이다. 아미노산 변형은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입의 조합을 포함할 수 있다. 아미노산 변형의 설명에는 점 돌연변이(예를 들어, 단일 뉴클레오티드를 다른 것과 교환하는 것)와 같은 유전자(즉, DNA 및 RNA) 변경, Fc 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 및 결실(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 제거)이 포함된다.
특정 구현예에서, Fc 작제물 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 적어도 하나(예컨대, 1, 2, 또는 3개)의 Fc 도메인은 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20개 이상)의 아미노산 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, Fc 작제물 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 Fc 도메인 단량체는 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20개 이하)의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "퍼센트(%) 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한(즉, 갭은 최적의 정렬을 위해 후보 및 참조 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있으며, 비상동 서열은 비교를 위해 무시할 수 있음) 후에 기준 서열, 예를 들어 야생형 Fc 도메인 단량체의 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한, 후보 서열, 예를 들어 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 Fc 도메인 단량체의 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율을 지칭한다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 주어진 기준 서열에 대한, 이와의, 또는 이와 비교한 주어진 후보 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성(이는 주어진 기준 서열에 대한, 이와의, 또는 이와 비교한 특정 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 후보 서열로 대안적으로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x (A/B의 분율)
여기서, A는 후보 서열 및 기준 서열의 정렬에서 동일한 것으로 점수가 부여된 아미노산(또는 핵산) 잔기의 수이고, B는 기준 서열에서의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 총 수이다. 후보 서열의 길이가 기준 서열의 길이와 동일하지 않은 일부 구현예에서, 기준 서열에 대한 후보 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성은 후보 서열에 대한 기준 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성과 동일하지 않을 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물) 내의 Fc 도메인 단량체는 야생형 Fc 도메인 단량체의 서열(예를 들어, 서열번호 42)과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물) 내의 Fc 도메인 단량체는 서열 번호 43~48, 및 50~53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 48, 52, 및 53의 서열과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 본원에 추가로 기재된 서열번호 1~36(예컨대, 서열번호: 17, 18, 26, 및 27) 중 어느 하나의 서열과 적어도 75% 동일한(적어도 75%, 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체는 서열 번호 42~48 및 50~53 중 어느 하나의 서열과 최대 10개의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 다른 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체는 서열 번호 42~48 및 50~53 중 어느 하나의 서열에 비해 최대 10개의 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 단백질을 이들의 상응하는 핵산으로부터 발현하는 데 필요한 필수 세포 성분, 예컨대 세포기관을 포함하는 비히클을 지칭한다. 일반적으로 핵산은 당업계에 알려진 종래 기술(형질전환, 형질주입, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입 등)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함된다. 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 또는 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포(예컨대, CHO 세포)일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 숙주 세포는 원하는 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 데 사용되며, 이는 이후 결합하여 원하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약학 조성물"은 유효 성분뿐만 아니라 유효 성분을 투여 방법에 적합하도록 할 수 있는 하나 이상의 부형제 및 희석제를 함유하는 의약적 또는 약학적 제형을 지칭한다. 본 발명의 약학 조성물은 Fc-항원 결합 도메인 작제물과 양립 가능한 약학적으로 허용 가능한 성분을 포함한다. 약학 조성물은 일반적으로 정맥내 또는 피하 투여를 위한 수용액 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 "실질적으로 균질한 집단"은 비환원 SDS 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피로 측정시 조성물(예컨대, 세포 배양 배지 또는 약학 조성물) 내 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 적어도 50%가 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 집단이다. 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 실질적으로 균질한 집단은 정제 전에, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 정제 후에, 또는 임의의 Fab 또는 Fc-특이적 친화성 크로마토그래피 후에만 수득될 수 있다. 다양한 구현예에서, 조성물 내 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%는 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는다. 다른 구현예에서, 조성물 내 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 최대 85%, 90%, 92%, 또는 95%는 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학적 조성물 중의 부형제 또는 희석제를 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능해야 하고 피투여자에게 해가 없어야 한다. 본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 적절한 약학적 안정성을 제공해야 한다. 담체의 특성은 투여 방식에 따라 다르다. 예를 들어, 경구 투여의 경우, 고형 담체가 바람직하며; 정맥내 투여의 경우, 수용액 담체(예컨대, WFI 및/또는 완충액)가 일반적으로 사용된다.
본원에서 사용된 "치료 유효량"은 대상체 또는 환자에서 원하는 생물학적 효과를 유도하는 데 효과적이거나 본원에 기재된 질병 또는 장애를 갖는 환자를 치료하는 데 효과적인 양, 예컨대 약학적 투여량을 지칭한다. 본원에서 "치료 유효량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 1회 용량 또는 임의의 투여량 또는 경로로 투여되어 원하는 치료 효과를 제공하는 양으로 해석될 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다.
본원에 사용된 단편이라는 용어와 부분이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
도 1은 (동일한 폴리펩티드 사슬을 함께 연결하여 형성된) 2개의 Fc 도메인을 갖는 직렬 작제물 및 직렬 Fc 서열의 오프-레지스터 회합에 의해 생성된 종의 일부를 보여주는 개략도이다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다.
도 2는 (동일한 폴리펩티드 사슬을 함께 연결하여 형성된) 펩티드 링커에 의해 연결된 3개의 Fc 도메인을 갖는 직렬 작제물 및 직렬 Fc 서열의 오프-레지스터 회합에 의해 생성된 종의 일부를 보여주는 개략도이다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다.
도 3a 및 도 3b는 링커에 의해 연결되고 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 조립된 2개의 Fc 도메인(도 3a) 또는 3개의 Fc 도메인(도 3b)을 갖는 Fc 작제물의 개략도이다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 처리되어 있다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및/또는 - 기호는 CH3 도메인의 정전기 스티어링 돌연변이를 나타내기 위해 사용된다.
도 4의 A 내지 J는 3개의 Fc 도메인을 갖는 동일한 Fc 작제물 구조에 부착된 다양한 유형의 Fab 관련 항원 결합 도메인의 개략도이다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 특이성 A에 대해 평행사변형으로 도시되고 특이성 B에 대해 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및/또는 - 기호는 CH3 도메인의 정전기 스티어링 돌연변이를 나타내기 위해 사용된다. 패널 G에서, 문자 H 및 L은 각각 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 서열을 나타내기 위해 사용된다.
도 5는 작제물당 단일 유형의 Fc 이종이량체화 요소를 사용하는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고, 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로, 또는 O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 6은 2개의 직교 Fc 이종이량체화 요소를 사용하는 직렬 Fc 도메인을 갖는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고, 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 쌍 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 7은 2개의 직교 Fc 이종이량체화 요소를 사용하는 분지형 Fc 도메인을 갖는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고, 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 쌍 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로, 또는 O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 8은 항원 결합 도메인이 3개의 별개의 경쇄 또는 하나의 공통 경쇄를 사용하는 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 3개의 별개의 경쇄가 사용되는 경우, 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고; 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 한 유형의 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있고; 제3 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 다른 유형의 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 3으로 주석이 추가되어 있다. 공통 경쇄가 사용되는 경우, 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 공통 VL 도메인은 별표로 표지되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B, C-D, 또는 E-F 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, D, E, 또는 F로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 9는 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 폴리펩티드 사슬의 비대칭 배열에 의해 조립된 3개의 대칭 분포된 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 삼중 특이적 분지형 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 작제물은 2개의 고유 경쇄(1 또는 별표로 주석이 추가되어 있음)를 사용한다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 10은 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 폴리펩티드 사슬의 비대칭 배열에 의해 조립된 5개의 대칭 분포된 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 삼중 특이적 분지형 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 작제물은 2개의 고유 경쇄(1 또는 별표로 주석이 추가되어 있음)를 사용한다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 11a는 2개의 고유 경쇄 및 5개의 Fc 도메인을 사용한 대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기되고, O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 11b는 2개의 고유 경쇄 및 5개의 Fc 도메인을 사용한 대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기되고, O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 12는 2개의 고유 경쇄 및 4개 내지 5개의 Fc 도메인을 사용한 비대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B, C-D, 또는 E-F 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, D, E, 또는 F로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 13은 2개의 고유 경쇄 및 4개 내지 5개의 Fc 도메인을 사용한 비대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B, C-D, 또는 E-F 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, D, E, 또는 F로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 14a는 3개의 직렬 Fc 도메인 및 공통 경쇄를 사용하는 상이한 표적 특이성을 갖는 2개의 Fab를 갖는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 이중 특이적 Fc 작제물의 발현을 입증하기 위해 이중 특이적 Fc 작제물을 사용하였다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, 제2 특이성을 갖는 가변 도메인(VH)은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및 - 기호는 정전기 스티어링 돌연변이의 변경된 전하를 나타낸다.
도 14b는 도 14a의 Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질주입된 세포의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 레인 1 및 2에서의 250 kDa 밴드의 존재는 목적하는 이중 특이적 작제물의 형성을 보여준다. 세포가 3개의 직렬 Fc 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬 및 경쇄에 대한 유전자만으로 형질주입된, 레인 3 및 4에서의 250 kDa 밴드의 부재는 3개의 직렬 Fc 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬이 동종이량체를 형성하지 않음을 보여준다.
도 15a는 단일 Fc 도메인에 부착된 2개의 상이한 Fab 서열을 갖는 이중 특이적 항체의 개략도를 나타낸다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, 제2 표적 특이성을 갖는 가변 도메인(VH)은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및 - 기호는 정전기 스티어링 돌연변이의 변경된 전하를 나타낸다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다.
도 15b는 도 15a의 이중 특이적 항체로 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질주입된 세포의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각각의 Fab 도메인의 조립을 용이하게 하기 위한 항체의 Fab 도메인의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 상이한 세트의 돌연변이는 표 3에 나타내어져 있으며, 이들 항체에 대한 SDS-PAGE 결과는 레인 1~7에 나타내어져 있다. 레인 8은 3개의 Fc 도메인을 갖고 항원 결합 도메인이 없는 Fc 작제물을 포함한다. 150 kDa 밴드의 존재는 목적하는 작제물의 형성을 보여준다. 도 15c는 도 15b의 레인 1의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 15d는 도 15b의 레인 2의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 15e는 도 15b의 레인 3의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 15f는 도 15b의 레인 4의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 22)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2202)는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2206) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2222)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2208)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2226 및 2224) 각각은 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2214 및 2220)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2210 및 2216)를 포함한다. VL 함유 도메인(2204, 2212, 및 2218)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 17은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 23)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2302)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2330)과 직렬로 스페이서에 의해 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2310, 2308, 및 2306)를 포함한다. 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드(2336, 2334, 및 2332)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2316, 2322, 및 2328)과 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2312, 2318, 및 2324)를 포함한다. VL 함유 도메인(2304, 2314, 2320, 및 2326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 18은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 24)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2402 및 2436)는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2426 및 2424) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2430 및 2420)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2410 및 2412)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(2404 및 2434)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2432 및 2418)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2408 및 2414)를 포함한다. VL 함유 도메인(2406, 2416, 2422, 및 2428)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 19는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 25)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2502 및 2536)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2508 및 2526) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2532 및 2530)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2516 및 2518)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2504 및 2534) 각각은 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2510 및 2524)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2514 및 2520)를 포함한다. VL 함유 도메인(2506, 2512, 2522, 및 2528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 20은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 26)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2602 및 2656)는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2642 및 2640), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2644 및 2638), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2648 및 2634)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2618 및 2620)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2606, 2604, 2654, 및 2652)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2612, 2650, 2626, 및 2632)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2616, 2610, 2622, 및 2628)를 포함한다. VL 함유 도메인(2608, 2614, 2624, 2630, 2636, 및 2646)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 21은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 27)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2702 및 2756)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2712 및 2730), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2744 및 2742), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2748 및 2738)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2720 및 2722)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2706, 2704, 2754, 및 2752)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2714, 2728, 2750, 및 2736)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2718, 2724, 2710, 및 2732)를 포함한다. VL 함유 도메인(2708, 2716, 2726, 2743, 2740, 및 2746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 22는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 28)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2802 및 2856)는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2826 및 2828), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2810 및 2844), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2850 및 2848)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2824 및 2830)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2806, 2804, 2854, 및 2852)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2818, 2812, 2836, 및 2842)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2822, 2816, 2832, 및 2838)를 포함한다. VL 함유 도메인(2808, 2814, 2820, 2834, 2840, 및 2846)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 23은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 29)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2902)는 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2918)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 각각 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2908 및 2906)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(2920)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2914)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2910)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(2916)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(2904 및 2912)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 24는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 30)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3002)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3022)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 각각 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3008 및 3006)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3024)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3014)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3010)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3026)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3020)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3016)를 포함한다. VL 함유 도메인(3004, 3012, 및 3018)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 25는 2개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 31)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3102)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3122)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 각각 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3108 및 3106)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3126)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3114)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3110)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3124)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3120)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3116)를 포함한다. VL 함유 도메인(3104, 3112, 및 3118)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 26은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 32)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3202)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3226)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 세 번째가 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3210, 3208, 및 3206)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3230 및 3228)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3216 및 3222)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3212 및 3218)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3224)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(3204, 3214, 및 3220)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 27은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 33)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3302)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3330)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 세 번째가 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3310, 3308, 및 3306)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3336 및 3334)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3316 및 3322)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3312 및 3318)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3322)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3328)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3324)를 포함한다. VL 함유 도메인(3304, 3314, 3320, 및 3326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 28은 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 34)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3402)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3430)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 세 번째가 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3410, 3408, 및 3406)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3436 및 3434)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3416 및 3422)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3412 및 3418)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3432)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3428)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3424)를 포함한다. VL 함유 도메인(3404, 3414, 3420, 및 3426)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 29는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 35)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3502)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3526) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3530)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3510)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3536)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3524) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3520)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3512)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3504)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3532)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3508)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3534)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3518)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3514)를 포함한다. VL 함유 도메인(3506, 3516, 3522, 및 3528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 30은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 36)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3602 및 3644)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3610 및 3620), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3634 및 3632), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3638 및 3628)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3614 및 3616)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3612 및 3618)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3604 및 3642)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3640 및 3626)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3608 및 3622)를 포함한다. VL 함유 도메인(3606, 3624, 3630, 및 3636)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 31은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3702 및 3756)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3712 및 3730), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3744 및 3742), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3748 및 3738)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3720 및 3722)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3706 및 3754)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3714 및 3728)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3718 및 3724)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3704 및 3752)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3750 및 3736)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3710 및 3732)를 포함한다. VL 함유 도메인(3708, 3716, 3726, 3234, 3740, 및 3746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 32는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 38)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3802)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3808) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3832)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3816)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3836)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3826) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3830)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3818)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3804)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3810)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3814)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3834)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3824)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3820)를 포함한다. VL 함유 도메인(3806, 3812, 3822, 및 3828)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 33은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 39)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3902 및 3944)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3932 및 3930), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3934 및 3928), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3938 및 3924)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3912 및 3914)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3910 및 3916)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3904 및 3942)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3940 및 3922)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3908 및 3918)를 포함한다. VL 함유 도메인(3906, 3920, 3926, 및 3936)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 34는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 40)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4002 및 4056)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4042 및 4040), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4044 및 4038), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4048 및 4034)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4018 및 4020)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4006 및 4054)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4012 및 4026)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4016 및 4022)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4004 및 4052)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4050 및 4032)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4010 및 4028)를 포함한다. VL 함유 도메인(4008, 4014, 4024, 4030, 4036, 및 4046)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 35는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 41)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4102 및 4144)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4120 및 4122), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4108 및 4134), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4140 및 4138)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4118 및 4124)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4104 및 4142)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4112 및 4130)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4116 및 4126)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4110 및 4132)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(4106, 4114, 4128, 및 4136)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 36은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 42)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4202 및 4256)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4226 및 4228), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4210 및 4244), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4250 및 4248)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4224 및 4230)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4206 및 4254)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4218 및 4236)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4222 및 4232)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4204 및 4252)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4212 및 4242)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4216 및 4238)를 포함한다. VL 함유 도메인(4208, 4214, 4220, 4234, 4240, 및 4246)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 37a는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 43)을 나타낸다. 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있다.
도 37b는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 45)을 나타낸다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있고 K447이 없다.
도 37c는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 47)을 나타낸다. 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있고 447K가 없다.
도 37d는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 42)을 나타낸다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있다.
도 38a는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 29)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 38b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 29)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 39a는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 30)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 39b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 30)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 40a는 2개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 31)의 예시이다.
도 40b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 30)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 41a는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 32)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 41b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 31)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 42a는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 33)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 42b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 33)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 43a는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 34)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 43b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 34)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 44a는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 35)의 예시이다.
도 44b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 35)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 45a는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 45b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 46a는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 40)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 46b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 2는 (동일한 폴리펩티드 사슬을 함께 연결하여 형성된) 펩티드 링커에 의해 연결된 3개의 Fc 도메인을 갖는 직렬 작제물 및 직렬 Fc 서열의 오프-레지스터 회합에 의해 생성된 종의 일부를 보여주는 개략도이다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다.
도 3a 및 도 3b는 링커에 의해 연결되고 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 조립된 2개의 Fc 도메인(도 3a) 또는 3개의 Fc 도메인(도 3b)을 갖는 Fc 작제물의 개략도이다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 처리되어 있다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및/또는 - 기호는 CH3 도메인의 정전기 스티어링 돌연변이를 나타내기 위해 사용된다.
도 4의 A 내지 J는 3개의 Fc 도메인을 갖는 동일한 Fc 작제물 구조에 부착된 다양한 유형의 Fab 관련 항원 결합 도메인의 개략도이다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 특이성 A에 대해 평행사변형으로 도시되고 특이성 B에 대해 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및/또는 - 기호는 CH3 도메인의 정전기 스티어링 돌연변이를 나타내기 위해 사용된다. 패널 G에서, 문자 H 및 L은 각각 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 서열을 나타내기 위해 사용된다.
도 5는 작제물당 단일 유형의 Fc 이종이량체화 요소를 사용하는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고, 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로, 또는 O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 6은 2개의 직교 Fc 이종이량체화 요소를 사용하는 직렬 Fc 도메인을 갖는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고, 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 쌍 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 7은 2개의 직교 Fc 이종이량체화 요소를 사용하는 분지형 Fc 도메인을 갖는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고, 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 쌍 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로, 또는 O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 8은 항원 결합 도메인이 3개의 별개의 경쇄 또는 하나의 공통 경쇄를 사용하는 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 3개의 별개의 경쇄가 사용되는 경우, 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고 숫자 1로 주석이 추가되어 있고; 제2 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 한 유형의 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 2로 주석이 추가되어 있고; 제3 표적 특이성을 갖는 Fab 가변 도메인은 다른 유형의 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고 숫자 3으로 주석이 추가되어 있다. 공통 경쇄가 사용되는 경우, 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 공통 VL 도메인은 별표로 표지되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B, C-D, 또는 E-F 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, D, E, 또는 F로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 9는 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 폴리펩티드 사슬의 비대칭 배열에 의해 조립된 3개의 대칭 분포된 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 삼중 특이적 분지형 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 작제물은 2개의 고유 경쇄(1 또는 별표로 주석이 추가되어 있음)를 사용한다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 10은 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 폴리펩티드 사슬의 비대칭 배열에 의해 조립된 5개의 대칭 분포된 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 삼중 특이적 분지형 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 작제물은 2개의 고유 경쇄(1 또는 별표로 주석이 추가되어 있음)를 사용한다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 11a는 2개의 고유 경쇄 및 5개의 Fc 도메인을 사용한 대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기되고, O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 11b는 2개의 고유 경쇄 및 5개의 Fc 도메인을 사용한 대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기되고, O-O 동종이량체화 돌연변이에 대해 O로 표기된다.
