JP2020514301A - 改変されたFc抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年1月6日に出願された米国仮出願第62/443,523号の出願日の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞障害(ADCC:antibody−dependent cytotoxicity)、抗体依存性細胞貪食(ADCP:antibody−dependent cellular phagocytosis)、および補体依存性細胞障害(CDC:complement−dependent cytotoxicity)など、Fcドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。治療用タンパク質の改善に対するニーズは未だ存在する。
の配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば20個のグリシン残基からなるスペーサーである。
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a)i)第一のFcドメイン単量体、ii)第二のFcドメイン単量体、およびiii)第一のFcドメイン単量体と第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド;b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチド;c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチド;d)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン;およびe)第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のFcドメイン単量体と当該第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインが形成され、当該第二のFcドメイン単量体と当該第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、当該Fc抗原結合ドメイン構築体は、単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
a)i)第一のFcドメイン単量体、ii)第二のFcドメイン単量体、およびiii)第一のFcドメイン単量体と第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー、を含む第一のポリペプチド;b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチド;c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチド;およびd)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン;およびe)第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のFcドメイン単量体と当該第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインが形成され、当該第二のFcドメイン単量体と当該第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
a)i)第一のFcドメイン単量体、ii)第二のFcドメイン単量体、およびiii)第一のFcドメイン単量体と第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド;b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチド;c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチド;d)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン;e)第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン;およびf)第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメインであって、当該第一のFcドメイン単量体と当該第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインが形成され、当該第二のFcドメイン単量体と当該第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインが形成され、当該第一、第二、および第三の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、当該Fc抗原結合ドメイン構築体は、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
a)i)第一のFcドメイン単量体、ii)第二のFcドメイン単量体、iii)第三のFcドメイン単量体、iv)第一のFcドメイン単量体と第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、およびv)第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第一のポリペプチド;b)vi)第四のFcドメイン単量体、vii)第五のFcドメイン単量体、viii)第六のFcドメイン単量体、ix)第四のFcドメイン単量体と第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、およびx)第五のFcドメイン単量体と第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー、を含む第二のポリペプチド;c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチド;d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチド;e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチド;f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチド;およびg)第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のFcドメイン単量体と当該第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインが形成され、当該第一のFcドメイン単量体と当該第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインが形成され、当該第四のFcドメイン単量体と当該第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインが形成され、当該第三のFcドメイン単量体と当該第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインが形成され、当該第六のFcドメイン単量体と当該第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインが形成され、当該Fc抗原結合ドメイン構築体は、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、20個のグリシン残基からなる;少なくとも1個のFcドメイン単量体は、KabatのI253位に単一アミノ酸変異を含み、KabatのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される;I253位の各アミノ酸変異は、I253Aである;少なくとも1個のFcドメイン単量体は、KabatのR292位に単一アミノ酸変異を含む;KabatのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される;R292位の各アミノ酸変異は、R292Pである;各Fcドメイン単量体は独立して、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる;第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメインのヒンジ部分は、
の配列を有し、第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:10個以下の単一アミノ酸の置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:8個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:6個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:5個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K;Fcドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む;単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である;単一アミノ酸置換は、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある;改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される;2個または4個の逆電荷変異は、以下から選択される:K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K;抗原結合ドメインは、scFvである;抗原結合ドメインは、VHドメインとCH1ドメインを含む;抗原結合ドメインはさらに、VLドメインを含む;VHドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3のセットを含む;VHドメインは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含む;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含み、CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3の配列を除き、VH配列は、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列を含む;抗原結合ドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む;抗原結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む;抗原結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、当該VHドメイン配列とVLドメイン配列は、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である;抗原結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含む;抗原結合ドメインは、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む;抗原結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、VLドメインとCLドメインを含むポリペプチドに結合して、Fabを形成することができる。
;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは20個のグリシン残基からなる;少なくとも一つのFcドメイン単量体は、KabatのI253位に単一アミノ酸変異を含み、KabatのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される;I253位の各アミノ酸変異は、I253Aである;Fcドメイン単量体の少なくとも一つは、KabatのR292位に単一アミノ酸変異を含む;KabatのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される;R292位の各アミノ酸変異は、R292Pである;各Fcドメイン単量体は独立して、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる;第二のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有し、第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:10個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:8個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:6個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:5個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K;Fcドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む;単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である;単一アミノ酸置換は、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある;改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される;2個または4個の逆電荷変異は、以下から選択される:K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K;抗原結合ドメインは、scFvである;抗原結合ドメインは、VHドメインとCH1ドメインを含む;抗原結合ドメインはさらに、VLドメインを含む;VHドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3のセットを含む;VHドメインは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含む;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含み、CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3の配列を除き、VH配列は、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列を含む;抗原結合ドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む;抗原結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む;抗原結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、当該VHドメイン配列とVLドメイン配列は、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である;抗原結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含む;抗原結合ドメインは、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む;抗原結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、VLドメインとCLドメインを含むポリペプチドに結合して、Fabを形成することができる。
改変された突起を形成する変異、および逆電荷変異は、CH3ドメインにある;変異は、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある;変異は、単一アミノ酸変化である;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる:
;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、20個のグリシン残基からなる;少なくとも1個のFcドメイン単量体は、KabatのI253位に単一アミノ酸変異を含み、KabatのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される;I253位の各アミノ酸変異は、I253Aである;少なくとも1個のFcドメイン単量体は、KabatのR292位に単一アミノ酸変異を含む;KabatのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される;R292位の各アミノ酸変異は、R292Pである;各Fcドメイン単量体は独立して、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる;第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメインのヒンジ部分は、
の配列を有し、第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:10個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:8個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:6個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:5個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K;Fcドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む;単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である;単一アミノ酸置換は、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある;改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される;2個または4個の逆電荷変異は、以下から選択される:K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K。
;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる;第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、20個のグリシン残基からなる;少なくとも1個のFcドメイン単量体は、KabatのI253位に単一アミノ酸変異を含み、KabatのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される;I253位の各アミノ酸変異は、I253Aである;少なくとも1個のFcドメイン単量体は、KabatのR292位に単一アミノ酸変異を含む;KabatのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される;R292位の各アミノ酸変異は、R292Pである;各Fcドメイン単量体は独立して、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる;第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;第一のFcドメインのヒンジ部分は、
の配列を有し、第二のFcドメイン単量体と第三のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、
のアミノ酸配列を有する;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:2個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む:
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:10個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:8個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:6個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む:5個以下の単一アミノ酸置換を伴う
;単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される:T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356K;Fcドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む;単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である;単一アミノ酸置換は、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある;VHドメインまたはscFvは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3のセットを含む;VHドメインまたはscFvは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含む;VHドメインまたはscFvは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含み、CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3の配列を除き、VH配列は、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である;VHドメインまたはscFvは、表2に記載される抗体のVH配列を含む;VHドメインまたはscFvは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む;VHドメインまたはscFvは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む;VHドメインまたはscFvは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、当該VHドメイン配列とVLドメイン配列は、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である;VHドメインまたはscFvは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含む。
本明細書に記載される場合、「Fcドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第二および第三の抗体定常ドメイン(CH2およびCH3)、またはそれらの機能性断片(例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、CH2ドメインまたはその機能性断片、およびCH3ドメインまたはその機能性断片)(例えば、(i)別のFcドメイン単量体と二量体形成してFcドメインを形成し、(ii)Fc受容体に結合することができる断片)を含むポリペプチド鎖を指す。Fcドメイン単量体は、IgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である(例えば、IgG)。さらに、Fcドメイン単量体は、IgGサブタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4)とすることが可能である(例えば、IgG1)。ヒトIgG1 Fcドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトIgG1のヒンジドメインは、KabatのD221〜L235にわたり、CH2ドメインは、G236〜K340にわたり、CH3ドメインは、G341〜K447にわたる。本明細書の多くの実施例において、CH3ドメインはK347を含まない。ゆえにCH3ドメインは、G341〜G446であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、E216〜L235を含み得る。これは、例えば、ヒンジがCH1ドメインまたは抗原結合ドメインに対してアミノ末端であるときに当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどの一部の例において、Kabatの221のAspは、Glnに変異されている。Fcドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域(CDR)として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Fcドメイン単量体は、野生型Fcドメイン単量体配列からの変更を10個程度(例えば、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4個のアミノ酸置換、付加または欠失)含有することが可能であり、該変更は、FcドメインとFc受容体間の相互作用を変える。Fcドメイン単量体は、野生型Fcドメイン単量体配列からの変更(例えば、単一アミノ酸置換)を10個程度含有することが可能であり(例えば、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4個のアミノ酸置換、付加または欠失)、当該変更は、Fcドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態において、以下のヒトIgG1 CH3ドメイン配列と比較して、CH3ドメイン上に、最大で10、8、6または5個の単一アミノ酸置換が存在する:
適切な変化の例は、当分野に公知である。
の配列を有する。
100×(Aのフラクション/B)
式中、Aは候補配列および参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸(または核酸)残基の数であり、Bは参照配列内のアミノ酸(または核酸)残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合の一部の実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸(または核酸)配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸(または核酸)配列同一性と等しくないはずである。
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞障害(ADCC:antibody−dependent cytotoxicity)、抗体依存性細胞貪食(ADCP:antibody−dependent cellular phagocytosis)、および補体依存性細胞障害(CDC:complement−dependent cytotoxicity)など、Fcドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。一部の例では、本開示は、公知の単一Fcドメインを含有する例えば公知の治療用抗体などの治療用抗体の抗原結合ドメインと、少なくとも二つのFcドメインを組み合わせて、固有の生物活性を有する新規の治療用抗体を作製することを企図するものである。一部の例において、本明細書に開示される新規治療剤は、例えば公知の治療用抗体などの公知のFcドメイン含有治療剤を越える生物活性を有する。少なくとも2個のFcドメインの存在により、エフェクター機能を強化することができ、例えばADCPおよび/またはCDCと組み合わされたADCCなどの複数のエフェクター機能が活性化され、それにより治療用分子の有効性が上昇する。一貫性のある生物学的機能を有する製品を作製するためには、Fcドメインの数を制御することが必須である。本開示は、Fcドメインをコードするペプチドのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成を制御して、限定された数のポリペプチド鎖から個別サイズの分子を組み立てるFc改変ツールのセットを特徴とする。国際特許出願公開WO/2015/168643、WO2017/151971、WO2017/205436、およびWO2017/205434は、2個以上のFcドメインを有する分子を組み立てるためのFc改変ツールおよび方法を開示しており、それらは参照によりその全体が本明細書に援用される。改変ツールには、製造結果を大きく改善させる構造特性(例えばグリシンリンカー)が含まれる。これらの構築体の特性により、実質的に均質な医薬組成物の効率的な生成が可能となる。医薬組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、医薬組成物においてそのような均質性があることが望ましい。また医薬組成物に高度な均質性を持たせることで、望ましくない物質(例えば分解産物、および/もしくは凝集産物または多量体)によって引き起こされる医薬品の凝集または分解の可能性を最小限にし、ならびに望ましくない物質によって引き起こされる有害なオフターゲットの副作用を限定化させる。
