BR112021000393A2

BR112021000393A2 - Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado

Info

Publication number: BR112021000393A2
Application number: BR112021000393-2A
Authority: BR
Inventors: Jonathan C. Lansing; Daniel Ortiz
Original assignee: Momenta Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2021-04-06
Also published as: EP3820910A4; WO2020014542A9; CA3106254A1; EP3820910A2; MX2021000305A; WO2020014542A2; AU2019301698A1; WO2020014542A3; US20210284717A1; CN112969717A; JP2021531755A; KR20210042325A; IL279989A

Abstract

composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado. a presente divulgação se refere a composições e métodos de construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado, em que os construtos do domínio de ligação fc-antígeno incluem pelo menos dois domínios fc e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÕES E MÉTODOS RELACIONADOS A CONSTRUTOS DO DOMÍ- NIO DE LIGAÇÃO FC-ANTÍGENO MANIPULADO”. Listagem de Sequência

[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência en- vidada eletronicamente no formato ASCII incorporada integralmente por meio desta para referência. A referida cópia ASCII, criada em 23 de agosto de 2019, é denominada 14131-0184WO1_SL.txt e possui

235.566 bytes de tamanho. Antecedentes da Invenção

[002] Muitos anticorpos terapêuticos funcionam recrutando ele- mentos do sistema imune inato por meio da função efetora dos domínios Fc, como citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Continua a haver necessidade de proteínas te- rapêuticas melhoradas. Sumário da Invenção

[003] A presente invenção apresenta composições e métodos para combinar a especificidade ao alvo de um domínio de ligação ao antígeno com pelo menos dois domínios Fc para gerar novas terapêuticas com atividade biológica única. As composições e métodos descritos neste documento permitem a construção de construtos constituídos por várias cadeias polipeptídicas e com múltiplos domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes (isto é, proteínas biespecíficas, tri- específicas ou multiespecíficas) e múltiplos domínios Fc de múltiplas cadeias polipeptídicas. O número, especificidade alvo e espaçamento dos domínios de ligação ao antígeno podem ser ajustados para alterar as propriedades de ligação (por exemplo, avidez de ligação) dos cons- trutos para antígenos alvo e o número de domínios Fc pode ser ajustado para controlar a magnitude das funções efetoras para eliminar células de ligação ao antígeno. Mutações (isto é, mutações de heterodimeriza- ção e/ou homodimerização, como descrito neste documento) são intro- duzidas nos polipeptídeos do construto para reduzir o número de com- plexos proteicos indesejados alternativamente montados que são pro- duzidos. Em alguns casos, mutações de heterodimerização ou homodi- merização são introduzidas nos monômeros do domínio Fc (preferenci- almente no domínio CH3) e monômeros do domínio Fc diferencialmente mutados são colocados entre as diferentes cadeias polipeptídicas que se agrupam ao construto, de modo a controlar a montagem das cadeias polipeptídicas no construto desejado. Estas mutações estabilizam sele- tivamente o pareamento desejado de certos monômeros do domínio Fc e desestabilizam seletivamente os pareamentos indesejados de outros monômeros do domínio Fc. Em alguns casos, os construtos de domínio de ligação Fc-antígeno são construtos de domínio de ligação Fc-antí- geno "ortogonais" que são formados por um primeiro polipeptídeo con- tendo monômeros do domínio Fc múltiplos, em que pelo menos dois dos monômeros de Fc contêm diferentes mutações de heterodimerização (e, assim, diferem um do outro na sequência), por exemplo, um polipep- tídeo mais longo com dois ou mais monômeros de Fc com diferentes mutações de heterodimerização, e pelo menos dois polipeptídeos adici- onais que contêm pelo menos um monômero de Fc, em que os monô- meros de Fc dos polipeptídeos adicionais contêm diferentes mutações de heterodimerização entre si (e, portanto, sequências diferentes), por exemplo, dois polipeptídeos mais curtos em que cada um contém um único monômero do domínio Fc com diferentes mutações de heterodi- merização. As mutações de heterodimerização dos polipeptídeos adici- onais são compatíveis com as mutações de heterodimerização de pelo menos do monômero de Fc do primeiro polipeptídeo.

[004] Em alguns casos, a presente invenção contempla a combi- nação de dois ou mais domínios de ligação ao antígeno (por exemplo,

domínios de ligação ao antígeno de anticorpos terapêuticos), com pelo menos dois domínios Fc para gerar um novo agente terapêutico. Em alguns casos, os domínios de ligação ao antígeno são iguais. Em alguns casos, os domínios de ligação ao antígeno são diferentes. Para gerar tais construtos, a invenção fornece vários métodos para a montagem de construtos com pelo menos dois, por exemplo, múltiplos, domínios Fc, e para controlar a homodimerização e heterodimerização de tais, para montar moléculas de tamanho discreto a partir de um número limitado de cadeias polipeptídicas, cujos polipeptídeos também são objeto da presente invenção. As propriedades desses construtos permitem a ge- ração eficiente de composições farmacêuticas substancialmente homo- gêneas. Essa homogeneidade em uma composição farmacêutica é de- sejável a fim de garantir a segurança, eficácia, uniformidade e confiabi- lidade da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, os no- vos construtos terapêuticos com pelo menos dois domínios Fc descritos neste documento têm uma atividade biológica que é maior do que a de uma proteína terapêutica com um único domínio Fc.

[005] Em um primeiro aspecto, a invenção exibe um construto do domínio de ligação ao antígeno de Fc incluindo função efetora potenci- alizada, onde o construto de ligação Fc-antígeno inclui pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno, por exemplo, dois, três, quatro ou cinco domínios de ligação e um primeiro domínio Fc unido a um se- gundo domínio Fc por um ligante. Em algumas modalidades, dois ou mais domínios de ligação ao antígeno têm especificidades alvo diferen- tes. Em alguns casos, o construto do domínio de ligação Fc-antígeno tem função efetora potencializada em um ensaio de citotoxicidade de- pendente de anticorpos (Antibody-Dependent Cytotoxicity, ADCC), um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpo (Antibody-Depen- dent Cellular Phagocytosis, ADCP) e/ou ensaio de citotoxicidade depen- dente do complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC) em relação a um construto com um domínio Fc único e pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno.

[006] Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que compreende: um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira es- pecificidade; um primeiro ligante; um primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um primeiro módulo de seletividade de hete- rodimerização; um segundo ligante; um segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um segundo módulo de seletividade de he- terodimerização; um terceiro ligante opcional; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 opcional, em que o primeiro e o segundo módu- los de seletividade de heterodimerização são diferentes.

[007] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG em que o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende um módulo de seletividade de heterodimerização ou um módulo de seletividade de heterodimerização que é idêntico ao primeiro ou segundo módulo de seletividade de heterodimerização.

[008] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende o do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; o pri- meiro ligante; o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreen- dendo um primeiro módulo de seletividade de heterodimerização; o se- gundo ligante; o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreen- dendo um segundo módulo de seletividade de heterodimerização; um terceiro ligante; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, nesta ordem.

[009] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende: o do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; o pri- meiro ligante; o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreen- dendo um primeiro módulo de seletividade de heterodimerização; um terceiro ligante; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1; o se- gundo ligante; e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compre- endendo um segundo módulo de seletividade de heterodimerização, nesta ordem.

[0010] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende o do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; um ter- ceiro ligante; um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1; o primeiro ligante; o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um primeiro módulo de seletividade de heterodimerização; o segundo ligante; e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um segundo módulo de seletividade de heterodimerização, nesta or- dem.

[0011] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma pro- tuberância modificada e o terceiro monômero do domínio de IgG1 com- preende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0012] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada e o segundo monômero do domínio de IgG1 compre- ende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0013] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada e o primeiro monômero do domínio de IgG1 compre- ende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0014] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do domínio Fc de IgG1 compreendem duas ou quatro mutações de carga inversa e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mutações que formam uma protuberância modifi- cada.

[0015] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protuberância modificada e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0016] Em algumas modalidades, os monômeros do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protuberância modifi- cada compreendendo ainda uma, duas ou três mutações de carga in- versa. Em algumas modalidades, os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada possuem, cada um, mutações que formam protube- rância idênticas. Em algumas modalidades, os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem duas ou quatro mutações de carga inversa e nenhuma mutação formando protuberância têm mu- tações de carga inversa idênticas.

[0017] Em algumas modalidades, as mutações que formam uma protuberância modificada e as mutações de carga inversa estão no do- mínio CH3. Em algumas modalidades, as mutações estão dentro da se- quência da posição EU G341 à posição EU K447, estes inclusos. Em algumas modalidades, as mutações são alterações de único aminoá- cido.

[0018] Em algumas modalidades, o segundo ligante e o terceiro li- gante opcional compreendem ou consistem em uma sequência de ami- noácidos selecionada do grupo consistindo em:

GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 23), GGGGS (SEQ ID NO: 1), GGSG (SEQ ID NO: 2), SGGG (SEQ ID NO: 3), GSGS (SEQ ID NO: 4), GSGSGS (SEQ ID NO: 5), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 6), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 7), GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 8), GGSGGS (SEQ ID NO: 9), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 10), GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GGSG (SEQ ID NO: 2), GGSG (SEQ ID NO: 2), GGSGGGSG (SEQ ID NO: 12), GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 234), GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 28), SACYCELS (SEQ ID NO: 29), RSIAT (SEQ ID NO: 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO: 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 32), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO: 33), GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 34), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 35), SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18), GGSGGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO: 36), GGGG (SEQ ID NO: 19), GGGGGGGG (SEQ ID NO: 20), GGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 21) e GGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 22). Em algumas mo- dalidades, o segundo ligante e o terceiro ligante opcional é um espaça- dor de glicina. Em algumas modalidades, o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem, independentemente, em 4 a 30 (SEQ ID NO: 235), 4 a 20 (SEQ ID NO: 236), 8 a 30 (SEQ ID NO: 237), 8 a 20 (SEQ ID NO: 238), 12 a 20 (SEQ ID NO: 239) ou 12 a 30 (SEQ ID NO: 240) resíduos de glicina. Em algumas modalidades, o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consiste em 20 resíduos de glicina (SEQ ID NO: 23).

[0019] Em algumas modalidades, pelo menos um dos monômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posi- ção EU I253. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácido na posição EU I253 é independentemente selecionada do grupo consis- tindo em I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, e I253Y. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácidos na posição I253 é I253A.

[0020] Em algumas modalidades, pelo menos um dos monômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posi- ção EU R292. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácido na posição EU R292 é independentemente selecionada do grupo que consiste em R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, e R292Y. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácidos na posição R292 é R292P.

[0021] Em algumas modalidades, a dobradiça de cada monômero do domínio Fc compreende ou consiste, independentemente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em EPKSCDKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 241) e DKTHTCPPCPA- PELL (SEQ ID NO: 242). Em algumas modalidades, a porção de dobra- diça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc possui a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 242). Em algumas modalidades, a porção de dobradiça do primeiro monômero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCDKTHTCPPCPAPEL (SEQ ID NO: 243). Em algumas modalida- des, a porção de dobradiça do primeiro monômero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCDKTHTCPPCPAPEL (SEQ ID NO: 243) e a porção de dobradiça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc têm a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 242).

[0022] Em algumas modalidades, os domínios CH2 de cada monô- mero do domínio Fc compreendem independentemente a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 244) com no máximo duas deleções ou substituições de único aminoácido. Em algumas modalidades, os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 244) com no máximo duas substituições de único amino- ácido. Em algumas modalidades, os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequência de aminoáci- dos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY- VDGVEVHNAKTKPREE-

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 244).

[0023] Em algumas modalidades, os domínios CH3 de cada monô- mero do domínio Fc compreendem independentemente a sequência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 245) com no máximo 10 substituições de único aminoá- cido. Em algumas modalidades, os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem independentemente a sequência de ami- noácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE- WESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 245) com no máximo 8 substituições de único aminoácido. Em algumas modalidades, os domínios CH3 de cada monômero do do- mínio Fc compreendem independentemente a sequência de aminoáci- dos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES- NGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 245) com no máximo 6 substituições de único aminoácido. Em algumas modalidades, os domínios CH3 de cada monômero do do- mínio Fc compreendem independentemente a sequência de aminoáci- dos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES- NGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 245) com no máximo 5 substituições de único aminoácido.

[0024] Em algumas modalidades, as substituições de único amino- ácido são selecionadas a partir do grupo que consiste em: S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, cada um dos monômeros do domínio Fc compreende, independentemente, a se- quência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47 com até 10 substituições de único aminoácido. Em algumas moda- lidades, até 6 das substituições de único aminoácido são mutações de carga inversa no domínio CH3 ou são mutações que formam uma pro- tuberância modificada. Em algumas modalidades, as substituições de único aminoácido estão na sequência da posição EU G341 à posição EU K447, com estas inclusas.

[0025] Em algumas modalidades, pelo menos uma das mutações que formam uma protuberância modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T e T394F. Em algumas modalidades, as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

[0026] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um scFv. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio CH1. Em algumas modali- dades, o domínio de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio VL. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 indicadas na Tabela 1A e 1B. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio VH compreendendo uma sequência de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o do- mínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e a sequência de VH, excluindo-se as sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, é pelo me- nos 95% ou 98% idêntica à sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um con- junto de sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 indicadas na Tabela 1A ou 1B. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um conjunto de se- quências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algu- mas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma se- quência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e um domínio VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma sequência de VL de um anticorpo indicado na Tabela 2, em que as sequências do domí- nio VH e VL, excluindo-se as sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR- H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, são pelo menos 95% ou 98% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um conjunto de uma sequência de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí- geno compreende um domínio constante de anticorpo CL de IgG e um domínio constante de anticorpo CH1 de IgG. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio CH1 e pode se ligar a um polipeptídeo compreendendo um do- mínio VL e um domínio CL para formar um Fab.

[0027] Em algumas modalidades, a invenção se refere a um com- plexo polipeptídico que compreende duas cópias do polipeptídeo de qualquer uma das modalidades, unidas por ligações dissulfeto entre re- síduos de cisteína na dobradiça de um monômero do domínio Fc de IgG1 de cada polipeptídeo. Em algumas modalidades, cada cópia do polipeptídeo compreende de forma idêntica um monômero do domínio Fc com duas ou quatro mutações de carga inversa selecionadas entre K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K, e em que as duas cópias do polipeptídeo são unidas nos monômeros do domínio Fc com estas mutações de carga inversa.

[0028] Em algumas modalidades, a invenção se refere a um com- plexo polipeptídico que compreende um polipeptídeo de qualquer uma das modalidades precedentes, unido a um segundo polipeptídeo que compreende um monômero do domínio Fc de IgG1, em que o polipep- tídeo e o segundo polipeptídeo são unidos por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobradiça do primeiro, segundo ou ter- ceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo e no domínio dobradiça do segundo polipeptídeo.

[0029] Em algumas modalidades, o segundo monômero de Fc de IgG1 do polipeptídeo compreende mutações formando uma cavidade modificada. Em algumas modalidades, as mutações que formam a ca- vidade modificada são selecionadas do grupo que consiste em: Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A. Em algumas modalida- des, o segundo monômero polipeptídico compreende ainda pelo menos uma mutação de carga inversa. Em algumas modalidades, a pelo me- nos uma mutação de carga inversa é selecionada a partir de: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, o segundo monômero do polipep- tídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

[0030] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compre- ende ainda um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira espe- cificidade ou uma segunda especificidade. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno tem uma segunda especificidade. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo. Em algumas mo- dalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia leve do anticorpo. Em algumas modalidades, o domí- nio de ligação ao antígeno é um scFv. Em algumas modalidades, o do- mínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio

CH1. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com- preende ainda um domínio VL.

Em algumas modalidades, o domínio VH compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 indicadas na Tabela 1A e 1B.

Em algumas modalidades, o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio VH com- preendendo uma sequência de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e a sequência de VH, excluindo-se as sequências de CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3, é pelo menos 95% ou 98% idêntica à sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o do- mínio VH compreende uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí- geno compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 indicadas na Tabela 1A ou 1B.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compre- ende sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um conjunto de sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e um domínio VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma sequência de VL de um anticorpo indicado na Tabela 2, em que as sequências do domínio VH e VL, excluindo-se as sequên- cias de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, são pelo menos 95% ou 98% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH e VL de um an- ticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio constante de anticorpo CL de IgG e um domínio constante de anticorpo CH1 de IgG. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domí- nio VH e um domínio CH1 e pode se ligar a um polipeptídeo compreen- dendo um domínio VL e um domínio CL para formar um Fab.

[0031] Em algumas modalidades, o complexo polipeptídico se une ainda a um terceiro polipeptídeo compreendendo um monômero do do- mínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que o polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo são unidos por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobradiça do primeiro, segundo ou terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo e o domínio dobradiça do terceiro polipeptídeo, em que o segundo e o terceiro polipeptídeos se unem a diferentes mo- nômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo.

[0032] Em algumas modalidades, o terceiro monômero do polipep- tídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, o terceiro polipeptídeo com- preende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

[0033] Em algumas modalidades, o terceiro polipeptídeo compre- ende ainda um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda es- pecificidade ou uma terceira especificidade. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno tem uma terceira especificidade.

[0034] Em algumas modalidades, o complexo polipeptídico compre- ende função efetora potencializada em um ensaio de citotoxicidade de- pendente de anticorpos (ADCC), um ensaio de fagocitose celular de- pendente de anticorpo (ADCP) e/ou ensaio de citotoxicidade depen- dente do complemento (CDC) em relação a um complexo polipeptídico que tem um domínio Fc único e pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno com especificidades diferentes.

[0035] Em outro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo que compreende um primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 com- preendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3; um segundo ligante; um segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3; um terceiro ligante opcional; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 opcional compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que pelo menos um monômero do domínio Fc compreende mutações que formam uma protuberância modificada e em que pelo menos um monômero do domínio Fc compre- ende pelo menos duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0036] Em algumas modalidades, o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mutações que formam uma protuberância modificada. Em algumas modalidades, o pri- meiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mutações que formam uma protuberância modificada e o segundo monômero do do- mínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga in- versa.

[0037] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma pro- tuberância modificada e o terceiro monômero do domínio de IgG1 com- preende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0038] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada e o segundo monômero do domínio de IgG1 compre- ende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0039] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada e o primeiro monômero do domínio de IgG1 compre- ende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0040] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do domínio Fc de IgG1 compreendem duas ou quatro mutações de carga inversa e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mutações que formam uma protuberância modifi- cada.

[0041] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protuberância modificada e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

[0042] Em algumas modalidades, os monômeros do domínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protuberância modifi- cada compreendendo ainda uma, duas ou três mutações de carga in- versa. Em algumas modalidades, os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada possuem, cada um, mutações que formam protube- rância idênticas. Em algumas modalidades, os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem duas ou quatro mutações de carga inversa e nenhuma mutação formando protuberância têm mu- tações de carga inversa idênticas.

[0043] Em algumas modalidades, as mutações que formam uma protuberância modificada e as mutações de carga inversa estão no do- mínio CH3. Em algumas modalidades, as mutações estão dentro da se- quência da posição EU G341 à posição EU K447, estes inclusos. Em algumas modalidades, as mutações são alterações de único aminoá- cido.

[0044] Em algumas modalidades, o segundo ligante e o terceiro li- gante opcional compreendem ou consistem em uma sequência de ami- noácidos selecionada do grupo consistindo em: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 23), GGGGS (SEQ ID NO: 1), GGSG (SEQ ID NO: 2), SGGG (SEQ ID NO: 3), GSGS (SEQ ID NO: 4), GSGSGS (SEQ ID NO: 5), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 6), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 7), GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 8), GGSGGS (SEQ ID NO: 9), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 10), GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GGSG (SEQ ID NO: 2), GGSG (SEQ ID NO: 2), GGSGGGSG (SEQ ID NO: 12), GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 234), GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 28), SACYCELS (SEQ ID NO: 29), RSIAT (SEQ ID NO: 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO: 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 32), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO: 33), GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 34), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 35), SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18), GGSGGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO: 36), GGGG (SEQ ID NO: 19), GGGGGGGG (SEQ ID NO: 20), GGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 21) e GGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 22). Em algumas mo- dalidades, o segundo ligante e o terceiro ligante opcional é um espaça- dor de glicina. Em algumas modalidades, o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem, independentemente, em 4 a 30 (SEQ ID NO:

235), 4 a 20 (SEQ ID NO: 236), 8 a 30 (SEQ ID NO: 237), 8 a 20 (SEQ ID NO: 238), 12 a 20 (SEQ ID NO: 239) ou 12 a 30 (SEQ ID NO: 240) resíduos de glicina. Em algumas modalidades, o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem em 20 resíduos de glicina (SEQ ID NO: 23).

[0045] Em algumas modalidades, pelo menos um dos monômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posi- ção EU I253. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácido na posição EU I253 é independentemente selecionada do grupo consis- tindo em I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, e I253Y. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácidos na posição I253 é I253A.

[0046] Em algumas modalidades, pelo menos um dos monômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posi- ção EU R292. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácido na posição EU R292 é independentemente selecionada do grupo que consiste em R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, e R292Y. Em algumas modalidades, cada mutação de aminoácidos na posição R292 é R292P.

[0047] Em algumas modalidades, a dobradiça de cada monômero do domínio Fc compreende ou consiste, independentemente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em EPKSCDKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 241) e DKTHTCPPCPA- PELL (SEQ ID NO: 242). Em algumas modalidades, a porção de dobra- diça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc possui a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 242). Em algumas modalidades, a porção de dobradiça do primeiro monômero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos

EPKSCDKTHTCPPCPAPEL (SEQ ID NO: 243). Em algumas modalida- des, a porção de dobradiça do primeiro monômero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCDKTHTCPPCPAPEL (SEQ ID NO: 243) e a porção de dobradiça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc têm a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 242).

[0048] Em algumas modalidades, os domínios CH2 de cada monô- mero do domínio Fc compreendem independentemente a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 244).

[0049] Em algumas modalidades, os domínios CH3 de cada monô- mero do domínio Fc compreendem independentemente a sequência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

[0050] Em algumas modalidades, as substituições de único amino- ácido são selecionadas a partir do grupo que consiste em: S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, cada mo- nômero do domínio Fc compreende independentemente a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47 com até 10 substituições de único aminoácido. Em algumas modalidades, até 6 das substituições de único aminoácido são mutações de carga inversa no domínio CH3 ou são mutações que formam uma protuberância modificada. Em algu- mas modalidades, as substituições de único aminoácido estão na se- quência da posição EU G341 à posição EU K447, com estas inclusas. Em algumas modalidades, pelo menos uma das mutações que formam uma protuberância modificada é selecionada do grupo que consiste em S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T e T394F. Em algumas modalidades, as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

[0051] Em algumas modalidades, a invenção se refere a um com- plexo polipeptídico que compreende um polipeptídeo de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o polipeptídeo se une a um se- gundo polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que o polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são uni- dos por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobra- diça de um primeiro, segundo ou terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo e o domínio dobradiça do segundo polipeptídeo e em que o polipeptídeo se une ainda a um terceiro polipeptídeo compre- endendo um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especi- ficidade e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que o po- lipeptídeo e o terceiro polipeptídeo se unem por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobradiça de um primeiro, segundo ou terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que não se une pelo segundo polipeptídeo e o domínio dobradiça do terceiro poli- peptídeo.

[0052] Em algumas modalidades, o segundo monômero polipeptí- dico ou o terceiro monômero polipeptídico compreende mutações que formam uma cavidade modificada. Em algumas modalidades, as muta- ções que formam a cavidade modificada são selecionadas do grupo que consiste em: Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A. Em algu- mas modalidades, o segundo monômero polipeptídico compreende mu- tações que formam uma cavidade modificada e compreende ainda pelo menos uma mutação de carga inversa. Em algumas modalidades, o ter- ceiro monômero do polipeptídeo compreende mutações que formam uma cavidade modificada e compreende ainda pelo menos uma muta- ção de carga inversa. Em algumas modalidades, a pelo menos uma mu- tação de carga inversa é selecionada a partir de: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, o segundo monômero do polipeptí- deo ou o terceiro monômero do polipeptídeo compreende duas ou qua- tro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, o terceiro monômero do polipeptídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro muta- ções de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K. Em algumas modalidades, o segundo monômero do polipeptídeo compre- ende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas entre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

[0053] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compre- ende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido. Em algumas modalidades, o terceiro polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

[0054] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio variável de cadeia leve do anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade é um scFv. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio VH e um do- mínio CH1. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende ainda um domínio VL. Em algumas modalidades, o domínio VH do domínio de ligação ao an- tígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 indicado na Tabela 1A ou 1B. Em algumas modalidades, o domínio VH domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domí- nio VH que compreende uma sequência de um anticorpo indicada na

Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio VH do domínio de liga- ção ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade com- preende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2 e a sequência de VH, excluindo as se- quências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, é pelo menos 95% ou 98% idêntica à sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma pri- meira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um con- junto de sequências de VH e VL de um conjunto de anticorpos indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí- geno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao an- tígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2 e um domínio VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma sequência de VL de um anticorpo indicado na Tabela 2, em que as sequências do domínio VH e VL, ex- cluindo as sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3, são pelo menos 95% ou 98% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende uma sequência de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio constante de anticorpo CL de IgG e um domínio constante de anticorpo CH1 de IgG. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio VH e um domínio CH1 e pode se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio VL e um domínio CL para formar um Fab.

[0055] Em algumas modalidades, o complexo polipeptídico compre- ende função efetora potencializada em um ensaio de citotoxicidade de- pendente de anticorpos (ADCC), um ensaio de fagocitose celular de- pendente de anticorpo (ADCP) e/ou ensaio de citotoxicidade depen- dente do complemento (CDC) em relação a um complexo polipeptídico que tem um domínio Fc único e pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno com especificidades diferentes.

[0056] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das modali- dades precedentes.

[0057] Em outro aspecto, a invenção se refere a um vetor de ex- pressão que compreende a molécula de ácido nucleico.

[0058] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospe- deira que compreende a molécula de ácido nucleico.

[0059] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospe- deira que compreende o vetor de expressão.

[0060] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de pro- dução do polipeptídeo de qualquer uma das modalidades precedentes compreendendo a cultura da célula hospedeira de qualquer uma das modalidade precedentes em condições para expressar o polipeptídeo.

[0061] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domínio VL de anticorpo. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira compreende ainda uma molécula de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domínio VL de anticorpo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domínio VL de anticorpo e um domínio CL de anti- corpo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domínio VL de anticorpo e um domínio CL de anti- corpo.

[0062] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um monômero do domínio Fc de IgG1 tendo não mais do que 10 mutações de único aminoácido. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo o monômero do domínio Fc de IgG1 tendo não mais do que 10 mutações de único aminoácido. Em algumas modalidades, o monômero do domínio Fc de IgG1 compre- ende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47 tendo não mais do que 10, 8, 6 ou 4 mutações de único aminoácido no domínio CH3.

[0063] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo de qualquer uma das mo- dalidades precedentes.

[0064] Em algumas modalidades, menos de 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% dos polipeptídeos da composição farmacêutica possuem pelo menos uma modificação de fucose em um monômero do domínio Fc.

[0065] Em todos os aspectos da invenção, alguns ou todos os mo- nômero do domínio Fc (por exemplo, um monômero do domínio Fc que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID

NOs; 42, 43, 45 e 47 com no máximo 10, 8, 6 ou 4 substituições de único aminoácido (por exemplo, no domínio CH3 somente) podem ter uma ou ambas as substituições de aminoácidos E345K e E430G além das ou- tras substituições ou modificações de aminoácidos. As substituições de aminoácidos E345K e E430G podem aumentar a multimerização do do- mínio Fc. Definições:

[0066] Como usado neste documento, o termo "monômero do do- mínio Fc" refere-se a uma cadeia polipeptídica que inclui pelo menos um domínio dobradiça e segundo e terceiro domínios constantes de an- ticorpo (CH2 e CH3) ou seus fragmentos funcionais (por exemplo, pelo menos um domínio dobradiça ou um fragmento funcional deste, um do- mínio CH2 ou um fragmento funcional deste, e um domínio CH3 ou um fragmento funcional deste) (por exemplo, fragmentos que são capazes de (i) dimerizar com outro monômero do domínio Fc para formar um domínio Fc, e (ii) se ligar a um receptor Fc). Um monômero do domínio Fc preferido compreende, de terminais amino a carbóxi, pelo menos uma porção da dobradiça IgG1, um domínio CH2 de IgG1 e um domínio CH3 de IgG1. Assim, um monômero do domínio Fc, por exemplo, mo- nômero do domínio Fc humano de IgG1 pode se estender de E316 a G446 ou K447, de P317 a G446 ou K447, de K318 a G446 ou K447, de K318 a G446 ou K447, de S319 a G446 ou K447, de C320 a G446 ou K447, de D321 a G446 ou K447, de K322 a G446 ou K447, de T323 a G446 ou K447, de K323 a G446 ou K447, de H324 a G446 ou K447, de T325 a G446 ou K447 ou de C326 a G446 ou K447. O monômero do domínio Fc pode ser qualquer isotipo de anticorpo imunoglobulina, in- cluindo IgG, IgE, IgM, IgA, ou IgD (por exemplo, IgG). Adicionalmente, o monômero do domínio Fc pode ser um subtipo de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, ou IgG4) (por exemplo, IgG1 humano). O monômero do domínio de IgG1 humano é usado nos exemplos descritos neste documento. O domínio dobradiça completo do IgG1 humano es- tende-se de E316 a P230 ou L235, o domínio CH2 estende-se de A231 ou G236 a K340 e o domínio CH3 estende-se de G341 a K447 da Nu- meração EU. Há diferentes visões da posição do último aminoácido do domínio dobradiça. É P230 ou L235. Em muitos exemplos deste docu- mento, o domínio CH3 não inclui K347. Assim, um domínio CH3 pode ser de G341 a G446. Em muitos exemplos deste documento, um domí- nio dobradiça pode incluir E216 a L235. Isto é verdadeiro, por exemplo, quando a dobradiça é de terminal carbóxi a um domínio CH1 ou a um domínio de ligação CD38. Em algum caso, por exemplo quando a do- bradiça está no terminal amino de um polipeptídeo, o Asp na Numera- ção EU 221 é mutado a Gln. Um monômero do domínio Fc não inclui nenhuma porção de uma imunoglobulina que seja capaz de atuar como uma região de reconhecimento de antígeno, por exemplo, um domínio variável ou uma região determinante de complementariedade (CDR). Os monômeros do domínio Fc podem conter tantas quantas dez altera- ções de uma sequência de monômero do domínio Fc do tipo selvagem (por exemplo, humano) (por exemplo, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 substituições, adições ou deleções de aminoácidos) que podem alterar a interação en- tre um domínio Fc e um receptor Fc. Os monômeros do domínio Fc po- dem conter tantas quantas dez alterações (por exemplo, alterações de único aminoácido) de uma sequência de monômero do domínio Fc do tipo selvagem (por exemplo, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 substituições, adições ou deleções de aminoácidos) que podem alterar a interação entre mo- nômeros do domínio Fc. Em certas modalidades, existem até 10, 8, 6 ou 5 substituições de único aminoácido no domínio CH3 em compara- ção com a sequência de domínio CH3 de IgG1 humano: GQPRE- PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO: 245). Exemplos de alterações adequadas são conhecidos na técnica.

[0067] Como usado neste documento, o termo "domínio Fc" refere- se a um dímero de dois monômeros do domínio Fc que são capazes de se ligar a um receptor Fc. No domínio Fc do tipo selvagem, os dois mo- nômeros do domínio Fc se dimerizam pela interação entre os dois do- mínios constantes de anticorpo CH3, bem como por uma ou mais liga- ções dissulfeto que se formam entre os domínios dobradiça dos dois monômeros do domínio Fc dimerizantes.

[0068] Na presente invenção, o termo “construto do domínio de li- gação Fc-antígeno” refere-se às cadeias polipeptídicas associadas que formam pelo menos dois domínios Fc como descritos neste documento e que incluem pelo menos um do “domínio de ligação ao antígeno”. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno descritos neste docu- mento podem incluir monômeros do domínio Fc que têm sequências iguais ou diferentes. Por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ter três domínios Fc, dois dos quais incluem IgG1 ou monômeros do domínio Fc derivados de IgG1, e um terceiro que inclui IgG2 ou monômeros do domínio Fc derivados de IgG2. Em outro exem- plo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ter três do- mínios Fc, dois deles incluem um "par protuberância-na-cavidade" e um terceiro que não inclui um "par protuberância-na-cavidade", por exem- plo, o terceiro domínio Fc inclui uma ou mais mutações de direção ele- trostática em vez de um par de protuberância-na-cavidade, ou o terceiro domínio Fc tem uma sequência tipo selvagem (ou seja, não inclui muta- ções). Um domínio Fc forma a estrutura mínima que se liga a um recep- tor Fc, por exemplo, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb ou FcγRIV. Em alguns casos, os construtos do domínio de ligação Fc-antí- geno são construtos do domínio de ligação Fc-antígeno "ortogonais" que são formadas pela junção de um primeiro polipeptídeo contendo vários monômeros do domínio Fc, em que pelo menos dois dos monô- meros de Fc contêm diferentes mutações de heterodimerização (ou seja, os monômeros de Fc cada um tem diferentes mutações de forma- ção de protuberância ou cada um tem diferentes mutações de direção eletrostática, ou um monômero tem mutações formadoras de protube- rância e um monômero tem mutações de direção eletrostáticas), a pelo menos dois polipeptídeos adicionais que cada um contém pelo menos um monômero de Fc, em que os monômeros de Fc dos polipeptídeos adicionais contêm diferentes mutações de heterodimerização entre si (ou seja, os monômeros de Fc dos polipeptídeos adicionais têm diferen- tes mutações de formação de protuberância ou têm diferentes mutações de direção eletrostática, ou um monômero tem mutações formadoras de protuberância e um monômero tem mutações de direção eletrostáticas). As mutações de heterodimerização dos polipeptídeos adicionais se as- sociam de forma compatível com as mutações de heterodimerização de pelo menos do monômero de Fc do primeiro polipeptídeo.

[0069] Como usado neste documento, o termo "domínio de ligação ao antígeno" refere-se a um peptídeo, um polipeptídeo ou um conjunto de polipeptídeos associados que é capaz de ligar especificamente a uma molécula alvo. Em algumas modalidades, o "domínio de ligação ao antígeno" é a sequência mínima de um anticorpo que se liga com espe- cificidade ao antígeno ligado pelo anticorpo. A ressonância plasmônica de superfície (SPR) ou vários imunoensaios conhecidos na técnica, por exemplo, Western Blots ou ELISAs, podem ser usados para avaliar a especificidade de anticorpos para um antígeno. Em algumas modalida- des, o "domínio de ligação ao antígeno" inclui um domínio variável ou uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anti- corpo, por exemplo, uma ou mais CDRs de um anticorpo indicado na Tabela 1A ou 1B, uma ou mais CDRs de um anticorpo indicado na Ta-

bela 2 ou os domínios de VH e/ou VL de um anticorpo indicado na Ta- bela 2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno pode incluir um domínio de VH e um domínio CH1, opcionalmente com um domínio de VL. Em outras modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento Fab de um anticorpo ou um scFv. Um domínio de ligação ao antígeno também pode ser um peptídeo modificado sinte- ticamente que se liga a um alvo especificamente, como uma proteína de ligação baseada em fibronectina (por exemplo, um monocorpo de domínio tipo III de fibronectina (FN3)). Em algumas modalidades, os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno descritos neste docu- mento têm dois ou mais domínios de ligação ao antígeno com especifi- cidade alvo diferente, ou seja, o construto do domínio de ligação Fc- antígeno é biespecífico, triespecífico ou multiespecífico. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao antígeno com especificidade alvo diferente se ligam a moléculas alvo diferentes, por exemplo, prote- ínas ou antígenos diferentes. Em algumas modalidades, os domínios de ligação com especificidade alvo diferente se ligam a partes diferentes da mesma proteína, por exemplo, a epítopos diferentes da mesma pro- teína.

[0070] Como utilizado neste documento, o termo "Regiões Determi- nante de Complementaridade" (CDRs) refere-se aos resíduos de ami- noácidos de um domínio variável de anticorpos que são necessários para a ligação ao antígeno. Cada domínio variável normalmente tem três regiões de CDR identificadas como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, e CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3). Cada região determinante de comple- mentaridade pode incluir resíduos de aminoácidos de uma "região de- terminante de complementaridade" definida por Kabat (ou seja, por volta dos resíduos 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) e 89-97 (CDR-L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) e 95-102 (CDR-H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al.,

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou esses resíduos de um "alça hipervariável" (ou seja, por volta dos resí- duos 26-32 (CDR-L1), 50-52 (CDR-L2) e 91-96 (CDR-L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (CDR-H1), 53-55 (CDR-H2) e 96-101 (CDR-H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos de uma região de CDR definida de acordo com Kabat e uma alça hipervariável.

[0071] "Regiões framework" (doravante FR) são aqueles resíduos de domínio variável que não os resíduos de CDR. Cada domínio variável normalmente tem quatro FRs identificados como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se as CDRs forem definidas de acordo com Kabat, os resíduos FR da cadeia leve são posicionados por volta dos resíduos 1-23 (LCFR1), 35- 49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) e 98-107 (LCFR4) e os resíduos FR da ca- deia pesada estão posicionados por volta dos resíduos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) e 103-113 (HCFR4) nos resíduos da cadeia pesada. Se as CDRs incluem resíduos de aminoácidos de alças hipervariáveis, os resíduos FR da cadeia leve são posicionados por volta dos resíduos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) e 97- 107 (LCFR4) na cadeia leve e os resíduos FR da cadeia pesada são posicionados por volta dos resíduos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56- 95 (HCFR3) e 102-113 (HCFR4) nos resíduos da cadeia pesada. Em alguns casos, quando a CDR inclui aminoácidos tanto de uma CDR como definido por Kabat quanto os de uma alça hipervariável, os resí- duos FR serão ajustados em conformidade.