도 12는 2개의 고유 경쇄 및 4개 내지 5개의 Fc 도메인을 사용한 비대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B, C-D, 또는 E-F 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, D, E, 또는 F로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 13은 2개의 고유 경쇄 및 4개 내지 5개의 Fc 도메인을 사용한 비대칭 분지형 Fc 백본에 기반한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 각각의 고유 폴리펩티드 사슬은 다르게 음영 또는 해시 처리되어 있다. 상이한 특이성을 갖는 Fab의 VH 도메인은 각각 1, 2, 또는 3으로 주석이 추가되어 있고, 직선면이 있는 평행사변형 또는 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되어 있다. Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되어 있다. 링커는 파선으로 도시되어 있다. 힌지 이황화 결합은 폴리펩티드 사슬을 연결하는 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B, C-D, 또는 E-F 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, D, E, 또는 F로 표기된다. Fc CH3 도메인은 J-K 또는 H-I 이종이량체화 돌연변이에 대해 J, K, H, 또는 I로 표기된다.
도 14a는 3개의 직렬 Fc 도메인 및 공통 경쇄를 사용하는 상이한 표적 특이성을 갖는 2개의 Fab를 갖는 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개략도를 나타낸다. 이중 특이적 Fc 작제물의 발현을 입증하기 위해 이중 특이적 Fc 작제물을 사용하였다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, 제2 특이성을 갖는 가변 도메인(VH)은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되어 있다. Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및 - 기호는 정전기 스티어링 돌연변이의 변경된 전하를 나타낸다.
도 14b는 도 14a의 Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질주입된 세포의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 레인 1 및 2에서의 250 kDa 밴드의 존재는 목적하는 이중 특이적 작제물의 형성을 보여준다. 세포가 3개의 직렬 Fc 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬 및 경쇄에 대한 유전자만으로 형질주입된, 레인 3 및 4에서의 250 kDa 밴드의 부재는 3개의 직렬 Fc 서열을 포함하는 폴리펩티드 사슬이 동종이량체를 형성하지 않음을 보여준다.
도 15a는 단일 Fc 도메인에 부착된 2개의 상이한 Fab 서열을 갖는 이중 특이적 항체의 개략도를 나타낸다. 제1 표적 특이성을 갖는 Fab 부분의 가변 도메인(VH + VL)은 평행사변형으로 도시되고, 제2 표적 특이성을 갖는 가변 도메인(VH)은 곡선면이 있는 평행사변형으로 도시되고, Fab 부분의 불변 도메인(CH1 + CL)은 직사각형으로 도시되고, Fc 부분의 도메인(CH2 및 CH3)은 타원형으로 도시되고, 링커는 파선으로 도시되고, 힌지 이황화 결합은 평행선의 쌍으로 도시되어 있다. CH3 타원은 노브-홀 쌍에 대한 노브를 나타내는 돌출부 및 홀을 나타내는 함몰부로 도시되어 있다. + 및 - 기호는 정전기 스티어링 돌연변이의 변경된 전하를 나타낸다. Fab 불변 도메인(CL 및 CH)은 A-B 또는 C-D 쌍 돌연변이에 대해 A, B, C, 또는 D로 표기된다.
도 15b는 도 15a의 이중 특이적 항체로 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로 형질주입된 세포의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각각의 Fab 도메인의 조립을 용이하게 하기 위한 항체의 Fab 도메인의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 상이한 세트의 돌연변이는 표 3에 나타내어져 있으며, 이들 항체에 대한 SDS-PAGE 결과는 레인 1~7에 나타내어져 있다. 레인 8은 3개의 Fc 도메인을 갖고 항원 결합 도메인이 없는 Fc 작제물을 포함한다. 150 kDa 밴드의 존재는 목적하는 작제물의 형성을 보여준다. 도 15c는 도 15b의 레인 1의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 15d는 도 15b의 레인 2의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 15e는 도 15b의 레인 3의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 15f는 도 15b의 레인 4의 정제된 작제물에 대한 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 22)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2202)는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2206) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2222)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2208)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2226 및 2224) 각각은 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2214 및 2220)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2210 및 2216)를 포함한다. VL 함유 도메인(2204, 2212, 및 2218)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 17은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 23)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2302)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2330)과 직렬로 스페이서에 의해 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2310, 2308, 및 2306)를 포함한다. 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드(2336, 2334, 및 2332)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2316, 2322, 및 2328)과 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2312, 2318, 및 2324)를 포함한다. VL 함유 도메인(2304, 2314, 2320, 및 2326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 18은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 24)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2402 및 2436)는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2426 및 2424) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2430 및 2420)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2410 및 2412)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(2404 및 2434)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2432 및 2418)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2408 및 2414)를 포함한다. VL 함유 도메인(2406, 2416, 2422, 및 2428)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 19는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 25)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2502 및 2536)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2508 및 2526) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2532 및 2530)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2516 및 2518)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2504 및 2534) 각각은 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2510 및 2524)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2514 및 2520)를 포함한다. VL 함유 도메인(2506, 2512, 2522, 및 2528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 20은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 26)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2602 및 2656)는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2642 및 2640), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2644 및 2638), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2648 및 2634)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2618 및 2620)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2606, 2604, 2654, 및 2652)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2612, 2650, 2626, 및 2632)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2616, 2610, 2622, 및 2628)를 포함한다. VL 함유 도메인(2608, 2614, 2624, 2630, 2636, 및 2646)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 21은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 27)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2702 및 2756)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2712 및 2730), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2744 및 2742), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2748 및 2738)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2720 및 2722)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2706, 2704, 2754, 및 2752)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2714, 2728, 2750, 및 2736)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2718, 2724, 2710, 및 2732)를 포함한다. VL 함유 도메인(2708, 2716, 2726, 2743, 2740, 및 2746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 22는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 28)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2802 및 2856)는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2826 및 2828), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2810 및 2844), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2850 및 2848)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2824 및 2830)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2806, 2804, 2854, 및 2852)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2818, 2812, 2836, 및 2842)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2822, 2816, 2832, 및 2838)를 포함한다. VL 함유 도메인(2808, 2814, 2820, 2834, 2840, 및 2846)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 23은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 29)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2902)는 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2918)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 각각 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2908 및 2906)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(2920)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2914)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2910)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(2916)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(2904 및 2912)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 24는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 30)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3002)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3022)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 각각 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3008 및 3006)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3024)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3014)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3010)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3026)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3020)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3016)를 포함한다. VL 함유 도메인(3004, 3012, 및 3018)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 25는 2개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 31)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3102)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3122)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 각각 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3108 및 3106)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3126)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3114)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3110)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3124)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3120)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3116)를 포함한다. VL 함유 도메인(3104, 3112, 및 3118)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 26은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 32)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3202)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3226)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 세 번째가 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3210, 3208, 및 3206)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3230 및 3228)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3216 및 3222)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3212 및 3218)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3224)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(3204, 3214, 및 3220)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 27은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 33)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3302)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3330)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 세 번째가 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3310, 3308, 및 3306)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3336 및 3334)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3316 및 3322)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3312 및 3318)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3322)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3328)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3324)를 포함한다. VL 함유 도메인(3304, 3314, 3320, 및 3326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 28은 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 34)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3402)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3430)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 세 번째가 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3410, 3408, 및 3406)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3436 및 3434)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3416 및 3422)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3412 및 3418)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3432)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3428)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3424)를 포함한다. VL 함유 도메인(3404, 3414, 3420, 및 3426)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 29는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 35)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3502)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3526) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3530)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3510)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3536)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3524) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3520)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3512)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3504)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3532)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3508)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3534)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3518)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3514)를 포함한다. VL 함유 도메인(3506, 3516, 3522, 및 3528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 30은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 36)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3602 및 3644)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3610 및 3620), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3634 및 3632), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3638 및 3628)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3614 및 3616)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3612 및 3618)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3604 및 3642)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3640 및 3626)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3608 및 3622)를 포함한다. VL 함유 도메인(3606, 3624, 3630, 및 3636)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 31은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3702 및 3756)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3712 및 3730), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3744 및 3742), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3748 및 3738)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3720 및 3722)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3706 및 3754)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3714 및 3728)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3718 및 3724)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3704 및 3752)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3750 및 3736)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3710 및 3732)를 포함한다. VL 함유 도메인(3708, 3716, 3726, 3234, 3740, 및 3746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 32는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 38)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3802)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3808) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3832)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3816)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3836)는 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3826) 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3830)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3818)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3804)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3810)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3814)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3834)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3824)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3820)를 포함한다. VL 함유 도메인(3806, 3812, 3822, 및 3828)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 33은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 39)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3902 및 3944)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3932 및 3930), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3934 및 3928), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3938 및 3924)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3912 및 3914)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3910 및 3916)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3904 및 3942)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3940 및 3922)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3908 및 3918)를 포함한다. VL 함유 도메인(3906, 3920, 3926, 및 3936)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 34는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 40)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4002 및 4056)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4042 및 4040), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4044 및 4038), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4048 및 4034)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4018 및 4020)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4006 및 4054)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4012 및 4026)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4016 및 4022)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4004 및 4052)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4050 및 4032)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4010 및 4028)를 포함한다. VL 함유 도메인(4008, 4014, 4024, 4030, 4036, 및 4046)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 35는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 41)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4102 및 4144)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4120 및 4122), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4108 및 4134), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4140 및 4138)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4118 및 4124)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4104 및 4142)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4112 및 4130)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4116 및 4126)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4110 및 4132)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(4106, 4114, 4128, 및 4136)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 36은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 42)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4202 및 4256)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4226 및 4228), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4210 및 4244), 및 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4250 및 4248)에 직렬로 스페이서에 의해 연결된, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4224 및 4230)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4206 및 4254)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4218 및 4236)에 직렬로 연결된 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4222 및 4232)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4204 및 4252)는 N-말단에 VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4212 및 4242)에 직렬로 연결된 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4216 및 4238)를 포함한다. VL 함유 도메인(4208, 4214, 4220, 4234, 4240, 및 4246)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 37a는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 43)을 나타낸다. 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있다.
도 37b는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 45)을 나타낸다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있고 K447이 없다.
도 37c는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 47)을 나타낸다. 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있고 447K가 없다.
도 37d는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 42)을 나타낸다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄이 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 표시되어 있지 않고, CH3 영역은 밑줄이 표시되어 있다.
도 38a는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 29)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 38b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 29)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 39a는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 30)의 예시이다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 39b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 30)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 40a는 2개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 31)의 예시이다.
도 40b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 30)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 41a는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 32)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 41b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 31)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 42a는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 33)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 42b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 33)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 43a는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 34)의 예시이다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 43b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 34)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 44a는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 35)의 예시이다.
도 44b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(대안적 작제물 35)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 45a는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 45b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
도 46a는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 40)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다.
도 46b는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)에 대한 예시적인 아미노산 서열이다.
많은 치료 항체는 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 Fc 도메인의 효과기 기능을 통해 선천적 면역계의 요소를 보충함으로써 작용한다. 일부 경우에, 본 발명은 고유의 생물학적 활성을 갖는 신규 치료제를 생성하기 위해 단일 Fc 도메인 함유 치료제, 예를 들어 공지의 치료 항체의 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 적어도 2개의 Fc 도메인과 조합하는 것을 고려한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 신규 치료제는 단일 Fc-도메인 함유 치료제, 예를 들어 공지의 치료 항체보다 큰 생물학적 활성을 갖는다. 적어도 2개의 Fc 도메인의 존재는 효과기 기능을 강화하고, ADCP 및/또는 CDC와 조합된 ADCC와 같은 다중 효과기 기능을 활성화하여, 치료 분자의 효능을 증가시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은, 함께 연결되어 동일한 단백질을 형성하는 폴리펩티드에 다중 직교 이종이량체화 기술(예를 들어, 표 4 및 표 5에서 선택된 2개의 상이한 세트의 돌연변이) 및/또는 동종이량체화 기술(예를 들어, 표 6 및 표 7에서 선택된 돌연변이)을 도입함으로써 다중 Fc 도메인을 갖는 항원-결합 단백질의 구축을 가능하게 한다. 동일한 단백질로 조립되는 폴리펩티드에 다중 이종이량체화 돌연변이 및/또는 동종이량체화 돌연변이를 도입하는, 본원에 기재된 설계 원리는, 예를 들어 직렬 Fc 도메인을 갖는 항체-유사 단백질, 대칭적으로 분지된 단백질, 비대칭적으로 분지된 단백질, 및 다중 특이적 항원-표적 단백질을 포함하는 매우 다양한 단백질의 구성을 생성할 수 있다. 본원에 기재된 설계 원리는 원치 않는 고차 구조 또는 제어되지 않은 복합체의 형성을 불리하게 하면서 복잡한 단백질 구성의 제어된 생성을 가능하게 한다.
본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 링커에 의해 함께 연결되는 적어도 2개의 항원-결합 도메인 및 적어도 2개의 Fc 도메인을 함유할 수 있으며, Fc 도메인 중 적어도 2개는 서로 상이하다(예를 들어, 작제물의 적어도 하나의 Fc 도메인은 항원-결합 도메인(예컨대, VH 도메인 CH1 도메인)에 연결되고 작제물의 적어도 하나의 Fc 도메인은 항원-결합 도메인에 연결되지 않거나, 또는 작제물의 2개의 Fc 도메인은 상이한 항원-결합 도메인에 연결된다). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 링커에 의해 분리된 2개 이상의 Fc 단량체를 함유하는 하나의 긴 펩티드 사슬의 발현, 및 각각 긴 펩티드 사슬의 하나 이상의 특정 Fc 단량체에 우선적으로 결합하도록 설계된 단일 Fc 단량체를 함유하는 2개 이상의 상이한 짧은 펩티드 사슬의 발현에 의해 제조된다. 임의의 수의 Fc 도메인이 이러한 방식으로 직렬로 연결되어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 Fc 도메인을 갖는 작제물을 생성할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물은 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2018/012689, WO 2015/168643, WO2017/151971, WO 2017/205436, 및 WO 2017/205434에 기재된, 2개 이상의 Fc 도메인을 갖는 분자를 조립하기 위한 Fc 유전자 조작 방법을 사용할 수 있다. 유전자 조작 방법은 1개 또는 2개 세트의 이종이량체화 선택성 모듈을 사용하여 직교 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 22~42; 도 4 내지 도 13; 도 16 내지 도 36: (i) 상이한 역전하 돌연변이를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈(표 5) 및(ii) 유전자 조작 함몰부 및 돌출부를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈(표 4))을 정확하게 조립한다. 각각의 Fc 단량체 폴리펩티드에 특정 아미노산 치환을 도입함으로써, 작제물의 특정 Fc 도메인으로 조립되도록 설계된 Fc 단량체 쌍에 임의의 이종이량체화 선택성 모듈이 혼입될 수 있다. 이종이량체화 선택성 모듈은 상이한 이종이량체화 선택성 모듈의 돌연변이를 갖는 Fc 단량체와의 회합을 불리하게 하면서, 특정 이종이량체화 선택성 모듈의 상보적 아미노산 치환을 갖는 Fc 단량체 간의 회합을 조장하도록 설계된다. 이러한 이종이량체화 돌연변이는 더 작거나 큰 복합체의 형성을 최소화하면서, 상이한 Fc 단량체 폴리펩티드가 작제물의 상이한 Fc 도메인의 원하는 직렬 구성으로 조립되도록 한다. 이러한 작제물의 특성은 약학 조성물의 안전성, 효능, 균일성, 및 신뢰성을 보장하는 데 바람직한 실질적으로 균질한 약학 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 조립은 본원에 기재된 바와 같은 두 세트의 이종이량체화 돌연변이 사이의 상이한 정전기 스티어링 돌연변이를 사용하여 달성될 수 있다. 정전기 스티어링 돌연변이의 일례는 Fc 단량체의 제1 노브에서의 E357K 및 Fc 단량체의 제1 홀에서의 K370D이며(이들 Fc 단량체는 회합하여 제1 Fc 도메인을 형성함), Fc 단량체의 제2 노브에서의 D399K 및 Fc 단량체의 제2 홀에서의 K409D이다(이들 Fc 단량체는 회합하여 제2 Fc 도메인을 형성함).
일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 결합 특성, 예컨대 (동일하거나 상이한 표적에 대한) 상이한 결합 친화도 또는 상이한 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 적어도 2개의 항원-결합 도메인(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 항원-결합 도메인)을 갖는다. Fc-항원 결합 도메인 작제물의 폴리펩티드 중 2개 이상이 상이한 항원-결합 도메인을 포함하는 상기 Fc 스캐폴드로부터 이중 특이적, 삼중 특이적, 또는 다중 특이적 작제물이 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 작제물의 항원 결합 도메인은 상이한 표적 특이성을 갖는다. 즉 항원 결합 도메인은 상이한 표적 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 장쇄 폴리펩티드는 제1 특이성의 하나의 항원-결합 도메인을 포함하고, 단쇄 폴리펩티드는 제2 특이성의 상이한 항원-결합 도메인을 포함한다. 상이한 항원 결합 도메인은 상이한 경쇄 또는 공통 경쇄를 사용할 수 있거나, 또는 scFv 도메인 또는 Fab 관련 도메인으로 이루어질 수 있다(도 4 참조). 이 개념의 대표적인 예는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 22~42(도 16 내지 도 36) 및 도 4 내지 도 13의 작제물이다.
동종이량체화 돌연변이가 있거나 없는 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이, 즉 직교 이종이량체화 돌연변이를 사용하여 이중 특이적 및 삼중 특이적 작제물이 생성될 수 있다(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 22~42; 도 16 내지 도 36; 도 4 내지 도 13). 이러한 이종이량체화 서열은 다른 이종이량체화 서열과의 회합을 불리하게 하는 방식으로 설계되어야 한다. 이러한 설계는 본원에 기재된 바와 같이 두 세트의 이종이량체화 돌연변이 사이의 상이한 정전기 스티어링 돌연변이 및/또는 두 세트의 이종이량체화 돌연변이 사이의 상이한 돌출부-함몰부 돌연변이를 사용하여 달성될 수 있다. 직교 정전기 스티어링 돌연변이의 일례는 제1 노브 Fc에서의 E357K, 제1 홀 Fc에서의 K370D, 제2 노브 Fc에서의 D399K, 및 제2 홀 Fc에서의 K409D이다.
I. Fc 도메인 단량체
Fc 도메인 단량체는 힌지 도메인, CH2 항체 불변 도메인, 및 CH3 항체 불변 도메인(예를 들어, 선택적인 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG1 힌지, CH2 항체 불변 도메인, 및 CH3 항체 불변 도메인)의 적어도 일부를 포함한다. Fc 도메인 단량체는 면역글로불린 항체 동형 IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD의 것일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 또한 임의의 면역글로불린 항체 동형(예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4)의 것일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 또한, 예를 들어 IgG1로부터의 힌지 및 CH2를 갖고 IgA로부터의 CH3을 갖거나, IgG1로부터의 힌지 및 CH2를 갖지만 IgG3으로부터의 CH3을 갖는 혼성체일 수 있다. Fc 도메인 단량체의 이량체는 백혈구의 표면에 위치한 수용체인, Fc 수용체, 예컨대 FcγRIIIa에 결합할 수 있는 (본원에서 추가로 정의된) Fc 도메인이다. 본 발명에서, Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인은 서로의 회합을 촉진하기 위해 CH3-CH3 항체 불변 도메인의 계면에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 N-말단 또는 C-말단에 부착된 추가 모이어티, 예를 들어 알부민-결합 펩티드 또는 정제 펩티드를 포함한다. 본 발명에서, Fc 도메인 단량체는 어떤 유형의 항체 가변 영역, 예컨대 VH, VL, 상보성 결정 영역(CDR), 또는 초가변 영역(HVR)도 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 42의 서열과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)의 Fc 도메인 단량체는 서열 번호 43, 44, 46, 47, 48, 및 50~53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 Fc 도메인 단량체는 서열 번호 48, 52, 및 53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
서열 번호 42
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서열번호 44
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서열번호 46
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서열번호 48
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서열번호 50
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서열번호 51
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서열번호 52
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서열번호 53
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II. Fc 도메인
본원에 정의된 바와 같이, Fc 도메인은 CH3 항체 불변 도메인 간의 상호작용으로 이량체화되는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. Fc 도메인은 Fc 수용체, 예컨대 Fc-감마 수용체(즉, Fcγ 수용체(FcγR)), Fc-알파 수용체(즉, Fcα 수용체(FcαR)), Fc-엡실론 수용체(즉, Fcε 수용체(FcεR)), 및/또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 최소 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 Fcγ 수용체(예컨대, FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16a), FcγRIIIb(CD16b)), 및/또는 FcγRIV 및/또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합한다.