Fcドメイン単量体は、ヒンジドメイン、CH2抗体定常ドメイン、およびCH3抗体定常ドメインを含む。Fcドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプIgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDのものとすることが可能である。Fcドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4)のものとしてもよい。Fcドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジおよびIgG1からのCH2およびIgAからのCH3による複合型、または、ヒンジおよびIgG1からのCH2であるがIgG3からのCH3による複合型であってもよい。Fcドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばFcγRIIIaであるFc受容体と結合することが可能なFcドメイン(本明細書でさらに規定される)である。本開示では、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインが、CH3−CH3抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Fcドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチドまたは精製用ペプチドである、N末端またはC末端に付加するさらなる部分を含む。および本開示では、Fcドメイン単量体は、例えばVH、VL、相補性決定領域(CDR)または超可変領域(HVR)である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。
本明細書で規定するように、Fcドメインは、CH3抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する二つのFcドメイン単量体を含む。Fcドメインは、Fc受容体、例えばFc−ガンマ受容体(すなわち、Fcγ受容体(FcγR))、Fc−アルファ受容体(すなわち、Fcα受容体(FcαR))、Fc−イプシロン受容体(すなわち、Fcε受容体(FcεR))および/または胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する最小限の構造を形成する。一部の実施形態では、本開示のFcドメインは、Fcγ受容体(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b))および/またはFcγRIVおよび/または胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する。
抗原結合ドメインは、標的分子に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを1個または複数含む。抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体または抗体構築体の断片、例えば、標的抗原に結合する抗体の最小部分であってもよい。抗原結合ドメインは、例えばフィブロネクチン系の結合タンパク質(例えば、FN3モノボディ)などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。断片の抗原結合(Fab)断片は、標的抗原に結合する抗体上の領域である。この領域は、重鎖および軽鎖それぞれの一つの定常ドメインと一つの可変ドメインから構成される。Fab断片は、VH、VL、CH1およびCLドメインを含む。可変ドメインのVHおよびVLはそれぞれ、単量体のアミノ末端で、相補性決定領域(CDR)が3個の1セットを含有する。Fab断片は、免疫グロブリン抗体アイソタイプのIgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDのものであり得る。またFab断片単量体は、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4)のものであってもよい。一部の実施形態において、Fab断片は、免疫グロブリンのプロテアーゼ処置(例えばペプシン)後の第二の同一Fab断片に共有結合的に付加され、F(ab’)2断片を形成してもよい。一部の実施形態において、Fabは、例えばドメイン間のリンカーを用いて融合される可変ドメインと定常ドメインの両方を含む単一ポリペプチドとして発現されてもよい。
本開示において、二量体形成選択モジュールは、二つのFcドメイン単量体の好ましい対形成を促進してFcドメインを形成する、Fcドメイン単量体内の構成要素または選択アミノ酸を含む。詳細には、二量体形成選択モジュールは、二つのFcドメイン単量体の相互作用するCH3抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、二つのCH3抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいFcドメインの最終形態は、二量体形成選択モジュールをもたないFcドメイン単量体で、または二量体形成選択モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつFcドメイン単量体で形成される他のFcドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、QuikChange(登録商標)Mutagenesis等のこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。
改変された空洞および改変された突起の使用(すなわち、「ノブイントゥホール(knob−into−hole)」ストラテジー)は、Carterおよびその協同研究者(Ridgway et al.,Protein Eng.9:617−612,1996;Atwell et al.,J Mol Biol.270:26−35,1997;Merchant et al.,Nat Biotechnol.16:677−681,1998)によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間およびホール間の相互作用は、立体的な不一致および好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第5,731,168号にも開示されている。
静電的ステアリングを、ノブ−イン−ホール(knob−in−hole)技術と組み合わせて、例えば二つの異なるポリペプチド中のFcドメイン単量体間でのヘテロ二量体形成を有利にすることができる。以下にさらに詳細に記載するが、静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の有益な静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングを使用して、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のいずれかを促進することができ、後者の場合にはノブ−イン−ホール技術と組み合わせることが有益な場合がある。ヘテロ二量体形成の場合、異なっているが、適合性のある変異を、ヘテロ二量体化されるFcドメイン単量体の各々に導入する。ゆえに、Fcドメイン単量体を改変して、以下の正電荷をもつアミノ酸置換、および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含ませることができる:D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439DおよびK439E。例えば一つのFcドメイン単量体、例えば空洞(Y349C、T366S、L368AおよびY407V)を有するFcドメイン単量体も、K370D変異を含むことができ、他のFcドメイン単量体、例えば突起(S354CおよびT366W)を有するFcドメイン単量体もE357Kを含むことができる。
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開公報第2014−0024111号に開示されている。
Fcドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、限定するものではないが表4に含むような電荷残基対などである、二つのFcドメイン単量体内に異なるものであるが適合する変異を導入することによって促進することが可能である。一部の実施形態では、Fcドメイン単量体は、以下の正電荷をもつアミノ酸置換および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含み得る:D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439DおよびK439E。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばD356KまたはE357Kを含有するFcドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばK370DまたはK370Eを含有するFcドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てFcドメインを形成する。別の実施例では、E357Kを含有するFcドメイン単量体と、K370Dを含有するFcドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てFcドメインを形成する。
Fcドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Fcドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異(ホモ二量体形成選択モジュール)を導入することによって、促進することが可能である。一部の実施形態では、二つのFcドメイン単量体が、CH3ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも二つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。二つのFcドメイン単量体内の残基の2以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したFcドメイン単量体は同じ変異の配列のFcドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではFcドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Fcドメイン単量体に導入されて、そのホモ二量体形成を促進し得る静電的ステアリング変異を、表5および6に示しているが、これらに限定されない。一実施形態では、Fcドメインは、例えばK409D/D399Kである二重の逆電荷の変異体(表5)をそれぞれ含む、二つのFcドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Fcドメインは、例えばK409D/D399K/K370D/E357Kである四重の逆電荷の変異体(表6)をそれぞれ含む、二つのFcドメイン単量体を含む。
本開示では、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインおよび/または会合する非タンパク質部分間における結合または接続を説明するために、リンカーを用いる。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも二つのFcドメイン単量体間の結合または接続であり、それに対してリンカーが、第一のFcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインのC末端を、第二のFcドメイン単量体のヒンジドメインのN末端に対して、二つのFcドメイン単量体が互いに直列に連結するように接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Fcドメイン単量体とそれに付加されるその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインのC末端を、アルブミン結合ペプチドのN末端に付加させることが可能である。
本開示では、二つのFcドメイン単量体間のリンカーは、3〜200のアミノ酸(例えば、3〜200、3〜180、3〜160、3〜140、3〜120、3〜100、3〜90、3〜80、3〜70、3〜60、3〜50、3〜45、3〜40、3〜35、3〜30、3〜25、3〜20、3〜15、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜200、5〜200、6〜200、7〜200、8〜200、9〜200、10〜200、15〜200、20〜200、25〜200、30〜200、35〜200、40〜200、45〜200、50〜200、60〜200、70〜200、80〜200、90〜200、100〜200、120〜200、140〜200、160〜200または180〜200のアミノ酸)を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。一部の実施形態では、二つのFcドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも12のアミノ酸、例えば、12〜200のアミノ酸(例えば、12〜200、12〜180、12〜160、12〜140、12〜120、12〜100、12〜90、12〜80、12〜70、12〜60、12〜50、12〜40、12〜30、12〜20、12〜19、12〜18、12〜17、12〜16、12〜15、12〜14または12〜13のアミノ酸)(例えば、14〜200、16〜200、18〜200、20〜200、30〜200、40〜200、50〜200、60〜200、70〜200、80〜200、90〜200、100〜200、120〜200、140〜200、160〜200、180〜200または190〜200のアミノ酸)を含有するアミノ酸スペーサーである。一部の実施形態では、二つのFcドメイン単量体間のリンカーは、12〜30のアミノ酸(例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30のアミノ酸)を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において公知であり、例えば、グリシンおよびセリン等のフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。或る実施形態では、スペーサーは、例えばGS、GGS、GGGGS(配列番号1)、GGSG(配列番号2)またはSGGG(配列番号3)の、複数のモチーフまたは繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、例えば
である、GSのモチーフを含む2〜12のアミノ酸を含有することが可能である。他の或る実施形態では、スペーサーは、例えば
である、GGSのモチーフを含む3〜12のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、例えば
である、GGSG(配列番号2)のモチーフを含む4〜20のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、例えば
である、GGGGS(配列番号1)のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、
である。
)と比較して、低減されたレベルのグリコシル化(例えば、低減されたレベルのO−グリコシル化)(例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース(Fuc)および/またはガラクトース(Gal)等のグリカン(例えば、キシロース)による低減したレベルのO−グリコシル化)を有し得る。
)と比較して、低減されたレベルのO−グリコシル化(例えば、低減されたレベルのO−キシロシル化)を有し得る。
)と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る。
である、GGGG(配列番号19)のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、例えば
である、GGGGG(配列番号24)のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、
である。
からなる12アミノ酸ペプチドスペーサーおよび20アミノ酸ペプチドスペーサーが直列に接続される。他の実施形態では、配列
からなる18アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するFc抗原結合ドメイン構築体は、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。
を含む。一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号37の配列と、少なくとも80%同一(例えば、80%、90%または100%同一)である配列を有する。
概して、本開示は、2〜10個のFcドメインと、1個または複数の抗原結合ドメインが付加されたFc抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。これらは、Fc受容体の一つの野生型Fcドメイン(例えばFcγRIIIa)よりも高い結合アフィニティーおよび/またはアビディティーを有し得る。本開示は、Fcドメインの二つのFcドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体または凝集の形成を回避するように、相互作用する二つのCH3抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を改変する方法を開示する。Fc抗原結合ドメイン構築体は、偶数のFcドメイン単量体を含み、Fcドメイン単量体の各対がFcドメインを形成する。Fc抗原結合ドメイン構築体は最小で二つの機能性Fcドメインと一つの抗原結合ドメインを含み、Fcドメインは、四つのFcドメイン単量体の二量体から形成される。抗原結合ドメインは、例えばリンカー、スペーサー、ペプチド結合、化学結合または化学的部分で、Fcドメインに結合され得る。
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは構築体を、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は、この技術分野で公知の従来の技術(形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等)によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源または昆虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、CHO(またはCHO由来細胞株、例えばCHO−K1、CHO−DXB11 CHO−DG44)、マウス宿主細胞(例えば、NS0、Sp2/0)、VERY、HEK(例えば、HEK293)、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7O3OならびにHsS78Bstの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質構築体の発現を調節する、または所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特性および特異的な機序を有する。適切な株化細胞または宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることが可能である。
Fc抗原結合ドメイン構築体は、タンパク質精製分野において公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー(例えばプロテインAアフィニティー)およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製に関するその他の標準技術によって、精製することが可能である。例えば、Fc抗原結合ドメイン構築体は、プロテインAカラム等のアフィニティーカラムを、適切に選択し、クロマトグラフィーカラム、ろ過、限外ろ過、塩析および透析手順と組み合わせることとによって、単離および精製することが可能である(例えば、Process Scale Purification of Antibodies,Uwe Gottschalk(ed.)John Wiley&Sons,Inc.,2009;and Subramanian(ed.)Antibodies−Volume I−Production and Purification,Kluwer Academic/Plenum Publishers,New York(2004)を参照)。
本開示は、本明細書に記載の一つまたは複数のFc抗原結合ドメイン構築体を含む医薬組成物を特徴とする。一つの実施形態において、医薬組成物は、構造が同一または実質的に同一であるFc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む。様々な例において、医薬組成物は、Fc抗原結合ドメイン構築体1〜42のいずれか一つの実質的に均質な群を含む。
医薬組成物は、投与形態と互換性のある手法で、治療効果があるような量で投与されて、症状の改善または治療をもたらす。医薬組成物は、例えば静脈内投与形態、皮下投与形態、摂取可能な溶液、薬剤放出カプセル等の経口投与形態である、種々の投与形態で投与される。個々の対象に適切な用量は、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。概して、組換えタンパク質は、1〜200mg/kg、例えば1〜100mg/kg、例えば20〜100mg/kgで投与される。したがって、最適な治療効果を得るために求められるとおりに、医療提供者が、用量を誂えて、決定し(titer)、投与経路を調整することが必要となる。
本開示に記載されるFc抗原結合ドメイン構築体は、様々なFc受容体介在性エフェクター機能を活性化することができる。免疫系の構成要素の一つは、補体依存性細胞障害(CDC)システムである。これは自然免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞の能力を強化し、外来性病原体を除去する。古典的補体経路、副補体経路、レクチン経路の三つの生化学的経路が、補体系を活性化する。それら経路すべてが、複雑な活性化とシグナル伝達カスケードのセットを伴っている。
本開示のFc抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞介在性細胞障害(ADCC)活性を強化することもできる。ADCCは能動免疫系の一部であり、抗体は外来病原体の表面抗原に結合し、それらを死に至らしめる。ADCCには、抗体によるナチュラルキラー(NK)細胞の活性化が含まれる。NK細胞はFc受容体を発現し、これが例えばIgGおよびIgMなどの抗体のFc部分に結合する。抗体が病原体に感染した標的細胞の表面に結合すると、その後に引き続いてNK細胞に結合し、活性化させる。NK細胞は、例えばIFN−γなどのサイトカイン、例えばパーフォリンおよびグランザイムなどのタンパク質を放出する。パーフォリンは、カルシウムの存在下で多量体化する孔形成サイトリシンである。グランザイムは、標的細胞中でプログラム化細胞死を誘導するセリンプロテアーゼである。NK細胞に加えて、マクロファージ、好中球、および好酸球もADCCを介在することができる。
本開示のFc抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞貪食(ADCP)活性を強化することもできる。ADCPは抗体オプソニン化としても知られており、このプロセスによって、病原体は、貪食細胞による摂食と除去の目印を付けられる。貪食細胞は、有害な外来病原体と、死んだ細胞または死にゆく細胞を摂食することによって身体を保護する細胞である。このプロセスは、病原体関連分子パターン(PAMPS)によって活性化され、NF−kBの活性化へと繋がっていく。次いで例えばC3bと抗体などのオプソニンが標的病原体に付加され得る。標的がオプソニンでコーティングされると、Fcドメインは、そのFc受容体を介して貪食細胞を引き付ける。次いで貪食細胞がその細胞を包み込み、摂食された物質のファゴソームが、リソソームと融合する。次いで、結果として出来たファゴリソソームが、細胞物質をタンパク質分解的に消化する。
タンパク質発現
Fc抗原結合ドメイン構築体は、フォールディング効率を上昇させ、望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成し得るサブユニットの非制御的な会合を最小化させるよう設計され、実質的に均質な(例えば少なくとも85%、90%、95%、98%、または99%均質な)医薬用途用組成物が作製されるように設計される。これら目標を念頭に、単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体7(CD20)および構築体7(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(抗CD20長鎖Fc(配列番号62)または抗PD−L1長鎖Fc(配列番号54)のいずれか2コピー、および短鎖Fc(配列番号63)を2コピー)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれか2コピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、E357K電荷変異、ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、電荷変異(K409D/D399K変異)Fcドメイン単量体(ホモ二量体形成を促進する)とともに直列で連続して含有し、N末端の、抗CD20VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体7(CD20))、またはN末端の、抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体7(PD−L1))のいずれかを含有する。短鎖のFc鎖は、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖はまた、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現されることもできる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表7のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。Fc−抗原結合ドメイン構築体7(CD20)が純粋であることを示した(図43、レーン4)。
タンパク質発現
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体13(CD20)および構築体13(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(抗CD20長鎖Fc(配列番号64および67〜69のいずれか一つ)または抗PD−L1長鎖Fc(配列番号58、59、60および65のいずれか一つ)のいずれか2コピー、および短鎖Fc(配列番号63)を2コピー)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれか2コピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、電荷変異(K409D/D399K変異)Fcドメイン単量体(ホモ二量体形成を促進する)を、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに、直列に連続して含有し、N末端の、抗CD20 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体13(CD20))、またはN末端の、抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体13(PD−L1))のいずれかを含有する。短鎖のFc鎖は、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現されることができる。四つの型の構築体13が、抗CD20重鎖、および抗PD−L1重鎖とともに作製された。各型は、長鎖Fcポリペプチド中のFcドメイン単量体間に異なる大きさのグリシンスペーサー(G4、G10、G15またはG20リンカー)を保有した。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。以下の構築体のそれぞれのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。Fc−抗原結合ドメイン構築体13(CD20)が純粋であることを示した(図43、レーン5)。
非対称直列Fcドメインから形成された非分岐構築体は以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体1(図1)は、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを直列に連続して含有し、各Fcドメイン単量体は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)(ヘテロ二量体形成を促進する)導入することで作製される改変突起を有する。抗原結合ドメインは、長鎖Fcと同じアミノ酸配列の一部として発現されてもよい(例えば、scFvを形成するため)。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、任意で表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)(ヘテロ二量体形成を促進する)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。本実施例において、Fc抗原結合ドメイン構築体2〜42に関する以下の実施例のそれぞれにおいて、細胞は、抗体可変軽鎖を発現する第三のプラスミドを含有してもよい。
