CN103635490A - 用作治疗剂的可溶性蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病例如过敏性哮喘和炎性肠病的改进的结合蛋白。本发明更具体地涉及包含两个异源二聚体的复合物的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：(i)第一单链多肽，其包含：(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和(ii)第二单链多肽，其包含：(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。本发明还涉及如图1所示的可溶性结合SIRPα的抗体样蛋白。

Description

用作治疗剂的可溶性蛋白
本发明涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病(例如过敏性哮喘和炎性肠病)的可溶解性、多特异性、多价结合蛋白。本发明的可溶性蛋白包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
本发明更具体地涉及对SIRPα具有特异性的可溶性结合蛋白。本发明的一个具体实施方案进一步由图1所示说明。
SIRPα(CD172α)是由包括巨噬细胞、粒细胞和常规树状细胞(DC)的髓系细胞表达以及在神经元细胞上的免疫受体(van den Berg等人,2008,Trends inImmunol.,29(5):203-6)。SIRPα是CD47的低亲和力配体(Rebres等人,2001,J.Biol.Chem.；276(37):34607-16；Hatherley等人,2007；J.Biol.Chem.；282(19):14567-75；Hatherley等人,2008；Mol.Cell；31(2)266-77)，并且SIRPα与CD47的相互作用组成了基于黏附和双向信号传导控制的细胞通讯体系，所述细胞通讯体系调节免疫系统和神经元系统中的多种细胞功能。这些功能包括移行、细胞成熟、巨噬细吞噬噬和髓样树状细胞的细胞因子产生(van den Berg等人,2008Trends in Immunol.29(5):203-6；Sarfati2009,Current Drug Targets,9(10):852-50)。
来自动物模型的数据表明SIRPα/CD47相互作用可以有助于或甚至控制几种病症的发病机理，所述病症包括自身免疫病、炎性疾病(Okuzawa等人,2008,BBRC；371(3):561-6；Tomizawa等人,2007,J.Immunol；179(2):869-877)；局部缺血性疾病(Isenberg等人,2008,Arter.Thromb Vasc.Biol.,28(4):615-21；Isenberg2008,Am.J.Pathol.,173(4):1100-12)或肿瘤学相关疾病(Chan等人,2009,PNAS,106(33):14016-14021；Majeti等人,2009,Cell,138(2):286-99)。调节SIRPα/CD47途径因此可以是用于多种疾病的有希望的治疗性选项。
已经建议使用针对CD47、SIRPα或CD47衍生的结合SIRPα的多肽的抗体作为治疗手段(例如见WO1998/40940、WO2004/108923、WO2007/133811和WO2009/046541)。此外，结合SIRPα的CD47衍生的融合蛋白在疾病(如TNBS-结肠炎(Fortin等人,2009,J Exp Med.,206(9):1995-2011)、朗格汉斯细胞移行(J.Immunol.2004,172:4091-4099)和关节炎(VLST Inc,2008,Exp.Opin.Therap.Pat.,18(5):555-561))的动物模型中是有效的。
此外，提出SIRPα/CD47参与控制吞噬(van den Berg等人,2008,Trends inImmunol.,29(5):203-6)，并且声称通过SIRPα结合多肽进行干涉来增进NOD小鼠系中的人干细胞植入(WO2009/046541)，表明含有CD47胞外结构域(ECD)的治疗剂用于人干细胞移植中的潜在益处。
本发明提供了可溶性结合蛋白，它们包含第一和第二多肽链的异源二聚体，每种链包含与抗体重链或轻链序列融合的结合部分。所述可溶性蛋白可以对抗原、靶或结合配偶体具有单、双、三或四特异性，并且与现有技术的分子相比具有增加的价态。与现有技术的分子相比，本发明的可溶性蛋白具有提供增加数量的针对结合配偶体的特异性和增加的价态。这具有重要的优点，如下文所述。这些可溶性蛋白用作治疗剂。
本发明还提供用作治疗剂的改进的可溶性SIRPα结合蛋白。与现有技术的CD47蛋白融合物相比，如本发明中所定义的结合SIRPα的抗体样蛋白可以提供增加针对靶向的表达SIRPα的细胞的亲合力，同时维持优异的可发展性特征的手段。另外，不受任何理论约束，预期较高的亲合力导致较长的药物动力学半寿期，从而提供增强的治疗功效。这些新的研究结果提供了靶向表达SIRPα的细胞的新治疗工具并且代表治疗性前景，特别地对于多种自身免疫病和炎性疾病、癌症或干细胞移植而言是如此。
因此，在一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
申请人先前已经开发了抗体样分子，称作“Fusobodies”，其中抗体的两条臂的可变区由哺乳动物结合分子的区域，例如SIRPα结合结构域替换，从而提供多价可溶性蛋白。本发明的可溶性蛋白与申请人的Fusobodies相似，因为这些分子也包含抗体序列。但是就本发明的分子而言，抗体序列的VH区和VL区－以及相关价态和抗原特异性－已经保留，这些区域与哺乳动物结合分子的区域融合。本发明的分子因此具有由双价抗体序列提供的一种或多种结合特异性，和由哺乳动物结合分子的4个单价区域提供的其他特异性。为区分本发明的可溶性蛋白与申请人先前开发的那些蛋白，术语“延伸型Fusobody”将在下文中使用。申请人先前开发的分子将继续称作“Fusobodies”或“非延伸型Fusobodies”。
在图1中显示延伸型Fusobody的一个实例，该图也描述了申请人先前开发的Fusobody，以及参照CD47-Fc分子。
与现有技术的分子相比，本发明的可溶性蛋白具有增加的价态。基于每条多肽链的单价以及每对VH和VL区还提供了单价的抗原结合特异性，本发明的异源二聚体优选地具有三价态。本发明的可溶性蛋白因此基于由4条多肽链上的哺乳动物结合分子的区域贡献的四价和由抗体VH区和VL区贡献的二价，具有六价态(六价)。在优选的实施方案中，每一单链多肽是单价的，每一异源二聚体是三价的，并且每一可溶性蛋白(基于两个异源二聚体的复合物)是六价的。通过在每种第一和第二单链多肽中并入单价的结合分子和由每对VH区和VL区提供的单价抗原结合特异性，每个异源二聚体的价态是三价，即，每个异源二聚体可以结合多达三个独立的结合配偶体，或在相同的结合配偶体上结合多达3次。这与其中第一和第二多肽链的异源二聚体的价态是1价(即，同时需要两条链结合这种结合配偶体)的现有技术分子(例如WO01/46261中披露的那些)形成对比至这样的程度：两个异源二聚体的复合物具有2价态。本发明的两个三价异源二聚体的复合物具有六价态，即，该蛋白质可以结合多达六个结合配偶体，或对相同的结合配偶体结合多达六次。本发明的异源二聚体是三价的，并且异源二聚体的复合物具有价态n x3，其中n是该复合物内部所包含的异源二聚体的数目。在优选的实施方案中，该复合物包含两个异源二聚体并且具有6价态。包含多于两个异源二聚体的复合物具有大于6的价态(例如9、12、15或18的价态)。本发明可溶性蛋白的增加的价态导致较高的亲合力，有利地影响半寿期和功效。除了这些作用之外，(与具有较低亲合力的治疗性分子比较)具有高亲合力的治疗性分子的另一个优点是，可以用于例如多达10倍的给药剂量减少。
WO2010/127284中公开了具有与抗体恒定区融合的双可变域的抗体样分子。公开的分子是双特异性的并且具有价态4，这源自该分子的每条臂上的两对VH区和VL区。在本发明的可溶性蛋白或延伸型Fusobody和WO2010/127284中所公开的双可变域分子之间的关键差异之一是在本发明的可溶性蛋白/延伸型Fusobody的每条臂上仅使用一个可变域(即VH和VL)。通过使用哺乳动物结合分子的单价区域－例如细胞表面受体(如CD47)的胞外结构域－而不使用第二可变域，仍可以获得针对第二(或第三抗原)的特异性。使用天然受体结构域的优点之一是与其相关结合配偶体的相互作用是更可预测的、天然的、特异的，并且在治疗情形中，与可能包含免疫原性区域和/或突变以改善特异性、亲和力和亲合力的治疗性抗体或双可变域分子相比，哺乳动物结合分子的结构域不具有预期的免疫原性。与双可变域分子相比，使用与抗体可变域融合的单价哺乳动物结合区的另一个优点是以构象方式紧邻于抗体可变域布置哺乳动物结合分子的区域(并且仍保留所需的结合特异性)的问题远比其中总是要求精确且最佳地使用接头来布置具有不同特异性的两个可变域更简单。因而，采用现有分子实现的多特异性可以用本发明的可溶性蛋白更容易地实现，并且因而所述分子提供增加的价态和其他优点。
在一个方面，本发明提供包含本发明的两个或多个可溶性蛋白的多价可溶性蛋白复合物，其中如果所述蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是Nx6。
因此，在一个方面，本发明提供一种具有至少六价(或至少是六价)的可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性(即是单价的)，并且哺乳动物结合分子的每个区域具有单价，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
在另一个方面，本发明提供可溶性蛋白的复合物，每个可溶性蛋白具有至少六价(或至少是六价的)，包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性(即是单价的)，并且哺乳动物结合分子的每个区域具有单价，从而所述可溶性蛋白的总价态是六，并且其中如果该蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是N x6。
在另一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)修饰的抗体重链序列，其以CH1-CH1-CH2-CH3顺序具有两个CH1区、CH2区和CH3区；和
(b)与第一CH1区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)修饰的抗体轻链序列，其具有两个融合的CL区；和
(d)与第一VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于所述可溶性蛋白的总价态是四。
在这个方面，可溶性蛋白的价态是4，然而，该分子保留延伸型Fusobody样结构，因为VH序列和VL序列分别被替换为CH1和CL序列。
在另一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体包含：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的至少一个单价区域；和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的至少一个单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态至少是六。
在一个优选的方面，可溶性蛋白针对1、2或3种抗原具有结合特异性。该结合特异性源自(i)抗体序列的VH区和VL区的抗原结合特异性，和(ii)哺乳动物结合分子的每个区域的结合特异性。
在一个优选的方面，每个异源二聚体内部的VH和VL区是对相同抗原、优选地对该抗原上的相同表位特异的。
在一个优选的方面，包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是相同的。在一个更优选的方面，包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域是相同的。
因此，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的相同哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
本发明还提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的相同哺乳动物结合分子的相同区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
在一个实施方案中，哺乳动物结合分子的每个区域和每对VH和VL CDR序列对相同的单一抗原具有结合特异性。在一个实施方案中，哺乳动物结合分子的区域可以结合抗原上的第一表位，并且每对VH和VL CDR序列可以结合相同抗原上的第二表位。在另一个实施方案中，哺乳动物结合分子的区域和每对VH和VL CDR序列可以结合相同抗原上的相同表位。
在一个实施方案中，本发明的可溶性蛋白或延伸型Fusobody对两种抗原具有结合特异性，其中哺乳动物结合分子的每个区域对第一抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第二抗原具有结合特异性。在一个具体实施方案中，本发明的SIRPα结合蛋白对SIRPα具有特异性(基于包含于每种多肽序列内部的CD47胞外结合结构域)并且基于VH/VL和相关CDR序列的特异性，对TNFα或环孢菌素A具有特异性。
在另一个实施方案中，包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是不同的。因此，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的第一哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的第二哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于所述第一和第二哺乳动物结合分子对第一和第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对所述第一或所述第二抗原具有特异性，因而可溶性蛋白是双特异性的，具有总价态六。
在一个备选实施方案中，VH区和VL区可以使不同的抗原结合至被哺乳动物结合分子的区域结合的一种或两种抗原。这种延伸型Fusobody是三特异性的，即可以结合三种不同抗原，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三抗原具有结合特异性。因此，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的第一哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的第二哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于所述第一和第二哺乳动物结合分子对第一和第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三种第二抗原具有特异性，因而可溶性蛋白是三特异性的，具有总价态六。
在特定的实施方案中，VH和VL CDR序列对TNFα、环孢菌素A或衍生自它们的表位具有结合特异性。
在一个优选的实施方案中，哺乳动物结合分子的区域与抗体序列的N端部分(即，与VH恒定区和VL恒定区)融合。因而，哺乳动物结合分子的区域的C端与抗体序列的N端融合。在一些实施方案中，这些序列直接连接，在一些实施方案中，可以使用接头序列。
在一个实施方案中，结合分子是细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、低分子量化合物(药物)、配体或细胞表面受体。优选地，该结合分子是哺乳动物单体的或同型聚合的细胞表面受体。结合分子的区域可以是完整分子或其可以保留该结合分子的生物活性的部分或片段。结合分子的区域可以是胞外区域或结构域。在一个实施方案中，所述哺乳动物单体的或同型聚合的细胞表面受体包含免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，例如它包含SIRPα结合结构域，所述SIRPα结合结构域可以是CD47的胞外结构域。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的可溶性SIRPα结合蛋白或结合SIRPα的延伸型Fusobody，其包含两个三价异源二聚体的六价复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含在抗体的VH区的N端部分处融合的第一SIRPα结合结构域；和，
(ii)第二单链多肽，其包含在抗体的VL区的N端部分处融合的第二SIRPα结合结构域。
在一个优选实施方案中，CH1区、CH2区和CH3区可以衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4相应区域的野生型或突变变体，其具有沉默的效应子功能和/或减少的细胞杀伤性ADCC或CDC效应子功能，例如减少的ADCC效应子功能。
在一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPα的延伸型Fusobody以0.05[1/s]或更小的koff(kd1)从结合的人SIRPα解离，如采用双价动力学拟合模型，通过表面等离子体共振如BiaCORE测定法所测量。
在另一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPα的Fusobody抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。