III. 항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 특정 표적 분자 또는 표적 분자의 세트에 결합하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 항원 결합 도메인은 항체의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체-작제물의 단편, 예를 들어 표적 항원에 결합하는 항체의 최소 부분일 수 있다. 항원 결합 도메인은 또한, 피브로넥틴 기반 결합 단백질(예를 들어, FN3 모노바디)과 같이 표적에 특이적으로 결합하는 합성 유전자 조작 펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 리간드 또는 수용체일 수 있다. 단편 항원-결합(Fab) 단편은 표적 항원에 결합하는 항체의 영역이다. 이는 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다. Fab 단편은 VH, VL, CH1, 및 CL 도메인을 포함한다. 가변 도메인 VH 및 VL은 각각 단량체의 아미노 말단에 3개 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 함유한다. Fab 단편은 면역글로불린 항체 동형 IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD의 것일 수 있다. Fab 단편 단량체는 또한 임의의 면역글로불린 항체 동형(예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4)의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 면역글로불린의 프로테아제 처리(예를 들어, 펩신)의 제2 동일 Fab 단편에 공유 결합으로 부착되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Fab는, 예를 들어 도메인 사이에 링커로 융합된 가변 도메인 및 불변 도메인 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드로 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, Fab 단편의 일부만이 항원 결합 도메인으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, Fab의 경쇄 성분(VL + CL)만이 사용될 수 있거나, Fab의 중쇄 성분(VH + CH)만이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, Fab 가변 영역의 VH와 VL 사슬의 융합 단백질인 단일-사슬 가변 단편(scFv)이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 직렬 Fd 분절 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하고 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는 선형 항체가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 당업계에 알려진 임의의 Fab 관련 작제물일 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 통해 경쇄 가변 도메인을 중쇄 가변 도메인에 융합하여 형성된 단일 사슬 가변 단편(sFv) 도메인일 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-83, 1988] 참조. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 낙타과 중쇄 항체 기반의 가변 중쇄(VHH) 또는 나노바디 도메인일 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kastelic et al., J. Immunol. Methods, 350: 54-62, 2009] 참조. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 돔발상어과 중쇄 항체 기반의 가변 신규 항원 수용체(VNAR) 단편일 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Greenberg et al., Eur. J. Immunol., 26:1123-9, 1996] 참조. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 2개의 펩티드 서열을 생성함으로써 형성될 수 있는 디아바디(Db)일 수 있다. 예를 들어, 항원 A 특이적 가변 경쇄 도메인이 항원 B 특이적 가변 중쇄 도메인에 짧은 펩티드 링커를 통해 융합되어 단일 폴리펩티드 사슬로 발현될 수 있다. 항원 B 특이적 가변 경쇄 도메인에 짧은 펩티드 링커를 통해 융합된 항원 A 특이적 가변 중쇄 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬로 조합된 경우, 디아바디는 항원 A 및 B에 대한 결합 도메인으로 형성된다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-8, 1993] 참조. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 디아바디의 두 사슬 사이에 펩티드 링커를 추가하여 형성될 수 있는 단일 사슬 디아바디(scDb)일 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Brusselbach et al., Tumor Targeting, 4:115-23, 1999] 참조.
항원 결합 도메인은 본원에 기재된 Fc-함유 폴리펩티드 내의 다양한 위치에서 다양한 수로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 Fc-함유 폴리펩티드의 N-말단에, C-말단에, 및/또는 Fc 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 펩티드 링커는 항원 결합 도메인, 예컨대 Fab 도메인과 Fc-함유 폴리펩티드의 Fc 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 일련의 연결된 다중 항원 결합 도메인(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 항원 결합 도메인)은 폴리펩티드 사슬을 따라 임의의 위치에 배치될 수 있다(Wu et al., Nat. Biotechnology, 25:1290-1297, 2007).
일부 구현예에서, 2개 이상의 항원 결합 도메인은 Fc-도메인 함유 폴리펩티드에서 또는 다수의 Fc-도메인 함유 폴리펩티드로 이루어진 단백질 복합체에서 서로에 대해 다양한 거리로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원 결합 도메인은, 예를 들어 단일클론 항체에서와 같이 동일한 Fc 도메인에서 서로 가까이 배치된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원 결합 도메인은 서로에 대해 더 멀리 떨어져 배치되는데, 예를 들어 항원 결합 도메인은 단백질 구조에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 Fc 도메인만큼 서로 분리된다.
일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 표적 특이성을 갖는 2개 이상의 항원 결합 도메인, 예를 들어 상이한 표적 특이성을 갖는 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 열거된 표적 또는 항원에 대해, 열거된 표적 또는 항원에 대한 표 1A 또는 1B에 열거된 CDR 서열 중 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 6개 모두를 포함하며, 이는 하기 표 1A 또는 1B에 추가로 상세히 제공된다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개 이상의 항원-결합 도메인을 갖고, 이들 각각은 열거된 표적 또는 항원에 대한 표 1A 또는 1B에 열거된 CDR 서열 중 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 6개 모두를 갖고, 여기서 2개 이상의 항원 결합 도메인은 상이한 CDR 서열을 갖는데, 예를 들어 CDR 서열 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개가 Fc 작제물의 항원 결합 도메인 간에 상이하다.
[표 1A]
[표 1B] 가변 도메인 서열
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2204/2222)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2330/2304)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2918/2904)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2914/2912)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3014/3012)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3122/3104)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3120/3118)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3114/3112)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3226/3204)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3430/3404)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3428/3426)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3532/3506)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3518/3516)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3810/3812)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3824/3822)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 표 1A 또는 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(예컨대, Fab 또는 scFv)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬에 포함된 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab는 표 2에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬에 포함된 CDR을 포함하며, VH and VL 서열의 나머지는 표 2의 항체의 VH and VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다. 일부 구현예에서, Fab는 표 1B에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬에 포함된 CDR을 포함하며, VH and VL 서열의 나머지는 표 1B의 항체의 VH and VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
[표 2]
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2204/2222)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2330/2304)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2328/2326, 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2918/2904)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2914/2912)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3014/3012)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3122/3104)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3120/3118)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3114/3112)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3226/3204)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3430/3404)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3428/3426)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3532/3506)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3518/3516)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3810/3812)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3824/3822)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2204/2222)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2330/2304)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2918/2904)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2914/2912)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3014/3012)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3122/3104)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3120/3118)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3114/3112)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3226/3204)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3430/3404)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3428/3426)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3532/3506)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3518/3516)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3810/3812)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3824/3822)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2204/2222)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 16의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2330/2304)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 17의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 18의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 19의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 20의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 21의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 22의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2918/2904)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 23의 2914/2912)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 24의 3014/3012)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3122/3104)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3120/3118)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 25의 3114/3112)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3226/3204)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 26의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 27의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3430/3404)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3428/3426)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 28의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3532/3506)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 29의 3518/3516)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 30의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 31의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3810/3812)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 32의 3824/3822)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 33의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 34의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 35의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 36의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2 또는 표 1B에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
항원 결합 도메인 이종이량체화 돌연변이
일부 경우에, 본원에 기재된 Fc 작제물의 항원 결합 도메인에 하나 이상의 이종이량체화 기술을 통합하여 작제물에서의 항원 결합 도메인의 조립을 촉진할 수 있다. 항원 결합 도메인에서의 이종이량체화 기술의 사용은 2개 이상의 상이한 항원 결합 도메인이 Fc 작제물에 부착되는 경우, 예를 들어 상이한 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인이 이중 특이적 또는 삼중 특이적 Fc 작제물에 부착되는 경우에 특히 유용하다. 예를 들어, 첫 번째 이종이량체화 기술은 제1 표적 특이성을 갖는 제1 Fab 도메인에 통합될 수 있고, 두 번째 이종이량체화 기술은 제2 표적 특이성을 갖는 제2 Fab 도메인에 통합될 수 있다. 첫 번째 이종이량체화 기술은 제1 Fab의 중쇄 또는 경쇄와 제2 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 회합을 억제하면서, 제1 Fab의 중쇄와 경쇄의 회합을 촉진한다. 마찬가지로, 두 번째 이종이량체화 기술은 제2 Fab의 중쇄 또는 경쇄와 제1 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 회합을 억제하면서, 제2 Fab의 중쇄와 경쇄의 회합을 촉진한다.
일부 구현예에서, 표 3에 있는 하나 이상의 이종이량체화 기술이 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 하나 이상의 항원 결합 도메인에 도입된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Liu et al., J. Biol.Chem. 290:7535-7562, 2015; Schaefer et al, Cancer Cell, 20:472-86, 2011; Lewis et al, Nat Biotechnol, 32:191-8, 2014; Wu et al, MAbs, 7:364-76, 2015; Golay et al, J Immunol, 196:3199-211, 2016; 및 Mazor et al, MAbs, 7:377-89, 2015]에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 이종이량체화 기술을 갖는다. 일부 구현예에서, 이종이량체화 기술은 항원 결합 도메인의 VH 도메인, CH1 도메인, VL 도메인, 및/또는 CL 도메인에 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종이량체화 기술은 항원 결합 도메인의 VH 도메인, CH1 도메인, VL 도메인, 및/또는 CL 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이일 수 있다.
[표 3] Fab 아암 이종이량체화 방법
IV. 이량체화 선택성 모듈
본 발명에서, 이량체화 선택성 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 바람직한 페어링을 용이하여 Fc 도메인을 형성하는 Fc 도메인 단량체 내의 성분 또는 선택 아미노산을 포함한다. 구체적으로, 이량체화 선택성 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에 위치한 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 부분이다. 이량체화 선택성 모듈에서, 아미노산 치환은 이들 치환을 위해 선택된 아미노산의 양립성의 결과로서 2개의 CH3 항체 불변 도메인의 이량체화를 유리하게 한다. 유리한 Fc 도메인의 최종 형성은 이량체화 선택성 모듈이 결여되거나 이량체화 선택성 모듈 내의 비양립성 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인 단량체로부터 형성되는 다른 Fc 도메인에 대해 선택적이다. 이러한 유형의 아미노산 치환은 QuikChange® 돌연변이 유발과 같은 당업계에 잘 알려진 통상적인 분자 클로닝 기술을 사용하여 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 CH3 항체 불변 도메인에 (본원에서 추가로 기술되는) 유전자 조작 함몰부를 포함한다. 다른 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 CH3 항체 불변 도메인에 (본원에서 추가로 기술되는) 유전자 조작 돌출부를 포함한다. Fc 도메인을 선택적으로 형성하기 위해, 양립성 이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체, 예를 들어 유전자 조작 함몰부를 함유하는 하나의 CH3 항체 불변 도메인 및 유전자 조작 돌출부를 함유하는 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인이 결합하여 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성한다. 유전자 조작 돌출부 및 유전자 조작 함몰부는 양립성 이종이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에서 이루어질 수 있는 이종이량체화 선택성 모듈의 예이다.
다른 구현예에서, 양하전 아미노산 치환을 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 갖는 Fc 도메인 단량체 및 음하전 아미노산 치환을 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 갖는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 (본원에서 추가로 기술되는) 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, 및 K439E. 하나의 예에서, 양하전 아미노산 치환, 예컨대 D356K 또는 E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 음하전 아미노산 치환, 예컨대 K370D 또는 K370E를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 예에서, E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 K370D를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 예에서, E356K 및 D399K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 K392D 및 K409D를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 역전하 아미노산 치환은 이종이량체화 선택성 모듈로 사용될 수 있으며, 이 경우 상이하지만 양립 가능한 역전하 아미노산 치환을 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체가 결합하여 이종이량체 Fc 도메인을 형성한다. 특이적 이량체화 선택성 모듈은 아래에서 추가로 설명되는 표 4 및 표 5에 제한 없이 추가로 열거되어 있다.
다른 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 동일한 역전하 돌연변이를 함유하는 동종이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 동종이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화를 촉진하여 동종이량체 Fc 도메인을 형성하는 역전하 아미노산 치환이다. 2개의 Fc 도메인 단량체에서 2개 이상의 상보적인 잔기 쌍의 두 구성원의 전하를 역전시킴으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이된 서열의 Fc 도메인 단량체에 대한 상보성을 유지하지만, 이러한 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 대해 더 낮은 상보성을 갖는다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이 K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D, 또는 D356K/K439E를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이의 임의의 쌍을 결합하는 사중 돌연변이, 예컨대 K409D/D399K/E357K/K370E를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 동종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 5 및 표 6에 추가로 나타내어져 있다. 동종이량체화 Fc 도메인은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 대칭 분지점을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 하나의 동종이량체화 Fc 도메인을 갖는다. 일 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개 이상의 동종이량체화 Fc 도메인, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 동종이량체화 도메인을 갖는다. 일 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 동종이량체화 Fc 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 하나의 동종이량체화 선택성 모듈을 갖는다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개 이상의 동종이량체화 선택성 모듈, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 동종이량체화 선택성 모듈을 갖는다.
추가 구현예에서, (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부를 함유하는 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 예를 들어, 역전하 돌연변이 K370D 및 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 역전하 돌연변이 E357K 및 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하는 다른 Fc 도메인 단량체가 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
이러한 Fc 도메인의 형성은 CH3 항체 불변 도메인의 양립성 아미노산 치환에 의해 촉진된다. 비양립성 아미노산 치환을 포함하는 2개의 이량체화 선택성 모듈, 예를 들어 CH3-CH3 계면에서 유전자 조작 함몰부를 함유하는 둘 모두, 유전자 조작 돌출부를 함유하는 둘 모두, 또는 동일한 하전 아미노산을 함유하는 둘 모두는 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하지 않을 것이다.
이종이량체화 Fc 도메인의 다중 쌍은 다중 비대칭 분지점, 다중 비분지점, 또는 비대칭 분지점 및 비분지점 모두를 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 다중의 별개의 이종이량체화 기술(예를 들어, 표 4 및 표 5 참조)이 이러한 Fc 도메인-함유 작제물을 조립하기 위해 상이한 Fc 도메인에 통합된다. 이종이량체화 기술은 Fc 단량체의 원치 않는 페어링에 대한 최소 회합(직교성)을 갖는다. 2개의 상이한 Fc 이종이량체화 방법, 예컨대 노브-홀(표 4) 및 정전기 스티어링(표 5)을 상이한 Fc 도메인에서 사용하여 원하는 작제물로의 폴리펩티드 사슬의 조립을 제어할 수 있다. 대안적으로, 2개의 상이한 노브-홀 변이체(예를 들어, 표 4에서 선택된 2개의 별개의 돌연변이 세트) 또는 2개의 상이한 정전기 스티어링 변이체(예를 들어, 표 5에서 선택된 2개의 별개의 돌연변이 세트)를 상이한 Fc 도메인에서 사용하여 원하는 작제물로의 폴리펩티드 사슬의 조립을 제어할 수 있다. 이종이량체화 Fc 도메인의 Fc 도메인 단량체를 상이한 폴리펩티드 사슬, 다중 Fc 도메인을 갖는 폴리펩티드 사슬에 배치하여 비대칭 분지를 생성할 수 있다. 이종이량체화 Fc 도메인의 하나의 Fc 도메인 단량체를 다중 Fc 도메인을 갖는 폴리펩티드 사슬에 배치하고 이종이량체화 Fc 도메인의 다른 Fc 도메인 단량체를 단일 Fc 도메인을 갖는 폴리펩티드 사슬에 배치하여 비분지점을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 선형이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 분지점을 갖지 않는다. 예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물은, 적어도 2개의 Fc 도메인 단량체가 상이한(즉, 상이한 이종이량체화 돌연변이를 갖는) 2개 이상의 Fc 도메인 단량체를 갖는 하나의 큰 펩티드, 및 각각 상이한 단일 Fc 도메인 단량체를 갖는 2개 이상의 더 작은 펩티드(즉, 상이한 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 갖는 2개 이상의 작은 펩티드)로부터 조립될 수 있다. 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 서로 양립할 수 없는 2개 이상의 이량체화 선택성 모듈, 예를 들어 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적절한 형성을 촉진하거나 용이하게 하는 표 4 및/또는 표 5에서 선택된 적어도 2개의 비양립성 이량체화 선택성 모듈을 가질 수 있으므로, 각각의 더 작은 펩티드의 Fc 도메인 단량체는 큰 펩티드의 양립성 Fc 도메인 단량체(들)과 회합한다. 일부 구현예에서, 긴 펩티드의 제1 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 제1 서브세트는 제1 짧은 펩티드의 Fc 도메인 단량체에서 아미노산 치환에 의해 형성된 제1 이량체화 선택성 모듈의 일부와 양립할 수 있는 제1 이량체화 선택성 모듈의 일부를 형성하는 아미노산 치환을 포함한다. 긴 펩티드의 제2 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 제2 서브세트는 제2 짧은 펩티드의 Fc 도메인 단량체에서 아미노산 치환에 의해 형성된 제2 이량체화 선택성 모듈의 일부와 양립할 수 있는 제2 이량체화 선택성 모듈의 일부를 형성하는 아미노산 치환을 포함한다. 제1 이량체화 선택성 모듈은 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 짧은 펩티드의 Fc 도메인 단량체 간의 결합을 불리하게 하면서, 제1 짧은 펩티드의 Fc 도메인 단량체에 대한 긴 펩티드의 제1 Fc 도메인 단량체(또는 Fc 도메인 단량체의 제1 서브세트)의 결합을 유리하게 한다. 유사하게, 제2 이량체화 선택성 모듈은 제2 Fc 도메인 단량체와 제1 짧은 펩티드의 Fc 도메인 단량체 간의 결합을 불리하게 하면서, 제2 짧은 펩티드의 Fc 도메인 단량체에 대한 긴 펩티드의 제2 Fc 도메인 단량체(또는 Fc 도메인 단량체의 제2 서브세트)의 결합을 유리하게 한다.
특정 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 제1 이량체화 선택성 모듈을 갖는 제1 Fc 도메인 및 제2 이량체화 선택성 모듈을 갖는 제2 Fc 도메인을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이 및/또는 표 5에서 선택된 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 갖는 하나의 Fc 단량체(예를 들어, Fc 단량체는 S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이 및 E357K 역전하 돌연변이를 가질 수 있음), 및 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이 및/또는 표 5에서 선택된 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 갖는 하나의 Fc 단량체(예를 들어, Fc 단량체는 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이 및 K370D 역전하 돌연변이를 가질 수 있음)로부터 조립된다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이 및/또는 표 5에서 선택된 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 갖는 하나의 Fc 단량체(예를 들어, Fc 단량체는 D356K 및 D399K 역전하 돌연변이를 가질 수 있음), 및 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이 및/또는 표 5에서 선택된 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 갖는 하나의 Fc 단량체(예를 들어, Fc 단량체는 K392D 및 K409D 역전하 돌연변이를 가질 수 있음)로부터 조립된다.
