CN112912103A - 多价蛋白质复合物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及制备和使用多蛋白复合物的方法。该复合物可以为溶液中或表面上的多个靶标建立多价结合机制。该复合物具有多种应用，并可用于例如T细胞的活化和/或扩增。

Description

多价蛋白质复合物

技术领域

本发明内容涉及制备和使用多价蛋白复合物的方法。

背景

创建具有一个或多个靶标多个结合位点的分子通常很困难。一种方法是将许多配体用化学方法缀合到聚合物上。例如，多糖，聚(乙二醇)(PEG)，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或合成的树枝状聚合物通常用于结合蛋白的化学缀合。然而，制备这样的共轭分子通常具有高成本和低产率，并且难以大规模制造。另一种方法是将结合配体与反应性交联剂共价交联，例如，将蛋白质与戊二醛交联。这种交联通常会产生随机定向和成簇的蛋白质复合物，这些复合物通常会损害其功能。

由于多价蛋白质复合物具有多种应用，因此需要开发一种更有效的方法来产生多价蛋白质复合物。

概要

本公开内容涉及制备和使用多价蛋白复合物的方法。

本公开内容提供了包含多蛋白复合物的组合物，所述多蛋白复合物包含具有两个或更多个Fc结合结构域的多肽，以及两个或更多个各自包含Fc区的含有Fc的蛋白，其中每个含有Fc的蛋白结合至多肽中的Fc结合结构域。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白是抗体，重链抗体，双特异性抗体或Fc融合蛋白。

在一些实施方案中，多蛋白复合物可以结合溶液或固体表面上的两个或更多个靶分子。

在一些实施方案中，Fc结合结构域是以下的lgG结合结构域：

葡萄球菌蛋白A或其任何功能变体，lgG的结合结构域

链球菌蛋白G或其任何功能变体，或天然或工程改造的Fc结合蛋白的Fc结合结构域。

在一些实施方案中，多肽中的两个或更多个Fc结合结构域通过接头序列连接。

在一些实施方案中，Fc结合结构域具有至少为

与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8或9具有90％的相同性。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白是与一个或多个选自CD2，CD3，CD7，CD11a，CD19，CD26，CD27，CD28，CD30，CD30L，CD40，CD43，CD44，CD45RA，CD46，CD49d，CD62L，CD69，CD81，CD95，CD196，CD127，

CD137，CD226，BTLA，0X40，ICOS，GITR，PD1，PDL1，CTLA4，HLA-DR和KLRG-1。

在一些实施方案中，可以通过共价键或非共价相互作用将两种或更多种多蛋白复合物进一步组装成超复合物。

在一些实施方案中，多蛋白复合物中的两个或更多个含Fc的蛋白是相同的。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白是抗CD3抗体。在一些实施方案中，含Fc的蛋白是抗CD28抗体。在一些实施方案中，含Fc的蛋白是与T细胞表面抗原(例如，CD2，CD27，CD28，CD46或CD137)特异性结合的抗体。

在一些实施方案中，组合物包含多种包含两个或更多个不同的含Fc蛋白的多蛋白复合物。

在一些实施方案中，组合物包含多种多蛋白复合物，每种多蛋白复合物包含一种或多种抗CD3抗体和一种或多种抗CD28抗体。

在本公开中还提供了用于调节细胞功能的方法。该方法包括使细胞与本文所述的组合物接触。

此外，本公开描述了激活或扩增T细胞的方法。所述方法包括使T细胞与多蛋白复合物接触，所述多蛋白复合物包含具有两个或更多个Fc结合结构域的多肽，以及两个或更多个各自包含Fc区的含有Fc的蛋白，其中每个含有Fc的蛋白与Fc结合。多肽中的-结合结构域。

在一些实施方案中，多蛋白复合物包含抗CD3抗体和抗CD28抗体。

在一些实施方案中，复合物进一步包含抗CD2抗体，抗CD27抗体，抗CD28抗体，抗CD46抗体或抗CD137抗体或其组合。

另外，本文描述了激活或扩增T细胞的方法。该方法包括使T细胞与包含以下成分的第一多蛋白复合物接触：

包含两个或更多个Fc结合结构域和两个或更多个抗CD3抗体的第一多肽，其中所述抗CD3抗体与所述第一多肽中的Fc结合结构域结合，并且第二多蛋白复合物包含第二多肽，其包含两个或更多个Fc结合结构域和两个或更多个抗CD28抗体，其中所述抗CD28抗体结合第二多肽中的Fc结合结构域。

在一些实施方案中，该方法进一步包括使T细胞与第三多蛋白复合物接触，该复合物包含第三多肽，该第三多肽包含两个或更多个Fc结合结构域，以及两个或更多个分别包含Fc区的Fc，其中每个含Fc的蛋白与第三多肽中的Fc结合域结合，其中所述含Fc的蛋白是抗CD2抗体，抗CD27抗体，抗CD28抗体，抗CD46抗体或抗CD 137抗体。

在一些实施方案中，细胞是CD8+细胞或细胞是CD8+细胞。

本公开还提供了一种试剂盒，其包含本文所述的组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含第一容器，该第一容器包含

组合物，其包含包含两个或更多个Fc结合结构域的多肽，和第二容器，其包含包含第一含Fc的蛋白质的组合物。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包括第三容器，其包含包含第二含Fc的蛋白质的组合物。

本公开还提供了包含蛋白质的多蛋白复合物，所述蛋白质包含两个或更多个Fc结合结构域和两个或更多个含Fc的蛋白质(例如抗体或Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，含Fc的蛋白紧密结合至Fc结合结构域。复合物可以是稳定且可溶于普通缓冲液和细胞培养基，为在溶液中，细胞表面或固体表面上交联分子提供了有用的工具。

例如，复合体可以同时与多个目标交互。因此，复合物是一种或多种的多价结合剂。

抗体/Fc融合蛋白可以识别的抗原/靶分子，从而提高了复合物与靶标之间的结合亲和力。

在一些实施方案中，由于Fc结合蛋白的固有柔性，复合物具有高度的柔性。Fc结合蛋白中的Fc结合结构域之间的接头区可以为Fc结合结构域提供高度自由度，从而将运动自由度传递给结合的含Fc的蛋白。复合物的柔性对于其适应细胞表面的形状或起伏的能力可能很重要，从而为识别和捕获细胞表面目标提供了更高的效率。

在一些实施方案中，复合物可溶于缓冲液和/或培养基(例如细胞培养基)。在一些实施方案中，复合物在塑料，玻璃或金属容器的表面上不粘附(例如，不结合)(例如，在细胞培养条件下)。

在一些实施方案中，复合物可以相互作用和交联多个拷贝的靶标。靶标可以是在表面上(例如细胞表面)或在溶液中。

在一些实施方案中，当复合物包含分别识别两个细胞上的特异性细胞表面分子的两种不同的抗体/Fc融合蛋白时，该复合物可以用于交联两个靶标或两个细胞。

在一些实施方案中，该复合物可用于通过交联许多细胞表面分子，在体外，离体或体内诱导或抑制细胞群的某些功能，例如诱导或抑制细胞群的某些功能。

在一些实施方案中，该复合物可以用于体外或离体的T细胞活化和扩增。

一方面，本公开提供了一种复合物，其包含用于T细胞活化和扩增的主要信号(例如抗CD3抗体)。

一方面，本公开提供了一种复合物，其包含用于T细胞活化和扩增的共刺激信号(例如，抗CD28抗体)。

在一些实施方案中，复合物包括用于T细胞活化和扩增的主要信号和共刺激信号。在一些实施方案中，在T细胞活化和扩增中使用了不止一个包含主要和共刺激信号的复合物。

在一些实施方案中，复合物可包含针对T细胞表面抗原的抗体，所述抗体包括例如CD2，CD27，CD46，CD137和/或CD226。

在一些实施方案中，该复合物可以导致T细胞的有效扩增，从而导致体外或离体扩增2至100,000倍。

在一些实施方案中，扩增的T细胞可包括例如CD4+或CD8+T细胞。

在一些实施方案中，该复合物可用于体外或离体的NK细胞活化和增殖。

在一些实施方案中，该复合物可用于杀死恶性细胞，包括癌细胞(例如，体外或体内)。

此外，本公开提供了包含Fc结合蛋白和至少两种含Fc的蛋白的多蛋白复合物。该复合物具有在溶液或固体表面上结合和交联两个或多个靶标的能力，其中Fc结合蛋白与含Fc的蛋白稳定地缔合，其中Fc结合蛋白包含至少两个Fc-。绑定域。