[0072] Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um reconhecimento completo de antígeno e sítio de ligação. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e uma leve em associação apertada, que pode ser covalente por natureza, por exemplo, em um scFv. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero de VH-VL.

[0073] O fragmento "Fab" contém um domínio variável e constante da cadeia leve e um domínio variável e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 incluem um par de fragmentos Fab que são geralmente ligados covalentemente perto de seu terminal carbóxi por cisteínas de dobradiça.

[0074] Os fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" incluem os domínios de anticorpos VH e VL em uma única cadeia poli- peptídica. Geralmente, o polipeptídeo scFv inclui ainda um ligante poli- peptídico entre os domínios VH e VL, o que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno.

[0075] Como usado neste documento, o termo "domínio constante de anticorpo" refere-se a um polipeptídeo que corresponde a um domí- nio de região constante de um anticorpo (por exemplo, um domínio constante de anticorpo CL, um domínio constante de anticorpo CH1, um domínio constante de anticorpo CH2, ou um domínio constante de anti- corpo CH3).

[0076] Como usado neste documento, o termo "promover" significa estimular e favorecer, por exemplo, favorecer a formação de um domínio Fc a partir de dois monômeros do domínio Fc que tenham maior afini- dade de ligação entre si do que por outros monômeros do domínio Fc distintos. Como descrito neste documento, dois monômeros do domínio Fc que se combinam para formar um domínio Fc podem ter modifica- ções de aminoácido compatíveis (por exemplo, protuberâncias modifi- cadas e cavidades modificadas, e/ou mutações de direção eletrostáti- cas) na interface de seus respectivos domínios constantes de anticorpo CH3. As modificações de aminoácido compatíveis promovem ou favore- cem a interação seletiva desses monômeros do domínio Fc entre si em relação a outros monômeros do domínio Fc que não possuem essas modificações de aminoácido ou que possuam modificações de aminoá- cido incompatíveis. Isto ocorre porque, devido às modificações de ami- noácido na interface dos dois domínios constantes de anticorpo CH3 in- terativos, os monômeros do domínio Fc têm uma maior afinidade entre si do que em relação a outros monômeros do domínio Fc que não pos- suem modificações de aminoácido.

[0077] Como usado neste documento, o termo "módulo de seletivi- dade de dimerização" refere-se a uma sequência do monômero do do- mínio Fc que facilita o pareamento favorizado entre dois monômeros do domínio Fc. Módulos de seletividade de dimerização "complementares" são módulos de seletividade de dimerização que promovem ou favore- cem a interação de dois monômeros do domínio Fc entre si. Módulos de seletividade de dimerização complementares podem ter sequências iguais ou diferentes. Módulos de seletividade de dimerização comple- mentares são descritos neste documento, e podem incluir mutações de complementariedade selecionadas das mutações formadoras de protu- berância e formadoras de cavidade modificada da Tabela 4 ou as mu- tações de direção eletrostáticas da Tabela 5.

[0078] Como usado neste documento, o termo "cavidade modifi- cada" refere-se à substituição de pelo menos um dos resíduos de ami- noácido originais no domínio constante de anticorpo CH3 por um resíduo de aminoácido diferente tendo um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original, criando, assim, uma cavidade tri- dimensional no domínio constante de anticorpo CH3. O termo "resíduo de aminoácido original" refere-se a um resíduo de aminoácido de ocor- rência natural codificado pelo código genético de um domínio constante de anticorpo CH3 do tipo selvagem. Uma cavidade modificada pode ser formada por, por exemplo, qualquer um ou mais das mutações de subs- tituição formadora de cavidade da Tabela 4.

[0079] Como usado neste documento, o termo "protuberância mo- dificada" refere-se à substituição de pelo menos um dos resíduos de aminoácido originais no domínio constante de anticorpo CH3 por um re- síduo de aminoácido diferente tendo um volume de cadeia lateral maior do que o resíduo de aminoácido original, criando, assim, uma protube- rância tridimensional no domínio constante de anticorpo CH3. O termo "resíduos de aminoácido originais" refere-se a resíduos de aminoácido de ocorrência natural codificados pelo código genético de um domínio constante de anticorpo CH3 do tipo selvagem. Uma protuberância modi- ficada pode ser formada por, por exemplo, qualquer um ou mais das mutações de substituição formadora de protuberância da Tabela 4.

[0080] Como usado neste documento, o termo "par de protuberân- cia-na-cavidade" descreve um domínio Fc que inclui dois monômeros do domínio Fc, em que o primeiro monômero do domínio Fc inclui uma cavidade modificada em seu domínio constante de anticorpo CH3, en- quanto o segundo monômero do domínio Fc inclui uma protuberância modificada em seu domínio constante de anticorpo C H3. Em um par de protuberância-em-cavidade, a protuberância modificada no domínio constante de anticorpo CH3 do primeiro monômero do domínio Fc é po- sicionada de modo que interaja com a cavidade modificada do domínio constante de anticorpo CH3 do segundo monômero do domínio Fc sem perturbar significativamente a associação normal do dímero na interface de domínio constante de anticorpo inter-CH3. Um par de protuberância- em-cavidade pode incluir, por exemplo, um par complementar de qual- quer uma ou mais mutações de substituição formadora de cavidade e qualquer uma ou mais mutações de substituição formadora de protube- rância da Tabela 4.

[0081] Como usado neste documento, o termo "domínio Fc hetero- dimérico" refere-se a um domínio Fc que é formado pela heterodimeri- zação de dois monômeros do domínio Fc, em que os dois monômeros do domínio Fc contêm mutações de carga inversa diferentes (ver, por exemplo, mutações na Tabela 5) que promovem a formação favorável desses monômeros do domínio Fc. Em um construto de Fc com três domínios Fc - um domínio Fc "de haste" carboxila terminal e dois domí- nios Fc "ramificado" amino terminal - cada domínio Fc "de ramificação" amino terminal pode ser um domínio Fc heterodimérico (também cha- mado de "domínio Fc heterodimérico de ramificação").

[0082] Como utilizado neste documento, o termo "estruturalmente idêntico", em referência a uma população de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno, refere-se a construtos que são conjuntos das mes- mas sequências polipeptídicas na mesma proporção e configuração e não se refere a qualquer modificação pós-tradução, tal como glicosila- ção.

[0083] Como usado neste documento, o termo "domínio Fc homo- dimérico" refere-se a um domínio Fc que é formado pela homodimeriza- ção de dois monômeros do domínio Fc, em que os dois monômeros do domínio Fc contêm as mesmas mutações de carga inversa (ver, por exemplo, mutações nas Tabelas 5 e 6). Em um construto de Fc com três domínios Fc - um domínio Fc "de haste" carboxila terminal e dois domí- nios Fc "de ramificação" amino terminal - o domínio Fc "de haste" car- boxila terminal pode ser um domínio Fc homodimérico (também cha- mado de “domínio Fc homodimérico de haste”).

[0084] Como usado neste documento, o termo "módulo de seletivi- dade de heterodimerização" refere-se a protuberâncias modificadas, ca- vidades modificadas, e certas substituições de aminoácido de carga in- versa que podem ser feitas nos domínios constantes de anticorpo CH3 dos monômeros do domínio Fc a fim de promover a heterodimerização favorável de dois monômeros do domínio Fc que tenham módulos de seletividade de heterodimerização compatíveis. Os monômeros do do-

mínio Fc contendo módulos de seletividade de heterodimerização po- dem ser combinar para formar um domínio Fc heterodimérico. Exemplos de módulos de seletividade de heterodimerização são mostrados nas Tabelas 4 e 5.

[0085] Como usado neste documento, o termo "módulo de seletivi- dade de homodimerização" refere-se a mutações de carga inversa em um monômero do domínio Fc em pelo menos duas posições dentro do anel de resíduos carregados na interface dentre domínios CH3 que pro- movem a homodimerização do monômero do domínio Fc para formar um domínio Fc. Por exemplo, as mutações de carga inversa que formam um módulo de seletividade de homodimerização podem estar em pelo menos dois aminoácidos das posições 356, 357, 370, 392, 399 e/ou 409 (pela numeração EU), que estão dentro do anel de resíduos carregados na interface entre domínios CH3. Exemplos de módulos de seletividade de homodimerização são mostrados nas Tabelas 4 e 5. Assim, D356 pode ser modificado para K ou R; E357 pode ser modificado para K ou R; K370 pode ser modificado para D ou E; K392 pode ser modificado para D ou E; D399 pode ser modificado para K ou R; e K409 pode ser modificado para D ou E.

[0086] Como usado neste documento, o termo "unido" é usado para descrever a combinação ou a ligação de dois ou mais elementos, com- ponentes, ou domínios proteicos, por exemplo, polipeptídeos, por meios incluindo conjugação química, meios recombinantes e ligações quími- cas, por exemplo, ligações peptídicas, ligações dissulfeto e ligações amida. Por exemplo, dois polipeptídeos únicos podem ser unidos para formar uma estrutura proteica contígua através de conjugação química, uma ligação química, um ligante peptídico, ou quaisquer outros meios de ligação covalente. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno é unido a um monômero do domínio Fc sendo expresso a partir de uma sequência de ácido nucleico contígua que codifica o do- mínio de ligação ao antígeno e o monômero do domínio Fc. Em outras modalidades, um domínio de ligação ao antígeno é ligado a um monô- mero do domínio Fc por meio de um ligante peptídico, em que o terminal N do ligante peptídico é unido ao terminal C do primeiro domínio de li- gação ao antígeno através de uma ligação química, por exemplo, uma ligação peptídica, e o terminal C do ligante peptídico é unido ao terminal N do segundo monômero do domínio Fc através de uma ligação quí- mica, por exemplo, uma ligação peptídica.

[0087] Como usado neste documento, o termo "associado" é usado para descrever a interação, por exemplo, ligação de hidrogênio, intera- ção hidrofóbica, ou interação iônica, entre polipeptídeos (ou sequências dentro de um único polipeptídeo) de modo que os polipeptídeos (ou se- quências dentro de um único polipeptídeo) sejam posicionados para for- mar um construto do domínio de ligação Fc-antígeno descrito neste do- cumento (por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc). Por exemplo, em algumas modalidades, quatro polipeptídeos, por exemplo, dois polipeptídeos incluindo, cada um, dois monômeros do domínio Fc, e dois polipeptídeos incluindo, cada um, um monômero do domínio Fc se associam para formar um construto de Fc que tem três domínios Fc (por exemplo, como descrito na FIGS. 50 e 51). Os quatro polipeptídeos podem se associar através de seus res- pectivos monômeros do domínio Fc. A associação entre polipeptídeos não inclui interações covalentes.

[0088] Como usado neste documento, o termo "ligante" refere-se a uma ligação entre dois elementos, por exemplo, domínios proteicos. Um ligante pode ser uma ligação covalente ou um espaçador. O termo "li- gação" refere-se a uma ligação química, por exemplo, uma ligação amida ou uma ligação dissulfeto, ou qualquer tipo de ligação criada a partir de uma reação química, por exemplo, conjugação química. O termo "espaçador" refere-se a uma fração (por exemplo, um polímero de polietilenoglicol (PEG)) ou uma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de 3-200 aminoácidos, 3-150 aminoácidos ou 3-100 aminoácidos) ocorrendo entre dois polipeptídeos ou domínios po- lipeptídicos para fornecer espaço e/ou flexibilidade entre os dois poli- peptídeos ou domínios polipeptídicos.

Um espaçador de aminoácidos é parte da sequência primária de um polipeptídeo (por exemplo, unido aos polipeptídeos espaçados ou domínios polipeptídicos através da estru- tura principal do polipeptídeo). A formação de ligações dissulfeto, por exemplo, entre duas regiões de dobradiça ou dois monômeros do domí- nio Fc que formam um domínio Fc, não é considerada um ligante.

As- sim, D356 pode ser modificado para K ou R; E357 pode ser modificado para K ou R; K370 pode ser modificado para D ou E; K392 pode ser modificado para D ou E; D399 pode ser modificado para K ou R; e K409 pode ser modificado para D ou E.

Como usado neste documento, o termo "espaçador de glicina" se refere a um ligante contendo apenas glicinas que unem dois monômeros do domínio Fc em série em tandem.

Um espaçador de glicina pode conter pelo menos 4 (SEQ ID NO: 19), 8 (SEQ ID NO: 20) ou 12 (SEQ ID NO: 21) glicinas (por exemplo, 4-30 (SEQ ID NO: 235), 8-30 (SEQ ID NO: 237), 12-30 (SEQ ID NO: 240) glicinas; por exemplo, 12-30 (SEQ ID NO: 240), 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 glicinas (SEQ ID NO: 235)). Em algumas modalidades, um espaça- dor de glicina possui a sequência de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27). Como usado neste documento, o termo "peptídeo de ligação à albumina" refere-se a uma sequência de aminoácidos de 12 a 16 aminoácidos que tem afinidade por e funciona para ligar a albumina sérica.

Um peptídeo de ligação à albumina pode ser de diferentes ori- gens, por exemplo, humana, de camundongo, ou de rato.

Em algumas modalidades da presente invenção, um peptídeo de ligação à albumina é fundido ao terminal C de um monômero do domínio Fc para aumentar a meia-vida sérica do construto do domínio de ligação Fc-antígeno. Um peptídeo de ligação à albumina pode ser fundido, diretamente ou atra- vés de um ligante, ao terminal N ou C de um monômero do domínio Fc.

[0089] Como usado neste documento, o termo "peptídeo de purifi- cação" refere-se a um peptídeo de qualquer comprimento que pode ser usado para purificação, isolamento, ou identificação de um polipeptídeo. Um peptídeo de purificação pode ser unido a um polipeptídeo para au- xiliar na purificação do polipeptídeo e/ou isolamento do polipeptídeo, por exemplo, de uma mistura de lisado celular. Em algumas modalidades, o peptídeo de purificação se liga a outra fração que tenha uma afinidade específica pelo peptídeo de purificação. Em algumas modalidades, es- sas frações que se ligam especificamente ao peptídeo de purificação estão ligadas a um suporte sólido, tal como uma matriz, uma resina, ou esferas de agarose. Exemplos de peptídeo de purificação que podem ser unidos a um construto do domínio de ligação Fc-antígeno são des- critos em mais detalhes neste documento.

[0090] Como usado neste documento, o termo "multímero" refere- se a uma molécula que inclui pelo menos dois construtos de Fc ou cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno associados descritos neste documento.

[0091] Como usado neste documento, o termo "polinucleotídeo" re- fere-se a um oligonucleotídeo, ou nucleotídeo, e fragmentos ou porções dos mesmos, e ao DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, que pode ser de fita simples ou dupla, e representa a fita sense ou anti- sense. Um único polinucleotídeo é traduzido em um único polipeptídeo.

[0092] Como usado neste documento, o termo "polipeptídeo" des- creve um polímero único em que os monômeros são resíduos de ami- noácidos que estão unidos através de ligações amida. Pretende-se que um polipeptídeo abranja qualquer sequência de aminoácidos, seja de ocorrência natural, recombinante ou produzida sinteticamente.

[0093] Como usado neste documento, o termo "posições de amino- ácido" refere-se aos números de posição de aminoácidos em uma pro- teína ou domínio proteico. As posições de aminoácido são numeradas usando o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 5ª ed, 1991) onde indicado (por exemplo, para regiões CDR e FR), de modo contrário é usada a numeração EU.

[0094] A FIG. 37A-37D representa domínios Fc de IgG1 humana numerados usando o sistema de numeração EU.

[0095] Como usado neste documento, o termo "modificação de ami- noácido" refere-se a uma alteração de uma sequência polipeptídica do domínio Fc que, comparada com uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de Fc do tipo selvagem, não mutante ou não modificada), pode ter um efeito sobre as propriedades farmacocinéticas (PK) e/ou farmacodinâmicas (PD), meia-vida sérica, funções efetoras (por exemplo, lise celular (por exemplo, toxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e/ou atividade de citotoxicidade de- pendente do complemento (CDC)), fagocitose (por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e/ou citotoxicidade celular de- pendente do complemento (CDCC)), ativação imunológica, e ativação de células T), afinidade por receptores Fc (por exemplo, receptores Fc- gama (FcγR) (por exemplo, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), e/ou FcγRIIIB (CD16b)), receptores Fc-alfa (FcαR), receptores Fc-épsilon (FcεR), e/ou receptores Fc neonatais (FcRn)), afinidade por proteínas envolvidas na cascata do complemento (por exemplo, C1q), modificações pós-traducionais (por exemplo, glico- silação, sialilação), propriedades de agregação (por exemplo, a capaci- dade de formar dímeros (por exemplo, homo e/ou heterodímeros) e/ou multímeros), e as propriedades biofísicas (por exemplo, altera a intera- ção entre CH1 e CL, altera a estabilidade, e/ou altera a sensibilidade à temperatura e/ou ao pH) de um construto de Fc, e pode promover maior eficácia de tratamento de doenças imunológicas e inflamatórias. Uma modificação de aminoácido inclui substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma modificação de amino- ácido é a modificação de único aminoácido. Em outra modalidade, a modificação de aminoácido é a modificação de múltiplos (por exemplo, mais de um) aminoácidos. A modificação de aminoácidos pode incluir uma combinação de substituições, deleções e/ou inserções de aminoá- cidos. Incluídas na descrição de modificações de aminoácidos, estão alterações genéticas (isto é, DNA e RNA), tais como mutações pontuais (por exemplo, a troca de um único nucleotídeo por outro), inserções e deleções (por exemplo, a adição e/ou remoção de um ou mais nucleotí- deos) da sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo Fc.

[0096] Em certas modalidades, pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) domínio Fc dentro de um construto de Fc ou construto do domínio de ligação Fc-antígeno inclui uma modificação de aminoácido. Em alguns casos, pelo menos um domínio Fc inclui uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou vinte anos ou mais) modificações de aminoácidos.

[0097] Em certas modalidades, pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) monômeros do domínio Fc dentro de um construto de Fc ou construto do domínio de ligação Fc-antígeno inclui uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição). Em alguns casos, o pelo me- nos um monômero do domínio Fc inclui uma ou mais (por exemplo, não mais de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou vinte) modificações de aminoácido (por exemplo, substituições).

[0098] Como usado neste documento, o termo "identidade percen- tual (%)" refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácido (ou ácido nucleico) de uma sequência candidata, por exemplo, a sequência de um monômero do domínio Fc em um construto do domínio de ligação Fc- antígeno descrito neste documento, que são idênticos aos resíduos de aminoácido (ou ácido nucleico) de uma sequência de referência, por exemplo, a sequência de um monômero do domínio Fc do tipo selva- gem, após o alinhamento das sequências e da introdução de gaps, se necessário, para se obter a identidade percentual máxima (isto é, gaps podem ser introduzidas em uma ou em ambas as sequências candidata e de referência para um alinhamento ideal e sequência não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). O alinhamento para fins de determinação da identidade percentual pode ser obtido de diversas formas que estejam dentro da técnica, por exemplo, usando softwares de computador disponíveis publicamente, tais como software BLAST, ALIGN, ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica po- dem determinar os parâmetros apropriados para a medição do alinha- mento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se obter o ali- nhamento máximo sobre o comprimento total das sequências sendo comparadas.

Em algumas modalidades, a identidade de sequência de aminoácidos (ou ácido nucleico) percentual de uma dada sequência candidata para, com ou contra uma dada sequência de referência (que pode ser alternativamente fraseada como uma dada sequência candi- data que tenha ou inclua uma certa identidade de sequência de amino- ácidos (ou ácido nucleico) percentual para, com ou contra uma dada sequência de referência) é calculada como se segue: 100 x (fração de A/B) onde A é o número de resíduos de aminoácido (ou ácido nucleico) mar- cados como idênticos no alinhamento da sequência candidata e da se- quência de referência, e onde B é o número total de resíduos de amino- ácidos (ou ácido nucleico) na sequência de referência.

Em algumas mo- dalidades onde o comprimento da sequência candidata não é igual ao comprimento da sequência de referência, a identidade de sequência percentual de aminoácidos (ou ácido nucleico) da sequência candidata para a sequência de referência não seria igual à identidade de sequên- cia percentual de aminoácidos (ou ácido nucleico) da sequência de re- ferência para a sequência candidata.

[0099] Em algumas modalidades, um monômero do domínio Fc em um construto de Fc descrito neste documento (por exemplo, um cons- truto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc) pode ter uma sequência que seja pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência de um monômero do domínio Fc do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 42). Em algu- mas modalidades, um monômero do domínio Fc em um construto de Fc descrito neste documento (por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc) pode ter uma sequência que seja pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43- 48 e 50-53. Em certas modalidades, um monômero do domínio Fc no construto de Fc pode ter uma sequência que seja pelo menos 95% idên- tica (por exemplo, pelo menos 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequên- cia da SEQ ID NO: 48, 52 e 53.

[00100] Em algumas modalidades, um espaçador entre dois monô- meros do domínio Fc pode ter uma sequência que seja pelo menos 75% idêntica (pelo menos, 75%, 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 99.5%, ou 100% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-36 (por exemplo, SEQ ID NOs: 17, 18, 26, e 27) descritas adicionalmente neste documento.

[00101] Em algumas modalidades, um monômero do domínio Fc na construto de Fc pode ter uma sequência que difira da sequência de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 42-48 e 50-53 por até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos. Em algumas moda- lidades, um monômero do domínio Fc no construto de Fc tem até 10 substituições de aminoácido em relação à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42-48 e 50-53 por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido.

[00102] Como usado neste documento, o termo "célula hospedeira" refere-se a um veículo que inclui os componentes celulares necessários, por exemplo, organelas, necessários para expressar proteínas de seus ácidos nucleicos correspondentes. Os ácidos nucleicos são normal- mente incluídos em vetores de ácido nucleico que podem ser introduzi- dos na célula hospedeira por técnicas convencionais conhecidas na téc- nica (transformação, transfecção, eletroporação, precipitação por fos- fato de cálcio, microinjeção direta, etc.). Uma célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana, ou uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula CHO). Como descrito neste documento, uma célula hospe- deira é usada para expressar um ou mais polipeptídeos que codificam domínios desejados que podem então se combinar para formar um construto do domínio de ligação Fc-antígeno desejado.

[00103] Como usado neste documento, o termo "composição farma- cêutica" refere-se a uma formulação medicinal ou farmacêutica que con- tém um ingrediente ativo bem como um ou mais excipientes e diluentes que permitam que o ingrediente ativo seja adequado para o método de administração. A composição farmacêutica da presente invenção inclui componentes farmaceuticamente aceitáveis que sejam compatíveis com o construto do domínio de ligação Fc-antígeno. A composição far- macêutica está normalmente na forma aquosa para administração intra- venosa ou subcutânea.

[00104] Como usado neste documento, uma "população substanci- almente homogênea" de polipeptídeos ou de um construto de Fc é um no qual pelo menos 50% dos polipeptídeos ou construtos de Fc em uma composição (por exemplo, um meio de cultura celular ou uma composi- ção farmacêutica) tem o mesmo número de domínios Fc, como deter- minado por eletroforese em gel de SDS não redutora ou cromatografia de exclusão por tamanho. Uma população substancialmente homogê- nea de polipeptídeos ou de um construto de Fc pode ser obtida antes da purificação, ou após a purificação da Proteína A ou Proteína G, ou após qualquer cromatografia de afinidade específica para Fab ou Fc apenas. Em várias modalidades, pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% dos polipeptídeos ou construtos de Fc na composi- ção têm o mesmo número de domínios Fc. Em outras modalidades, até 85%, 90%, 92%, ou 95% dos polipeptídeos ou construtos de Fc na com- posição têm o mesmo número de domínios Fc.

[00105] Como usado neste documento, o termo "carreador farma- ceuticamente aceitável" refere-se a um excipiente ou diluente em uma composição farmacêutica. O carreador farmaceuticamente aceitável deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao recebedor. Na presente invenção, o carreador farmaceu- ticamente aceitável deve fornecer estabilidade farmacêutica adequada ao construto do domínio de ligação Fc-antígeno. A natureza do carrea- dor difere com o modo de administração. Por exemplo, para administra- ção oral, um carreador sólido é preferencial; para administração intrave- nosa, um carreador de solução aquosa (por exemplo, WFI e/ou uma solução tamponada) é geralmente usado.

[00106] Como usado neste documento, "quantidade terapeutica- mente eficaz" refere-se a uma quantidade, por exemplo, dose farmacêu- tica, eficaz na indução de um efeito biológico desejado em um sujeito ou paciente ou no tratamento de um paciente com uma condição ou distúrbio descrito neste documento. Também é entendido neste docu-

mento que uma "quantidade terapeuticamente eficaz" pode ser interpre- tada como uma quantidade que proporciona um efeito terapêutico de- sejado, tanto tomada em uma dose quanto em qualquer dosagem ou via, tomada sozinha ou em combinação com outros agentes terapêuti- cos.

[00107] Como usado neste documento, o termo fragmento e o termo porção podem ser usados indistintamente. Breve Descrição das Figuras

[00108] A FIG. 1 é um esquema que mostra que um construto em tandem com os dois domínios Fc (formados pela união das cadeias po- lipeptídicas idênticas) e algumas das espécies resultantes geradas por associação fora do registro das sequências de Fc em tandem. Os domí- nios variáveis da porção de Fab (VH + VL) são representados como os paralelogramos, os domínios constantes da porção de Fab (CH1 + CL) são descritos como retângulos, os domínios da porção de Fc (CH2 e CH3) são descritos como ovais, e os dissulfetos da dobradiça são mos- trados como pares de linhas paralelas.

[00109] A FIG. 2 é um esquema que mostra que um construto em tandem com os três domínios Fc conectados por ligantes peptídicos (for- mados pela união das cadeias polipeptídicas idênticas) e algumas das espécies resultantes geradas por associação fora do registro das se- quências de Fc em tandem. Os domínios variáveis da porção de Fab (VH + VL) são representados como os paralelogramos, os domínios constantes da porção de Fab (CH1 + CL) são descritos como retângu- los, os domínios da porção de Fc (CH2 e CH3) são descritos como ovais, e os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares de li- nhas paralelas.

[00110] As FIGs. 3A e 3B são esquemas de construtos de Fc com dois domínios Fc (FIG. 3A) ou três domínios Fc (FIG. 3B) conectado por ligante e montado usando domínios de heterodimerização ortogonais.

Cada uma das cadeias polipeptídicas únicas é protegida diferente- mente. Os domínios variáveis da porção de Fab (VH + VL) são repre- sentados como os paralelogramos, os domínios constantes da porção de Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos, os domínios da porção de Fc (CH2 e CH3) são representados como ovais, os ligantes são mostrados como linhas tracejadas, e os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares de linhas paralelas. CH3 ovais são mostra- das com protuberâncias para representar "knobs" e cavidades para des- crever "holes" para pares de "knob-into-holes". Sinais de mais e/ou me- nos são usados para representar mutações de direção eletrostáticas no domínio CH3.

[00111] As FIGs. 4A-J são esquemas de tipos diferentes de domínios de ligação ao antígeno relacionados a Fab ligados à mesma estrutura do construto de Fc com três domínios Fc. Cada uma das cadeias poli- peptídicas únicas é sombreada ou hachurada diferentemente. Os domí- nios variáveis da porção Fab (VH + VL) são representados como os pa- ralelogramos para especificidade A e os paralelogramos com um lado curvo para especificidade B. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos, os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como ovais, os ligantes são mostra- dos como linhas tracejadas, e os dissulfetos da dobradiça são mostra- dos como pares de linhas paralelas. CH3 ovais são mostradas com pro- tuberâncias para representar "knobs" e cavidades para descrever "ho- les" para pares de "knob-into-holes". Sinais de mais e/ou menos são usados para representar mutações de direção eletrostáticas no domínio CH3. No painel G, as letras H e L são usadas para denotar as sequên- cias de domínio constante de cadeia leve e pesada, respectivamente.

[00112] A FIG. 5 represento esquemas de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno biespecíficos que usam um tipo único de elemento de heterodimerização de Fc por construto. Cada cadeia polipeptídica única é sombreada ou hachurada diferentemente. Os domínios variá- veis da porção Fab (VH + VL) com uma primeira especificidade alvo são representados como paralelogramos e são indicados com o número 1 e os domínios variáveis Fab com uma segunda especificidade alvo são representados como paralelogramos com um lado curvo e são indica- dos com o número 2. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o pareamento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I ou O para mutações com heterodimeriza- ção O-O.

[00113] A FIG. 6 represento esquemas dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno com domínios Fc em tandem que usam dois ele- mentos de heterodimerização de Fc ortogonais. Cada cadeia polipeptí- dica única é sombreada ou hachurada diferentemente. Os domínios va- riáveis da porção Fab (VH + VL) com uma primeira especificidade alvo são representados como paralelogramos e são indicados com o número 1 e os domínios variáveis Fab com uma segunda especificidade alvo são representados como paralelogramos com um lado curvo e são indi- cados com o número 2. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o pareamento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I ou O para mutações com pareamento de heterodimerização.

[00114] A FIG. 7 represento esquemas dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno com domínios Fc ramificados que usam dois ele- mentos de heterodimerização de Fc ortogonais. Cada cadeia polipeptí- dica única é sombreada ou hachurada diferentemente. Os domínios va- riáveis da porção Fab (VH + VL) com uma primeira especificidade alvo são representados como paralelogramos e são indicados com o número 1 e os domínios variáveis Fab com uma segunda especificidade alvo são representados como paralelogramos com um lado curvo e são indi- cados com o número 2. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o pareamento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com pareamento de heterodimerização J-K ou H-I ou O para mutações com heterodimerização O-O.

[00115] A FIG. 8 represento esquemas de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno em que os domínios de ligação ao antígeno usam três cadeias leves distintas ou uma cadeia leve comum. Cada cadeia polipeptídica única é sombreada ou hachurada diferentemente. Nos ca- sos em que três cadeias leves distintas são usadas, os domínios variá- veis da porção Fab (VH + VL) com uma primeira especificidade alvo são representados como paralelogramos e são indicados com o número 1; os domínios variáveis Fab com uma segunda especificidade alvo são representados como paralelogramos com um tipo de lado curvo e são indicados com o número 2; e os domínios variáveis Fab com uma ter- ceira especificidade alvo são representados como paralelogramos com outro tipo de lado curvo e são indicados com o número 3. Nos casos em que uma cadeia leve comum é usada, os domínios VH dos Fabs com especificidades diferentes são indicados com 1, 2 ou 3 respectivamente e o domínio VL é marcado com um asterisco. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os do- mínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que co- nectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C, D, E ou F para mutações com o pa- reamento A-B, C-D ou E-F. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I.

[00116] A FIG. 9 represento esquemas de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno ramificados triespecíficos com três domínios Fc dis- tribuídos simetricamente e domínios de ligação ao antígeno que são montados por um arranjo assimétrico de cadeias polipeptídicas usando domínios de heterodimerização ortogonais. Os construtos usam duas cadeias leves únicas (indicadas com 1 ou um asterisco). Os domínios VH dos Fabs com especificidades diferentes são indicados com 1, 2 ou 3, respectivamente, e são representados como paralelogramos com la- dos retos ou paralelogramos com lado curvo. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os do- mínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que co- nectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o parea- mento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I.

[00117] A FIG. 10 represento esquemas de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno ramificados triespecíficos com cinco domínios Fc distribuídos simetricamente e domínios de ligação ao antígeno que são montados por um arranjo assimétrico de cadeias polipeptídicas usando domínios de heterodimerização ortogonais. Os construtos usam duas cadeias leves únicas (indicadas com 1 ou um asterisco). Os domínios VH dos Fabs com especificidades diferentes são indicados com 1, 2 ou 3, respectivamente, e são representados como paralelogramos com la- dos retos ou paralelogramos com lado curvo. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os do- mínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que co- nectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o parea- mento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I.

[00118] A FIG. 11A represento esquemas dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno triespecíficos baseados em estruturas principais de Fc ramificadas simétricas usando duas cadeias leves únicas e cinco domínios Fc. Cada cadeia polipeptídica única é sombreada ou hachu- rada diferentemente. Os domínios VH dos Fabs com especificidades di- ferentes são indicados com 1, 2 ou 3, respectivamente, e são represen- tados como paralelogramos com lados retos ou paralelogramos com lado curvo. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são re- presentados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o pareamento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I e são designados com O para mutações com heterodimeri- zação O-O.

[00119] A FIG. 11B represento esquemas dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno triespecíficos baseados em estruturas principais de Fc ramificadas simétricas usando duas cadeias leves únicas e cinco domínios Fc. Cada cadeia polipeptídica única é sombreada ou hachu- rada diferentemente. Os domínios VH dos Fabs com especificidades di- ferentes são indicados com 1, 2 ou 3, respectivamente, e são represen- tados como paralelogramos com lados retos ou paralelogramos com lado curvo. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são re- presentados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o pareamento A-B ou C-D. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para mutações com heterodimerização J-K ou H-I e são designados com O para mutações com heterodimeri- zação O-O.

[00120] A FIG. 12 represento esquemas dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno triespecíficos baseados em estruturas principais de Fc ramificadas assimétricas usando duas cadeias leves únicas e quatro a cinco domínios Fc. Cada cadeia polipeptídica única é sombre- ada ou hachurada diferentemente. Os domínios VH dos Fabs com es- pecificidades diferentes são indicados com 1, 2 ou 3, respectivamente, e são representados como paralelogramos com lados retos ou parale- logramos com lado curvo. Os domínios constantes da porção Fab (CH1

+ CL) são representados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C, D, E ou F para mutações com o pareamento A-B, C-D ou E-F. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para muta- ções com heterodimerização J-K ou H-I.

[00121] A FIG. 13 represento esquemas dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno triespecíficos baseados em estruturas principais de Fc ramificadas assimétricas usando duas cadeias leves únicas e quatro a cinco domínios Fc. Cada cadeia polipeptídica única é sombre- ada ou hachurada diferentemente. Os domínios VH dos Fabs com es- pecificidades diferentes são indicados com 1, 2 ou 3, respectivamente, e são representados como paralelogramos com lados retos ou parale- logramos com lado curvo. Os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos. Os domínios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados como formas ovais. Os ligantes são mostrados com linhas pontilhadas. Os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares das linhas paralelas que conectam as cadeias polipeptídicas. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C, D, E ou F para mutações com o pareamento A-B, C-D ou E-F. Os domínios Fc CH3 são designados com J, K, H ou I para muta- ções com heterodimerização J-K ou H-I.

[00122] A FIG. 14A representa um esquema de um construto do do- mínio de ligação Fc-antígeno biespecífico com três domínios Fc em tan- dem e dois Fabs com especificidades alvo diferentes que usam uma cadeia leve comum. O construto Fc biespecífico foi usado para demons- trar a expressão de construtos de Fc biespecíficos. Os domínios variá- veis da porção Fab (VH + VL) com uma primeira especificidade alvo são representados como paralelogramos e o domínio variável (VH) com uma segunda especificidade alvo é representado como um paralelogramo com um lado curvo. Os domínios constantes da porção de Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos, os domínios da porção Fab (CH2 e CH3) são representados como formas ovais, os ligantes são mostrados como linhas tracejadas e os dissulfetos da dobradiça são mostrados como pares de linhas paralelas. CH3 ovais são mostradas com protuberâncias para representar "knobs" e cavidades para descre- ver "holes" para pares de "knob-into-holes". Os sinais de mais e menos indicam as cargas alteradas das mutações de orientação eletrostática.

[00123] A FIG. 14B mostra os resultados de uma análise de SDS- PAGE de células transfectadas com genes que codificam os polipeptí- deos que se agrupam para formar o construto de Fc da FIG. 14A. A presença de uma banda de 250 kDa nas faixas 1 e 2 demonstra a for- mação do construto de Fc pretendido. A ausência de uma banda de 250 kDa nas faixas 3 e 4, onde as células foram transfectadas apenas com genes para a cadeia leve e a cadeia polipeptídica contendo três sequên- cias de Fc em tandem, demonstra que as cadeias polipeptídicas con- tendo três sequências de Fc em tandem não forma homodímeros.

[00124] A FIG. 15A representa um esquema de um anticorpo biespe- cífico com duas sequências de Fab diferentes ligadas a um domínio Fc único. Os domínios variáveis da porção Fab (VH + VL) com uma pri- meira especificidade alvo são representados como paralelogramos e o domínio variável (VH) com uma segunda especificidade é representado como um paralelogramo com um lado curvo, os domínios constantes da porção Fab (CH1 + CL) são representados como retângulos, os domí- nios da porção Fc (CH2 e CH3) são representados na forma oval, os ligantes são mostrados como linhas tracejadas e os dissulfetos da do- bradiça são mostrados como pares de linhas paralelas. CH3 ovais são mostradas com protuberâncias para representar "knobs" e cavidades para descrever "holes" para pares de "knob-into-holes". Os sinais de mais e menos indicam as cargas alteradas das mutações de orientação eletrostática. Os domínios constantes Fab (CL e CH) são designados com A, B, C ou D para mutações com o pareamento A-B ou C-D.

[00125] A FIG. 15B mostra os resultados de uma análise de SDS- PAGE de células transfectadas com genes que codificam os polipeptí- deos que se agrupam ao anticorpo biespecífico da FIG. 15A. Os con- juntos diferentes de mutações presentes nas cadeias pesadas e leves dos domínios Fab do anticorpo para facilitar a montagem dos respecti- vos domínios Fab são mostrados na Tabela 3 e os resultados de SDS- PAGE para esses anticorpos são mostrados nas faixas 1-7. A faixa 8 contém um construto com domínios Fc com 3 domínios Fc e nenhum domínio de ligação ao antígeno. A presença da banda de 150 kDa de- monstra a formação do construto pretendido. A FIG. 15C mostra os re- sultados da análise de LC-MS para construto purificado da faixa 1 da FIG. 15B.

[00126] A FIG. 15D mostra os resultados da análise de LC-MS para construto purificado da faixa 2 da FIG. 15B.

[00127] A FIG. 15E mostra os resultados da análise para construto purificado da faixa 3 da FIG. 15B.

[00128] A FIG. 15F mostra os resultados da análise de LC-MS para construto purificado da faixa 4 da FIG. 15B.