또한, 정의된 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인의 형성을 촉진하는 데 사용되는 다른 방법은, 이종이량체 형성을 위해 Fc 도메인 단량체 각각에 류신 지퍼의 단량체 α-나선을 C-말단 융합하는 것을 포함하는 LUZ-Y 접근법(미국 특허 출원 공개 제WO2011034605호)뿐 아니라, 각각 IgA 및 IgG CH3 서열의 교번 분절을 포함하는 이종이량체 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인을 생성하는 SEED(strand-exchange engineered domain) 바디 접근법(Davis et al., Protein Eng Des Sel. 23:195-202, 2010)을 제한 없이 포함한다.
V. 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부
유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부(또는 "노브-홀" 전략)의 사용은 Carter 및 공동 연구자들에 의해 설명된다(Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-612, 1996; Atwell et al., J Mol Biol. 270:26-35, 1997; Merchant et al., Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998). 노브-홀의 상호작용은 이종이량체 형성을 유리하게 하는 반면, 노브-노브 및 홀-홀 상호작용은 입체적 충돌 및 유리한 상호작용의 결실로 인해 동종이량체 형성을 저해한다. "노브-홀" 기술은 미국 특허 번호 제5,731,168호에도 개시되어 있다.
본 발명에서, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조에 사용된다. 유전자 조작 함몰부는 단백질의 원래의 아미노산이 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 빈 공간이다. 유전자 조작 돌출부는 단백질의 원래의 아미노산이 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 돌기이다. 구체적으로, 대체되는 아미노산은 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있고, 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화에 관여한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부는 다른 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 돌출부를 수용하도록 생성되어, CH3 항체 불변 도메인 둘 모두는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 촉진하거나 유리하게 하는 (전술한) 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)로서 작용한다. 다른 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부는 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산을 더 잘 수용하도록 생성된다. 또 다른 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 돌출부는 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산과 추가 상호작용을 형성하도록 생성된다.
유전자 조작 함몰부는 티로신 또는 트립토판과 같은 더 큰 측쇄를 함유하는 아미노산을 알라닌, 발린, 또는 트레오닌과 같은 더 작은 측쇄를 함유하는 아미노산으로 대체함으로써 구성될 수 있다. 구체적으로, (앞서 추가로 기술된) 일부 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)은 CH3 항체 불변 도메인에 Y407V 돌연변이와 같은 유전자 조작 함몰부를 함유한다. 유사하게, 유전자 조작 돌출부는 더 작은 측쇄를 함유하는 아미노산을 더 큰 측쇄를 함유하는 아미노산으로 대체함으로써 구성될 수 있다. 구체적으로, (앞서 추가로 기술된) 일부 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)은 CH3 항체 불변 도메인에 T366W 돌연변이와 같은 유전자 조작 돌출부를 함유한다. 본 발명에서, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 또한 CH3 도메인간 이황화 결합 조작과 결합되어 이종이량체 형성을 강화한다. 하나의 예에서, 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하는 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 예에서, Y349C가 추가된 유전자 조작 함몰부를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 S354C가 추가된 유전자 조작 돌출부를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 이황화 결합 조작 또는 구조 계산(혼합 HA-TF)과 함께 다른 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부가 제한 없이 표 4에 포함된다.
[표 4] Fc 이종이량체화 방법 (노브-홀)
상이한 아미노산 잔기를 갖는 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산 잔기를 치환하는 것은 원래의 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산을 변경함으로써 달성될 수 있다. 대체될 수 있는 원래의 아미노산 잔기 수의 상한은 계면에서의 충분한 상호작용이 여전히 유지되는 한, CH3 항체 불변 도메인 계면에서의 잔기의 총 수이다.
유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부와 정전기 스티어링의 조합
예를 들어 2개의 상이한 폴리펩티드의 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 유리하게 하기 위해 정전기 스티어링이 노브-홀 기술과 조합될 수 있다. 이하에서 보다 자세히 설명되는 정전기 스티어링은 펩티드, 단백질 도메인, 및 단백질의 반대로 하전된 아미노산 간의 유리한 정전기 상호작용을 이용하여 고차 단백질 분자의 형성을 제어하는 것이다. 정전기 스티어링은 동종이량체화 또는 이종이량체화를 촉진하는 데 사용될 수 있으며, 후자는 노브-홀 기술과 유용하게 조합될 수 있다. 이종이량체화의 경우, 상이하지만 양립 가능한 돌연변이가 이종이량체화될 Fc 도메인 단량체 각각에 도입된다. 따라서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나를 포함하도록 변형될 수 있다: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, 및 K439E. 예를 들어, 하나의 Fc 도메인 단량체, 예를 들어 함몰부(Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V)를 갖는 Fc 도메인 단량체는 K370D 돌연변이를 포함할 수도 있고, 다른 Fc 도메인 단량체, 예를 들어 돌출부(S354C 및 T366W)를 갖는 Fc 도메인 단량체는 E357K를 포함할 수 있다.
보다 일반적으로, 임의의 함몰부 돌연변이(또는 돌연변이 조합): Y407T, Y407A, F405A, Y407T, T394S, T394W:Y407A, T366W:T394S, T366S:L368A:Y407V:Y349C, 및 S3364H:F405가 표 5의 돌연변이와 조합될 수 있고, 임의의 돌출부 돌연변이(또는 돌연변이 조합): T366Y, T366W, T394W, F405W, T366Y:F405A, T366W:Y407A, T366W:S354C, 및 Y349T:T394F가 표 5의 돌연변이와 조합될 수 있으며, 이는 함몰부 돌연변이(또는 돌연변이 조합)와 함께 사용되는 표 5의 돌연변이와 페어링된다.
VI. 정전기 스티어링
정전기 스티어링은 펩티드, 단백질 도메인, 및 단백질의 반대로 하전된 아미노산 간의 유리한 정전기 상호작용을 이용하여 고차 단백질 분자의 형성을 제어하는 것이다. 이중 특이적 항체의 생성에서 이종이량체 형성을 위해 동종이량체의 형성을 감소시키는 항체 도메인의 상호작용을 변경하는 정전기 스티어링 효과를 이용하는 방법은 미국 특허 출원 공개 제2014-0024111호에 개시되어 있다.
본 발명에서, 정전기 스티어링은 Fc 도메인 단량체의 이량체화 및 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 형성을 제어하는 데 사용된다. 특히, 정전기 스티어링을 사용하는 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 제어하기 위해, CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 도입된 특정 하전 아미노산에 따라 상호작용이 정전기적으로 유리해지거나 불리해지도록 양하전 또는 음하전 아미노산 잔기로 대체된다. 일부 구현예에서, 계면의 양하전 아미노산, 예컨대 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘이 음하전 아미노산, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체된다. 다른 구현예에서, 계면의 음하전 아미노산이 양하전 아미노산으로 대체된다. 하전 아미노산은 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다. 하전 아미노산을 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인에 도입함으로써, 하전 아미노산 간의 상호작용으로 인한 정전기 스티어링 효과에 의해 제어되는 Fc 도메인 단량체의 이량체를 선택적으로 형성할 수 있는 (앞서 추가로 기술된) 이량체화 선택성 모듈이 생성된다.
일부 구현예에서, 정전기 스티어링 효과에 의해 제어되어 Fc 도메인 단량체의 이량체를 선택적으로 형성할 수 있는 역전하를 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 생성하기 위해, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이종이량체화 또는 동종이량체화를 통해 선택적으로 형성될 수 있다.
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화는 2개의 Fc 도메인 단량체에 표 5에 제한 없이 포함된 전하 잔기 쌍과 같은 상이하지만 양립 가능한 돌연변이를 도입함으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, 및 K439E, 예를 들어 D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, 및 K439E 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상. 하나의 예에서, 양하전 아미노산 치환, 예컨대 D356K 또는 E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 음하전 아미노산 치환, 예컨대 K370D 또는 K370E를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 예에서, E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 K370D를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 예에서, E356K 및 D399K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 K392D 및 K409D를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
"이종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체가 이들 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 형성을 촉진하는 상이한 역전하 돌연변이(이종이량체화 선택성 모듈)(예를 들어, 표 5의 돌연변이 참조)를 함유하는, 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭한다. 하나의 예에서, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 3개의 Fc 도메인 중 2개는 정전기 스티어링 효과에 의해 촉진되는, 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성될 수 있다.
[표 5] Fc 이종이량체화 방법 (정전기 스티어링)
Fc 도메인 단량체의 동종이량체화
Fc 도메인 단량체의 동종이량체화는 동일한 정전기 스티어링 돌연변이(동종이량체화 선택성 모듈)를 Fc 도메인 단량체 둘 모두에 대칭 방식으로 도입함으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 동일한 역전하 돌연변이를 함유하는 동종이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 2개의 Fc 도메인 단량체에서 2개 이상의 상보적인 잔기 쌍의 두 구성원의 전하를 역전시킴으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이된 서열의 Fc 도메인 단량체에 대한 상보성을 유지하지만, 이러한 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 대해 더 낮은 상보성을 갖는다. Fc 도메인 단량체 내에 도입되어 이의 동종이량체화를 촉진할 수 있는 정전기 스티어링 돌연변이는 제한 없이 표 5 및 표 6에 나타내어져 있다. 일 구현예에서, Fc 도메인은, 각각 이중 역전하 돌연변이(표 5), 예컨대 K409D/D399K를 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은, 각각 사중 역전하 돌연변이(표 6), 예컨대 K409D/D399K/K370D/E357K를 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 3개의 Fc 도메인 중 하나는 정전기 스티어링 효과에 의해 촉진되는, 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성될 수 있다. "동종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체가 동일한 역전하 돌연변이(예를 들어, 표 5 및 표 6의 돌연변이 참조)를 함유하는, 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭한다. 3개의 Fc 도메인, 즉 1개의 카복실 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "분지" Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인은 동종이량체 Fc 도메인("줄기 동종이량체 Fc 도메인"이라고도 함)일 수 있다. 줄기 동종이량체 Fc 도메인은, 각각 이중 돌연변이 K409D/D399K를 함유하는 2개의 Fc 도메인 단량체에 의해 형성될 수 있다.
[표 6] Fc 동종이량체화 방법
[표 7] Fc 동종이량체화 방법
기타 이종이량체화 방법
다수의 다른 이종이량체화 기술이 문헌에 기재되어 있다. 임의의 하나 이상의 이러한 기술(표 8)이 본원에 기재된 임의의 노브-홀 및/또는 정전기 스티어링 이종이량체화 및/또는 동종이량체화 기술과 조합되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 제조할 수 있다.
[표 8] 기타 Fc 이종이량체화 방법
VII. 링커
본 발명에서, 링커는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인 및/또는 회합된 비단백질 모이어티 간의 결합 또는 연결을 기술하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 2개의 Fc 도메인 단량체 간의 결합 또는 연결이고, 이 경우 링커는 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 제2 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단에 연결하여, 2개의 Fc 도메인 단량체가 직렬로 서로 연결된다. 다른 구현예에서, 링커는 Fc 도메인 단량체와 그에 부착되는 임의의 다른 단백질 도메인 간의 연결이다. 예를 들어, 링커는 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 알부민-결합 펩티드의 N-말단에 부착시킬 수 있다.
링커는 단순 공유 결합, 예컨대 펩티드 결합, 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체, 또는 화학 반응으로 생성된 임의의 종류의 결합, 예컨대 화학적 접합일 수 있다. 링커가 펩티드 결합인 경우, 하나의 단백질 도메인의 C-말단의 카복실산기는 축합 반응에서 다른 단백질 도메인의 N-말단의 아미노기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있다. 구체적으로, 펩티드 결합은 당업계에 잘 알려진 통상적인 유기 화학 반응을 통한 합성 수단으로부터, 또는 숙주 세포에서의 자연적 생성에 의해 형성될 수 있으며, 직렬의 두 단백질 모두, 예컨대 2개의 Fc 도메인 단량체의 DNA 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에서 필수 분자 기구, 예컨대 DNA 중합효소 및 리보솜에 의해 두 단백질 모두를 인코딩하는 연속 폴리펩티드로 직접 전사되고 번역될 수 있다.
링커가 합성 중합체, 예컨대 PEG 중합체인 경우, 중합체는 각각의 단부에서 반응성 화학 작용기로 작용화되어, 두 단백질의 연결 단부에서 말단 아미노산과 반응할 수 있다.
(상술한 펩티드 결합을 제외하고) 링커가 화학 반응으로 만들어지는 경우, 화학 작용기, 예컨대 아민, 카복실산, 에스테르, 아지드, 또는 당업계에서 통상 사용되는 기타 작용기는 하나의 단백질의 C-말단 및 다른 단백질의 N-말단에 각각 합성되어 부착될 수 있다. 이어서, 두 작용기는 합성 화학 수단을 통해 반응하여 화학 결합을 형성함으로써 두 단백질을 함께 연결할 수 있다. 이러한 화학적 접합 절차는 당업자에게 통상적인 것이다.
스페이서
본 발명에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 3~200개의 아미노산(예컨대, 3~200개, 3~180개, 3~160개, 3~140개, 3~120개, 3~100개, 3~90개, 3~80개, 3~70개, 3~60개, 3~50개, 3~45개, 3~40개, 3~35개, 3~30개, 3~25개, 3~20개, 3~15개, 3~10개, 3~9개, 3~8개, 3~7개, 3~6개, 3~5개, 3~4개, 4~200개, 5~200개, 6~200개, 7~200개, 8~200개, 9~200개, 10~200개, 15~200개, 20~200개, 25~200개, 30~200개, 35~200개, 40~200개, 45~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 또는 180~200개의 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서일 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 적어도 12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예컨대, 12~200개, 12~180개, 12~160개, 12~140개, 12~120개, 12~100개, 12~90개, 12~80개, 12~70개, 12~60개, 12~50개, 12~40개, 12~30개, 12~20개, 12~19개, 12~18개, 12~17개, 12~16개, 12~15개, 12~14개, 또는 12~13개의 아미노산) (예컨대, 14~200개, 16~200개, 18~200개, 20~200개, 30~200개, 40~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 180~200개, 또는 190~200개의 아미노산)을 함유하는 아미노산 스페이서이다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 12~30개의 아미노산(예컨대, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산)을 함유하는 아미노산 스페이서이다. 적합한 펩티드 스페이서는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 글리신 및 세린과 같은 가요성 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 모티프, 예컨대 GS, GGS, GGGGS(서열 번호 1), GGSG(서열 번호 2), 또는 SGGG(서열 번호 3)의 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GS, 예컨대 GS, GSGS(서열 번호 4), GSGSGS(서열 번호 5), GSGSGSGS(서열 번호 6), GSGSGSGSGS(서열 번호 7), 또는 GSGSGSGSGSGS(서열 번호 8)의 모티프를 포함하는 2 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 스페이서는 GGS, 예컨대 GGS, GGSGGS(서열 번호 9), GGSGGSGGS(서열 번호 10), 및 GGSGGSGGSGGS(서열 번호 11)의 모티프를 포함하는 3 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스페이서는 GGSG(서열 번호 2), 예컨대 GGSGGGSG(서열 번호 12), GGSGGGSGGGSG(서열 번호 13), GGSGGGSGGGSGGGSG(서열 번호 14), 또는 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(서열번호 15)의 모티프를 포함하는 4 내지 20개의 아미노산을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 스페이서는 GGGGS(서열번호 1), 예컨대 GGGGSGGGGS(서열번호 16) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 17)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18)이다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 글리신 잔기, 예를 들어 적어도 4개의 글리신 잔기(예컨대, 4~200개, 4~180개, 4~160개, 4~140개, 4~40개, 4~100개, 4~90개, 4~80개, 4~70개, 4~60개, 4~50개, 4~40개, 4~30개, 4~20개, 4~19개, 4~18개, 4~17개, 4~16개, 4~15개, 4~14개, 4~13개, 4~12개, 4~11개, 4~10개, 4~9개, 4~8개, 4~7개, 4~6개, 또는 4~5개의 글리신 잔기) (예컨대, 4~200개, 6~200개, 8~200개, 10~200개, 12~200개, 14~200개, 16~200개, 18~200개, 20~200개, 30~200개, 40~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 180~200개, 또는 190~200개의 글리신 잔기)만을 함유한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 4~30개의 글리신 잔기(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 글리신 잔기)를 갖는다. 일부 구현예에서, 글리신 잔기만을 함유하는 스페이서는 글리코실화(예컨대, O-글리코실화라고도 지칭되는 O-연결 글리코실화)되지 않을 수 있거나, 예를 들어 하나 이상의 세린 잔기를 함유하는 스페이서(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))와 비교하여 글리코실화 수준의 감소(예컨대, O-글리코실화 수준의 감소)(예컨대, 자일로스, 만노스, 시알산, 푸코스(Fuc), 및/또는 갈락토스(Gal)(예컨대, 자일로스)와 같은 글리칸에 의한 O-글리코실화 수준의 감소)를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 글리신 잔기만을 함유하는 스페이서는 O-글리코실화(예컨대, O-자일로실화)되지 않을 수 있거나, 예를 들어 하나 이상의 세린 잔기를 함유하는 스페이서(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))와 비교하여 O-글리코실화 수준의 감소(예컨대, O-자일로실화 수준의 감소)를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 글리신 잔기만을 함유하는 스페이서는 단백질 분해를 겪지 않을 수 있거나, 예를 들어 하나 이상의 세린 잔기를 함유하는 스페이서(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))와 비교하여 단백질 분해율의 감소를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 스페이서는 GGGG(서열 번호 19), 예컨대 GGGGGGGG(서열 번호 20), GGGGGGGGGGGG(서열 번호 21), GGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 22), 또는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 23)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGGGG(서열번호 24), 예컨대 GGGGGGGGGG(서열번호 25), 또는GGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 26)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 27)이다.
다른 구현예에서, 스페이서는 글리신 및 세린 외의 아미노산, 예를 들어 GENLYFQSGG(서열번호 28), SACYCELS(서열번호 29), RSIAT(서열번호 30), RPACKIPNDLKQKVMNH(서열번호 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(서열번호 32), AAANSSIDLISVPVDSR(서열번호 33), 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(서열번호 34)를 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 12-아미노산 또는 20-아미노산 펩티드 스페이서는 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬로 연결하는 데 사용되고, 12-아미노산 및 20-아미노산 펩티드 스페이서는 각각 서열 GGGSGGGSGGGS(서열 번호 35) 및 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열 번호 18)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 서열 GGSGGGSGGGSGGGSGGS(서열번호 36)로 이루어진 18-아미노산 펩티드 스페이서가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 상기 서열번호 1~36 중 어느 하나의 서열과 적어도 75% 동일한(예컨대, 적어도 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 서열번호 17, 18, 26, 및 27 중 어느 하나의 서열과 적어도 80% 동일한(예컨대, 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 서열번호 18 또는 27 중 어느 하나의 서열과 적어도 80% 동일한(예컨대, 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, Fc 도메인 단량체의 힌지의 아미노 말단과 동일 폴리펩티드에 있는 Fc 단량체의 카복시 말단 사이의 링커(즉, 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 제2 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단에 연결하여 두 Fc 도메인 단량체가 서로 직렬로 연결되도록 하는 링커)는 공유 결합이 아닌 3개 이상의 아미노산을 갖는 스페이서(예컨대, 3~200개의 아미노산(예를 들어, 3~200, 3~180, 3~160, 3~140, 3~120, 3~100, 3~90, 3~80, 3~70, 3~60, 3~50, 3~45, 3~40, 3~35, 3~30, 3~25, 3~20, 3~15, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 3~5, 3~4, 4~200, 5~200, 6~200, 7~200, 8~200, 9~200, 10~200, 15~200, 20~200, 25~200, 30~200, 35~200, 40~200, 45~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 또는 180~200개의 아미노산) 또는 적어도 12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예를 들어, 12~200, 12~180, 12~160, 12~140, 12~120, 12~100, 12~90, 12~80, 12~70, 12~60, 12~50, 12~40, 12~30, 12~20, 12~19, 12~18, 12~17, 12~16, 12~15, 12~14, 또는 12~13개의 아미노산)(예를 들어, 14~200, 16~200, 18~200, 20~200, 30~200, 40~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 180~200, 또는 190~200개의 아미노산을 함유하는 아미노산 스페이서))이다.