在一些实施方案中，Fc结合结构域选自葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合结构域或其任何功能变体，链球菌蛋白G的IgG结合结构域或其任何功能变体，以及天然的或工程化的Fc结合蛋白/肽。Fc结合结构域可以连接有或没有接头区。

在一些实施方案中，两个或更多个相同的含Fc的分子与一个Fc结合蛋白结合以形成单特异性复合物。

在一些实施方案中，将两个或更多个不同的含Fc蛋白结合至一个Fc结合蛋白以形成双重/多特异性复合物。

在一些实施方案中，可以通过Fc结合蛋白之间的共价或非共价相互作用将两种或更多种复合物进一步组装成超复合物。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白可在其序列中包含另外的标签，片段，结构域或修饰。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白包括抗体和/或Fc融合蛋白，其中所述抗体是免疫球蛋白分子(例如，具有两个重链和两个轻链)，重链抗体，双特异性抗体，单克隆抗体，多克隆抗体或标记或修饰的抗体，其中Fc融合蛋白是至少包含至少一个的工程化嵌合蛋白序列中有一个Fc区。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白是抗CD2，抗CD3，抗CD7，抗CD11a，抗CD19，抗CD26，抗CD27，抗CD28，抗CD30，CD30L，抗CD40，抗CD43，抗CD44，CD45RA，抗CD46，抗CD49d，抗CD62L，抗CD69，抗CD81，抗CD95，CD196，抗CD127，抗CD137，抗CD226，抗BTLA，抗0X40，抗ICOS，抗GITR，抗PD1，抗PDL1，抗CTLA4，抗HLA-DR，抗KLRG-1抗体或其组合。

在一些实施方案中，单特异性复合物包含抗CD3抗体。

在一些实施方案中，单特异性复合物包含抗CD28抗体。

在一些实施方案中，单特异性复合物还包含针对T细胞表面蛋白的抗体，所述T细胞表面蛋白包括例如CD2，CD27，CD28，CD46或CD137。

在一些实施方案中，双特异性复合物包含抗CD3和抗CD28抗体。

在一些实施方案中，复合物具有体外，离体或体内活化和/或扩增T细胞的能力。

在一些实施方案中，复合物具有同时靶向多个细胞表面分子的能力和/或具有诱导或抑制细胞功能的能力。

此外，本发明内容描述了包含Fc结合蛋白和至少一种含有Fc的蛋白的试剂盒，其中所述Fc结合蛋白和所述含有Fc的蛋白是分开提供的，并且其中所述Fc结合蛋白和含Fc的蛋白质可以摩尔比混合以形成复合物。在一些实施方案中，每个复合物是预先形成的。

在本发明内容中还提供了用于诱导或抑制细胞功能的方法，其包括使细胞与多种复合物接触。

另外，本文描述了通过使T细胞与多种本文描述的复合物接触来活化和扩增T细胞的方法.其中所述复合物包含用于激活TCR/CD3信号传导途径的抗CD3抗体和作为共刺激信号的抗CD28抗体。

在一些实施方案中，复合物还包含针对CD2，CD27，CD28，CD46或CD137的共刺激抗体。

如本文所用，术语“蛋白质”是指具有一个或多个氦基酸残基长链的大分子。蛋白质可具有一个或多个多肽链(例如1、2、3、4、5、6或更多多肽链)。蛋白质中的氦基酸可以被一些其他分子例如糖和/或脂质修饰。

如本文所用，术语“多蛋白复合物”，“蛋白复合物”和“复合物”可互换使用，并且是指具有两个或更多个多肽链的季蛋白结构。蛋白质复合物中的多肽链可以通过非共价相互作用或共价键(例如二硫键)相互结合。

如本文所用，术语“超复合物”是指两种或更多种多蛋白复合物的稳定缔合。

如本文所用，术语“结构域”是指具有独特的结构和/或功能的蛋白质单元。蛋白质结构域通常具有可识别的三级结构，可以独立于蛋白质的其余部分而存在。

如本文所用，术语“多结构域”是指蛋白质中的两个或更多个结构域。

如本文所用，术语“Fc”或“Fc区”是指免疫球蛋白分子或其变体的“可结晶的片段”区域。

如本文所用，术语“Fc结合蛋白”是指可以结合Fc区的蛋白。Fc结合蛋白可以具有1、2、3、4个或更多个多肽。

如本文所用，术语“Fc结合多肽”是指可以结合至Fc区的工程化或天然存在的多肽。Fc结合多肽也是Fc结合蛋白。

如本文所用，术语“Fc结合结构域”是指可以结合至Fc区的蛋白质结构域。

如本文所用，术语“Fc融合蛋白”是指具有Fc区和非Fc区的工程化嵌合蛋白。

如本文所用，术语“含Fc的蛋白质”是指具有Fc区的蛋白质分子。含Fc的蛋白可以包括但不限于抗体，重链抗体，抗体的变体和Fc融合蛋白。

如本文所用，术语“多价”是指具有一个以上的抗原或靶标结合位点。

如本文所用，术语“亲和力”是指由于多重亲和力而在两个分子之间增强的结合强度。

如本文所用，术语“交联”是指将一个分子或靶标连接至另一分子或靶标的直接或间接连接。可以通过共价键或非共价相互作用进行交联。在一些实施方案中，交联由交联剂介导，所述交联剂是与两个靶标相互作用的中间分子或复合物。

如本文所用，术语“抗原”和“靶标”可互换使用，并且是指被抗体或其变体特异性识别的分子。在一些实施方案中，靶标是受体。

如本文所用，术语“蛋白A”是指由金黄色葡萄球菌中的基因spa编码的42kDa表面蛋白。蛋白A的Ig结合结构域是Fc结合结构域，其对免疫球蛋白G的Fc区域具有高亲和力。

如本文所用，术语“域Z”和“Z域”在本文中可互换地指蛋白A的结构域B的修饰形式。“Z结构域”(SEQ ID NO：6)包括蛋白A的结构域B的Gly29残基处的突变。

如本文所用，术语“蛋白G”是指由C和G组链球菌细菌中的基因spg编码的免疫球蛋白和白蛋白结合蛋白。

如本文所用，术语“接头区”或“接头序列”是指连接两个蛋白质结构域的氦基酸区段。接头可以是中间结构域，环区或无序区。

如本文所用，术语“亲和标签”是指对另一分子或靶标具有特异性亲和力的氦基酸序列的区段。亲和标签的示例包括，例如，poly-Histag，Strep-tag，HA-tag，Flag-tag，GST-tag和Myc-tag等。

如本文所用，术语“单特异性复合物”是指具有两个或更多个相同的含Fc的蛋白质(例如抗体或Fc融合蛋白)的拷贝的复合物。单特异性复合物识别并结合单一类型的抗原/靶标。

如本文所用，术语“双特异性复合物”是指具有两种不同的含Fc的蛋白质(例如，抗体或Fc融合蛋白)的复合物。双特异性复合物可以识别并结合两个不同的靶标或同一靶标上的两个不同的表位。

如本文所用，术语“多特异性复合物”是指具有两种或更多种不同的含Fc的蛋白质(例如，抗体或Fc融合蛋白)的复合物。多特异性复合物可以识别并结合至两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)不同的靶标或表位。

如本文所用，术语T细胞的“激活”是指T细胞中细胞信号级联的激活，其最终导致细胞增殖和/或效应子功能。在一些实施方案中，取决于所接收的主要TCR信号和相关的共刺激信号，T细胞的活化可导致细胞死亡。