[00129] A FIG. 16 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 22) contendo dois domínios Fc e três do- mínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por três monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos. O primeiro polipeptídeo (2202) contém um monômero do do- mínio Fc contendo protuberância (2208) ligado por um espaçador em uma série em tandem a outro monômero do domínio Fc contendo pro-

tuberância (2206) e um domínio de ligação ao antígeno com uma pri- meira especificidade contendo um domínio VH (2222) no terminal N. O segundo e o terceiro polipeptídeos (2226 e 2224) contêm, cada um, um monômero do domínio Fc contendo cavidade (2210 e 2216) unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (2214 e 2220) no ter- minal N. Um domínio contendo VL (2204, 2212 e 2218) é ligado a cada domínio VH.

[00130] A FIG. 17 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 23) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (2302) contém três monômeros do domínio Fc contendo protuberância (2310, 2308 e 2306) ligado por espaçadores em uma série em tandem a outro domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (2330) no terminal N. O segundo, terceiro e quarto polipeptídeos (2336, 2334 e 2332) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (2312, 2318 e 2324) unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um do- mínio VH (2316, 2322 e 2328) no terminal N. Um domínio contendo VL (2304, 2314, 2320 e 2326) é ligado a cada domínio VH.

[00131] A FIG. 18 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 24) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (2402 e 2436) contêm um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (2410 e 2412) ligado por um espaça- dor em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo protuberância (2426 e 2424) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (2430 e 2420) no terminal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (2404 e 2434) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (2408 e 2414) unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (2432 e 2418). Um domínio contendo VL (2406, 2416, 2422 e 2428) é ligado a cada domínio VH.

[00132] A FIG. 19 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 25) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (2502 e 2536) contêm um monômero do domínio Fc contendo protuberância (2516 e 2518) ligado por um es- paçador em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc con- tendo aminoácidos com cargas diferentes na interface C H3-CH3 do que a sequência WT (2508 e 2526) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (2532 e 2530) no terminal N. O segundo e o terceiro polipeptídeos (2504 e 2534) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (2514 e 2520) unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (2510 e 2524) no terminal N. Um domínio contendo VL (2506, 2512, 2522 e 2528) é ligado a cada domínio VH.

[00133] A FIG. 20 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 26) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (2602 e 2656) contêm um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface

CH3-CH3 do que a sequência WT (2618 e 2620) ligado por espaçadores em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo pro- tuberância (2642 e 2640), um segundo monômero do domínio Fc con- tendo protuberância (2644 e 2638) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (2648 e 2634) no terminal N. O terceiro, quarto, quinto e sexto polipeptídeos (2606, 2604, 2654 e 2652) contêm um monômero do domínio Fc con- tendo cavidade (2616, 2610, 2622 e 2628) unido em uma série em tan- dem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifi- cidade contendo um domínio VH (2612, 2650, 2626 e 2632) no terminal N. Um domínio contendo VL (2608, 2614, 2624, 2630, 2636 e 2646) é ligado a cada domínio VH.

[00134] A FIG. 21 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 27) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (2702 e 2756) contêm um monômero do domínio Fc contendo protuberância (2720 e 2722) ligado por espa- çadores em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc con- tendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 em re- lação à sequência WT (2712 e 2730), um monômero do domínio Fc con- tendo protuberância (2744 e 2742) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (2748 e 2738) no terminal N. O terceiro, quarto, quinto e sexto polipeptídeos (2706, 2704, 2754 e 2752) contêm um monômero do domínio Fc con- tendo cavidade (2718, 2724, 2710 e 2732) unido em uma série em tan- dem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifi- cidade contendo um domínio VH (2714, 2728, 2750 e 2736) no terminal N. Um domínio contendo VL (2708, 2716, 2726, 2743, 2740 e 2746) é ligado a cada domínio VH.

[00135] A FIG. 22 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 28) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (2802 e 2856) contêm um monômero do domínio Fc contendo protuberância (2824 e 2830) ligado por espa- çadores em uma série em tandem a um segundo monômero do domínio Fc contendo protuberância (2826 e 2828), um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (2810 e 2844) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (2850 e 2848) no terminal N. O terceiro, quarto, quinto e sexto polipeptídeos (2806, 2804, 2854 e 2852) contêm um monômero do domínio Fc con- tendo cavidade (2822, 2816, 2832 e 2838) unido em uma série em tan- dem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifi- cidade contendo um domínio VH (2818, 2812, 2836 e 2842) no terminal N. Um domínio contendo VL (2808, 2814, 2820, 2834, 2840 e 2846) é ligado a cada domínio VH.

[00136] A FIG. 23 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 29) contendo dois domínios Fc e dois domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por três monômeros do domínio Fc contendo po- lipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (2902) contém dois monômeros do domínio Fc contendo protuberância (2908 e 2906), cada um com um conjunto diferente de mutações de heterodimerização, ligado por um es- paçador em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo domínio VH (2918). O se- gundo polipeptídeo (2920) contém um monômero do domínio Fc con- tendo cavidade (2910) com um primeiro conjunto de mutações de hete- rodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (2914) no terminal N. O terceiro polipeptídeo (2916) contém um monô- mero do domínio Fc contendo cavidade com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização. Um domínio contendo VL (2904 e 2912) é ligado a cada domínio VH.

[00137] A FIG. 24 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 30) contendo dois domínios Fc e três do- mínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por três monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos. O primeiro polipeptídeo (3002) contém dois monômeros do domínio Fc contendo protuberância (3008 e 3006), cada um com um conjunto diferente de mutações de heterodimerização, ligado por um es- paçador em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo domínio VH (3022) no termi- nal N. O segundo polipeptídeo (3024) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3010) com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um do- mínio VH (3014) no terminal N. O terceiro polipeptídeo (3026) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3016) com um pri- meiro segundo de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira es- pecificidade contendo um domínio VH (3020) no terminal N. Um domínio contendo VL (3004, 3012 e 3018) é ligado a cada domínio VH.

[00138] A FIG. 25 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 31) contendo dois domínios Fc e três do- mínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por três monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos. O primeiro polipeptídeo (3102) contém dois monômeros do domínio Fc contendo protuberância (3108 e 3106), cada um com um conjunto diferente de mutações de heterodimerização, ligado por um es- paçador em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo domínio VH (3122) no termi- nal N. O segundo polipeptídeo (3126) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3110) com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um do- mínio VH (3114) no terminal N. O terceiro polipeptídeo (3124) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3116) com um se- gundo conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira es- pecificidade contendo um domínio VH (3120) no terminal N. Um domínio contendo VL (3104, 3112 e 3118) é ligado a cada domínio VH.

[00139] A FIG. 26 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 32) contendo três domínios Fc e três do- mínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo po- lipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (3202) contém três monômeros do domínio Fc contendo protuberância (3210, 3208 e 3206), o terceiro com um conjunto diferente de mutações de heterodimerização em relação aos primeiros dois, ligado por espaçadores em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo domínio VH (3226) no terminal N. O segundo e terceiro poli- peptídeos (3230 e 3228) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3212 e 3218) com um primeiro conjunto de mutações de he- terodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de liga- ção ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (3216 e 3222) no terminal N. O quarto polipeptídeo (3224) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade com um segundo con- junto de mutações de heterodimerização. Um domínio contendo VL

(3204, 3214 e 3220) é ligado a cada domínio VH.

[00140] A FIG. 27 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 33) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (3302) contém três monômeros do domínio Fc contendo protuberância (3310, 3308 e 3306), o terceiro com um conjunto diferente de mutações de heterodimerização em rela- ção aos primeiros dois, ligado por espaçadores em uma série em tan- dem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especifici- dade contendo domínio VH (3330) no terminal N. O segundo e terceiro polipeptídeos (3336 e 3334) contêm um monômero do domínio Fc con- tendo cavidade (3312 e 3318) com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um do- mínio VH (3316 e 3322) no terminal N. O quarto polipeptídeo (3322) con- tém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3324) com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma sé- rie em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (3328) no terminal N. Um domí- nio contendo VL (3304, 3314, 3320 e 3326) é ligado a cada domínio VH.

[00141] A FIG. 28 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 34) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo po- lipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (3402) contém três monômeros do domínio Fc contendo protuberância (3410, 3408 e 3406), o terceiro com um conjunto diferente de mutações de heterodimerização em relação aos primeiros dois, ligado por espaçadores em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo domínio VH (3430) no terminal N. O segundo e terceiro poli- peptídeos (3436 e 3434) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3412 e 3418) com um primeiro conjunto de mutações de he- terodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de liga- ção ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (3416 e 3422) no terminal N. O quarto polipeptídeo (3432) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3424) com um se- gundo conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira es- pecificidade contendo um domínio VH (3428) no terminal N. Um domínio contendo VL (3404, 3414, 3420 e 3426) é ligado a cada domínio VH.

[00142] A FIG. 29 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 35) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo po- lipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (3502) contém um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (3510) ligado por um espaçador em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo protu- berância (3526) com um primeiro conjunto de mutações de heterodime- rização e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especi- ficidade contendo um domínio VH (3530) no terminal N. O segundo poli- peptídeo (3536) contém um monômero do domínio Fc contendo amino- ácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (3512) ligado por um espaçador em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo protuberância (3524) com um se- gundo conjunto de mutações de heterodimerização e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um do- mínio VH (3520) no terminal N. O terceiro polipeptídeo (3504) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3508) com um pri- meiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (3532) no terminal N. O quarto polipeptídeo (3534) contém um monômero do domínio Fc contendo ca- vidade (3514) com um segundo conjunto de mutações de heterodimeri- zação unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao an- tígeno com uma terceira especificidade contendo um domínio VH (3518) no terminal N. Um domínio contendo VL (3506, 3516, 3522 e 3528) é ligado a cada domínio VH.

[00143] A FIG. 30 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 36) contendo cinco domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (3602 e 3644) contêm um monômero do domínio Fc contendo protuberância (3614 e 3616), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, ligados por espaçadores em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo ami- noácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequên- cia WT (3610 e 3620), outro monômero do domínio Fc contendo protu- berância (3634 e 3632), com um segundo conjunto de mutações de he- terodimerização e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (3638 e 3628) no terminal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (3612 e 3618) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização. O quinto e sexto polipeptídeos (3604 e 3642) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3608 e 3622) com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (3640 e 3626) no ter- minal N. Um domínio contendo VL (3606, 3624, 3630 e 3636) é ligado a cada domínio VH.

[00144] A FIG. 31 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 37) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos. Dois polipeptídeos (3702 e 3756) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3720 e 3722), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, ligados por espaçadores em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (3712 e 3730), outro monômero do domínio Fc contendo protuberância (3744 e 3742), com um segundo conjunto de mutações de heterodime- rização e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especi- ficidade contendo um domínio VH (3748 e 3738) no terminal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (3706 e 3754) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3718 e 3724) com um primeiro conjunto de mu- tações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um do- mínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade con- tendo um domínio VH (3714 e 3728) no terminal N. O quinto e sexto polipeptídeos (3704 e 3752) contêm um monômero do domínio Fc con- tendo cavidade (3710 e 3732) com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização unidos em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade contendo um domínio VH (3750 e 3736) no terminal N. Um domínio contendo VL (3708, 3716, 3726, 3234, 3740 e 3746) é ligado a cada domínio VH.

[00145] A FIG. 32 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 38) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo po- lipeptídeos. O primeiro polipeptídeo (3802) contém um monômero do domínio Fc contendo protuberância (3816), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, ligado por um espaçador em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (3808) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especi- ficidade contendo um domínio VH (3832) no terminal N. O segundo poli- peptídeo (3836) contém um monômero do domínio Fc contendo protu- berância (3818), com um segundo conjunto de mutações de heterodi- merização, ligado por um espaçador em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (3826) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um do- mínio VH (3830) no terminal N. O terceiro polipeptídeo (3804) contém um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3814) com um pri- meiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (3810) no terminal N. O quarto polipeptídeo (3834) contém um monômero do domínio Fc contendo ca- vidade (3820) com um segundo conjunto de mutações de heterodimeri- zação unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao an- tígeno com uma terceira especificidade contendo um domínio VH (3824) no terminal N. Um domínio contendo VL (3806, 3812, 3822 e 3828) é ligado a cada domínio VH.

[00146] A FIG. 33 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 39) contendo cinco domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (3902 e 3944) contêm um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (3912 e 3914), ligados por espaçado- res em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo protuberância (3932 e 3930), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, um segundo monômero do domínio Fc contendo protuberância (3934 e 3928), com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização, e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (3938 e 3924) no ter- minal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (3910 e 3916) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização. O quinto e sexto polipeptídeos (3904 e 3942) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (3908 e 3918) com um segundo conjunto de mutações de heterodimeri- zação unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao an- tígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (3940 e 3922) no terminal N. Um domínio contendo VL (3906, 3920, 3926 e 3936) é ligado a cada domínio VH.

[00147] A FIG. 34 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 40) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos. Dois polipeptídeos (4002 e 4056) contêm um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (4018 e 4020), ligados por espaçado- res em uma série em tandem a um monômero do domínio Fc contendo protuberância (4042 e 4040), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, um segundo monômero do domínio Fc contendo protuberância (4044 e 4038), com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização, e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (4048 e 4034) no ter- minal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (4006 e 4054) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (4016 e 4022) com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma sé- rie em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (4012 e 4026) no terminal N. O quinto e sexto polipeptídeos (4004 e 4052) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (4010 e 4028) com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização unidos em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade contendo um domínio VH (4050 e 4032) no terminal N. Um domínio con- tendo VL (4008, 4014, 4024, 4030, 4036 e 4046) é ligado a cada domínio VH.

[00148] A FIG. 35 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 41) contendo cinco domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos. Dois polipeptídeos (4102 e 4144) do protuberância (4118 e 4124), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, ligados por espaçadores em uma série em tandem a um segundo mo- nômero do domínio Fc contendo protuberância (4120 e 4122), com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização, e um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (4108 e 4134) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (4140 e 4138) no terminal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (4104 e 4142) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (4116 e 4126) com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (4112 e

4130) no terminal N. O quinto e sexto polipeptídeos (4110 e 4132) con- têm um monômero do domínio Fc contendo cavidade com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização. Um domínio contendo VL (4106, 4114, 4128 e 4136) é ligado a cada domínio VH.

[00149] A FIG. 36 é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 42) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos. Dois polipeptídeos (4202 e 4256) do protuberância (4224 e 4230), com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização, ligados por espaçadores em uma série em tandem a um segundo mo- nômero do domínio Fc contendo protuberância (4226 e 4228), com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização, e um monômero do domínio Fc contendo aminoácidos com cargas diferentes na interface CH3-CH3 do que a sequência WT (4210 e 4244) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade contendo um domínio VH (4250 e 4248) no terminal N. O terceiro e quarto polipeptídeos (4206 e 4254) contêm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (4222 e 4232) com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização unido em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade contendo um domínio VH (4218 e 4236) no terminal N. O quinto e sexto polipeptídeos (4204 e 4252) con- têm um monômero do domínio Fc contendo cavidade (4216 e 4238) com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização unidos em uma série em tandem a um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade contendo um domínio VH (4212 e 4242) no ter- minal N. Um domínio contendo VL (4208, 4214, 4220, 4234, 4240 e 4246) é ligado a cada domínio VH.

[00150] A FIG. 37A representa a sequência de aminoácido de um

IgG1 humano (SEQ ID NO: 43) com numeração EU. A região da dobra- diça é indicada por um sublinhado duplo, o domínio CH2 não é subli- nhado e a região CH3 é sublinhada.

[00151] A FIG. 37B representa a sequência de aminoácido de um IgG1 humano (SEQ ID NO: 45) com numeração EU. A região da dobra- diça, que não possui E216-C220, com estes inclusos, é indicada por um sublinhado duplo, o domínio CH2 não é sublinhado e a região CH3 é sublinhada e não possui K447.

[00152] A FIG. 37C representa a sequência de aminoácido de um IgG1 humano (SEQ ID NO: 47) com numeração EU. A região da dobra- diça é indicada por um sublinhado duplo, o domínio CH2 não é subli- nhado e a região CH3 é sublinhada e não possui 447K.

[00153] A FIG. 37D representa a sequência de aminoácido de um IgG1 humano (SEQ ID NO: 42) com numeração EU. A região da dobra- diça, que não possui E216-C220, com estes inclusos, é indicada por um sublinhado duplo, o domínio CH2 não é sublinhado e a região CH3 é sublinhada.

[00154] A FIG. 38A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 29) contendo dois domínios Fc e dois domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por três monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos.

[00155] A FIG. 38B é uma sequência de aminoácidos exemplar ISED IDO NOS: 316-317, 48, 61 e 315, respectivamente, na ordem em que aparecem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (cons- truto alternativo 29).

[00156] A FIG. 39A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 30) contendo dois domínios Fc e três domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por três monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos.

[00157] A FIG. 39B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 316-318, 61 e 315, respectivamente, na ordem em que apare- cem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 30).

[00158] A FIG. 40A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 31) contendo dois domínios Fc e três domínios de ligação ao antígeno com três especificidades di- ferentes.

[00159] A FIG. 40B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 316-317, 319, 61 e 315, respectivamente, na ordem em que aparecem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (cons- truto alternativo 30).

[00160] A FIG. 41A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 32) contendo três domínios Fc e três domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos.

[00161] A FIG. 41B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 320, 317, 48, 61 e 315, respectivamente, na ordem em que aparecem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (cons- truto alternativo 31).

[00162] A FIG. 42A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 33) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com duas especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos.

[00163] A FIG. 42B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 320, 317-318, 61 e 315, respectivamente, na ordem em que aparecem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (cons- truto alternativo 33).

[00164] A FIG. 43A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 34) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por quatro monômeros do domínio Fc contendo polipeptídeos.

[00165] A FIG. 43B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 320, 317, 61, 319 e 314, respectivamente, na ordem em que aparecem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (cons- truto alternativo 34).

[00166] A FIG. 44A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto alternativo 35) contendo três domínios Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes.

[00167] A FIG. 44B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 321, 61, 322 e 317-318, respectivamente, na ordem em que aparecem) para o construto do domínio de ligação Fc-antígeno (cons- truto alternativo 35).

[00168] A FIG. 45A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 37) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos.

[00169] A FIG. 45B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 323, 61 e 317-318, respectivamente, na ordem em que apare- cem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 37).

[00170] A FIG. 46A é uma ilustração de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 40) contendo cinco domínios Fc e seis domínios de ligação ao antígeno com três especificidades diferentes. O construto é formado por seis monômeros do domínio Fc contendo poli- peptídeos.

[00171] A FIG. 46B é uma sequência de aminoácidos exemplar (SEQ ID NOS: 323, 61 e 317-318, respectivamente, na ordem em que apare- cem) para um construto do domínio de ligação Fc-antígeno (construto 37). Descrição Detalhada

[00172] Muitos anticorpos terapêuticos funcionam recrutando ele- mentos do sistema imune inato por meio da função efetora dos domínios Fc, como citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Em alguns casos, a presente invenção contem- pla a combinação de pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno de um domínio Fc único contendo agentes terapêuticos, por exemplo, anticorpos terapêuticos conhecidos, com pelo menos dois domínios Fc para gerar um agente terapêutico novo com atividade biológica única. Em alguns casos, um agente terapêutico novo descrito neste docu- mento tem uma atividade biológica maior do que a do domínio Fc único contendo agentes terapêuticos, por exemplo, anticorpos terapêuticos conhecidos. A presença de pelo menos dois domínios Fc pode potenci- alizar as funções efetoras e ativar múltiplas funções efetoras, como ADCC em combinação com ADCP e/ou CDC, aumentando assim a efi- cácia das moléculas terapêuticas.

[00173] Os métodos e composições descritos neste documento per- mitem a construção de proteínas de ligação ao antígeno com múltiplos domínios Fc, introduzindo múltiplas tecnologias de heterodimerização ortogonais (por exemplo, dois conjuntos diferentes de mutações seleci- onadas das Tabelas 4 e 5) e/ou tecnologias de homodimerização (por exemplo, mutações selecionadas das Tabelas 6 e 7) nos polipeptídeos que se unem para formar a mesma proteína. Os princípios do desenho descritos neste documento, que introduzem múltiplas mutações de he- terodimerização e/ou mutações de homodimerização nos polipeptídeos que se agrupam na mesma proteína, permitem a criação de uma grande diversidade de configurações proteicas, incluindo, por exemplo, proteí- nas semelhantes a anticorpos com domínios Fc em tandem, proteínas simetricamente ramificadas, proteínas assimetricamente ramificadas e proteínas que direcionam antígeno multiespecífico. Os princípios de de- sign descritos neste documento permitem a criação controlada de con- figurações complexas de proteínas, desfavorecendo a formação de es- truturas indesejadas de ordem superior ou de complexos não controla- dos.

[00174] Os construtos do domínio de ligação ao Fc-antígeno ortogo- nais descritos neste documento podem conter pelo menos dois domí- nios Fc que são unidos por um ligante, em que pelo menos dois dos domínios Fc diferem um do outro, por exemplo, pelo menos um domínio Fc do construto é unido a um domínio de ligação ao antígeno (por exem- plo, um domínio CH1 do domínio VH) e pelo menos um domínio Fc do construto não é unido a um domínio de ligação ao antígeno ou dois do- mínios Fc do construto são unidos a domínios de ligação ao antígeno diferentes. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno ortogonais são produzidos pela expressão de uma cadeia peptídica longa contendo dois ou mais monômeros de Fc separados por ligantes e pela expressão de duas ou mais cadeias peptídicas curtas diferentes que cada uma contém um monômero de Fc único que é projetado para se ligar prefe- rencialmente a um ou mais monômeros de Fc específicos na cadeia peptídica longa. Qualquer número de domínios Fc pode ser conectado em tandem desta forma, permitindo a criação de construtos com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais domínios Fc.

[00175] Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem usar os métodos de montagem de moléculas com dois ou mais domínios Fc descritos em PCT/US2018/012689, WO 2015/168643, WO2017/151971, WO 2017/205436 e WO 2017/205434, os quais são incorporados a este documento por referência em sua totalidade. Os métodos de manipulação fazem uso de um ou dois conjuntos de módu- los de seletividade de heterodimerização para montar com precisão construtos do domínio de ligação Fc-antígeno ortogonais (construtos 22-42; FIG. 4-FIG. 13; FIG. 16-FIG. 36: (i) módulos de seletividade de heterodimerização com mutações de carga inversa diferentes (Tabela 5) e (ii) módulos de seletividade de heterodimerização com cavidades e protuberâncias modificadas (Tabela 4). Qualquer módulo de seletivi- dade de heterodimerização pode ser incorporado em um par de monô- meros de Fc projetados para se agrupar em um domínio Fc específico do construto, introduzindo substituições específicas de aminoácidos em cada polipeptídeo de monômero de Fc. Os módulos de seletividade de heterodimerização são projetados para incentivar a associação entre os monômeros de Fc tendo as substituições complementares de aminoá- cidos de um módulo de seletividade de heterodimerização específico, ao mesmo tempo em que desfavoreça a associação com os monômeros de Fc tendo as mutações de um módulo de seletividade de heterodime- rização diferente. Estas mutações de heterodimerização garantem a montagem dos diferentes polipeptídeos de monômeros de Fc na confi- guração em tandem desejada de diferentes domínios Fc de um cons- truto com formação mínima de complexos menores ou maiores. As pro- priedades desses construtos permitem a geração eficiente de composi- ções farmacêuticas substancialmente homogêneas, o que é desejável para garantir a segurança, eficácia, uniformidade e confiabilidade das composições farmacêuticas.

[00176] Em algumas modalidades, a montagem de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno descrito neste documento pode ser re- alizada usando diferentes mutações de orientação eletrostática entre os dois conjuntos de mutações de heterodimerização como descrito neste documento. Um exemplo de mutações de orientação eletrostática é E357K em um primeiro knob de um monômero de Fc e K370D em um primeiro hole de um monômero de Fc, em que esses monômeros de Fc se associam para formar um primeiro domínio Fc e D399K em um se- gundo knob de um monômero de Fc e K409D em um segundo hole de um monômero de Fc, em que esses monômeros de Fc se associam para formar um segundo domínio Fc.

[00177] Em algumas modalidades, o construto do domínio de ligação Fc-antígeno tem pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis domínios de ligação ao antí- geno) com características de ligação diferentes, como diferentes afini- dades de ligação (para os mesmos ou diferentes alvos) ou especificida- des para diferentes moléculas alvo. Os construtos biespecíficos, tries- pecíficos ou multiespecíficos podem ser gerados a partir das estruturas em andaime de Fc acima nas quais dois ou mais dos polipeptídeos do construto do domínio de ligação Fc-antígeno incluem domínios de liga- ção ao antígeno diferentes. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao antígeno do construto têm especificidades alvo diferentes, ou seja, os domínios de ligação ao antígeno se ligam a moléculas alvo di- ferentes. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de cadeia longa inclui um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especifici- dade e um polipeptídeo de cadeia curta inclui um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade. Os domínios de ligação ao antígeno diferentes podem usar cadeias leves diferentes, uma cadeia leve comum ou podem consistir em domínios scFv ou domínios relacio- nados a Fab (vide FIG. 4). Os exemplos ilustrativos deste conceito são construtos do domínio de ligação Fc-antígeno 22-42 (FIG. 16-FIG. 36) e os construtos na FIG. 4-FIG. 13.

[00178] Os construtos biespecíficos e triespecíficos podem ser gera- dos pelo uso de dois conjuntos diferentes de mutações de heterodime- rização, ou seja, mutações de heterodimerização ortogonais com ou sem mutações de homodimerização (por exemplo, construtos do domí- nio de ligação Fc-antígeno 22-42; FIG. 16-FIG. 36; FIG. 4-FIG. 13). Tais sequências de heterodimerização precisam ser projetadas de tal forma que desfavoreçam a associação com as outras sequências de heterodi- merização. Tais designs podem ser realizados usando diferentes muta- ções de direção eletrostática entre os dois conjuntos de mutações de heterodimerização, e/ou diferentes mutações protuberância-na-cavi- dade entre os dois conjuntos de mutações de heterodimerização, como descrito neste documento. Um exemplo de mutações de direção ele- trostática ortogonais é E357K no primeiro "knob" Fc, K370D no primeiro "hole" Fc, D399K no segundo "knob" Fc e K409D no segundo "hole" Fc. I. Monômeros do domínio Fc

[00179] Um monômero do domínio Fc inclui pelo menos uma porção de um domínio dobradiça, um domínio constante de anticorpos CH2, e um domínio constante de anticorpos CH3 (por exemplo, uma dobradiça de IgG1 humana, um domínio constante de anticorpos CH2, e um domí- nio constante de anticorpos CH3 com substituições de aminoácidos op- cionais). O monômero do domínio Fc pode ser do isotipo de anticorpo imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgA, ou IgD. O monômero do domínio Fc também pode ser de qualquer isotipo de anticorpo de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, ou IgG4). Os monômeros do domínio Fc também podem ser híbridos, por exemplo, com a dobradiça e CH2 de IgG1 e o CH3 de IgA, e com a dobradiça e CH2 de IgG1, mas o CH3 de IgG3. Um dímero de monômeros do domínio Fc é um domínio Fc (posteriormente definido neste documento) que pode ser ligar a um receptor Fc, por exemplo, FcγRIIIa, que é um receptor localizado na su- perfície de leucócitos. Na presente invenção, o domínio constante de anticorpo CH3 de um monômero do domínio Fc pode conter substitui- ções de aminoácidos na interface dos domínios constantes de anticorpo CH3-CH3 para promover sua associação um com outro. Em outras mo- dalidades, um monômero do domínio Fc inclui uma fração adicional, por exemplo, um peptídeo de ligação à albumina ou um peptídeo de purifi- cação, ligado ao terminal N ou C. Na presente invenção, um monômero do domínio Fc não contém qualquer tipo de região variável de anticorpo, por exemplo, VH, VL, uma região determinante de complementariedade (CDR), ou uma região hipervariável (HVR).

[00180] Em algumas modalidades, um monômero do domínio Fc em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno descrito neste docu- mento (por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc) pode ter uma sequência que seja pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência da SEQ ID NO:42. Em algumas modalidades, um monô- mero do domínio Fc em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno descrito neste documento (por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc) pode ter uma sequência que seja pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43, 44, 46, 47, 48, e 50-53. Em certas modalidades, um monômero de do- mínio Fc no construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ter uma sequência que seja pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 48, 52 e 53. SEQ ID NO: 42 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV-

DVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 44 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG- FYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 46 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

ALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 48 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDG- FYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 50 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 51 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 52 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

ALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 53 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD-

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKG- FYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK II. Domínios Fc

[00181] Como definido neste documento, um domínio Fc inclui dois monômeros do domínio Fc que são dimerizados pela interação entre os domínios constantes de anticorpo CH3. Um domínio Fc forma a estrutura mínima que se liga a um receptor Fc, por exemplo, receptores Fc gama (isto é, receptores Fcγ (FcγR)), receptores Fc-alfa (isto é, receptores Fcα (FcαR)), receptores Fc-épsilon (isto é, receptores Fcε (FcεR)), e/ou o receptor Fc neonatal (FcRn). Em algumas modalidades, um domínio Fc da presente invenção se liga a um receptor Fcγ (por exemplo, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIIb (CD16b)), e/ou FcγRIV e/ou o receptor Fc neonatal (FcRn). III. Domínios de ligação ao antígeno

[00182] Um domínio de ligação ao antígeno pode ser qualquer pro- teína ou polipeptídeo que se ligue a uma molécula alvo específica ou conjunto de moléculas alvo. Os domínios de ligação ao antígeno in- cluem um ou mais peptídeos ou polipeptídeos que ligam especifica- mente uma molécula alvo. Os domínios de ligação ao antígeno podem incluir o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno pode ser um fragmento de um anticorpo ou um construto-anticorpo, por exemplo, a porção mí- nima do anticorpo que se liga ao antígeno alvo. Um domínio de ligação ao antígeno também pode ser um peptídeo modificado sinteticamente que se liga a um alvo especificamente, como uma proteína de ligação baseada em fibronectina (por exemplo, um monocorpo FN3). Em al- gumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno pode ser um ligante ou receptor. Um fragmento de ligação ao antígeno (Fab) de fra- gmento é uma região em um anticorpo que se liga a um antígeno alvo.

É composto por um domínio constante e um variável de cada uma das cadeias leve e pesada. Um fragmento Fab inclui domínios VH, VL, CH1 e CL. Os domínios variáveis VH e VL cada um contêm um conjunto de 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) na extremidade terminal amino do monômero. O fragmento Fab pode ser do isotipo de anticorpo de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgA, ou IgD. O monômero do fragmento Fab também pode ser de qualquer isotipo de anticorpo de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, ou IgG4). Em algumas modalidades, um fragmento Fab pode ser ligado covalente- mente a um segundo fragmento Fab idêntico após o tratamento com protease (por exemplo, pepsina) de uma imunoglobulina, formando um fragmento F(ab')2. Em algumas modalidades, o Fab pode ser expresso como um único polipeptídeo, que inclui os domínios variável e constante fundidos, por exemplo, com um ligante entre os domínios.

[00183] Em algumas modalidades, apenas uma porção de um frag- mento Fab pode ser usada como um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, apenas o componente de cadeia leve (VL + CL) de um Fab pode ser usado, ou apenas o componente de cadeia pesada (VH + CH) de um Fab pode ser usado. Em algumas modalidades, pode-se utilizar um fragmento variável de cadeia única (scFv), que é uma proteína de fusão das cadeias VH e VL da região variável Fab. Em outras modalidades, pode-se usar um anticorpo linear, que inclui um par de segmentos de Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1), que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complementares formam um par de regi- ões de ligação ao antígeno.

[00184] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno pode ser um construto relacionado a Fab que são conhecidos na técnica. Por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno pode ser um domínio do fragmento variável de cadeia única (scFv) formado pela fu- são de um domínio variável de cadeia leve em um domínio variável de cadeia pesada via ligante peptídico. Vide Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 85:5879-83, 1988, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno pode ser um domínio pesado variável (VHH) ou na- nobody baseado em anticorpos de cadeia pesada de Camelidae. Vide Kastelic et al., J. Immunol. Methods, 350: 54-62, 2009, o qual é incorpo- rado a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno pode ser fragmentos do receptor de novo antígeno variável (VNAR) baseados em anticorpos de cadeia pesada de Squalidae. Vide Greenberg et al., Eur. J. Immunol., 26:1123–9, 1996, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno pode ser um diabody (Db) que pode ser formado pela produ- ção de duas sequências peptídicas. Por exemplo, um domínio leve va- riável específico para antígeno A pode ser fundido via ligante peptídico curto em um domínio pesado variável específico para antígeno B e ex- presso como uma cadeia polipeptídica única. Quando combinado com uma cadeia polipeptídica contendo um domínio pesado variável especí- fico para antígeno A fundido via ligante peptídico curto em um domínio leve variável específico para antígeno B, um diabody se forma com do- mínios de ligação para antígenos A e B. Vide Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:6444-8, 1993, o qual é incorporado a este docu- mento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno pode ser um diabody de cadeia única (scDb) que pode ser formado pela adição de um ligante peptídico entre duas cadeias de um diabody. Vide Brüsselbach et al., Tumor Targeting, 4:115-23, 1999, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

[00185] Os domínios de ligação ao antígeno podem ser colocados em vários números e em vários locais dentro dos polipeptídeos con- tendo Fc descritos neste documento. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação ao antígeno podem ser colocados no terminal N, terminal C e/ou entre os domínios Fc de um polipeptídeo contendo Fc. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ligante peptídico pode ser colocado entre um domínio de ligação ao antígeno, por exem- plo, um domínio Fab e um domínio Fc de um polipeptídeo contendo Fc. Em algumas modalidades, múltiplos domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais domínios de ligação ao antígeno) unidos em uma série podem ser colocados em qualquer posição ao longo de uma cadeia polipeptídica (Wu et al., Nat. Biotechnology, 25:1290-1297, 2007).

[00186] Em algumas modalidades, dois ou mais domínios de ligação ao antígeno podem ser colocados em várias distâncias em relação um ao outro em um domínio Fc contendo polipeptídeo ou em um complexo proteico feito de numerosos domínios Fc contendo polipeptídeos. Em algumas modalidades, dois ou mais domínios de ligação ao antígeno são colocados ao lado um do outro, por exemplo, no mesmo domínio Fc, como em um anticorpo monoclonal). Em algumas modalidades, dois ou mais domínios de ligação ao antígeno são colocados mais distantes em relação um ao outro, por exemplo, os domínios de ligação ao antí- geno são separados um do outro por 1, 2, 3, 4 ou 5, ou mais domínios Fc na estrutura proteica.

[00187] Em algumas modalidades, um construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno pode ter dois ou mais domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes, por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou mais domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes.

[00188] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno da presente invenção inclui um alvo ou antígeno listado na Tabela

1A ou 1B, um, dois, três, quatro, cinco ou todas as seis sequências de CDR listadas na Tabela 1A ou 1B para o alvo ou antígeno listado, como fornecido em mais detalhes abaixo da Tabela 1A ou 1B.

Em algumas modalidades, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tem dois ou mais domínios de ligação ao antígeno, cada um com uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis sequências de CDR listadas na Tabela 1A ou 1B para o alvo ou antígeno listado, em que dois ou mais domínios de ligação ao antígeno têm duas sequências de CDR diferentes, por exemplo, em que uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das sequências de CDR diferem entre os domínios de ligação ao antígeno do construto de Fc.