非対称直列Fcドメインから形成された非分岐構築体は以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体2(図2)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、3コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を、N末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、各Fcドメイン単量体は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体3(図3)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、各Fcドメイン単量体は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製された。Fc抗原結合ドメイン構築体4(図4)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、3コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、各Fcドメイン単量体は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体5(図5)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を、N末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、各Fcドメイン単量体は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体6(図6)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、3コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を、N末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、各Fcドメイン単量体は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体7(図7)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体8(図8)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体9(図9)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体10(図10)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、直列に連続した2個のFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該直列に連続したFcドメイン単量体の各々は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有している。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体11(図11)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、直列に連続した2個のFcドメイン単量体と、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するN末端のFcドメイン単量体を、直列に連続して含有し、当該直列に連続したFcドメイン単量体の各々は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有している。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体12(図12)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、直列に連続した2個のFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、当該直列に連続したFcドメイン単量体の各々は、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有している。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体13(図13)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体14(図14)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するN末端のFcドメイン単量体を、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体15(図15)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体16(図16)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、2個のFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体17(図17)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、N末端の、2個のFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体18(図18)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、2個のFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端FcドメインまたはC末端Fcドメインのいずれにもない。Fc抗原結合ドメイン構築体19(図19)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、および表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製された。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体20(図20)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、および表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する、N末端の、別のFcドメイン単量体とともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体21(図21)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体、およびN末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の抗原結合ドメインとを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体22(図22)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体23(図23)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、3コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該3個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体24(図24)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体25(図25)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体26(図26)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を各々が有する2個のFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体27(図27)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を有する別の突起含有Fcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体28(図28)は、2種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、4コピーの短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異を少なくとも1個(例えばS354CおよびT366W変異)、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数(例えばE357K)導入することで作製される改変突起を各々が有する2個のFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)を少なくとも1個、および任意で、表4から選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を1個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、N末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体29(図29)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異の異なるセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体を含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体30(図30)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異の異なるセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体31(図31)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fc)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異の異なるセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。アミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる短鎖Fcおよび長鎖Fcに対するものである。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体32(図32)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcと、2コピーの第一短鎖Fc、および1コピーの第二短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該3個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異のセット(ヘテロ二量体形成変異)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する(第三のFcドメイン単量体は、最初の二つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する)。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体を含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体33(図33)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fc、および2コピーの第一短鎖Fc、および1コピーの第二短鎖Fc)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該3個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異のセット(ヘテロ二量体形成変異)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する(第三のFcドメイン単量体は、最初の二つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する)。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体34(図34)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(長鎖Fc、2コピーの第一短鎖Fc、および1コピーの第二短鎖Fc)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を、N末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該3個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異のセット(ヘテロ二量体形成変異)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する(第三のFcドメイン単量体は、最初の二つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する)。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体35(図35)は、4種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2種の別個の長鎖Fc、および2種の別個の短鎖Fc)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。第一の長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第二の長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の長鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、四つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体36(図36)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fcのそれぞれ2コピー)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する第二のFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体を含有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体37(図37)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fcのそれぞれ2コピー)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する第二のFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体38(図38)は、4種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2種の別個の長鎖Fc、および2種の別個の短鎖Fc)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。第一の長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第二の長鎖Fcは、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の長鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびNN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、四つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体39(図39)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fcのそれぞれ2コピー)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する第二のFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Fcは、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体を含有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体40(図40)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fcのそれぞれ2コピー)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第一のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有するFcドメイン単量体、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する第二のFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体41(図41)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fcのそれぞれ2コピー)と、2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の異なるセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、空洞含有Fcドメイン単量体を含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の2個の異なるセットを有する長鎖Fcと短鎖Fcを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体42(図42)は、3種の別個のFc単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fcと、2種の別個の短鎖Fcのそれぞれ2コピー)と、3種もしくは2種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2個のFcドメイン単量体を、表4または表5から選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体、およびN末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該2個のFcドメイン単量体はそれぞれ、表3から選択される突起形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の異なるセット、および任意で、表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第一の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、表3から選択される空洞形成変異の第一のセット(ヘテロ二量体形成を促進する)、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。第二の短鎖Fcは、Fcドメイン単量体、およびN末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Fcドメイン単量体は、第一の短鎖Fc中の変異の第一のセットとは異なる、表3から選択される空洞形成変異(ヘテロ二量体形成変異)の第二のセット、および任意で表4から選択される逆電荷変異を1個または複数、有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
Fc抗原結合ドメイン構築体は、3個のFcドメインと、N末端のCTLA4 Fabドメインを有して設計された。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。発現されたタンパク質は、実施例1にあるように精製された。タンパク質は、非還元SDS−PAGEゲル上で泳動された(図44)。S3IおよびS3Y SIF−体タンパク質は、各々が異なるプラスミドから発現された三つの異なるタンパク質を含むヘキサマーである。レーン上の数字は、発現用細胞にトランスフェクトされたプラスミドDNAの比率を表す。2:1:1の比率は、0.5mgのSIF−体長鎖プラスミド、0.25mgのSIF短鎖プラスミド、および0.25mgのFab軽鎖が、細胞1リットルへのトランスフェクトのために使用された混合液中に存在したことを示す。1:1:1の比率では、0.33mgの各プラスミドが使用された。4:1:1の比率では、0.67mgの長鎖、0.167mgの短鎖、0.167mgの軽鎖が使用された。
抗CTLA−4抗原結合ドメインを含有する2個の構築体を、構築体7および13の設計に基づいて生成した。親mAbと、両Fc抗原結合ドメイン構築体の抗原結合ドメインが、イピリムマブ由来のCDRを含有する。CTLA−4への標的結合を測定するために、SPRアッセイを実施した(図45)。左のパネルにおいて、親mAB、Fc3Y− Fc−抗原結合ドメイン構築体(イピリムマブ抗原結合ドメインを用いた構築物13の改変型)、およびFc3I−Fc抗原結合ドメイン構築体(イピリムマブ抗原結合ドメインを用いた構築体7の改変型)の解離定数を測定した。Fc3Y−Fcは、親mAbと比較してCTLA−4標的結合の強化を示した。一方で、Fc3I−Fcは親mAbと類似したCTLA−4標的結合を示した。右のパネルにおいて、異なるFc抗原結合ドメイン構築体のFcγRIIIa結合を測定するために使用された別のSPRアッセイの結果を示す。三つのイピリムマブ型が試験され、脱フコシル化が結合を約10倍強化することが判明した。SIF3I、SIF3Y、およびイピリムマブCDRを含有する、その対応する抗原結合ドメインを有する両構築体の四つのFc抗原結合ドメイン構築体が試験された。四つの構築体すべてが、親mAbと比較して約300〜800倍強化されたFcγRIIIa結合を示した。
親mAbおよび様々なFc抗原結合ドメイン構築体による、CDC、ADCPおよびADCC経路の活性化を検証するために三つのアッセイを使用した。抗CD20モノクローナル抗体であるGazyva(オビヌツズマブ)由来のCDRを含有する四つの構築体を作製した。フコシル化mAbおよび脱フコシル化mAbの両方を作製し、ならびにS3Y(実施例2に記載されるように、構築体13、図13の構造)およびSAI(実施例1に記載されるように、構築体7、図7の構造)のFc抗原結合ドメイン構築体が作製された。CDCアッセイを以下のとおり実施した:
1.抗CD20 CDCアッセイにおいて使用された標的細胞は、Rajiリンパ芽球様ヒトB細胞株(ATCC CCL−86)である。Raji細胞を遠心により懸濁培養液から取り出し、6x105細胞/mlでX−VIVO 15培地中に再懸濁した。
2.Raji細胞を、96ウェルの平底アッセイプレートに、1ウェル当たり100μl(6x104細胞/ウェル)の量で移した。
3.抗CD20モノクローナル抗体(mAb)およびSIF体の各々を、X−VIVO 15培地中で3.33μMに希釈した。次いで、1.5mlポリプロピレンチューブ中で、抗CD20 mAbおよびSIF体の各々を用いて、連続1:3希釈を行い、11点の希釈シリーズを得た。
4.抗CD20 mAbおよびSIF体の各希釈を、アッセイプレート中の適切なウェルに、50μl/ウェルで移した。
5.抗CD20 mAbおよびSIF体を移した後ただちに、50μlの正常なヒト血清補体をアッセイプレート中の各ウェルに移した。
6.アッセイプレートを37℃、5%CO2で2時間インキュベートした。
7.2時間インキュベーションした後、20μlのWST−1増殖試薬をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
8.プレートを37℃、5%CO2のインキュベーターへと14時間戻した。
9.14時間のインキュベーション後、プレートを、プレート振盪器上で1分間振盪し、分光光度計を使用して、600nmの補正を用いて、450nmで直ちにウェルの吸光度を決定した。
FcγRIIa−H ADCPレポーターバイオアッセイのComplete Kit(Promega社、カタログ番号G9901)は、生物発光細胞系アッセイであり、これを使用して、FcγRIIaに特異的に結合および活性化する抗体、ならびにFcドメインを有する他の生物物質の有効性と安定性を測定することができる。アッセイは、アミノ酸131位でヒスチジン(H)を含有する高アフィニティーヒトFcgRIIa−Hバリアント、およびNFAT−応答要素(NFAT−RE)により駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株からなる。標的細胞と関連抗体を共培養したとき、FcγRIIa−Hエフェクター細胞が抗体のFcドメインに結合し、FcγRIIaのシグナル伝達とNFAT−RE−介在性のルシフェラーゼ活性が生じる。生体発光シグナル信号を検出し、Bio−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準蛍光度計を使用して定量した。抗CD20 AbsおよびSIF体(構築体7(CD20)または構築体13(CD20))の濃度を上げてRaji(CD20+)標的細胞およびFcと共にインキュベートした。抗CD20 AbsおよびSIF体の濃度を上げて、図47の中央のパネルで指定される濃度で、Raji(CD20+)標的細胞およびFcγRIIa−Hエフェクター細胞とともにインキュベートした(2:1 E:T比。およそ35,000個のエフェクター細胞:15,000個の標的細胞)。6時間、37℃でインキュベーションを進行させた。Bio−Glo(商標)。試薬を添加し、発光をPHERAstarのFS測定器で測定した。データは、図47の中央のパネルにおいて指定された濃度のRIIa−Hエフェクター細胞(2:1 E:T比、およそ35,000個のエフェクター細胞:15,000個の標的細胞)、GraphPad Prismソフトウェアを使用して4PL曲線に適合させた。6時間、37℃でインキュベーションを進行させた。Bio−Glo(商標)試薬を添加し、発光を、PHERAstar FS測定器で測定した。GraphPad Prismソフトウェアを使用して、データを4PL曲線に適合させた(図47、中央のパネル)。SAI構築体(構築体7(CD20))およびS3Y構築体(構築体13(CD20))の両方が、mAbと比較して100倍超の有効性の上昇を示した。
ヒト初代NKエフェクター細胞(Hemacare社)を解凍し、5x105/mLで、リンパ球増殖培地−3(Lonza社)中、37℃で一晩、そのままの状態にさせた。次の日、ヒトリンパ芽球様細胞株のRaji標的細胞(ATCC CCL−86)を回収し、アッセイ培地(フェノールレッドフリーのRPMI、10%FBSΔ、GlutaMAX(商標))中に再懸濁させ、様々な濃度の関心対象の各プローブの存在下で30分間、37℃で播種した。次いで休ませたNK細胞を回収し、アッセイ培地中に再懸濁させ、抗CD20をコートしたRaji細胞を含有するプレートに添加した。エフェクター細胞と標的細胞の最終比率を5:1(5x104NK細胞:1x104 Raji細胞)として、37℃で6時間、プレートをインキュベートした。
ペプチドおよびグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−MS/MS
タンパク質は、6Mのグアニジン(Sigma社)中で1μg/μLに希釈した。ジチオスレイトール(DTT)を濃度10mMまで加えて、65℃で30分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で1時間、30mMのヨードアセトアミド(IAM)と共にインキュベートして、遊離チオールをアルキル化(カルバミドメチル化(carbamidomethylate))した。その後タンパク質を、10kDa膜を介して25mMの炭酸水素アンモニウム緩衝液(pH7.8)中に透析し、IAM、DTTおよびグアニジンを除去した。タンパク質は、Barocycler(NEP 2320、Pressure Biosciences社)中で、トリプシンで消化した。圧力は、37℃で、20,000psiと周囲圧力との間を1時間に合計30サイクルで循環させた。ペプチドのLC−MS/MS分析は、Ultimate 3000(Dionex)クロマトグラフィーシステムとQ−Exactive(Thermo Fisher Scientific社)質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として0.1%FA水溶液および0.1%FAアセトニトリル溶液を用いて、BEH PepMap(Waters社)カラムで分離した。四重極型の分離幅(isolation width)±1.5Daで、2価イオン(z=2)m/z 842.5に基づいて、一つずつキシロシル化されたリンカーペプチドをターゲットとした。
タンパク質は、78.98%の水、20%のアセトニトリル、1%のギ酸(FA)および0.02%のトリフルオロ酢酸からなる移動緩衝液(running buffer)中で、2μg/μLの濃度に希釈した。サイズ排除クロマトグラフィー分離は、合計カラム長700mmに直列にした二つのZenix−C SEC−300(Sepax Technologies社、デラウェア州ニューアーク)2.1×350mmで行った。タンパク質は、80μL/分の流量で、上記した移動緩衝液を用いてSECカラムから溶出した。質量スペクトルは、ポジティブモードで動作させたQSTAR Elite(Applied Biosystems社)Q−ToF質量分光計で取得した。それぞれのサイズのフラクション下の中性質量を、クロマトグラフィーピークの全幅にわたってスペクトルを合計することによって、ベイズのピークデコンボリューション(Bayesian peak deconvolution)を用いてデコンボリュートした。
サンプルを1mg/mLに希釈して、HTタンパク質発現変性緩衝液(HT Protein Express denaturing buffer)(パーキンエルマー(PerkinElmer)社)と混合した。混合物を40℃で20分間インキュベートした。サンプルを70μLの水で希釈して、96ウェルプレートに移した。サンプルは、HT Protein Express LabChip(パーキンエルマー社)を備えたCaliper GXII機器(パーキンエルマー社)で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