例如，所述可溶性蛋白或结合SIRPα的Fusobody以2nM或更小、1nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小例如在10pM和2nM、或20pM和1nM、或30pM和0.2nM之间的IC50抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放，如树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
在另一个相关的实施方案中，每个异源二聚体的所述第一和第二单链多肽由二硫键共价地结合，例如使用相应CH1和CL区的半胱氨酸残基之间的天然二硫键。
在一个实施方案中，所述哺乳动物结合分子的每个区域在肽接头不存在下与其相应的VH序列或VL序列融合。在另一个实施方案中，所述哺乳动物结合分子的每个区域通过肽接头与其相应的VH序列或VL序列融合。肽接头可以包含5至20个氨基酸，例如，它可以是甘氨酸和丝氨酸氨基酸的聚合物、优选地是(GGGGS)n，其中是1和4之间的任何整数，优选地是2。
在一个优选实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPα的延伸型Fusobody基本上由两个异源二聚体组成，其中每个异源二聚体的所述第一单链多肽包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且这两个异源二聚体彼此通过在它们铰链区处的半胱氨酸之间的二硫键稳定缔合。
在一个实施方案中，本发明的可溶性蛋白包含选自以下的至少一个SIRPα结合结构域：
(i)人细胞表面受体CD47的胞外结构域；
(ii)衍生自SEQ ID NO:2的胞外结构域；
(iii)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:57多肽或其保留SIRPα结合特性的片段；和，
(iv)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:57的或所述片段的变体多肽，所述变体多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPα结合特性。
在一个优选实施方案中，CD47的胞外结构域的区域是SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:57。
在一个具体的实施方案中，包含于所述第一和第二单链多肽内部的两个或多个SIRPα结合结构域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分数。在一个具体实施方案中，两个或多个SIRPα结合结构域具有相同的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，在结合SIRPα的延伸型Fusobody内部的全部SIRPα结合结构域具有相同的氨基酸序列。例如，全部SIRP结合结构域由SEQID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:57组成。
在一个具体实施方案中，本发明的所述可溶性蛋白或结合SIRPα的延伸型Fusobody包含两个异源二聚体，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)SEQ ID NO:20的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:21的第二单条轻链多肽；
(ii)SEQ ID NO:22的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:23的第二单条轻链多肽；或
(iii)SEQ ID NO:40的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:41的第二单条轻链多肽。
与抗体的重链和轻链相似，所述第一和第二单链多肽至少经一个二硫键稳定缔合。
在一个相关的实施方案中，可溶性蛋白或结合SIRPα的Fusobody包含两个异源二聚体，其中每个异源二聚体的第一和第二单链多肽分别与(i)SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21、(ii)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或(iii)SEQ IDNO:40和SEQ ID NO:41的相应第一和第二单链多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性。优选地，这些分子保留如上文所述的结合SIRPα的延伸型Fusobody的有利功能特征。
在一个具体实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody的四个SIRPα结合结构域是在序列上相同的。
本发明还涉及包含两个或多个延伸型Fusobody或结合SIRPα的延伸型Fusobody的这类多价可溶性蛋白复合物，其中如果该蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是Nx6。
本发明还涉及用作药物或诊断工具，例如用于自身免疫病以及急性和慢性炎性病症的治疗或诊断中的此类可溶性蛋白或延伸型Fusobody、特别地是SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody。具体而言，SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody是用于治疗选自Th2介导的气道炎症、过敏性病症、哮喘、炎性肠病和关节炎的病症。
本发明的可溶性蛋白或Fusobody也可以在有需求的受试者中用于治疗或诊断局部缺血性病症、白血病或其他癌症或用于增加造血干细胞植入。
定义
为了可以更轻易地理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在详细描述中给出。
术语SIRPα指显示与CD47(整联蛋白缔合蛋白)黏附的人信号调节蛋白α(也称为CD172α或SHPS-1)。人SIRPα包括SEQ ID NO:1，但是还包括但不限于任何天然多态性变体，例如，包括人SIRPα的单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。表1中描述了人类中在SIRPα核苷酸序列中发现的剪接变体或SNP的实例。
表1：SIRPα蛋白的变体
Figure BDA0000438719970000131
术语CD47涉及整联蛋白缔合蛋白，一种参与细胞粘附于胞外基质时出现的胞内钙浓度增加的哺乳动物膜蛋白。人CD47包括SEQ ID NO:2，还包括但不限于任何天然多态性变体，例如，包括人CD47的单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。表2中描述了人类中在CD47核苷酸序列中发现的剪接变体或SNP的实例。
表2：CD47蛋白的变体
Figure BDA0000438719970000141
如本文所用，术语“蛋白质”指由在一条或多条线性链中排列的氨基酸组成并折叠成球状形式的任何有机化合物。聚合物链中的氨基酸由相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起。术语“蛋白质”还包括但不限于肽、单链多肽或主要由两条或多条氨基酸链组成的任何复杂分子。它还包括但不限于糖蛋白或其他已知的翻译后修饰形式。它还包括天然蛋白的已知天然或人工化学修饰形式，例如但不限于，糖工程化、PEG化、羟基化(hesylation)等、非天然氨基酸的掺入和用于与另一个分子化学缀合的氨基酸修饰。
如本文所用，“复合物蛋白”指由至少两个单链多肽组成的蛋白质，其中所述至少两个单链多肽在适宜的条件下经非共价结合作用或共价结合作用例如通过二硫键缔合在一起。“异源二聚蛋白”指由形成一种复合物蛋白的两个单链多肽组成的蛋白质，其中所述两个单链多肽具有不同的氨基酸序列，特别地，它们的氨基酸序列彼此之间共有不多于90、80、70、60或50%的同一性。相反，“同型二聚蛋白”指由形成一种复合物蛋白的两个相同或基本上相同多肽组成的蛋白质，其中所述两个单链多肽共有100%同一性或至少99%或至少95%同一性，氨基酸差异由与同型二聚体的另一个多肽相比不影响这个多肽的功能特征及物理特征的氨基酸置换、添加或缺失(例如保守的氨基酸置换)组成。
如本文所用，当一种蛋白质缺少任何跨膜结构域或使这种多肽锚定或整合入表达该多肽的细胞的膜中的蛋白质结构域时，它是“可溶的”。具体而言，本发明的可溶性蛋白可以同样地不含CD47的跨膜结构域和胞内结构域。如本文所用，术语“抗体”指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白质。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定域包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其其间插有更保守的区域，名为构架区(FR)。每个VH和VL包含从氨基端至羧基端按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的3个CDR和4个FR。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))结合。
术语“互补决定区”和“CDR”指在抗体可变区内部赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。通常而言，在每个重链可变区中存在三种CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且在每个轻链可变区中存在三种CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
给定的CDR的氨基酸序列界限可以通过许多方法确定，所述方法包括由Kabat等人,(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)”，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等人,(1997)JMB273，927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些。短语“恒定区”指赋予效应子功能的抗体分子部分。
如本文本中所用，术语“Fusobody”(或“非延伸型Fusobody”)指包含(例如经一个或多个二硫键)稳定缔合在一起的两个异源二聚体的抗体样可溶性蛋白，每个异源二聚体由一条氨基酸重链和一条氨基酸轻链组成。每条重链或轻链包含抗体的恒定区，下文分别称作Fusobody的重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区至少包含抗体的CH1区并且还可以包含CH2和CH3区，包括铰链区。轻链恒定区包含抗体的CL区。在Fusobody中，抗体的可变区由哺乳动物结合分子的区域替换，这些区域是异源可溶性结合结构域。术语“异源的”意指这些结构域不天然地发现与抗体的恒定区缔合。具体而言，此类异源结合结构域没有由4个构架区FR1、FR2、FR3和FR4和其间3个互补决定区(CDR)组成的抗体可变域的典型结构。Fusobody的每条臂因此包含第一单链多肽，其包含在抗体的恒定CH1重链区的N端部分处共价连接的第一结合结构域；和第二单链多肽，其包含在抗体的恒定CL轻链区的N端部分处共价连接的第二结合结构域。这个共价键合可以是直接键合，例如经肽键(peptidic bound)，或是间接键合，经接头，例如肽接头。Fusobody的两个异源二聚体是例如由至少一个二硫键在它们的铰链区处共价连接的，类似于抗体结构。
“延伸型Fusobody”指包含(例如经一个或多个二硫键)稳定缔合在一起的两个异源二聚体的抗体样可溶性蛋白，每个异源二聚体由一条氨基酸重链和一条氨基酸轻链组成。每条重链或轻链包含抗体的恒定区和可变区，下文分别称作延伸型Fusobody的重链区和轻链区。在重链内部，恒定区包含抗体的CH1区、CH2区和CH3区，包括铰链区。与抗体结构类似，抗体的CH2和CH3区称作延伸型Fusobody的Fc部分或Fc半分子。下文中进一步描述延伸型Fusobody的Fc部分的详述。在轻链内部，轻链恒定区包含抗体的CL区。与VH区和VL区融合的是哺乳动物结合分子的区域，这些区域是异源可溶性结合结构域。术语“异源”意指这些结构域不天然与抗体的可变区或恒定区缔合存在并且不具有由4个构架区FR1、FR2、FR3和FR4和在其间的3个CDR组成的抗体可变域的典型结构。延伸型Fusobody的每条臂因此包含第一单链多肽，其包含在抗体重链的VH区的N端部分处共价连接的第一结合结构域；和第二单链多肽，其包含在抗体轻链的VL区的N端部分处共价连接的第二结合结构域。这个共价键合可以是直接键合，例如经肽键，或是间接键合，经接头，例如肽接头。延伸型Fusobody的两个异源二聚体是例如由至少一个二硫键在它们的铰链区处共价连接的，类似于抗体结构。如先前所描述，延伸型Fusobody具有由其VH区和VL区提供的针对抗原的特异性和由与抗体重链序列和轻链序列融合的异源可溶性结合结构域提供的其他特异性。
如本文所用，术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链和本发明的可溶性蛋白及延伸型Fusobody的C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。人IgG重链Fc区通常定义为包含IgG抗体的从位置C226或从P230至羧基端的氨基酸残基。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引。可以移除Fc区的C端赖氨酸(残基K447)，例如，在抗体的产生或纯化期间。
术语抗体的“价态”指单个抗体分子可以结合的抗原决定簇的数目。全部抗体的价态至少是2并且在一些情况下更大。
术语“亲合力”用来描述蛋白质之间多个键相互作用的联合强度。亲合力区别于描述单键强度的亲和力。就这一点而论，亲合力是键亲和力的联合协同强度(功能性亲和力)，而非键的总和。采用本发明的延伸型Fusobody，哺乳动物结合分子的区域和来自VH/VL对的抗原结合位点同时与它们相应的结合配偶体相互作用。尽管可以轻易地破坏每个单一结合性相互作用(取决于相对亲和力)，但是因为许多结合性相互作用同时存在，所以单个位点的短暂不结合不导致分子散开，并且这个位点的结合可能恢复原状。总体效应是抗原与抗体协同地强烈结合(例如IgM据称具有低亲和力但具有高亲合力，因为与IgG、IgE和IgD的2个强结合位点相比，它具有10个弱结合位点)。图1是与参照CD47-Fc分子相比，Fusobody和延伸型Fusobody分子的示意图。已经在本领域中描述了具有Fusobody样结构的分子的实例，特别地，描述了包含异源二聚受体的配体结合区的分子，其中需要每个异源二聚体的两条链来结合每种配体，即每个异源二聚体具有价态1，并且对于由两个异源二聚体组成的蛋白质，具有总价态2(见例如WO01/46261)。
在一个优选的实施方案中，哺乳动物单体的或同聚的细胞表面受体的胞外结构域或这种胞外结构域的保留配体结合活性的变体或区域与抗体的重链可变区和轻链可变区融合。所得到的延伸型Fusobody分子是保留了用作治疗性分子的抗体分子的有利性能的多价蛋白质。
如本文所用的术语“哺乳动物结合分子”是可以与靶分子、细胞、复合物和/或组织结合的任何分子或其部分或片段，并且其包括蛋白质、核酸、糖、脂类、低分子量化合物及其片段，每一者具有与选自以下的一个或多个成员结合的能力：可溶性蛋白、细胞表面蛋白、细胞表面受体蛋白、胞内蛋白、糖、核酸、激素或低分子量化合物(小分子药物)或其片段。哺乳动物结合分子可以是蛋白质、细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、配体、受体或其片段。在优选的实施方案中，哺乳动物结合分子是属于免疫球蛋白超家族的天然或突变蛋白；能够与其天然受体结合的天然激素或变体；能够与互补序列和/或可溶性细胞表面或胞内核酸/多核苷酸结合蛋白结合的核酸或多核苷酸序列；能够与其他糖结合部分和/或可溶性细胞表面或胞内蛋白结合的糖结合部分；与可溶性或细胞表面或胞内靶蛋白结合的低分子量化合物(药物)。
术语“IgSF结构域”指含有免疫球蛋白超家族结构域的蛋白质，它们包含通过介导细胞的结合、识别或黏附过程而参与免疫系统的庞大种类的细胞表面蛋白和可溶性蛋白。IgSF结构域分子的免疫球蛋白结构域与免疫球蛋白共有结构相似性。IgSF结构域含有约70-110个氨基酸并且根据它们的大小和功能分类。Ig结构域拥有特征性Ig折叠，这种Ig折叠具有由反平行β链的两个片层形成的夹心样结构。Ig折叠由半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键以及该夹心内侧面上的疏水性氨基酸之间的相互作用稳定。这个Ig结构域的一个末端具有称作互补决定区的节段，所述节段对于IgSF结构域的特异性是重要的。大部分Ig结构域是可变的(IgV)或恒定的(IgC)。显示一个或多个IgSF结构域的蛋白质的实例是细胞表面共刺激分子(CD28、CD80、CD86)、抗原受体(TCR/BCR)、共受体(CD3/CD4/CD8)。其他实例是参与细胞黏附的分子(ICAM-1、VCAM-1)或具有形成细胞因子结合受体(IL1R、IL6R)的IgSF结构域的分子以及胞内肌蛋白。在许多实例中，存在多个紧邻细胞环境的IgSF结构域是由含有这种IgSF结构域的所述细胞表面受体触发的信号传导的功效的要求。一个突出实例是含有IgSF结构域的分子(CD28、ICAM-1、CD80和CD86)在免疫突触中簇集，这种簇集产生允许抗原呈递细胞最佳呈递抗原以及导致T细胞受控活化的微环境(Dustin,2009,Immunity)。需要簇集以正确发挥功能的含有IgSF的其他分子的其他实例是CD2(Li等人,1996,J.Mol.Biol.,263(2):209-26)和ICAM-1(Jun等人,(2000,J.Biol.Chem.；276(31):29019-27)。
因此，通过模拟含有IgSF结构域的寡价(oligovalent)结构，包含几个IgSF结构域的本发明延伸型Fusobody可以有利地用于调节其相应结合配偶体的活性。