Tabela 1A Alvo Nome do anti- CDR1-IMGT (pe- CDR2-IMGT (pe- CDR3-IMGT (pe- CDR1-IMGT CDR2- CDR3-IMGT corpo sado) sado) sado) (leve) IMGT (leve) (leve) B7-H3 Enoblitzumabe GFTFSSFG (SEQ ISSDSSAI (SEQ GRGRENIYYGS- QNVDTN SAS QQYNNYPFT ID NO: 76) ID NO: 106) RLDY (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 137) 171) 201) beta-ami- Gantenerumabe GFTFSSYA (SEQ INASGTRT (SEQ ARGKGN- QSVSSSY GAS LQIYNMPIT loide ID NO: 77) ID NO: 107) THKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 138) 172) 202) CCR4 Mogamulizumabe GFIFSNYG (SEQ ISSASTYS (SEQ GRHSDGNFAFGY RNIVHING- KVS FQGSLLPWT ID NO: 78) ID NO: 108) (SEQ ID NO: 139) DTY (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 203) 173) CD19 Inebilizumabe GFTFSSSW IYPGDGDT (SEQ ARSGFITTVRDFDY ESVDTFGIS EAS QQSKEVPFT (SEQ ID NO: 79) ID NO: 109) (SEQ ID NO: 140) F (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 204) 174) CD20 Obinutuzumabe GYAFSYSW IFPGDGDT (SEQ ARNVFDGYWLVY KSLLHSN- QMS AQNLELPYT (SEQ ID NO: 80) ID NO: 110) (SEQ ID NO: 141) GITY (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 205) 175) CD20 Ocaratuzumabe GRTFTSYNMH AIYPLTGDT (SEQ ARSTYVGG- SSVPY ATS QQWLSNPP (SEQ ID NO: 81) ID NO: 111) DWQFDV (SEQ ID (SEQ ID NO: T NO: 142) 176) (SEQ ID NO: 206) CD20 Rituximabe GYTFTSYN (SEQ IYPGNGDT (SEQ CARSTYYGG- SSVSY ATS QQWTSNPP ID NO: 82) ID NO: 112) DWYFNV (SEQ ID (SEQ ID NO: T NO: 143) 177) (SEQ ID NO: 207) CD20 Ublituximabe GYTFTSYN (SEQ IYPGNGDT (SEQ ARYDYNYAMDY SSVSY ATS QQWTFNPP ID NO: 82) ID NO: 112) (SEQ ID NO: 144) (SEQ ID NO: T 177) (SEQ ID NO: 208) CD20 Veltuzumabe GYTFTSYN (SEQ IYPGNGDT (SEQ ARSTYYGG- SSVSY ATS QQWTSNPP ID NO: 82) ID NO: 112) DWYFDV (SEQ ID (SEQ ID NO: T NO: 145) 177) (SEQ ID NO: 207) CD22 Epratuzumabe GYTFTSYW INPRNDYT (SEQ ARRDITTFY (SEQ QSVLYSANH WAS HQYLSS (SEQ ID NO: 83) ID NO: 113) ID NO: 146) KNY (SEQ NO:

(SEQ ID NO: 209) 178) CD37 Otlertuzumabe GYSFTGYN IDPYYGGT (SEQ ARSVGPFDS ENVYSY FAK QHHSD- (SEQ ID NO: 84) ID NO: 114) (SEQ ID NO: 147) (SEQ ID NO: NPWT 179) (SEQ ID NO: 210) CD38 Daratumumabe GFTFNSFA (SEQ ISGSGGGT (SEQ AKDKIL- QSVSSY DAS QQRSNWPP ID NO: 85) ID NO: 115) WFGEPVFDY (SEQ (SEQ ID NO: T ID NO: 148) 180) (SEQ ID NO: 211) CD38 Isatuximabe GYTFTDYW IYPGDGDT (SEQ ARGDYYGSNSLDY QDVSTV SAS QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 86) ID NO: 109) (SEQ ID NO: 149) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 181) 212) CD3epsi- Foralumabe GFKFSGYG IWYDGSKK (SEQ ARQMGYWHFDLW QSVSSY DAS QQRSNWP- lon (SEQ ID NO: 87) ID NO: 116) (SEQ ID NO: 150) (SEQ ID NO: PLT 180) (SEQ ID NO: 213) CD52 Alentuzumabe GFTFTDFY (SEQ IRDKAKGYTT AREGHTAAPFDY QNIDKY NTN LQHISRPRT ID NO: 88) (SEQ ID NO: 117) (SEQ ID NO: 151) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 182) 214) CD105 Carotuximabe GFTFSDAW IRSKASNHAT TRWRRFFDS SSVSY ATS QQWSSNPL (SEQ ID NO: 89) (SEQ ID NO: 118) (SEQ ID NO: 152) (SEQ ID NO: T 177) (SEQ ID NO: 215) CD147 cHAb18 GFTFSDAW IRSANNHAPT TRDSTATH (SEQ ID QSVIND TAS QQDTSPP (SEQ ID NO: 89) (SEQ ID NO: 119) NO: 153) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 183) 216) c-Met ABT-700 GYIFTAYT (SEQ IKPNNGLA (SEQ ARSEITTEFDY ESVDSYANS RAS QQSKEDPLT ID NO: 90) ID NO: 120) (SEQ ID NO: 154) F (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 217) 184) CTLA-4 Ipilimumabe GFTFSSYT (SEQ ISYDGNNK (SEQ ARTGWLGPFDY QSVGSSY GAF QQYGSSPW ID NO: 91) ID NO: 121) (SEQ ID NO: 155) (SEQ ID NO: T 185) (SEQ ID NO: 218) EGFR2 Margetuximabe GFNIKDTY (SEQ IYPTNGYT (SEQ SRWGG- QDVNTA SAS QQHYTTPPT ID NO: 92) ID NO: 122) DGFYAMDY (SEQ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: ID NO: 156) 186) 219) EGFR3 Lumretuzumabe GYTFRSSY (SEQ IYAGTGSP (SEQ ARHRDYYSNSLTY QSVLNSGN WAS QSDYSYPYT ID NO: 93) ID NO: 123) (SEQ ID NO: 157) QKNY (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 220) 187) EphA3 Ifabotuzumabe GYTFTGYW IYPGSGNT (SEQ ARGGYYEDFDS QGIISY (SEQ AAS GQYANYPYT (SEQ ID NO: 94) ID NO: 124) (SEQ ID NO: 158) ID NO: 188) (SEQ ID NO: 221) GD3 Ecromeximabe GFAFSHYA (SEQ ISSGGSGT (SEQ TRVKLGTYYFDS QDISNY YSS HQYSKLP ID NO: 95) ID NO: 125) (SEQ ID NO: 159) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 189) 222) GPC3 Codrituzumabe GYTFTDYE (SEQ LDPKTGDT (SEQ TRFYSYTY (SEQ ID QSLVHSNR KVS SQNTHVPPT ID NO: 96) ID NO: 126) NO: 160) NTY (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 223) 190) KIR2DL1/ Lirilumabe GGTFSFYA (SEQ FIPIFGAA (SEQ ARIPSGSYYYDYD QSVSSY DAS QQRSNWMY 2/3 ID NO: 97) ID NO: 127) MDV (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: T 161) 180) (SEQ ID NO: 224) MUC5AC Ensituximabe GFSLSKFG (SEQ IWGDGST (SEQ VKPGGDY (SEQ ID SSISY DTS HQRDSYPW ID NO: 98) ID NO: 128) NO: 162) (SEQ ID NO: T 191) (SEQ ID NO: 225) fosfatidil- Bavituximabe GYSFTGYN IDPYYGDT (SEQ VKGGYY- QDIGSS ATS LQYVSSPPT serina (SEQ ID NO: 84) ID NO: 129) GHWYFDV (SEQ ID (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: NO: 163) 192) 226) RHD Roledumabe GFTFKNYA (SEQ ISYDGRNI (SEQ ARPVRS- QDIRNY AAS QQYYNSPPT ID NO: 99) ID NO: 130) RWLQLGLEDAFHI (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:

(SEQ ID NO: 164) 193) 227) SLAMF7 Elotuzumabe GFDFSRYW INPDSSTI (SEQ ARPDGNYWYFDV QDVGIA WAS QQYSSYPYT (SEQ ID NO: 100) ID NO: 131) (SEQ ID NO: 165) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 194) 228) HER2 Trastuzumabe GFNIKDTY (SEQ IYPTNGYT (SEQ SRWGG- QDVNTA SAS QQHYTTPPT ID NO: 92) ID NO: 122) DGFYAMDY (SEQ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: ID NO: 156) 186) 219) OX40 Oxelumabe GFTFNSYA (SEQ ISGSGGFT (SEQ AKDRLVAPGTFDY QGISSW AAS QQYNSYPYT ID NO: 101) ID NO: 132) (SEQ ID NO: 166) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 195) 229) PD-L1 Avelumabe GFTFSSYI (SEQ IYPSGGIT (SEQ ARIKLGTVTTVDY SSDVG- DVS SSYTSSSTR ID NO: 102) ID NO: 133) (SEQ ID NO: 167) GYNY V (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 196) 230) CD135 4G8-SDIEM SYWMH (SEQ ID EIDPSDSYKDYN AITTTPFDF (SEQ ID RASQSISNN YSQSIS QQSNTWPY NO: 103) QKFKD (SEQ ID NO: 168) LH (SEQ ID T NO: 134) (SEQ ID NO: NO: 200) (SEQ ID NO: 197) 231) HIV1 VRC01LS GYTFLNCPI GWMKPRGGAVN ARYFFGSSP- SQYGSLAW GGS QQYEFFGQ (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 135) NWYFD (SEQ ID (SEQ ID NO: GT NO: 169) 198) (SEQ ID NO: 232) HER3 KTN3379 GFTFSYYYMQ IGSSGGVTN ARVGLGDAFD- SLSNIGLN SRN AAWDDSPP (SEQ ID NO: 105) (SEQ ID NO: 136) IWQQ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: G 170) 199) (SEQ ID NO: 233) CD38 SYYMN GISGDPSNTY- DLPLVYTGFAY SGDNLRHYYVY GDSKRPS QTYTG- SYYMN (SEQ YADSVKG (SEQ (SEQ ID NO: 247) (SEQ ID NO: 248) (SEQ ID NO: GAS ID NO: 251) ID NO: 246) 249) (SEQ ID NO: 250) Tabela 1B: Sequências de Domínio Variável Anticorpo VH/CH1 VL Atezolizumabe EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVR- DIQMTQSPSSLSASVG- PD-L1 QAPGKGLEWVAWISPYGGSTY- DRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAP-

YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYCARRHWP KLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF GGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG- ATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRT- TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK- SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE- VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS PKSCDKTHTCPPCPAPELLGG- KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD ID NO: 257) GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY- KCKVSNKALPAPIEK-

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM- HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 252) Durvalumabe EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVR- EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYL- PD-L1 QAPGKGLEWVANIKQDGS- AWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIP-

EKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPW EGG- TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG- WFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG- TASVVCLLNNFYPREAK-

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE- KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ PKSCDKTHTCPPCPAPEFEGG- ID NO: 258)

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY- KCKVSNKALPASIEK-

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM- HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 253)

Anticorpo VH/CH1 VL Tremelimumabe QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIN CTLA-4 PGKGLEWVAV IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY SYLDWYQQKPGKAPKLLIYAAS- LQMNSLRAED TAVYYCARDP SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA-

RGATLYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG PSVFPLAPCS TYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE RSTSESTAAL GCLVKDYFPE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAK- PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT-

FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT (SEQ ID NO: 259)

PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 254) Isatuximabe QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCK- DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCK- CD38 ASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYA- ASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVP-

QKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYG DRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPY SNSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG- TFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG- TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY TASVVCLLNNFYPREAK- SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE- VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS PKSCDKTHTCPPCPAPELLGG- KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD ID NO: 260) GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY- KCKVSNKALPAPIEK-

TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM- HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 255) MOR 202 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVR- DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVY- CD38 QAPGKGLEWVSGISGDPSNTY- WYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIP YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPL ERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTG- VYTGFAYWGQGTLVTV (SEQ ID NO: 256) GASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 261) (Somente VH)

[00189] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (2204/2222 na FIG. 16) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00190] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (cada um de 2218/2220 e 2212/2214 na FIG. 16) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00191] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (2330/2304 na FIG. 17) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00192] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (cada um de 2328/2326, 2322/2320 e

2316/2314 na FIG. 17) pode incluir as três sequências de CDR de ca- deia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos lista- dos na Tabela 1A ou 1B.

[00193] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2430/2428 e 2420/2422 na FIG. 18) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00194] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2432/2406 e 2418/2416 na FIG. 18) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00195] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2532/2506 e 2530/2528 na FIG. 19) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00196] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2510/2512 e 2524/2522 na FIG. 19) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00197] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2648/2646 e 2634/2636 na FIG. 20) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00198] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630 e 2626/2624 na FIG. 20) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anti- corpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00199] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2748/2746 e 2738/2740 na FIG.

21) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00200] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734 e 2728/2726 na FIG. 21) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anti- corpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00201] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2850/2808 e 2848/2846 na FIG. 22) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00202] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840 e 2836/2834 na FIG. 22) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anti- corpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00203] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2918/2904 na FIG. 23) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00204] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2914/2912 na FIG. 23) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00205] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (cada um de 3022/3004 e 3020/3018 na FIG. 24) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00206] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (3014/3012 na FIG. 24) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00207] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3122/3104 na FIG. 25) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00208] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3120/3118 na FIG. 25) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00209] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3114/3112 na FIG. 25) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00210] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (3226/3204 na FIG. 26) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00211] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (cada um de 3222/3220 e 3216/3214 na FIG. 26) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00212] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3330/3304 e 3328/3326 na FIG. 27) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00213] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3322/3320 e 3316/3314 na FIG. 27) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00214] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3430/3404 na FIG. 28) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00215] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3428/3426 na FIG. 28) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00216] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (cada um de 3422/3420 e 3416/3414 na FIG. 28) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00217] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (cada um de 3530/3528 e 3520/3522 na FIG. 29) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00218] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3532/3506 na FIG. 29) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00219] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3518/3516 na FIG. 29) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00220] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3638/3636 e 3628/3620 na FIG. 30) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00221] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3640/3606 e 3626/3624 na FIG.

30) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00222] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3748/3746 e 3738/3740 na FIG. 31) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00223] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3736/3734in e 3750/3708 na FIG. 31) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00224] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3714/3716 e 3728/3726 na FIG. 31) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00225] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (cada um de 3832/3806 e 3830/3822 na FIG. 32) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00226] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3810/3812 na FIG. 32) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00227] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3824/3822 na FIG. 32) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00228] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3938/3936 e 3924/3926 na FIG. 33) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00229] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3940/3906 e 3922/3920 na FIG. 33) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00230] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4048/4046 e 4034/4036 na FIG. 34) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00231] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4050/4008 e 4032/4030 na FIG. 34) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00232] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4012/4014 e 4026/4024 na FIG. 34) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00233] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4140/4106 e 4138/4136 na FIG. 35) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00234] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4112/4114 e 4130/4128 na FIG. 35) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00235] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4250/4208 e 4248/4246 na FIG. 36) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00236] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4218/4220 e 4236/4234 na FIG. 36) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00237] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4212/4214 e 4242/4240 na FIG. 36) pode incluir as três sequências de CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1A ou 1B.

[00238] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um Fab ou um scFv) inclui as cadeias VH e VL de um an- ticorpo listado na Tabela 2 ou Tabela 1B. Em algumas modalidades, o Fab inclui as CDRs contidas nas cadeias VH e VL de um anticorpo listado na Tabela 2 ou Tabela 1B. Em algumas modalidades, o Fab inclui as CDRs contidas nas cadeias VH e VL de um anticorpo listado na Tabela 2 e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas, ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo na Tabela 2. Em algumas modalidades, o Fab inclui as CDRs contidas nas cadeias VH e VL de um anticorpo listado na Tabela 1B e o restante das sequên- cias de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idên- ticas, pelo menos 99% idênticas, ou pelo menos 99,5% idênticas às se- quências de VH e VL de um anticorpo na Tabela 1B. Tabela 2 Target Nome do anticorpo Antígeno AbGn-7 AbGn-7 AMHR2 GM-102 B7-H3 DS-5573a CA19-9 MVT-5873 CAIX Anti-CAIX CD19 XmAb5871 CD33 BI-836858 CD37 BI-836826

CD38 MOR-202 CD47 Anti-CD47 CD70 ARGX-110 CD70 ARGX-110 CD98 IGN-523 CD147 Metuzumabe CD157 MEN-1112 c-Met ARGX-111 EGFR2 GT-Mab 7.3-GEX EphA2 DS-8895a FGFR2 FPA-144 GM2 BIW-8962 HPA-1a NAITgam ICAM-1 BI-505 IL-3Ralfa Talacotuzumabe JL-1 Leucotuximabe antígeno de mieloma kappa MDX-1097 KIR32DL2 IPH-4102 LAG-3 GSK-2381781 P. aeruginosa sorotipo O1 AR-104 pGlu-abeta PBD-C06 TA-MUC1 GT-MAB 2.5-GEX

[00239] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (2204/2222 na FIG. 16) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00240] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (cada um de 2218/2220 e 2212/2214 na FIG. 16) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2.

[00241] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (2330/2304 na FIG. 17) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela

2 ou Tabela 1B.

[00242] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (cada um de 2328/2326, 2322/2320 e 2316/2314 na FIG. 17) podem incluir as sequências de VH e VL de qual- quer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00243] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2430/2428 e 2420/2422 na FIG. 18) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00244] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2432/2406 e 2418/2416 na FIG. 18) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00245] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2532/2506 e 2530/2528 na FIG. 19) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00246] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2510/2512 e 2524/2522 na FIG. 19) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00247] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2648/2646 e 2634/2636 na FIG. 20) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00248] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630 e 2626/2624 na FIG. 20) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00249] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2748/2746 e 2738/2740 na FIG. 21) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00250] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734 e 2728/2726 na FIG. 21) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00251] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2850/2808 e 2848/2846 na FIG. 22) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00252] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840 e 2836/2834 na FIG. 22) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00253] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2918/2904 na FIG. 23) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00254] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2914/2912 na FIG. 23) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00255] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (cada um de 3022/3004 e 3020/3018 na FIG. 24) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00256] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (3014/3012 na FIG. 24) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela

2 ou Tabela 1B.

[00257] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3122/3104 na FIG. 25) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00258] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3120/3118 na FIG. 25) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00259] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3114/3112 na FIG. 25) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00260] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (3226/3204 na FIG. 26) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00261] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (cada um de 3222/3220 e 3216/3214 na FIG. 26) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00262] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3330/3304 e 3328/3326 na FIG. 27) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00263] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3322/3320 e 3316/3314 na FIG. 27) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00264] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3430/3404 na FIG. 28) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00265] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3428/3426 na FIG. 28) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00266] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (cada um de 3422/3420 e 3416/3414 na FIG. 28) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00267] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (cada um de 3530/3528 e 3520/3522 na FIG. 29) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00268] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3532/3506 na FIG. 29) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00269] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3518/3516 na FIG. 29) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00270] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3638/3636 e 3628/3620 na FIG. 30) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00271] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3640/3606 e 3626/3624 na FIG.

30) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00272] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3748/3746 e 3738/3740 na FIG. 31) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00273] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3736/3734in e 3750/3708 na FIG. 31) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00274] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3714/3716 e 3728/3726 na FIG. 31) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00275] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (cada um de 3832/3806 e 3830/3822 na FIG. 32) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00276] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3810/3812 na FIG. 32) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00277] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3824/3822 na FIG. 32) podem incluir as se- quências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00278] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3938/3936 e 3924/3926 na FIG. 33) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00279] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3940/3906 e 3922/3920 na FIG. 33) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00280] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4048/4046 e 4034/4036 na FIG. 34) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00281] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4050/4008 e 4032/4030 na FIG. 34) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00282] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4012/4014 e 4026/4024 na FIG. 34) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00283] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4140/4106 e 4138/4136 na FIG. 35) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00284] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4112/4114 e 4130/4128 na FIG. 35) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00285] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4250/4208 e 4248/4246 na FIG. 36) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00286] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4218/4220 e 4236/4234 na FIG.

36) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00287] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4212/4214 e 4242/4240 na FIG. 36) podem incluir as sequências de VH e VL de qualquer um dos anticor- pos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00288] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (2204/2222 na FIG. 16) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00289] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (cada um de 2218/2220 e 2212/2214 na FIG. 16) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00290] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (2330/2304 na FIG. 17) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00291] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (cada um de 2328/2326, 2322/2320 e 2316/2314 na FIG. 17) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00292] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2430/2428 e 2420/2422 na FIG. 18) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00293] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2432/2406 e 2418/2416 na FIG. 18) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00294] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2532/2506 e 2530/2528 na FIG. 19) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00295] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2510/2512 e 2524/2522 na FIG. 19) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00296] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2648/2646 e 2634/2636 na FIG. 20) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00297] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630 e 2626/2624 na FIG. 20) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00298] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2748/2746 e 2738/2740 na FIG. 21) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00299] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734 e 2728/2726 na FIG. 21) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00300] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2850/2808 e 2848/2846 na FIG. 22) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00301] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840 e 2836/2834 na FIG. 22) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00302] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2918/2904 na FIG. 23) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00303] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2914/2912 na FIG. 23) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00304] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (cada um de 3022/3004 e 3020/3018 na FIG. 24) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00305] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (3014/3012 na FIG. 24) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00306] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3122/3104 na FIG. 25) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00307] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3120/3118 na FIG. 25) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00308] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3114/3112 na FIG. 25) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00309] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (3226/3204 na FIG. 26) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00310] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (cada um de 3222/3220 e 3216/3214 na FIG. 26) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00311] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3330/3304 e 3328/3326 na FIG. 273) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00312] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3322/3320 e 3316/3314 na FIG. 27) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de

VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00313] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3430/3404 na FIG. 28) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00314] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3428/3426 na FIG. 28) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00315] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (cada um de 3422/3420 e 3416/3414 na FIG. 28) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00316] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (cada um de 3530/3528 e 3520/3522 na FIG. 29) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00317] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3532/3506 na FIG. 29) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00318] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3518/3516 na FIG. 29) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00319] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3638/3636 e 3628/3620 na FIG.

30) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00320] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3640/3606 e 3626/3624 na FIG. 30) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00321] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3748/3746 e 3738/3740 na FIG. 31) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00322] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3736/3734in e 3750/3708 na FIG. 31) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Ta- bela 1B.

[00323] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3714/3716 e 3728/3726 na FIG. 31) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00324] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (cada um de 3832/3806 e 3830/3822 na FIG. 32) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00325] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3810/3812 na FIG. 32) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00326] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3824/3822 na FIG. 32) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00327] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3938/3936 e 3924/3926 na FIG. 33) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00328] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3940/3906 e 3922/3920 na FIG. 33) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00329] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4048/4046 e 4034/4036 na FIG. 34) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00330] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4050/4008 e 4032/4030 na FIG. 34) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00331] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4012/4014 e 4026/4024 na FIG. 34) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de

VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00332] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4140/4106 e 4138/4136 na FIG. 35) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00333] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4112/4114 e 4130/4128 na FIG. 35) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00334] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4250/4208 e 4248/4246 na FIG. 36) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00335] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4218/4220 e 4236/4234 na FIG. 36) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00336] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4212/4214 e 4242/4240 na FIG. 36) podem incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00337] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (2204/2222 na FIG. 16) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00338] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (cada um de 2218/2220 e 2212/2214 na FIG. 16) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00339] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (2330/2304 na FIG. 17) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00340] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (cada um de 2328/2326, 2322/2320 e 2316/2314 na FIG. 17) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idên- ticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qual- quer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00341] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2430/2428 e 2420/2422 na FIG. 18) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên-

ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00342] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (cada um de 2432/2406 e 2418/2416 na FIG. 18) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00343] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2532/2506 e 2530/2528 na FIG. 19) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00344] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (cada um de 2510/2512 e 2524/2522 na FIG. 19) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00345] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2648/2646 e 2634/2636 na FIG. 20) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me-

nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VLde qualquer um dos anti- corpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00346] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (cada um de 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630 e 2626/2624 na FIG. 20) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00347] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2748/2746 e 2738/2740 na FIG. 21) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00348] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (cada um de 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734 e 2728/2726 na FIG. 21) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00349] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2850/2808 e 2848/2846 na FIG. 22) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên-

[00350] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (cada um de 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840 e 2836/2834 na FIG. 22) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00351] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2918/2904 na FIG. 23) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00352] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (2914/2912 na FIG. 23) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00353] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (cada um de 3022/3004 e 3020/3018 na FIG. 24) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên-

[00354] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (3014/3012 na FIG. 24) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00355] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3122/3104 na FIG. 25) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VLde qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00356] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3120/3118 na FIG. 25) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00357] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (3114/3112 na FIG. 25) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela

2 ou Tabela 1B.

[00358] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (3226/3204 na FIG. 26) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VLL de qualquer um dos anticorpos listados na Ta- bela 2 ou Tabela 1B.

[00359] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (cada um de 3222/3220 e 3216/3214 na FIG. 26) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00360] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3330/3304 e 3328/3326 na FIG. 27) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00361] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (cada um de 3322/3320 e 3316/3314 na FIG. 27) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00362] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3430/3404 na FIG. 28) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00363] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (3428/3426 na FIG. 28) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00364] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (cada um de 3422/3420 e 3416/3414 na FIG. 28) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00365] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (cada um de 3530/3528 e 3520/3522 na FIG. 29) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00366] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3532/3506 na FIG. 29) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00367] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (3518/3516 na FIG. 29) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00368] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3638/3636 e 3628/3620 na FIG. 30) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00369] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (cada um de 3640/3606 e 3626/3624 na FIG. 30) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00370] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3748/3746 e 3738/3740 na FIG. 31) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên-

[00371] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3750/3708 e 3736/3734 na FIG. 31) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00372] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (cada um de 3714/3716 e 3728/3726 na FIG. 31) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00373] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (cada um de 3832/3806 e 3830/3822 na FIG. 32) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00374] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3810/3812 na FIG. 32) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela

2 ou Tabela 1B.

[00375] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (3824/3822 na FIG. 32) pode incluir as se- quências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00376] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3938/3936 e 3924/3926 na FIG. 33) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00377] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (cada um de 3940/3906 e 3922/3920 na FIG. 33) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00378] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4048/4046 e 4034/4036 na FIG. 34) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VLL são pelo menos 95% idênticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo menos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00379] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4050/4008 e 4032/4030 na FIG. 34) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de VH e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00380] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (cada um de 4012/4014 e 4026/4024 na FIG. 34) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00381] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4140/4106 e 4138/4136 na FIG. 35) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00382] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (cada um de 4112/4114 e 4130/4128 na FIG. 35) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00383] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4250/4208 e 4248/4246 na FIG. 36) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00384] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4218/4220 e 4236/4234 na FIG. 36) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B.

[00385] Um domínio de ligação ao antígeno do construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (cada um de 4212/4214 e 4242/4240 na FIG. 36) pode incluir as sequências de CDR contidas nas sequências de V H e VL, e o restante das sequências de VH e VL são pelo menos 95% idên- ticas, pelo menos 97% idênticas, pelo menos 99% idênticas ou pelo me- nos 99,5% idênticas às sequências de VH e VL de qualquer um dos an- ticorpos listados na Tabela 2 ou Tabela 1B. Mutações de Heterodimerização do Domínio de Ligação ao Antígeno

[00386] Em alguns casos, uma ou mais tecnologias de heterodimeri- zação podem ser incorporadas a um domínio de ligação ao antígeno de um construto de Fc descrito neste documento para promover a monta- gem do domínio de ligação ao antígeno no construto. O uso das tecno- logias de heterodimerização nos domínios de ligação ao antígeno é par- ticularmente útil quando dois entre mais domínios de ligação ao antí- geno diferentes estão ligados a um construto de Fc, por exemplo, quando os domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes estão ligados a construtos de Fc biespecíficos ou triespecífi- cos. Por exemplo, uma primeira tecnologia de heterodimerização pode ser incorporada a um primeiro domínio Fab com uma primeira especifi- cidade alvo e uma segunda tecnologia de heterodimerização pode ser incorporada a um segundo domínio Fab com uma segunda especifici- dade alvo. A primeira tecnologia de heterodimerização promove a asso- ciação das cadeias pesadas e leves do primeiro Fab, desencorajando a associação das cadeias pesadas ou leves do primeiro Fab com as ca- deias pesadas ou leves do segundo Fab. Da mesma forma, a segunda tecnologia de heterodimerização promove a associação das cadeias pe- sadas e leves do segundo Fab, desencorajando a associação das ca- deias pesadas ou leves do segundo Fab com as cadeias pesadas ou leves do primeiro Fab.

[00387] Em algumas modalidades, uma ou mais tecnologias de he- terodimerização presentes na Tabela 3 são introduzidas a um ou mais domínios de ligação ao antígeno em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno tem pelo menos uma tecnologia de heterodimerização, como des- crito em Liu et al., J. Biol.Chem. 290:7535-7562, 2015; Schaefer et al, Cancer Cell, 20:472-86, 2011; Lewis et al, Nat Biotechnol, 32:191-8, 2014; Wu et al, MAbs, 7:364-76, 2015; Golay et al, J Immunol, 196:3199- 211, 2016; e Mazor et al, MAbs, 7:377-89, 2015, os quais são incorpo- rados a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, uma tecnologia de heterodimerização pode ser incorpo- rada ao domínio VH, ao domínio CH1, ao domínio VL e/ou ao domínio CL de um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a tecnologia de heterodimerização pode ser uma ou mais mutações no domínio VH, domínio CH1, domínio VL e/ou domínio CL de um domínio de ligação ao antígeno.

Tabela 3. Métodos de heterodimerização do braço de Fab Método VH1 CH11 VL1 CL1 Referência Orientação ele- Q39K, S183D Q38D, A43D S176K Liu et al., J. trostática Q105K Biol.Chem. 290:7535- 7562, 2015 Orientação ele- Q39D, S183K Q38K,A43K S176D Liu et al., J. trostática Q105D Biol.Chem. 290:7535- 7562, 2015 CrossMabCH1-CL Ne- Domínio Nenhum Domínio Schaefer et nhum CL CH1 al, Cancer Cell, 20:472-86, 2011 VHVRD1CHCRD2- 39K, H172A, 1R,38D,(36F) L135Y, Lewis et al, VLVRD1CLCRD2 62E F174G S176W Nat Bio- technol, 32:191-8, 2014 VHVRD2CH1wt- 39Y Nenhum 38R Nenhum Lewis et al, VLVRD2CLwt Nat Bio- technol, 32:191-8, 2014 TCR CC 39K TCR C 38D TCR C Wu et al, MAbs, 7:364-76, 2015 CR3 Ne- T192E Nenhum N137K, Golay et al, nhum S114A J Immunol, 196:3199- 211, 2016

Tabela 3. Métodos de heterodimerização do braço de Fab Método VH1 CH11 VL1 CL1 Referência MUT4 Ne- L143Q, Nenhum V133T, Golay et al, nhum S188V S176V J Immunol, 196:3199- 211, 2016 DuetMab Ne- F126C Nenhum S121C Mazor et al, nhum MAbs, 7:377-89, 2015; Mazor et al, MAbs, 7:461-9, 2015 1 Todos os resíduos são numerados como descrito nas referências apresentadas IV. Módulos de seletividade de dimerização

[00388] Na presente invenção, um módulo de seletividade de dime- rização inclui componentes ou seleciona aminoácidos dentro do monô- mero do domínio Fc que facilita o pareamento preferencial de dois mo- nômeros do domínio Fc para formar um domínio Fc. Especificamente, um módulo de seletividade de dimerização é parte do domínio constante de anticorpo CH3 de um monômero do domínio Fc, o qual inclui substi- tuições de aminoácido posicionadas na interface entre os domínios constantes de anticorpo CH3 interativos de dois monômeros do domínio Fc. Em um módulo de seletividade de dimerização, as substituições de aminoácidos tornam favorável a dimerização dos dois domínios cons- tantes de anticorpo CH3 como resultado da compatibilidade dos amino- ácidos escolhidos para tais substituições. A formação final do domínio Fc favorecido é seletiva sobre outros domínios Fc que se formam a partir de monômeros do domínio Fc que não possuem módulos de seletivi- dade de dimerização ou com substituições de aminoácidos incompatí- veis nos módulos de seletividade de dimerização. Este tipo de substitui-

ção de aminoácido pode ser feita usando técnicas de clonagem mole- cular convencionais bem conhecidas na técnica, tais como mutagênese QuikChange®.

[00389] Em algumas modalidades, um módulo de seletividade de di- merização inclui uma cavidade modificada (descrita posteriormente neste documento) no domínio constante de anticorpo CH3. Em outras modalidades, o módulo de seletividade de dimerização inclui uma pro- tuberância modificada (descrita posteriormente neste documento) no domínio constante de anticorpo CH3. Para formar seletivamente um do- mínio Fc, dois monômeros do domínio Fc com módulos de seletividade de dimerização compatíveis, por exemplo, um domínio constante de an- ticorpo CH3 contendo uma cavidade modificada e o outro domínio cons- tante de anticorpo CH3 contendo uma protuberância modificada, combi- nam-se para formar um par de protuberância-na-cavidade de monôme- ros do domínio Fc. Protuberâncias modificadas e cavidades modificadas são exemplos de módulos de seletividade de heterodimerização, que podem ser feitos nos domínios constantes de anticorpo C H3 dos monô- meros do domínio Fc a fim de promover a heterodimerização favorável de dois monômeros do domínio Fc que tenham módulos de seletividade de heterodimerização compatíveis.

[00390] Em outras modalidades, um monômero do domínio Fc com um módulo de seletividade de dimerização contendo substituições de aminoácidos positivamente carregados e um monômero do domínio Fc com um módulo de seletividade de dimerização contendo substituições de aminoácidos negativamente carregados podem se combinar seleti- vamente para formar um domínio Fc através da orientação eletrostática favorável (descrita posteriormente neste documento) dos aminoácidos carregados. Em algumas modalidades, um monômero do domínio Fc pode incluir uma das seguintes substituições de aminoácidos positiva ou negativamente carregados: K392D, K392E, D399K, K409D, K409E,

K439D, e K439E. Em um exemplo, um monômero do domínio Fc con- tendo uma substituição de aminoácido positivamente carregado, por exemplo, D356K ou E357K, e um monômero do domínio Fc contendo uma substituição de aminoácido negativamente carregado, por exem- plo, K370D ou K370E, podem se combinar seletivamente para formar um domínio Fc através de orientação eletrostática favorável dos amino- ácidos carregados. Em outro exemplo, um monômero do domínio Fc contendo E357K e um monômero do domínio Fc contendo K370D po- dem se combinar seletivamente para formar um domínio Fc através de orientação eletrostática favorável dos aminoácidos carregados. Em ou- tro exemplo, um monômero do domínio Fc contendo E356K e D399K e um monômero do domínio Fc contendo K392D e K409D podem se com- binar seletivamente para formar um domínio Fc através de direção ele- trostática favorável dos aminoácidos carregados. Em algumas modali- dades, as substituições de aminoácidos de carga inversa podem ser usadas como módulos de seletividade de heterodimerização, em que dois monômeros do domínio Fc contendo substituições de aminoácidos de carga inversa diferentes, mas compatíveis, se combinam para formar um domínio Fc heterodimérico. Os módulos de seletividade de dimeri- zação específicos são listados ainda, sem limitação, nas Tabelas 4 e 5 descritas abaixo.

[00391] Em outras modalidades, dois monômeros do domínio Fc in- cluem módulos de seletividade de homodimerização contendo muta- ções de carga inversa idênticas em pelo menos duas posições dentro do anel de resíduos carregados na interface entre os domínios CH3. Os módulos de seletividade de homodimerização são substituições de ami- noácidos de carga inversa que promovem a homodimerização de mo- nômeros do domínio Fc para formar um domínio Fc homodimérico. Ao inverter a carga de ambos os membros dos dois ou mais pares comple-

mentares de resíduos nos dois monômeros do domínio Fc, os monôme- ros do domínio Fc mutantes permanecem complementares aos monô- meros do domínio Fc da mesma sequência mutante, mas têm uma me- nor complementaridade com os monômeros do domínio Fc sem essas mutações. Em uma modalidade, um domínio Fc inclui monômeros do domínio Fc que incluem os mutantes duplos K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D, ou D356K/K439E. Em outra modalidade, um domínio Fc inclui monômeros do domínio Fc incluindo mutantes qu- ádruplos que combinam qualquer par de mutantes duplos, por exemplo, K409D/D399K/E357K/K370E. Exemplos de módulos de seletividade de homodimerização são mostrados posteriormente nas Tabelas 5 e 6. Os domínios Fc de homodimerização podem ser usados para criar pontos de ramificação simétricos em um construto do domínio de ligação Fc- antígeno. Em uma modalidade, um construto do domínio de ligação Fc- antígeno descrito neste documento tem um domínio Fc de homodimeri- zação. Em uma modalidade, um construto do domínio de ligação Fc- antígeno tem dois ou mais domínios Fc de homodimerização, por exem- plo, dois, três, quatro ou cinco ou mais domínios de homodimerização. Em uma modalidade, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tem três domínios Fc de homodimerização. Em algumas modalidades, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tem um módulo de se- letividade de homodimerização. Em algumas modalidades, um cons- truto do domínio de ligação Fc-antígeno tem dois ou mais módulos de seletividade de homodimerização, por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou mais módulos de seletividade de homodimerização.

[00392] Em outras modalidades, um monômero do domínio Fc con- tendo (i) pelo menos uma mutação de carga inversa e (ii) pelo menos uma cavidade modificada ou pelo menos uma protuberância modificada pode se combinar seletivamente com um outro monômero do domínio

Fc contendo (i) pelo menos uma mutação de carga inversa e (ii) pelo menos uma protuberância modificada ou pelo menos uma cavidade mo- dificada para formar um domínio Fc. Por exemplo, um monômero do domínio Fc contendo a mutação de carga inversa K370D e as cavidades modificadas Y349C, T366S, L368A e Y407V e um outro monômero do domínio Fc contendo a mutação de carga inversa E357K e as protube- râncias modificadas S354C e T366W podem se combinar seletivamente para formar um domínio Fc.

[00393] A formação desses domínios Fc é promovida pelas substitui- ções de aminoácidos compatíveis nos domínios constantes de anticorpo CH3. Dois módulos de seletividade de dimerização contendo substitui- ções de aminoácidos incompatíveis, por exemplo, ambos contendo ca- vidades modificadas, ambos contendo protuberâncias modificadas, ou ambos contendo os mesmos aminoácidos carregados na interface CH3- CH3, não irão promover a formação de um domínio Fc de heterodimeri- zação.

[00394] Vários pares de domínios Fc de heterodimerização podem ser usados para criar construtos do domínio de ligação Fc-antígeno com vários pontos de ramificação assimétricos, vários pontos de não ramifi- cação ou pontos de ramificação assimétricas e pontos de não ramifica- ção. Múltiplas e distintas tecnologias de heterodimerização (vide, por exemplo, Tabelas 4 e 5) são incorporadas a diferentes domínios Fc para montar esses construtos contendo domínios Fc. As tecnologias de he- terodimerização têm associação mínima (ortogonalidade) para parea- mento indesejado de monômeros de Fc. Dois métodos diferentes de he- terodimerização de Fc, como "knobs-into-holes" (Tabela 4) e orientação eletrostática (Tabela 5) podem ser usados em diferentes domínios Fc para controlar a montagem das cadeias polipeptídicas no construto de- sejado. Alternativamente, duas variantes diferentes de "knobs-into-ho- les" (por exemplo, dois conjuntos distintos de mutações selecionadas da Tabela 4), ou duas variantes diferentes da direção eletrostática (por exemplo, dois conjuntos distintos de mutações selecionadas da Tabela 5), podem ser usadas em diferentes domínios Fc para controlar a mon- tagem das cadeias polipeptídicas no construto desejado. Ramificações assimétricos podem ser criados colocando os monômeros do domínio Fc de um domínio Fc de heterodimerização em diferentes cadeias poli- peptídicas, cadeia polipeptídica com múltiplos domínios Fc. Pontos não ramificados podem ser criados colocando um monômero do domínio Fc do domínio Fc de heterodimerização em uma cadeia polipeptídica com vários domínios Fc e o outro monômero do domínio Fc do domínio Fc de heterodimerização em uma cadeia polipeptídica com um único domí- nio Fc.