CDCは、連続希釈されたリツキシマブ、Fc構築体4またはIVIgでRaji細胞(ATCC)がコーティングされた、比色分析アッセイで評価した。全てのウェルにヒト血清補体(Quidel社)を25%v/vで添加し、37℃で2時間インキュベートした。細胞は、WST−1細胞増殖試薬(Roche Applied Science社)を添加した後で、37℃で12時間インキュベートした。プレートを振とう機に2分間移し、450nmの吸光度を測定した。
3個のFcドメイン、および2個の「分岐」サブユニット内にノブイントゥホール変異を有するFc構築体の長鎖ポリペプチドおよび短鎖ポリペプチドを発現するプラスミド(Fc構築体A)、または3個のFcドメイン、ならびに2個の「分岐」サブユニット内にノブイントゥホール変異および静電的ステアリング変異を有するFc構築体の長鎖ポリペプチドおよび短鎖ポリペプチドを発現するプラスミド(Fc構築体B)を、HEK293細胞にトランスフェクトした。培養7日後に、遠心分離で細胞を除き、生培地上清を非還元SDS−PAGEで分離した(図10)。可視化させたタンパク質バンドの濃度測定分析で、3個のFcドメインを有するFc構築体Aと、3個のFcドメインを有するFc構築体Bが、同レベルで発現されている(Fc3)ことが明らかになった。しかしながら、Fc構築体Aの構築体は、混入状態の二量体(Fc2)種を有意に高いレベルで発現した(図51)。両セットの構築体は、単量体の種(Fc1)を同様のレベルで発現した。画像中に存在するさらなるバンドは、偽トランスフェクト対照(mock transfected control)中に存在している培地成分を表す。
望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成するサブユニットの見当違い(off−register)な会合を最小化するために、ヘテロ二量体形成に有利に働く変異(例えば、ノブアンドホール)を「枝」サブユニット内に導入した。これらのアミノ酸置換は、ノブのサブユニットとホールのカウンターパートの呼び合いを持続させ、それと同時にノブサブユニット間の会合を妨害する。ノブ変異は野生型のFc配列との組立も抑制するため、「幹」Fcサブユニットと、ノブおよびホールの「枝」サブユニットの親和性をさらに減少させるための追加的変異を含ませる必要性は疑問視される。この疑問に対処するため、カルボキシル末端「幹」サブユニット内に野生型Fcドメイン単量体配列と、アミノ末端「枝」サブユニット内にノブ変異をもつFcドメイン単量体とを含有する、Fc構築体の長ポリペプチドを生成した。対応する短ポリペプチドは、ホール変異をもつFcドメイン単量体とした。このFc構築体は、Fc構築体A内のポリペプチド配列に基づいているが、長鎖ポリペプチドそれぞれのカルボキシ末端の「幹」サブユニット中には野生型のFcドメイン単量体配列がある。
タンパク質発現
非対称直列Fcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製された。Fc抗原結合ドメイン構築体4(CD20)および構築体4(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(長鎖Fc(配列番号66)、および抗CD20短鎖Fc(配列番号67)または抗PD−L1 Fc鎖(配列番号68)のいずれか3コピー)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれか3コピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、3個のFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、ここで各Fcドメイン単量体は、E357K電荷変異、ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有する。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368AおよびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体、ならびにN末端の、抗CD20 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体4(CD20))、またはN末端の、抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体4(PD−L1))のいずれかを含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖も、scFvの一部として短鎖FcのN末端に融合されて発現されることができる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表9の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fcをコードし、一つのプラスミドは短鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
タンパク質発現
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体8(CD20)および構築体8(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fc(配列番号69)、および抗CD20短鎖Fc(配列番号67)または抗PD−L1 短鎖Fc(配列番号68)のいずれか2コピー)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、E357K電荷変異、ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有する。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368AおよびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体、ならびにN末端の抗CD20 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体8(CD20))、またはN末端の抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体8(PD−L1))のいずれかを含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖も、scFvの一部として短鎖FcのN末端に融合されて発現されることができる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表10の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fcをコードし、一つのプラスミドは短鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
タンパク質発現
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体9(CD20)および構築体9(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(抗CD20長鎖Fc(配列番号62)または抗PD−L1長鎖Fc(配列番号54)のいずれか2コピー、および抗CD20短鎖Fc(配列番号67)または抗PD−L1 短鎖Fc(配列番号68)のいずれか2コピー)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、E357K電荷変異、ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異のK409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列で連続して含有し、N末端の抗CD20VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体9(CD20))、またはN末端の抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体9(PD−L1))のいずれかを含有する。短鎖Fcは、K370Dの電荷変異ならびにY349C、T366S、L368AおよびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体、ならびにN末端の抗CD20重鎖(構築体9(CD20))またはN末端の抗PD−L1重鎖(構築体9(PD−L1))を含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖も、scFvの一部として長鎖Fcおよび/または短鎖FcのN末端に融合されて発現されることができる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表11の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは短鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
タンパク質発現
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体10(CD20)および構築体10(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(抗CD20長鎖Fc(配列番号70)または抗PD−L1長鎖Fc(配列番号71)のいずれか2コピー、および4コピーの短鎖Fc(配列番号63)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは2個のFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、ここで各Fcドメイン単量体は、E357K電荷変異、ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有し、逆電荷変異のK409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列で連続して含有し、N末端の抗CD20VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体10(CD20))、またはN末端の抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体10(PD−L1))のいずれかを含有する。短鎖のFc鎖は、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現されることができる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表12の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
タンパク質発現
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、C末端Fcドメインにある。Fc抗原結合ドメイン構築体16(CD20)および構築体4(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(抗CD20長鎖Fc(配列番号72)または抗PD−L1長鎖Fc(配列番号73)のいずれか2コピー、および4コピーの短鎖Fc(配列番号63)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれか3コピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、逆電荷変異のK409DおよびD399K変異(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、2個のFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有し、その各単量体は、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有し、N末端の抗CD20 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体10(CD20))、またはN末端の抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体10(PD−L1))のいずれかを含有する。短鎖のFc鎖は、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現されることができる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表13の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
タンパク質発現
単独分岐したFcドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、N末端FcドメインまたはC末端Fcドメインのいずれにもない。Fc抗原結合ドメイン構築体19(CD20)および構築体19(PD−L1)は各々、2種の別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(抗CD20長鎖Fc(配列番号74)または抗PD−L1長鎖Fc(配列番号75)のいずれか2コピー、および4コピーの短鎖Fc(配列番号63)、および抗CD20軽鎖ポリペプチド(配列番号61)または抗PD−L1軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Fcは、E357Kの電荷変異、ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異のK409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列で連続して含有し、E357Kの電荷変異ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有し、N末端の抗CD20VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体19(CD20))、またはN末端の抗PD−L1 VHおよびCH1ドメイン(Kabatの1〜220位)(構築体19(PD−L1))のいずれかを含有する。短鎖のFc鎖は、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を含有する。抗CD20軽鎖または抗PD−L1軽鎖はまた、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現されることもできる。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表14の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド(一つのプラスミドは軽鎖(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは長鎖Fc(抗CD20または抗PD−L1)をコードし、一つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
サンプルを、Laemmliサンプルバッファー(4%SDS、Bio−Rad社)中で、95℃で10分間、変性させた。サンプルを、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad社)で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
抗CD20モノクローナル抗体であるオビヌツズマブと比較して、抗CD20 Fc構築体が、CDC活性を強化する度合いを検証するためのCDCアッセイを開発した。GazyvaのCDRを有する抗CD20 Fc構築体4、7、8、9、10、13および19は、実施例1、2および51〜56に記載されるように作製した。四つの型の構築体13(CD20)を作製した。それらは長鎖の長鎖Fc単量体の間のグリシンスペーサーのサイズのみが異なっている(G4、G10、G15およびG20リンカー)。それぞれの抗CD20 Fc構築体、およびオビヌツズマブモノクローナル抗体は、以下のように実施されるCDC アッセイにおいて検証された:
10%の熱非働化FBSを補充したRPMI−1640中で増殖させたDaudi細胞を沈殿させ、氷冷PBSで1回洗浄し、1mL当たり1.0x106個の生細胞の濃度で、0.1%BSA含有RPMI−1640中に再懸濁させた。この細胞懸濁液50マイクロリットルを、96ウェルプレートのすべてのウェル(プレートの端を除く)に加えた。プレートは、すべての添加が済むまで氷上に保持された。被験物質を、RPMI−1640+BSA中で、450nMの開始濃度から4倍連続希釈した。各被験物質に対し、総数で10段階の濃度を検証した。播種されたDaudi細胞に対し、それぞれ50マイクロリットルを加えた。正常またはC1q枯渇ヒト補体血清(Quidel社、カリフォルニア州サンディエゴ)を、RPMI−1640+BSA中、1:5に希釈した。播種されたDaudi細胞に対し、それぞれ50マイクロリットルを加えた。6個の正常血清対照ウェルには、細胞、培地のみ(処置無し)、および1/5正常血清(正常バックグラウンド)を入れた。これらウェルのうち3個には、16.5μLのTriton X−100(Promega社、ウィスコンシン州マディソン)(正常溶解対照)も入れた。C1q枯渇バックグラウンドおよび溶解対照も同様に調製した。PBSをすべてのプレート端のウェルに入れた。2時間、37℃でプレートをインキュベートした。2時間後、予め温めたAlamarブルー(Thermo社、マサチューセッツ州ウォルサム)50μLを全ウェルに加えた(プレート端を除く)。プレートをインキュベーターに一晩戻した(18時間、37℃)。18時間後、蛍光を、FlexStation3で測定した。プレートは、544/590 Ex/Emフィルターおよび自動カットオフを使用して最高点を読み取った。正常なバックグラウンド、正常な溶解対照、C1q枯渇バックグラウンド、およびC1q枯渇溶解対照のウェルに対し、平均値が算出された。細胞溶解の百分率を以下のように計算した:
細胞溶解%=(RFU試験−RFUバックグラウンド)/(RFU溶解対照−RFUバックグラウンド)×100
各構築体に対して、EC50(nM)が決定された。
抗PD−L1モノクローナル抗体であるアベルマブ(avelumab)(バベンチオ(Bavencio))と比較して、抗PD−L1 Fc構築体が、CDC活性を強化する度合いを検証するためのCDCアッセイを開発した。アベルマブのCDRを有する抗PD−L1 Fc構築体7、8、10、13および19は、実施例1、2および51〜56に記載されるように作製した。四つの型の構築体13(PD−L1)を作製した。それらは長鎖の長鎖Fc単量体の間のグリシンスペーサーのサイズのみが異なっている(G4、G10、G15およびG20リンカー)。それぞれの抗PD−L1 Fc構築体、およびアベルマブモノクローナル抗体は、以下のように実施されるCDC アッセイにおいて検証された:
ヒトPD−L1遺伝子を安定的に発現するようトランスフェクトされたヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞株(CrownBio社)を、DMEM(10%FBS、および選択マーカーとして2μg/mLのピューロマイシン)において培養した。細胞を回収し、ゲネテシン(genetecin)またはフェノールレッドを含まないX−Vivo−15培地(Lonza社)において希釈した。6x105細胞/mLのHEK−PD−L1細胞100μlを、96ウェルの組織培養処理平底プレート(BD Falcon社)に播種した。Fc構築体および抗体に、X−VIVO−15培地中で1:3の連続希釈を行った。希釈された構築体50μLを、ウェルへ、標的細胞の上部に添加した。50μlの非希釈のヒト血清補体(Quidel Corporation)を、各ウェルに添加した。次いで、アッセイプレートを37℃で2時間インキュベートした。2時間インキュベートした後、20μLのWST−1細胞増殖試薬(Roche Diagnostics Corp)を各ウェルに加え、37℃で一晩インキュベートした。翌朝、アッセイプレートをプレート振とう器上に2〜5分間置いた。吸光度は、分光光度計(Molecular Devices SPECTRAmax M2)上、600nmで補正を行い、450nmで測定した。各構築体に対して、EC50(nM)が決定された。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
3構築体は、アッセイ条件下で測定可能なCDCを発生させなかった。
ADCPレポーターアッセイ
抗CD20モノクローナル抗体のオビヌツズマブ(Gazyva)と比較して、抗CD20 Fc構築体が、FcγRIIaシグナル伝達を活性化し、それによりADCP活性を強化する度合いを検証するためのADCPレポーターアッセイを開発した。GazyvaのCDRを有する抗CD20 Fc構築体4、7、8、9、10、13および19は、実施例1、2および51〜56に記載されるように作製した。四つの型の構築体13(CD20)を検証した。それら構築体は、長鎖Fc単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっている(G4、G10、G15およびG20リンカー)。各抗CD20 Fc構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCレポーターアッセイにおいて検証した:
Raji標的細胞(1.5x104細胞/ウェル)およびJurkat/FcγRIIa−Hエフェクター細胞(Promega社)(3.5x104細胞/ウェル)を、4%低IgG血清(Promega社)を補充したRPMI1640培地中に再懸濁し、連続希釈した抗CD20 Fc構築体を含む96ウェルプレートに播種した。5%CO2中、37℃、6時間のインキュベーションを行った後、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Bio−Glo Luciferase Assay Reagent(Promega社)を使用して発光を測定した。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
抗CD20 Fc構築体7、8、9、13(G20リンカー)および19を、追加のADCPアッセイにおいて検証し、ADCPレポーターアッセイの結果を確認した。各抗CD20 Fc構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCアッセイにおいて検証した:
単球を凍結PBMCから精製し、M−CSFの存在下、バッグ中で培養した。IL−10を培養バッグに添加し、2日後に分化したM2cマクロファージをADCPアッセイにおいて使用した。単球/マクロファージの合計培養時間は8日であった。抗CD20 Fc構築体を10倍連続希釈して、KILR Raji細胞とともに30分間インキュベートした。マクロファージを、Hyclone社の10%Super Low IgG Defined FBS(熱不動化)を含有するフェノールレッドフリーのRPMI(Life Technology社)のアッセイ培地中に再懸濁し、8:1の(M2c)エフェクター:標的比で、コートされたKILR Raji細胞を含有するプレートに播種し、24時間インキュベートした。インキュベーション後、PathHunter(登録商標)ProLabel(登録商標)/ProLink(商標)検出キット試薬をプレートに添加し、室温で60分のインキュベーションの後、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)上で読み取った。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
ADCPレポーターアッセイ
抗PD−L1 Fc構築体が、抗PD−L1モノクローナル抗体のアベルマブ(avelumab)(バベンシオ(Bavencio))と比較して、FcγRIIaシグナル伝達を活性化し、それによりADCP活性を強化する度合いを検証するためのADCPレポーターアッセイを開発した。アベルマブのCDRを有する抗PD−L1 Fc構築体4、7、8、9、10、13、16および19は、実施例1、2および51〜56に記載されるように作製した。四つの型の構築体13(PD−L1)を検証した。それら構築体は、長鎖Fc単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっている(G4、G10、G15およびG20リンカー)。各抗PD−L1 Fc構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCレポーターアッセイにおいて検証した:
標的HEK−PD−L1細胞(1.5x104細胞/ウェル)およびJurkat/FcγRIIa−Hエフェクター細胞(Promega社)(3.5x104細胞/ウェル)を、4%低IgG血清(Promega社)を補充したRPMI1640培地中に再懸濁し、連続希釈した抗PD−L1 Fc構築体を含む96ウェルプレートに播種した。5%CO2中、37℃、6時間のインキュベーションを行った後、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Bio−Glo Luciferase Assay Reagent(Promega社)を使用して発光を測定した。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
3構築体は、アッセイ条件下で測定可能なFcγRIIaシグナル伝達を誘導しなかった。
抗PD−L1 Fc構築体8、9、および13(G20リンカー)を、追加のADCPアッセイにおいて検証し、ADCPレポーターアッセイの結果を確認した。各抗PD−L1 Fc構築体、およびフコシル化アベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCアッセイにおいて検証した:
M2cマクロファージを、1ウェル当たり2x105細胞で、96ウェルのU底の超低結合プレート(Costar社、7007)に播種し、少なくとも1時間、37℃、5%CO2の加湿インキュベーターに平衡化させた。HEK293 PD−L1細胞を、カルセイン−AM(Invitrogen社、C−3100)を用いてメーカーのプロトコールに従い染色し、6.7nMから5倍希釈された抗PD−L1構築体とともに15分間、室温で前インキュベーションを行った。次いでそれらを3:1のエフェクター:標的比でマクロファージと混ぜ合わせ、2時間、37℃、5%CO2インキュベーターでインキュベートした。染色用のV底96ウェルプレートに細胞を移し、次いでFACS緩衝液(PBS+2% FBS)を用いて洗浄した。集めた細胞を、Fcブロック(Biolegend社、422302)を使用してブロッキングし、抗CD11b−APC Ab(Biolegend社、301310)を用いて4℃、1時間で染色した。細胞をFACS緩衝液で洗浄し、BD FACS Verseで読み取った。FlowJoを使用して解析を行った。ダブレットは、FSC−H対FSC−Aのプロットによる算出から取り除いた。カルセイン−AMおよびCD11bが陽性の細胞は、貪食事象として、または二重陽性マクロファージ(DP)としてみなされた。貪食の百分率は、(DP細胞数/総標的細胞数)*100を計算することにより算出された。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
ADCCレポーターアッセイ
抗CD20モノクローナル抗体のオビヌツズマブ(Gazyva)と比較して、抗CD20 Fc構築体が、FcγRIIIaシグナル伝達を誘導し、ADCC活性を強化する度合いを検証するためのADCCレポーターアッセイを開発した。GazyvaのCDRを有する抗CD20 Fc構築体4、7、8、9、10、13および19は、実施例1、2および51〜56に記載されるように作製した。四つの型の構築体13(CD20)を検証した。それら構築体は、長鎖Fc単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっている(G4、G10、G15およびG20リンカー)。各抗CD20 Fc構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCレポーターアッセイにおいて検証した:
Raji標的細胞(1.25x104細胞/ウェル)およびJurkat/FcγRIIIa−Hエフェクター細胞(Promega社)(7.45x104細胞/ウェル)を、4%低IgG血清(Promega社)を補充したRPMI1640培地中に再懸濁し、連続希釈した抗CD20 Fc構築体を含む96ウェルプレートに播種した。5%CO2中、37℃、6時間のインキュベーションを行った後、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Bio−Glo Luciferase Assay Reagent(Promega社)を使用して発光を測定した。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
抗CD20 Fc構築体7、8、9、13(G20リンカー)および19を、追加のADCCアッセイにおいて検証し、ADCCレポーターアッセイの結果を確認した。各抗CD20 Fc構築体、およびフコシル化Gazyvaモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCアッセイにおいて検証した:
NK細胞を解凍し、Lonza社のLGM培地中、250,000細胞/mlで再懸濁し、一晩培養した。プローブを連続希釈(10倍)し、5:1のエフェクター:標的比(50,000:10,000または25,000:5,000、ドナーに依存する)でKILR Raji細胞とともに30分間インキュベートした。NK細胞を計数し、Hyclone社の10%Super Low IgG Defined FBS(熱不動化)を含有するフェノールレッドフリーのRPMI(Life Technology社)のアッセイ培地中に再懸濁し、コートされたKILR Raji細胞を含有するプレートに播種した。5時間30分後、KILR検出試薬を混合し、プレートに添加した。プレートは、室温で30分のインキュベーションの後に、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)上で読み取られた。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
ADCCレポーターアッセイ