如本文所用，术语“SIRPγ”指CD172g。人SIRPγ包括SEQ ID NO:115，还包括但不限于任何天然多态性变体，例如，包含人SIRPγ的单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。表3中描述了人类中在SIRPγ核苷酸序列中发现的剪接变体或SNP的实例。
表3：SIRPγ蛋白的变体
Figure BDA0000438719970000181
Figure BDA0000438719970000191
如本文所用的术语“双价动力学拟合模型”指描述双价分析物与单价配体结合的模型，如Baumann等人,(1998,J.Immunol.Methods,221(1-2):95-106)中所述，所述文献的内容通过引用方式并入作为参考。在这个模型中，生成两组速率常数，每个结合步骤具有一个速率常数ka1、ka2、kd1和kd2。如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”意指特定蛋白质-蛋白质相互作用的结合速率常数，而如本文所用，术语“Kdis”或“Kd”意指特定蛋白质-蛋白质相互作用的解离速率常数。术语“koff”作为Kdis或kd1或解离速率常数的同义词使用。如本文所用，术语“KD”意指解离常数，它从Kd对Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并且对于KD1，表示为摩尔浓度(M)，以及对KD2，表示为共振单位(RU)。KD2(RU)可以换算成摩尔浓度(M)，如Baumann等人所述。蛋白质-蛋白质相互作用的KD值可以使用本领域充分建立的方法确定。例如，一种用于确定蛋白质/蛋白质相互作用的KD(或KD1或KD2)的方法是使用表面等离子体共振法或使用生物传感器系统如BiaCORE系统。在下文实施例中描述至少一种用于确定与SIRPa相互作用的本发明蛋白质的KD值的测定法。
如本文所用，术语“亲和力”指多肽和其靶之间在单个位点处相互作用的强度。在每个位点内部，多肽的结合区通过弱的非共价力与其靶在众多位点处相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用，术语结合性多肽或蛋白质的“高亲和力”指多肽或蛋白质对其靶具有1μM或更小的KD。
在一个实施方案中，本发明的可溶性蛋白抑制免疫复合物刺激的细胞因子(例如，IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-23、IL-8和/或TNF-α)从用金黄色葡萄球菌Cowan1(Pansorbin)或可溶性CD40L和IFN-γ刺激的外周血单核细胞、常规树状细胞(DC)和/或单核细胞衍生的DC中释放。免疫复合物刺激的树状细胞释放细胞因子测定法的实例是在下文实施例中以更多细节描述的体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。在一个优选的实施方案中，抑制免疫复合物刺激的细胞释放细胞因子的蛋白质是这样的蛋白质，它以2nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小例如在2nM和20pM之间或1nM和10pM之间的IC50抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放，如树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
如本文所用，除非另外更具体地定义，否则与功能测定法相关时，术语“抑制”指与阴性对照相比时，所测定的功能的任何统计学上显著的抑制。
在实施例中以进一步的细节描述了评价本发明可溶性蛋白或延伸型Fusobody对SIRPα的功能特征的影响的测定法。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。
术语“非人动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人的灵长类、绵羊、犬、猫、马、奶牛、鸡、两栖类、爬行类等。
如本文所用，术语“优化的”意指核苷酸序列已经受到改变以使用在生产性细胞或生物即真核细胞例如毕赤酵母属(Pichia)或酵母属(Saccharomyces)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞或原核细胞例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中为优选的密码子编码氨基酸序列。
优化的核苷酸序列经工程化以完全或尽可能保留由起始核苷酸序列最初编码的起始氨基酸序列，也称作“亲本”序列。本文中的优化序列已经工程化以具有在生产性细胞或生物例如哺乳动物细胞中为优选的密码子，然而本文还构思了这些序列在其他原核或真核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称作优化的。
如本文所用，“SIRPα结合结构域”指对于在适宜条件下对与SIRPα结合而言为必需的任何单链多肽结构域。SIRPα结合结构域包含直接参与同SIRPα物理相互作用的全部氨基酸残基。它还可以包含不直接与SIRPα相互作用但对于SIRPα结合结构域与SIRPα相互作用的正确构象而言是需要的他氨基酸。SIRPα结合结构域可以与异源结构域融合，而没有显著改变它们对SIRPα的结合特性。SIRPα结合结构域可以在已知与SIRPα结合的蛋白质(如CD47蛋白)的结合结构域当中选择。SIRPα结合结构域还可以由针对SIRPα的人工结合物组成。具体而言，衍生自单链免疫球蛋白支架的结合物如单结构域抗体、单链抗体(scFv)或骆驼科(camelid)抗体。在一个实施方案中，术语“SIRPα结合结构域”不含有衍生自如与SIRPα结合的抗体的可变区如VH区和VL区中的SIRPα抗原结合区。
本发明的多个方面在以下子部分进一步详细描述。
本发明的延伸型Fusobody的优选实施方案是可溶性SIRPα结合蛋白，其复合物和衍生物，它们全部包含如此后描述的SIRPα结合结构域。为易于理解，包含SIRPα结合结构域的延伸型Fusobody、其复合物和衍生物称作本发明的SIRPα结合蛋白。
在一个优选的实施方案中，SIRPα结合结构域选自：
(i)人CD47的胞外结构域；
(ii)SEQ ID NO:4的多肽或保留SIRPα结合特性的SEQ ID NO:4的片段；
(iii)SEQ ID NO:4的变体多肽，其与SEQ ID NO:4具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPα结合特性；
(ii)SEQ ID NO:3的多肽或保留SIRPα结合特性的SEQ ID NO:3的片段；
(iii)SEQ ID NO:3的变体多肽，其与SEQ ID NO:3具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPα结合特性；
(ii)SEQ ID NO:57的多肽或保留SIRPα结合特性的SEQ ID NO:57的片段；和
(iii)SEQ ID NO:57的变体多肽，其与SEQ ID NO:57具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPα结合特性。
本发明的SIRPα结合蛋白应当保留与SIRPα结合的能力。CD47的结合结构域已经充分表征并且人CD47的一个胞外结构域是SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:3的多肽。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:3的多肽的片段可以因此在包含CD47的SIRPα结合结构域的那些片段当中选出。那些片段通常不包含CD47的跨膜结构域和胞内结构域。在非限制性的说明性实施方案中，SIRPα结合结构域基本上由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:57组成。片段包括但不限于其中已经从SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5的C端或N端截去1个至10个之间氨基酸的较短多肽(例如SEQ ID NO:57)。SIRPα结合结构域还包括但不限于SEQ ID NO:4、SEQID NO:57或SEQ ID NO:3的变体多肽，其中氨基酸残基已经通过氨基酸缺失、插入或置换被突变，仍分别与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:3具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%同一性；只要对天然序列的改变基本上不影响SIRPα结合蛋白的生物学活性，特别地不影响它对SIRPα的结合特性即可。在一些实施方案中，它包括其中与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:3相比时，不多于1、2、3、4或5个氨基酸已经在SIRPα结合结构域中因氨基酸缺失或置换被突变的突变氨基酸序列。突变氨基酸序列的实例是衍生自单核苷酸多态性的那些序列(见表2)。
如本文所用，考虑到需要为最佳比对这两个序列而导入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的函数(即，％同一性=相同位置数#/位置总数#x100)。可以使用如下文描述的数学算法，完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。
两个氨基酸序列之间的同一性百分数可以使用已经集成至ALIGN程序中的E.Myers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)算法确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分数可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443-453,1970)算法来确定。然而，确定同一性百分数的另一个程序是CLUSTAL(M.Larkin等人,Bioinformatics23:2947-2948,2007；由D.Higgins和P.Sharp,Gene73:237-244,1988首先描述)，该程序是作为独立程序或通过网络服务器(见http://www.clustal.org/)可获得的。
在一个具体实施方案中，SIRPα结合结构域包括对SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:3的改变，其中对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:57或SEQID NO:3的所述改变基本上由保守的氨基酸置换组成。
保守的氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:3的SIRPα结合结构域内部的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的结合测定法或功能测定法对新多肽变体测试保留的功能。
在另一个实施方案中，SIRPα结合结构域在与非人灵长类(如食蟹猴或猕猴)SIRPα交叉反应的那些当中选出。
在另一个实施方案中，SIRPα结合结构域在不与同SIRPα密切相关的人蛋白质如SIRPγ交叉反应的那些当中选出。
在一些实施方案中，SIRPα结合结构域在那些结合结构域当中选出，这些结合结构域保留了包含这种SIRPα结合结构域的SIRPα结合蛋白抑制CD47-Fc融合物与SIRPα+U937细胞结合的能力，至少到与包含SEQ ID NO:4或SEQID NO:3的人SIRPα的胞外结构域的SIRPα结合蛋白的相同程度，如基于平板的细胞黏附测定法中所测量。
在其他实施方案中，SIRPα结合结构域在那些结合结构域当中选出，这些结合结构域保留了包含这种SIRPα结合结构域的SIRPα结合蛋白抑制体外分化的髓样树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放的能力，至少到与包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3的人SIRPα的胞外结构域的SIRPα结合蛋白的相同程度，如树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
SIRPα结合结构域可以符合可读框方式与VH区或VL区直接融合或经多肽接头(间隔区)融合。这种间隔区可以是单个氨基酸(如，例如，一个甘氨酸残基)或5-100个之间的氨基酸，例如5-20个之间的氨基酸。这种接头应当允许SIRPα结合结构域采取正确的空间方向以形成与SIRPα的结合位点。合适的多肽接头可以在采取柔性构象的那些多肽接头当中选出。此类接头的实例是(但不限于)包含甘氨酸和丝氨酸残基的那些接头，例如(Gly4Ser)n，其中n是1-12之间(例如1和4之间)的整数，例如2。
本发明的SIRPα结合蛋白可以缀合或融合在一起以形成多价蛋白质。
技术人员可以进一步有利地使用为工程化抗体分子所开发的背景技术以增加该分子的价态或为它们的特定用途而改善或修改工程化分子的特性。
在另一个实施方案中，本发明的SIRPα结合蛋白可以与另一个异源蛋白融合，所述异源蛋白能够增加所得到的融合蛋白在血液中的半寿期。
这种异源蛋白可以是例如免疫球蛋白、血清白蛋白和其片段。这种异源蛋白也可以是多肽，其能够与血清白蛋白结合以增加所得到的分子在受试者中施用时的半寿期。这种方法例如在EP0486525中描述。
备选地或额外地，本发明的可溶性蛋白还包含用于多聚化的结构域。
结合SIRPα的延伸型Fusobody
在一个方面，本发明涉及包含至少一个SIRPα结合结构域的延伸型Fusobody。延伸型Fusobody的两个异源二聚体可以含有具有不同结合特异性的不同结合结构域，从而产生双特异性或三特异性Fusobody。例如，Fusobody可以包含一个含有SIRPα结合结构域的异源二聚体和另一个含有另一个异源结合结构域的异源二聚体。备选地，Fusobody的两个异源二聚体均包含SIRPα结合结构域。在后者情况下，这类SIRPα结合结构域的结构或氨基酸序列可以是相同或不同的。在一个优选实施方案中，Fusobody的两个异源二聚体均包含相同的SIRPα结合结构域。
本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody的具体实例
本发明的Fusobody包括但不限于如实施例中表4在结构上表征的Fusobody。在这些实施例中使用的SIRPα结合结构域在SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中显示。本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody的重链氨基酸序列的具体实例是选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:40的多肽序列。本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody的轻链氨基酸序列的具体实例是选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:41的多肽序列。
本发明的其他结合SIRPα的延伸型Fusobody包含这样的SIRPα结合结构域，所述结构域已经通过氨基酸缺失、插入或置换被突变，仍与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的任一个相应SIRPα结合结构域具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99同一性百分数。在一些实施方案中，本发明的Fusobody包含这样的SIRPα结合结构域，所述结构域包括突变氨基酸序列，其中与如SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的任一序列中所述的SIRPα结合结构域相比时，已经通过氨基酸缺失或置换在SIRPα结合结构域中改变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
在一个实施方案中，如实例#4中所述，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody包含SEQ ID NO:18的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:19的第二单条轻链多肽。
在一个实施方案中，如实例#5中所述，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody包含SEQ ID NO:20的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:21的第二单条轻链多肽。
在一个实施方案中，如实例#6中所述，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody包含SEQ ID NO:22的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:23的第二单条轻链多肽。
在一个实施方案中，如实例#7中所述，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody包含SEQ ID NO:40的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:41的第二单条轻链多肽。
在一个实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody包含与上文实例#4、#5、#6或#7的至少一个相应重链多肽和或轻链多肽具有至少95%序列同一性的重链多肽和/或轻链多肽。