如本文所用，术语T细胞“扩增”是指活化后T细胞的增殖。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述了根据本发明的方法提供治疗的动物，人或非人。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人类患者可以是成年人类或未成年人(例如18岁以下的人类)。除人类外，患者包括但不限于小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，兔子，雪貂，猫，狗和灵长类动物。包括例如非人类的灵长类动物(例如猴子，黑猩猩，大猩猩等)，啮齿动物(例如大鼠，小鼠，沙鼠，仓鼠，雪貂，兔子)，兔形体，猪(例如猪，微型动物)猪，马，犬，猫，牛和其他家养，农场和动物园的动物。

如本文所用，术语“约”是指在适用的情况下测量数值的+/-20％的偏差。在一些实施例中，推导是所测量的数值的+/-10％，+/-5％，+/-1％或+/-0.1％。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料。其他，也可以使用本领域已知的合适方法和材料。材料，方法和示例仅是说明性的，而无意于进行限制。本文提及的所有出版物，专利申请，专利，序列，数据库条目和其他参考文献通过引用整体并入本文。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。

根据以下详细描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。

附图说明

专利或申请文件包含至少一个彩色附图。专利局将根据要求并支付必要的费用，提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

附图说明图1A是示出单特异性复合物的实例的图。该复合物具有包含四个Fc结合结构域的Fc结合蛋白。四种抗体通过其Fc区与Fc结合蛋白结合。

图1B是示出双重特异性复合物的实例的图。该复合物具有两种不同类型的抗体(例如，特异性结合不同抗原的抗体)和包含四个Fc结合结构域的多肽。

图2是显示双特异性复合物与T细胞上的T细胞表面标志物之间相互作用的示意图。该复合物包含抗CD3抗体(用于T细胞活化的主要信号)和抗CD28抗体(用于T细胞活化的共刺激信号)。该复合物可以改变其构象，并更有效地与T细胞表面的T细胞表面分子结合。

图3是显示CD3被包含抗CD3抗体的单特异性复合物交联的示意图。CD3链的交联导致CD3-TCR超复合物的组装。通过共刺激信号(例如抗CD28抗体)，T细胞可以被激活并开始增殖。

图4是显示通过多蛋白复合物交联两个细胞的示意图。双特异性复合物包含两种不同的抗体，可以结合两个细胞并使它们紧密接近。

图5A-5C是一系列图像，显示T细胞被包含抗CD3抗体和

在第7、14和21天包含抗CD28抗体的单特异性复合物。在静态细胞培养条件下，由复合物扩增的T细胞形成小簇。

图5D-5F是一系列图像，显示T细胞被涂有CD3/CD28的“磁珠”(“Dynabeads”)扩增。由磁珠膨胀的T细胞倾向于形成更大的簇。结果表明，与磁珠相比，该复合物可以在细胞和抗体之间提供更好的接触。

图6是显示通过复合物，Dynabeads，ImmunoCult CD3/CD28激活剂(“TAC”)和Streptamer CD3/CD28预混物(“Streptamer”)扩增的T细胞数目的图。所述复合物包括单特异性抗CD3复合物和单特异性抗CD28复合物，它们以1∶2的比例混合并添加到细胞培养物中。将Dynabeads以约3∶1的比例加入到细胞中。根据生产商的规程，将immunoCult TAC和Streptamer Premix添加到细胞培养物中。

图7是显示在分别用复合物，Dynabeads，TAC和StreptamerCD3/CD28预混物扩增后第21天的细胞生存力的图。通过复合物扩增的T细胞具有超过99％的细胞活力，在所有测试试剂中最高。

图8是显示荧光激活细胞分选(FACS)结果的图，其中在分离后(添加试剂的第1天)或13天后，用荧光标记的抗CD3，抗CD4和抗CD8抗体对T细胞进行染色。与complexex，Dynabeads，TAC或Streptamer CD3/CD28 Premix一起培养。当用复合物处理T细胞时，CD8+群体增加约38％，CD4+群体减少约12％。由复合物诱导的CD8+细胞的增加率比其他组的增加率高得多。

图9显示了Fc结合蛋白和人IgG抗体的复合物的形成和纯化。将Fc结合蛋白(SEQID NO：10)，IgG抗体和复合物置于凝胶过滤柱(GE)上。

Healthcare Superdex S200)。通过以约1∶3的摩尔比混合Fc结合蛋白和IgG抗体来形成复合物(如实施例2中所述)。洗脱色谱图重叠，以显示洗脱体积的差异，该体积指示了三种蛋白质的分子量和复合物的化学计量。

图10显示了蛋白A的五个示例性Ig结合结构域(SEQ ID NOS：1-5)，Z结构域(SEQID NO：6)，蛋白G的Ig结合结构域(SEQ ID NOS：7-的氦基酸序列。9)，和示例性的Fc结合蛋白，其包含五个串联的Z结构域(SEQ ID NO：10)。

详细说明

本公开提供了产生和使用多价蛋白质复合物的方法。蛋白质复合物可以具有可以与多个靶分子结合或相互作用的多个结合位点。这种复合物在需要同时发生分子相互作用(例如受体交联)的情况下非常有用。例如，复合物可以促进CD3-TCR超复合物的组装和扩增T细胞。因此，复合物可以加速过继性T细胞疗法(ACT)的过程。

由于ACT的高度特异性和长期免疫保护作用，其可用于治疗包括癌症在内的多种人类疾病。特别地，ACT已经成为转移性疾病患者治愈性癌症治疗的临床途径。在临床环境中，通常需要在输注之前从外周血单核细胞(PBMC)，基因修饰的T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞体外扩增T淋巴细胞。然后将肿瘤特异性的细胞毒性T细胞注入到癌症患者体内，以识别，靶向和破坏肿瘤细胞为目标。

T细胞活化触发细胞信号传导级联，其依赖于T细胞受体(TCR)信号和共刺激信号，可进一步导致细胞增殖，效应功能或细胞凋亡。众所周知，T细胞需要至少两个独立的信号才能在体内完全激活(Smith-Garvin等人，“T细胞激活”。免疫学年度评论27(2009)：591-619。)。在许多情况下，主要信号是与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原多肽与T细胞受体(TCR)结合的抗原特异性信号。共刺激信号通常由抗原呈递细胞(APC)上的细胞因子和/或共刺激信号介导。如果不提供共刺激信号，则仅被主要信号激活的T细胞将在很大程度上导致细胞凋亡。

已经开发了多种方法来活化和扩增T细胞，而在体外或离体都不涉及APC。研究表明，TCR复合物的结合与CD3分子的组装有关，而CD3分子与TCR形成了一个超级复合物。CD3的两条s链交联导致TCR-CD3超复合物的形成，从而引起T细胞活化的信号级联反应。当固定在固体表面上时，针对CD3s链的抗体(例如OTK3克隆)可以有效触发TCR-CD3超复合物的形成。同时，TCR激活受T细胞表面上的几种共刺激分子(例如CD28)调控。因此，固定的抗CD3和抗CD28抗体通常用于体外或离体的有效T细胞活化和扩增。例如，用抗CD3和CD28抗体包被的磁珠是一种体外扩增T细胞的流行方法。据推测，抗体包被的微珠的表面模拟APC，从而导致T细胞快速增殖。但是，珠状结构具有明显的局限性。磁珠的刚性表面可能不能很好地替代APC。

此外，在临床环境中从T细胞中完全去除磁珠(即“去微球”)可能是一个挑战。已经开发了其他一些类似的方法。但是，这些方法通常具有各种局限性，并且也难以在临床环境中使用。例如，显示CD3和CD28的四聚体复合物对于扩增T细胞有效。锚定在抗生蛋白链菌素(四聚体)上的抗CD3和抗CD28抗体也可以激活/扩增T细胞。然而，可能由于那些抗体复合物的刚性，那些四聚体在激活T细胞方面不是十分有效。此外，制造那些四聚体的高成本可能使其难以用于大规模的T细胞扩增。