抗PD−L1モノクローナル抗体のアベルマブ(avelumab)(バベンシオ(Bavencio))と比較して、抗PD−L1 Fc構築体が、FcγRIIIaシグナル伝達を誘導し、ADCC活性を強化する度合いを検証するためのADCCレポーターアッセイを開発した。アベルマブのCDRを有する抗PD−L1 Fc構築体4、7、8、10、13、16および19は、実施例1、2および51〜56に記載されるように作製した。四つの型の構築体13(PD−L1)を検証した。それら構築体は、長鎖Fc単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっていた(G4、G10、G15およびG20リンカー)。各抗PD−L1 Fc構築体、およびフコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCレポーターアッセイにおいて検証した:
標的HEK−PD−L1細胞(1.25x104細胞/ウェル)およびJurkat/FcγRIIIaエフェクター細胞(Promega社)(7.45x104細胞/ウェル)を、4%低IgG血清(Promega社)を補充したRPMI1640培地中に再懸濁し、連続希釈した抗PD−L1構築体を含む96ウェルプレートに播種した。5%CO2中、37℃、6時間のインキュベーションを行った後、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Bio−Glo Luciferase Assay Reagent(Promega社)を使用して発光を測定した。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
抗PD−L1 Fc構築体8、9、13(G20リンカー)および19を、追加のADCCアッセイにおいて検証し、ADCCレポーターアッセイの結果を確認した。各抗PD−L1 Fc構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたADCCアッセイにおいて検証した:
ADCC A549−KILRアッセイを、メーカーの指示(DiscoverX社)に従い実施した。A549−KILR細胞株を、AssayComplete(商標)Cell Culture Kit−105を使用して、組織培養フラスコ中で増殖させた。AssayComplete(商標)Cell Detachment試薬を使用して細胞を採取し、2x105細胞/mLに、AssayComplete(商標)Cell Plating 39試薬を用いて調節し、50μL/ウェル(1x104細胞)で、96ウェルの白色底組織培養処理済プレート内に分散させた。AssayComplete(商標)Cell Plating 39試薬中で抗PD−L1構築体を11nMに希釈し、直後に連続希釈(1:4)を行った。希釈された構築体を、10μL/ウェルでウェルに添加し、アッセイプレートを30分間、37℃、5%CO2でインキュベートした。凍結NK細胞(Hemacare社)を解凍し、1x106細胞/mLで、AssayComplete(商標)Cell Plating 39試薬を使用して再懸濁した。30分間のインキュベーション後、NK細胞を、50μL/ウェル(5x104細胞/ウェル)でアッセイプレートに加えた。脱フコシル化抗PD−L1 IgG1抗体を使用した陽性対照、および抗体非存在下でA549−KILR細胞と共培養されたNK細胞からなる陰性対照も、含ませた。次いでアッセイプレートを37℃、5%CO2で3時間インキュベートした。インキュベーション直後に、100μL/ウェルのKILR Detection Working Solution(4:1:1の体積比で混合されたKILR検出試薬1、2および3から構成される)を各ウェルに加えた。続いてアッセイプレートを室温で30分間インキュベートし、その後、発光レベルを、PHERAstar FS照度計(BMG LABTECH社)を使用して決定した。
1別段の記載がない限り、すべての構築体はG20リンカーを含んだ。
2構築体は自然発生的なE388D変異を含有した。
全血末梢血単核細胞(PMBC)枯渇アッセイを使用して、抗CD20構築体13のフコシル化型および脱フコシル化型において、オビヌツズマブ(Gazyva)由来CDRを含有する抗CD20 Fc構築体を使用してCD19+B細胞を枯渇させ得るかどうかを決定した。CD19は、B細胞特異的な表面抗原であり、ならびにB細胞に由来する白血病およびリンパ腫もCD19を発現する。ヒト全血をEDTA管で採取し、100μLを、2.96μM〜0.3pMの範囲で連続希釈した、VivoTag645−標識抗CD20 Fc構築体とともに10分間、37℃でインキュベートした。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)抗IgD、フィコエリトリン(PE)抗CD11c、アロフィコシアニン−H7(APC/H7)抗CD14 、PerCp Cy5.5抗CD19、フィコエリトリン−シアニン7(PE/Cy7)抗CD56、およびパシフィックブルー(Pac Blue)抗CD3の抗体(BioLegend社)を含有する免疫細胞特異的抗体のカクテルを血液細胞に添加して、さらに30分間、37℃で染色した。染色後、赤血球(RBC)を、塩化アンモニウム溶液(STEMCELL technologies社)を用いて2回、室温(RT)で10分間溶解させ、細胞をPBSで洗浄した。200μLのFACS緩衝液(2%FBS含有PBS)中に細胞を再懸濁させ、サンプルをFACSVerseTM機器(BD Biosciences社)で取得した。白血球のゲートは、フォワードスキャッター(FSC)とサイドスキャッター(SSC)を使用して設定し、B細胞は、SSClow、FSCint、CD11c−、CD14−、CD56−、CD3−、およびCD19+、IgD+として特徴解析した。
ヒトリンパ腫のマウス播種性腫瘍モデルを使用して、疾患進行および治療反応性に対する抗CD20 Fc構築体(抗CD20構築体13)の単回投与または複数回投与の効果を、生体発光イメージングにより検証した。CB17−重症複合型免疫不全(SCID)マウス(メス、6〜7週齢で、平均体重は20グラム、Charles River Laboratoriesの系統236)を48時間、実験動物ケア施設中に飼育して、その後、IACUCプロトコールに従い使用した。水と食物は不断に与えた。全ての実験は、機関の実験動物倫理委員会により承認された。マウスは毎日、不快感の兆候および全身外観をチェックされた。腫瘍異種移植片モデルについては、5x106個のルシフェラーゼ発現ヒトバーキットリンパ腫Daudi細胞(Daudi−Luc)を、尾静脈を通して静脈内注入した。注入前、Daudi−luc細胞は、CD20およびCD38の細胞表面発現を示した。生体発光シグナルに基づき様々な処置群(7匹のマウス/群)に無作為化するため、腫瘍細胞移植後1時間で、マウスを段階分けした(そのような早期の時点では多くは肺に集中していた)。腫瘍注入の5時間後、各群のマウスは、臨床的投与範囲と同様の剤の単回投与(18mg/kgのダラツムマブ(抗CD38モノクローナル抗体)、18mg/kgのオビヌツズマブ(Gazyva、抗CD20 IgG1モノクローナル抗体)、30mg/kgの抗CD20構築体13、IgG1用量のモル等量)を用いて腹腔内注入で処置された。生理食塩水を陰性対照としてマウス群に投与した。別の群では、抗CD20構築体13は、30mg/kgで2日に1回、合計で6回投与が行われた(すなわち、マウスは、腫瘍注入後、1、3、5、7、9および11日目に抗CD20構築体13で処置された)。腫瘍増殖の時間的変化は、IVIS spectrum(PerkinElmer社)での生体発光イメージングにより決定された。イメージングを行うために、マウスに麻酔をかけ、次いでD−ルシフェリン注射を行った(15mg/mLのストック溶液を150μl/マウス)。次いで電荷結合素子検出器を用いたイメージングのためにマウスを遮光ボックス内に置いた。マウス内のルシフェラーゼ発現細胞から発せられた光子を、曝露期間にわたり計数した。総流束(光子/秒)としての放射輝度の生データが算出され、Living Image Software(PerkinElmer社)を使用して定量的な画像解析が行われた。照明の下で、関心対象領域の描画のための解剖学的参照用の白黒画像が取得された。背面および前面から採取された光の放射は、個々のマウスの総体表面積上で積分され、腫瘍質量発達の尺度として時間でプロットされた。腫瘍量を表す積分生体発光強度が測定され、データは平均±SEMとして表されている(7匹のマウス/群)。
でラベリングされた点は、対応する処置群と比較して<0.0001のp値を有した。抗CD20構築物13の複数回投与は、このモデルアッセイにおいて、当該構築物の単回投与とほぼ同等の有効性であった。マウスは構築体13の複数回投与に耐容し、目に見える副作用は示さなかった(データは示さず)。
この明細書中に記載した全ての公開公報、特許および特許出願は、あたかも独立の公開公報または特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。
[本発明1001]
強化されたエフェクター機能を備えたFc抗原結合ドメイン構築体であって、
抗原結合ドメイン、およびリンカーにより第二のFcドメインに結合された第一のFcドメインを含み、
抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1002]
抗原結合ドメイン;リンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのFcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1003]
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1004]
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1005]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1006]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1007]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1008]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1009]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1010]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1011]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1012]
改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1個、2個または3個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1002〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、CH3ドメインにある、本発明1002〜1012のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
前記変異が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1015]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1002〜1013のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1017]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1018]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1019]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1020]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのI253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
KabatのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1020のポリペプチド。
[本発明1022]
I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1023]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのR292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1022のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
KabatのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292TおよびR292Yからなる群から選択される、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1025]
R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1026]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1002〜1025のいずれかのポリペプチド。
[本発明1027]
前記第二のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1028]
前記第一のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1029]
前記第一のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有し、前記第二のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1030]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kからなる群から選択される、本発明1030〜1037のいずれかのポリペプチド。
[本発明1039]
前記Fcドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1040]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1041]
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1042]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1043]
前記2個または4個の逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kから選択される、本発明1005、1006および1009〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
前記抗原結合ドメインが、scFvである、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1045]
前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1046]
前記抗原結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1047]
前記VHドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1048]
前記VHドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1049]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、
本発明1045のポリペプチド。
[本発明1050]
前記VHドメインが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1051]
前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1052]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1053]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1054]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1055]
前記抗原結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1056]
前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつVLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1057]
第一または第二のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを2コピー含有するポリペプチド複合体。
[本発明1058]
ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。
[本発明1059]
前記第二のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、本発明1058のポリペプチド複合体。
[本発明1060]
前記改変された空洞を形成する変異が、Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405Aからなる群から選択される、本発明1059のポリペプチド複合体。
[本発明1061]
前記第二のポリペプチドが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1058〜1060のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1062]
抗原結合ドメイン;リンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのFcドメイン単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1063]
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1064]
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1065]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1066]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1067]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1068]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1069]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1070]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1071]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第一のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1072]
表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、本発明1062〜1071のいずれかのポリペプチド。
[本発明1073]
表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異が、CH3ドメインにある、本発明1062〜1072のいずれかのポリペプチド。
[本発明1074]
前記変異が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1075]
前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、本発明1062〜1073のいずれかのポリペプチド。
[本発明1076]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1072のポリペプチド。
[本発明1077]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1078]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1079]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1080]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのI253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1079のいずれかのポリペプチド。
[本発明1081]
KabatのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から独立して選択される、本発明1080のポリペプチド。
[本発明1082]
I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、本発明1071のポリペプチド。
[本発明1083]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのR292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1082のいずれかのポリペプチド。
[本発明1084]
KabatのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292TおよびR292Yからなる群から選択される、本発明1083のポリペプチド。
[本発明1085]
R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、本発明1084のポリペプチド。
[本発明1086]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1062〜1085のいずれかのポリペプチド。
[本発明1087]
前記第二のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1088]
前記第一のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1089]
前記第一のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有し、前記第二のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1090]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1091]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1092]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1093]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1094]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1095]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1096]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1097]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1098]
前記単一アミノ酸の置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kからなる群から選択される、本発明1090〜1097のいずれかのポリペプチド。
[本発明1099]
前記Fcドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1100]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメインにおける逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1101]
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1102]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1103]
前記2個または4個の逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kから選択される、本発明1065、1066および1069〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1104]
前記抗原結合ドメインが、scFvである、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1105]
前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1106]
前記抗原結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1107]
前記VHドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1108]
前記VHドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1109]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、
本発明1105のポリペプチド。
[本発明1110]
前記VHドメインが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1111]
前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1112]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1113]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、
本発明1105のポリペプチド。
[本発明1114]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1115]
前記抗原結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1116]
前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつVLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1117]
第一または第二のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを2コピー含有するポリペプチド複合体。
[本発明1118]
ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、本発明1062〜1116のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。
[本発明1119]
前記第二のポリペプチド単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷変異を含む、本発明1118のポリペプチド複合体。
[本発明1120]
前記第二のポリペプチド単量体が、表4から選択される逆電荷変異を1、2または3個含み、かつ前記ポリペプチド中の、表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷変異に対し相補的である、本発明1129のポリペプチド複合体。
[本発明1121]
前記第二のポリペプチドが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1118〜1120のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1122]
ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのFcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1123]
前記第一のIgG1単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1124]
前記第一のIgG1単量体のアミノ末端側に、scFvをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1125]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1126]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1127]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1128]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1129]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1130]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1131]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1132]