스페이서는 또한, Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단과 CD38 결합 도메인(예를 들어, CD38 중쇄 결합 도메인의 CH1 도메인 또는 CD38 경쇄 결합 도메인의 CL 도메인)의 카복시 말단 사이에 존재할 수 있어, 도메인들이 3개 이상 아미노산의 스페이서(예컨대, 3~200개의 아미노산(예를 들어, 3~200, 3~180, 3~160, 3~140, 3~120, 3~100, 3~90, 3~80, 3~70, 3~60, 3~50, 3~45, 3~40, 3~35, 3~30, 3~25, 3~20, 3~15, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 3~5, 3~4, 4~200, 5~200, 6~200, 7~200, 8~200, 9~200, 10~200, 15~200, 20~200, 25~200, 30~200, 35~200, 40~200, 45~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 또는 180~200개의 아미노산) 또는 적어도 12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예를 들어, 12~200, 12~180, 12~160, 12~140, 12~120, 12~100, 12~90, 12~80, 12~70, 12~60, 12~50, 12~40, 12~30, 12~20, 12~19, 12~18, 12~17, 12~16, 12~15, 12~14, 또는 12~13개의 아미노산)(예를 들어, 14~200, 16~200, 18~200, 20~200, 30~200, 40~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 180~200, 또는 190~200개의 아미노산을 함유하는 아미노산 스페이서))에 의해 연결되도록 한다.
VII. 혈청 단백질-결합 펩티드
혈청 단백질 펩티드에 대한 결합은 단백질 의약품의 약동학을 개선할 수 있으며, 특히 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 혈청 단백질-결합 펩티드와 융합될 수 있다.
일례로, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 알부민-결합 펩티드는 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 일 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열 DICLPRWGCLW(서열번호 37)를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열번호 37의 서열과 적어도 80% 동일한(예컨대, 80%, 90%, 또는 100% 동일한) 서열을 갖는다.
본 발명에서, 알부민-결합 펩티드는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 특정 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc 작제물의 하나 이상의 폴리펩티드의 C-말단에 부착될 수 있다. 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc 작제물에서 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 인코딩하는 폴리펩티드의 C-말단에 융합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 인코딩하는 폴리펩티드의 제2 Fc 도메인 단량체에 연결되는 Fc 도메인 단량체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(114 및 116); 도 2의 Fc 도메인 단량체(214 및 216))의 C-말단에 부착될 수 있다. 알부민-결합 펩티드는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 유전적으로 융합될 수 있거나, 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 화학적 수단, 예컨대 화학적 접합을 통해 부착될 수 있다. 원하는 경우, Fc-항원 결합 도메인 작제물과 알부민-결합 펩티드 사이에 스페이서가 삽입될 수 있다. 이론에 구속되지 않는 범위에서, 본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 알부민-결합 펩티드를 포함시키면 혈청 알부민에 대한 결합을 통해 치료 단백질을 장기간 유지할 수 있을 것으로 예상된다.
VIII. Fc-항원 결합 도메인 작제물
일반적으로, 본 발명은 2~10개의 Fc 도메인 및 하나 이상의 부착된 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 특징으로 한다. 이들은 Fc 수용체, 예컨대 FcγRIIIa에 대한 단일 야생형 Fc 도메인보다 더 큰 결합 친화도 및/또는 친화력을 가질 수 있다. 본 발명은 Fc 도메인의 2개의 Fc 도메인 단량체가 서로 선택적으로 이량체를 형성하여 원치 않는 다량체 또는 응집체의 형성을 방지하도록, 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 아미노산을 유전자 조작하는 방법을 개시한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 Fc 도메인 단량체의 각각의 쌍이 Fc 도메인을 형성하는 짝수의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체의 이량체 및 1개의 항원 결합 도메인으로 형성된 최소 2개의 작용성 Fc 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어 링커, 스페이서, 펩티드 결합, 화학 결합, 또는 화학 모이어티를 사용하여 Fc 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 Fc 도메인의 제1 쌍의 2개의 Fc 도메인 단량체가 서로 선택적으로 이량체를 형성하고 Fc 도메인의 제2 쌍의 2개의 Fc 도메인 단량체가 서로 선택적으로 이량체를 형성하여 원치 않는 다량체 또는 응집체의 형성을 방지하도록, 제1 쌍의 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 표 4 및 표 5에서 선택된 한 세트의 아미노산 치환을 유전자 조작하고, 제2 쌍의 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 제1 세트의 아미노산 치환과 다른, 표 4 및 표 5에서 선택된 제2 세트의 아미노산 치환을 유전자 조작하는 방법에 관한 것이다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물은 본원에 기재된 이종이량체화 Fc 도메인을, 선택적으로 동종이량체화 Fc 도메인과 함께, 사용하여 많은 다양한 유형의 구조로 조립될 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 비대칭 직렬 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 분지점이 N-말단 또는 C-말단 Fc 도메인에 없는 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 항원 결합 도메인 서열을 갖는 장쇄 및 단쇄를 사용하여 이중 특이적, 삼중 특이적, 또는 다중 특이적 작제물을 형성하도록 조립될 수 있다(예를 들어, 도 4 내지 도 13; 도 16 내지 도 36). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이 및/또는 동종이량체화 돌연변이 및 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 사슬을 사용하여 이중 특이적, 삼중 특이적, 또는 다중 특이적 작제물을 형성하도록 조립될 수 있다. 이종이량체화 및/또는 동종이량체화 돌연변이는 많은 다양한 유형의 작제물 구조의 구체적인 형성을 가이드할 수 있어, 원치 않거나 예상치 못한 구조를 갖는 작제물의 형성을 억제하면서, 상이한 특이성의 항원 결합 도메인이 특정 선택된 작제물 위치에 배치되도록 할 수 있다. 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함한다. 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함한다. 다중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개 초과의 상이한 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은 다양한 방식으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결될 수 있다. 항원 결합 도메인은 Fc 사슬의 융합 단백질로 발현될 수 있다. 항원의 중쇄 성분은 Fc 사슬의 융합 단백질로 발현될 수 있고, 경쇄 성분은 별개의 폴리펩티드로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 항원 결합 도메인으로 사용된다. scFv는 긴 Fc 사슬의 융합 단백질로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 성분은 개별적으로 발현되고 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 외인성으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 개별적으로 발현되고, 이후 화학 결합에 의해 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결된다.
일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 하나 이상의 Fc 폴리펩티드에는 C-말단 라이신 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 모든 Fc 폴리펩티드에는 C-말단 라이신 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 하나 이상의 Fc 폴리펩티드에서의 C-말단 라이신의 부재는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)의 집단, 예컨대 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 균질한 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단의 균질성을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 또는 제6 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 도 16의 폴리펩티드 2202, 2222, 및 2224, 도 17의 2302, 2332, 2334, 및 2336, 도 18의 2402, 2404, 2434, 및 2436, 도 19의 2502, 2504, 2534, 및 2536, 도 20의 2602, 2604, 2606, 2652, 2654, 및 2656, 도 21의 2702, 2704, 2706, 2752, 2754, 및 2756, 도 22의 2802, 2804, 2806, 2852, 2854, 및 2856, 도 23의 2902, 2916, 및 2920, 도 24의 3002, 3024, 및 3026, 도 25의 3102, 312, 및 3126, 도 26의 3202, 3224, 3228, 및 3230, 도 27의 3302, 3332, 3334, 및 3336, 도 28의 3402, 3432, 3434, 및 3436, 도 29의 3502, 3504, 3534, 및 3536, 도 30의 3602, 3604, 3612, 3618, 3642, 및 3644, 도 31의 3702, 3704, 3706, 3752, 3754, 및 3756, 도 32의 3802, 3804, 3834, 및 3836, 도 33의 3902, 3904, 3910, 3916, 3942, 및 3944, 도 34의 4002, 4004, 4006, 4052, 4054, 및 4056, 도 35의 4102, 4104, 4110, 4132, 4142, 및 4144, 도 36의 4202, 4204, 4206, 4252, 4254, 및 4256)의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이될 수 있다.
본원의 실시예에 기재된 예시적인 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 경우, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 노브 및 홀 서브유닛에 각각 E357K 및 K370D 전하 쌍을 포함할 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 29~42는 E357K 및 K370D 쌍을 포함할 수 있는 직교 정전기 스티어링 돌연변이를 사용할 수 있으며, 또한 추가 스티어링 돌연변이를 포함할 수 있다. 직교 노브 및 홀을 갖는 Fc-항원 결합 작제물 29~42의 경우, 정전기 스티어링 돌연변이가 직교 쌍 중 하나를 제외하고 모두 필요하며, 모든 직교 쌍에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 직교 노브 및 홀이 필요한 경우, 노브1에 대한 정전기 스티어링 변형은 E357K이고 홀1에 대한 정전기 스티어링 변형은 K370D일 수 있으며, 노브2에 대한 정전기 스티어링 변형은 K370D이고 홀2에 대한 정전기 스티어링 변형은 E357K일 수 있다. 제3 직교 노브 및 홀이 필요한 경우(예를 들어, 삼중 특이적 항체의 경우), 정전기 스티어링 변형 E357K 및 D399K가 노브3에 대해 첨가될 수 있고 정전기 스티어링 변형 K370D 및 K409D가 홀3에 대해 첨가될 수 있거나, 또는 정전기 스티어링 변형 K370D 및 K409D가 노브3에 대해 첨가될 수 있고 정전기 스티어링 변형 E357K 및 D399K가 홀3에 대해 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 예시적인 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~42) 중 어느 하나는 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 강화된 효과기 기능을 가질 수 있거나, 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함할 수 있다.
IX. 숙주 세포 및 단백질 생산
본 발명에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩티드 및 작제물을 이들의 상응하는 핵산으로부터 발현하는 데 필요한 필수 세포 성분, 예컨대 세포기관을 포함하는 비히클을 지칭한다. 핵산은 당업계에 알려진 종래 기술(형질전환, 형질주입, 전기천공, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입 등)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함될 수 있다. 숙주 세포는 포유류, 박테리아, 진균, 또는 곤충 기원의 것일 수 있다. 포유류 숙주 세포는 CHO(또는 CHO-유래 세포주, 예컨대 CHO-K1, CHO-DXB11 CHO-DG44), 쥣과 숙주 세포(예컨대, NS0, Sp2/0), VERY, HEK(예컨대, HEK293), BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 작제물의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 단백질 산물을 변형하고 처리하는 숙주 세포가 또한 선택될 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 산물의 번역후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특정한 매커니즘을 갖는다. 발현된 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.
상응하는 DNA 플라스미드 작제물에서의 단백질 산물의 발현 및 분비를 위해, 숙주 세포는 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 및 선별 마커를 포함하여, 당업계에 알려진 적절한 발현 제어 요소에 의해 제어된 DNA로 형질주입되거나 형질전환될 수 있다. 치료 단백질의 발현 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2nd ed. 2004 edition (2004년 7월 20일); Vladimir Voynov and Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd ed. 2012 edition (2012년 6월 28일)] 참조.
일부 구현예에서, 예를 들어 세포 배양 상청액에서 Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 플라스미드 작제물로 형질주입된 숙주 세포에 의해 생성되는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일하며(몰 기준), 예를 들어 Fc 작제물의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%는 구조적으로 동일하다.
X. 탈푸코실화
각 Fc 단량체는 Asn 297에 N-글리코실화 부위를 포함한다. 글리칸은 주어진 Fc 단량체에서 다수의 상이한 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 항원-결합 Fc 작제물 또는 항체 함유 조성물에서, 글리칸은 매우 이종성일 수 있으며, 존재하는 글리칸의 성질은 특히, 항체 또는 항원-결합 Fc 작제물을 생성하는 데 사용되는 세포의 유형, 세포의 성장 조건(성장 배지 포함), 및 생성후 정제에 따라 달라질 수 있다. 다양한 경우에, 본원에 기재된 작제물을 함유하는 조성물은 적어도 어느 정도 탈푸코실화된다. 예를 들어, 조성물에 존재하는 글리칸(예컨대, Fc 글리칸)의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%는 푸코스 잔기가 결여되어 있다. 따라서, 글리칸의 5%~60%, 5%~50%, 5%~40%, 10%~50%, 10%~50%, 10%~40%, 20%~50%, 또는 20%~40%는 푸코스 잔기가 결여되어 있다. 적어도 어느 정도 탈푸코실화된 조성물은 1,3,4-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스 억제제의 존재 하에 항체를 생산하는 세포를 배양하여 생성될 수 있다. 본원에 기재된 작제물 및 폴리펩티드의 상대적으로 탈푸코실화된 형태는 FUT8의 발현이 감소되거나 없는 세포에서의 발현 및 베타-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라제(GnT-III)를 과발현하는 세포에서의 발현을 포함하는 다양한 다른 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
XI. 정제
Fc-항원 결합 도메인 작제물은, 예를 들어, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화(예컨대, 단백질 A 친화) 및 크기-배제 컬럼 크로마토그래피), 원심 분리, 용해도 차이 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술 등 단백질 정제 분야에 공지된 임의의 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단백질 A 컬럼과 같은 친화성 컬럼을 적절히 선택하고 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외여과, 염석, 및 투석 절차와 조합하여 단리되고 정제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009; 및 Subramanian (ed.) Antibodies-Volume I-Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2004)] 참조).
일부 경우에, Fc-항원 결합 도메인 작제물은, 예를 들어 전체 세포 용해 혼합물로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 용이하게 정제하고 단리하기 위해 하나 이상의 정제 펩티드에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드는 정제 펩티드에 대해 특이적 친화도를 갖는 다른 모이어티에 결합한다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 매트릭스, 수지, 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 부착된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결될 수 있는 정제 펩티드의 예는 헥사-히스티딘 펩티드, FLAG 펩티드, myc 펩티드, 및 혈구응집소(HA) 펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헥사-히스티딘 펩티드(HHHHHH(서열번호 38))는 마이크로몰 친화도로 니켈-작용화된 아가로스 친화성 컬럼에 결합한다. 일부 구현예에서, FLAG 펩티드는 서열 DYKDDDDK(서열번호 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, FLAG 펩티드는 직렬 연결로 서열 DYKDDDDK의 정수 배수, 예컨대 3xDYKDDDDK를 포함한다. 일부 구현예에서, myc 펩티드는 서열 EQKLISEEDL(서열번호 40)을 포함한다. 일부 구현예에서, myc 펩티드는 직렬 연결로 서열 EQKLISEEDL의 정수 배수, 예컨대 3xEQKLISEEDL을 포함한다. 일부 구현예에서, HA 펩티드는 서열 YPYDVPDYA(서열번호 41)를 포함한다. 일부 구현예에서, HA 펩티드는 직렬 연결로 서열 YPYDVPDYA의 정수 배수, 예컨대 3xYPYDVPDYA를 포함한다. FLAG, myc, 또는 HA 정제 펩티드를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며 보통 상업적으로 이용 가능하다. 이들 항체로 작용화된 고형 지지체(예컨대, 매트릭스, 수지, 또는 아가로스 비드)를 사용하여 FLAG, myc, 또는 HA 펩티드를 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물의 경우, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 정제 공정으로 사용할 수 있다. 단백질 A 리간드는 Fc 영역을 통해 Fc-항원 결합 도메인 작제물과 상호작용하여, 단백질 A 크로마토그래피를 숙주 세포 단백질의 대부분을 제거할 수 있는 매우 선별적인 포획 공정으로 만든다. 본 발명에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 실시예 5에 기재된 바와 같이 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이종이량체화 및/또는 동종이량체화 도메인을 사용하면 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 60% 이상의 순도로 제조할 수 있고, 즉, 세포에서 생성되는 단백질 작제 물질의 60% 이상이 원하는 Fc 작제물 구조를 가지며, 예를 들어, 제조에서 단백질 작제 물질의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 원하는 Fc 작제물 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조에서 단백질 작제 물질의 30% 미만은 원치 않는 Fc 작제물 구조(예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같은 고차종의 작제물)를 가지며, 예를 들어, 제조에서 단백질 작제 물질의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 원치 않는 Fc 작제물 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 알려진 정제 방법(예를 들어, 단백질 친화성 정제)을 사용한 추가 정제 후의 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 최종 순도는 80% 이상일 수 있고, 즉, 정제된 단백질 작제 물질의 80% 이상이 원하는 Fc 작제물 구조를 가지며, 예를 들어, 제조에서 단백질 작제 물질의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 원하는 Fc 작제물 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 알려진 정제 방법(예를 들어, 단백질 친화성 정제)을 사용하여 추가 정제되는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조에서 단백질 작제 물질의 15% 미만은 원치 않는 Fc 작제물 구조(예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같은 고차종의 작제물)를 가지며, 예를 들어, 제조에서 단백질 작제 물질의 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 원치 않는 Fc 작제물 구조를 갖는다.
XII. 약학 조성물/제제
본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 구조가 동일하거나 실질적으로 동일한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함한다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물은 Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~42 중 어느 하나의 실질적으로 균질한 집단을 포함한다.
본 발명의 치료 단백질 작제물, 예를 들어 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)은 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 치료 단백질을 포함하는 약학 조성물은 당업자에게 알려진 방법으로 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체 중의 멸균 용액 또는 현탁액을 포함하는 주사용 제형의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 주사용 멸균수(WFI), 생리 식염수, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 희석제, 결합제, 부형제와 같은 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 매질과 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 적합하게 배합한 다음, 일반적으로 허용되는 제약 관행에서 필요한 단위 용량 형태로 혼합함으로써 제형화될 수 있다. 약제에 포함된 유효 성분의 양은 지정된 범위 내에서 적합한 용량이 제공되도록 하는 양이다.
주사용 멸균 조성물은 주사용 증류수를 비히클로 사용하여 통상적인 제약 관행에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 적합한 가용화제, 예를 들어 에탄올과 같은 알코올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다가알코올, 및 폴리소르베이트 80TM, HCO-50과 같은 비이온성 계면활성제 등과 선택적으로 조합하여 생리 식염수 또는 글루코스 함유 등장액 및 D-소비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화나트륨과 같은 기타 보충제가 주사용 수용액으로 사용될 수 있다. 치료 단백질 제품을 위한 제형화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2d ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006)] 참조.
XIII. 치료 방법 및 투여량
본원에 기재된 작제물은 항원 결합 도메인(도메인들)이 유래된 항체(항체들)에 의해 치료되는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 작제물이 C38을 인식하는 항원 결합 도메인을 가진 경우, 작제물은 다양한 암(예컨대, 혈액 악성종양 및 고형 종양)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 약학 조성물은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로, 그리고 증상의 개선 또는 완화에 이르는 데 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 약학 조성물은 다양한 투약 형태, 예컨대 정맥내 투약 형태, 피하 투약 형태, 경구 투약 형태, 예컨대 섭취 가능 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 투여된다. 개별 대상체에 대한 적절한 투여량은 치료 목적, 투여 경로, 및 환자의 상태에 따라 다르다. 일반적으로, 재조합 단백질은 1~200 mg/kg, 예컨대 1~100 mg/kg, 예컨대 20~100 mg/kg으로 투여된다. 따라서, 의료 제공자는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 필요에 따라 투여량을 조정하고 적정하고 투여 경로를 수정해야 할 것이다.