[00395] Em algumas modalidades, os construtos do domínio de liga- ção Fc-antígeno descritos neste documento são lineares. Em algumas modalidades, os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno descritos neste documento não possuem pontos de ramificação. Por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ser montado a partir de um peptídeo grande com dois ou mais monômeros do domínio Fc, onde pelo menos dois monômeros do domínio Fc são diferentes (ou seja, têm mutações de heterodimerização diferentes), e dois ou mais peptídeos menores, cada um tendo um monômero do domínio Fc dife- rente (ou seja, dois ou mais pequenos peptídeos com monômeros do domínio Fc com mutações de heterodimerização diferentes). Os cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno descritos neste documento po- dem ter dois ou mais módulos de seletividade de dimerização que são incompatíveis entre si, por exemplo, pelo menos dois módulos de sele- tividade de dimerização incompatíveis selecionados das Tabelas 4 e/ou 5, que promovem ou facilitam a formação adequada dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno, de modo que o monômero do domínio

Fc de cada peptídeo menor se associe com seus monômeros do domí- nio Fc compatíveis no peptídeo maior. Em algumas modalidades, um primeiro monômero do domínio Fc ou primeiro subconjunto de monô- meros do domínio Fc em um peptídeo longo contém substituições de aminoácidos que fazem parte de um primeiro módulo de seletividade de dimerização que é compatível com uma parte do primeiro módulo de seletividade de dimerização formado por substituições de aminoácidos no monômero do domínio Fc de um primeiro peptídeo curto. Um se- gundo monômero do domínio Fc ou segundo subconjunto de monôme- ros do domínio Fc em um peptídeo longo contém substituições de ami- noácidos que fazem parte de um segundo módulo de seletividade de dimerização que é compatível com uma parte do segundo módulo de seletividade de dimerização formado por substituições de aminoácidos no monômero do domínio Fc de um segundo peptídeo curto. O primeiro módulo de seletividade de dimerização favorece a ligação de um pri- meiro monômero do domínio Fc (ou primeiro subconjunto de monôme- ros do domínio Fc) no peptídeo longo ao monômero do domínio Fc de um primeiro peptídeo curto, ao mesmo tempo em que desfavorece a ligação entre um primeiro monômero do domínio Fc e o monômero do domínio Fc do segundo peptídeo curto. De maneira similar, o segundo módulo de seletividade de dimerização favorece a ligação de um se- gundo monômero do domínio Fc (ou segundo subconjunto de monôme- ros do domínio Fc) no peptídeo longo ao monômero do domínio Fc de um segundo peptídeo curto, ao mesmo tempo em que desfavorece a ligação entre um segundo monômero do domínio Fc e o monômero do domínio Fc do primeiro peptídeo curto.

[00396] Em certas modalidades, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ter um primeiro domínio Fc com um primeiro módulo de seletividade de dimerização, e um segundo domínio Fc com um se-

gundo módulo de seletividade de dimerização. Em algumas modalida- des, o primeiro domínio Fc é montado a partir de um monômero de Fc com pelo menos uma mutação formadora de protuberância selecionada da Tabela 4 e/ou pelo menos uma mutação de carga inversa selecio- nada da Tabela 5 (por exemplo, o monômero de Fc pode ter mutações formadora de protuberância S354C e T366W e uma mutação de carga inversa E357K), e um monômero de Fc com pelo menos uma mutação formadora de cavidade selecionada da Tabela 4 e/ou pelo menos uma mutação de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, o mo- nômero de Fc pode ter mutações formadoras de cavidade Y349C, T366S, L368A e Y407V e uma mutação de carga inversa K370D. Em algumas modalidades, o segundo domínio Fc é montado a partir de um monômero de Fc com pelo menos uma mutação formadora de protube- rância selecionada da Tabela 4 e/ou pelo menos uma mutação de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, o monômero de Fc pode ter mutações de carga inversa D356K e D399K), e um monômero de Fc com pelo menos uma mutação formadora de cavidade selecionada da Tabela 4 e/ou pelo menos uma mutação de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, o monômero de Fc pode ter mutações de carga inversa K392D e K409D).

[00397] Além disso, outros métodos usados para promover a forma- ção de domínios Fc com monômeros do domínio Fc definidos incluem, sem limitação, a abordagem LUZ-Y (Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº WO2011034605) que inclui uma fusão C-terminal de α-hélices monoméricas de um zíper de leucina a cada um dos monômeros do domínio Fc para permitir a formação de heterodímeros, bem como a abordagem do corpo de domínio modificado de troca de fita (SEED) (Davis et al., Protein Eng Des Sel. 23:195-202, 2010) que gera domínio Fc com monômeros do domínio Fc heterodiméricos, com cada um in- cluindo segmentos alternados de sequências de CH3 de IgA e IgG.

V. Cavidades modificadas e protuberâncias modificadas

[00398] O uso de cavidades modificadas e protuberâncias modifica- das (ou a estratégia de "knob-into-hole") é descrito por Carter e colabo- radores (Ridgway et al. Protein Eng. 9:617-612, 1996; Atwell et al. J Mol Biol.270:26-35, 1997; Merchant et al. Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998). A interação de nó (“knob”) e orifício (“hole”) favorece a formação de heterodímeros, em que a interação knob-knob e hole-hole impede a formação de heterodímero devido ao choque estérico e deleção de in- terações favoráveis. A técnica “knob-into-hole” também é descrita na Patente U.S. nº 5,731,168.

[00399] Na presente invenção, as cavidades modificadas e protube- râncias modificadas são usadas na preparação dos construtos do domí- nio de ligação Fc-antígeno descritos neste documento. Uma cavidade modificada é um espaço vazio que é criado quando um aminoácido ori- ginal de uma proteína é substituído por um aminoácido diferente com um volume menor de cadeia lateral. Uma protuberância modificada é uma saliência que é criada quando um aminoácido original de uma pro- teína é substituído por um aminoácido diferente com um volume maior de cadeia lateral. Especificamente, o aminoácido sendo substituído está no domínio constante de anticorpo CH3 de um monômero do domínio Fc e está envolvido na dimerização de dois monômeros do domínio Fc. Em algumas modalidades, uma cavidade modificada em um domínio cons- tante de anticorpo CH3 é criada para acomodar uma protuberância mo- dificada em um outro domínio constante de anticorpo CH3, de tal modo que ambos os domínios constantes de anticorpo CH3 atuam como mó- dulos de seletividade de dimerização (por exemplo, módulos de seleti- vidade de heterodimerização) (descritos acima) que promovem ou favo- recem a dimerização dos dois monômeros do domínio Fc. Em outras modalidades, uma cavidade modificada em um domínio constante de anticorpo CH3 é criada para acomodar melhor um aminoácido original em um outro domínio constante de anticorpo CH3. Em ainda outras mo- dalidades, uma protuberância modificada em um domínio constante de anticorpo CH3 é criada para formar interações adicionais com os amino- ácidos originais em um outro domínio constante de anticorpo CH3.

[00400] Uma cavidade modificada pode ser construída através da substituição de aminoácidos contendo cadeias laterais maiores, tais como tirosina ou triptofano, por aminoácidos contendo cadeias laterais menores, tais como alanina, valina ou treonina. Especificamente, alguns módulos de seletividade de dimerização (por exemplo, os módulos de seletividade de heterodimerização) (descritos adicionalmente acima) contêm cavidades modificadas, tais como a mutação Y407V no domínio constante de anticorpo CH3. Semelhantemente, uma protuberância mo- dificada pode ser construída ao substituir aminoácidos que contêm ca- deias laterais menores por aminoácidos que contêm cadeias laterais maiores. Especificamente, alguns módulos de seletividade de dimeriza- ção (por exemplo, os módulos de seletividade de heterodimerização) (descritos adicionalmente acima) contêm protuberâncias modificadas, tal como a mutação T366W no domínio constante de anticorpo CH3. Na presente invenção, as cavidades modificadas e as protuberâncias mo- dificadas também são combinadas com a manipulação da ligação dis- sulfeto do domínio inter-CH3 para potencializar a formação de heterodí- meros. Em um exemplo, um monômero do domínio Fc que contém as cavidades modificadas Y349C, T366S, L368A e Y407V podem se com- binar seletivamente com um outro monômero do domínio Fc que contém as protuberâncias S354C e T366W para formar um domínio Fc. Em um outro exemplo, um monômero do domínio Fc que contém uma cavidade modificada com a adição de Y349C e um monômero do domínio Fc que contém uma protuberância modificada com a adição de S354C podem se combinar seletivamente para formar um domínio Fc. Outras cavida- des modificadas e protuberâncias modificadas, em combinação tanto com manipulação de ligação dissulfeto quanto com cálculos estruturais (HA-TF misturados) estão incluídas, sem limitação, na Tabela 4. Tabela 4: Métodos de heterodimerização de Fc ("Knobs-into-holes") Método Mutações (Cadeia A) Mutações (Cadeia B) Referência (Domínio CH3 do monômero 1 do domí- (Domínio CH3 do monômero 1 nio Fc) do domínio Fc) Knobs-into-Holes (Y-T) Y407T T336Y Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes Y407A T336W Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes F405A T394W Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes Y407T T366Y Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes T394S F405W Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes T394W, Y407T T366Y, F406A Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes T394S, Y407A T366W, F405W Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes T366W, T394S F405W, T407A Pat. US Nº 8,216,805 Knobs-into-Holes F405T T394Y Knobs-into-Holes S354C, T366W Y349C, T366S, L368A, Y407V Knobs-into-Holes (CW- Y349C, T366S, L368A, Y407V S354C, T366W Merchant et al., CSAV) Nat. Biotechnol. 16(7):677-81, 1998 HA-TF S364H, F405A Y349T, T394F WO2011028952 Nota: Todos os resíduos numerados pelo esquema de numeração EU (Edelman e outros, Proc Acad Natl Sci EUA, 63:78-85, 1969)

[00401] Substituir um resíduo de aminoácido original no domínio constante de anticorpo CH3 por um resíduo de aminoácido diferente pode ser obtido alterando o ácido nucléico que codifica o resíduo de aminoácido original. O limite superior para o número de resíduos de aminoácidos originais que podem ser substituídos é o número total de resíduos na interface dos domínios constantes de anticorpo C H3, dado que a interação suficiente na interface ainda seja mantida. Combinar cavidades modificadas e protuberâncias modificadas com ori- entação eletrostática

[00402] A orientação eletrostática pode ser combinada com a tecno- logia "knob-into-holes" para favorecer a heterodimerização, por exem-

plo, entre monômeros do domínio de Fc em dois polipeptídeos diferen- tes. A orientação eletrostática, descrita em maiores detalhes abaixo, é a utilização de interações eletrostáticas favoráveis entre aminoácidos de carga oposta em peptídeos, domínios proteicos e proteínas para con- trolar a formação de moléculas proteicas com maior ordenação. A ori- entação eletrostática pode ser usada promover a homodimerização ou o heterodimerização, o último dos quais pode ser combinado de maneira útil com a tecnologia "knobs-into-holes". No caso de heterodimerização, mutações diferentes, mas compatíveis, são introduzidas em cada um dos monômeros do domínio Fc que devem ser heterodimerizados. As- sim, um monômero do domínio Fc pode ser modificado para incluir uma das seguintes substituições de aminoácidos positiva ou negativamente carregadas: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D e K439E. Por exemplo, um mo- nômero do domínio Fc, por exemplo, um monômero do domínio Fc que tem uma cavidade (Y349C, T366S, L368A e Y407V), pode também in- cluir a mutação K370D e o outro monômero do domínio Fc, por exemplo, um monômero do domínio Fc que tem uma protuberância (S354C e T366W) pode incluir E357K.

[00403] Mais geralmente, qualquer uma das mutações de cavidade (ou combinações de mutação): Y407T, Y407A, F405A, Y407T, T394S, T394W:Y407A, T366W:T394S, T366S:L368A:Y407V:Y349C, e S3364H:F405 podem ser combinadas com uma mutação na Tabela 5 e qualquer uma das mutações de protuberância (ou combinações de mu- tação): T366Y, T366W, T394W, F405W, T366Y:F405A, T366W:Y407A, T366W:S354C, e Y349T:T394F podem ser combinadas com uma mu- tação na Tabela 5 que é pareada com a mutação da Tabela 5 usado em combinação com a mutação da cavidade (ou combinação de mutação). VI. Orientação eletrostática

[00404] A orientação eletrostática é a utilização de interações ele- trostáticas favoráveis entre aminoácidos de carga oposta em peptídeos, domínios de proteínas e proteínas para controlar a formação de molé- culas de proteína com maior ordenação. Um método de usar efeitos de orientação eletrostática para alterar a interação de domínios de anti- corpo para reduzir a formação de homodímero a favor da formação de heterodímero na geração de anticorpos biespecíficos é descrito na Pu- blicação do Pedido de Patente U.S. Nº 2014-0024111.

[00405] Na presente invenção, a orientação eletrostática é usada para controlar a dimerização de monômeros do domínio Fc e a formação de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno. Particularmente, para controlar a dimerização de monômeros do domínio Fc usando a orien- tação eletrostática, um ou mais resíduos de aminoácidos que compõem a interface CH3-CH3 são substituídos por resíduos de aminoácidos car- regados positiva ou negativamente, de tal modo que a interação se torna eletrostaticamente favorável ou desfavorável dependendo dos aminoá- cidos específicos carregados introduzidos. Em algumas modalidades, um aminoácido carregado positivamente na interface, como lisina, argi- nina ou histidina é substituído por um aminoácido carregado negativa- mente, tal como o ácido aspártico ou ácido glutâmico. Em outras moda- lidades, um aminoácido carregado negativamente na interface é substi- tuído por um aminoácido carregado positivamente. Os aminoácidos car- regados podem ser introduzidos em um dos domínios constantes de an- ticorpo CH3 em interação, ou em ambos. Através da introdução de ami- noácidos carregados nos domínios constantes de anticorpo CH3 em in- teração, são criados módulos de seletividade de dimerização (descritos adicionalmente acima) que podem formar seletivamente dímeros de monômeros do domínio Fc, como controlado pelos efeitos da orientação eletrostática, resultando a partir da interação entre aminoácidos carre- gados.

[00406] Em algumas modalidades, para criar um módulo de seletivi- dade de dimerização incluindo cargas invertidas que podem formar se- letivamente dímeros dos monômeros do domínio Fc, como controlado pelos efeitos de orientação eletrostática, os dois monômeros do domínio Fc pode ser seletivamente formados através da heterodimerização ou homodimerização. Heterodimerização de monômeros do domínio Fc

[00407] A heterodimerização de monômeros do domínio Fc pode ser promovida ao introduzir mutações diferentes, mas compatíveis, nos dois monômeros do domínio Fc, tais como os pares de resíduos de carga incluídos, sem limitação, na Tabela 5. Em algumas modalidades, um monômero do domínio Fc pode incluir uma das seguintes substituições de aminoácidos positiva ou negativamente carregados: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, e K439E, por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 ou mais de D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, e K439E. Em um exemplo, um monômero do domínio Fc contendo uma substituição de aminoácido positivamente carregado, por exemplo, D356K ou E357K, e um monômero do domínio Fc con- tendo uma substituição de aminoácido negativamente carregado, por exemplo, K370D ou K370E, podem se combinar seletivamente para for- mar um domínio Fc através de orientação eletrostática favorável dos aminoácidos carregados. Em outro exemplo, um monômero do domínio Fc contendo E357K e um monômero do domínio Fc contendo K370D podem se combinar seletivamente para formar um domínio Fc através de orientação eletrostática favorável dos aminoácidos carregados. Em outro exemplo, um monômero do domínio Fc contendo E356K e D399K e um monômero do domínio Fc contendo K392D e K409D podem se combinar seletivamente para formar um domínio Fc através de direção eletrostática favorável dos aminoácidos carregados.

[00408] Um "domínio Fc heterodimérico" refere-se a um domínio Fc que é formado pela heterodimerização de dois monômeros do domínio Fc, em que os dois monômeros do domínio Fc contêm mutações de carga inversa diferentes (módulo de seletividade de heterodimerização) (ver, por exemplo, mutações na Tabela 5) que promovem a formação favorável destes dois monômeros do domínio Fc. Em um exemplo, em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc, dois dos três domínios Fc podem ser formados pela heterodimerização de dois monômeros do domínio Fc, como promovido pelos efeitos de orientação eletrostática. Tabela 5: Métodos de heterodimerização de Fc (orientação eletrostá- tica) Método Mutações (Cadeia A) Mutações (Cadeia B) Referência (Domínio CH3 do monômero 1 do (Domínio CH3 do monômero 2 do domínio Fc) domínio Fc) Orientação Eletrostática K409D D399K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K409D D399R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K409E D399K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K409E D399R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K392D D399K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K392D D399R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K392E D399K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K392E D399R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K392D, K409D E356K, D399K Gunasekaran et al., J Biol (DD-KK) Chem. 285: 19637-46, 2010 Orientação Eletrostática K370E, K409D, K439E E356K, E357K, D399K WO 2006/106905 Knobs-into-Holes mais S354C, E357K, T366W Y349C, T366S, L368A, K370D, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática Y407V Orientação Eletrostática K370D E357K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370D E357R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370E E357K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370E E357R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370D D356K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370D D356R US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370E D356K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370E D356K US 2014/0024111 Orientação Eletrostática K370E, K409D, K439E E356K, E357K, D399K US 2014/0024111 Nota: Todos os resíduos numerados pelo esquema de numeração EU (Edelman e outros, Proc Acad Natl Sci EUA, 63:78-85, 1969) Homodimerização de monômeros do domínio Fc

[00409] A homodimerização de monômeros do domínio Fc pode ser promovida ao introduzir as mesmas mutações de orientação eletrostá- tica (módulos de seletividade de homodimerização) em ambos os mo- nômeros do domínio Fc em uma forma simétrica. Em algumas modali- dades, dois monômeros do domínio Fc incluem módulos de seletividade de homodimerização contendo mutações de carga inversa idênticas em pelo menos duas posições dentro do anel de resíduos carregados na interface entre os domínios CH3. Ao inverter a carga de ambos os mem- bros dos dois ou mais pares complementares de resíduos nos dois mo- nômeros do domínio Fc, os monômeros do domínio Fc mutantes per- manecem complementares aos monômeros do domínio Fc da mesma sequência mutante, mas têm uma menor complementaridade com os monômeros do domínio Fc sem essas mutações. As mutações de ori- entação eletrostática que podem ser introduzidas em um monômero do domínio Fc para promover sua homodimerização são mostradas, sem limitações, nas Tabelas 5 e 6. Em uma modalidade, um domínio Fc inclui dois monômeros do domínio Fc, cada um incluindo os mutantes de carga inversa dupla (Tabela 5), por exemplo, K409D/D399K. Em uma outra modalidade, um domínio Fc inclui dois monômeros do domínio Fc, cada um incluindo os mutantes reversos quádruplos (Tabela 6), por exemplo, K409D/D399K/K370D/E357K.

[00410] Por exemplo, em um construto do domínio de ligação Fc-an- tígeno tendo três domínios Fc, um dos três domínios Fc pode ser for- mado pela homodimerização de dois monômeros do domínio Fc, como promovido pelos efeitos de orientação eletrostática. Um "domínio Fc ho- modimérico" refere-se a um domínio Fc que é formado pela homodime- rização de dois monômeros do domínio Fc, em que os dois monômeros do domínio Fc contêm as mesmas mutações de carga inversa (ver, por exemplo, as mutações nas Tabelas 5 e 6). Em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno que tem três domínios Fc - um domínio Fc "de haste" de terminal carboxila e dois domínios Fc "de ramificação" de ter- minal amino - o domínio Fc "haste" de terminal carboxila pode ser um domínio Fc homodimérico (chamado também de um “domínio Fc homo- dimérico de haste”). Um domínio Fc homodimérico com haste pode ser formado por dois monômeros do domínio Fc, cada um contendo os mu- tantes duplos K409D/D399K.

Tabela 6: Métodos de homodimerização de Fc Método Mutações (Cadeias A e B) (domínio CH3 Referência dos monômeros 1 e 2 do domínio Fc) Tipo Selvagem Nenhum Orientação Eletrostática (KD) D399K, K409D Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática D399K, K409E Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática E357K, K370D Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática E357K, K370E Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática D356K, K439D Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática D356K, K439E Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática K392D, D399K Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática K392E, D399K Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010, WO 2015/168643 Orientação Eletrostática D399R, K409D

Orientação Eletrostática D399R, K409E

Orientação Eletrostática D399R, K392D

Orientação Eletrostática D399R, K392E

Orientação Eletrostática E357K, K370D

Orientação Eletrostática E357R, K370D

Orientação Eletrostática E357K, K370E

Orientação Eletrostática E357R, K370E

Orientação Eletrostática D356K, K370D

Orientação Eletrostática D356R, K370D

Orientação Eletrostática D356K, K370E

Orientação Eletrostática D356R, K370E

Nota: Todos os resíduos numerados pelo esquema de numeração EU (Edelman e outros, Proc Acad Natl Sci EUA, 63:78-85, 1969) Tabela 7: Métodos de homodimerização de Fc Mutações de carga inversa no domínio CH3 de cada um dos Mutações de carga inversa no domínio CH3 de cada um dos dois monômeros do domínio Fc em um domínio Fc homo- dois monômeros do domínio Fc em um domínio Fc homo- dimérico dimérico

K409D/D399K/K370D/E357K K392D/D399K/K370D/E357K

K409D/D399K/K370D/E357R K392D/D399K/K370D/E357R

K409D/D399K/K370E/E357K K392D/D399K/K370E/E357K

K409D/D399K/K370E/E357R K392D/D399K/K370E/E357R

K409D/D399K/K370D/D356K K392D/D399K/K370D/D356K

K409D/D399K/K370D/D356R K392D/D399K/K370D/D356R

K409D/D399K/K370E/D356K K392D/D399K/K370E/D356K

K409D/D399K/K370E/D356R K392D/D399K/K370E/D356R

K409D/D399R/K370D/E357K K392D/D399R/K370D/E357K

K409D/D399R/K370D/E357R K392D/D399R/K370D/E357R

K409D/D399R/K370E/E357K K392D/D399R/K370E/E357K

K409D/D399R/K370E/E357R K392D/D399R/K370E/E357R

K409D/D399R/K370D/D356K K392D/D399R/K370D/D356K

K409D/D399R/K370D/D356R K392D/D399R/K370D/D356R

K409D/D399R/K370E/D356K K392D/D399R/K370E/D356K

K409D/D399R/K370E/D356R K392D/D399R/K370E/D356R

K409E/D399K/K370D/E357K K392E/D399K/K370D/E357K

K409E/D399K/K370D/E357R K392E/D399K/K370D/E357R

K409E/D399K/K370E/E357K K392E/D399K/K370E/E357K

K409E/D399K/K370E/E357R K392E/D399K/K370E/E357R

K409E/D399K/K370D/D356K K392E/D399K/K370D/D356K

K409E/D399K/K370D/D356R K392E/D399K/K370D/D356R

K409E/D399K/K370E/D356K K392E/D399K/K370E/D356K

K409E/D399K/K370E/D356R K392E/D399K/K370E/D356R

K409E/D399R/K370D/E357K K392E/D399R/K370D/E357K

K409E/D399R/K370D/E357R K392E/D399R/K370D/E357R

K409E/D399R/K370E/E357K K392E/D399R/K370E/E357K

K409E/D399R/K370E/E357R K392E/D399R/K370E/E357R

K409E/D399R/K370D/D356K K392E/D399R/K370D/D356K

K409E/D399R/K370D/D356R K392E/D399R/K370D/D356R

K409E/D399R/K370E/D356K K392E/D399R/K370E/D356K

K409E/D399R/K370E/D356R K392E/D399R/K370E/D356R

Nota: Todos os resíduos numerados pelo esquema de numeração EU (Edelman e outros, Proc Acad Natl Sci EUA, 63:78-85, 1969) Outros métodos de heterodimerização

[00411] Várias outras tecnologias do heterodimerização foram des- critas. Qualquer uma ou mais destas tecnologias (Tabela 8) podem ser combinadas com qualquer tecnologia "knob-into-holes" e/ou heterodi- merização e/ou homodimerização de orientação eletrostática descrita neste documento para produzir um construto do domínio de ligação Fc- antígeno. Tabela 8: Outros métodos de heterodimerização de Fc Método Mutações (Cadeia A) Mutações (Cadeia B) Referência ZW1 (VYAV-VLLW) T350V, L351Y, F405A, Y407V T350V, T366L, K392L, T394W Von Kreudenstein et al, MAbs, 5:646-54, 2013 Dobradiça IgG1/pares D221E, P228E, L368E D221R, P228R, K409R Strop et al, J Mol Biol, de carga CH3 (EEE- 420:204-19, 2012 RRR) EW-RVT K360E, K409W Q347R, D399V, F405T Choi et al, Mol Cancer Ther, 12:2748-59, 2013 EW-RVTS-S K360E, K409W, Y349C Q347R, D399V, F405T, S354C Choi et al, Mol Immunol, 65:377-83, 2015 Introdução da Carga L351D T366K De Nardis, J Biol Chem, (DK Biclonic) 292:14706-17, 2017 Introdução da carga L351D, L368E L351K, T366K De Nardis, J Biol Chem, (DEKK Biclonic) 292:14706-17, 2017 DuoBody (L-R) F405L K409R Labrijn et al, Proc Natl Acad Sci USA, 110:5145- 50, 2013 SEEDbody IgG/A quimera IgG/A quimera Davis et al, Protein Eng Des Sel, 23:195-202, 2010 BEAT (A/B) S364K, T366V, K370T, K392Y, F405S, Q347E, Y349A, L351F, S364T, T366V, Skegro et al, J Biol Chem, Y407V, K409W, T411N K370T, T394D, V397L, D399E, F405A, 292:9745-59, 2017 Y407S, K409R, T411R BEAT (A/B min) S364K, T366V, K370T, K392Y, K409W, F405A, Y407S Skegro et al, J Biol Chem, T411N 292:9745-59, 2017 BEAT (A/B + Q) Q347A, S364K, T366V, K370T, K392Y, Q347E, Y349A, L351F, S364T, T366V, Skegro et al, J Biol Chem, F405S, Y407V, K409W, T411N K370T, T394D, V397L, D399E, F405A, 292:9745-59, 2017 Y407S, K409R, T411R BEAT (A/B – T) S364K, T366V, K370T, K392Y, F405S, Q347E, Y349A, L351F, S364T, T366V, Skegro et al, J Biol Chem, Y407V, K409W, T411N K370T, T394D, V397L, D399E, F405A, 292:9745-59, 2017 Y407S, K409R

7.8.60 (DMA-RRVV) K360D, D399M, Y407A E345R, Q347R, T366V, K409V Leaver-Fay et al, Struc- ture, 24:641-51, 2016

20.8.34 (SYMV-GDQA) Y349S, K370Y, T366M, K409V E356G, E357D, S364Q, Y407A Leaver-Fay et al, Struc- ture, 24:641-51, 2016 Nota: Todos os resíduos numerados pelo esquema de numeração EU (Edelman e outros, Proc Acad Natl Sci EUA, 63:78-85, 1969)

VII. Ligantes

[00412] Na presente invenção, um peptídeo de ligação é usado para descrever uma ligação ou conexão entre domínios de polipeptídeos ou de proteína e/ou associados a frações não proteicas. Em algumas mo- dalidades, um ligante é uma ligação ou uma conexão entre pelo menos dois monômeros do domínio Fc, pois o ligante conecta terminal C do domínio constante de anticorpo CH3 de um primeiro monômero do do- mínio Fc ao terminal N do domínio dobradiça de um segundo monômero do domínio Fc, de tal modo que os dois monômeros do domínio Fc são unidos uns aos outros em série em tandem. Em outras modalidades, um ligante é uma ligação entre um monômero do domínio Fc e qualquer outros domínios de proteína que são anexados ao mesmo. Por exemplo, um ligante pode anexar o terminal C do domínio constante de anticorpo CH3 de um monômero do domínio Fc ao terminal N de um peptídeo de ligação à albumina.

[00413] Um ligante pode ser uma ligação covalente simples, por exemplo, uma ligação peptídica, um polímero sintético, por exemplo, um polímero de polietilenoglicol (PEG) ou qualquer tipo de ligação criado a partir de uma reação química, por exemplo, uma conjugação química. No caso em que um ligante é uma ligação peptídica, o grupo de ácido carboxílico no terminal C de um domínio de proteína pode reagir com o grupo amino no terminal N de um outro domínio de proteína em uma reação de condensação para formar uma ligação peptídica. Especifica- mente, a ligação peptídica pode ser formada a partir de meios sintéticos através de uma reação química orgânica convencional bem conhecida na técnica, ou por produção natural de uma célula hospedeira, em que uma sequência polinucleotídica codifica as sequências de DNA de am- bas as proteínas, por exemplo, dois monômeros do domínio Fc, em sé- rie em tandem, pode ser diretamente transcrita e traduzida em um poli-

peptídeo contíguo codificando ambas as proteínas pelas máquinas mo- leculares necessárias, por exemplo, polimerase de DNA e ribossomo, na célula hospedeira.

[00414] No caso em que um ligante é um polímero sintético, por exemplo, um polímero de PEG, o polímero pode ser acrescido com gru- pos funcionais químicos reativos em cada extremidade para reagir com os aminoácidos terminais nas extremidades de ligação de duas proteí- nas.

[00415] No caso em que um ligante (exceto a ligação peptídica men- cionada acima) é feito a partir de uma reação química, os grupos funci- onais químicos, por exemplo, amina, ácido carboxílico, éster, azida ou outros grupos funcionais comumente usados na técnica, podem ser li- gados sinteticamente ao terminal C de uma proteína e o terminal N de outra proteína, respectivamente. Os dois grupos funcionais podem en- tão reagir através de meios de química sintética para formar uma ligação química, ligando assim as duas proteínas. Tais procedimentos de con- jugação química são rotineiros para os versados na técnica. Espaçador

[00416] Na presente invenção, um ligante entre dois monômeros do domínio Fc pode ser um espaçador de aminoácidos, incluindo 3-200 aminoácidos (por exemplo 3-200, 3-180, 3-160, 3-140, 3-120, 3-100, 3- 90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 3-45, 3-40, 3-35, 3-30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-200, 5-200, 6-200, 7-200, 8-200, 9-200, 10- 200, 15-200, 20-200, 25-200, 30-200, 35-200, 40-200, 45-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, ou 180-200 aminoácidos). Em algumas modalidades, um ligante entre dois monômeros do domínio Fc é um espaçador de aminoácidos con- tendo pelo menos 12 aminoácidos, tal como 12-200 aminoácidos (por exemplo, 12-200, 12-180, 12-160, 12-140, 12-120, 12-100, 12-90, 12- 80, 12-70, 12-60, 12-50, 12-40, 12-30, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-

16, 12-15, 12-14, ou 12-13 aminoácidos) (por exemplo, 14-200, 16-200, 18-200, 20-200, 30-200, 40-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90- 200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, 180-200, ou 190-200 amino- ácidos). Em algumas modalidades, um ligante entre dois monômeros do domínio Fc é um espaçador de aminoácidos que contém 12-30 amino- ácidos (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos). Os espaçadores peptídicos ade- quados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ligantes pep- tídicos que contêm resíduos de aminoácidos flexíveis, tais como glicina e serina. Em certas modalidades, um espaçador pode conter motivos, por exemplo, motivos múltiplos ou repetidos, de GS, GGS, GGGGS (SEQ ID NO: 1), GGSG (SEQ ID NO: 2) ou SGGG (SEQ ID NO: 3). Em outras modalidades, um espaçador pode conter 2 a 12 aminoácidos in- cluindo motivos de GS, por exemplo, GS, GSGS (SEQ ID NO: 4), GSGSGS (ID SEQ NO: 5), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 6), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 7) ou GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 8). Em outras modalidades, um espaçador pode conter de 3 a 12 ami- noácidos incluindo motivos de GGS, por exemplo, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 9), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 10) e GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11). Em ainda outras modalidades, um espaçador pode conter de 4 a 20 aminoácidos incluindo motivos de GGSG (SEQID NO: 2), por exemplo, GGSGGGSG (SEQ ID NO: 12), GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 13), GGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 14) ou GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 15). Em outras modali- dades, um espaçador pode conter motivos de GGGGS (SEQ ID NO: 1), por exemplo, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO; 16) ou GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17). Em certas modalidades, um espaçador é SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18).

[00417] Em algumas modalidades, um espaçador entre dois monô- meros do domínio Fc contém apenas resíduos de glicina, por exemplo,

pelo menos 4 resíduos de glicina (por exemplo, 4-200 (SEQ ID NO: 262), 4-180 (SEQ ID NO: 263), 4-160 (SEQ ID NO: 264), 4-140 (SEQ ID NO: 265), 4-40 (SEQ ID NO: 266), 4-100 (SEQ ID NO: 267), 4-90 (SEQ ID NO: 268), 4-80 (SEQ ID NO: 269), 4-70 (SEQ ID NO: 270), 4-60 (SEQ ID NO: 271), 4-50 (SEQ ID NO: 272), 4-40 (SEQ ID NO: 266), 4-30 (SEQ ID NO: 235), 4-20 (SEQ ID NO: 236), 4-19 (SEQ ID NO: 273), 4-18 (SEQ ID NO: 274), 4-17 (SEQ ID NO: 275), 4-16 (SEQ ID NO: 276), 4-15 (SEQ ID NO: 277), 4-14 (SEQ ID NO: 278), 4-13 (SEQ ID NO: 279), 4-12 (SEQ ID NO: 280), 4-11 (SEQ ID NO: 281), 4-10 (SEQ ID NO: 282), 4-9 (SEQ ID NO: 283), 4-8 (SEQ ID NO: 284), 4-7 (SEQ ID NO: 285), 4-6 (SEQ ID NO: 286) ou 4-5 (SEQ ID NO: 287) resíduos de glicina) (por exemplo, 4- 200 (SEQ ID NO: 262), 6-200 (SEQ ID NO: 288), 8-200 (SEQ ID NO: 289), 10-200 (SEQ ID NO: 290), 12-200 (SEQ ID NO: 291), 14-200 (SEQ ID NO: 292), 16-200 (SEQ ID NO: 293), 18-200 (SEQ ID NO: 294), 20- 200 (SEQ ID NO: 295), 30-200 (SEQ ID NO: 296), 40-200 (SEQ ID NO: 297), 50-200 (SEQ ID NO: 298), 60-200 (SEQ ID NO: 299), 70-200 (SEQ ID NO: 300), 80-200 (SEQ ID NO: 301), 90-200 (SEQ ID NO: 302), 100- 200 (SEQ ID NO: 303), 120-200 (SEQ ID NO: 304), 140-200 (SEQ ID NO: 305), 160-200 (SEQ ID NO: 306), 180-200 (SEQ ID NO: 307), ou 190-200 (SEQ ID NO: 308) resíduos de glicina). Em certas modalidades, um espaçador tem 4-30 (SEQ ID NO: 235) resíduos de glicina (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 resíduos de glicina (SEQ ID NO: 235)). Em algumas modalidades, um espaçador que contém apenas re- síduos de glicina pode não ser glicosilado (por exemplo, glicosilação O- ligada, também referida como O-glicosilação) ou pode ter um nível de glicosilação diminuído (por exemplo, um nível de O-glicosilação diminu- ído) (por exemplo, um nível de O-glicosilação diminuído com glicanos, tais como xilose, manose, ácidos siálicos, fucose (Fuc) e/ou galactose (Gal) (por exemplo, xilose)), como comparado com, por exemplo, um espaçador que contém um ou mais resíduos de serina (por exemplo, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18)).

[00418] Em algumas modalidades, um espaçador que contêm ape- nas resíduos de glicina pode não ser O-glicosilado (por exemplo, O-xi- losilação) ou pode ter um nível diminuído de O-glicosilação (por exem- plo, um nível diminuído de O-xilosilação), como comparado a, por exem- plo, um espaçador que contém um ou mais resíduos de serina (por exemplo, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18)).

[00419] Em algumas modalidades, um espaçador que contém ape- nas resíduos de glicina pode não se submeter à proteólise ou pode ter uma taxa de proteólise diminuída em comparação com, por exemplo, um espaçador que contém um ou mais resíduos de serina (por exemplo, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18)).

[00420] Em certas modalidades, um espaçador pode conter motivos de GGGG (SEQ ID NO: 19), por exemplo, GGGGGGGG (SEQ ID NO: 20), GGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 21), GGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 22) ou GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 23). Em certas moda- lidades, um espaçador pode conter motivos de GGGGG (SEQ ID NO: 24), por exemplo, GGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 25) ou GGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 26). Em certas modalidades, um espaçador é GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).

[00421] Em outras modalidades, um espaçador pode também conter aminoácidos que não sejam glicina e serina, por exemplo, GEN- LYFQSGG (SEQ ID NO: 28), SACYCELS (SEQ ID NO: 29), RSIAT (SEQ ID NO: 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO: 31), GGSA- GGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 32), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO: 33) ou GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 34).

[00422] Em certas modalidades na presente invenção, um espaçador peptídico de 12 ou 20 aminoácidos é usado para ligar dois monômeros do domínio Fc na série em tandem, os espaçadores peptídicos de 12 ou 20 aminoácidos consistindo nas sequências GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 35) e SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18), res- pectivamente. Em outras modalidades, um espaçador de peptídeo de 18 aminoácidos que consiste na sequência GGSGGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO: 36) pode ser usado.

[00423] Em algumas modalidades, um espaçador entre dois monô- meros do domínio Fc pode ter uma sequência que seja pelo menos 75% idêntica (por exemplo, pelo menos 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-36 descritas acima. Em certas moda- lidades, um espaçador entre dois monômeros do domínio Fc pode ter uma sequência que seja pelo menos 80% idêntica (por exemplo, pelo menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, ou 99,5% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 18, 26, e 27. Em certas modalidades, um espaçador entre dois monômeros do domínio Fc pode ter uma sequência que é pelo menos 80% idêntica (por exem- plo, pelo menos, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99% ou 99,5%) à sequência da SEQ ID NO: 18 ou 27.