改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1個、2個または3個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1133]
改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、CH3ドメインにある、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1134]
ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
少なくとも一つのFcドメイン単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1135]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1136]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端側に、scFvをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1137]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1138]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1139]
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1140]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1141]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1142]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1143]
第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第一のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1144]
表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1145]
表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異が、CH3ドメインにある、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1146]
前記変異が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1147]
前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1148]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1149]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1150]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1151]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのI253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1152]
KabatのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から独立して選択される、本発明1151のポリペプチド。
[本発明1153]
I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、本発明1152のポリペプチド。
[本発明1154]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのR292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1155]
KabatのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292TおよびR292Yからなる群から選択される、本発明1154のポリペプチド。
[本発明1156]
R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、本発明1155のポリペプチド。
[本発明1157]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1158]
前記第二のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1159]
前記第一のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1160]
前記第一のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有し、前記第二のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列:
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1161]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1162]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1165]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1166]
各Fcドメイン単量体のCH2ドメインが同一であり、以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1167]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1168]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1169]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1170]
各Fcドメイン単量体のCH3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下:
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1171]
前記単一アミノ酸の置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1172]
前記Fcドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1173]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメインにおける逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1174]
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、本発明1173のポリペプチド。
[本発明1175]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つは、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1176]
前記2個または4個の逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kから選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1178]
前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1179]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1180]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1181]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1182]
前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1183]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1184]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1185]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1186]
IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインをさらに含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1187]
本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1188]
本発明1187の核酸分子を含む、発現ベクター。
[本発明1189]
本発明1187の核酸分子を含む、宿主細胞。
[本発明1190]
本発明1188の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1191]
本発明1189または本発明1190の宿主細胞を、ポリペプチドを発現する条件下で培養する工程を含む、本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドを製造する方法。
[本発明1192]
抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1193]
抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1194]
抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1195]
抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1196]
10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1197]
10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1199]
前記IgG1 Fcドメイン単量体が、CH3ドメイン中に10、8、6または4個以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号42、43、45および47のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1196または1197の宿主細胞。
[本発明1200]
本発明1002から1186のいずれかのポリペプチドを含む、医薬組成物。
[本発明1201]
前記ポリペプチドの40%、30%、20%、10%、5%、2%未満が、Fcドメイン単量体上で少なくとも1個のフコース改変を有する、本発明1200の医薬組成物。
[本発明1202]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
本発明1001のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1203]
前記単一Fcドメイン構築体が、抗体である、本発明1001または1202のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1204]
実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1205]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1204の組成物。
[本発明1206]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1204の組成物。
[本発明1207]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1208]
前記生物活性が、Fc受容体介在性エフェクター機能である、本発明1207のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1209]
前記Fc受容体介在性エフェクター機能が、ADCC活性、ならびにADCP活性および/またはCDC活性である、本発明1208のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1210]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、および
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメイン
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1211]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1202、1207、または1210のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1212]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、および前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1202、1207、または1210のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1213]
前記抗原結合ドメインが、Fabである、本発明1001および1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1214]
前記抗原結合ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、本発明1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1215]
前記抗原結合ドメインが、scFvである、本発明1214のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1216]
前記抗原結合ドメインが、V H ドメインおよびC H 1ドメインを含み、
前記V H ドメインおよびC H 1ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、
本発明1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1217]
前記抗原結合ドメインが、V L ドメインをさらに含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1218]
V L ドメインを含む第四のポリペプチドを含む、本発明1217のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1219]
前記V H ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1220]
前記V H ドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1221]
前記V H ドメインが、表2に記載の抗体のV H 配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記V H 配列が、表2に記載される抗体のV H 配列に対し、少なくとも95%同一である、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1222]
前記V H ドメインが、表2に記載される抗体のV H 配列を含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1223]
前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1224]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のV H 配列およびV L 配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1225]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のV H 配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むV H ドメイン、および表2に記載の抗体のV L 配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むV L ドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記V H ドメイン配列およびV L ドメイン配列が、表2に記載される抗体のV H 配列およびV L 配列に対し、少なくとも95%同一である、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1226]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のV H 配列およびV L 配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1227]
IgG C L 抗体定常ドメインおよびIgG C H 1抗体定常ドメインをさらに含み、
前記IgG C H 1抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第一のポリペプチドまたは前記第二のポリペプチドのN末端に付加される、
本発明1001および1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1228]
前記第一のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、本発明1202〜1227のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1229]
前記第二のFcドメイン単量体および前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、本発明1202〜1228のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1230]
前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、本発明1202から1228のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1231]
前記二量体形成選択モジュールが、Fcドメイン単量体のうちの一つのC H 3ドメイン内に改変された空洞と、前記Fcドメイン単量体の他方のC H 3ドメイン内に改変された突起とを含み、
前記改変された空洞および前記改変された突起が、Fcドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置されている、
本発明1228または1229のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1232]
前記改変された突起が、S354C、T366W、T366Y、T394W、T394FおよびF405Wからなる群から選択される改変を少なくとも1個含み、前記改変された空洞が、Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A、およびT394Sからなる群から選択される改変を少なくとも1個含む、本発明1231のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1233]
前記Fcドメイン単量体のうちの一つがY407VおよびY349Cを含み、前記Fcドメイン単量体の他方がT366WおよびS354Cを含む、本発明1228または1229のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1234]
前記二量体形成選択モジュールが、ドメイン単量体のうちの1つのC H 3ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Fcドメイン単量体のうちの他方のC H 3ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸とを含み、
前記負電荷をもつアミノ酸および前記正電荷をもつアミノ酸が、Fcドメインの形成を促進するよう配置されている、
本発明1228または1229のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1235]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、D399K、およびK409DまたはK409Eのいずれかを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1236]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K392DおよびD399Kを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1237]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Eを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1238]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、D356KおよびK439Dを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1239]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K392EおよびD399Kを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1240]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Dを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1241]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、D356KおよびK439Eを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1242]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、S354CおよびT366Wを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1243]
前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、S354CおよびT366Wを含み、前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体がそれぞれ、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1244]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体がそれぞれ、E357KまたはE357Rを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、K370DまたはK370Eを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1245]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体が、K370DまたはK370Eを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、E357Kまたは357Rを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1246]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体がそれぞれ、K409DまたはK409Eを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、D399KまたはD399Rを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1247]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体が、D399KまたはD399Rを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、K409DまたはK409Eを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1248]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1個または複数のリンカーが、結合である、本発明1001および1202〜1247のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1249]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1個または複数のリンカーが、スペーサーである、本発明1001および1202〜1247のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1250]
前記スペーサーが、以下:
の配列を有するポリペプチドを含む、本発明1249のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1251]
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、本発明1249のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1252]
前記スペーサーが、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1251のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1253]
前記スペーサーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1252のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1254]
前記抗原結合ドメイン構築体が、リンカーにより前記Fcドメイン単量体に結合されている、本発明1001および1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1255]
前記リンカーが、スペーサーである、本発明1254のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1256]
前記Fcドメインのうちの少なくとも1個が、I253位にアミノ酸改変を少なくとも1個含む、本発明1001および1202〜1255のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1257]
I253位の前記アミノ酸改変が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1256のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1258]
I253位の各アミノ酸改変が、I253Aである、本発明1257のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1259]
前記Fcドメインのうちの少なくとも1個が、R292位にアミノ酸改変を少なくとも1個含む、本発明1001および1202〜1258のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1260]
R292位の各アミノ酸改変が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、本発明1259のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1261]
R292位の各アミノ酸改変が、R292Pである、本発明1260のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1262]
前記Fcドメイン単量体のうちの1個または複数が、IgGヒンジドメイン、IgG C H 2抗体定常ドメイン、およびIgG C H 3抗体定常ドメインを含む、本発明1001および1202〜1261のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1263]
前記Fcドメイン単量体のそれぞれが、IgGヒンジドメイン、IgG C H 2抗体定常ドメイン、およびIgG C H 3抗体定常ドメインを含む、本発明1262のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1264]
前記IgGが、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4からなる群から選択されるサブタイプのIgGである、本発明1262または1263のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1265]
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれにおけるN末端Aspが、Glnに変異されている、本発明1001および1202〜1264のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1266]