XIV. 보체 의존성 세포독성(CDC)
본 명세서에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 다양한 Fc 수용체 매개 효과기 기능을 활성화할 수 있다. 면역계의 구성 요소 중 하나는 항체와 식세포의 외부 병원체 제거 능력을 강화하는 선천적 면역계의 일부인 보체 의존성 세포독성(CDC) 시스템이다. 3가지 생화학적 경로, 즉 고전적인 보체 경로, 대체 보체 경로, 및 렉틴 경로는 보체 시스템을 활성화하며, 이들 모두는 일련의 복합 활성화 및 신호전달 캐스케이드를 수반한다.
고전적인 보체 경로에서, IgG 또는 IgM은 보체 활성화를 유발한다. C1q 단백질은 항원에 결합한 후 이러한 항체에 결합하여 C1 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 C1 에스테라제를 생성하며, 이는 C4 및 C2 단백질을 C4a와 C4b, 및 C2a와 C2b로 절단하고 활성화한다. C2a 및 C4b 단편은 이어서 C3 전환효소로 불리는 단백질 복합체를 형성하며, 이는 C3을 C3a와 C3b로 절단하여, 신호 증폭 및 막 공격 복합체의 형성을 유도한다.
본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 면역계에 의한 CDC 활성을 강화할 수 있다.
CDC는 Raji 세포(ATCC)를 연속 희석된 항체, Fc-항원 결합 도메인 작제물, 또는 IVIg로 코팅하는 비색 분석법을 사용하여 평가될 수 있다. 인간 혈청 보체(Quidel)를 25% v/v로 모든 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션할 수 있다. WST-1 세포 증식 시약(Roche Applied Science)을 첨가한 후 세포를 37℃에서 12시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 플레이트를 2분간 진탕기에 놓고, 450 nm에서의 흡광도를 측정할 수 있다.
XV. 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)
본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 또한 면역계에 의한 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성을 강화할 수 있다. ADCC는 항체가 외부 병원체의 표면 항원과 결합하여 그들을 사멸의 표적으로 하는 적응 면역계의 일부이다. ADCC는 항체에 의한 자연 살해(NK) 세포의 활성화를 수반한다. NK 세포는 IgG 및 IgM과 같은 항체의 Fc 부분에 결합하는 Fc 수용체를 발현한다. 항체가 병원체에 감염된 표적 세포의 표면에 결합되면, 이후 NK 세포와 결합하여 이를 활성화한다. NK 세포는 IFN-γ와 같은 사이토카인과 퍼포린 및 그랜자임과 같은 단백질을 방출한다. 퍼포린은 칼슘의 존재 하에 올리고머화되는 기공 형성 세포용해소이다. 그랜자임은 표적 세포에서 세포 예정사를 유도하는 세린 프로테아제이다. NK 세포 외에, 대식세포, 호중구, 및 호산구 또한 ADCC를 매개할 수 있다.
ADCC는 발광 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 인간 1차 NK 효과기 세포(Hemacare)를 해동하고 37℃에서 5x105/mL의 림프구 성장 배지-3(Lonza)에 밤새 정치시킨다. 다음날, 인간 림프아구성 세포주 Raji 표적 세포(ATCC CCL-86)를 회수하고, 분석 배지(페놀 레드 무함유 RPMI, 10% FBSΔ, GlutaMAX™)에 재현탁하고, 다양한 농도의 목적 프로브 각각의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 플레이팅한다. 이어서, 정치시킨 NK 세포를 회수하고, 분석 배지에 재현탁하고, 항-CD20 코팅된 Raji 세포를 함유하는 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 5:1(5x104 NK 세포: 1x104 Raji)의 효과기-대-표적 세포의 최종 비율로 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
CytoTox-Glo™ 세포독성 분석 키트(Promega)를 사용하여 ADCC 활성을 측정한다. CytoTox-Glo™ 분석은 발광성 펩티드 기질을 사용하여, 막 무결성을 상실한 세포, 예를 들어 용해된 Raji 세포에 의해 방출되는 죽은 세포 프로테아제 활성을 측정한다. 6시간의 인큐베이션 후, 준비된 시약(기질)을 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 오비탈 플레이트 진탕기에 두었다. PHERAstar F5 플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 발광을 측정한다. 데이터는 대조 조건(NK 세포 + Raji만)에서의 판독치를 시험 조건에서 빼서 백그라운드를 제거한 후 분석된다.
XVI. 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)
본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 또한 면역계에 의한 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 활성을 강화할 수 있다. 항체 옵소닌작용으로도 알려진 ADCP는 병원체가 식세포에 의해 섭취되어 제거되도록 표시되는 과정이다. 식세포는 유해한 외래 병원체 및 죽거나 죽어가는 세포를 섭취하여 신체를 보호하는 세포이다. 이 과정은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPS)에 의해 활성화되어 NF-κB 활성화로 이어진다. 이어서, C3b와 같은 옵소닌 및 항체가 표적 병원체에 부착할 수 있다. 표적이 옵소닌으로 코팅되면, Fc 도메인은 Fc 수용체를 통해 식세포를 유인한다. 이어서, 식세포가 세포를 삼키고, 섭취된 물질의 포식소체는 리소좀과 융합된다. 이어서, 이후의 포식리소좀은 세포 물질을 단백질 분해하여 소화시킨다.
ADCP는 생물발광 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 항체 의존성 세포-매개 식균작용(ADCP)은 치료 항체의 중요한 작용 매커니즘이다. ADCP는 FcγRIIa(CD32a), FcγRI(CD64), 및 FcγRIIIa(CD16a)를 통해 단핵구, 대식세포, 호중구, 및 수지상 세포에 의해 매개될 수 있다. 3가지 수용체 모두 항체 인식, 면역 수용체 클러스터링, 및 ADCP를 유발하는 신호전달 이벤트에 참여할 수 있지만, 차단 연구는 FcγRIIa가 이러한 과정에 관여하는 주요 Fcγ 수용체임을 시사한다.
FcγRIIa-H ADCP 수용체 생물검정은, FcγRIIa에 특이적으로 결합하여 이를 활성화하는 Fc 도메인을 사용하여 항체 및 다른 생물 제제의 효능과 안정성을 측정하는 데 사용될 수 있는 생물발광 세포 기반 분석이다. 이러한 분석은 아미노산 131에 히스티딘(H)을 함유하는 고친화도 인간 FcγRIIa-H 변이체를 발현하는 유전자 조작 Jurkat T 세포주 및 NFAT-반응 요소(NFAT-RE)에 의해 유도되는 루시페라제 리포터로 구성된다.
표적 세포 및 관련 항체와 공배양하는 경우, FcγRIIa-H 효과기 세포는 항체의 Fc 도메인에 결합하여 FcγRIIa 신호전달 및 NFAT-RE 매개 루시퍼라제 활성을 유발한다. 생물발광 신호는 루시퍼라제 분석 및 표준 발광측정기를 사용하여 검출되고 정량화된다.
실시예
하기 실시예는 본원에 청구된 방법 및 화합물이 어떻게 수행되고, 제조되고, 평가되는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 기재되며, 오직 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1. 선형 Fc-항원 도메인 함유 폴리펩티드의 조립을 제어하기 위한 직교 이종이량체화 도메인의 사용
Fc 도메인 사이에 펩티드 링커를 포함하거나 포함하지 않는 직렬 Fc 작제물의 제조를 포함하여, 항체의 C-말단에 Fc 도메인을 부가하는 다양한 접근법이 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Nagashima et al., Mol Immunol, 45:2752-63, 2008, 및 Wang et al. MAbs, 9:393-403, 2017] 참조). 그러나, 과학 문헌에 기재된 다중 Fc 도메인을 갖는 항체 작제물을 제조하는 방법은 다수의 원치 않는 Fc 도메인 함유 단백질 종의 생성을 초래하기 때문에 효과가 제한적이다. 이러한 종은 산물 생성 중에 폴리펩티드 사슬의 제어되지 않은 오프-레지스터 회합으로 인해 상이한 분자량 가지므로 사다리형 분자량을 초래한다(예를 들어, 문헌[Nagashima et al., Mol Immunol, 45:2752-63, 2008, 및 Wang et al. MAbs, 9:393-403, 2017] 참조). 도 1 및 도 2는 2개의 직렬 Fc 단량체(도 1) 또는 3개의 직렬 Fc 단량체(도 3)를 함유하는 폴리펩티드의 오프-레지스터 회합에 의해 생성될 수 있는 다양한 분자량의 다중 Fc 도메인을 갖는 단백질 종의 일부 예를 개략적으로 도시한다. 정의된 분자량의 다중 Fc 도메인을 갖는 원하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 이러한 기존 접근법을 사용하여 일관되게 얻으려면, 더 큰 분자량의 고차종(HOS)의 제거가 요구되며, 이는 원하는 작제물의 수율을 크게 감소시킨다.
직교 이종이량체화 도메인의 사용은 다량의 고차종(HOS)을 생성하지 않으면서 직렬 Fc 확장을 갖는 구조의 생성을 가능하게 하였다. 도 3a 및 도 3b는 다중 Fc 도메인 단량체를 갖는 하나의 긴 폴리펩티드를 각각 단일 Fc 단량체를 갖는 2개의 상이한 짧은 폴리펩티드에 연결하여 생성되는, 2개의 Fc 도메인(도 3a) 또는 3개의 Fc 도메인(도 3b)을 갖는 직교 선형 Fc-항원 도메인 결합 작제물의 예를 도시한다. 이러한 예에서, 각 작제물의 하나의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 CH3-CH3 계면에서의 역전하 돌연변이와 조합된 노브-홀 돌연변이, 및 1개의 다른 Fc 도메인(도 3a) 또는 2개의 다른 Fc 도메인(도 3b)의 CH3-CH3 계면에서의 2개의 역전하 돌연변이를 포함한다. 2개의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 단량체를 갖는 짧은 폴리펩티드 사슬은 돌출부-형성 돌연변이 및 단일 역전하 돌연변이를 갖는 장쇄 Fc 단량체에 대해 더 낮은 친화성을 가지며, 2개의 양립성 역전하 돌연변이를 갖는 장쇄 Fc 단량체(들)에 결합할 가능성이 훨씬 더 크다. 역전하 돌연변이와 조합된 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 단량체를 갖는 짧은 폴리펩티드 사슬은 양립성 역전하 돌연변이와 조합된 돌출부-형성 돌연변이를 갖는 장쇄 Fc 단량체에 결합할 가능성이 훨씬 더 크다.
직교 이종이량체화 돌연변이는 또한, 고차종과 같은 원치 않는 단백질 종의 생성을 감소시키면서, 작제물의 특정 Fc 도메인에 상이한 특이성의 특정 항원 결합 도메인을 배치하여 이중 특이적 또는 다중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 조립하는 데 사용될 수 있다. 실시예 3, 4, 및 7 내지 27은 Fc 도메인에 (선택적으로 동종이량체화 돌연변이와 함께) 직교 이종이량체화 돌연변이를 도입하여 생성될 수 있는 이중 특이적 및 다중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 일부 예를 나타낸다.
실시예 2. Fc-항원 결합 도메인 작제물에 대한 다양한 항원 결합 도메인의 부착
이종이량체화 돌연변이를 사용하여 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 Fc 도메인에 많은 유형의 항체-기반 항원 결합 도메인이 다양한 조합 및 형태로 부착될 수 있다. 예를 들어, 상이한 Fab 또는 Fab 관련 항원 결합 도메인을 특정 Fc 도메인에 부착하여 다중 항원에 대한 특이성을 갖는 Fc 작제물을 생성할 수 있다. 도 4는 3개의 Fc 도메인의 기본 구조는 동일하지만 항원 결합 도메인 성분이 상이한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 일부 예를 도시한다. 예를 들어, 도 4의 이중 특이적 Fc 작제물 각각은, 2개의 역전하 돌연변이를 함유하는 하나의 장쇄의 Fc 단량체가 2개의 양립성 역전하 돌연변이를 함유하는 다른 장쇄의 Fc 단량체와 회합할 때 형성되는 "줄기" Fc 도메인에서 연결되는 2개의 상이한 장쇄 폴리펩티드(각각은 2개의 Fc 도메인 단량체를 함유)를 갖는다. 이 도면의 줄기 Fc 도메인의 각각의 단량체는 2개의 역전하 돌연변이를 갖지만, Fc 단량체는 추가(2개 초과)의 양립성 역전하 돌연변이를 포함하도록 설계될 수 있다. 각각의 장쇄 폴리펩티드는 또한, 함몰부-형성 돌연변이 및 양립성 역전하 돌연변이를 갖는 더 짧은 폴리펩티드의 Fc 도메인 단량체와 양립 가능한, 돌출부-형성 돌연변이 및 역전하 돌연변이를 함유하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 장쇄 폴리펩티드 및/또는 단쇄 폴리펩티드는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
도 4의 A는 공통 경쇄가 상이한 표적 특이성을 갖는 다중 Fab 도메인(이 예에서는 2개의 Fab 도메인)과 함께 사용될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677-681, 1998] 참조. 작제물의 Fab 중쇄 부분의 친화성 성숙이 필요할 수 있다.
도 4의 B는 항원-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 제1 표적 특이성을 갖는 단일 사슬 항원-결합 도메인(예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 가변 중쇄(VHH), 또는 가변 신규 항원 수용체(VNAR))이 하나의 위치(예를 들어, 하나의 Fc 도메인에 대한 N-말단 또는 C-말단)에 포함될 수 있고 제2 표적 특이성의 Fab가 다른 위치(예를 들어, 동일한 Fc 도메인의 다른 말단, 또는 다른 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단)에 포함될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol., 15:159-63, 1997] 참조.
도 4의 C는 도메인들 사이에 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 제1 표적 특이성을 갖는 단일 사슬 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv, VHH, 또는 VNAR)이 제2 표적 특이성을 갖는 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Dimasi et al., J. Mol. Biol., 393:672-92, 2009] 참조.
도 4의 D는 제1 표적 특이성을 갖는 중쇄 또는 경쇄가 제2 표적 특이성을 갖는 단일 사슬 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv, VHH, 또는 VNAR)의 N-말단에 융합될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Lu et al., J. Immunol. Methods, 267:213-26, 2002] 참조.
도 4의 E는 Fc 도메인에 대한 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 상이한 표적 특이성을 갖는 2개의 상이한 단일 사슬 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv, VHH, 또는 VNAR)이 작제물의 다른 위치(예를 들어, 다양한 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단)에 포함될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Connelly et al., Int. Immunol., 10:1863-72, 1998] 참조.
도 4의 F는 다중 단일 사슬 항원-결합 도메인이 이들 사이에 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고 직렬로 융합될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hayden et al., Ther. Immunol., 1:3-15, 1994] 참조. 단일 사슬 항원 결합 도메인은 상이한 표적 특이성을 가질 수 있다.
도 4의 G는 경쇄 미스페어링을 방지하기 위해 항원 결합 도메인들 중 하나의 중쇄 성분과 경쇄 성분 사이에서 가변 도메인이 교환될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/080251 참조.
도 4의 H는 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고 디아바디 또는 단일 사슬 디아바디가 하나 이상의 Fc 도메인에 융합될 수 있음을 보여준다.
도 4의 I는 하나의 scFv가 하나의 폴리펩티드 사슬의 CH1 도메인에 융합될 수 있고, 상이한 표적 특이성을 갖는 scFv가 다른 폴리펩티드 사슬의 CL 도메인에 융합될 수 있음을 보여준다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Zuo et al., Protein Eng., 13:361-7, 2000] 참조.
도 4의 J는, 예를 들어 표 3에서 선택되는 돌연변이가 각 Fab의 경쇄 및 중쇄 도메인의 특정 페어링을 촉진하기 위해 하나 이상의 Fab 도메인의 경쇄 및 중쇄 서열에 도입될 수 있음을 보여준다.
이들 예는 모두 Fc 작제물로 회합하는 폴리펩티드의 N-말단에 부착되는 항원 결합 도메인을 보여주지만, 항원 결합 도메인은 또한 또는 대안적으로, 폴리펩티드의 C-말단에 부착되거나 Fc 작제물의 링커, 예를 들어 Fc 도메인 사이의 링커에 부착될 수 있다.
실시예 3. 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 생성될 수 있는 이중 특이적 Fc 작제물 구조의 유형
표 4 및 표 5에서 선택된 상이한 노브-홀 및/또는 정전기 역전하 돌연변이를 갖는 직교 이종이량체화 도메인은 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 조립 중에 상이한 표적 특이성을 갖는 다중 항원 결합 도메인 및 Fc 도메인의 포지셔닝을 제어하기 위해 상이한 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있다. Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드 사슬에 1개, 2개 이상의 직교 이종이량체화 도메인을 통합하는 설계 원리를 이용해 매우 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물 구조가 생성될 수 있다.
도 5는 작제물의 하나의 Fc 도메인에 한 세트의 동종이량체화 돌연변이(O, O)를 통합하여 2개 또는 3개의 Fc 단량체 및 제1 표적 특이성의 항원 결합 도메인(1, 1)을 갖는 2개의 장쇄 폴리펩티드를 연결함으로써 조립될 수 있는 분지형 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 일부 예를 도시한다. Fc 도메인 단량체 및 제2 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인(2, 2)을 갖는 단일 단쇄 폴리펩티드에 장쇄 폴리펩티드의 나머지 Fc 단량체를 연결하기 위해 한 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H)가 사용된다. 도 5a 및 도 5d는 작제물의 Fc 도메인에 한 세트의 직교 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H)만을 사용하여 조립될 수 있는 간단한 선형 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 예를 도시한다. 이러한 Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드의 모든 N-말단은 항원 결합 도메인을 갖는다.
도 6은 2개 이상의 직교 이종이량체화 기술을 사용하여 조립될 수 있는 선형 직렬 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 일부 예를 도시한다. 항원 결합 도메인이 없는 다른 Fc 도메인을 유지하면서 작제물의 Fc 도메인들 중 일부에 대한 상이한 표적 특이성의 항원 결합 도메인의 선택적 배치를 제어하기 위해 2개 이상의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이가 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 2개 또는 3개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 하나의 장쇄 폴리펩티드는 N-말단에 부착된 제1 특이성의 항원 결합 도메인(1, 1)을 갖는다. 하나의 Fc 도메인 단량체를 갖는 제1 작은 폴리펩티드 사슬에 장쇄 폴리펩티드를 연결하기 위해 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H)가 사용되는 한편, 하나의 Fc 도메인 단량체를 갖는 제2 작은 폴리펩티드를 장쇄에 연결하기 위해 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(J, K 또는 K, J)가 사용된다. 상이한 작은 사슬 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두는 제2 표적 특이성의 항원 결합 도메인(2, 2) 또는 제1 표적 특이성의 항원 결합 도메인(1, 1)을 가질 수 있다.
도 7은 Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드들 중 일부만이 N-말단에 항원 결합 도메인을 가지고 있기 때문에 Fc 도메인들 중 일부만이 항원 결합 도메인에 연결된 분지형 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 예를 도시한다. 2개의 상이한 장쇄 폴리펩티드를 연결하기 위해 하나의 동종이량체화 Fc 도메인(O, O)이 사용되고, 장쇄를 2개의 상이한 작은 폴리펩티드에 연결하기 위해 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이가 사용된다. Fc 단량체를 갖는 제1 단쇄 폴리펩티드에 장쇄 폴리펩티드 Fc 단량체를 연결하기 위해 한 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H)가 사용된다. Fc 단량체를 갖는 제2 짧은 폴리펩티드에 장쇄 폴리펩티드의 다른 Fc 단량체를 연결하기 위해 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(J, K 또는 K, J)가 사용된다. 임의의 장쇄 또는 단쇄 폴리펩티드는 제1 표적 특이성을 갖는 제1 항원 결합 도메인(1, 1) 또는 제2 표적 특이성을 갖는 제2 항원 결합 도메인(2, 2)을 가질 수 있다.