[00424] Em certas modalidades, o ligante entre o terminal amino da dobradiça de um monômero do domínio Fc e o terminal carbóxi de um monômero de Fc que é no mesmo polipeptídeo (ou seja, o ligante co- necta o terminal C do domínio constante de anticorpo CH3 de um pri- meiro monômero do domínio Fc ao terminal N do domínio dobradiça de um segundo monômero do domínio Fc, de modo que os dois monôme- ros do domínio Fc sejam unidos entre si em série em tandem) em um espaçador tendo 3 ou mais aminoácidos ao invés de uma ligação cova- lente (por exemplo, 3-200 aminoácidos (por exemplo 3-200, 3-180, 3-

160, 3-140, 3-120, 3-100, 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 3-45, 3-40, 3-35, 3-30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-200, 5-200, 6- 200, 7-200, 8-200, 9-200, 10-200, 15-200, 20-200, 25-200, 30-200, 35- 200, 40-200, 45-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, ou 180-200 aminoácidos) ou um espaçador de aminoácido contendo pelo menos 12 aminoácidos, tal como 12-200 aminoácidos (por exemplo, 12-200, 12-180, 12-160, 12-140, 12-120, 12- 100, 12-90, 12-80, 12-70, 12-60, 12-50, 12-40, 12-30, 12-20, 12-19, 12- 18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, ou 12-13 aminoácidos) (por exemplo,14- 200, 16-200, 18-200, 20-200, 30-200, 40-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, 180-200, ou 190- 200 aminoácidos)).

[00425] Em espaçador também pode estar presente entre o terminal N domínio dobradiça de um monômero do domínio Fc e o terminal car- bóxi de um domínio de ligação CD38 (por exemplo, um domínio CH1 de um domínio de ligação de cadeia pesada CD38 ou o domínio CL de um domínio de ligação de cadeia leve CD38) de modo que os domínios es- tejam unidos por um espaçador de 3 ou mais aminoácidos (por exemplo, 3-200 aminoácidos (por exemplo, 3-200, 3-180, 3-160, 3-140, 3-120, 3- 100, 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 3-45, 3-40, 3-35, 3-30, 3-25, 3-20, 3- 15, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-200, 5-200, 6-200, 7-200, 8-200, 9-200, 10-200, 15-200, 20-200, 25-200, 30-200, 35-200, 40-200, 45- 200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 120-200, 140- 200, 160-200, ou 180-200 aminoácidos) ou um espaçador de aminoáci- dos contendo pelo menos 12 aminoácidos, tal como 12-200 aminoáci- dos (por exemplo, 12-200, 12-180, 12-160, 12-140, 12-120, 12-100, 12- 90, 12-80, 12-70, 12-60, 12-50, 12-40, 12-30, 12-20, 12-19, 12-18, 12- 17, 12-16, 12-15, 12-14, ou 12-13 aminoácidos) (por exemplo, 14-200, 16-200, 18-200, 20-200, 30-200, 40-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80- 200, 90-200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, 180-200, ou 190-200 aminoácidos)). VII. Peptídeos de ligação a proteínas séricas

[00426] A ligação a peptídeos de proteína sérica pode aprimorar a farmacocinética de farmacêuticos proteicos e, em particular, os constru- tos do domínio de ligação Fc-antígeno descritos aqui podem ser fundi- dos com peptídeos de ligação a proteínas séricas.

[00427] Como um exemplo, os peptídeos de ligação à albumina que podem ser usados nos métodos e composições descritos neste docu- mento são geralmente conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o peptídeo de ligação à albumina inclui a sequência DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 37). Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação à albumina tem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, 90% ou 100% idênticas) à SEQ ID NO: 37.

[00428] Na presente invenção, os peptídeos de ligação à albumina podem ser associados ao terminal N ou C de certos polipeptídeos no construto do domínio de ligação Fc-antígeno. Em uma modalidade, um peptídeo de ligação à albumina pode ser ligado ao terminal C de um ou mais polipeptídeos nos construtos de Fc contendo um domínio de liga- ção ao antígeno. Em outra modalidade, um peptídeo de ligação à albu- mina pode ser fundido ao terminal C do polipeptídeo que codifica dois monômeros do domínio Fc ligados na série em tandem nos construtos de Fc contendo um domínio de ligação ao antígeno. Em uma outra mo- dalidade, um peptídeo de ligação à albumina pode ser ligado ao terminal C do monômeros do domínio Fc (por exemplo, os monômeros do domí- nio Fc 114 e 116 na FIG. 1; os monômeros do domínio Fc 214 e 216 na FIG. 2) que unido ao segundo monômero do domínio Fc no polipeptídeo que codifica os dois monômeros do domínio Fc ligados em uma série em tandem. Os peptídeos de ligação à albumina podem ser genetica- mente fundidos aos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno ou ligados aos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno através de meios químicos, por exemplo, conjugação química. Se desejado, um espaçador pode ser inserido entre o construto domínio de ligação Fc- antígeno e o peptídeo de ligação à albumina. Sem estar ligado a uma teoria, espera-se que a inclusão de um peptídeo de ligação à albumina em um construto domínio de ligação Fc-antígeno da invenção possa le- var a uma retenção prolongada da proteína terapêutica através de sua ligação à albumina sérica. VIII. Construtos do domínio de ligação Fc-antígeno

[00429] No general, a invenção apresenta construtos do domínio de ligação Fc-antígeno que têm 2-10 domínios Fc e um ou mais domínios de ligação ao antígeno ligados. Os mesmos podem ter maior afinidade de ligação e/ou avidez do que um único domínio Fc do tipo selvagem para um receptor de Fc, por exemplo, FcγRIIIa. A invenção divulga mé- todos de manipulação de aminoácidos na interface de dois domínios constantes de anticorpo CH3 em interação, de tal modo dois monômeros do domínio Fc de um domínio Fc formam seletivamente um dímero uns com os outros, evitando, portanto, a formação de muiltímeros ou agre- gados não desejados. Um construto do domínio de ligação Fc-antígeno inclui um número igual de monômeros do domínio Fc, com cada par de monômeros do domínio Fc formando um domínio Fc. Um construto do domínio de ligação Fc-antígeno inclui, no mínimo, dois domínios Fc fun- cionais formados a partir de um dímero de quatro monômeros do domí- nio Fc e um domínio de ligação ao antígeno. O domínio de ligação ao antígeno pode ser ligado a um domínio Fc por exemplo, com um ligante, um espaçador, uma ligação peptídica, uma ligação química ou fração do produto químico. Em algumas modalidades, a invenção refere-se aos métodos da manipulação de um conjunto das substituições de aminoá- cido selecionadas das Tabelas 4 e 5 na interface de um primeiro par dos dois domínios constantes de anticorpo CH3 em interação, e manipula-

ção de um segundo conjunto de substituições de aminoácido seleciona- das das Tabelas 4 e 5, diferente do primeiro conjunto de substituições de aminoácido, na interface de um segundo par de dois domínios cons- tantes de anticorpo CH3 em interação, de modo que o primeiro par de dois monômeros do domínio Fc de um domínio Fc forma seletivamente um dímero entre si e o segundo par de dois monômeros do domínio Fc de um domínio Fc forma seletivamente um dímero entre si, assim impe- dindo a formação de multímeros ou de agregados não desejados.

[00430] Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados em muitos tipos diferentes de estruturas usando os domínios Fc de heterodimerização, opcionalmente com os domínios Fc de homo- dimerização, descritos neste documento. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados a partir dos domínios Fc em tandem assimétricos. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados a partir dos domínios Fc unicamente ramificados, onde o ponto de ramificação está no domínio Fc do terminal N. Os cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados a partir dos domínios Fc unicamente ramificados, onde o ponto de ramificação está no domínio Fc do terminal C. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados a partir dos domínios Fc unicamente ramificados, onde o ponto de ramificação não está nem no terminal N nem no terminal C do domínio Fc..

[00431] Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados para formar construtos biespecíficos, triespecíficos ou multi- específicos usando cadeias longas e curtas com sequências do domínio de ligação ao antígeno diferentes (por exemplo, FIG. 4 - FIG. 13; FIG. 16 - FIG. 36). Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno podem ser montados para formar construtos biespecíficos, triespecíficos ou multiespecíficos usando cadeias com conjuntos de mutações de hete-

rodimerização e/ou mutações de homodimerização diferentes e domí- nios de ligação ao antígeno diferentes. As mutações de heterodimeriza- ção e/ou homodimerização podem orientar a formação específica para muitos tipos diferentes de estruturas de construtos, permitindo a coloca- ção de domínios de ligação ao antígeno de especificidades diferentes nos locais de construto escolhidos particulares, desencorajando a for- mação de construtos com estruturas indesejadas ou inesperadas. Um construto do domínio de ligação Fc-antígeno biespecífico inclui dois do- mínios de ligação ao antígeno diferentes. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno biespecíficos incluem três domínios de ligação ao antígeno diferentes. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno mul- tiespecífico pode incluir mais de três domínios de ligação ao antígeno diferentes.

[00432] O domínio de ligação ao antígeno pode ser ligado ao cons- truto do domínio de ligação Fc-antígeno de muitas maneiras. O domínio de ligação ao antígeno pode ser expresso como uma proteína de fusão de uma cadeia de Fc. O componente de cadeia pesada do antígeno pode ser expresso como uma proteína de fusão de uma cadeia de Fc e um componente de cadeia leve pode ser expresso como um polipeptí- deo separado. Em algumas modalidades, um scFv é usado como um domínio de ligação ao antígeno. O scFv pode ser expresso como uma proteína de fusão da cadeia longa de Fc. Em algumas modalidades, os componentes de cadeias leve e pesada são expressos separadamente e adicionados de maneira exógena ao construto do domínio de ligação Fc-antígeno. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí- geno é expresso separadamente e posteriormente ligado construto do domínio de ligação Fc-antígeno com uma ligação química.

[00433] Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos de Fc em construto do domínio de ligação Fc-antígeno não possuem um resí-

duo de lisina C-terminal. Em algumas modalidades, todos os polipeptí- deos de Fc em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno não possuem um resíduo de lisina C-terminal. Em algumas modalidades, a ausência de uma lisina C-terminal em um ou mais polipeptídeos de Fc em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode aprimorar a homogeneidade de uma população de um construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno (por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc- antígeno com três domínios Fc), por exemplo, uma população de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc que é pelo menos 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% homogênea.

[00434] Em algumas modalidades, o Asp N-terminal ou mais entre primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto ou sexto polipeptídeos em um construto do domínio de ligação Fc-antígeno descrito neste documento (por exemplo, polipeptídeos 2202, 2222 e 2224 na FIG. 16, 2302, 2332, 2334 e 2336 na FIG. 17, 2402, 2404, 2434 e 2436 na FIG. 18, 2502, 2504, 2534 e 2536 na FIG. 19, 2602, 2604, 2606, 2652, 2654 e 2656 na FIG. 20, 2702, 2704, 2706, 2752, 2754 e 2756 na FIG. 21, 2802, 2804, 2806, 2852, 2854 e 2856 na FIG. 22, 2902, 2916, e 2920 na FIG. 23, 3002, 3024 e 3026 na FIG. 24, 3102, 312 e 3126 na FIG. 25, 3202, 3224, 3228 e 3230 na FIG. 26, 3302, 3332, 3334 e 3336 na FIG. 27, 3402, 3432, 3434 e 3436 na FIG. 28, 3502, 3504, 3534 e 3536 na FIG. 29, 3602, 3604, 3612, 3618, 3642 e 3644 na FIG. 30, 3702, 3704, 3706, 3752, 3754 e 3756 na FIG. 31, 3802, 3804, 3834 e 3836 na FIG. 32, 3902, 3904, 3910, 3916, 3942 e 3944 na FIG. 33, 4002, 4004, 4006, 4052, 4054 e 4056 na FIG. 34, 4102, 4104, 4110, 4132, 4142 e 4144 na FIG. 35, 4202, 4204, 4206, 4252, 4254 e 4256 in FIG. 36) pode ser mu- tado para Gln.

[00435] Para os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno exem- plares descritos nos Exemplos neste documento, os construtos 1-28 do domínio de ligação Fc-antígeno podem conter pares da carga de E357K e de K370D nas subunidades "Knobs" e "Holes", respectivamente. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno 29-42 podem usar as mu- tações de orientação eletrostática ortogonais que podem conter o pare- amento de E357K e de K370D, e também poderiam incluir mutações de orientação adicionais. Para construtos do domínio de ligação Fc-antí- geno 29-42 com mutações de orientação eletrostática de "knobs" e "ho- les" ortogonais são requeridos todos menos um dos pares ortogonais, e podem ser incluídos em todos os pares ortogonais.

[00436] Em algumas modalidades, se dois "knobs" e "holes" ortogo- nais forem requeridos, a modificação de orientação eletrostática para "Knob1" pode ser E357K e a modificação de orientação eletrostática para "Hole1" pode ser K370D, e a modificação de orientação eletrostá- tica para "Knob2" pode ser K370D e a modificação de orientação ele- trostática para "Hole2" pode ser E357K. Se houver a necessidade de um terceiro "knob" e "hole" ortogonais (por exemplo, para um anticorpo triespecífico) modificações de orientação eletrostática E357K e D399K podem ser adicionadas para "Knob3" e as modificações de orientação eletrostática K370D e K409D podem ser adicionadas para "Hole3" ou as modificações de orientação eletrostática K370D e K409D podem ser adicionadas para "Knob3" e as modificações de orientação eletrostática E357K e D399K podem ser adicionadas para "Hole3".

[00437] Qualquer um dos construtos do domínio de ligação Fc-antí- geno exemplares descrito neste documento (por exemplo, construtos do domínio de ligação Fc-antígeno 1-42) pode ter função efetora potencia- lizada em um ensaio de citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC), um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) e/ou ensaio de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) em relação a um construto com um único domínio Fc e o domínio de ligação ao antígeno, ou pode incluir uma atividade biológica que não é exibida por um construto com um único domínio Fc e o domínio de ligação ao antígeno. IX. Produção de células hospedeiras e de proteína

[00438] Na presente invenção, uma célula hospedeira se refere a um veículo que inclui os componentes celulares necessários, por exemplo, organelas, para expressar polipeptídeos e construtos descritos neste documento a partir de seus ácidos nucleicos correspondentes. Os áci- dos nucleicos podem ser incluídos em vetores de ácido nucleico que podem ser introduzidos na célula hospedeira por técnicas convencio- nais conhecidas na técnica (transformação, transfecção, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, etc.). As células hospedeiras podem ser de origem mamífera, bacteriana, de fungos ou de insetos. As células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não es- tão limitadas a, CHO (ou cepas de células derivadas de CHO, por exem- plo, CHO-K1, CHO-DXB11 CHO-DG44), células hospedeiras murinas (por exemplo, NS0, Sp2/0), VERY, HEK. (por exemplo, HEK293), BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, CRL7O3O e células HsS78Bst. Também podem ser escolhidas células hospedeiras que modulem a expressão dos construtos protei- cos, ou modifiquem e processem o produto proteico da maneira especí- fica desejada. Células hospedeiras diferentes têm características e me- canismos específicos para o processamento pós-traducional e modifi- cação de produtos proteicos. As linhas de célula apropriadas ou siste- mas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a correta modifi- cação e processamento da proteína expressa.

[00439] Para a expressão e secreção de produtos proteicos a partir de seus construtos plasmidiais de DNA correspondentes, as células hospedeiras podem ser transfectadas ou transformadas com DNA con- trolado por elementos de controle de expressão adequados conhecidos na técnica, incluindo o promotor, potencializador, sequências, extermi-

nadores de transcrição, sítios de poliadenilação e marcadores selecio- náveis. Os métodos para a expressão de proteínas terapêuticas são co- nhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2ª ed. edição de 2004 (20 de julho de 2004); Vladimir Voynov e Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Pro- teins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2ª ed. edição de 2012 (28 de junho de 2012).

[00440] Em algumas modalidades, pelo menos 50% do construto do domínio de ligação Fc-antígeno que são produzidos por uma célula hos- pedeira transfectada com construtos de plasmídeo do DNA que codifi- cam os polipeptídeos que se unem para formar o construto de Fc, por exemplo, no sobrenadante da cultura celular, são estruturalmente idên- ticos (em uma base molar), por exemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% dos construtos de Fc são estruturalmente idênticos. X. Afucosilação

[00441] Cada monômero de Fc inclui um sítio de N-glicosilação na Asn 297. O glicano pode estar presente em um número de diferentes formas em um dado monômero de Fc. Em uma composição contendo anticorpos ou os construtos de ligação Fc-antígeno descritos neste do- cumento, os glicanos podem ser bastante heterogêneos e a natureza do presente glicano pode depender, entre outras coisas, do tipo de cé- lulas usadas para produzir os anticorpos ou construtos de ligação Fc- antígeno, as condições de crescimento para as células (incluindo os meios de crescimento) e purificação pós-produção. Em vários casos, as composições contendo um construto descrito neste documento são afu- cosilados até certo ponto, pelo menos. Por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% dos glicanos (por exemplo, os glicanos de Fc) presentes na composição não possuem um resíduo de fucose. Assim, 5%-60%,

5%-50%, 5%-40%, 10%-50%, 10%-50%, 10%-40%, 20%-50%, ou 20%- 40% dos glicanos não têm resíduo de fucose. Composições que são afucosiladas até pelo menos certo ponto podem ser produzidas por cé- lulas de cultura produtoras de anticorpos na presença de inibidor de 1,3,4-Tri-O-acetil-2-deoxi-2-fluoro-L-fucose. Formas relativamente afu- cosiladas dos construtos e polipeptídeos descritos neste documento po- dem ser produzidas usando uma variedade de outros métodos, inclu- indo: expressar em células com expressão de FUT8 reduzida ou au- sente e expressar em células que superexpressam beta-1,4-manosil- glicoproteína 4-beta-N-acetilglucosamiltransferase (GnT-III). XI. Purificação

[00442] Um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica de purificação pro- teica, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca de íons, afini- dade (por exemplo, afinidade de Proteína A) e cromatografia em coluna por exclusão de tamanho), centrifugação, solubilidade diferenciada ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Por exemplo, um construto do domínio de ligação Fc-antígeno pode ser iso- lado e purificado adequadamente selecionando e combinando colunas de afinidade como coluna da Proteína A com colunas de cromatografia, filtração, ultra filtração, procedimentos de "salting-out" e de diálise (ver, por exemplo, Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009; e Subramanian (ed.) Antibodies- Volume I-Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publis- hers, Nova York (2004)).

[00443] Em alguns casos, um construto do domínio de ligação Fc- antígeno pode ser conjugado a um ou mais peptídeos de purificação para facilitar a purificação e isolamento do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno a partir de, por exemplo, toda a mistura de lisado celu- lar. Em algumas modalidades, o peptídeo de purificação se liga a outra fração que tenha uma afinidade específica pelo peptídeo de purificação.

Em algumas modalidades, essas frações que se ligam especificamente ao peptídeo de purificação estão ligadas a um suporte sólido, tal como uma matriz, uma resina, ou esferas de agarose.

Os exemplos de peptí- deos de purificação que podem ser unidos a um construto do domínio de ligação Fc-antígeno incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de hexa-histidina (SEQ ID NO: 38), um peptídeo FLAG, um peptídeo myc e um peptídeo de hemaglutinina (HA). Um peptídeo de hexa-histi- dina (SEQ ID NO: 38) (HHHHHH (SEQ ID NO: 38)) se liga à coluna de afinidade de agarose funcionalizada com níquel com afinidade micro- molecular.

Em algumas modalidades, um peptídeo FLAG inclui a se- quência DYKDDDDK (SEQ ID NO: 39). Em algumas modalidades, um peptídeo FLAG inclui múltiplos inteiros da sequência DYKDDDDK (SEQ ID NO: 39) na série em tandem, por exemplo, 3xDYKDDDDK (SEQ ID NO: 309). Em algumas modalidades, um peptídeo myc inclui a sequên- cia EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 40). Em algumas modalidades, um pep- tídeo myc inclui múltiplos inteiros da sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 40) na série em tandem, por exemplo, 3xEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 310). Em algumas modalidades, um peptídeo HA inclui a sequência YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, um peptídeo HA inclui múltiplos inteiros da sequência YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 41) na série em tandem, por exemplo, 3xYPYDVPDYA (SEQ ID NO: 311). Os anticorpos que especificamente reconhecem e se ligam ao peptídeo de purificação FLAG, myc ou HA são bem conhecidos na técnica e ge- ralmente estão comercialmente disponíveis.

Um suporte sólido (por exemplo, uma matriz, uma resina ou grânulos de agarose) funcionali- zado com estes anticorpos pode ser usado para purificar um construto do domínio de ligação Fc-antígeno que inclui um peptídeo FLAG, myc ou HA.

[00444] Para os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno, a cro- matografia em coluna da Proteína A pode ser empregada como um pro- cesso de purificação. Os ligantes da Proteína A interagem com os cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno através da região Fc, tornando a cromatografia de Proteína A um processo de captura altamente sele- tivo que é capaz de remover a maior parte das proteínas de célula hos- pedeira. Na presente invenção, os construtos do domínio de ligação Fc- antígeno podem ser purificados usando a cromatografia por coluna de Proteína A, como descrito no Exemplo 5.

[00445] Em algumas modalidades, o uso de domínios de heterodi- merização e/ou homodimerização descritos neste documento permite a preparação de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno com 60% ou mais pureza, ou seja, em que 60% ou mais do material do cons- truto proteico produzido nas células tem a estrutura de construto de Fc desejada, por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% do material de construto de Fc em uma preparação que tem a estrutura de construto de Fc desejada. Em algu- mas modalidades, menos de 30% do material de construto proteico em uma preparação de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno tem uma estrutura de construto de Fc não desejada (por exemplo, uma espécie de ordem superior do construto, como descrito no Exemplo 1) por exemplo, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou me- nos do material de construto proteico em uma preparação tem uma es- trutura de construto de Fc não desejado. Em algumas modalidades, a pureza final de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno, após purificação adicional usando um ou mais métodos conhecidos de purifi- cação (por exemplo, purificação de afinidade de Proteína A), pode ser 80% ou mais, ou seja, em que 80% ou mais do material de construto proteico purificado tem a estrutura de construto de Fc desejada, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% do material de construto proteico em uma preparação tem a estrutura de construto de Fc desejada. Em algumas modalidades, menos de 15% do material de construto proteico em uma preparação de um construto do domínio de ligação Fc-antígeno que é ainda mais purificado usando um ou mais métodos conhecidos de purificação (por exemplo, purificação de afinidade de Proteína A) tem uma estrutura de construto de Fc inde- sejada (por exemplo, uma espécie de ordem superior do construto, como descrito no Exemplo 1), por exemplo, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos do material de construto proteico na preparação tem uma estrutura de construto de Fc indesejada. XII. Composições/preparações farmacêuticas

[00446] A invenção apresenta composições farmacêuticas que in- cluem um ou mais construtos do domínio de ligação Fc-antígeno descri- tos neste documento. Em uma modalidade, uma composição farmacêu- tica inclui uma população substancialmente homogênea de construtos do domínio de ligação Fc que são idênticas ou substancialmente idênti- cas na estrutura. Em vários exemplos, a composição farmacêutica inclui uma população substancialmente homogênea de qualquer um dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno 1-42.

[00447] Um construto de proteína terapêutica, por exemplo, um cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno descrito neste documento (por exemplo, um construtos do domínio de ligação Fc-antígeno tendo três domínios Fc), da presente invenção pode ser incorporado em uma com- posição farmacêutica. As composições farmacêuticas que incluem pro- teínas terapêuticas podem ser formuladas por métodos conhecidos pe- los versados na técnica. A composição farmacêutica pode ser adminis- trada parentericamente na forma de uma formulação injetável incluindo uma solução ou suspensão estéril em água ou outro líquido farmaceuti- camente aceitável. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada combinando apropriadamente o construto do domínio de li- gação Fc-antígeno com veículos ou meios farmaceuticamente aceitá- veis, como água estéril para injeção (WFI), soro fisiológico, emulsio- nante, agente de suspensão, surfactante, estabilizador, diluente, agluti- nante, excipiente, seguidos de mistura em forma de dose unitária ne- cessária para práticas farmacêuticas geralmente aceitas. A quantidade de ingrediente ativo incluído nas preparações farmacêuticas é tal que uma dose apropriada dentro da faixa designada é fornecida.

[00448] A composição estéril para injeção pode ser formulada em conformidade com práticas farmacêuticas convencionais usando água destilada para injeção como um veículo. Por exemplo, o soro fisiológico ou uma solução isotônica contendo glicose e outros suplementos tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio podem ser usados como uma solução aquosa para injeção, opcionalmente em combinação com um agente solubilizante adequado, por exemplo, ál- cool tal como etanol e poliálcool tal como propilenoglicol ou polietileno- glicol, e um surfactante não iônico, tal como polissorbato 80TM, HCO-50 e semelhantes comumente conhecidos na técnica. Os métodos de for- mulação para os produtos proteicos terapêuticos são conhecidos na téc- nica, ver por exemplo, Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2ª ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006). XIII. Métodos de Tratamento e Dosagem

[00449] Os construtos descritos neste documento podem ser usados para tratar distúrbios que são tratados pelo anticorpo (anticorpos) do qual o domínio (domínios) de ligação ao antígeno é derivado. Por exem- plo, quando o construto tem um domínio de ligação ao antígeno que reconhece CD38, o construto pode ser usado para tratar uma variedade de cânceres (por exemplo, malignidades hematológicas e tumores sóli-

dos) e doenças autoimunes. As composições farmacêuticas são admi- nistradas de maneira compatível com a formulação de dosagem e na quantidade que seja terapeuticamente eficaz para resultar em melhoria ou remediação dos sintomas. As composições farmacêuticas são admi- nistradas em uma variedade de formas de dosagem, por exemplo, for- mas de dosagem intravenosas, formas de dosagem subcutâneas, for- mas de dosagem orais, tais como soluções ingeríveis, cápsulas de libe- ração de fármacos e semelhantes. A dosagem apropriada para o sujeito individual depende dos objetivos terapêuticos, a via de administração e a condição do paciente. Geralmente, as proteínas recombinantes são dosadas em 1-200 mg/kg, por exemplo, 1-100 mg/kg, por exemplo, 20- 100 mg/kg. Em conformidade, será necessário que um médico adeque e meça a concentração da dosagem e modifique a via de administração como necessário para obter o efeito terapêutico ideal. XIV. Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC)

[00450] Construtos do domínio de ligação Fc-antígeno descritos nesta invenção são capazes de ativar várias funções efetoras mediados pelo receptor Fc. Um componente do sistema imunológico é o sistema de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), uma parte do sis- tema imunológico inato que potencializa a capacidade de anticorpos e células fagocíticas de limpar patógenos estranhos. Três vias bioquími- cas ativam o sistema do complemento: a via do complemento clássico, a via do complemento alternativa, e a via de lectina, que implicam um conjunto complexo de ativação complexa e cascatas de sinalização.

[00451] Na via do complemento clássica, IgG ou IgM desencadeiam a ativação do complemento. A proteína C1q se liga a esses anticorpos depois de terem se ligado a um antígeno, formando o complexo C1. Este complexo gera C1s esterase, que cliva e ativa as proteínas C4 e C2 em C4a e C4b, e C2a e C2b. Os fragmentos C2a e C4b formam então um complexo proteico chamado C3 convertase, que cliva C3 em C3a e C3b,

levando a uma amplificação de sinal e formação do complexo de ataque de membrana.

[00452] Os construtos de domínio de ligação Fc-antígeno desta in- venção são capazes de melhorar a atividade do CDC pelo sistema imu- nológico.

[00453] O CDC foi avaliado por um ensaio colorimétrico no qual cé- lulas Raji (ATCC) foram revestidas com um anticorpo diluído serial- mente, construto do domínio de ligação Fc ou IVIg. O complemento de soro humano (Quidel) pode ser adicionado a todos os poços a 25% v/v e incubado por 2 h a 37°C. As células podem ser incubadas por 12 h a 37°C após adição de reagente de proliferação celular WST-1 (Roche Applied Science). As placas podem então ser colocadas em um agitador por 2 minutos e absorbância a 450 nm pode ser medida. XV. Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC)

[00454] Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno desta in- venção também são capazes de potencializar a atividade de citotoxici- dade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) pelo sis- tema imunológico. A ADCC é uma parte do sistema imunológico adap- tativo onde anticorpos se ligam a antígenos superficiais de patógenos estranhos e os direcionam para eliminação. A ADCC envolve a ativação de células natural killer (NK) por anticorpos. As células NK expressam receptores Fc, que se ligam a porções Fc de anticorpos como IgG e IgM. Quando os anticorpos são ligados à superfície de uma célula alvo infec- tada por patógenos, eles então se ligam às células NK e as ativam. As células NK liberam citocinas como IFN-γ, e proteínas como perforina e granzimas. Perforina é um poro formando citolisina que oligomeriza na presença de cálcio. Granzimas são proteases de serinas que induzem morte celular programada em células alvo. Além às células NK, os ma- crófagos, os neutrófilos e os eosinófilos podem também mediar a ADCC.

[00455] A ADCC pode ser avaliada usando um ensaio de lumines- cência. Células efetoras NK primárias humanas (Hemacare) são des- congeladas e repousadas durante a noite a 37 °C em meio de cresci- mento de linfócitos-3 (Lonza) a 5x105/ mL. No dia seguinte, as células alvo Raji da linhagem celular linfoblastoide humana (ATCC CCL-86) são colhidas, ressuspensas em meios de ensaio (RPMI livre de vermelho de fenol, 10% de FBSΔ, GlutaMAX ™) e plaqueadas na presença de várias concentrações de cada sonda de interesse por 30 minutos a 37 °C. As células NK em repouso são então colhidas, ressuspensas em meios de ensaio e adicionadas às placas contendo as células Raji revestidas com anti-CD20. As placas são incubadas a 37 °C durante 6 horas com a proporção final de células efetoras para células alvo de 5:1 (5x104 célu- las NK: 1x104 Raji).

[00456] O kit de Ensaio de Citotoxicidade CytoTox-Glo™ (Promega) é usado para determinar a atividade ADCC. O ensaio CytoTox-Glo ™ usa um substrato de peptídeo luminogênico para medir a atividade da protease das células mortas, que é liberada pelas células que perderam a integridade da membrana, por exemplo, células Raji lisadas. Após o período de incubação de 6 horas, o reagente preparado (substrato) é adicionado a cada poço da placa e colocado em um agitador de placa orbital por 15 minutos em temperatura ambiente. A luminescência é me- dida usando o leitor de placas PHERAstar F5 (BMG Labtech). Os dados são analisados após as leituras das condições de controle (células NK + Raji apenas) serem subtraídas das condições de teste para eliminar o fundo. XVI. Fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP)

[00457] Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno desta in- venção também são capazes de potencializar a atividade de fagocitose mediada por células dependentes de anticorpos (ADCP) pelo sistema imunológico. A ADCP, também conhecida como opsonização de anti- corpos, é o processo pelo qual um patógeno é marcado para ingestão e eliminação por um fagócito. Os fagócitos são células que protegem o corpo ingerindo patógenos estranhos nocivos e células mortas ou mor- rendo. O processo é ativado por padrões moleculares associados a pa- tógenos (PAMPS), que levam à ativação de NF-κB. Opsoninas, como C3b e anticorpos, podem se ligar a patógenos alvo. Quando um alvo é revestido com opsonina, os domínios Fc atraem fagócitos por meio de seus receptores Fc. Os fagócitos então envolvem as células e o fagos- somo do material ingerido é fundido com o lisossoma. O fagolisossomo subsequente então digere proteoliticamente o material celular.

[00458] A ADCP pode ser avaliada usando um ensaio de biolumines- cência. A fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) é um importante mecanismo de ação dos anticorpos terapêuti- cos. A ADCP pode ser mediada por monócitos, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas via FcγRIIa (CD32a), FcγRI (CD64) e FcγRIIIa (CD16a). Todos os três receptores podem participar no reconhecimento de anticorpos, agrupamento de receptores imunológicos e eventos de sinalização que resultam em ADCP; no entanto, estudos de bloqueio sugerem que FcγRIIa é o receptor Fcγ predominante envolvido neste processo.

[00459] O Bioensaio de Repórter ADCP FcγRIIa-H é um ensaio de bioluminescência baseado em células que pode ser usado para medir a potência e estabilidade de anticorpos e outros produtos biológicos com domínios Fc que se ligam e ativam especificamente FcγRIIa. O ensaio consiste em uma linhagem de células T Jurkat geneticamente modifi- cada que expressa a variante FcγRIIa-H humana de alta afinidade que contém uma Histidina (H) no aminoácido 131 e um repórter de luciferase conduzido por um elemento de resposta a NFAT (NFAT-RE).

[00460] Quando co-cultivadas com uma célula alvo e anticorpo rele- vante, as células efetoras FcγRIIa-H ligam-se ao domínio Fc do anti- corpo, resultando na sinalização de FcγRIIa e atividade de luciferase mediada por NFAT-RE. O sinal bioluminescente é detectado e quantifi- cado com um ensaio de Luciferase e um luminômetro padrão. Exemplos

[00461] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos versados na técnica uma invenção e descrição completas de como os métodos e compostos reivindicados neste documento são realiza- dos, feitos e avaliados e se destinam a ser puramente exemplares da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Exemplo 1. Uso de domínios de heterodimerização ortogonais para controlar a montagem de polipeptídeos contendo domínio Fc-antí- geno linear

[00462] Uma variedade de abordagens para anexar domínios Fc aos terminais C de anticorpos foram descritos, incluindo a produção de construtos Fc em tandem com e sem ligantes peptídicos entre domínios Fc (ver, por exemplo, Nagashima et al., Mol Immunol, 45: 2752-63, 2008, e Wang et al. MAbs, 9: 393-403, 2017). No entanto, os métodos descritos na literatura científica para produzir construtos de anticorpos com múltiplos domínios Fc são limitados em sua eficácia porque esses métodos resultam na produção de numerosas espécies indesejadas de proteínas contendo o domínio Fc. Essas espécies têm pesos molecula- res diferentes que resultam de associação fora de registro não contro- lada de cadeias polipeptídicas durante a produção do produto, resul- tando em uma escada de pesos moleculares (ver, por exemplo, Na- gashima et al., Mol Immunol, 45:2752-63, 2008, e Wang et al. MAbs, 9:393-403, 2017). As FIG. 1 e FIG. 2 representam esquematicamente alguns exemplos das espécies de proteínas com múltiplos domínios Fc de vários pesos moleculares que podem ser produzidos pela associa- ção fora de registro de polipeptídeos contendo dois monômeros de Fc em tandem (FIG. 1) ou três monômeros de Fc em tandem (FIG. 3). Con- sistentemente, alcançar um construto do domínio de ligação Fc-antí- geno desejado com vários domínios Fc tendo um peso molecular defi- nido usando essas abordagens existentes requer a remoção de espé- cies de ordem superior (HOS) com pesos moleculares maiores, o que reduz muito o rendimento do construto desejado.

[00463] O uso de domínios de heterodimerização ortogonais permitiu a produção de estruturas com extensões Fc em tandem sem também gerar grandes quantidades de espécies de ordem superior (HOS). As FIGs. 3A e 3B representam exemplos de construtos do domínio de liga- ção Fc-antígeno lineares ortogonais com dois domínios Fc (FIG. 3A) ou 3 domínios Fc (FIG. 3B) que são produzidos pela união de um polipep- tídeo longo com vários monômeros do domínio Fc a dois polipeptídeos curtos diferentes, cada um com um único monômero de Fc. Nestes exemplos, um domínio Fc de cada construto inclui mutações "knobs- into-holes" em combinação com uma mutação de carga inversa na in- terface CH3-CH3 do domínio Fc e duas mutações de carga inversa na interface CH3-CH3 de qualquer 1 do outro domínio Fc (FIG. 3A) ou 2 outros domínios Fc (FIG. 3B). Cadeias polipeptídicas curtas com monô- meros de Fc tendo as duas mutações de carga inversa têm uma afini- dade mais baixa para o monômero de Fc de cadeia longa com mutações formadoras de protuberância e uma mutação de carga inversa única, e são muito mais propensos a se ligar ao(s) monômero(s) Fc de cadeia longa tendo 2 mutações de carga inversa compatíveis. As cadeias poli- peptídicas curtas com monômeros de Fc tendo mutações formadoras de cavidade em combinação com uma mutação de carga inversa são muito mais propensas a se ligar ao monômero de Fc de cadeia longa tendo mutações formadoras de protuberância em combinação com uma mutação de carga inversa compatível.

[00464] As mutações de heterodimerização ortogonais também po- dem ser usadas para montar construtos do domínio de ligação Fc-antí- geno biespecíficos ou multiespecíficos, colocando domínios de ligação ao antígeno particulares com especificidade diferente nos domínios Fc específicos nos construtos, reduzindo a geração de espécies proteicas indesejadas, como espécies de ordem superior. Os Exemplos 3, 4 e 7- 27 mostram alguns exemplos de construtos do domínio de ligação Fc- antígeno multiespecíficos que podem ser produzidos pela introdução de mutações de heterodimerização ortogonais (opcionalmente com muta- ções de homodimerização) nos domínios Fc. Exemplo 2. Ligação de diversos domínios de ligação ao antígeno aos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno

[00465] Muitos tipos de domínios de ligação ao antígeno baseados em anticorpo podem estar ligados em várias combinações e conforma- ções aos domínios Fc dos construtos do domínio de ligação Fc-antígeno usando mutações de heterodimerização. Por exemplo, os domínios de ligação ao antígeno de Fab ou relacionados a Fab podem estar ligados a domínios Fc particulares para gerar construtos Fc com especificidade para múltiplos antígenos. A FIG. 4 ilustra alguns exemplos dos constru- tos do domínio de ligação Fc-antígeno com a mesma estrutura básica de 3 domínios Fc, mas com componentes do domínio de ligação ao an- tígeno diferentes. Para fins de exemplo, cada um dos construtos de Fc biespecíficos na Fig. 4 têm dois polipeptídeos de cadeia longa diferen- tes, cada uma contendo dois monômeros do domínio Fc, que são unidos em um domínio Fc "de haste" que se forma quando um monômero de Fc com uma cadeia longa contendo duas mutações de carga inversa se associa a um monômero de Fc de outra cadeia longa contendo duas mutações de carga inversa compatíveis. Apesar de cada monômero dos domínios Fc de haste nesta figura ter duas mutações de carga inversa,

os monômeros de Fc podem ser designados para incluir mutações de carga inversa compatíveis adicionais (mais de duas). Cada polipeptídeo de cadeia longa também compreende um monômero do domínio Fc contendo mutações formadoras de protuberância e uma mutação de carga inversa que é compatível com o monômero do domínio Fc de um polipeptídeo menor que tem mutações formadoras cavidade e uma mu- tação de carga inversa compatível. Os polipeptídeos de cadeia longa e os polipeptídeos de cadeia curta podem incluir um ou mais domínios de ligação ao antígeno.