在另一个方面，如实例#4中所述，本发明提供了本发明的分离的延伸型Fusobody，其具有：由SEQ ID NO:75的核苷酸序列编码的第一单条重链多肽；和由SEQ ID NO:76的核苷酸序列编码的第二单条轻链多肽。
在另一个方面，如实例#5中所述，本发明提供了本发明的分离的延伸型Fusobody，其具有：由SEQ ID NO:77的核苷酸序列编码的第一单条重链多肽；和由SEQ ID NO:78的核苷酸序列编码的第二单条轻链多肽。
在另一个方面，如实例#6中所述，本发明提供了本发明的分离的延伸型Fusobody，其具有：由SEQ ID NO:79的核苷酸序列编码的第一单条重链多肽；和由SEQ ID NO:80的核苷酸序列编码的第二单条轻链多肽。
在另一个方面，如实例#7中所述，本发明提供了本发明的分离的延伸型Fusobody，其具有：(iii)由SEQ ID NO:97的核苷酸序列编码的第一单条重链多肽；和由SEQ ID NO:98的核苷酸序列编码的第二单条轻链多肽。
本发明的其他结合SIRPα的延伸型Fusobody包含由核苷酸序列编码的重链，所述核苷酸序列已经通过核苷酸缺失、插入或置换被突变，但仍与SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:97具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明的延伸型Fusobody包含由核苷酸序列编码的重链，所述核苷酸序列包括突变核苷酸序列，其中与SEQID NO:77、或SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:97相比时，已经通过核苷酸缺失、插入或置换而改变了不多于1、2、3、4或5个核苷酸。本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody包含由核苷酸序列编码的轻链，所述核苷酸序列已经通过核苷酸缺失、插入或置换被突变，但仍与SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80或SEQID NO:98具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明的延伸型Fusobody包含由核苷酸序列编码的轻链，所述核苷酸序列包括突变核苷酸序列，其中与SEQ ID NO:78、或SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:98相比时，已经通过核苷酸缺失、插入或置换而改变了不多于1、2、3、4或5个核苷酸。
在优选的实施方案中，本发明提供本发明的分离的延伸型Fusobody，其中(a)VH区包含选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的一个或多个CDR，和/或VL区包含选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33的一个或多个CDR，或(b)VH区包含选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的一个或多个CDR：和/或VL区包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的一个或多个CDR，或(c)VH区和/或VL区包含与如(a)或(b)中所述的相应CDR序列共有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％序列同一性的一个或多个CDR。
在优选的实施方案中，本发明的延伸型Fusobody包含(a)选自SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:44的VH多肽序列，和/或(b)选自SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:48的VL多肽序列，和/或(c)与如上文(a)或(b)中所述的至少一个相应VH序列或VL序列具有至少95％序列同一性的VH或VL多肽序列。
在一个优选的方面，本发明还提供延伸型Fusobody，所述延伸型Fusobody交叉阻断至少一种如先前所描述的可溶性蛋白或延伸型Fusobody或被至少一种如先前所描述的可溶性蛋白或延伸型Fusobody交叉阻断，或与如先前所描述的可溶性蛋白或延伸型Fusobody竞争与相同表位的结合。
功能性Fusobody
在又一个实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody具有重链和轻链氨基酸序列；重链和轻链核苷酸序列；或与重链和轻链恒定区融合的SIRPα结合结构域，它们与以上段落中所描述的结合SIRPα的特定Fusobody、特别地如表4中所述的实例#4、#5、#6和#7的相应氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述延伸型Fusobody基本上保留以上段落中所描述的结合SIRPα的特定Fusobody、特别地如表4中所述的实例#4-7中至少一个Fusobody的相同的功能特征。
例如，本发明提供分离的延伸型Fusobody，其包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，其中所述重链具有与选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQID NO:40的氨基酸序列至少80%、至少90%、至少95%或至少99%同一的氨基酸序列；所述轻链具有与选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:41的氨基酸序列至少80%、至少90%、至少95%或至少99%同一的氨基酸序列；所述延伸型Fusobody与SIRPα和与TNFα或环孢菌素A特异性结合，并且所述延伸型Fusobody抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。
如本文中所用，“与SIRPα特异性结合”的延伸型Fusobody意指在实施例中描述的至少一个结合亲和力测定法(例如在BiaCORE测定法中通过表面等离子体共振法)中以0.05[1/s]或更小的koff(kd1)与SEQ ID NO:1的人SIRPα多肽结合的Fusobody。“与不为SIRPα的多肽交叉反应”的延伸型Fusobody意指以0.05[1/s]或更小的koff(kd1)与其他多肽结合的Fusobody。“不与特定多肽交叉反应”的延伸型Fusobody意指以下述koff(kd1)与这种多肽结合的Fusobody，其中所述koff(kd1)比相似条件下度量所述延伸型Fusobody与人SIRPα的结合亲和力的koff(kd1)高至少10倍、优选地高至少百倍。在某些实施方案中，不与其他多肽交叉反应的此类Fusobody在标准结合测定法中针对这些蛋白质显示出基本上检测不到的结合作用。
在多个实施方案中，所述Fusobody可以显示出上文讨论的功能特征中的一种或多种或者全部。
在其他实施方案中，SIRPα结合结构域可以与以上涉及“SIRPα结合结构域”的段落中所述的SIRPα结合结构域的特定序列(包括但不限于SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:57的多肽或其保留SIRPα结合特性的片段)中的至少一个序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一。在其他实施方案中，SIRPα结合结构域可以与以上涉及“SIRPα结合结构域”的段落中所述的SIRPα结合结构域的特定序列(包括但不限于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:57的多肽或其保留SIRPα结合特性的片段)中的至少一个序列同一，除了在所述特定序列中不多于1、2、3、4或5个氨基酸位置处的氨基酸置换之外。
具有与具体描述的SIRPα结合结构域具备高(即，至少80%、90%、95%、99%或更大)同一性的SIRPα结合结构域的延伸型Fusobody可以通过以下方式获得：诱变(例如，位点定向或PCR介导的诱变)分别编码所述特定SIRPα结合结构域的核酸分子，随后使用本文所述的功能测定法对编码的经改变的延伸型Fusobody检测保留的功能(即，上文所述的功能)。
在其他实施方案中，重链和轻链氨基酸序列可以与上文所述的特定Fusobody实例#4-7的重链和轻链50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一，同时保留上述的结合SIRPα的延伸型Fusobody的功能特征中的至少一个功能特性。具有与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQID NO:40中任一者的相应重链和SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:41中任一者的相应轻链具备高(即，至少80%、90%、95%或更大)同一性的结合SIRPα的延伸型Fusobody可以通过以下方式获得：诱变(例如，位点定向或PCR介导的诱变)分别编码重链SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79和SEQ IDNO:97以及轻链SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:98的核酸分子，随后使用本文所述的功能测定法对所编码的经改变的结合SIRPα的Fusobody检测保留的功能(即，上文所述的功能)。
在一个实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody是实例#4的变体，其具有与SEQ ID NO:18至少80%、90%、95%或99%同一的重链和与SEQ ID NO:19至少80%、90%、95%或99%同一的轻链，该延伸型Fusobody与SIRPα特异性结合，并且该延伸型Fusobody抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中由多种细菌性衍生物如金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子等所激发的促炎细胞因子释放。
在一个实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody是实例#5的变体，其具有与SEQ ID NO:20至少80%、90%、95%或99%同一的重链和与SEQ ID NO:21至少80%、90%、95%或99%同一的轻链，该延伸型Fusobody与SIRPα特异性结合，并且该延伸型Fusobody体显示出至少一种以下功能特征：(i)它抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中由多种细菌性衍生物如金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子等所激发的促炎细胞因子释放，并且(ii)它具有针对TNFα的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody是实例#6的变体，其具有与SEQ ID NO:22至少80%、90%、95%或99%同一的重链和与SEQ ID NO:23至少80%、90%、95%或99%同一的轻链，该延伸型Fusobody与SIRPα特异性结合，并且该延伸型Fusobody体显示出至少一种以下功能特征：(i)它抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中由多种细菌性衍生物如金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子等所激发的促炎细胞因子释放，并且(ii)它具有针对TNFα的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody是实例#7的变体，其具有与SEQ ID NO:40至少80%、90%、95%或99%同一的重链和与SEQ ID NO:41至少80%、90%、95%或99%同一的轻链，该延伸型Fusobody与SIRPα特异性结合，并且该延伸型Fusobody体显示出至少一种以下功能特征：(i)它抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中由多种细菌性衍生物如金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子等所激发的促炎细胞因子释放，并且(ii)它具有针对环孢菌素A的结合特异性。
延伸型Fusobody的Fc结构域
Fc结构域至少包含CH2和CH3结构域。如本文所用，术语Fc结构域还包括但不限于与抗体的天然Fc片段例如人Fc片段相比，已经在五个氨基酸位置中的一个、两个、三个、四个位置处导入氨基酸置换、缺失或插入的Fc变体。
使用Fc结构域来制造在人类中体内半寿期增加的可溶性构建体是本领域熟知的并且例如在Capon等人(US5,428,130)中描述。在一个实施方案中，提出在Fusobody构建体内部使用相似的Fc部分。然而，可以理解本发明不涉及有时称作“Fc融合蛋白”或“免疫黏附素”的本领域已知蛋白质。实际上，术语“Fc融合蛋白”或“免疫黏附素”在本领域中通常指与CH2结构域和CH结构域直接融合，但是至少不包含CL区或CH1区二者之一的异源的结合区。所得到的蛋白质包含两个异源结合区。Fusobody可以包含与CH1区的N端融合的Fc部分，从而重构出可以(通常经CH1区和CL二硫键)与轻链相互作用的全长恒定重链。
在一个实施方案中，延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白的CH1的铰链区经修饰，从而铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如，增加或减少。这种方法在美国专利号5,677,425(Bodmer等人)中进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以便例如促进轻链和重链的装配或增加或减少融合多肽的稳定性。
在另一个实施方案中，修饰延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白的Fc区以增加其生物学半寿期。多种方法是可能的。例如，可以突变以下位置的一个或多个：252、254、256，如美国专利号6,277,375中所述，例如M252Y、S254T、T256E。
在另外的其他实施方案中，延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白的Fc区通过用一个不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变以改变Fc部分的效应子功能。例如，一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基替换，从而Fc部分对效应子配体具有改变的亲和力。改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基替换，从而所得到的Fc部分具有改变的C1q结合作用和/或减少或消除的依赖补体的细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利号6,194,551(Idusogie等人)中进一步详细描述。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变Fc区固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中进一步描述。
在又一个实施方案中，修饰延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白的Fc区以增加融合多肽介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的能力和/或以通过修饰一个或多个氨基酸而增加或减少Fc区对Fcγ受体的亲和力。这种方法在PCT公开WO00/42072中进一步描述。另外，人IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经绘制定位，并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见Shields,R.L.等人,2001J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在一个实施方案中，延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白的Fc结构域是人源的，并且可以来自任一个免疫球蛋白类，如IgG或IgA，并且来自任何亚型，如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的嵌合体。在其他实施方案中，Fc结构域来自非人动物，例如，但不限于小鼠、大鼠、兔、骆驼科(camelid)、鲨鱼、非人灵长类或仓鼠。
在某些实施方案中，IgG1同种型的Fc结构域用于延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白中。在一些具体实施方案中，使用IgG1Fc片段的突变变体，例如，减少或消除融合多肽介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和/或与Fcγ受体结合的能力的沉默IgG1Fc。IgG1同种型沉默突变体的实例是所谓LALA突变体，其中亮氨酸残基由丙氨酸残基在氨基酸位置234和235替换，如Hezareh等人(J.Virol,2001年12月;75(24):12161-8)所描述。IgG1同种型沉默突变体的另一个实例包含D265A突变和/或P329A突变。在某些实施方案中，Fc结构域是防止在Fc结构域第297位置处的残基上糖基化的突变体，例如，在Fc结构域的第297位置处天冬酰胺残基的氨基酸置换。这种氨基酸置换的实例是N297被甘氨酸或丙氨酸替换。