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのうちの1個または複数が、C末端リジンを欠く、本発明1001および1202〜1265のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1267]
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが、C末端リジンを欠く、本発明1266のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1268]
前記ポリペプチドのうちの1個もしくは複数のN末端またはC末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、本発明1001および1202〜1267のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1269]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1270]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも75%が、前記第一のFcドメイン、前記第二のFcドメイン、および前記抗原結合ドメインを含む、本発明1269の細胞培養培地。
[本発明1271]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、構造的に同一であり、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも0.1mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、
細胞培養培地。
[本発明1272]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも75%が、構造的に同一である、本発明1271の細胞培養培地。
[本発明1273]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも10mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1272のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1274]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも100mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1273のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1275]
Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(3)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、または前記第三のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1276]
実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
[本発明1277]
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1276の組成物。
[本発明1278]
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Dを含み、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K370DおよびE357Kを含む、本発明1277の組成物。
[本発明1279]
実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
[本発明1280]
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1279の組成物。
[本発明1281]
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Dを含み、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K370DおよびE357Kを含む、本発明1280の組成物。
[本発明1282]
実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合している抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1283]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1282のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1284]
実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1285]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1284のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1286]
実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成する、組成物。
[本発明1287]
前記第二のFcドメイン単量体および第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のFcドメイン単量体と前記第十のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1286のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1288]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1289]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1290]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1291]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
[本発明1292]
Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(3)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
(5)第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1293]
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1288、1289、1290、1291、または1292のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1294]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1295]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二、および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1296]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1297]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
[本発明1298]
Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(3)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
(5)第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと、
(6)第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメインと、
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1299]
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1294、1295、1296、1297または1298のいずれかの組成物。
[本発明1300]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1301]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1302]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1303]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1304]
Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(3)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(5)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1305]
前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1300、1301、1302、1303、または1304のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1306]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1307]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1308]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1309]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、細胞培養培地。
[本発明1310]
Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(3)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(5)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1311]
前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1306、1307、1308、1309、または1310のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1312]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vii)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1313]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1314]
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1315]
Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1316]
Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(3)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(5)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(6)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(7)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1317]
前記第二および第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のFcドメイン単量体と前記第十のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1312、1313、1314、1315、または1316のFc抗原結合ドメイン構築体。
Claims (313)
- 強化されたエフェクター機能を備えたFc抗原結合ドメイン構築体であって、
抗原結合ドメイン、およびリンカーにより第二のFcドメインに結合された第一のFcドメインを含み、
抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 抗原結合ドメイン;リンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのFcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。 - 前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1個、2個または3個の逆電荷変異をさらに含む、請求項2〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、CH3ドメインにある、請求項2〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項2〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのI253位で単一アミノ酸変異を含む、請求項2〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KabatのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項20に記載のポリペプチド。
- I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、請求項21に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのR292位で単一アミノ酸変異を含む、請求項2〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KabatのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292TおよびR292Yからなる群から選択される、請求項23に記載のポリペプチド。
- R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、請求項24に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kからなる群から選択される、請求項30〜37のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、請求項2〜29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項39に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、請求項39に記載のポリペプチド。
- 前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記2個または4個の逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kから選択される、請求項5、6および9〜29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、scFvである、請求項2〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、請求項2〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、請求項43に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、
請求項45に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、請求項45に記載のポリペプチド。 - 前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、請求項2〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつVLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、請求項2〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 第一または第二のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、請求項2〜56のいずれか一項に記載のポリペプチドを2コピー含有するポリペプチド複合体。
- ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、請求項2〜56のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。 - 前記第二のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、請求項58に記載のポリペプチド複合体。
- 前記改変された空洞を形成する変異が、Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405Aからなる群から選択される、請求項59に記載のポリペプチド複合体。
- 前記第二のポリペプチドが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項58〜60のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 抗原結合ドメイン;リンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのFcドメイン単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。 - 前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、請求項62に記載のポリペプチド。
- 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第一のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、請求項62〜71のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異が、CH3ドメインにある、請求項62〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、請求項73に記載のポリペプチド。
- 前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、請求項62〜73のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのI253位で単一アミノ酸変異を含む、請求項62〜79のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KabatのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から独立して選択される、請求項80に記載のポリペプチド。
- I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、請求項71に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのR292位で単一アミノ酸変異を含む、請求項62〜82のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KabatのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292TおよびR292Yからなる群から選択される、請求項83に記載のポリペプチド。
- R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、請求項84に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸の置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kからなる群から選択される、請求項90〜97のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、請求項62〜89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメインにおける逆電荷変異である、請求項99に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、請求項99に記載のポリペプチド。
- 前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記2個または4個の逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kから選択される、請求項65、66および69〜89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、scFvである、請求項62〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、請求項62〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、請求項103に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、
請求項105に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、
請求項105に記載のポリペプチド。 - 前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、請求項62〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつVLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、請求項62〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 第一または第二のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、請求項2〜56のいずれか一項に記載のポリペプチドを2コピー含有するポリペプチド複合体。
- ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、請求項62〜116のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のIgG1 Fcドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。 - 前記第二のポリペプチド単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷変異を含む、請求項118に記載のポリペプチド複合体。
- 前記第二のポリペプチド単量体が、表4から選択される逆電荷変異を1、2または3個含み、かつ前記ポリペプチド中の、表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷変異に対し相補的である、請求項129に記載のポリペプチド複合体。
- 前記第二のポリペプチドが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項118〜120のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのFcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。 - 前記第一のIgG1単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1単量体のアミノ末端側に、scFvをさらに含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、請求項122に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のIgG1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1個、2個または3個の逆電荷変異をさらに含む、請求項122〜131のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、CH3ドメインにある、請求項122〜131のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第一のIgG1 Fcドメイン単量体;第二のリンカー;ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第二のIgG1 Fcドメイン単量体;任意の第三のリンカー;および任意の、ヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインとを含む第三のIgG1 Fcドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
少なくとも一つのFcドメイン単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。 - 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、請求項134に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端側に、scFvをさらに含む、請求項134に記載のポリペプチド。
- 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、請求項134に記載のポリペプチド。
- 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第一のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 第三のリンカーおよび第三のIgG1 Fcドメイン単量体を含み、
前記第二のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第三のIgG1 Fcドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第一のIgG1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、請求項134〜143のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異が、CH3ドメインにある、請求項134〜143のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのI253位で単一アミノ酸変異を含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KabatのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から独立して選択される、請求項151に記載のポリペプチド。
- I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、請求項152に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、KabatのR292位で単一アミノ酸変異を含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- KabatのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292TおよびR292Yからなる群から選択される、請求項154に記載のポリペプチド。
- R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、請求項155に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸の置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kからなる群から選択される、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、CH3ドメインにおける逆電荷変異である、請求項99に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、両端を含むKabatのG341位〜KabatのK447位の配列内にある、請求項173に記載のポリペプチド。