例如，在下文中描述了使用各种试剂扩增T细胞的方法以及有关如何在临床环境中使用T细胞的一般描述。

US7572631B2，US2007/0036783A1和美国专利US2016/0681A；它们中的每一个均通过引用整体并入本文。

本发明内容提供了一种用于简单，有效和通用地形成多蛋白复合物的方法。当掺入用于T细胞活化的刺激信号时，多蛋白复合物可以有效地活化/扩增T细胞群体(例如，用于扩增可以在ACT中使用的T细胞)。

多蛋白复合物

本公开提供了一种多蛋白复合物，其包含包含两个或更多个Fc结合结构域的Fc结合蛋白(例如Fc结合多肽)和两个或更多个包含Fc的蛋白，每个包含Fc区，其中每个含Fc的蛋白都结合到Fc中的Fc结合域多肽。

在一些实施方案中，多蛋白复合物由至少一种Fc结合蛋白和两种或更多种含Fc的蛋白组装而成。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白或多肽具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个Fc结合结构域。蛋白质复合物可具有至少两个含Fc的蛋白质(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个含Fc的蛋白质)。含Fc的蛋白质可以识别并结合特定的靶标。在一些实施方案中，蛋白质复合物为特定靶标提供一个以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10)结合位点。

在一些实施方案中，多肽或Fc结合蛋白中的Fc结合结构域被含Fc的蛋白完全占据。在一些

实施方案，多肽或Fc结合蛋白中的Fc结合结构域未被含Fc的蛋白完全占据。例如，含Fc的蛋白质不占据1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个Fc结合结构域。

在一些实施方案中，蛋白复合物可用于结合单一类型靶标的多个拷贝。在一些其他实施方案中，蛋白质复合物可用于结合两个或更多个不同的靶标。

多蛋白质复合物可以是多价的。在一些实施方案中，复合物可以通过Fc结合结构域与多种抗体/Fc融合蛋白之间的非共价相互作用形成。

在一些实施方案中，多蛋白复合物是单特异性复合物。单特异性复合物可以与Fc结合蛋白(例如，多肽)和一种类型的抗体/Fc-融合蛋白一起形成(图1A)。抗体可以是识别一个靶标或分子的单克隆抗体或多克隆抗体。靶标或分子可以在溶液中或在颗粒(例如，纳米颗粒)的表面上。单特异性复合物可以结合两个或多个相同类型的分子。

在一些实施方案中，多蛋白复合物是双特异性复合物。

可以用Fc结合蛋白和两种不同的抗体/Fc融合蛋白形成双特异性复合物(图IB)。结合在Fc结合蛋白上的两种抗体/Fc融合蛋白的摩尔比可以变化(例如1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3或1∶4)。在一些实施方案中，相等数量的不同抗体/Fc融合蛋白可以结合单个Fc结合蛋白。双特异性复合物可以靶向溶液或细胞或颗粒表面上的两个不同分子。双特异性复合物可用于交联两个不同的靶标(例如，不同的分子，不同的颗粒和/或不同的细胞)。例如，如图2所示，如图4所示，双特异性复合物可以使T细胞和癌细胞交联或聚集在一起，其中在双特异性复合物中同时结合T细胞上的细胞表面标志物和癌细胞上的细胞表面标志物。。

在一些实施方案中，多蛋白复合物是多特异性复合物。多特异性复合物可以与Fc结合蛋白和两种或更多种两种不同的抗体/Fc融合蛋白一起形成。多特异性复合物可用于交联溶液中的多个不同靶标。

由于Fc结合蛋白的柔性，多蛋白复合物表现出构象柔性。对于每个Fc结合域，域间连接可以是灵活的，以具有很大的自由度。结果，该复合物可以更好地模拟抗原呈递细胞与T细胞的相互作用。

在一些实施方案中，当复合物是单特异性的时，多蛋白质复合物与一种类型的细胞表面抗原/靶标相互作用。在一些其他实施方案中，当多蛋白复合物是双特异性或多特异性时，该复合物可以与一个以上的细胞表面抗原/靶标相互作用。在一些实施方案中，该络合物可用于使溶液中或固体表面上的两个或更多个分子交联。在一些其他实施方案中，复合物可用于交联两个或更多个细胞或颗粒。

在一些实施方案中，该复合物可用于调节细胞功能，例如通过交联细胞表面分子来诱导或抑制某些细胞功能。

在一些实施方案中，复合物可用于活化和扩增T细胞群以治疗癌症或传染病。

Fc结合蛋白

多蛋白复合物具有多结构域Fc结合蛋白或Fc结合多肽，其用作抗体及其变体(例如全长抗体，重链抗体)的连接平台，和Fc融合蛋白。可以在“免疫球蛋白G的Fc结合配体：高亲和力蛋白和肽概述”一文中找到有关常见Fc结合蛋白的全面综述(Choe W.等，Materials。2016；9(12))。：994)，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白或Fc结合多肽包含至少两个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Fc结合结构域。Fc结合结构域可以是葡萄球菌蛋白A的Ig结合结构域或其任何功能性变体，Z结构域或其任何功能性变体，链球菌蛋白G的免疫球蛋白结合结构域或其任何功能性变体以及任何其他天然或工程改造的Fc结合多肽。蛋白A具有五个Ig结合域，包括C(SEQ ID NO：1)，D(SEQ ID NO：2)，E(SEQ ID NO：3)，A(SEQ ID NO；4)和B(SEQ ID NO：5)。“Z结构域”是修饰的B结构域(如SEQ ID NO：6所示)。来自链球菌sp。的蛋白G的Ig结合结构域。基团G包括C1(SEQ ID NO：7)，C2(SEQ ID NO：8)和C3(SEQ ID NO：9)。蛋白A和蛋白G对来自不同物种和/或来自不同亚类的抗体具有不同的亲和力。因此，可以基于要使用的抗体来选择Fc结合蛋白或Fc结合多肽中的不同Fc结合结构域。在一些实施方案中，Fc结合结构域是天然存在的或工程改造的Fc结合多肽，例如蛋白A，蛋白G和蛋白L的Fc结合结构域。Fc结合结构域或多肽的实例可见于文章“免疫球蛋白G的Fc结合配体：高亲和力蛋白质和肽的概述”(Choe W.等，Materials.2016；9(12)：994)，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，Fc结合多肽的Fc结合蛋白包含两个Fc结合域，三个Fc结合域，四个Fc结合域，五个Fc结合域，六个Fc结合域，七个或由以下组成Fc结合结构域，八个Fc结合结构域或八个以上的Fc结合结构域。

由于Z结构域具有有限的Fab结合活性，因此Fc结合蛋白或仅具有Z结构域的Fc结合多肽可用于产生多蛋白复合物。在一些实施方案中，Fc结合蛋白或Fc结合多肽具有五个串联连接的Z结构域(SEQ ID NO：10)，其可在溶液中容纳1、2、3、4或5个抗体(例如约3个)。-4抗体平均在溶液中)。在一些实施方案中，抗体是抗CD3或抗CD28抗体。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白或Fc结合多肽具有Fc结合结构域的混合物，例如来自蛋白A，Cl结构域的C结构域，D结构域，E结构域，A结构域和B结构域蛋白G的C2结构域，C2结构域和C3结构域，Z结构域，Fc结合多肽的一些其他Fc结合结构域及其变体。这些Fc结合结构域的变体也可以包括在Fc结合蛋白或Fc结合多肽中。变体可以具有氦基酸取代，缺失和/或添加，并且仍然保留如本文所述的Fc结合结构域的天然形式的功能活性。

在一些实施方案中，Fc结合结构域在有或没有接头序列的情况下连接。例如，野生型蛋白A中的五个Ig结合域被认为没有域间接头序列。为了增加Fc结合蛋白的柔性，可以在相邻结构域之间添加额外的结构域间接头序列。接头序列的一些实例包括GGGGGG(SEQ IDNO：11).GSGSGS(SEQ ID NO：12)和SSSSS(SEQ ID NO：13)。