在另一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG2、IgG3或IgG4。
在一个实施方案中，延伸型Fusobody或SIRPα结合蛋白的Fc结构域包含二聚化结构域，优选地通过能够在包含这种Fc结构域的两个融合多肽之间产生共价二硫键的半胱氨酸。
糖基化修饰
在又一个实施方案中，与常见的哺乳动物糖基化模式如在CHO或人细胞系中获得的那些相比，本发明的可溶性蛋白(特别地包括SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody)的糖基化模式可以改变。例如，可以通过使用原核细胞系作为宿主细胞或已经工程化以缺少糖基化的哺乳动物细胞，产生非糖基化的蛋白质。糖修饰也可以通过例如改变SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody内部的一个或多个糖基化位点来完成。
额外地或备选地，可以产生具有改变的糖基化类型的糖基化蛋白。此类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化装置的宿主细胞中表达本发明的可溶性蛋白来完成，即与相应野生型细胞中观察到的糖基化模式相比，可溶性蛋白的糖基化模式改变。具有改变的糖基化装置的细胞已经在本领域中描述并且可以用作表达重组可溶性蛋白从而以便产生这类糖基化改变的可溶性蛋白的宿主细胞。例如，EP1,176,195(Hang等人)描述具有功能上受破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶,从而在这种细胞系中表达的糖蛋白显示出过低岩藻糖基化(hypofucosylation)。WO03/035835描述了一种变异CHO细胞系，Lecl3细胞，所述细胞系具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)联糖的能力，这也导致在这种宿主细胞中表达的糖蛋白过低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等人,2002J.Biol.Chem.277:26733-26740).备选地，可溶性蛋白可以在为哺乳动物样糖基化模式而工程化的酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))或丝状真菌(例如，里氏木霉(Trichoderma reesei))(见例如EP1297172B1)中产生。那些糖工程化的宿主细胞的优点是特别地提供具有均匀糖基化模式和/或较高产率的多肽组合物。
PEG化的可溶性蛋白和其他缀合物
本发明可溶性蛋白的另一个实施方案涉及聚乙二醇化。本发明的可溶性蛋白例如SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以是PEG化的。PEG化是一项熟知技术以与无PEG化的相同生物制品相比，增加所得到的生物制品的生物(例如，血清)半寿期。为聚乙二醇化一种多肽，该多肽一般与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得与多肽连接的条件下反应。PEG化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应实施。如本文所用，术语“聚乙二醇”意图包括已经用来衍生化其他蛋白质的任何形成的PEG，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。用于PEG化蛋白质的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的可溶性蛋白。见例如，Nishimura等人的EP0,154,316和Ishikawa等人的EP0,401,384。
备选性缀合物或聚合载体特别地可以用来改善所得到的缀合物的药物代谢动力学特性。聚合载体可以包含至少一种天然的或合成的分枝、线性或树状聚合物。聚合载体优选地是在水和体液中可溶的；并且优选地是可药用的聚合物。水溶性聚合物部分包括，但不限于，例如，聚烷撑二醇和其衍生物，包括PEG、PEG均聚物、mPEG、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中所述均聚物和共聚物是未取代的或在一个末端处取代的，例如，以酰基取代；聚甘油或聚唾液酸；糖、多糖、纤维素和纤维素衍生物，包括甲基纤维素和羧甲基纤维素；淀粉(例如，羟烷基淀粉(HAS)，尤其是羟乙基淀粉(HES)和糊精及其衍生物；葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括交联葡聚糖、交联糊精和羧甲基糊精；壳聚糖(一种线性多糖)、肝素和肝素的片段；聚乙烯醇和聚乙烯基乙醚；聚乙烯吡咯烷酮；α,β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺；和聚氧乙基化多元醇。
SIRPα结合蛋白作为药物的用途
本发明的延伸型Fusobody和特别地结合SIRPα的可溶性蛋白可以用作药物，特别地用来(以统计或生物显著的方式)降低或抑制受试者中炎性和/或自身免疫反应，特别地由SIRPα+细胞介导的反应。与细胞毒性剂或与通过Fc部分提供的细胞杀伤效应子功能缀合时，SIRPα结合作用也可以有利地用于治疗、减少或抑制癌症或肿瘤，特别地如髓系淋巴增殖性疾病如急性髓系淋巴增殖性(AML)病症或膀胱癌。
编码本发明可溶性蛋白的核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明可溶性蛋白的核酸分子，包括但不限于与延伸型Fusobody相关的实施方案，例如，如实施例的表4中所述。本发明提供一种分离的核酸，其编码所述可溶性蛋白的一个异源二聚体的至少一条单链多肽。编码结合SIRPα的延伸型Fusobody的核苷酸序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；或SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80；或SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98，每对分别编码结合SIRPα的延伸型Fusobody的重链和轻链。
所述核酸可以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或可以是部分纯化的或基本上纯形式的核酸。当通过包括碱/SDS处理、CsCl区带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳的标准技术和本领域熟知的其他技术从其他细胞组分或其他杂质(例如，其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，核酸是“分离的”或“变得基本上纯的”。参见F.Ausubel等人编著.1987Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或可以不含有内含子序列。在一个实施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体如噬菌体展示载体中或重组质粒载体中。本发明因此提供分离的核酸或克隆载体或表达载体，其包含选自SEQID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98的至少一种核酸：。
编码可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody(例如，如上文和在实施例中所述)的DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操作，例如以包括用于表达系统中适宜分泌的任何信号序列、任何纯化标签和用于其他纯化步骤的可切除标签。在这些操作中，DNA片段有效连接至另一个DNA分子或有效连接至编码另一种蛋白质的片段，如纯化/分泌标签或柔性接头。在这种上下文中所用的术语“有效连接”意指两个DNA片段例如以有功能的方式连接，从而由这两个DNA片段编码的氨基酸序列仍符合可读框，或从而蛋白质在所希望的启动子的控制下表达。
产生SIRPα结合蛋白和延伸型Fusobody的转染瘤的生成
本发明的可溶性蛋白，例如SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody，可以如本领域熟知，使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生。为了在宿主细胞转染瘤中表达和产生重组延伸型Fusobody，技术人员可以有利地使用与抗体分子或抗体样分子的表达和重组产生相关的自身常识。本发明提供了适用于产生本发明的可溶性蛋白或蛋白质复合物的重组宿主细胞，包含编码所述蛋白质的所述异源二聚体的所述第一和第二单链多肽和任选地分泌信号的核酸。
在一个方面，重组宿主细胞包含稳定整合于基因组中的SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；或SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80；或SEQ ID NO:97和SEQID NO:98的核酸。在优选的方面，宿主细胞是哺乳动物细胞系。本发明提供一种产生本发明的可溶性蛋白(如SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody)或蛋白质复合物的方法，如先前所描述，所述方法包括在产生所述可溶性蛋白或蛋白质复合物的适宜条件下培养宿主细胞和分离所述蛋白质。
例如，为表达本发明的可溶性蛋白或其中间体，编码相应多肽的DNA可以通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目的多肽的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆法)获得，并且可以将所述DNA插入表达载体中，从而相应的基因与转录和翻译控制序列有效连接。选择表达载体和表达控制序列是与所用表达宿主细胞相容的。编码本发明可溶性蛋白(例如，结合SIRPα的延伸型Fusobody的重链和轻链或中间体)的基因由标准方法(例如，基因片段和载体上互补限制性位点的连接或如果不存在限制性位点，钝端连接)插入表达载体中。额外地或备选地，重组表达载体可以编码促进多肽链从宿主细胞分泌的信号肽。基因可以克隆至载体中，从而信号肽与多肽链的氨基端符合可读框地连接。在采用CD47衍生的序列作为SIRPα结合区的具体实施方案中，信号肽可以是CD47信号肽或异源信号肽(即，不天然与CD47序列相关的信号肽)。
除编码多肽的序列之外，本发明的重组表达载体还携带控制基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他控制多肽链基因转录或翻译的表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA1990)中描述。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。备选地，可以使用非病毒调节序列，如遍在蛋白启动子或P-珠蛋白启动子。另外，由不同来源的序列组成的调节元件，如SRa启动子系统，含有来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列(Takebe,Y.等人,1988Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除此之外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择已将载体引入其中的宿主细胞（见例如美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017，全都属于Axel等）。例如，选择标记基因一般对其中已经导入载体的宿主细胞赋予针对药物(如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的耐药性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中连同甲氨蝶呤选择/扩增一起使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达蛋白质，编码可溶性蛋白或中间体如结合SIRPα的延伸型Fusobody的重链和轻链序列的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意图包括常见用于导入外源DNA至原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如，电穿孔法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染法等。在原核或真核宿主细胞中表达本发明的可溶性蛋白在理论上是可能的。讨论了糖蛋白在真核细胞、特别地哺乳动物宿主细胞中的表达，因为此类真核细胞并且特别地哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配并分泌正确折叠的和有生物学活性的糖蛋白如结合SIRPα的延伸型Fusobody。
可以使用针对抗体分子所开发的熟知表达系统有利地产生延伸型Fusobody。本发明的延伸型Fusobody胜过包含双可变域的现有分子的优点之一是可以使用天然的或近乎天然的哺乳动物结合结构域序列连同抗体提供的VH序列和VL序列的组合，实现抗原/靶特异性。因为可溶性蛋白仅包含每个异源二聚体一组VH序列和VL序列，与布置两组(或更多组)VH序列和VL序列时所要求的相比，与相关的哺乳动物结合分子区域紧邻的这些区域的位置较不关键。因此，就任何接头序列的利用和优化而言并且还就宿主细胞中表达异源二聚体而言，本发明的可溶性蛋白提供增加的生产简单性和便利性，并且需要使用分子生物学更简单的操作。换句话说，对于优化包含于本发明可溶性蛋白内部的各序列的间距并仍保留所要求功能性而言，存在较少要求。这与其中使用两组VH结构域和VL结构域实现双特异性的那些分子形成对比，其中它们的相应构象和彼此的位置可以更关键并且因此需要更多的空间优化。
用于表达可溶性蛋白和中间体(如本发明的结合SIRPα的Fusobody的重链和轻链)的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，包括随DH FR选择标记(例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中所描述)一起使用的dhfr-CHO细胞(由Urlaub和Chasin,1980,Proc Natl AcadSci USA77:4216-4220描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞或人细胞系(包括PER-C6细胞系、Crucell或HEK293细胞，Yves Durocher等人,2002,Nucleic acids research第30卷,第2期e9)。当编码多肽的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，可溶性蛋白和中间体(如本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody的重链和轻链)通过培养所述宿主细胞一段时间产生，所述时间足以允许重组多肽在宿主细胞中表达或重组多肽分泌至培育有宿主细胞的培养基中。多肽随后可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。
结合SIRPα的多价蛋白质
在另一个方面，本发明提供多价蛋白质，例如处于复合物形式，其包含至少两个相同或不同的本发明的可溶性SIRPα结合蛋白。在一个实施方案中，多价蛋白包含至少两个、三个或四个本发明的可溶性SIRPα结合蛋白。可溶性SIRPα结合蛋白可以经蛋白质融合或共价键或非共价键连接在一起。本发明的多价蛋白可以通过使用本领域已知的方法缀合组分结合特异性而制备。例如，多价蛋白的每种结合特异性可以单独地产生并且随后彼此缀合。
多种偶联或交联剂可以用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、和磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(见，例如，Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人,1985Proc Natl Acad Sci USA82:8648)。其他方法包括在Paulus,1985Behring Ins.No.78,118-132；Brennan等人,1985Science229:81-83)和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些方法。共价键可以通过两个半胱氨酸之间的二硫键获得，例如来自Fc结构域的半胱氨酸的二硫键。
缀合的SIRPα结合蛋白