도 5 내지 도 7의 작제물은 Fab 어셈블리를 제어하기 위한 돌연변이(A, B 또는 B, A; C, D 또는 D, C)가 사용된 Fab 도메인으로 도시되어 있지만, 다른 항원 결합 도메인, 예를 들어 단일 사슬 항원 결합 도메인(예컨대, scFv 또는 VHH) 또는 공통 경쇄를 사용하는 상이한 중쇄를 갖는 항원 결합 도메인이 대신 사용될 수 있다.
실시예 4. 직교 이종이량체화 도메인을 사용하여 생성될 수 있는 삼중 특이적 Fc 작제물 구조의 유형
표 4 및 표 5에서 선택된 상이한 노브-홀 및/또는 정전기 역전하 돌연변이를 갖는 직교 이종이량체화 도메인은 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 조립 중에 상이한 표적 특이성을 갖는 다중 항원 결합 도메인 및 Fc 도메인의 포지셔닝을 제어하기 위해 상이한 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있다. Fc 작제물로 조립되는 폴리펩티드 사슬에 1개, 2개 이상의 직교 이종이량체화 도메인을 통합하는 설계 원리를 이용해 매우 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물 구조가 생성될 수 있다.
도 8은 작제물의 Fc 도메인에 두 세트의 직교 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H, 및 J, K 또는 K, J)를 사용하여 조립될 수 있는 간단한 선형 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 예를 도시한다. 이러한 Fc 작제물로 조립되는 모든 폴리펩티드의 N-말단은 항원 결합 도메인에 부착된다. 이러한 예의 작제물에서, 2개의 Fc 도메인을 갖는 장쇄 폴리펩티드가 제1 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인(1, 1 또는 *, 1)에 부착된다. 단일 Fc 도메인 단량체를 갖는 상이한 단쇄 폴리펩티드 각각이 제2 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인(2, 2, 또는 *, 2) 또는 제3 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인(3, 3, 또는 *, 3)에 부착된다. 상이한 항원 결합 도메인 각각은 어셈블리를 유도하는 돌연변이(A, B 또는 B, A, C, D 또는 D, C, 및 E, F 또는 F, E)를 가질 수 있거나, 상이한 중쇄(1, 2, 또는 3) 및 공통 경쇄(*)를 가질 수 있다.
도 9 및 도 10은 직교 이종이량체화 기술이 폴리펩티드 사슬의 비대칭 배열을 사용하여 삼중 특이적 분지형 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 생성하는 데 또한 사용될 수 있음을 보여준다. 도 9에서, 각각 2개의 Fc 도메인 단량체 및 상이한 항원 결합 도메인(2, 2 또는 *, 2, 또는 *, 3)을 갖는 2개의 장쇄 폴리펩티드는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 J, K)를 사용하여 연결된다. 각각의 장쇄는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H, 또는 J, K 또는 K, J)를 사용하여 Fc 도메인 단량체 및 제3 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인(1, 1 또는 *, 1)을 갖는 단쇄 폴리펩티드에 연결된다. 도 10은, 각각 3개의 Fc 도메인 단량체 및 상이한 항원 결합 도메인(2, 2 또는 *, 2, 또는 *, 3)을 갖는 2개의 장쇄 폴리펩티드가 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 J, K)를 사용하여 연결되는 것을 보여준다. 각각의 장쇄는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H, 또는 J, K 또는 K, J)를 사용하여 Fc 도메인 단량체 및 제3 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인을 갖는 단쇄 폴리펩티드에 연결된다. 도 9 및 도 10의 작제물에서 항원 결합 도메인은 경쇄 어셈블리를 유도하는 돌연변이(A, B 또는 B, A, 또는 C, D 또는 D, C)를 가질 수 있거나, 상이한 중쇄(1, * 또는 *, 1, 2, * 또는 *, 2, 또는 3, * 또는 *, 3)와 함께 공통 경쇄를 사용할 수 있다.
도 11a 및 도 11b는, 각각 3개의 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인(1, 1, *, 1, 또는 1, *)을 갖는 2개의 장쇄 폴리펩티드를 연결하기 위해 한 세트의 동종이량체화 돌연변이(O, O)를 사용하는 점을 제외하고는, 도 10의 작제물과 유사한 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 예를 도시한다. 각각 Fc 도메인 단량체 및 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 2개의 상이한 작은 폴리펩티드에 장쇄를 연결하기 위해 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이가 사용된다. 제2 표적 특이성의 항원 결합 도메인(2, 2, *, 2, 또는 2, *)을 갖는 제1 단쇄 폴리펩티드에 장쇄 폴리펩티드 Fc 단량체를 연결하기 위해 한 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H)가 사용된다. 제3 표적 특이성을 갖는 항원 결합 도메인(3, 3, *, 3, 또는 3, *)을 갖는 제2 짧은 폴리펩티드에 장쇄 폴리펩티드의 다른 Fc 단량체를 연결하기 위해 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(J, K 또는 K, J)가 사용된다. 도 11의 작제물에서 항원 결합 도메인은 경쇄 어셈블리를 유도하는 돌연변이(A, B 또는 B, A, 또는 C, D 또는 D, C)를 가질 수 있거나, 상이한 중쇄(1, * 또는 *, 1, 2, * 또는 *, 2, 또는 3, * 또는 *, 3)와 함께 공통 경쇄를 사용할 수 있다.
도 12 및 도 13은 항원-결합 도메인 및 Fc 도메인의 비대칭 분포를 갖는 삼중 특이적 분지형 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 일부 예를 도시한다. 다양한 길이(2개 또는 3개의 Fc 도메인 단량체) 또는 동일한 길이(2개의 Fc 도메인 단량체)의 상이한 장쇄 폴리펩티드의 Fc 단량체를 연결하기 위해 두 세트의 직교 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H, 또는 J, K 또는 K, J)가 사용된다. 상이한 장쇄 폴리펩티드 중 2개는 상이한 표적 특이성, 예컨대 제2 표적 특이성(2, 2) 또는 제3 표적 특이성(3, 3)을 갖는 항원 결합 도메인에 부착된다. Fc 도메인 단량체 및 제1 표적 특이성의 항원 결합 도메인(1, 1)을 갖는 단쇄 폴리펩티드를 장쇄 폴리펩티드의 Fc 도메인 단량체에 연결하기 위해 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(H, I 또는 I, H, 또는 J, K 또는 K, J)가 사용된다.
도 8 내지 도 13의 Fc 작제물 중 일부는 Fab 어셈블리를 제어하기 위한 돌연변이(예를 들어, A, B 또는 B, A; C, D 또는 D, C, 또는 E, F 또는 F, E)가 사용된 Fab 도메인으로 도시되어 있지만, 다른 항원 결합 도메인, 예를 들어 단일 사슬 항원 결합 도메인(예컨대, scFv 또는 VHH) 또는 공통 경쇄를 사용하는 상이한 중쇄를 갖는 항원 결합 도메인이 대신 사용될 수 있다.
실시예 5. CD20 및 PD-L1을 표적으로 하는 이중 특이적 Fc 작제물
3개의 직렬 Fc 도메인 및 상이한 표적 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인(항-CD20(오비누투주맙) 및 항-PD-L1(아벨루맙) 항원 결합 도메인)을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 제조하였다. 상이한 Fab는 상이한 VH 및 CH1 도메인을 가졌지만 공통 경쇄(VL)를 공유하였다. Fc 작제물은 제1(상부) Fc 도메인에 부착된 제1 항원 결합 도메인 및 작제물의의 제3(하부) Fc 도메인에 부착된 제2 항원 결합 도메인을 가졌다(도 14a). 작제물의 하나의 버전은 긴 Fc 사슬에 항-CD20 VH 및 CH1을 배치하고 짧은 Fc 사슬에 항-PD-L1 VH 및 CH1을 배치한 반면, 작제물의 다른 버전은 긴 Fc 사슬에 항-PD-L1 VH 및 CH1을 배치하고 짧은 사슬에 항-CD20 VH 및 CH1을 배치하였다. 표 9의 폴리펩티드 서열을 사용하여 작제물을 제조하였다. Fc 작제물을 제조하는 데 필요한 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 운반하는 작제물을 HEK 세포에 형질주입하고, 폴리펩티드를 발현시키고, 사용된 세포 배지를 SDS-PAGE로 분석하였다.
[표 9] 이중 특이적 Fc 작제물에 대한 서열
도 14b에 나타낸 바와 같이, 원하는 산물에 대해 예상했던대로 각 작제물에 대한 주요 단백질 밴드는 250 kDa였다(레인 1 및 2). 250 kDa 산물을 잠재적으로 생성할 수 있는 Fc 작제물을 제조하는 데 사용된 4개의 폴리펩티드의 유일한 다른 조합은 Fab VH 및 CH1과 직렬 연결된 3개의 Fc 도메인을 포함하는 두 카피의 장쇄 폴리펩티드와 두 카피의 Fab 경쇄의 조합일 것이다. 이러한 원치 않는 산물의 형성은 3개의 직렬 Fc 도메인 모두에서의 동종이량체화를 방지하기 위해 이종이량체화 돌연변이에 의한 부전을 필요로 할 것이다. 원치 않는 동종이량체화 산물의 생성으로 인해 250 kDa 단백질 밴드가 생성될 가능성을 배제하기 위해, 3개의 직렬 Fc 도메인을 갖는 장쇄 폴리펩티드 및 공통 Fab 경쇄에 대한 유전자를 2개의 단쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 다른 2개의 유전자의 부재 하에 HEK 세포에 형질주입하였다. 도면은 SDS-PAGE에 의해 사용 배지에서 250 kDa 산물이 검출되지 않았음을 보여준다(레인 3 및 4). 전체적으로, 도면의 레인 1~4로부터의 결과는 작제물을 조립하는 데 필요한 4개의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현하여 원하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 두 형태 모두가 올바르게 생성되었음을 보여준다.
세포 배양
DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 아미노산 서열은 여러 플라스미드에 의해 인코딩되었다.
단백질 정제
발현된 단백질을 Poros MabCapture A 컬럼을 사용하여 단백질 A-기반 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc 작제물을 로딩 후 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.0)로 세정하고, 추가 공정 관련 불순물을 제거하기 위해 중간 세정 완충액 50 mM 구연산염 완충액(pH 5.5)으로 추가 세정하였다. 결합된 Fc 작제 물질을 pH 3의 100 mM 글리신으로 용리하고, pH 7.4의 1 M TRIS를 첨가하여 용리액을 신속하게 중화한 후, 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.
Poros XS 수지를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질을 추가로 분별하였다. pH 6의 50 mM MES(완충액 A)로 컬럼을 사전 평형화하고, 로딩을 위해 샘플을 평형화 완충액에 희석하였다(1:3). 용리 완충액으로서 50 mM MES(100% A)에서 pH 6의 400 mM 염화나트륨(100% B)까지의 12~15 CV 선형 구배를 사용하여 샘플을 용리하였다. 용리 중에 수집된 모든 분획을 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하고, 표적 분획을 풀링하여 정제된 Fc 작제 물질을 생성하였다.
이온 교환 후, 풀링된 물질을 접선 유동 여과 시스템에서 30 kDa 컷오프 폴리에테르 설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 1X-PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 약 10~15 mg/mL로 농축하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.
실시예 6. CD38 및 BCMA를 표적으로 하는 이중 특이적 작제물
이종이량체화 돌연변이를 사용하여 동일한 분자에서 상이한 표적 특이성을 갖는 2개의 상이한 Fab 도메인의 조립을 유도할 가능성을 입증하기 위해, 하나의 항-CD38 Fab 및 하나의 항-BCMA Fab를 갖는 이중 특이적 항체를 제조하였다(도 15a). Fc 도메인 단량체를 갖는 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬 및 2개의 상이한 경쇄 폴리펩티드를 사용하여 Fc 작제물을 조립하였다. 하나의 폴리펩티드 사슬은 돌출부-형성 돌연변이 및 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 Fab의 불변 도메인(CH1 + CL)에 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이(B)를 갖는 Fab 중쇄 부분을 가졌다. 이 Fab 부분에 대한 경쇄는 양립성 세트의 이종이량체화 돌연변이(B)를 갖거나 야생형 서열을 가졌다. 제2 폴리펩티드 사슬은 함몰부-형성 돌연변이 및 역전하 돌연변이(제1 폴리펩티드의 역전하 돌연변이와 양립 가능)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 Fab의 불변 도메인(CH1 + CL)에 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이(C)를 갖는 Fab 중쇄 부분을 가졌다. 이 Fab 부분에 대한 경쇄는 양립성 세트의 이종이량체화 돌연변이(D)를 갖거나 야생형 서열을 가졌다. 표 10은 이들 Fab의 각각의 어셈블리를 제어하기 위해 항-CD38 Fab 경쇄 및 중쇄에, 그리고 항-BCMA 경쇄 및 중쇄에 사용된 상이한 Fab 이종이량체화 돌연변이를 나타낸다.
[표 10] 항-CD38(다라투무맙) 및 항-BCMA(벨란타맙) 서열에 대한 돌연변이
도 15b는 Fc 작제물을 인코딩하는 4개의 유전자가 HEK 세포에 형질주입되었을 때 150 kDa 산물이 수득되었음을 보여준다(레인 1~6 참조). 이는 원하는 Fc 작제물의 예상된 크기였다. 레인 8은 3개의 Fc 도메인을 갖고 항원 결합 도메인이 없는 작제물이 발현된 대조군이었다. 노브-홀 및 역전하 돌연변이를 함유하는 Fc 도메인에 부착된 돌연변이된 Fab 도메인의 발현은 Fab 이종이량체화 돌연변이 및 Fc 이종이량체화 돌연변이가 성공적으로 함께 사용되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 조립할 수 있음을 나타낸다.
액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 분석
원하는 종의 Fc-항원 결합 도메인 작제물(도 15a 및 표 10)이 형성되었는지 확인하기 위해 액체 크로마토그래피-질량 분석을 또한 수행하였다. 발현된 단백질을 Poros MabCapture A 컬럼을 사용하여 단백질 A-기반 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 로딩 후 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.0)로 세정하고, 추가 공정 관련 불순물을 제거하기 위해 중간 세정 완충액 50 mM 구연산염 완충액(pH 5.5)으로 추가 세정하였다. 결합된 Fc 작제 물질을 pH 3의 100 mM 글리신으로 용리하였고, pH 7.4의 1 M TRIS를 첨가하여 용리액을 신속하게 중화한 후, 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.
10 kDa 스핀 필터(EMD Millipore)를 사용하여 100 μg의 각 Fc 작제물을 1 μg/μL의 농도로 50 mM 중탄산암모늄(pH 7.8)에 완충액 교환하였다. 50 μg의 샘플을 30 유닛 PNGase F(Promega)와 함께 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 물 중의 0.1% 포름산 및 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산을 이동상으로 사용하여 Waters Acquity C4 BEH 컬럼(1x100 mm, 1.7 um 입도, 300A 기공 크기)에서 분리를 수행하였다. Ultimate 3000(Dionex) 크로마토그래피 시스템 및 Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific) 질량 분석기에서 LC-MS를 수행하였다. 스펙트럼은 Biopharma Finder(Thermo Fisher Scientific)의 기본 ReSpect 방법을 사용하여 디컨볼루션되었다.
도 15c 내지 도 15f는 SDS-PAGE에서 관찰된 150 kDa 산물(도 15b)이 주로 각각의 상이한 경쇄 중 하나(하나는 항-CD38 Fab에 대한 것이고 하나는 항-BCMA Fab에 대한 것)를 포함함을 입증하는 LC-MS 분석 결과를 보여준다. 원하는 이중 특이적 종은 탈글리코실화 후 145,523 Da의 분자량을 갖는 반면, 2개의 항-BCMA 경쇄를 갖는 작제물은 원하는 종보다 261 Da 낮은 분자량을 가지며, 2개의 항-CD38 경쇄를 갖는 작제물은 원하는 종보다 261 Da 높은 분자량을 갖는다. 각 샘플에서의 우세한 종은 각 경쇄 중 하나를 포함하는 145,523 Da 종이었다(도 15c는 도 15b의 레인 1의 정제된 작제물의 주요 LC-MS 피크를 나타내고; 도 15d는 도 15b의 레인 2의 정제된 작제물의 주요 LC-MS 피크를 나타내고; 도 15e는 도 15b의 레인 3의 정제된 작제물의 주요 LC-MS 피크를 나타내고; 도 15f는 도 15b의 레인 4의 정제된 작제물의 주요 LC-MS 피크를 나타냄).
실시예 7. Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 22(도 16)는 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 두 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 가짐), 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 8. Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 23(도 17)은 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 세 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 직렬 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 가짐), 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 9. Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 24(도 18)는 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬 및 두 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 10. Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 25(도 19)는 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬 및 두 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 11. Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 26(도 20)은 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬 및 네 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 가짐)와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 12. Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 27(도 21)은 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬 및 네 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 13. Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 28(도 22)은 2개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬 및 네 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를가짐), 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 14. Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 29(도 23)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 상이한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐)를 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 15. Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 30(도 24)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 상이한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐)를 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 16. Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 31(도 25)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 상이한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐)를 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 17. Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 32(도 26)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬, 하나의 짧은 Fc 사슬의 두 카피, 및 한 카피의 제2 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 직렬 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐)를 포함한다(제3 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 가짐). 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 18. Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 33(도 27)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬, 두 카피의 제1 짧은 Fc 사슬, 한 카피의 제2 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 직렬 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐)를 포함한다(제3 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 가짐). 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 19. Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 34(도 28)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬, 두 카피의 제1 짧은 Fc 사슬, 한 카피의 제2 짧은 Fc 사슬) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 직렬 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐)를 포함한다(제3 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 세트의 이종이량체화 돌연변이를 가짐). 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 20. Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 35(도 29)는 4개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(2개의 별개의 긴 Fc 사슬, 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 제1 긴 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 긴 Fc 사슬은 제1 긴 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 4개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 21. Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 36(도 30)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 22. Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 37(도 31)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 23. Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 38(도 32)은 4개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(2개의 별개의 긴 Fc 사슬, 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 제1 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 제1 긴 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 4개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 24. Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 39(도 33)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 25. Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 40(도 34)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 26. Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 41(도 35)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 상이한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐), 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 27. Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 42(도 36)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(각각은 표 4에서 선택된 상이한 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 가짐), 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다.
실시예 28. Fc-항원 결합 도메인 작제물을 특성화하는 데 사용된 실험적 분석
펩티드 및 글리코펩티드 액체 크로마토그래피-MS/MS
단백질(Fc 작제물)을 6 M 구아니딘(Sigma)에 1 μg/μL로 희석하였다. 디티오트레이톨(DTT)을 10 mM의 농도로 첨가하여 65℃에서 30분 동안 변성 조건 하에 이황화결합을 감소시켰다. 얼음에서 냉각한 후, 샘플을 암실에서 1시간 동안 30 mM 요오드아세트아미드(IAM)와 함께 인큐베이션하여 유리 티올을 알킬화(카바미도메틸화)하였다. 이어서, 단백질을 10-kDa 멤브레인을 통해 25 mM 중탄산암모늄 완충액(pH 7.8)으로 투석하여 IAM, DTT, 및 구아니딘을 제거하였다. 단백질을 Barocycler(NEP 2320; Pressure Biosciences, Inc.)에서 트립신으로 분해하였다. 압력은 37℃에서 1시간 동안 20,000 psi와 상압 사이에서 총 30 사이클 순환되었다. Ultimate 3000(Dionex) 크로마토그래피 시스템 및 Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific) 질량 분석기에서 펩티드의 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 물 중의 0.1% FA 및 아세토니트릴 중의 0.1% FA를 이동상으로 사용하여 BEH PepMap(Waters) 컬럼에서 단백질을 분리하였다.