在一些实施方案中，Fc结合结构域与化学接头连接，例如二硫键，碳二亚胺，NHS酯，亚氦基酯，五氟苯基酯，羟甲基膦，马来酰亚胺，卤代乙酰基(溴代或碘代)，吡啶基二硫化物，硫代磺酸盐，乙烯基砜，酰肼，烷氧基胺，重氮基，芳基叠氮化物或异氰酸酯。

每个Fc结合结构域可对抗体/Fc融合蛋白的Fc区具有高亲和力。因此，每种Fc结合蛋白可容纳抗体/Fc融合蛋白的两个或更多个拷贝或两个或更多个分子的Fc/融合蛋白。

不同的抗体/Fc融合蛋白。在一些实施方案中，复合物提供了高的局部配体密度以与抗原/靶标结合，导致增强的结合亲和力。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白或Fc结合多肽包含单个Fc结合结构域(例如，Z结构域)的两个或更多个拷贝。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白或Fc结合多肽包含两个或更多个不同的Fc结合结构域(例如，B结构域和Z结构域)。

在一些实施方案中，将Fc结合多肽工程化以包括一个或多个半胱氦酸残基，用于通过二硫键进一步交联Fc结合多肽。

在一些实施方案中，将Fc结合蛋白或Fc结合多肽工程化以包括一些其他功能性结构域或序列。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白或Fc结合多肽包括亲和标签，例如但不限于聚-Histag，Strep-tag，HA-tag，Flag-tag，GST-tag，亲和标签(如果包含)可以为多蛋白复合物提供纯化工具。亲和标签也可以提供用于将多蛋白复合物固定在表面或另一分子上的方法。

在一些实施方案中，Fc结合蛋白无论是野生型的还是工程加工型的，可以在表达系统例如细菌(例如大肠杆菌)，酵母，藻类，昆虫细胞和哺乳动物细胞中合。将Fc结合蛋白纯化至均一水平后，对Fc结合蛋白进行定量并在适当的缓冲液中重构为所需浓度。

在一些实施方案中，Fc结合结构域可具有与所述免疫球蛋白结合结构域至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％相同的序列在本公开中(例如，域B，C，A，E，D，Z，C1，C2和C3)。

在一些实施方案中，Fc结合多肽可具有与SEQ ID NO：10至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的序列。

含Fc的蛋白

含Fc的蛋白质是具有Fc区的蛋白质分子。含Fc的蛋白质可以包括例如抗体，重链抗体和Fc-融合蛋白。Fc融合蛋白可以是包含至少一个Fc区的工程化嵌合蛋白。包含FC区的含Fc的蛋白质可以通过Fc区与Fc结合蛋白缔合。

抗体可以是单克隆抗体，多克隆抗体或其变体。该抗体也可以是免疫球蛋白分子(包括两条重链和两条轻链)，或一种二链重链抗体。

含Fc的蛋白质可以对溶液或固体表面上的抗原或靶标具有特异性结合亲和力。在一些实施方案中，含Fc的蛋白是可以结合细胞表面标志物的抗体或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，细胞表面标记是肿瘤细胞表面标记。

在一些实施方案中，抗体或其变体来自单个动物来源或来自多个动物来源，包括但不限于小鼠，大鼠，兔，马，绵羊，山羊，牛，骆驼科动物，鲨鱼，猪，仓鼠，人类。在一些实施方案中，抗体是从动物中提取的。在其他

实施方案，从重组蛋白表达系统纯化抗体/Fc融合蛋白。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白质是可以识别T细胞表面标志物的抗体。在一些实施方案中，含Fc的蛋白提供用于T细胞活化和扩增的主要信号(例如抗CD3)和/或共刺激信号(例如抗CD28，抗CD2，抗CD27，抗CD46)。(抗CD137，抗CD226)用于T细胞活化和扩增。在一些实施方案中，含Fc的蛋白可以特异性结合CD3，CD28，CD2，CD27，CD46，CD137或CD226。

在一些实施方案中，含Fc的蛋白是双特异性抗体。它可以为T细胞活化和扩增提供主要信号和共刺激信号。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一臂可以结合CD3，双特异性抗体的第二臂可以结合CD28，CD2，CD27，CD46，CD137或CD226。

制备多蛋白复合物的方法

可以多种不同方式制备复合物，并且可以形成具有不同滴定度的Fc-结合蛋白和抗体/Fc-融合蛋白的复合物。

为了制备单特异性复合物，可以将选择的抗体/Fc融合蛋白与纯化的Fc结合蛋白以一定摩尔比混合。尽管使用更多摩尔量的抗体/Fc-融合蛋白进行混合，但是由于Fc-结合蛋白中的空间位阻，抗体/Fc-结合蛋白可能会或可能不会饱和Fc-结合蛋白上的结合位点。在一些实施方案中，Fc结合蛋白与含Fc的蛋白的摩尔比为约1∶2至约1∶100(例如，约1∶2至约1∶10，或约1∶2之间)和大约1∶5)。

为了产生双特异性或多特异性复合物，可以首先将等摩尔量的两种或更多种抗体/Fc-融合蛋白混合。将抗体/Fc融合蛋白的混合物进一步以所需摩尔比与Fc结合蛋白或Fc结合多肽混合。或者，将两种或多种抗体/Fc融合蛋白的所需摩尔比混合。将所得混合物与Fc结合蛋白进一步以所需摩尔比混合。在一些实施方案中，用于形成双特异性复合物的两种不同抗体/Fc融合蛋白的摩尔比可以在约1∶1与约1∶5之间(例如，约1∶1、1∶2)，

1∶3、1∶4或1∶5)。在一些实施方案中，用于形成多特异性复合物的各种抗体/Fc融合蛋白为大约相等摩尔。

混合在一起的组分的相互作用可能很快。因此，可以在短时间内(例如少于6小时，1小时，10分钟或1分钟)形成络合物。

配合物可以通过色谱法进一步纯化。复合物的纯化可以基于Fc结合蛋白具有的亲和标签。为了分离溶液中各种不同的配合物，可以使用离子交换色谱法。离子交换色谱可以根据复合物中各种抗体/Fc融合蛋白所具有的差异电荷来分离复合物的不同种群。

在一些实施方案中，该复合物在一定温度范围内是稳定的并且可溶的，例如0-40℃，优选4-37℃。

在一些实施方案中，将两种或更多种复合物混合在一起以形成组合物。

在一些实施方案中，将两种或更多种络合物混合在一起并进一步用二硫键或其他化学接头交联。

在一些实施方案中，多蛋白复合物在生成后，可以用液相色谱法进一步纯化，例如但不限于尺寸排阻/凝胶过滤，亲和色谱，离子交换色谱和疏水色谱。可以将溶液中的纯化复合物浓缩或稀释至所需浓度。在一些实施方案中，溶液中的复合物可以在各种条件下例如在不同的温度条件下长时间存储。

本公开进一步提供了包含编码如本文所述的氦基酸序列的序列的载体和包含这些载体的细胞。本公开还提供了重组载体(例如表达载体)，其包括本文公开的核酸(例如编码本文公开的多肽的核酸)，将重组载体引入宿主细胞(即使得宿主细胞包含多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体)，以及通过重组技术产生多肽或其蛋白质。

本公开还提供了至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％与本文所述的任何核苷酸序列相同，并且氦基酸序列至少为1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，

与本文所述的任何氦基酸序列相同，分别为85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％相同。在一些实施方案中，本公开涉及编码本文所述的任何多肽的核苷酸序列，或由本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氦基酸序列。在一些实施方案中，核酸序列小于10、20、30、40，

50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400或500个核苷酸。在一些实施方案中，氦基酸序列小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或150个氦基酸酸残基。