在另一个方面，本发明表征了与治疗性部分如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合的延伸型Fusobody，特别地结合SIRPα的延伸型Fusobody。这类缀合物在本文中称作“缀合的延伸型Fusobody”或“缀合的结合SIRPα的延伸型Fusobody”。术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括有害于(例如，杀死)细胞的任何物质。此类物质已经用来制备抗体的缀合物或免疫缀合物。这类技术可以有利地随缀合的延伸型Fusobody、特别随缀合的结合SIRPα的延伸型Fusobody一起使用。细胞毒素或细胞毒性剂的实例包括紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括，例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、消融剂(例如，氮芥、噻替哌(thioepa)、chloraxnbucil、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环类(例如，佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称作放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
可以与本发明的延伸型Fusobody缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生和澳瑞司他汀(auristatin)和其衍生物。
细胞毒素可以使用本领域可获得的接头技术与本发明的SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody缀合。已经用来将细胞毒素与本发明的SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。可以选择例如对于溶酶体区室内部低pH的切割作用敏感或对于蛋白酶(如肿瘤组织中优先表达的蛋白酶如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))的切割作用敏感的接头。
对于细胞毒素类型、接头和用于将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，也参见Saito,G.等人,2003Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等人,2003Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.,2003Cancer Cell3:207-212；Allen,T.M.,2002Nat.Rev.Cancer2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.,2002Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.,2001Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
本发明的SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物。可以与本发明的SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的实例包括，但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于制备放射性免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的实例是可商业获得的，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来使用本发明的SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody制备放射性药物。另外，用于将毒素或放射性同位素与抗体缀合的技术是熟知的，参见例如，Thorpe,"AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)",引自Monoclonal Antibodies'84:Biological AndClinical Applications；Pinchera等人(编著),第475-506页(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy(癌症疗法中治疗性使用放射标记抗体的分析、结果和未来展望)",引自Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编著),第303-16页(Academic Press1985)和Thorpe等人,"ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒特性)",Inmunol.Rev.,62:119-58(1982)。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其含有与一种或多种可药用运载体或载体一起配制的一种或组合的本发明可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody。
可以通过具有所希望的纯度的蛋白质与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000))混合，以水溶液、冻干或其他干燥的制剂形式制备包含本发明的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody的药物制剂用于储存。本发明还涉及冻干的组合物，其至少包含本发明的可溶性蛋白(例如，本发明的结合SIRPα的延伸型Fusobody)和一种或多种适宜的可药用载体。本发明也涉及以液体制剂预填充的注射器，所述液体制剂至少包含本发明的可溶性蛋白(例如，结合SIRPα的延伸型Fusobody)和一种或多种适宜的可药用载体或运载体。
该药物组合物可以额外地包含至少一种其他有效成分。因此，本发明的药物组合物也可以在联合疗法中施用，即，与其他药剂组合。例如，联合疗法可以包括与至少一种其他有效成分如抗炎药或另一个化疗药组合的本发明可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody。可以在联合疗法中使用的治疗剂的实例在下文关于本发明的可溶性SIRPα结合蛋白的用途的部分中以更多细节描述。
如本文所用，“可药用载体”或“可药用运载体”包括生理学上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌药和抗真菌药、等渗和吸收延迟剂等。载体应当适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，活性成分可以在保护该活性成分免遭可能使这种活性成分失活的酸和其他天然条件作用的材料中包衣。
本发明的药物组合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指一种盐，它保留亲本化合物的所希望的生物活性并且不引起任何不希望的毒理作用(见，例如，Berge,S.M.等人,1977J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸、如氢氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳香磺酸等的那些酸加成盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属如钠、钾、镁、钙等以及衍生自无毒有机胺、如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些碱加成盐。
本发明的药物组合物也可以包括可药用的抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱盐酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以在本发明的药物组合物中使用的合适水质和非水质载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。
这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒方法和通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止存在微生物。也可能希望的是将等渗剂如糖、氯化钠等纳入所述组合物。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶引起。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况下之外，构思了所述介质或试剂在本发明药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。
治疗性组合物一般必须是无菌和在制造和储存条件下稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。在许多情况下，可以在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而引起。
可以通过在具有上文所列举的一种成分或多种成分组合的适宜溶剂中以所要求的量掺入可溶性蛋白，例如，结合SIRPα的延伸型Fusobody，根据需要，随后无菌微量过滤，制备无菌可注射溶液剂。总体上，通过将活性成分掺入含有基础分散介质和来自上文所列举那些成分的其他所要求的成分中来制备分散体。在用于现场制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末情况下，制备方法是真空干燥法和冷冻干燥(冻干)法，所述方法产生有效成分的粉末，以及来自先前无菌过滤的溶液中的任何额外的想要的成分。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量将根据正在治疗的受试者和具体施用模式变动。可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量通常将是组合物的产生治疗效果的量。总体上，以100%计，这个量将是与可药用载体组合时约0.01%至约99%的有效成分，约0.1%至约70%，或约1%至约30%的有效成分。
调整剂量方案以提供想要的最佳反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次大丸剂(bolus)，可以随时间推移施用几个分开的剂量，或该剂量可以如治疗情况的迫切需要所示，按比例减少或增加。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便利剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理分立的单元；每个单元含有预定量的活性化合物，所述的预定量经计算与所要求的药用载体结合时产生所需的治疗效果。用于本发明剂量单位形式的说明书由活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果决定并且完全取决于此，并且限制作用是复合这种活性化合物用于治疗个体中敏感的领域内固有的。
为施用本发明的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody，剂量是约0.0001至100mg/kg和更常见地0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-30mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要施用每周一次、每隔两周一次、每隔三周一次、每隔四周一次、每月一次、每隔3个月一次或每隔3至6个月一次。用于本发明的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody的剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用以下给药方案之一给予蛋白质：每隔四周给予六个剂量，随后每隔三个月；每隔三周；3mg/kg体重，一次，随后每隔三周1mg/kg体重。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody通常在多个时刻上施用。单次剂量之间的间隔期可以是例如每周、每月、每隔三个月或每年。间隔期也可以是不规则的，这通过测量可溶性多肽/蛋白在患者中的血液水平指示。在一些方法中，调整剂量以实现约0.1-1000μg/ml的血浆多肽浓度，并且在一些方法中实现约5-300μg/ml。
备选地，可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以作为持续释放形式施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率根据可溶性蛋白在患者中的半寿期变动。施用的剂量和频率可以根据治疗是否为预防性或治疗性而变动。在预防性应用中，相对低的剂量以相对地不频繁的间隔期在长的时间范围内施用。一些患者继续接受治疗持续其余生。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔期上相对高的剂量直至疾病的进展减低或终止或直至患者显示出部分或完全的疾病症状改善。此后，患者可以按预防性方案施用。
可以变动有效成分在本发明药物组合物中的实际剂量水平，从而以获得有效成分的量，其中对于特定患者、组合物和施用模式，所述的量有效实现想要的治疗反应，而对患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域熟知的因素。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody的“治疗有效剂量”可以导致降低疾病症状的严重性、增加无疾病症状期的频率和持续期或预防因疾病侵袭所致的受损或致残。
本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用。如技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变动。本发明可溶性蛋白的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、眼内、经气管、皮下、角皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨的胸骨内注射和输注。
备选地，可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。
活性成分可以连同将保护蛋白质免于快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的多种方法是公开的或总体上是本领域技术人员已知的。见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(持续释放和控释放药物递送系统),J.R.Robinson,编著,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978。
可以用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。例如，在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可以用无针头皮下注射装置如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中所示的仪器施用。在本发明中有用的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其显示用于以受控速率分配药物的可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，其显示用于经皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其显示用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其显示用于连续递送药物的可变流量的可植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其显示具有多腔区室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其显示渗透性药物递送系统。许多其他的此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody以确保在体内的正确分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们例如在脂质体中配制。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，因而增强靶向的药物递送(参见例如V.V.Ranade,1989J.Cline Pharmacol.29:685)。
本发明的用途和方法
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody具有体外和体内诊断性和治疗性用途。例如，这些分子可以施用至(例如，在体外或在体内)培养的细胞或受试者中（例如体内）以治疗、预防或诊断多种病症。在一个实施方案中，可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以用于在否则干扰扩增的其他细胞类型存在下体外扩充干细胞或其他细胞类型如胰腺β细胞。此外，特别地使用SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody在体外对功能性SIRPα在来自某生物(如人类)中生物学样品的细胞的细胞表面的表达定性及定量。这种应用可以是有用的，因为市售SIRPα抗体与SIRPβ的多种同工型交叉反应，致使难以毫不含糊地定量细胞表面上的SIRPα蛋白表达。可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody的定量因此可以用于诊断目的，例如以评估SIRPα蛋白表达量与免疫或癌症疾病的相关性并且因此允许为治疗选择患者(患者分类)，例如，采用靶向SIRPα的缀合SIRPα结合蛋白和基于抗体的治疗。