- 前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つは、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記2個または4個の逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Kから選択される、請求項122〜145のいずれ一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%または98%同一である、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項123、124、135および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインをさらに含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項2〜187のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 請求項187に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項187の核酸分子を含む、宿主細胞。
- 請求項188に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項189または請求項190に記載の宿主細胞を、ポリペプチドを発現する条件下で培養する工程を含む、請求項2〜187のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項189に記載の宿主細胞。
- 抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項190に記載の宿主細胞。
- 抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項189に記載の宿主細胞。
- 抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項190に記載の宿主細胞。
- 10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項189に記載の宿主細胞。
- 10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項190に記載の宿主細胞。
- 前記IgG1 Fcドメイン単量体が、CH3ドメイン中に10、8、6または4個以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号42、43、45および47のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項196または197に記載の宿主細胞。
- 請求項2から186のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
- 前記ポリペプチドの40%、30%、20%、10%、5%、2%未満が、Fcドメイン単量体上で少なくとも1個のフコース改変を有する、請求項200に記載の医薬組成物。
- (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
請求項1に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記単一Fcドメイン構築体が、抗体である、請求項1または202に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項204に記載の組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項204に記載の組成物。
- (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記生物活性が、Fc受容体介在性エフェクター機能である、請求項207に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fc受容体介在性エフェクター機能が、ADCC活性、ならびにADCP活性および/またはCDC活性である、請求項208に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、および
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメイン
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項202、207、または210に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、および前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項202、207、または210に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、Fabである、請求項1および202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、scFvである、請求項214に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、
前記VHドメインおよびCH1ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、
請求項202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記抗原結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- VLドメインを含む第四のポリペプチドを含む、請求項217に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記VHドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列のセットを含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記VHドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、前記VH配列が、表2に記載される抗体のVH配列に対し、少なくとも95%同一である、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記VHドメインが、表2に記載される抗体のVH配列を含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメイン、および表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインを含み、
CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の配列を除き、前記VHドメイン配列およびVLドメイン配列が、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対し、少なくとも95%同一である、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインをさらに含み、
前記IgG CH1抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第一のポリペプチドまたは前記第二のポリペプチドのN末端に付加される、
請求項1および202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第一のFcドメイン単量体および前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、請求項202〜227のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のFcドメイン単量体および前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、請求項202〜228のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、請求項202から228のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記二量体形成選択モジュールが、Fcドメイン単量体のうちの一つのCH3ドメイン内に改変された空洞と、前記Fcドメイン単量体の他方のCH3ドメイン内に改変された突起とを含み、
前記改変された空洞および前記改変された突起が、Fcドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置されている、
請求項228または229に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記改変された突起が、S354C、T366W、T366Y、T394W、T394FおよびF405Wからなる群から選択される改変を少なくとも1個含み、前記改変された空洞が、Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A、およびT394Sからなる群から選択される改変を少なくとも1個含む、請求項231に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの一つがY407VおよびY349Cを含み、前記Fcドメイン単量体の他方がT366WおよびS354Cを含む、請求項228または229のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記二量体形成選択モジュールが、ドメイン単量体のうちの1つのCH3ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Fcドメイン単量体のうちの他方のCH3ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸とを含み、
前記負電荷をもつアミノ酸および前記正電荷をもつアミノ酸が、Fcドメインの形成を促進するよう配置されている、
請求項228または229に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、D399K、およびK409DまたはK409Eのいずれかを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K392DおよびD399Kを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Eを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、D356KおよびK439Dを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K392EおよびD399Kを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Dを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、D356KおよびK439Eを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、S354CおよびT366Wを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、S354CおよびT366Wを含み、前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体がそれぞれ、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体がそれぞれ、E357KまたはE357Rを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、K370DまたはK370Eを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体が、K370DまたはK370Eを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、E357Kまたは357Rを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体がそれぞれ、K409DまたはK409Eを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、D399KまたはD399Rを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体が、D399KまたはD399Rを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、K409DまたはK409Eを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1個または複数のリンカーが、結合である、請求項1および202〜247のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1個または複数のリンカーが、スペーサーである、請求項1および202〜247のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、請求項249に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記スペーサーが、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項251に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記スペーサーが、20個のグリシン残基からなる、請求項252に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記抗原結合ドメイン構築体が、リンカーにより前記Fcドメイン単量体に結合されている、請求項1および202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記リンカーが、スペーサーである、請求項254に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメインのうちの少なくとも1個が、I253位にアミノ酸改変を少なくとも1個含む、請求項1および202〜255のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- I253位の前記アミノ酸改変が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項256に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- I253位の各アミノ酸改変が、I253Aである、請求項257に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメインのうちの少なくとも1個が、R292位にアミノ酸改変を少なくとも1個含む、請求項1および202〜258のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- R292位の各アミノ酸改変が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、請求項259に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- R292位の各アミノ酸改変が、R292Pである、請求項260に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの1個または複数が、IgGヒンジドメイン、IgG CH2抗体定常ドメイン、およびIgG CH3抗体定常ドメインを含む、請求項1および202〜261のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のそれぞれが、IgGヒンジドメイン、IgG CH2抗体定常ドメイン、およびIgG CH3抗体定常ドメインを含む、請求項262に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記IgGが、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4からなる群から選択されるサブタイプのIgGである、請求項262または263に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれにおけるN末端Aspが、Glnに変異されている、請求項1および202〜264のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのうちの1個または複数が、C末端リジンを欠く、請求項1および202〜265のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが、C末端リジンを欠く、請求項266に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記ポリペプチドのうちの1個もしくは複数のN末端またはC末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項1および202〜267のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - 前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも75%が、前記第一のFcドメイン、前記第二のFcドメイン、および前記抗原結合ドメインを含む、請求項269に記載の細胞培養培地。
- Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、構造的に同一であり、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも0.1mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、
細胞培養培地。 - 前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも75%が、構造的に同一である、請求項271に記載の細胞培養培地。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも10mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項269〜272のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも100mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項269〜273のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
- Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(3)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、または前記第三のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。 - 前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項276に記載の組成物。 - 前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Dを含み、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K370DおよびE357Kを含む、請求項277に記載の組成物。
- 実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。 - 前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項279に記載の組成物。 - 前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、E357KおよびK370Dを含み、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、K370DおよびE357Kを含む、請求項280に記載の組成物。
- 実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合している抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項282に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項284に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 実質的に均質なFc抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成する、組成物。 - 前記第二のFcドメイン単量体および第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のFcドメイン単量体と前記第十のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項286に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(3)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
(5)第二のポリペプチドおよび/または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項288、289、290、291、または292のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二、および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(c)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(e)前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(f)前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)第三のFcドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(3)第四のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
(5)第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと、
(6)第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメインと、
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項294、295、296、297または298のいずれか一項に記載の組成物。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(3)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(5)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第一のFcドメイン単量体および第三のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項300、301、302、303、または304のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成する、細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)以下:
(iv)第三のFcドメイン単量体、
(v)第四のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第三のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(3)第五のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第六のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(5)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第二のFcドメイン単量体および第四のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第四のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のFcドメイン単量体および前記第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のFcドメイン単量体および前記第六のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項306、307、308、309、または310に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vii)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞障害(CDC)アッセイにおいて、一つのFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成し、
単一のFcドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - (a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が、
(a)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(b)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(c)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(d)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(e)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(f)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(g)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)以下:
(i)第一のFcドメイン単量体、
(ii)第二のFcドメイン単量体、
(iii)第三のFcドメイン単量体、
(iv)前記第一のFcドメイン単量体と前記第二のFcドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(v)前記第二のFcドメイン単量体と前記第三のFcドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(2)以下:
(vi)第四のFcドメイン単量体、
(vii)第五のFcドメイン単量体、
(viii)第六のFcドメイン単量体、
(ix)前記第四のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(x)前記第五のFcドメイン単量体と前記第六のFcドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(3)第七のFcドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(4)第八のFcドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(5)第九のFcドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(6)第十のFcドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(7)前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体が組み合わされて第一のFcドメインを形成し、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体が組み合わされて第二のFcドメインを形成し、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体が組み合わされて第三のFcドメインを形成し、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体が組み合わされて第四のFcドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のFcドメイン単量体が組み合わされて第五のFcドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50%が構造的に同一である、工程、および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第二および第五のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のFcドメイン単量体と前記第五のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のFcドメイン単量体と前記第七のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のFcドメイン単量体と前記第八のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のFcドメイン単量体と前記第九のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のFcドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のFcドメイン単量体と前記第十のFcドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項312、313、314、315、または316に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
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