在一些实施方案中，氦基酸序列(i)包括氦基酸序列；或(ii)由氦基酸序列组成，其中所述氦基酸序列是本文所述的任何序列。在一些实施方案中，核酸序列(i)包括核酸序列；或(ii)由核酸组成

序列，其中核酸序列是本文描述的任何序列。

为了确定两个氦基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氦基酸或核酸之一或两者中引入缺口)为了比较目的，可以不考虑用于最佳比对的氦基酸序列和非同源序列)。为了比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少80％，并且在一些实施方案中为至少90％，95％或100％。然后比较相应氦基酸位置或核苷酸位置的氦基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氦基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置是相同的(如本文所用，氦基酸或核酸的“同一性”等同于氦基酸酸或核酸“同源性”)。考虑到缺口数和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数，这需要引入以实现两个序列的最佳比对。为了本发明的目的，两个序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定可以使用Blossum 62评分矩阵来实现，其间隙罚分为12，间隙延伸罚分为4，移码间隙罚分为5。

使用复合物的方法

所述多蛋白复合物可以用于结合多种细胞表面蛋白以调节细胞功能，例如诱导或抑制细胞功能。

在一些实施方案中，复合物可以结合T细胞群，向T细胞提供主要和共刺激信号。在一些实施方案中，复合物可用于激活和/或扩增T细胞。

起始T细胞可获自外周血单核细胞

(PBMC)受试者(例如，人类)的供体的血液。T细胞也可以从许多其他来源获得，包括骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的任何T细胞系。可以通过消耗B细胞，NK细胞，单核细胞，血小板，树突状细胞，粒细胞和红细胞来分离本实验中使用的T细胞。T细胞分离的技术是本领域普通技术人员已知的。

在一些实施方案中，提供包含两个或多个拷贝的抗CD3抗体的单特异性复合物作为T细胞活化和增殖的主要信号。单特异性抗CD3复合物交联CD3的s链，并触发CD3-TCR超复合物在T细胞上的组装(图3)。组装的CD3-TCR转导单个级联反应，从而激活T细胞。

在一些实施方案中，包含两个或更多拷贝的抗CD28抗体的单特异性复合物可以为T细胞活化提供共刺激信号。

在一些实施方案中，包含抗体的两个或更多个拷贝的单特异性复合物，所述抗体选自但不限于抗CD2，抗CD3，抗CD27，抗CD46，抗CD 137和抗-CD226可以用作另一个共刺激信号。

在一些实施方案中，包含主要信号和刺激信号的复合物用于治疗T细胞。例如，单特异性抗CD3复合物和单特异性抗CD28复合物可以一起用于有效的T细胞活化和扩增。

在一些实施方案中，用于治疗T细胞的不同单特异性复合物的摩尔比是可调节的。例如，具有主要信号的复合物(例如抗CD3)和具有共刺激信号的复合物(例如抗CD28)的摩尔比可以在约1∶1至约1∶100之间。具有主要信号的复合物(例如抗CD3)和具有共刺激信号的复合物(例如抗CD28)也可以在约1∶100至约1∶1之间(图2)。

本文所述的比率(例如，主要信号：共刺激信号，或共刺激信号：主要信号)可以大于1∶100、1∶90、1∶80、1∶70，1∶60、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5、1∶2或1∶1。比率也可以小于1∶100、1∶90、1∶80、1∶70、1∶60、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5，1∶2或1∶1。

在一些实施方案中，提供共刺激信号的未复合抗体和包含抗CD3抗体的单特异性复合物一起用于T细胞活化(图3)。在一些实施方案中，抗CD28抗体和包含抗CD3的单特异性复合物一起用于T细胞活化。在一些其他实施方案中，两种或更多种未复合的共刺激抗体和包含抗CD3的单特异性复合物用于T细胞活化。如本文所用，术语“未复合的”是指不与Fc结合蛋白缔合的可溶性抗体。

在一些实施方案中，另外的共刺激信号包括选自但不限于抗CD2，抗CD7，抗CD27，抗CD46，抗CD 137和抗CD226的抗体。这些抗体可以是复合物也可以是非复合物，并被添加到抗CD3和抗CD28的单特异性复合物中以激活T细胞。

在一些实施方案中，同时包含抗CD3和抗CD28抗体的双特异性复合物用于T细胞活化(图2)。

在一些实施方案中，双特异性复合物，其包含抗CD3和用于共刺激信号的抗体，所述抗体选自但不限于抗CD2，抗CD7，抗CD27，抗CD46，抗CD 137和抗CD226可用于T细胞活化。

在一些实施方案中，另外的共刺激信号包括复合和/或非复合抗体，所述复合和/或非复合抗体选自但不限于抗CD2，抗CD7，抗CD27，抗CD46，抗CD137和抗可以将CD226添加到抗CD3和抗CD28的双重特异性复合物中以激活T细胞。

在一些实施方案中，将不同的预组装复合物和任何未复合抗体分别添加至T细胞培养基。在一些其他实施方案中，在添加到T细胞培养基中之前，将不同的预组装的复合物和任何未复合的抗体预混合。

在一些实施方案中，细胞培养容器被无毒的亲水性材料堵塞以防止多蛋白复合物的潜在固定化。至少一部分复合物在细胞培养基中保持可溶状态。

在一些实施方案中，基于复合物的摩尔浓度的计算，要活化的每个T细胞被至少一种包含抗CD3的复合物覆盖一种包含抗CD28的复合物。可以在T细胞的扩增过程中添加包含抗CD3和/或抗CD28的其他复合物。

在一些实施方案中，通过特异性结合复合物(例如复合物中的亲和标签)的亲和树脂除去包含抗CD3和/或抗CD28的过量复合物。

在一些实施方案中，由本文所述的复合物激活的T细胞可以扩增约2-100000倍(例如，超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30倍)，40、50、60、70、80、90、100、500、1000、5000、10000、50000或100000倍)在2至30天内(例如2、3、4、5、6、7、8，9、10、20或30天)。在一些实施方案中，可以将T细胞扩增超过10倍，100倍，1000倍，2000倍，4000倍，

通过使用本文公开的多蛋白复合物在适当的时期(例如21天)达到100,000倍或更多。

在一些实施方案中，复合物对于体外和离体的T细胞扩增非常有效。在一些实施方案中，通过本文描述的方法的T细胞扩增效率比基于磁珠的扩增高约2-20倍。

在一些实施方案中，与基于珠的扩增相比，被复合物扩增的T细胞具有相等或更少的末端扩增细胞或凋亡细胞。

在一些实施方案中，通过本文所述的复合物扩增的T细胞具有超过90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％细胞活力的％，99.2％，99.3％，99.4％或99.5％(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，扩展开始后的16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天)。

在一些实施方案中，由复合物扩增的T细胞以1∶1至1∶20(例如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，1∶10、1∶15或1∶20)。在一些实施方案中，与基于珠的扩增相比，本文所述的复合物和方法可以诱导具有更大比例的CD8+细胞的扩增的T细胞群体。在一些实施方案中，CD8+细胞在T细胞(例如，CD8+细胞和CD4+细胞)中的比例大于10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，即95％。在一些实施方案中，CD4+细胞在T细胞(例如，CD8+细胞和CD4+细胞)中的比例低于5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％。在一些实施方案中，本文所述的复合物可使CD8+细胞的百分比增加超过10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％。在一些实施方案中，本文所述的复合物可以使T细胞中CD4+细胞的百分比降低超过1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％。

在一些实施方案中，从受试者收集T细胞，并通过本文描述的方法扩增。扩增的T细胞可用于多种目的，例如过继细胞转移。

在一些实施方案中，包含两种不同抗体/Fc融合蛋白的双特异性复合物可用于通过使一个细胞与复合物上的一种抗体/Fc融合蛋白结合并结合另一种细胞来交联两个不同细胞。与复合物中的其他抗体/Fc融合蛋白结合。

在一些实施方案中，T细胞在IL-2存在下扩增。

在一些实施方案中，包含识别T细胞上的抗原的抗体和包含识别肿瘤细胞表面标志物的另一种抗体的双特异性复合物可以使T细胞与肿瘤细胞交联(图4)。在一些实施方案中，交联可以杀死肿瘤细胞。