[00466] A FIG. 4A ilustra que uma cadeia leve comum pode ser usada com múltiplos domínios Fab (dois domínios Fab neste exemplo) com especificidades alvo diferentes. Vide Merchant et al., Nat. Bio- technol., 16:677-681, 1998, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. A maturação de afinidade das porções de cadeia pesada de Fab do construto pode ser necessária.

[00467] A FIG. 4B ilustra que um domínio de ligação ao antígeno de cadeia única (por exemplo, fragmento variável de cadeia única (scFv), pesada variável (VHH) ou receptor de antígeno novo variável (VNAR)) com uma primeira especificidade pode ser incorporado em uma posição (por exemplo, N-terminal ou C-terminal para um domínio Fc) e um Fab com uma segunda especificidade alvo pode ser incorporado em outra posição (por exemplo, no outro terminal do mesmo domínio Fc ou no terminal N ou terminal C de outro domínio Fc) com ou sem o uso de ligantes peptídicos entre os domínios de ligação ao antígeno e os domí- nios Fc. Vide Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol., 15:159-63, 1997, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

[00468] A FIG. 4C ilustra que um domínio de ligação ao antígeno de cadeia única (por exemplo, um scFv, VHH ou VNAR) com uma primeira especificidade alvo pode ser fundido ao terminal N de cadeia pesada ou leve com uma segunda especificidade com ou sem o uso de um ligante peptídico entre os domínios. Vide Dimasi et al., J. Mol. Biol., 393:672- 92, 2009, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

[00469] A FIG. 4D ilustra que a cadeia pesada ou leve com uma pri- meira especificidade pode ser fundida ao terminal N de um domínio de ligação ao antígeno de cadeia única (por exemplo, um scFv, VHH ou VNAR) com uma segunda especificidade alvo. Vide Lu et al., J. Immu- nol. Methods, 267:213-26, 2002, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

[00470] A FIG. 4E ilustra que dois domínios de ligação ao antígeno de cadeia única diferentes (por exemplo, scFv, VHH ou VNAR) com es- pecificidades diferentes podem ser incorporados em posições diferentes do construto (por exemplo, nos terminais N ou terminais C de vários domínios Fc) com ou sem o uso de ligantes peptídicos aos domínios Fc. Vide Connelly et al., Int. J. Immunol., 10:1863-72, 1998, o qual é incor- porado a este documento por referência em sua totalidade.

[00471] A FIG. 4F ilustra que múltiplos domínios de ligação ao antí- geno de cadeia única podem ser fundidos em tandem, com ou sem o uso de ligante peptídico entre eles. Vide Hayden et al., Ther. J. Immu- nol., 1:3-15, 1994, o qual é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. Os domínios de ligação ao antígeno de cadeia única podem ter especificidades alvo diferentes.

[00472] A FIG. 4G ilustra que os domínios variáveis podem ser tro- cados entre componentes de cadeia pesada e leve de um dos domínios de ligação ao antígeno para evitar pareamento incorreto de cadeia leve. Vide WO 2009/080251, o qual é incorporado a este documento por re- ferência em sua totalidade.

[00473] A FIG. 4H ilustra que um diabody ou diabody de cadeia única pode ser fundido a um ou mais domínios Fc, com ou sem o uso de um ligante peptídico.

[00474] A FIG. 4I ilustra que um scFv pode ser fundido ao domínio CH1 em uma cadeia polipeptídica e um scFv com uma especificidade alvo diferente pode ser fundido ao domínio CL em outra cadeia polipep- tídica. Vide Zuo et al., Protein Eng., 13:361-7, 2000, o qual está incor- porado a este documento por referência em sua totalidade.

[00475] A FIG. 4J ilustra que mutações, selecionadas, por exemplo, da Tabela 3, podem ser introduzidas às sequências de cadeia leve e pesada de um ou mais domínios Fab para promover o pareamento es- pecífico dos domínios de cadeia leve e pesada de cada Fab.

[00476] Enquanto todos esses exemplos mostram os domínios de li- gação ao antígeno como sendo ligados aos terminais N dos polipeptí- deos que se associam aos construtos de Fc, os domínios de ligação ao antígeno também podem, ou alternativamente, estar ligados aos termi- nais C dos polipeptídeos ou ligados aos ligantes dos construtos de Fc, por exemplo, aos ligantes entre domínios Fc. Exemplo 3. Tipos de estruturas de construto de Fc específicos que podem ser gerados usando domínios de heterodimerização orto- gonais

[00477] Domínios de heterodimerização ortogonais com diferentes mutações carga inversa "knob-into-hole" e/ou eletrostáticas seleciona- das das Tabelas 4 e 5 podem ser integrados em diferentes cadeias po- lipeptídicas para controlar o posicionamento de múltiplos domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes e domínios Fc durante a montagem do construto do domínio de ligação Fc-antígeno biespecífico. Uma grande variedade de estruturas dos construtos do do- mínio de ligação Fc-antígeno pode ser gerada usando princípios de de- sign que incorporam pelo menos um, dois ou mais domínios de hetero- dimerização ortogonais nas cadeias polipeptídicas que se agrupam nos construtos de Fc.

[00478] A Fig. 5 representa alguns exemplos de construtos de liga- ção Fc-antígeno biespecíficos ramificados que podem ser montados pela incorporação de um conjunto de mutações de homodimerização (O, O) em um domínio Fc do construto para unir dois polipeptídeos de cadeia longa com 2 ou 3 monômeros de Fc e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade (1, 1). Um conjunto de muta- ções de heterodimerização (H, I ou I, H) é usado para unir o restante dos monômeros de Fc dos polipeptídeos de cadeia longa a um polipep- tídeo de cadeia curta única com um monômero do domínio Fc e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade alvo (2, 2). As FIGs. 5A e 5D representam exemplos de construtos do domí- nio de ligação Fc-antígeno biespecíficos lineares simples que podem ser montados usando apenas um conjunto de mutações de heterodime- rização ortogonais (H, I ou I, H) nos domínios Fc do construto. Todos os terminais N dos polipeptídeos que se agrupam a esses construtos de Fc têm domínios de ligação ao antígeno.

[00479] A FIG. 6 mostra exemplos de alguns construtos do domínio de ligação Fc-antígeno em tandem lineares que podem ser montados usando duas de mais tecnologias de heterodimerização ortogonais. Dois ou mais conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização podem ser usados para controlar a colocação seletiva dos domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes em alguns dos domínios Fc dos construtos, mantendo outros domínios Fc livres de do- mínios de ligação ao antígeno. Nesses exemplos, um polipeptídeo de cadeia longa com 2 ou 3 monômeros do domínio Fc tem um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade (1, 1) ligado ao terminal N. Um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização (H, I ou I, H) é usado para unir um polipeptídeo de cadeia longa a uma pri- meira cadeia polipeptídica pequena com um monômero do domínio Fc, enquanto um segundo conjunto de mutações de heterodimerização (J,

K ou K, J) é usado para unir um segundo polipeptídeo pequeno com um monômero do domínio Fc à cadeia longa. Cada um ou ambos os poli- peptídeos de cadeia pequena diferentes podem ter tanto um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade (2, 2) ou um do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade (1, 1).

[00480] A FIG. 7 ilustra exemplos de construtos do domínio de liga- ção Fc-antígeno biespecíficos ramificados em que apenas alguns dos domínios Fc estão unidos a um domínio de ligação ao antígeno, porque apenas alguns dos polipeptídeos que se agrupam nos construtos de Fc têm domínios de ligação ao antígeno em seus terminais N. Um domínio Fc de homodimerização (O, O) é usado para unir dois polipeptídeos de cadeia longa diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de he- terodimerização são usados para unir cadeias longas a dois polipeptí- deos pequenos diferentes. Um conjunto de mutações de heterodimeri- zação (H, I ou I, H) é usado para unir um monômero de Fc do polipeptí- deo de cadeia longa a um primeiro polipeptídeo de cadeia curta com um monômero de Fc. Um segundo conjunto de mutações de heterodimeri- zação (J, K ou K, J) é usado para unir outro monômero de Fc nos poli- peptídeos de cadeia longa a um segundo polipeptídeo curto com um monômero de Fc. Qualquer um dos polipeptídeos de cadeia longa ou cadeia curta pode ter tanto um primeiro domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade alvo (1, 1) quanto um segundo domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade alvo (2, 2).

[00481] Enquanto os construtos nas FIGs. 5-7 são desenhados com domínios Fab com mutações usadas para controlar a montagem de Fab (A, B ou B, A; C, D ou D, C), outros domínios de ligação ao antígeno podem ser usados em vez disso, por exemplo, domínios de ligação ao antígeno de cadeia única (por exemplo, scFv ou VHH) ou domínios de ligação ao antígeno com cadeias pesadas diferentes que usam uma ca- deia leve comum.

Exemplo 4. Tipos de estruturas do construto de Fc triespecífico que podem ser geradas usando domínios de heterodimerização or- togonais

[00482] Domínios de heterodimerização ortogonais com diferentes mutações carga inversa "knob-into-hole" e/ou eletrostáticas seleciona- das das Tabelas 4 e 5 podem ser integrados em diferentes cadeias po- lipeptídicas para controlar o posicionamento de múltiplos domínios de ligação ao antígeno com especificidades alvo diferentes e domínios Fc durante a montagem do construto do domínio de ligação Fc-antígeno triespecífico. Uma grande variedade de estruturas dos construtos do do- mínio de ligação Fc-antígeno pode ser gerada usando princípios de de- sign que incorporam pelo menos um, dois ou mais domínios de hetero- dimerização ortogonais nas cadeias polipeptídicas que se agrupam nos construtos de Fc.

[00483] A FIG. 8 representa exemplos de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno triespecíficos lineares simples que podem ser mon- tados usando dois conjuntos de mutações de heterodimerização orto- gonais (H, I ou I, H e J, K ou K, J) nos domínios Fc do construto. Os terminais N de todos os polipeptídeos que se agrupam a esses constru- tos de Fc são ligados aos domínios de ligação ao antígeno. Nesses construtos exemplares, um polipeptídeo de cadeia longa com 2 domí- nios Fc está ligado a um domínio de ligação ao antígeno com uma pri- meira especificidade alvo (1, 1 ou *, 1). Cada um dos polipeptídeos de cadeia curta diferentes com um monômero do domínio Fc está ligado tanto a um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifi- cidade (2, 2 ou *, 2) quanto a um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade alvo (3, 3 ou *, 3). Cada um dos domínios de ligação ao antígeno diferentes pode ter mutações que direcionam a montagem (A, B ou B, A, C, D ou D, C e E, F ou F, E) ou pode ter uma cadeia pesada diferente (1, 2 ou 3) e uma cadeia leve comum (*).

[00484] A FIG. 9 e a FIG. 10 mostram que as tecnologias de hetero- dimerização ortogonais também podem ser usadas para produzir cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno ramificados triespecíficos usando um arranjo assimétrico de cadeias polipeptídicas. Na FIG. 9, dois polipeptídeos de cadeia longa, cada um com 2 monômeros do do- mínio Fc e domínios de ligação ao antígeno diferentes (2, 2 ou *, 2 ou *, 3) se unem usando um primeiro conjunto de mutações de heterodimeri- zação (tanto H, I, quanto J, K). Cada uma das cadeias longas se une a um polipeptídeo de cadeia curta com um monômero do domínio Fc e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade (1, 1 ou *, 1) usando um segundo conjunto de mutações de heterodimeri- zação (H, I ou I, H ou J, K ou K, J). A FIG. 10 mostra dois polipeptídeos de cadeia longa, cada um com 3 monômeros do domínio Fc e domínios de ligação ao antígeno diferentes (2, 2 ou *, 2 ou *, 3) se unem usando um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização (tanto H, I, quanto J, K). Cada uma das cadeias longas se une a um polipeptídeo de cadeia curta com um monômero do domínio Fc e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade (1, 1 ou *, 1) usando um segundo conjunto de mutações de heterodimerização (H, I ou I, H ou J, K ou K, J). Os domínios de ligação ao antígeno nos cons- trutos da FIG. 9 e FIG. 10 podem ter mutações que direcionam a mon- tagem da cadeia leve (A, B ou B, A ou C, D ou D, C) ou podem usar uma cadeia leve comum com cadeias pesadas diferentes (1, * ou *, 1, 2, * ou *, 2 ou 3, * ou *, 3).

[00485] As FIG. 11A e a FIG. 11B ilustram exemplos de construtos do domínio de ligação Fc-antígeno triespecíficos que são similares aos construtos da FIG. 10, exceto que eles usam um conjunto de mutações de homodimerização (O, O) para unir dois polipeptídeos de cadeia longa que cada três monômeros do domínio Fc e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade (1, 1, *, 1 ou 1, *). Dois con- juntos diferentes de mutações de heterodimerização são usados para unir as cadeias longas a dois polipeptídeos pequenos diferentes, cada um tendo um monômero do domínio Fc e um domínio de ligação ao antígeno. Um conjunto de mutações de heterodimerização (H, I ou I, H) é usado para unir um monômero de Fc de polipeptídeo de cadeia longa a um primeiro polipeptídeo de cadeia curta única com um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade alvo (2, 2, *, 2 ou 2, *). Um segundo conjunto de mutações de heterodimerização (J, K ou K, J) é usado para unir outro monômero de Fc nos polipeptídeos de cadeia longa a um segundo polipeptídeo curto com um domínio de liga- ção ao antígeno com uma terceira especificidade alvo (3, 3, *, 3 ou 3, *). Os domínios de ligação ao antígeno nos construtos da FIG. 11 podem ter mutações que direcionam a montagem da cadeia leve (A, B ou B, A ou C, D ou D, C) ou podem usar uma cadeia leve comum com cadeias pesadas diferentes (1, * ou *, 1, 2, * ou *, 2 ou 3, * ou *, 3).

[00486] As FIG. 12 e FIG. 13 mostram alguns exemplos de constru- tos do domínio de ligação Fc-antígeno ramificados triespecíficos que têm uma distribuição assimétrica de domínios de ligação ao antígeno e domínios Fc. Dois conjuntos de mutações de heterodimerização ortogo- nais (H, I ou I, H ou J, K ou K, J) são usados para unir os monômeros de Fc de polipeptídeos de cadeia longa diferentes tanto de comprimento variável (2 ou 3 monômeros do domínio Fc) quanto de comprimento igual (2 monômeros do domínio Fc). Dois polipeptídeos de cadeia longa diferentes se ligam a domínios de ligação ao antígeno com especifici- dade alvo diferente, por exemplo, uma segunda especificidade alvo (2, 2) ou uma terceira especificidade alvo (3, 3). Um segundo conjunto de mutações de heterodimerização (H, I ou I, H ou J, K ou K, J) é usado para unir um polipeptídeo de cadeia curta com um monômero do domí-

nio Fc e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especifi- cidade alvo (1, 1) aos monômeros do domínio Fc nos polipeptídeos de cadeia longa.

[00487] Apesar de alguns dos construtos de Fc das FIGs. 8-13 serem desenhados com domínios Fab com mutações usadas para controlar a montagem de Fab (A, B ou B, A; C, D ou D, C), outros domínios de ligação ao antígeno podem ser usados em vez disso, por exemplo, do- mínios de ligação ao antígeno de cadeia única (por exemplo, scFv ou VHH) ou domínios de ligação ao antígeno com cadeias pesadas dife- rentes que usam uma cadeia leve comum. Exemplo 5. Construto de Fc biespecífico direcionado para CD20 e PD-L1

[00488] Um construto do domínio de ligação Fc-antígeno com três domínios Fc em tandem e dois domínios de ligação ao antígeno com especificidade alvo diferente (domínios de ligação ao antígeno anti- CD20 (obinutuzumabe) e anti-PD-L1 (avelumabe)) foi produzido. Os Fabs diferentes tinham domínios CH e CH1 diferentes, mas comparti- lhavam uma cadeia leve comum (VL). O construto de Fc tinha um pri- meiro domínio de ligação ao antígeno ligado ao primeiro domínio Fc (su- perior) e um segundo domínio de ligação ao antígeno ligado ao terceiro domínio Fc (inferior) do construto (FIG. 14A). Uma versão do construto colocou VH e CH1 de anti-CD20 na cadeia de Fc longa e VH e CH1 de anti-PD-L1 na cadeia de Fc curta, enquanto outra versão do construto colocou VH e CH1 de anti-PD-L1 na cadeia de Fc longa e VH e CH1 de anti-CD20 na cadeia curta. Os construtos foram produzidos usando as sequências polipeptídicas da Tabela 9. Os construtos que portam genes que codificam os polipeptídeos necessários para a produção de cons- trutos de Fc foram transfectados em células HEK, os polipeptídeos fo- ram expressos e o meio de células usado foi analisado por SDS-PAGE.

Tabela 9. Sequências para construtos de Fc biespecíficos Construto Cadeia leve Cadeia Fc longa Primeira cadeia de Fc curta Segunda cadeia de (com anti-CD20 VH e CH1) (com anti-CD20 VH e CH1) Fc curta Construto de Fc SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 48 biespecífico DIVMTQTPLSLPVTPGE- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS- EVQLLESGGGLVQPGGSLR- DKTHTCPPCPA- (anti-CD20 e PASISCRSSKSLLHSN- GYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRI- LSCAASGFTFSSYIMMWVR- PELLGG- anti-PD-L1), GITYLYWYLQK- FPGD- QAPGKGLEWVSSIYPSG- PSVFLFPPKPK- Versão 1 PGQSPQLLIYQMSN- GDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSL GIT- DTLMIS- LVSGVPDRFSGSGSGT RSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQG- FYADTVKGRFTISRDNSKNT RTPEVTCVVV- DFTLKISRVEAE- TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG- LYLQMNSLRAEDTAVYYCA- DVSHEDPEVK- DVGVYYCAQNLELPYT- TAALG- RIKLGTVTTVDYWGQG- FNWYVD- FGGGTKVEIKRTVAAP- CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV TLVTVSSASTKGPSVFPLAP- GVEVHNAKTKPR SVFIFPPSDEQLKSG- LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN- SSKSTSGGTAALGCLVKDYF EEQYNS- TAS- VNHKPSNTKVDKKVEPKSCD- PEPVTVSWNSGALTSGVHT- TYRVVSVLTVLHQ VVCLLNNFYPREAKVQ KTHTCPPCPAPELL- FPAVLQSSGLYSLSSVVTV- DWLNGKEYK- WKVDNALQSGNSQES- GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV PSSSLGTQTYICNVNHK- CKVSNKALPAPI- VTEQDSKDSTYS- SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- PSNTKVD- EKTISKA- LSSTLTLSKADYEKHKV QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK- KKVEPKSCDKTHTCPPCPAP KGQPREPQVCTL- YACEVTHQGLSSPVT- CKVSNKAL- ELLGGPSVFLFPPKPKDTL- PPSRDELTKN- KSFNRGEC PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT MISRTPEVTCVVVDVSHED- QVSLSCAVDG- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN- PEVKFNWYVDGVEVHNAKT- FYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD- KPREE- GQPENNYKTTPP KSRWQQGN- QYNSTYRVVSVLTVLHQDW VLDSDGS- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGG LNGKEYKCKVSNKALPAPI- FFLVSKLTVDKSR- GGGGGGGGGGGGGGGGGD- EKTISKAKGQPREPQVYTL- WQQGN- KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL- PPSRDELTKNQVS- VFSCSVMHEA- MISRTPEVTCVVV- LTCLVKGFYPS- LHNHYTQKSLS-

DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE DIAVEWESNGQPENNYDTT LSPG EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK- PPVLDSDGSFFLYSDLTVD- CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL- KSRWQQGNVFSCSVMHEA- PPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW LHNHYTQKSLSLSPG ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS- KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT- QKSLS- LSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL- MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVS- LTCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGQ Construto de Fc SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 313 SEQ ID NO: 315 SEQ ID NO: 48 biespecífico DIVMTQTPLSLPVTPGE- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT- QVQLVQSGAEVKK- DKTHTCPPCPA- (anti-CD20 e PASISCRSSKSLLHSN- FSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGIT- PGSSVKVSCKAS- PELLGG- anti-PD-L1), GITYLYWYLQK- FYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE GYAFSYSWINWVR- PSVFLFPPKPK- Versão 2 PGQSPQLLIYQMSN- DTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVS- QAPGQGLEWMGRIFPGD- DTLMIS- LVSGVPDRFSGSGSGT SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG- GDTDYNGKFKGRVTITADKS RTPEVTCVVV- DFTLKISRVEAE- CLVK- TSTAYMELSSLRSEDTA- DVSHEDPEVK- DVGVYYCAQNLELPYT- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS VYYCARNVFD- FNWYVD- FGGGTKVEIKRTVAAP- GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK- GYWLVYWGQGTLVTVS- GVEVHNAKTKPR SVFIFPPSDEQLKSG- PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL- SASTKGPSVFPLAP- EEQYNS- TAS- GG- SSKSTSGGTAALGCLVKDYF TYRVVSVLTVLHQ VVCLLNNFYPREAKVQ PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH PEPVTVSWNSGALTSGVHT- DWLNGKEYK- WKVDNALQSGNSQES- EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- FPAVLQSSGLYSLSSVVTV- CKVSNKALPAPI- VTEQDSKDSTYS- QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK- PSSSLGTQTYICNVNHK- EKTISKA- LSSTLTLSKADYEKHKV CKVSNKALPA- PSNTKVD- KGQPREPQVCTL- YACEVTHQGLSSPVT- PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKN KKVEPKSCDKTHTCPPCPAP PPSRDELTKN- KSFNRGEC QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN- ELLGGPSVFLFPPKPKDTL- QVSLSCAVDG- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD- MISRTPEVTCVVVDVSHED- FYPSDIAVEWESN KSRWQQGN- PEVKFNWYVDGVEVHNAKT- GQPENNYKTTPP

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGD- KPREE- VLDSDGS- KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL- QYNSTYRVVSVLTVLHQDW FFLVSKLTVDKSR- MISRTPEVTCVVV- LNGKEYKCKVSNKALPAPI- WQQGN- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EKTISKAKGQPREPQVYTL- VFSCSVMHEA- EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK- PPSRDELTKNQVS- LHNHYTQKSLS- CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL- LTCLVKGFYPS- LSPG PPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW DIAVEWESNGQPENNYDTT ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS- PPVLDSDGSFFLYSDLTVD- KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT- KSRWQQGNVFSCSVMHEA- QKSLS- LHNHYTQKSLSLSPG LSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL- MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVS- LTCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGQ

[00489] Como mostrado na FIG. 14B, a banda proteica predominante para cada construto tinha 250 kDa, como era esperado para o produto desejado (faixas 1 e 2). A única outra combinação dos quatro polipeptí- deos usados para produzir os construtos de Fc capazes de produzir po- tencialmente um produto de 250 kDa seria a combinação de duas cópias da cadeia leve de Fab com duas cópias do polipeptídeo de cadeia longa contendo três domínios Fc em tandem com VH e CH1 de Fab. A forma- ção deste produto indesejado necessitaria de uma falha das mutações de heterodimerização para impedir a homodimerização em todos os três domínios Fc em tandem. Para descartar a possibilidade da banda pro- teica de 250 kDa ter resultado da produção do produto homodimerizado indesejado, os genes para cadeia leve de Fab comum e o polipeptídeo de cadeia longa com os três domínios Fc em tandem foram transfecta- dos em células HEK na ausência dos outros dois genes que codificam os dois polipeptídeos de cadeia curta. A Fig. mostra que nenhum pro- duto de 250 kDa foi detectado no meio usado por SDS-PAGE (faixas 3 e 4). De um modo geral, os resultados das faixas 1-4 da FIG. demons- tram que ambas as versões do construto do domínio de ligação Fc-an- tígeno desejadas foram produzidas corretamente pela expressão dos genes que codificam quatro polipeptídeos necessários para montar o construto.

Cultura de Células

[00490] As sequências de DNA foram otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA foram transfectados através de lipossomas em 293 células de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos foram codificadas por múltiplos plasmídeos. Purificação de Proteína

[00491] As proteínas expressas foram purificadas a partir do sobre- nadante da cultura de células por cromatografia em coluna de afinidade com base em Proteína A, usando uma coluna Poros MabCapture A. Os construtos de Fc capturados foram lavados com solução salina tampo- nada com fosfato (PBS, pH 7,0) após o carregamento e posteriormente lavados com tampão de lavagem intermediário, tampão citrato 50 mM (pH 5,5) para remover impurezas adicionais relacionadas ao processo. O material do construto de Fc ligado é eluído com glicina 100 mM, pH 3 e o eluato foi rapidamente neutralizado pela adição de TRIS 1 M pH 7,4, em seguida, centrifugado e filtrado de maneira estéril através de um filtro de 0,2 μm.

[00492] As proteínas foram adicionalmente fracionadas por cromato- grafia de troca iônica usando resina Poros XS. A coluna foi pré-equili- brada com MES 50 mM, pH 6 (tampão A), as amostras foram diluídas (1:3) no tampão de equilíbrio antes do carregamento. A amostra foi elu- ída usando um gradiente linear 12-15CV de MES 50 mM (100% A) para cloreto de sódio 400 mM, pH 6 (100% B) como tampão de eluição. To- das as frações coletadas durante a eluição foram analisadas por croma- tografia por exclusão de tamanho analítica (SEC) e as frações alvo fo- ram agrupadas para produzir o material de construto de Fc purificado.

[00493] Após a troca iônica, o material acumulado foi trocado por meio de tampão em tampão 1X-PBS usando um cartucho de membrana polietersulfona (PES) com cutoff de 30 kDa em um sistema de filtração de fluxo tangencial. As amostras foram concentradas a aproximada- mente 10-15 mg/mL e submetidas à filtração estéril através de um filtro de 0,2 μm. Exemplo 6. Construto biespecífico direcionado para CD38 e BCMA

[00494] Para demonstrar a viabilidade do uso de mutações de hete- rodimerização para direcionar a montagem de dois domínios de Fab di- ferentes com especificidades alvo diferentes na mesma molécula, o an- ticorpo biespecífico com um Fab de anti-CD38 e um Fab de anti-BCMA foi preparado (FIG. 15A). O construto Fc foi montado usando duas ca- deias polipeptídicas diferentes com monômeros do domínio Fc e dois polipeptídeos de cadeia leve diferentes. Uma cadeia polipeptídica tinha um monômero do domínio Fc com mutações formadoras de protuberân- cia e uma mutação de carga inversa e uma porção da cadeia pesada de Fab com um primeiro conjunto de mutações de heterodimerização (B) nos domínios constantes (CH1 + CL) do Fab. A cadeia leve para essa porção de Fab tinha um conjunto compatível de mutações de heterodi- merização (B) ou tinha uma sequência de tipo selvagem. Uma segunda cadeia polipeptídica tinha um monômero do domínio Fc com mutações formadoras de cavidade e uma mutação de carga inversa (compatível com mutação de carga inversa do primeiro polipeptídeo) e uma porção da cadeia pesada de Fab com um segundo conjunto de mutações de heterodimerização (C) nos domínios constantes (CH1 + CL) do Fab. A cadeia leve para essa porção de Fab tinha um conjunto compatível de mutações de heterodimerização (D) ou tinha uma sequência de tipo sel- vagem. A Tabela 10 representa as diferentes mutações de heterodime- rização de Fab que foram usadas nas cadeias leve e pesada de Fab de anti-CD38 e nas cadeias leve e pesada de anti-BCMA para controlar a respectiva montagem desses Fabs.

Tabela 10. Mutações para as sequências de anti-CD38 (darzatumu- mabe) e anti-BCMA (belantamabe) Faixa -CD38 LC -CD38 HC -BCMA LC -BCMA HC (Fab / Fc) (Fab / Fc) 1 Q38K, A43K, S176D Q39D, Q105D, S183K / Q38D, A43D, S176K Q39K, Q105K, S183D / Y349C, T366S, L368A, S354C, E357K, T366W K370D, Y407V 2 Q38D, A43D, S176K Q39K, Q105K, S183D / Q38K, A43K, S176D Q39D, Q105D, S183K / Y349C, T366S, L368A, S354C, E357K, T366W K370D, Y407V 3 Q38K, A43K, S176D Q39D, Q105D, S183K / Q38D, A43D, S176K Q39K, Q105K, S183D / S354C, E357K, T366W Y349C, T366S, L368A, K370D, Y407V 4 Q38D, A43D, S176K Q39K, Q105K, S183D / Q38K, A43K, S176D Q39D, Q105D, S183K / S354C, E357K, T366W Y349C, T366S, L368A, K370D, Y407V 5 WT WT / Y349C, T366S, WT WT / S354C, E357K, L368A, K370D, Y407V T366W 6 WT WT / S354C, E357K, WT WT / Y349C, T366S, T366W L368A, K370D, Y407V 7 WT WT / WT WT WT / WT

[00495] A FIG. 15B mostra que quando quatro genes que codificam o construto de Fc foram transfectados em células HEK, um produto de 150 kDa foi obtido (vide faixas 1-6). Esse era o tamanho esperado do construto de Fc desejado. A faixa 8 era um controle em que um cons- truto com três domínios Fc e nenhum domínio de ligação ao antígeno foi expresso. A expressão dos domínios de Fab mutados ligados aos domínios Fc contendo mutações knobs-into-holes e de carga inversa indica que as mutações de heterodimerização de Fab e as mutações de heterodimerização de Fc podem ser usadas com êxito para montar o domínio de ligação Fc-antígeno. Análises de Cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS)

[00496] A cromatografia líquida-espectrometria de massa também foi conduzida para determinar se as espécies desejadas do construto do domínio de ligação Fc-antígeno (FIG. 15A e Tabela 10) foram formadas. As proteínas expressadas foram purificadas a partir do sobrenadante da cultura de células por cromatografia em coluna de afinidade com base em Proteína A usando uma coluna Poros MabCapture A. Os construtos do domínio de ligação Fc-antígeno capturados foram lavados com solu- ção salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,0) após o carregamento e posteriormente lavados com tampão de lavagem intermediário, tam- pão citrato 50 mM (pH 5,5) para remover impurezas adicionais relacio- nadas ao processo. O material do construto de Fc ligado foi eluído com glicina 100 mM, pH 3 e o eluato foi rapidamente neutralizado pela adição de TRIS 1 M pH 7,4, em seguida, centrifugado e filtrado de maneira estéril através de um filtro de 0,2 μm.

[00497] 100 μg de cada construto de Fc foram trocados por tampão em bicarbonato de amônio 50 mM (pH 7,8) usando filtros de rotação de 10 kDa (EMD Millipore) a uma concentração de 1 μg/μL. 50 μg da amos- tra foram incubados com 30 unidades de PNGase F (Promega) a 37°C por 5 horas. A separação foi realizada em uma coluna Waters Acquity C4 BEH (1x100 mm, tamanho de partícula de 1,7 um, tamanho de poro 300A) usando ácido fórmico a 0,1% em água e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila como as fases móveis. LC-MS foi realizada em um Sistema de Cromatografia Ultimate 3000 (Dionex) e um Espectrômetro de Massa Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific). Os espectros foram deconvoluí- dos usando o método ReSpect padrão do Biopharma Finder (Thermo Fisher Scientific).

[00498] As FIGs 15C-15F mostram resultados das análises de LC- MS demonstrando que os produtos de 150 kDa que foram observados em SDS-PAGE (FG. 15B) continham predominantemente uma de cada uma das diferentes cadeias leves (uma para Fab de anti-CD38 e um para Fab de anti-BCMA). As espécies biespecíficas desejadas, após de- glicosilação, têm um peso molecular de 145.523 Da, enquanto o cons- truto com duas cadeias leves de anti-BCMA tem um peso molecular 261 Da menor e o construto com duas cadeias leves de anti-CD38 tem um peso molecular de 261 Da maior do que as espécies desejadas. A es- pécie dominante em cada uma das amostras foi a espécie de 145.523

Da contendo uma de cada cadeia leve (a FIG. 15C mostra o pico de LC- MS principal do construto purificado da faixa 1 da Fig. 15B; a FIG. 15D mostra o pico de LC-MS principal do construto purificado da faixa 2 da FIG. 15B; a FIG. 15E mostra o pico de LC-MS principal do construto purificado da faixa 3 da FIG. 15B; e a FIG. 15F mostra o pico de LC-MS principal do construto purificado da faixa 4 da FIG. 15B). Exemplo 7. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 22

[00499] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 22 (FIG. 16) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma ca- deia de Fc longa e duas cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois poli- peptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém dois monômeros do domínio Fc com uma protuberância modificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de protuberância selecionada da Tabela 4 (por exemplo, mutações S354C e T366W) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) em uma série em tandem e um domínio de ligação ao antígeno de uma primeira especificidade no terminal N. A cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio de Fc com uma cavidade mo- dificada que é produzido pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, K370D) e domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células ma- míferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de liposso- mas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 8. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 23

[00500] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 23 (FIG. 17) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma ca- deia de Fc longa e três cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois poli- peptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém três monômeros do domínio Fc com uma protuberância modificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de protuberância selecionada da Tabela 4 (por exemplo, mutações S354C e T366W) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) em uma série em tandem e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio de Fc com uma cavidade modificada que é produzido pela introdução de pelo menos uma muta- ção formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, K370D) e domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células ma- míferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de liposso- mas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 9. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 24

[00501] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 24 (FIG. 18) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas có- pias de uma cadeia de Fc longa e duas cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com uma protuberância mo- dificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de protuberância selecionada da Tabela 4 (por exemplo, mu- tações S354C e T366W) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) e um do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no termi- nal N. A cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio de Fc com uma cavidade modificada que é produzido pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, K370D) e domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expres- são em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamí- fero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário

(HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 10. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 25

[00502] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 25 (FIG. 19) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas có- pias de uma cadeia de Fc longa e duas cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com uma protuberância modificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de protuberância se- lecionada da Tabela 4 (por exemplo, mutações S354C e T366W) e, op- cionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) em uma série em tandem com um mo- nômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) e um do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no termi- nal N. A cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio de Fc com uma cavidade modificada que é produzido pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, K370D) e domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expres- são em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamí- fero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário

(HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 11. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 26

[00503] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 26 (FIG. 20) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas có- pias de uma cadeia de Fc longa e quatro cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) em uma série em tandem com dois monômeros do domínio Fc, cada um com uma protu- berância modificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de protuberância selecionada da Tabela 4 (por exemplo, mutações S354C e T366W) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especi- ficidade no terminal N. A cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio de Fc com uma cavidade modificada que é produzido pela in- trodução de pelo menos uma mutação formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo, K370D) e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. As sequências de DNA são oti- mizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As prote- ínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 12. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 27

[00504] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 27 (FIG. 21) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas có- pias de uma cadeia de Fc longa e quatro cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com uma protuberância modificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de protuberância se- lecionada da Tabela 4 (por exemplo, mutações S354C e T366W) e, op- cionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K), em uma série em tandem com um mo- nômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K), outro monômero do domínio Fc contendo protuberância com uma protuberân- cia modificada que é produzida pela introdução de pelo menos uma mu- tação formadora de protuberância selecionada da Tabela 4 (por exem- plo, S354C e T366W) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) e um do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no termi- nal N. A cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio de Fc com uma cavidade modificada que é produzido pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5 (por exemplo,

K370D) e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda espe- cificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfec- tados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 13. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 28

[00505] Um construto formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes é produzido como des- crito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 28 (FIG. 22) inclui dois polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas có- pias de uma cadeia de Fc longa e quatro cópias de uma cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém dois monômeros do domínio Fc, cada um com uma protuberância modificada que é pro- duzida pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de pro- tuberância selecionada da Tabela 4 (por exemplo, mutações S354C e T366W) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 (por exemplo, E357K) em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A cadeia de Fc curta contém um monô- mero do domínio de Fc com uma cavidade modificada que é produzido pela introdução de pelo menos uma mutação formadora de cavidade da Tabela 4 (por exemplo, mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionada da

Tabela 5 (por exemplo, K370D) e domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as ca- deias Fc curta e longa são codificadas por dois plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 14. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 29

[00506] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 29 (FIG. 23) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de Fc curtas distintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia Fc longa contém dois monômeros do domínio Fc, cada um com um conjunto diferente de mutações formadoras de protu- berância diferente selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodime- rização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa di- ferente selecionada da Tabela 5, em uma série em tandem com um do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no termi- nal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade seleci- onadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. A segunda cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa seleci- onadas da Tabela 5. As sequências de DNA são otimizadas para ex- pressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfec- tados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 15. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 30

[00507] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 30 (FIG. 24) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de Fc curtas distintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia Fc longa contém dois monômeros do domínio Fc, cada um com um conjunto diferente de mutações formadoras de protu- berância diferente selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodime- rização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa di- ferente selecionada da Tabela 5, em uma série em tandem com um do- mínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no termi- nal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade seleci- onadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela

5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. A segunda cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa seleci- onadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma pri- meira especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimiza- das para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de ex- pressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As prote- ínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 16. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 31

[00508] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 31 (FIG. 25) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia Fc longa contém dois monômeros do do- mínio Fc, cada um com um conjunto diferente de mutações formadoras de protuberância diferente selecionadas da Tabela 4 (mutações de he- terodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga in- versa diferente selecionada da Tabela 5, em uma série em tandem com um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio

Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade se- lecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. A segunda cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa seleci- onadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma ter- ceira especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimiza- das para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de ex- pressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos são para as cadeias de Fc curta e longa codificadas por três plasmídeos separados. As pro- teínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 17. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 32

[00509] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 32 (FIG. 26) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa, duas cópias de uma cadeia de Fc curta e uma cópia de uma segunda cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de ca- deia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia Fc longa contém três monômeros do domínio Fc, cada um com um con- junto de mutações formadora de protuberância selecionada da Tabela

4 (mutações de heterodimerização), e, opcionalmente, um ou mais mu- tações de carga inversa selecionada da Tabela 5, (o terceiro monômero do domínio Fc com um conjunto de mutações de heterodimerização di- ferente dos dois primeiros) em uma série em tandem com um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade seleciona- das da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. A segunda cadeia Fc curta contém um monômero do domí- nio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, op- cionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados atra- vés de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 18. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 33

[00510] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 33 (FIG. 27) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cópias de uma primeira cadeia de Fc curta e uma cópia de uma segunda cadeia de Fc curta) e dois polipep- tídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve co- mum. A cadeia Fc longa contém três monômeros do domínio Fc, cada um com um conjunto de mutações formadora de protuberância selecio- nada da Tabela 4 (mutações de heterodimerização), e, opcionalmente, um ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5, (o ter- ceiro monômero do domínio Fc com um conjunto de mutações de hete- rodimerização diferente dos dois primeiros) em uma série em tandem com um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especifici- dade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. A segunda cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações for- madoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodi- merização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira ca- deia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga in- versa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as ca- deias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 19. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 34

[00511] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo.