所述方法特别适于治疗、预防或诊断由SIRPα+细胞介导的自身免疫病和炎性病症，例如，过敏性哮喘或溃疡性结肠炎。这些病症包括急性和慢性炎性病症、变态反应和过敏性疾病、自身免疫病、局部缺血性病症、严重感染、和细胞或组织或器官移植排斥，包括非人组织移植物(异种移植物)。所述方法特别适于治疗、预防或诊断由表达与CD47反应的激活性SIRPβ受体的异常或突变变体的细胞所介导的自身免疫病和炎性或恶性病症以及因与CD47或其他SIRPα配体结合所致的功能障碍。
自身免疫病的实例包括但不限于关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括炎性病症和涉及骨丢失的风湿病、炎性疼痛、脊柱关节病包括强直性脊柱炎、赖特尔综合征、反应性关节炎、银屑病关节炎和肠病性关节炎、超敏反应(包括气道超敏反应和皮肤超敏反应)和变态反应。自身免疫病包括自身免疫血液病(包括例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血和特发性血小板减少症)、系统性红斑狼疮、炎性肌病、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、史蒂文斯-约翰逊综合征、特发性脂肪泻、内分泌眼病、格雷夫斯病、肉状瘤病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、(前和后)眼色素层炎、干燥性角结膜炎和春季角结膜炎、间质性肺纤维化、银屑病关节炎和肾小球肾炎(伴有和不伴有肾病综合征，例如，包括痛风、朗格汉斯细胞组织细胞增多病、特发性肾病综合征或微小病变肾病)、肿瘤、多发性硬化、皮肤和角膜的炎性疾病、肌炎、骨植入物松动、代谢紊乱，如动脉粥样硬化、糖尿病和血脂异常。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也用于治疗、预防或改善哮喘、支气管炎、尘肺、肺气肿、和气道的其他阻塞性或炎性疾病。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也用于治疗、预防或改善免疫系统介导的或炎性肌疾病包括冠状肌病(coronar myopathy)。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也用于治疗、预防或改善涉及表达SIRPα的内皮或平滑肌系统的疾病。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也用于治疗IgE介导的病症。IgE介导的病症包括特应性疾病，它们以免疫应答于多种常见的吸入和摄取的天然存在抗原的遗传性倾向性和持续产生IgE抗体为特征。具体的特应性病症包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和变应性胃肠病。
然而，与升高的IgE水平相关的病症不限于具有遗传性(特应性)病因学的那些疾病。似乎是IgE介导的并且用本发明制剂可治疗的与升高的IgE水平相关的其他病症包括超敏反应(例如，过敏性超敏反应)、湿疹、荨麻疹、变应性支气管肺曲霉菌病、寄生虫病、IgE过多综合征、毛细管扩张性运动失调、威斯科特-奥尔德里奇综合征、胸腺淋巴组织发育不全、IgE骨髓瘤和移植物抗宿主反应。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody用作涉及其中炎性途径由SIRPα+细胞(如激活的小胶质细胞)介导的主要神经系统的急性疾病的一线治疗。具体应用例如可以是沉默在脊髓损伤后激活的小胶质细胞以加速愈合并且防止形成淋巴样结构和与神经系统的组分自反应的抗体。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以作为单独的有效成分或例如作为辅助剂与其他药物(例如免疫抑制剂或免疫调节剂或例如用于治疗或预防上文提到的疾病的其他抗炎药)共同或联合施用。例如，可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以与DMARD，例如，金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、甲氨蝶呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、霉酚酸、环孢菌素A、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、米诺环素、来福米特、糖皮质激素类；钙调神经磷酸酶抑制剂，例如，环孢菌素A或FK506；淋巴细胞再循环调节物，例如，FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性的子囊霉素(ascomycin)，例如，ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤(azathioprene)；甲氨蝶呤；来福米特；咪唑立宾(mizoribine)；霉酚酸；麦考酚酸酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；免疫抑制性单克隆抗体(例如，针对白细胞受体例如，MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配体的单克隆抗体；其他免疫调节性化合物，例如，LEA29Y；黏附分子抑制剂，例如，LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗药，例如，紫杉醇、吉西他滨、顺铂、多柔比星或5-氟尿嘧啶；抗TNF剂，例如，针对TNF的单克隆抗体，例如，英利昔单抗、阿达木单抗、CDP870，或针对TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如，依那西普、PEG-TNF-RI；促炎细胞因子阻断药、IL-1阻断药，例如，Anakinra或IL-1阱（trap）、AAL160、ACZ885、IL-6阻断药；趋化因子阻断药，例如，蛋白酶(例如金属蛋白酶)抑制剂或激活剂、抗IL-15抗体、抗IL-6抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗IL17抗体、抗IL12抗体、抗IL12R抗体、抗IL23抗体、抗IL23R抗体、抗IL21抗体、NSAID、如阿斯匹灵、布洛芬(ibuprophen)、扑热息痛(paracetamol)、萘普生、选择性Cox2抑制剂、组合型Cox1和2抑制剂如双氯酚酸或抗感染药(名单不限于提到的药剂)联合使用。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也用作与抗炎或支气管扩张药物物质合并使用的共治疗剂，特别地用于治疗阻塞性或炎性气道疾病，如本文中提到的那些，例如作为此类药物的治疗性活性的增效剂或作为减少此类药物的所需要剂量或潜在副作用的手段。本发明的药物可以与抗炎或支气管扩张药物以固定的药物组成混合，或它可以单独地、在抗炎或支气管扩张药物之前、同时或之后施用。此类抗炎药物包括类固醇类、特别地糖皮质激素类，如布地奈德、倍氯米松、氟替卡松或莫米松，和多巴胺受体激动剂如卡麦角林、溴隐亭或罗匹尼罗。此类支气管扩张药物包括抗胆碱能剂或抗毒蕈碱剂，特别地异丙托溴铵、氧托溴铵和噻托溴铵。
本发明药剂和类固醇的组合可以例如用于治疗COPD或特别地治疗哮喘。本发明药剂和抗胆碱能剂或抗毒蕈碱剂或多巴胺受体激动剂的组合可以例如用于治疗哮喘或特别地治疗COPD。
根据前文，本发明还提供了一种用于治疗阻塞性或炎性气道病的方法，所述方法包括施用如本文描述的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody至有需要的受试者，特别地人类受试者。在另一个方面，本发明提供如本文描述的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody用于制备治疗阻塞性或炎性气道病的药物。
可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody也特别地用于治疗、预防或改善慢性胃肠炎症，如炎性肠病，包括节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。
“慢性胃肠炎症”指胃肠道粘膜的炎症，其特征在于相对较长的发病阶段，长时间持续(例如，从几日、几周、几月或几年和直至受试者终生)，并且与单核细胞的浸润或流入相关，并且可以进一步与自发消退和自发出现的时期相关。因而，患有慢性胃肠炎症的受试者可以预期需要长时间的监督、观察或护理。具有这种慢性炎症的“慢性胃肠炎性病症”(也称作“慢性胃肠炎性疾病”)包括，但不必然限于炎性肠病(IBD)、由环境性损害引起的结肠炎(例如，由治疗方案(如施用化疗、放射疗法等)引起或与之相关(例如，作为副作用)的胃肠炎症(例如，结肠炎)、在多种疾病如慢性肉芽肿病中的结肠炎(Schappi等人,Arch Dis Child.2001年2月；1984(2):147-151)、乳糜病(celiac disease)、乳糜泻(其中肠衬层应答于摄取一种称作谷蛋白的蛋白质而发炎的一种遗传病)、食物过敏、胃炎、感染性胃炎或小肠结肠炎(例如，幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)感染的慢性活动性胃炎)和其他形式的由感染物引起的胃肠炎症和其他类似病状。
如本文所用，“炎性肠病”或“IBD”指以全部或部分肠的炎症为特征的多种疾病的任一种。炎性肠病的实例包括，但不限于节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。在本说明书通篇范围内对IBD的称谓在本说明书中经常指胃肠炎性疾病的示例，并且不意指是限制性的。
根据前文，本发明还提供了一种用于治疗慢性胃肠炎症或炎性肠病(如溃疡性结肠炎)的方法，所述方法包括施用如本文描述的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody至有需要的受试者，特别地人类受试者。在另一个方面，本发明提供如本文描述的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody，用于制备治疗慢性胃肠炎症或炎性肠病的药物。
本发明也用于治疗、预防或改善白血病或其他癌症。例如，本发明的可溶性SIRPα结合蛋白可以在白血病中诱导细胞耗尽或凋亡。可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody可以用于治疗、预防或改善选自以下的癌症：急性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、膀胱癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多病(histiocytosis)的恶性形式。
调节SIRPα-CD47相互作用可以用来至增加造血干细胞植入(参见例如，与CD47-Fc融合蛋白的用途相关的WO2009/046541)。本发明和例如可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody因此用于增加人造血干细胞植入。造血干细胞植入可以用来治疗或减少患有受损的血细胞生成或遗传性免疫缺陷病、自身免疫病或造血病症或已经接受过任何清髓性治疗的患者的症状。例如，此类造血疾病选自急性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、范科尼贫血、重型地中海贫血、镰状细胞贫血、重症联合免疫缺陷、威斯科特-奥尔德里奇综合征、嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症和先天性代谢缺陷。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗造血病症的可溶性SIRPα结合蛋白或Fusobody，特别地在用扩充的含有造血干细胞的细胞群治疗后，以便改善造血干细胞植入，其中所述造血病症选自急性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、范科尼贫血、重型地中海贫血、镰状细胞贫血、重症联合免疫缺陷、威斯科特-奥尔德里奇综合征、嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症和先天性代谢缺陷。
另外，在本发明的范围内部包括如上文定义的方法，所述方法包括共施用，例如，同时或依次施用治疗有效量的可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody和至少一种第二药物物质，所述第二药物物质例如是如上所示的免疫抑制/免疫调节药、抗炎性化疗药或抗感染药物。
本发明的范围内还包括一种治疗性组合，例如，试剂盒，其包含治疗有效量的a)可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody和b)至少一种第二物质，选自免疫抑制/免疫调节药、抗炎性化疗药或抗感染药物，例如如上所示的药物。试剂盒可以包含施用其的说明书。
在可溶性SIRPα结合蛋白或延伸型Fusobody与其他免疫抑制/免疫调节药、抗炎性化疗药或抗感染疗法共同施用的情况下，共施用的组合化合物的剂量当然将根据使用的共同药物的类型、根据正在治疗的疾病等变动。
附图简述
图1：与非延伸型Fusobody和参照CD47-Fc分子相比，结合SIRPα的延伸型Fusobody的实例的示意图。
图2A：参照CD47-Fc分子(实例#9)与固定的人SIRPα的结合。
图2B：具有CD47和TNFα特异性的延伸型Fusobody(实例#5)与固定的人SIRPα的结合。
图3：与具有CD47特异性的非延伸型Fusobody(实例#2)和抗TNFα单克隆抗体(实例#8)相比，对CD47和TNFα具有特异性的延伸型Fusobody(实例#5和#6)与固定的重组人TNFα的结合。
已经充分描述了本发明，通过以下实施例和权利要求进一步说明本发明，所述实施例和权利要求是说明性的并且不意图是进一步限制性的。
实施例
1.本发明的延伸型Fusobody的实例
下表4提供了本发明的延伸型Fusobody的实例(实例#4、#5、#6和#7)，它们可以是通过重组方法，使用编码所公开的延伸型Fusobody重链和轻链氨基酸序列的DNA产生。该表进一步包括具有非延伸形式的Fusobody(实例#2和#3)和参照CD47-Fc分子(实例#1和#9)，和市售的常规抗TNF抗体(实例#8)。
表4：
Figure BDA0000438719970000511
Figure BDA0000438719970000521
Figure BDA0000438719970000531
Figure BDA0000438719970000541
Figure BDA0000438719970000551
2.亲和力测定
2.1与SIRPα的结合测定法(BiaCORE测定法)
可以通过表面等离子体共振法表征具有SIRPα结合部分的延伸型Fusobody对二价重组SIRPα的亲合力。为此，在分别通过标准方法如EDC/NHS或乙醇胺进行表面活化/失活后，人SIRPα-Fc(1μg/mL,R&D systems,UK)可以通过蛋白质A固定在BiaCORE芯片上，像CM5(羧甲基化葡聚糖基质)上。可以通过注入的延伸型Fusobody与SIRPα结合部分的接触时间120秒、解离时间240秒和流速50μl/分钟进行评估。在每次注射分析物后，芯片可以用温和洗脱缓冲液(Thermo Scientific)再生。
2.2针对固定的抗原的结合测定法
可以通过基于DELFIA的方法测试延伸型Fusobody与基础性抗体支架的主要抗原(或备选地与融合在受体结构域上的配体)结合的能力。对于图3中显示的CD47-TNFα延伸型Fusobody(实例#5和#6)，通过将磷酸盐缓冲盐水pH7.6(PBS,Life-technologies,CH)中的人重组TNFα(Novartis自制或R&DSystems，UK)以1-3μg/mL固定到适宜微量滴定平板(Maxisorb,Nunc Brand,CH)上进行这个步骤。在用含有1%w/v牛血清白蛋白(BSA)，0.05%吐温20(Sigma；AldrichInc，CH)的PBS封闭之后，将测试蛋白质在室温以浓度0.01-1μg/mL添加于摇床上的PBS/0.5%BSA中。通过在PBS/BSA0.5%/吐温200.05%中的3个洗涤循环移除未结合的蛋白质，随后添加生物素酰化的山羊抗人IgG(Southern Biotech)1-3μg/ml。在3个洗涤循环后，使用链霉亲和素-铕和DELFIA检测试剂遵循制造商的说明书(Perkin Elmer)检测结合的生物素酰化的抗人Ig。铕衍生的时间分辨荧光可以用专用的读数仪(Victor2，Perkin Elmer)定量。
2.3全血人细胞结合测定法
遵照伦理准则，将来自健康志愿者的人血液收集至肝素钠涂布的空采血管(BectonDickinison,BD)中。将血液等分至中96孔深孔聚丙烯平板(Costar)并且始终在终浓度0.1%w/v叠氮钠存在下在冰上与多个浓度的SIRPα结合蛋白(包括本发明的Fusobody和参照CD47Fc分子)孵育。荧光染料Alexa Fluor647(AX647)可以使用标记试剂盒(Invitrogen)与SIRPα结合蛋白缀合。AX647-缀合的SIRPα结合蛋白(如实施例1和表4中所述)可以按1-10nM的浓度添加至全血样品，在冰上30分钟。在最后15分钟期间，添加浓度优化的针对表型的细胞表面标记物的抗体：CD14-PE(克隆MEM18,Immunotools,德国)、CD3Percp-Cy5.5(克隆SK7，BD)、CD16FITC(克隆3G8，BD)。通过添加10x体积的FACSLYSING溶液(BD)并且在室温孵育10分钟裂解全血。样品用含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液(SIGMA-ALDRICH)洗涤两次。在裂解后24小时内，在Facs Canto II(BD)上获得样品。细胞亚类根据单核细胞光散射图谱并且通过CD14+和CD3-表达来设门。对于这些细胞亚类，可以绘制荧光直方图并且取中位荧光强度作为读出数统计地评价这些图。