원형 질량 분석(Intact Mass Spectrometry)
10 kDa 스핀 필터(EMD Millipore)를 사용하여 50 μg의 단백질(Fc 작제물)을 1 μg/μL의 농도로 50 mM 중탄산암모늄(pH 7.8)에 완충액 교환하였다. 30 유닛 PNGase F(Promega)를 샘플에 첨가하고 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 물 중의 0.1% FA 및 아세토니트릴 중의 0.1% FA를 이동상으로 사용하여 Waters Acquity C4 BEH 컬럼(1x100 mm, 1.7 um 입도, 300A 기공 크기)에서 분리를 수행하였다. Ultimate 3000(Dionex) 크로마토그래피 시스템 및 Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific) 질량 분석기에서 LC-MS를 수행하였다. 스펙트럼은 Biopharma Finder(Thermo Fisher Scientific)의 기본 ReSpect 방법을 사용하여 디컨볼루션되었다.
모세관 전기영동-도데실 황산나트륨(CE-SDS) 분석
샘플을 1 mg/mL로 희석하고 HT Protein Express 변성 완충액(PerkinElmer)과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 샘플을 70 μL의 물로 희석하고 96-웰 플레이트로 옮겼다. HT Protein Express LabChip(PerkinElmer)이 장착된 Caliper GXII 기기(PerkinElmer)로 샘플을 분석하였다. 형광 강도를 사용하여 각각의 크기 변형의 상대 존재비를 산출하였다.
비환원 SDS-PAGE
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시킨다. Criterion TGX 무착색(stain-free) 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루(Coommassie blue) 염색으로 가시화한다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화한다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드의 정량화를 수행한다.
보체 의존성 세포독성(CDC)
Raji 세포(ATCC)를 연속 희석된 리툭시맙, Fc 작제물, 또는 IVIg로 코팅하는 비색 분석법으로 CDC를 평가하였다. 인간 혈청 보체(Quidel)를 25% v/v로 모든 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. WST-1 세포 증식 시약(Roche Applied Science)을 첨가한 후 세포를 37℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 2분간 진탕기에 두었고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
실시예 29. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 29의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 29(도 38a)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 볼 수 있는 바와 같이, 2개의 상이한 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인을 사용하는 대신, 하나의 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인이 사용되고 하나의 정전기 스티어링 이종이량체화 도메인이 사용된다. 예시적인 서열은 도 38b에 나타내어져 있다.
실시예 30. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 30의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 30(도 39a)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 볼 수 있는 바와 같이, 2개의 상이한 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인을 사용하는 대신, 하나의 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인이 사용되고 하나의 정전기 스티어링 이종이량체화 도메인이 사용된다. 예시적인 서열은 도 39b에 나타내어져 있다.
실시예 31. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 31의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 31(도 40)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 볼 수 있는 바와 같이, 2개의 상이한 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인을 사용하는 대신, 하나의 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인이 사용되고 하나의 정전기 스티어링 이종이량체화 도메인이 사용된다. 예시적인 서열은 도 40b에 나타내어져 있다.
실시예 32. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 32의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 32(도 41a)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬, 하나의 짧은 Fc 사슬의 두 카피, 및 한 카피의 제2 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 볼 수 있는 바와 같이, 2개의 상이한 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인을 사용하는 대신, 하나의 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인이 사용되고 하나의 정전기 스티어링 이종이량체화 도메인(2개의 Fc 도메인에 존재)이 사용된다. 예시적인 서열은 도 41b에 나타내어져 있다.
실시예 33. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 33의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 33(도 42a)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬, 두 카피의 제1 짧은 Fc 사슬, 한 카피의 제2 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 볼 수 있는 바와 같이, 2개의 상이한 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인을 사용하는 대신, 하나의 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인이 사용되고 하나의 정전기 스티어링 이종이량체화 도메인(2개의 Fc 도메인에 존재)이 사용된다. 예시적인 서열은 도 42b에 나타내어져 있다.
실시예 34. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 34의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 대안적 작제물 34(도 43a)는 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬, 두 카피의 제1 짧은 Fc 사슬, 한 카피의 제2 짧은 Fc 사슬) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 볼 수 있는 바와 같이, 2개의 상이한 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인을 사용하는 대신, 하나의 돌출부/함몰부 이종이량체화 도메인이 사용되고 하나의 정전기 스티어링 이종이량체화 도메인(2개의 Fc 도메인에 존재)이 사용된다. 예시적인 서열은 도 43b에 나타내어져 있다.
실시예 35. Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 35(도 44a)는 4개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(2개의 별개의 긴 Fc 사슬, 및 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 제1 긴 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 긴 Fc 사슬은 제1 긴 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 4개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다. 예시적인 서열은 도 44b에 나타내어져 있다.
실시예 36. Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 37(도 45a)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 짧은 Fc 사슬 및 긴 Fc 사슬에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 인코딩된다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다. 예시적인 서열은 도 45b에 나타내어져 있다.
실시예 37. Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 긴 Fc 사슬 및 짧은 Fc 사슬을 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 40(도 46a)은 3개의 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(두 카피의 긴 Fc 사슬, 2개의 별개의 짧은 Fc 사슬 각각의 두 카피) 및 3개 또는 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 긴 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬 연결된, 표 5 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 4에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제1 짧은 Fc 사슬은 표 4에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 제2 짧은 Fc 사슬은 제1 짧은 Fc 사슬의 제1 세트의 돌연변이와 다른, 표 4에서 선택된 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및, 선택적으로, 표 5에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 N-말단의 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 포함한다. 발현된 단백질은 실시예 5에서와 같이 정제된다. 예시적인 서열은 도 46b에 나타내어져 있다.
기타 구현예
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 독립적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 나타내어진 것과 같은 정도로 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명을 이의 특정 구현예와 관련하여 기술하였지만, 추가의 변형이 가능하다는 것과, 본 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 공지되었거나 통상적인 실시 내에서 상기 제시된 본질적인 특징에 적용될 수 있고 청구범위의 범주에 따르는 본 발명으로부터의 벗어남을 포함하여 일반적으로 본 발명의 원리를 따른 본 발명의 임의의 변형, 사용, 또는 응용을 포함하고자 하는 것임은 이해될 것이다.
기타 구현예는 청구 범위 내에 포함된다.
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Arg Ser Ile Ala Thr
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
1 5 10 15
His
<210> 32
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 32
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Thr Gly Ser Gly
35
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 33
Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ile Asp Leu Ile Ser Val Pro Val Asp Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 34
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 34
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
albumin binding peptide
<400> 37
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 38
His His His His His His
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
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<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 43
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 44
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 45
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 45
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 46
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 47
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 47
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 48
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Asp Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 51
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 52
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 53
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 53
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
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<400> 56
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<400> 58
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<400> 59
000
<210> 60
<400> 60
000
<210> 61
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 61
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<400> 62
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<400> 63
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<400> 66
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<400> 74
000
<210> 75
<400> 75
000
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 76
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 77
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 78
Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 79
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Trp
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 80
Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 86
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Gly Phe Lys Phe Ser Gly Tyr Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 89
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 90
Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 93
Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Ser Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Gly Phe Ala Phe Ser His Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Gly Phe Ser Leu Ser Lys Phe Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Gly Phe Thr Phe Lys Asn Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 103
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Gly Tyr Thr Phe Leu Asn Cys Pro Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Tyr Met Gln
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 107
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1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser
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<211> 8
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
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1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 110
Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 111
Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 112
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 113
Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 114
Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 115
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 117
Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 118
Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Ile Arg Ser Ala Asn Asn His Ala Pro Thr
1 5 10
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 122
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 123
Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Ser Pro
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 124
Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 126
Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 129
Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 130
Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Ile
1 5
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
1 5
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 132
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 133
Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr
1 5
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 135
Gly Trp Met Lys Pro Arg Gly Gly Ala Val Asn
1 5 10
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Ile Gly Ser Ser Gly Gly Val Thr Asn
1 5
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 138
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
1 5 10 15
Phe Asp Val
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 140
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr
1 5 10
<210> 142
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 142
Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val
1 5 10
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
1 5 10 15
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 144
Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 145
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 146
Ala Arg Arg Asp Ile Thr Thr Phe Tyr
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 147
Ala Arg Ser Val Gly Pro Phe Asp Ser
1 5
<210> 148
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 148
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 149
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 149
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 150
Ala Arg Gln Met Gly Tyr Trp His Phe Asp Leu Trp
1 5 10
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 151
Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 152
Thr Arg Trp Arg Arg Phe Phe Asp Ser
1 5
<210> 153
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 153
Thr Arg Asp Ser Thr Ala Thr His
1 5
<210> 154
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 154
Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 155
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 156
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 156
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 157
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 157
Ala Arg His Arg Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Leu Thr Tyr
1 5 10
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 158
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Glu Asp Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 159
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 159
Thr Arg Val Lys Leu Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 160
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 161
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 161
Ala Arg Ile Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Val Lys Pro Gly Gly Asp Tyr
1 5
<210> 163
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 163
Val Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 164
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 164
Ala Arg Pro Val Arg Ser Arg Trp Leu Gln Leu Gly Leu Glu Asp Ala
1 5 10 15
Phe His Ile
<210> 165
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 165
Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 166
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 166
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 167
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 167
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 168
Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe
1 5
<210> 169
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 169
Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp
1 5 10
<210> 170
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 170
Ala Arg Val Gly Leu Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gln Gln
1 5 10
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 171
Gln Asn Val Asp Thr Asn
1 5
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 172
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 173
Arg Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 174
Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe
1 5 10
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 175
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
1 5 10
<210> 176
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Ser Ser Val Pro Tyr
1 5
<210> 177
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 177
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 178
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 178
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ala Asn His Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 179
Glu Asn Val Tyr Ser Tyr
1 5
<210> 180
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 180
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 181
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 181
Gln Asp Val Ser Thr Val
1 5
<210> 182
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 182
Gln Asn Ile Asp Lys Tyr
1 5
<210> 183
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 183
Gln Ser Val Ile Asn Asp
1 5
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 184
Glu Ser Val Asp Ser Tyr Ala Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 185
Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 186
Gln Asp Val Asn Thr Ala
1 5
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 187
Gln Ser Val Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 188
Gln Gly Ile Ile Ser Tyr
1 5
<210> 189
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 189
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 190
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 190
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 191
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 191
Ser Ser Ile Ser Tyr
1 5
<210> 192
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 192
Gln Asp Ile Gly Ser Ser
1 5
<210> 193
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 193
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
1 5
<210> 194
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 194
Gln Asp Val Gly Ile Ala
1 5
<210> 195
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 195
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 196
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 197
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 197
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 198
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 198
Ser Gln Tyr Gly Ser Leu Ala Trp
1 5
<210> 199
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 199
Ser Leu Ser Asn Ile Gly Leu Asn
1 5
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 200
Tyr Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 201
Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 202
Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile Thr
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 203
Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 204
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 205
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 206
Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 207
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 208
Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 209
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 209
His Gln Tyr Leu Ser Ser
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 210
Gln His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 211
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 212
Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr Thr
1 5
<210> 213
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 213
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 214
Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg Thr
1 5
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 215
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 216
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 216
Gln Gln Asp Thr Ser Pro Pro
1 5
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 217
Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 218
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 219
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 220
Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 221
Gly Gln Tyr Ala Asn Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 222
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 222
His Gln Tyr Ser Lys Leu Pro
1 5
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 223
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 224
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr Thr
1 5
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 225
His Gln Arg Asp Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 226
Leu Gln Tyr Val Ser Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 227
Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 228
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 229
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 230
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 230
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val
1 5 10
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 231
Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 232
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 232
Gln Gln Tyr Glu Phe Phe Gly Gln Gly Thr
1 5 10
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 233
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Pro Pro Gly
1 5
<210> 234
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 234
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 235
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 4-30 residues
<400> 235
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 236
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> This sequence may encompass 4-20 residues
<400> 236
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 237
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 8-30 residues
<400> 237
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 238
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> This sequence may encompass 8-20 residues
<400> 238
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 239
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> This sequence may encompass 12-20 residues
<400> 239
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 240
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 12-30 residues
<400> 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 241
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 241
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu
20
<210> 242
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 242
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
<210> 243
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 243
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu
<210> 244
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 244
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 245
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 245
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 246
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 246
Gly Ile Ser Gly Asp Pro Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 247
Asp Leu Pro Leu Val Tyr Thr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 248
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 248
Ser Gly Asp Asn Leu Arg His Tyr Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 249
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 249
Gly Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 250
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 250
Gln Thr Tyr Thr Gly Gly Ala Ser
1 5
<210> 251
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 251
Ser Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 252
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 252
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 253
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 253
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 254
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 254
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
210 215 220
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 255
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 255
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 256
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 256
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Asp Pro Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Leu Pro Leu Val Tyr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
115
<210> 257
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 257
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 258
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 258
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 259
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 259
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 260
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 260
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 261
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 261
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg His Tyr Tyr Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Gly Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Leu
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Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105
<210> 262
<211> 200
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 4-200 residues
<400> 262
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 263
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(180)
<223> This sequence may encompass 4-180 residues
<400> 263
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly
180
<210> 264
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(160)
<223> This sequence may encompass 4-160 residues
<400> 264
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<223> This sequence may encompass 12-200 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
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<400> 292
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 16-200 residues
<400> 293
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 18-200 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 295
<211> 200
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<213> Artificial Sequence
<220>
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polypeptide
<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 30-200 residues
<400> 296
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<220>
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<223> This sequence may encompass 40-200 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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polypeptide
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<223> This sequence may encompass 70-200 residues
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
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<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 80-200 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 90-200 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 100-200 residues
<400> 303
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 120-200 residues
<400> 304
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
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50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 140-200 residues
<400> 305
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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165 170 175
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195 200
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 160-200 residues
<400> 306
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 180-200 residues
<400> 307
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 190-200 residues
<400> 308
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 309
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 309
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 310
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 310
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
20 25 30
<210> 311
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 311
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
20 25
<210> 312
<211> 943
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 312
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
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275 280 285
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 313
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 314
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 315
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 316
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 317
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 318
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
<210> 319
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 319
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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435 440 445
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 320
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr
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930 935 940
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 321
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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100 105 110
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115 120 125
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
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435 440 445
Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
545 550 555 560
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
565 570 575
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
580 585 590
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr
595 600 605
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
645 650 655
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
660 665 670
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
675 680 685
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 322
<211> 696
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 322
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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515 520 525
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530 535 540
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 323
<211> 943
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 323
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
725 730 735
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
930 935 940
Claims (173)
- 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 선택적인 제3 링커; 및 선택적인 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 이종이량체화 선택성 모듈과 제2 이종이량체화 선택성 모듈은 상이한, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1항에 있어서, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 동종이량체화 선택성 모듈 또는 제1 또는 제2 이종이량체화 선택성 모듈과 동일한 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제3 링커; 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제3 링커; 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 및 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체를 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인; 제3 링커; 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제1 링커; 제1 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 및 제2 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체를 순서대로 포함하는 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1항에 있어서, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1항에 있어서, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1항에 있어서, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제8항, 제10항, 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 상기 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 돌출부-형성 돌연변이를 갖는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제3항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고 돌출부-형성 돌연변이를 포함하지 않는 상기 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 역전하 돌연변이를 갖는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있는, 폴리펩티드.
- 제14항에 있어서, 상기 돌연변이들은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이들은 단일 아미노산 변화인, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진, 폴리펩티드. - 제1항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 글리신 스페이서인, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30, 4 내지 20, 8 내지 30, 8 내지 20, 12 내지 20, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어진, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제21항에 있어서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제22항에 있어서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A인, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제24항에 있어서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제25항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P인, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진, 폴리펩티드.
- 제27항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 폴리펩티드.
- 제27항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는, 폴리펩티드.
- 제27항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 가지며, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제40항에 있어서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이이거나 또는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이인, 폴리펩티드.
- 제40항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 scFv인, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제44항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, VH 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 폴리펩티드.
- 제46항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있는, 폴리펩티드.
- 각각의 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 내 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결된 제1항 내지 제57항 중 어느 항의 폴리펩티드의 두 카피를 포함하는 폴리펩티드 복합체.
- 제58항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 각각의 카피는 동일하게, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택된 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 상기 폴리펩티드의 두 카피는 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체에서 연결되는, 폴리펩티드 복합체.
- IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결된 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제60항에 있어서, 제2 폴리펩티드 IgG1 Fc 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제61항에 있어서, 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이는 Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제61항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제63항에 있어서, 적어도 하나의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제60항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 제1 특이성 또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제2 특이성을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 항원 결합 도메인은 scFv인, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, VH 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 폴리펩티드 복합체.
- 제72항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있는, 폴리펩티드 복합체.
- (내용 없음)
- 제60항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 복합체는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드에 추가로 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제3 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되고, 제2 및 제3 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 상이한 IgG1 Fc 도메인 단량체에 연결되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제85항에 있어서, 제3 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제2 특이성 또는 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제88항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제3 특이성을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
- 단일 Fc 도메인 및 상이한 특이성의 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 복합체에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 강화된 효과기 기능을 포함하는 제58항 내지 제89항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체.
- 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 선택적인 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 선택적인 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되,
적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고,
적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드. - 제91항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제91항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제91항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제91항에 있어서, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제91항에 있어서, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제91항에 있어서, IgG1 Fc 도메인 단량체 중 2개는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항, 제94항 내지 제96항, 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 상기 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 돌출부-형성 돌연변이를 갖는, 폴리펩티드.
- 제91항 또는 제97항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고 돌출부-형성 돌연변이를 포함하지 않는 상기 폴리펩티드의 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 각각 동일한 역전하 돌연변이를 갖는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있는, 폴리펩티드.
- 제102항에 있어서, 상기 돌연변이들은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제103항에 있어서, 상기 돌연변이들은 단일 아미노산 변화인, 폴리펩티드.
- 제91항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진, 폴리펩티드. - 제91항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 글리신 스페이서인, 폴리펩티드.
- 제91항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30, 4 내지 20, 8 내지 30, 8 내지 20, 12 내지 20, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진, 폴리펩티드.
- 제91항에 있어서, 제2 링커 및 선택적인 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어진, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제109항에 있어서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제110항에 있어서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A인, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제112항에 있어서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제113항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P인, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진, 폴리펩티드.
- 제115항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 폴리펩티드.
- 제115항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는, 폴리펩티드.
- 제115항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 가지며, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인들은 동일하고, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인들은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 폴리펩티드.
- 제119항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제91항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제128항에 있어서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이이거나 또는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이인, 폴리펩티드.
- 제128항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 폴리펩티드.
- 제91항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- 제91항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드.
- (내용 없음)
- 제91항 내지 제132항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 폴리펩티드는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드에 추가로 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 의해 연결되지 않은 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제3 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체 또는 제3 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제135항에 있어서, 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이는 Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제135항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하고 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제135항에 있어서, 제3 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하고 적어도 하나의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제137항 또는 제138항에 있어서, 적어도 하나의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체 또는 제3 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제137항에 있어서, 제3 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제138항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, 및 D356K로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 scFv인, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인의 VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 1A 또는 1B에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 폴리펩티드 복합체.
- 제148항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
- 제134항에 있어서, 제1 특이성의 항원 결합 도메인 및/또는 제2 특이성의 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있는, 폴리펩티드 복합체.
- 단일 Fc 도메인 및 상이한 특이성의 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 복합체에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 강화된 효과기 기능을 포함하는 제134항 내지 제158항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체. 160. 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
- (내용 없음)
- 제160항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제160항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
- 제161항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 조건 하에서 제162항 또는 제163항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
- 제162항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제163항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제162항에 있어서, 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제163항에 있어서, 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제162항에 있어서, 10개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제163항에 있어서, 10개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제169항 또는 제170항에 있어서, IgG1 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 10개, 8개, 6개, 또는 4개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
- 제172항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 미만은 Fc 도메인 단량체에 적어도 하나의 푸코스 변형을 갖는, 약학 조성물.
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