O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 34 (FIG. 28) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa, duas cópias de uma primeira cadeia de Fc curta e uma cópia de uma segunda cadeia de Fc curta) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum.

A cadeia Fc longa contém três monômeros do domínio Fc, cada um com um conjunto de mutações formadora de protuberância selecio- nada da Tabela 4 (mutações de heterodimerização), e, opcionalmente, um ou mais mutações de carga inversa selecionada da Tabela 5, (o ter- ceiro monômero do domínio Fc com um conjunto de mutações de hete- rodimerização diferente dos dois primeiros) em uma série em tandem com um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especifici- dade no terminal N.

A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N.

A segunda cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações for- madoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodi- merização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira ca- deia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga in- versa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N.

As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as ca- deias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 20. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 35

[00512] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (FIG. 29) inclui quatro polipeptídeos contendo monômero de Fc dis- tintos (duas cadeias de Fc longas distintas e duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A primeira cadeia de Fc longa con- tém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) em uma série em tandem com um monômero do domí- nio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protube- rância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A segunda cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com um se- gundo conjunto de mutações formadoras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro con- junto de mutações na primeira cadeia de Fc longa e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no ter-

minal N. A primeira cadeia de Fc curta contém um monômero do domí- nio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. A segunda cadeia de Fc curta contém um monô- mero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimeriza- ção) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimi- zadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias de Fc curta e longa são codificadas por quatro plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 21. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 36

[00513] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 36 (FIG. 30) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A primeira ca- deia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protuberância selecionados da

Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, em uma sé- rie em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mu- tações K409D/D399K), um segundo monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de protuberância seleciona- das da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no ter- minal N. A primeira cadeia de Fc curta contém um monômero do domí- nio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela

5. A segunda cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade sele- cionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do pri- meiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expres- são em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamí- fero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 22. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 37

[00514] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo.

O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (FIG. 31) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum.

A pri- meira cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protuberância seleciona- dos da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K), um segundo monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de protuberância seleci- onadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 4 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N.

A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do do- mínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavi- dade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, op- cionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda espe- cificidade no terminal N.

A segunda cadeia de Fc curta contém um mo- nômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações forma- doras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodime- rização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N.

As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as ca- deias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 23. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 38

[00515] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 38 (FIG. 32) inclui quatro polipeptídeos contendo monômero de Fc dis- tintos (duas cadeias de Fc longas distintas e duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A primeira cadeia de Fc longa con- tém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de muta- ções formadoras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecio- nadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A segunda cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de pro- tuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc longa e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa sele- cionadas da Tabela 5, em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um do- mínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no ter- minal N. A segunda cadeia de Fc curta contém um monômero do domí- nio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, op- cionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira espe- cificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfec- tados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias de Fc curta e longa são codificadas por quatro plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 24. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 39

[00516] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 39 (FIG. 33) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionados da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K), em uma série em tandem com um monômero do domí- nio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protube- rância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, um segundo monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domí- nio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade seleci- onadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela

5. A segunda cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade sele- cionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do pri- meiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expres- são em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamí- fero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 25. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 40

[00517] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo.

O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (FIG. 34) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum.

A ca- deia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionados da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K), em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimeriza- ção) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa seleci- onadas da Tabela 5, um segundo monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de protuberância seleciona- das da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no ter- minal N.

A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade se- lecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N.

A segunda cadeia de Fc curta contém um monô- mero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimeriza- ção) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimi- zadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As prote- ínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 26. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 41

[00518] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 41 (FIG. 35) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém dois monômeros do domínio Fc com um conjunto dife- rente de mutações formadoras de protuberância selecionadas da Ta- bela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga in- versa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um mo- nômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações forma- doras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodime- rização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. A segunda cadeia Fc curta con- tém um monômero do domínio Fc contendo cavidade com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamíferas e clona- das no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo

5. Exemplo 27. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 42

[00519] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 42 (FIG. 36) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A ca- deia de Fc longa contém dois monômeros do domínio Fc com um con- junto diferente de mutações formadoras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mu- tações K409D/D399K) e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de hete- rodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga in- versa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade no terminal N. A segunda cadeia de Fc curta contém um monômero do domínio Fc com um segundo con- junto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mu- tações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N. As sequências de DNA são otimizadas para expressão em células mamí- feras e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de liposso- mas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. Exemplo 28. Ensaios Experimentais usados para caracterizar cons- trutos do domínio de ligação Fc-antígeno Cromatografia Líquida com Peptídeos e Glicopeptídeos-MS/MS

[00520] As proteínas (construtos de Fc) foram diluídas a 1 μg/μL em guanidina 6M (Sigma). Ditiotreitol (DTT) foi adicionado a uma concen- tração de 10 mM, para reduzir as ligações dissulfeto sob condições de desnaturação a 65°C por 30 min. Após resfriamento em gelo, as amos- tras foram incubadas com iodoacetamida (IAM) de 30 mM por 1 h no escuro para alquilação (carbamidometilação) os tióis livres. A proteína foi, então, dialisada através de uma membrana de 10-kDa em tampão de bicarbonato de amônio 25 mM (pH 7,8) para remover IAM, DTT e guanidida. A proteína foi digerida com tripsina em Barocycler (NEP 2320; Pressure Biosciences, Inc.). A pressão foi ciclada entre 20.000 psi e pressão ambiente a 37 °C por um total de 30 ciclos em 1 h. A análise de LC-MS/MS dos peptídeos foi realizada em um Sistema de Cromato- grafia Ultimate 3000 (Dionex) e um Espectrômetro de Massa Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos foram separados em uma Co- luna BEH PepMap (Waters) usando FA 0,1% em água e FA 0,1% em acetonitrila como as fases móveis. Espectrometria de Massa Intacta

[00521] 50 μg da proteína (construto de Fc) foram trocados por tam- pão em bicarbonato de amônio 50 mM (pH 7,8) usando filtros de rotação de 10 kDa (EMD Millipore) a uma concentração de 1 μg/μL. 30 unidades de PNGase F (Promega) foram adicionadas à amostra e incubadas a 37 °C durante 5 horas. A separação foi realizada em uma coluna Waters Acquity C4 BEH (1x100 mm, tamanho de partícula de 1,7 um, tamanho de poro 300A) usando FA a 0,1% em água e FA a 0,1% em acetonitrila como as fases móveis. LC-MS foi realizada em um Sistema de Croma- tografia Ultimate 3000 (Dionex) e um Espectrômetro de Massa Q-Exac- tive (Thermo Fisher Scientific). Os espectros foram deconvoluídos usando o método ReSpect padrão do Biopharma Finder (Thermo Fisher Scientific). Ensaio de Eletroforese Capilar com dodecil sulfato de sódio (CE-SDS)

[00522] As amostras foram diluídas a 1 mg/mL e misturadas com o tampão desnaturante HT Protein Express (PerkinElmer). A mistura foi incubada a 40 °C por 20 min. As amostras foram diluídas com 70 μL de água e transferidas para uma placa de 96 poços. As amostras foram analisadas por um instrumento Caliper GXII (PerkinElmer) equipado com o HT Protein Express LabChip (PerkinElmer). A intensidade de flu- orescência foi usada para calcular a abundância relativa de cada vari- ante de tamanho.

SDS-PAGE não redutor

[00523] As amostras foram desnaturadas em tampão de amostra La- emmli (4% SDS, Bio-Rad) a 95 °C por 10 minutos. As amostras foram executadas em um gel livre de corantes Criterion TGX (4-15% poliacri- lamida, Bio-Rad). As bandas de proteína são visualizadas por ilumina- ção UV ou coloração com azul de Coomassie. Géis foram fotografados pelo Sistema de Produção de Imagens ChemiDoc MP (Bio-Rad). A quantificação de bandas é realizada usando software Imagelab 4.0.1 (Bio-Rad). Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC)

[00524] A CDC foi avaliada por um ensaio colorimétrico no qual cé- lulas Raji (ATCC) foram revestidas com Rituximabe diluído serialmente, um construto de Fc, ou IVIg. O complemento de soro humano (Quidel) foi adicionado a todos os poços a 25% v/v e incubado por 2 h a 37 °C. As células foram incubadas por 12 h a 37 °C após adição de reagente de proliferação celular WST-1 (Roche Applied Science). As placas foram colocadas em um agitador por 2 minutos e absorbância a 450 nm foi medida. Exemplo 29. Design e purificação do construto alternativo do do- mínio de ligação Fc-antígeno 29

[00525] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto alternativo do domínio de ligação Fc- antígeno 29 (FIG. 38A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de Fc curtas dis- tintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. Como pôde ser observado, em vez de usar dois domínios de heterodimerização de protuberância/cavidade diferentes,

são usados um domínio de heterodimerização de protuberância/cavi- dade e um domínio de heterodimerização de orientação eletroestática. As sequências exemplares são mostradas na FIG. 38B. Exemplo 30. Design e purificação do construto alternativo do do- mínio de ligação Fc-antígeno 30

[00526] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto alternativo do domínio de ligação Fc- antígeno 30 (FIG. 39A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de Fc curtas dis- tintas) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. Como pôde ser observado, em vez de usar dois domínios de heterodimerização de protuberância/cavidade diferentes, são usados um domínio de heterodimerização de protuberância/cavi- dade e um domínio de heterodimerização de orientação eletroestática. As sequências exemplares são mostradas na FIG. 39B. Exemplo 31. Design e purificação do construto alternativo do do- mínio de ligação Fc-antígeno 31

[00527] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto alternativo do domínio de ligação Fc- antígeno 31 (FIG. 40) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de Fc curtas dis- tintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um poli- peptídeo de cadeia leve comum. Como pôde ser observado, em vez de usar dois domínios de heterodimerização de protuberância/cavidade di- ferentes, são usados um domínio de heterodimerização de protuberân-

cia/cavidade e um domínio de heterodimerização de orientação eletro- estática. As sequências exemplares são mostradas na FIG. 40B. Exemplo 32. Design e purificação do construto alternativo do do- mínio de ligação Fc-antígeno 32

[00528] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto alternativo do domínio de ligação Fc- antígeno 32 (FIG. 41A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa, duas cópias de uma cadeia de Fc curta e uma cópia de uma segunda cadeia de Fc curta) e dois polipep- tídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve co- mum. Como pôde ser observado, em vez de usar dois domínios de he- terodimerização de protuberância/cavidade diferentes, são usados um domínio de heterodimerização de protuberância/cavidade e um domínio de heterodimerização de orientação eletroestática (presente em dois domínios Fc). As sequências exemplares são mostradas na FIG. 41B. Exemplo 33. Design e purificação do construto alternativo do do- mínio de ligação Fc-antígeno 33

[00529] Um construto biespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto alternativo do domínio de ligação Fc- antígeno 33 (FIG. 42A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa e duas cópias de uma primeira cadeia de Fc curta e uma cópia de uma segunda cadeia de Fc curta) e dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. Como pôde ser observado, em vez de usar dois domínios de heterodimerização de protuberância/cavidade diferentes, são usados um domínio de heterodimerização de protuberância/cavidade e um do- mínio de heterodimerização de orientação eletroestática (presente em dois domínios Fc). As sequências exemplares são mostradas na FIG. 42B. Exemplo 34. Design e purificação do construto alternativo do do- mínio de ligação Fc-antígeno 34

[00530] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto alternativo do domínio de ligação Fc- antígeno 34 (FIG. 43A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distintos (uma cadeia de Fc longa, duas cópias de uma primeira ca- deia de Fc curta e uma cópia de uma segunda cadeia de Fc curta) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. Como pôde ser observado, em vez de usar dois domínios de heterodimerização de protuberância/cavidade diferentes, são usados um domínio de heterodimerização de protuberância/cavi- dade e um domínio de heterodimerização de orientação eletroestática (presente em dois domínios Fc). As sequências exemplares são mos- tradas na FIG. 43B. Exemplo 35. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 35

[00531] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 35 (FIG. 44A) inclui quatro polipeptídeos contendo monômero de Fc dis- tintos (duas cadeias de Fc longas distintas e duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptídeos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum.

A primeira cadeia de Fc longa con- tém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) em uma série em tandem com um monômero do domí- nio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protube- rância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N.

A segunda cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K) em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com um se- gundo conjunto de mutações formadoras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro con- junto de mutações na primeira cadeia de Fc longa e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no ter- minal N.

A primeira cadeia de Fc curta contém um monômero do domí- nio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especifici- dade no terminal N.

A segunda cadeia de Fc curta contém um monô- mero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimeriza- ção) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa se- lecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N.

As sequências de DNA são otimi- zadas para expressão em células mamíferas e clonadas no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4. Os construtos de plasmídeo de DNA são transfectados através de lipossomas em células 293 de rim humano embrionário (HEK). As sequências de aminoácidos para as cadeias de Fc curta e longa são codificadas por quatro plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. As sequências exemplares são mostradas na FIG. 44B. Exemplo 36. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 37

[00532] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 37 (FIG. 45A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distin- tos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptí- deos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A primeira cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de protuberância seleci- onados da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, em uma série em tandem com um monômero do domínio Fc com mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exemplo, mutações K409D/D399K), um segundo monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de protuberân- cia selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opci- onalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 4 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira espe- cificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monô- mero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimeriza- ção) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa seleci- onadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma se- gunda especificidade no terminal N. A segunda cadeia de Fc curta con- tém um monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de muta- ções formadoras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) diferente do primeiro conjunto de mutações na pri- meira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N. As sequências de aminoácidos para as cadeias Fc curta e longa são codificadas por três plasmídeos separados. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. As sequências exemplares são mostradas na FIG. 45B. Exemplo 37. Design e purificação do construto do domínio de liga- ção Fc-antígeno 40

[00533] Um construto triespecífico formado usando cadeias de Fc longas e curtas com domínios de ligação ao antígeno diferentes e dois conjuntos diferentes de mutações de heterodimerização é produzido como descrito abaixo. O construto do domínio de ligação Fc-antígeno 40 (FIG. 46A) inclui três polipeptídeos contendo monômero de Fc distin- tos (duas cópias de uma cadeia de Fc longa e duas cadeias de cada uma das duas cadeias de Fc curtas distintas) e três ou dois polipeptí- deos de cadeia leve distintos ou um polipeptídeo de cadeia leve comum. A cadeia de Fc longa contém um monômero do domínio Fc com muta- ções de carga inversa selecionados da Tabela 5 ou Tabela 5 (por exem- plo, mutações K409D/D399K), em uma série em tandem com um mo- nômero do domínio Fc com um primeiro conjunto de mutações forma- doras de protuberância selecionadas da Tabela 4 (mutações de hetero- dimerização) e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5, um segundo monômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações formadoras de protuberância seleci- onadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, opcional- mente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade no terminal N. A primeira cadeia Fc curta contém um monômero do do- mínio Fc com um primeiro conjunto de mutações formadoras de cavi- dade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodimerização) e, op- cionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda espe- cificidade no terminal N. A segunda cadeia de Fc curta contém um mo- nômero do domínio Fc com um segundo conjunto de mutações forma- doras de cavidade selecionadas da Tabela 4 (mutações de heterodime- rização) diferente do primeiro conjunto de mutações na primeira cadeia de Fc curta e, opcionalmente, uma ou mais mutações de carga inversa selecionadas da Tabela 5 e um domínio de ligação ao antígeno com uma terceira especificidade no terminal N. As proteínas expressas são purificadas como no Exemplo 5. As sequências exemplares são mos- tradas na FIG. 46B. Outras Modalidades

[00534] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente men- cionados nesse relatório descritivo estão incorporados ao presente do- cumento por referência na mesma medida, como se cada publicação ou pedido de patente independente fossem especificamente e individual- mente indicados como sendo incorporados por referência.

[00535] Embora a invenção tenha sido descrita em relação às suas modalidades específicas, entende-se que ela seja capaz de modifica- ções adicionais e que o presente pedido pretenda abranger quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, de modo geral, os princípios da invenção e incluindo desvios da invenção decorrentes de práticas conhecidas e comuns na técnica à qual a invenção pertence e possam ser aplicados às características essenciais previamente esta- belecidas no presente documento, e segue o escopo das reivindicações.

[00536] Outras modalidades estão incluídas nas reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; um primeiro ligante; um primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 com- preendendo um primeiro módulo de seletividade de heterodimerização; um segundo ligante; um segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um segundo módulo de seletividade de heterodimeri- zação; e um terceiro ligante opcional; e um terceiro monômero do domí- nio Fc de IgG1 opcional, em que o primeiro e o segundo módulos de seletividade de heterodimerização são diferentes.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro mo- nômero do domínio Fc de IgG em que o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende um módulo de seletividade de heterodimeriza- ção ou um módulo de seletividade de heterodimerização que é idêntico ao primeiro ou segundo módulo de seletividade de heterodimerização.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende: o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; um primeiro ligante; o primeiro monô- mero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um primeiro módulo de seletividade de heterodimerização; o segundo ligante; o segundo monô- mero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um segundo módulo de seletividade de heterodimerização; um terceiro ligante; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, nesta ordem.

4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende: o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; o primeiro ligante; o primeiro monô- mero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um primeiro módulo de seletividade de heterodimerização; um terceiro ligante; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 o segundo ligante; e o segundo mo- nômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um segundo módulo de seletividade de heterodimerização, nesta ordem.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade; um terceiro ligante; um terceiro mo- nômero do domínio Fc de IgG1; o primeiro ligante; o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um primeiro módulo de seletivi- dade de heterodimerização; o segundo ligante; e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um segundo módulo de seleti- vidade de heterodimerização, nesta ordem.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro mo- nômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domí- nio Fc de IgG1 e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compre- endem, cada um, mutações que formam uma protuberância modificada e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro mo- nômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domí- nio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compre- endem, cada um, mutações que formam uma protuberância modificada e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro mo- nômero do domínio Fc de IgG1, em que o segundo monômero do domí- nio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compre- endem, cada um, mutações que formam uma protuberância modificada e o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro mo- nômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do domí- nio Fc de IgG1 compreendem, cada um, duas ou quatro mutações de carga inversa e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mu- tações que formam uma protuberância modificada.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do do- mínio Fc de IgG1 compreendem, cada um, mutações que formam uma protuberância modificada e um monômero do domínio Fc de IgG1 com- preende duas ou quatro mutações de carga inversa.

11. Polipeptídeos, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, caracterizados pelo fato de que os monômeros do domí- nio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protuberância modificada compreendendo, ainda, uma, duas ou três mutações de carga inversa.

12. Polipeptídeos, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, 6-8, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem mutações que formam uma protuberância modificada possuem, cada um, muta- ções que formam protuberância idênticas.

13. Polipeptídeos, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3 e 9, caracterizado pelo fato de que os monômeros do do- mínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem duas ou quatro mutações de carga inversa e nenhuma mutação de carga inversa pos- suem, cada um, mutações de carga inversa idênticas.

14. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as mutações que formam uma protuberância modificada e as mutações de carga inversa estão no domínio CH3.

15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracte- rizado pelo fato de que as mutações estão na sequência da posição EU G341 à posição EU K447, com estas inclusas.

16. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as mutações são altera- ções de um único aminoácido.

17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos seleci- onada do grupo consistindo em: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSI- DLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG e GGGGGGGGGGGGGGGGG.

18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional são um espaçador de glicina.

19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem, independentemente, em 4 a 30, 4 a 20, 8 a 30, 8 a 20, 12 a 20 ou 12 a 30 resíduos de glicina.

20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem em 20 resíduos de glicina.

21. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos monômeros do do- mínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posição EU I253.

22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracte- rizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição EU I253 é independentemente selecionada do grupo consistindo em I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W e I253Y.

23. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 22, caracte- rizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição I253 é I253A.

24. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos mo- nômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posição EU R292.

25. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracte- rizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição EU R292 é independentemente selecionada do grupo consistindo em R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T e R292Y.

26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição R292 é R292P.

27. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a dobradiça de cada mo- nômero do domínio Fc compreende ou consiste, independentemente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em EPKSCDKTHTCPPCPAPELL e DKTHTCPPCPAPELL.

28. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizado pelo fato de que a porção de dobradiça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc têm a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL.

29. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizado pelo fato de que a porção de dobradiça do primeiro monômero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCD- KTHTCPPCPAPEL.

30. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizado pelo fato de que a porção de dobradiça do primeiro monômero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCD- KTHTCPPCPAPEL e a porção de dobradiça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc têm a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL.

31. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a se- quência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK com no máximo duas deleções ou substituições de único aminoácido.

32. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED-

PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

33. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK com no máximo duas substituições de único aminoácido.

34. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK.

35. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a se- quência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS-

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no má- ximo 10 substituições de único aminoácido.

36. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a se- quência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS-

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no má- ximo 8 substituições de único aminoácido.

37. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a se- quência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS-

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no má- ximo 6 substituições de único aminoácido.

38. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a se- quência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS-

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no má- ximo 5 substituições de único aminoácido.

39. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 31 a 38, caracterizado pelo fato de que as substituições de único aminoácido são selecionadas do grupo consistindo em: S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

40. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que cada um dos monômeros do domínio Fc compreende, independentemente, a sequência de ami- noácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

41. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizado pelo fato de que até 6 das substituições de único aminoácido são mutações de carga inversa no domínio CH3 ou são mutações que for- mam uma protuberância modificada.

42. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizado pelo fato de que as mutações de único aminoácido estão na se- quência da posição EU G341 à posição EU K447, com estas inclusas.

43. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que pelo menos uma das mutações que formam uma protuberância modificada é selecionada do grupo consistindo em S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T e T394F.

44. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

45. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é um scFv.

46. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio CH1.

47. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 44, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio VL.

48. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio VH compreende um conjunto de se- quências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

49. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio VH compreendendo uma sequência de um an- ticorpo indicado na Tabela 2.

50. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e

CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e a sequência de VH, excluindo-se as sequências de CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3, é pelo menos 95% ou 98% idêntica à sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2.

51. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio VH compreende uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2.

52. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

53. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 de um conjunto de sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

54. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e um domínio VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma sequência de VL de um anticorpo indicado na Tabela 2, em que as sequências do domínio VH e VL, excluindo-se as sequências CDR-H1, CDR-H2, CDR- H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, são pelo menos 95% ou 98% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

55. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um conjunto de uma sequência de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

56. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 1 a 44,

caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com- preende um domínio constante de anticorpo CL de IgG e um domínio constante de anticorpo CH1 de IgG.

57. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com- preende um domínio VH e um domínio CH1 e pode se ligar a um poli- peptídeo compreendendo um domínio VL e um domínio CL para formar um Fab.

58. Complexo polipeptídico caracterizado pelo fato de que compreende duas cópias do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 57, unidas por ligações dissulfeto entre re- síduos de cisteína na dobradiça de um monômero do domínio Fc de IgG1 de cada polipeptídeo.

59. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que cada cópia do polipeptídeo compre- ende de forma idêntica um monômero do domínio Fc com duas ou qua- tro mutações de carga inversa selecionadas dentre K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K, e em que as duas cópias do polipeptídeo são unidas nos monô- meros do domínio Fc com estas mutações de carga inversa.

60. Complexo polipeptídico caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 57, unido a um segundo polipeptídeo compreendendo um monômero do domínio Fc de IgG1, em que o polipeptídeo e o se- gundo polipeptídeo são unidos por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobradiça do primeiro, segundo ou terceiro monô- mero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo e o domínio dobradiça do segundo polipeptídeo.

61. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do Fc de IgG1 do polipeptídeo compreende mutações que formam uma cavidade mo- dificada.

62. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que as mutações que formam a cavidade modificada são selecionadas do grupo consistindo em: Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A.

63. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do polipeptídeo compreende pelo menos uma mutação de carga inversa.

64. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação de carga inversa é selecionada dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

65. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do peptídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

66. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 66, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

67. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 66, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende ainda um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade ou uma segunda especificidade.

68. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação

67, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno possui uma segunda especificidade.

69. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antí- geno compreende um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo.

70. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antí- geno compreende um domínio variável de cadeia leve de anticorpo.

71. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antí- geno é um scFv.

72. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antí- geno compreende um domínio VH e um domínio CH1.

73. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio VL.

74. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende um con- junto de sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

75. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio VH compreendendo uma sequência de um anticorpo indicado na Tabela 2.

76. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e a sequência de VH, excluindo-se as sequências de CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3, é pelo menos 95% ou 98% idêntica à sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2.

77. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende uma se- quência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2.

78. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um conjunto de sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR- H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

79. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende sequências de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um conjunto de sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

80. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e um domínio VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma sequência de VL de um anticorpo indicado na Tabela 2, em que as sequências do domínio VH e VL, excluindo-se as sequências CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, são pelo menos 95% ou 98% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

81. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

82. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antí- geno compreende um domínio constante de anticorpo CL de IgG e um domínio constante de anticorpo CH1 de IgG.

83. Complexo polipeptídico, de acordo com as reivindicações 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antí- geno compreende um domínio VH e um domínio CH1 e pode se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio VL e um domínio CL para formar um Fab.

84. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 83, caracterizado pelo fato de que o complexo polipeptídico se une adicionalmente a um terceiro polipeptídeo compre- endendo um monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um do- mínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que o poli- peptídeo e o terceiro polipeptídeo são unidos por ligações dissulfeto en- tre resíduos de cisteína no domínio dobradiça do primeiro, segundo ou terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo e o domínio dobradiça do terceiro polipeptídeo, em que o segundo e o terceiro poli- peptídeos se unem a diferentes monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo.

85. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o terceiro monômero do peptídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

86. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizado pelo fato de que o terceiro polipeptídeo compre- ende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

87. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 86, caracterizado pelo fato de que o terceiro polipeptídeo compreende ainda um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade ou uma terceira especificidade.

88. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno possui uma terceira especificidade.

89. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 88, caracterizado pelo fato de que compreende função efetora potencializada em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), um ensaio de fagocitose celular de- pendente de anticorpo (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) em relação a um complexo polipeptídico que possui um único domínio Fc e pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno com especificidades diferentes.

90. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um do- mínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3; um segundo li- gante; um segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3; um terceiro ligante opcional; e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 opci- onal compreendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um do- mínio CH3, em que pelo menos um monômero do domínio Fc compreende muta- ções que formam uma protuberância modificada, e em que pelo menos um monômero do domínio Fc compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

91. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mutações que formam uma protuberância modificada.

92. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mutações que formam uma protuberância modificada e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

93. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreendem, cada um, mutações que formam uma protuberância mo- dificada e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

94. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 com- preendem, cada um, mutações que formam uma protuberância modifi- cada e o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

95. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que o segundo monômero do domínio Fc de IgG1 e o terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 com- preendem, cada um, mutações que formam uma protuberância modifi- cada e o primeiro monômero do domínio Fc de IgG1 compreende duas ou quatro mutações de carga inversa.

96. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do do- mínio Fc de IgG1 compreendem, cada um, duas ou quatro mutações de carga inversa e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreende mu- tações que formam uma protuberância modificada.

97. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, caracte- rizado pelo fato de que compreende um terceiro ligante e um terceiro monômero do domínio Fc de IgG1, em que dois dos monômeros do do- mínio Fc de IgG1 compreendem, cada um, mutações que formam uma protuberância modificada e um monômero do domínio Fc de IgG1 com- preende duas ou quatro mutações de carga inversa.

98. Polipeptídeos, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 90 a 97, caracterizados pelo fato de que os monômeros do do- mínio Fc de IgG1 compreendem mutações que formam uma protube- rância modificada compreendendo, ainda, uma, duas ou três mutações de carga inversa.

99. Polipeptídeos, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 90, 93 a 96 e 98, caracterizado pelo fato de que os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem mutações que formam uma protuberância modificada possuem, cada um, muta- ções que formam protuberância idênticas.

100. Polipeptídeos, de acordo com as reivindicações 90 ou 96, caracterizado pelo fato de que os monômeros do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo que compreendem duas ou quatro mutações de carga inversa e nenhuma mutação de carga inversa possuem, cada um, mutações de carga inversa idênticas.

101. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 100, caracterizado pelo fato de que as mutações que for- mam uma protuberância modificada e as mutações de carga inversa estão no domínio CH3.

102. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 101, ca- racterizado pelo fato de que as mutações estão na sequência da posi- ção EU G341 à posição EU K447, com estas inclusas.

103. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 102, caracterizado pelo fato de que as mutações são alte- rações de um único aminoácido.

104. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos seleci- onada do grupo consistindo em: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSI- DLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG e GGGGGGGGGGGGGGGGG.

105. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional são um espaçador de glicina.

106. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem, independentemente, em 4 a 30, 4 a 20, 8 a 30, 8 a 20, 12 a 20 ou 12 a 30 resíduos de glicina.

107. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de que o segundo ligante e o terceiro ligante opcional consistem em 20 resíduos de glicina.

108. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 90 a 107, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos monômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único aminoácido na posição EU I253.

109. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 108, ca- racterizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição EU I253 é independentemente selecionada do grupo consistindo em I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W e I253Y.

110. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 109, ca- racterizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição I253 é I253A.

111. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 110, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos monômeros do domínio Fc compreende uma mutação de único amino- ácido na posição EU R292.

112. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 111, ca- racterizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição EU R292 é independentemente selecionada do grupo consistindo em R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T e R292Y.

113. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 112, ca- racterizado pelo fato de que cada mutação de aminoácido na posição R292 é R292P.

114. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 90 a 113, caracterizado pelo fato de que a dobradiça de cada monômero do domínio Fc compreende ou consiste, independente- mente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo con- sistindo em EPKSCDKTHTCPPCPAPELL e DKTHTCPPCPAPELL.

115. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 114, ca- racterizado pelo fato de que a porção de dobradiça do segundo monô-

mero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc têm a se- quência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL.

116. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 114, ca- racterizado pelo fato de que a porção de dobradiça do primeiro monô- mero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCD- KTHTCPPCPAPEL.

117. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 114, ca- racterizado pelo fato de que a porção de dobradiça do primeiro monô- mero do domínio Fc tem a sequência de aminoácidos EPKSCD- KTHTCPPCPAPEL e a porção de dobradiça do segundo monômero do domínio Fc e do terceiro monômero do domínio Fc têm a sequência de aminoácidos DKTHTCPPCPAPELL.

118. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 117, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a sequência de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

119. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequên- cia de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

120. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequên-

cia de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-

121. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH2 de cada monômero do domínio Fc são idênticos e compreendem a sequên- cia de aminoácidos: GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK.

122. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a sequência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no máximo 10 substituições de único aminoácido.

123. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a sequência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no máximo 8 substituições de único aminoácido.

124. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a sequência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no máximo 6 substituições de único aminoácido.

125. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que os domínios CH3 de cada monômero do domínio Fc compreendem, independentemente, a sequência de aminoácidos: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG com no máximo 5 substituições de único aminoácido.

126. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 118 a 125, caracterizado pelo fato de que as substituições de único aminoácido são selecionadas do grupo consistindo em: S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

127. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 118, caracterizado pelo fato de que cada um dos monô- meros do domínio Fc compreende, independentemente, a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

128. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 127, ca- racterizado pelo fato de que até 6 das substituições de único aminoácido são mutações de carga inversa no domínio CH3 ou são mutações que formam uma protuberância modificada.

129. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 128, ca- racterizado pelo fato de que as mutações de único aminoácido estão na sequência da posição EU G341 à posição EU K447, com estas inclusas.

130. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de que pelo menos uma das mutações que formam uma protuberância modificada é selecionada do grupo consistindo em S354C, T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A,

S354C, Y349T e T394F.

131. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

132. Complexo polipeptídico caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 90 a 131, em que o polipeptídeo se une a um segundo poli- peptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e um monômero do domínio Fc de IgG1 com- preendendo um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que o polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são unidos por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobradiça de um primeiro, segundo ou terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do polipeptídeo e o domínio dobradiça do segundo polipeptídeo, e em que o polipeptídeo é unido ainda a um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade e um monômero do domínio Fc de IgG1 compreendendo um domínio do- bradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que o polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo são unidos por ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína no domínio dobradiça de um primeiro, segundo ou terceiro monômero do domínio Fc de IgG1 do peptídeo que não é unido pelo segundo polipeptídeo e o domínio dobradiça do terceiro polipeptídeo.

133. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do polipeptí- deo ou o terceiro monômero do polipeptídeo compreende mutações que formam uma cavidade modificada.

134. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que as mutações que formam a cavidade modificada são selecionadas do grupo consistindo em: Y407T, Y407A,

F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A.

135. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do polipeptí- deo compreende mutações que formam uma cavidade modificada e compreendem ainda pelo menos uma mutação de carga inversa.

136. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que o terceiro monômero do polipeptídeo compreende mutações que formam uma cavidade modificada e com- preendem ainda pelo menos uma mutação de carga inversa.

137. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 135 ou 136, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação de carga inversa é selecionada dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

138. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do peptídeo ou o terceiro monômero do peptídeo compreende duas ou quatro muta- ções de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

139. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o terceiro monômero do peptídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre: K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

140. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que o segundo monômero do peptídeo compreende duas ou quatro mutações de carga inversa, em que as duas ou quatro mutações de carga inversa são selecionadas dentre:

K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R e D356K.

141. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 140, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

142. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 141, caracterizado pelo fato de que o terceiro polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo até 10 substituições de único aminoácido.

143. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 142, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo.

144. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 143, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio variável da cadeia leve do anticorpo.

145. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 144, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade é um scFv.

146. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 144, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio VH e um domínio CH1.

147. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende ainda um domínio VL.

148. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio VH do do- mínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compre- ende um conjunto de sequências CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

149. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio VH do do- mínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compre- ende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio VH compreendendo uma sequência de anticorpos indicada na Tabela 2.

150. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio VH do domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio VH do do- mínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compre- ende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um an- ticorpo indicado na Tabela 2, e a sequência de VH, excluindo-se as se- quências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, é pelo menos 95% ou 98% idêntica à sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2.

151. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um conjunto de sequên- cias CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 indicado na Tabela 1A ou 1B.

152. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende sequências CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um conjunto de se- quências VH e VL de um conjunto de anticorpos indicado na Tabela 2.

153. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio VH compre- endendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma sequência de VH de um anticorpo indicado na Tabela 2, e um domínio VL compreendendo CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma sequência de VL de um anticorpo indi- cado na Tabela 2, em que as sequências do domínio VH e VL, exclu- indo-se as sequências CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, são pelo menos 95% ou 98% idênticas às sequências de VH e VL de um anticorpo indicado na Tabela 2.

154. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende uma sequência VH e uma sequência VL de um conjunto de anticorpos indicado na Tabela 2.

155. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio constante de anticorpo CL de IgG e um domínio constante de anticorpo CH1 de IgG.

156. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação

132, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno com uma primeira especificidade e/ou o domínio de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade compreende um domínio VH e um do- mínio CH1 e pode se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domí- nio VL e um domínio CL para formar um Fab.

157. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132 a 156, caracterizado pelo fato de que compre- ende função efetora potencializada em um ensaio de citotoxicidade ce- lular dependente de anticorpos (ADCC), um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) em relação a um complexo polipeptídico que pos- sui um único domínio Fc e pelo menos dois domínios de ligação ao an- tígeno com especificidades diferentes.

158. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 157.

159. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindica- ção 158.

160. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação

158.

161. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor de expressão como definido na reivindicação 159.

162. Método de produção do polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 157, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira como definida na reivindica- ção 161 ou 162, em condições para expressar o polipeptídeo.

163. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 160, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domí- nio VL de anticorpo.

164. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 160, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domí- nio VL de anticorpo.

165. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 160, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domí- nio VL de anticorpo e um domínio CL de anticorpo.

166. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 160, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um domí- nio VL de anticorpo e um domínio CL de anticorpo.

167. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 160, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um monô- mero do domínio Fc de IgG1 tendo não mais que 10 mutações de único aminoácido.

168. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 161, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um monô- mero do domínio Fc de IgG1 tendo não mais que 10 mutações de único aminoácido.

169. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 167 ou 168, caracterizada pelo fato de que o monômero do domínio Fc de IgG1 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 45 e 47, tendo não mais que 10, 8, 6 ou 4 mutações de único aminoácido no domínio CH3.

170. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 157.

171. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 170, caracterizada pelo fato de que menos de 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% dos polipeptídeos têm pelo menos uma modificação de fucose em um monômero do domínio Fc.