因此，本公开内容还提供了杀死癌细胞的方法。该方法可以包括使癌细胞与本文所述的多蛋白复合物接触。在一些实施方案中，多蛋白复合物可以识别并结合免疫细胞上的特定细胞表面分子(例如，CD2，CD27，CD46，CD 137和/或CD226)，以及癌症上的特定细胞表面分子。单元格(例如，PD-L1，Her2和CD20)。因此，本公开还提供了一种治疗受试者癌症的方法。

在一些实施方案中，复合物可用于捕获和分离特定类型的细胞。该复合物可包含识别待捕获细胞上的特定表面蛋白的抗体/Fc融合蛋白。在一些

实施方案，Fc结合蛋白可具有亲和标签，包括例如聚His标签和Strep标签。一旦细胞被多种复合物结合，包含固体颗粒或膜以及与复合物中Fc结合蛋白上的亲和标签特异性相互作用的结合部分的基质可用于下拉细胞。

成分和试剂盒

本公开还提供了包含所述复合物的组合物或药物组合物。

在一些实施方案中，将组合物与药学上可接受的载体。药物组合物和制剂可以在体外，体内或离体使用，或者可以肠胃外，局部，口服或局部施用。

在一些实施方案中，由于Fc结合蛋白与蛋白结合物之间的高亲和力相互作用，该复合物在缓冲液(例如磷酸盐缓冲液，碳酸氢盐缓冲液)或介质(例如DMEM，X-VIVO-15)中稳定。抗体/Fc-融合蛋白。复合物可以在各种条件下保持其结构，例如各种温度(例如0℃至37℃)，各种pH(例如pH 5至pH 9)，各种离子强度(例如0-2,000ms/cm))和/或在去污剂(例如TWEEN-20)的存在下。

在一些实施方案中，该复合物可以在很宽的温度(例如4℃至37℃)和pH(例如pH 5至pH 9)的范围内完全溶于溶液，缓冲液或介质中。

本公开进一步提供了包含多蛋白复合物，抗体，其他组分及其使用说明的T细胞扩增试剂盒。

实施例子

在以下实施例中进一步描述本发明，其不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例子1：材料和方法

在实施例中使用以下材料和方法。

T细胞的来源

在扩增之前，起始T细胞获自供体人血的外周血单核细胞(PBMC)。通过消耗B细胞，NK细胞，单核细胞，血小板，树突细胞，粒细胞和红细胞来分离实施例中使用的T细胞。

T细胞培养

首先在37℃下用含2.0％人血清白蛋白(HSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭48孔细胞培养板18小时。用HSA封闭可防止多蛋白复合物固定在塑料表面上。过量的HSA用PBS冲洗掉。从PBMC中分离出的T细胞在X-VIVO^TM15(位于瑞士巴塞尔，伦敦，Lonza)中培养，含5％人AB血清和10-20IU/mLIL-2，起始细胞密度为0.1-1.0×106/mL。所有细胞均在37℃，5％CC和75％湿度的培养箱中培养。

抗体

小鼠抗人CD3(“OKT3”)和小鼠抗人CD28(“CD28.2”)单克隆抗体购自LifeTechnologies(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。两种抗体溶液均稀释至0.2pg/pL。

Fc结合蛋白

设计并在酵母系统中表达含有五个Z结构域(SEQ ID NO：10)的多肽。用SuperdexS75凝胶过滤色谱柱(GE Healthcare，Boston，MA)纯化分泌的蛋白质。将纯化的蛋白质在PBS中重构为0.2pg/pL的浓度。

磁珠

将Dynabeads ClinExVivo TM CD3/CD28(或“Dynabeads”，购自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)用于比较目的。在实验中使用的珠与细胞的比例为3∶1。

四聚体抗体复合物(TAC)

T细胞活化剂“ImmunoCult TM人CD3/CD28T细胞活化剂”(来自加拿大温哥华的STEMCELLTechnologies)也用于比较目的。将大约25pL的TAC溶液添加到1mL培养液中以扩增T细胞。

Streptamer CD3/CD28预混料

T细胞活化剂Streptamer CD3/CD28预混溶液(来自IBA Lifesciences，哥延根，德国)也用于T细胞扩增。

实施例子2：多蛋白复合物的形成

进行实验以制备抗CD3抗体和抗CD28抗体的单特异性复合物。为了确认Fc结合蛋白与人IgG抗体之间形成复合物并评估其化学计量，对复合物，Fc结合蛋白和人IgG进行了凝胶过滤层析(GE Healthcare)超强

S200)(图9)。根据洗脱体积估算每个群体的分子量。根据滴定和尺寸排阻实验，每个Fc结合蛋白可大约结合约三个IgG分子。因此，使用Fc结合蛋白与抗体的摩尔比为1∶3来混合Fc结合蛋白和抗体。

简要地，将90pg的抗CD3抗体或抗CD28抗体与10pg的Fc结合蛋白混合。将混合溶液无菌过滤并储存在4℃。任选地，用Superdex 200柱(GE Healthcare，Boston，MA)纯化形成的单特异性复合物。复合物的洗脱峰与Fc结合蛋白或抗体的峰完全分开。用BCA蛋白测定试剂盒(购自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA))定量收集的复合物级分，并将蛋白浓度调节至100-200pg/ml。

还通过将Fc结合蛋白与抗CD3抗体和抗CD28抗体混合来制备同时包含抗CD3和抗CD28的双特异性复合物。首先混合等摩尔浓度的抗CD3和抗CD28。然后将抗体混合物与Fc结合蛋白混合。它产生了50％的双特异性复合物，25％的单特异性抗CD3复合物和25％的单特异性抗CD28复合物。简要地。将45pg的抗CD3抗体和45pg的抗CD28抗体充分混合。然后将约10μl的Fc结合蛋白加入到混合物中。该复合物溶液用于治疗T细胞。

实施例子3：扩增T细胞

由于在体外/离体扩增过程中数目通常增加数十倍或数百倍，因此当T细胞约70-90％汇合时，T细胞会定期分裂。分离以约1∶2至1∶5的比例进行。细胞分裂后补充培养基。可以将其他的T细胞扩增剂引入亚培养物中，以补偿由分裂引起的稀释。

简而言之，收集，计数并将从PBMC分离的T细胞计数并平均分配到预先用HSA封闭的48孔板的孔中。每个孔在100pL的体积中包含起始数目为0.lx106的细胞。

在一个实验中，根据增产方法将孔分组。

每个组具有三个重复的孔，均等处理。将3pL PBS加入第1组(阴性对照)。第2组用2pL抗CD3复合物和3pL抗CD28复合物治疗。第3组用3pL的CTS Dynabeads CD3/CD28(ThermoFisher)处理，细胞与珠的比例为约1∶3。第4组用3μL免疫学CD3/CD28(StemcellTechnologies Inc)处理。第5组用5μLCD3/CD28链霉菌预混物(IBA Lifesciences)治疗。

在更换培养基之前，在膨胀剂或PBS存在下将T细胞传代培养2天。更换培养基后立即添加新鲜的液体T细胞膨胀剂。在培养基更换过程中将Dynabeads CD3/CD28与细胞保持在一起。分裂后每两天计数一次细胞。

结果：如图所示。如图6所示，用含有CD3/CD28的多蛋白复合物处理的第2组显示出更高的T细胞扩增效率。为了比较，T细胞扩增复合物的效率比包括Dynabeads CD3/CD28，Immunocult CD3/CD28(“TAC”)和CD3/CD28 Streptamers预混物(“Streptamer”)的其他扩增剂高约50％至1,000％。T细胞的起始种群为约0.1×106，并且在约10IU的IL-2存在下培养细胞。分裂细胞并以1-3间隔计数。用复合物处理的细胞具有比其他测试试剂更高的扩增速率。