3.用于测量抑制金黄色葡萄球菌Cowan1菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放的树状细胞细胞因子释放测定法
如先前所描述，将外周血单核细胞(CD14+)用GMSCF/IL4分化成单核细胞衍生性树状细胞(DC)(Latour等人,J of Immunol,2001:167:2547)。DC在X-VIVO15无血清培养基中用金黄色葡萄球菌Cowan1粒子按1/40,000(Pansorbin)在多个浓度的结合人SIRPα的Fusobody(1至10000pM)存在下刺激。在24小时培养后通过HTRF(Cisbio)评估TNFα释放。
4.结果
在表5A和5B中显示了如表4中所述的结合SIRPα的延伸型Fusobody和参照分子的结合特性。
表5A：
4.1亲和力测定
表5B中显示与参照CD47-Fc分子(实例#9)相比，延伸型Fusobody实例#5的BiaCORE结合数据(Koffs)。分别在图2A和2B中显示这些分子的BiaCORE结合作用。结果显示，延伸型Fusobody#5对SIRPα具有更高亲合力(基于改善的Koff或kd1)。这项研究结果也反映在表5A列出的结果中，其中与参照CD47-Fc分子相比，延伸型Fusobody显示多达200倍改善的IC50值。
表5A：
实例# 描述 kd1(1/s) KD1(M) kd2(1/s) KD2(M)
#9 CD47-Fc 0.1092 9.39E-07 0.003399 1.29E-05
#5 CD47-抗TNF-α延 0.005089 5.35E-08 0.009904 4.11E-07
伸型Fusobody
4.2细胞因子释放的抑制
表6中显示了抑制TNFα从金黄色葡萄球菌Cowan1粒子刺激的人单核细胞衍生的树状细胞释放的浓度(IC50)。结果显示CD47延伸型Fusobody在功能上以pM效力有效阻断树状细胞活化。这些数据显示在单特异性和双特异性延伸型Fusobody支架中均保留CD47结构域的功能。
表6：
Figure BDA0000438719970000591
Figure BDA0000438719970000601
4.3与TNFα的结合
图3显示尽管向基础性支架抗体的可变域中引入修饰，但是对CD47和TNFα均具有特异性的那些延伸型Fusobody(实例#5和#6)仍可以结合TNFα，在这种情况下引入接头以使CD47结构域与抗TNFα抗体的VH/VL融合。相反，具有CD47特异性的单特异性非延伸型Fusobody(实例#2)不与固定的TNFα结合。这些数据显示75KDa主要抗原如TNFα仍可以被含有不同接头长度的CD47-TNFα-延伸型Fusobody有效地结合。另外，尽管抗原固定到塑料表面上，但与该抗原结合仍是可行的。其他实验已经显示可溶性抗原(TNFα)也可以被其中CD47结构域同时被SIRPα占据的CD47-TNFαFusobody结合和中和(数据未显示)。总之，这些数据证实了本发明延伸型Fusobody的多特异性结合能力。
用于实施本发明的有用的氨基酸和核苷酸序列
表7A:用于实施本发明的氨基酸和核苷酸序列的简要描述
Figure BDA0000438719970000602
Figure BDA0000438719970000621
Figure BDA0000438719970000651
Figure BDA0000438719970000661
表7B:序列表
Figure BDA0000438719970000671
Figure BDA0000438719970000681
Figure BDA0000438719970000701
Figure BDA0000438719970000711
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Figure BDA0000438719970000761
Figure BDA0000438719970000771
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Figure BDA0000438719970000861
Figure BDA0000438719970000871
Figure BDA0000438719970000881
Figure BDA0000438719970000891

Claims (49)

1.一种可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
2.根据权利要求1所述的可溶性蛋白，其中蛋白质针对1、2或3种结合配偶体具有结合特异性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域是相同的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的每个单价区域和每对VH和VL CDR序列对相同的单一抗原具有结合特异性。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的区域能结合抗原上的第一表位，并且每对VH和VL CDR序列能结合相同抗原上的第二表位。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的区域和每对VH和VL CDR序列能结合相同抗原上的相同表位。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对两种抗原具有结合特异性，其中哺乳动物结合分子的每个区域对第一抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第二抗原具有结合特异性。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是不同的。
9.根据权利要求8所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对两种抗原具有结合特异性，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，并且包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第一抗原或第二抗原具有结合特异性。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对三种抗原具有结合特异性，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三抗原具有结合特异性。
11.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是蛋白质、细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、低分子量化合物、配体、细胞表面受体、或其片段。
12.根据权利要求11所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是单体的或同聚的细胞表面受体的胞外结构域。
13.根据权利要求12所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物单体的或同聚的细胞表面受体包含IgSF结构域。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子包含SIRPα结合结构域。
15.根据权利要求14所述的可溶性蛋白，其中所述SIRPα结合结构域选自：
(i)人细胞表面受体CD47的胞外结构域；
(ii)SEQ ID NO:2的衍生的胞外结构域；
(iii)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:57的多肽或其保留SIRPα结合特性的片段；和，
(iv)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:57的或所述片段的变体多肽，所述变体多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPα结合特性。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的两个或多个SIRPα结合结构域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分数。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的可溶性蛋白，其中两个或多个SIRPα结合结构域具有相同的氨基酸序列。
18.如权利要求14至17中任一项所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体内部的SIRPα结合结构域具有相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的可溶性蛋白，其中SIRPα结合结构域是具有选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:57的氨基酸序列的人细胞表面受体CD47的胞外结构域。
20.根据权利要求15所述的可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：
(i)第一单链多肽，其包含：
(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
(b)CD47的胞外结构域的单价区域，所述CD47区域的羧基端与VH区的N末端融合；和
(ii)第二单链多肽，其包含：
(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
(d)CD47的胞外结构域的单价区域，所述CD47区域的羧基端与VL区的N末端融合。
21.根据权利要求20所述的可溶性蛋白，其中CD47的胞外结构域的所述区域是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:57。
22.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中VH和VL CDR序列对TNFα、环孢菌素A或衍生自它们的表位具有结合特异性。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的可溶性蛋白，其以0.05[1/s]或更小的koff(kd1)从结合的人SIRPα解离，如采用双价动力学拟合模型，在BiaCORE测定法中所测量。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的可溶性蛋白，其抑制体外产生的单核细胞衍生的树状细胞中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。
25.根据权利要求24所述的可溶性蛋白，其以0.1nM或更小的IC50抑制体外产生的单核细胞衍生的树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放，如在树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
26.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体的所述第一和第二单链多肽由二硫键共价地连接。
27.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体的所述第一单链多肽包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且所述两个异源二聚体彼此通过所述铰链区处的二硫键稳定缔合。
28.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子的每个区域在肽接头不存在下与其相应的VH序列或VL序列融合。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子的每个区域通过肽接头与其相应的VH序列或VL序列融合。
30.根据权利要求29所述的可溶性蛋白，其中所述肽接头包含5至20个氨基酸。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的可溶性蛋白，其中所述肽接头是甘氨酸和丝氨酸氨基酸的聚合物，优选地是(GGGGS)n，其中n是1和4之间的任何整数，优选地是2。
32.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中抗体的CH1区、CH2区和CH3区衍生自人IgG1、IgG2或IgG4相应区域的沉默突变体，其具有降低的ADCC效应子功能。
33.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述异源二聚体包含：
(i)SEQ ID NO:20的第一单链多肽和SEQ ID NO:21的第二单链多肽；
(ii)SEQ ID NO:22的第一单链多肽和SEQ ID NO:23的第二单链多肽；或
(iii)SEQ ID NO:40的第一单链多肽和SEQ ID NO:41的第二单链多肽。
34.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述第一单链多肽和所述第二单链多肽具有与以下的相应第一单链多肽和第二单链多肽至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性：
(i)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；
(ii)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；或
(iii)SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。
35.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其包含：
(i)由SEQ ID NO:77的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO:78的核苷酸序列编码的轻链；或
(ii)由SEQ ID NO:79的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO:80的核苷酸序列编码的轻链；或
(iii)由SEQ ID NO:97的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO:98的核苷酸序列编码的轻链。
36.包含两个或多个根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白的多价可溶性蛋白复合物，其中如果所述蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是N x6。
37.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用作药物或诊断工具。
38.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于治疗或诊断自身免疫病和/或急性和慢性炎性疾病。
39.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于治疗选自Th2介导的气道炎症、过敏性疾病、哮喘、炎性肠病和关节炎的疾病。
40.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于治疗缺血性疾病、白血病或其他癌症。
41.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于在有需求的受试者中增加造血干细胞植入。
42.药物组合物，其包含与一种或多种可药用载体组合的权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物。
43.根据权利要求42中所述的药物组合物，其额外地包含至少一种其他有效成分。
44.分离的核酸，其编码根据权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白的一个异源二聚体的至少一条单链多肽。
45.根据权利要求44中所述的分离的核酸，或克隆载体或表达载体，其包含选自SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQID NO:97和SEQ ID NO:98的至少一种核酸。
46.适用于产生根据权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物的重组宿主细胞，其包含编码所述蛋白质的所述异源二聚体的所述第一和第二单链多肽和任选地分泌信号的核酸。
47.根据权利要求46所述的重组宿主细胞，其包含稳定整合于基因组中的SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；或SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80；或SEQID NO:97和SEQ ID NO:98的核酸。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞系。
49.用于产生根据权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物的方法，包括在产生所述可溶性蛋白或蛋白质复合物的适宜条件下培养根据权利要求46至48中任一项所述的宿主细胞和分离所述蛋白质。
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