表1.使用不同膨胀剂的膨胀倍数

实施例子4：通过不同的膨胀剂扩增的细胞的生存力

扩增21天后，将T细胞用碘化丙啶染色以进行生存力测试。如图1所示。如图7所示，通过复合物，Dynabeads CD3/CD28，ImmunoCult CD3/CD28激活剂和Streptamer CD3/CD28预混物扩增的细胞的活力分别为99.2％，94.1％，94.5％和88.3％。因此，蛋白质复合物在活化和扩增后不会引起明显的T细胞死亡。相反，被其他膨胀剂消耗的T细胞具有约5-12％的细胞死亡。

实施例子5：CD4+和CD8+群体分析

以下缀合有荧光染料的单克隆抗体用于流式细胞仪分析：FITC缀合的抗CD4，抗CD8(Dako Cytomation，Denmark)，抗CD3(BD Biosciences，San Jose，CA)抗体；PE偶联的抗CD4抗体；PE-Cy-5-缀合的抗CD8抗体(Dako Cytomation，丹麦)。

T细胞用FITC偶联或藻红蛋白(PE)偶联的抗体染色，包括单克隆小鼠抗人CD4和CD8，多克隆山羊抗小鼠抗体(Sigma，St.Louis，MO)和单克隆小鼠抗人IgG，Fc片段特异性F(ab)2抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)被用于分析细胞表面免疫表型。

洗涤细胞并将其重悬于50pL的Hanks缓冲盐水溶液中，该溶液包含2％FBS和5pL储备抗体制剂。在4-10℃下孵育10分钟后，将细胞洗涤两次，重悬于300pL含1％多聚甲醛的PBS中，并用FACScan(BD Biosciences Immunocytometry Systems，加利福尼亚州圣何塞)进行分析。

对于每组，大于96％的T细胞表达CD3。如图4所示，CD4+和CD8+的比例随着不同的膨胀剂而变化。表8总结了结果。

表2.CD4+和CD8+群体的相对变化

由蛋白质复合物扩增的T细胞具有比其他扩增剂明显更高的CD8+亚群。这表明该蛋白复合物可以刺激CD8+亚群。有趣的是，由复合物，TAC和Streptamer扩增的T细胞均比由Dynabeads扩增的细胞具有更高的CD8+亚群和更低的CD4+亚群。

实施例子6：扩增的T细胞的功能特征

来自PBMC的T细胞在两种单体复合物(即抗CD3复合物和抗CD28复合物)或Dynabeads CD3/CD28的存在下被激活和扩增。简而言之，将起始浓度为0.1×106/mL的约100pL/孔的T细胞与100IU/mL的IL-2培养。向细胞中加入约2pL的抗CD3单体复合物和约3pL的抗CD28单体复合物。Dynabeads CD3/CD28膨胀剂用于比较目的。

将微球以最终的微球与细胞的比例为3∶1添加到细胞中。对于阴性对照，在孔中添加空白PBS。

扩增13天后，收集细胞，洗涤并将其传至无IL-2的新孔中。加入膨胀剂或PBS。细胞生长24小时后，收集细胞培养物的上清液用于分析分泌的细胞因子。

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量IL-2，IL-4，INFy和TNFα的水平。T细胞分泌细胞因子的方式取决于许多因素，包括细胞亚群和刺激条件。蛋白质复合物和磁珠膨胀剂导致T细胞的亚群略有不同。而且，对CD3/CD28分子的不同交联作用可能会触发T细胞内部的不同激活信号。预期由蛋白质复合物和Dynabeads活化和扩增的T细胞分泌的细胞因子水平是不同的。

其他实施方式

应当理解，尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面，优点和修改在所附权利要求的范围内。

Claims (24)

1.一种包含多蛋白复合物的组合物，所述组合物包含

含有两个或多个Fc结合结构域的多肽，和两个或多个含Fc的蛋白，其中每个含FC的蛋白都包含一个Fc区，

其中每个含Fc的蛋白结合到含Fc结合结构域的多肽。

2.权利要求1的组合物，其中所述含Fc的蛋白是抗体，

重链抗体，双特异性抗体或Fc融合蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述多蛋白复合物可以结合至溶液或固体表面上的两个或更多个靶分子。

4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述Fc结合结构域是葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域或其任何功能变体，链球菌蛋白G的IgG结合结构域或其任何功能变体，或天然或工程改造的Fc结合蛋白的Fc结合结构域。

5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述两种或更多种Fc结合多肽中的结构域通过接头序列连接。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述Fc结合结构域具有与SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8至少90％相同的序列。或9。

7.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述含Fc的蛋白是特异性结合一种或多种靶的抗体，所述靶选自CD2，CD3，CD7，CD11a，CD19。CD26，CD27，CD28，CD30，CD30L，CD40，CD43，CD44，CD45RA，CD46，CD49d，CD62L，CD69，CD81，CD95，CD196，CD127，CD137，CD226，BTLA，0X40，ICOS，GITR，PD1，PDL1，CTLA4，HLA-DR和KLRG-1。

8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中可以通过共价键或非共价相互作用将两种或更多种多蛋白复合物进一步组装成超复合物。

9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述多蛋白复合物中的两种或更多种含Fc的蛋白是相同的。

10.权利要求9的组合物，其中所述含Fc的蛋白是抗CD3抗体。

11.权利要求9的组合物，其中所述含Fc的蛋白是抗CD28抗体。

12.权利要求9的组合物，其中所述含Fc的蛋白是与T细胞表面抗原(例如，CD2，CD27，CD28，CD46或CD137)特异性结合的抗体。

13.权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述组合物包含多种多蛋白复合物，所述复合物包含两种或更多种不同的含Fc的蛋白。

14.权利要求13的组合物，其中所述组合物包含多种多蛋白复合物，每种多蛋白复合物包含一种或多种抗CD3抗体和一种或多种抗CD28抗体。

15.一种用于调节细胞功能的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1-14中任一项的组合物接触。

16.一种激活或扩增T细胞的方法，该方法包括

使T细胞与包含多蛋白复合物的组合物接触，所述组合物包含两个或多个含Fc结合结构域的多肽，和两个或多个含Fc的蛋白质，其中每个包含一个Fc区，其中每个含Fc的蛋白质结合到前述多肽中的Fc结合结构域。

17.权利要求16的方法，其中所述多蛋白复合物包含抗CD3抗体和抗CD28抗体。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述复合物还包含抗CD2抗体，抗CD27抗体，抗CD28抗体，抗CD46抗体或抗CD137抗体或其组合。

19.一种用于激活或扩增T细胞的方法，所述方法包括

与T细胞接触

第一多蛋白复合物，其包含

含两个或更多个Fc结合结构域的第一多肽，和

两个或多个抗CD3抗体，其中该抗CD3抗体与第一个多肽中的Fc结合域结合，和

第二种多蛋白复合物，包括

第二多肽，其包含两个或更多个Fc结合结构域和两个或更多个抗CD28抗体，其中所述抗CD28抗体结合至

第二多肽中的Fc结合结构域。

20.根据权利要求19所述的方法，所述方法进一步包括

使T细胞与第三种多蛋白复合物接触，该复合物包括

含两个或更多个Fc结合结构域的第三多肽，和

两个或多个含Fc的蛋白，每个蛋白都包含一个Fc区，

其中每个含Fc的蛋白与第三多肽中的Fc结合结构域结合，

其中含Fc的蛋白是抗CD2抗体，抗CD27抗体，抗CD28抗体，抗CD46抗体或抗CD137抗体。

21.权利要求15-20中任一项的方法，其中所述细胞是CD8+细胞或所述细胞是CD8+细胞。

22.一种试剂盒，其包含权利要求1-14中任一项的组合物。

23.一种套件，包括

第一容器，其包含包含包含具有两个或更多个Fc结合结构域的多肽的组合物，和

第二容器，其包含包含第一含Fc蛋白的组合物。

24.根据权利要求22所述的套件，还包括

第三容器，其包含包含第二含Fc的蛋白质的组合物。

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