CN113646622A - 用于多价分子的功能分析的基于spr的结合测定 - Google Patents
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- G01N2021/5903—Transmissivity using surface plasmon resonance [SPR], e.g. extraordinary optical transmission [EOT]
Abstract
本文报道了包含第一蛋白质性部分和第二蛋白质性部分的异二聚体融合多肽,其中所述第一蛋白质性部分和所述第二蛋白质性部分是双特异性抗体的第一抗原和第二抗原,所述双特异性抗体包含与所述第一蛋白质性部分特异性结合的第一结合位点和与所述第二蛋白质性部分特异性结合的第二结合位点,其中所述第一蛋白质性部分融合到IgG1亚型的第一抗体重链Fc区多肽的N末端,其中所述第二蛋白质性部分融合到IgG1亚型的第二抗体重链Fc区多肽的N末端,其中所述第一重链Fc区多肽和所述第二重链Fc区多肽形成二硫键连接的异二聚体,其中所述重链Fc区多肽中的一者或两者在其C末端包含用于固定到固相的标签,并且其中所述第一Fc区多肽和所述第二Fc区多肽分别包含突变T366W和T366S/L368A/Y407V;以及所述融合多肽用于在表面等离子体共振方法中确定双特异性抗体对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的用途,所述双特异性抗体包含与所述第一抗原特异性结合的第一结合位点和与所述第二抗原特异性结合的第二结合位点。
Description
本发明属于功能测定领域。本文报道了一种新颖的基于SPR的结合测定,用于测量多特异性抗体与其不同抗原的同时相互作用。该方法特别适用于确定和测量双特异性抗体的基于亲合力的结合强度。
背景技术
SPR(表面等离子体共振)是一种基于生物传感器的技术,以测量实时蛋白质-蛋白质相互作用。SPR技术已成为生物制药研发领域的标准工具(参见,例如,M.A.Cooper,Nat.Rev.Drug Dis.1(2002)515-528;D.G.Myszka,J.Mol.Recognit.12(1999)390-408;R.L.Rich and D.G.Myszka,J.Mol.Recognit.13(2000)388-407;D.G.Myszka andR.L.Rich,Pharm.Sci.Technol.Today 3(2000)310-317;R.Karlsson and A.Faelt,J.Immunol.Meth.200(1997)121-133),并且通常用于确定大分子相互作用的速率常数。确定分子相互作用的缔合和解离动力学的能力提供了关于复合物形成机制的详细见解(参见,例如,T.A.Morton,D.G.Myszka,Meth.Enzymol.295(1998)268-294)。该信息正在成为单克隆抗体和其他生物制药产品的选择和优化过程的重要组成部分(参见,例如,K.Nagataand H.Handa,in Real-time analysis of biomolecular interactions,Springer,2000;R.L.Rich and D.G.Myszka,Curr.Opin.Biotechnol.11(2000)54-61;A.C.Malmborg and C.A.Borrebaeck,J.Immunol.Meth.183(1995)7-13;W.Huber andF.Mueller,Curr.Pharm.Des.12(2006)3999-4021)。此外,SPR技术允许确定例如抗体结合靶标的结合活性(结合能力)。
只有几种技术可以在一种方法中对两种或多种相互作用进行功能评估(例如悬浮阵列技术,综述于Y.Leng,Chem.Soc.Rev 44(2015);时间分辨荧光测定(参见,例如,T-C.Liu,Clin.Biochem.47(2014)439–444))。这些技术利用了不同荧光团的并行检测。此外,还存在光学生物传感器,其允许对多种相互作用进行在线测量,以及由此允许序贯测量(参见,例如,D.G.Myszka,J.Mol.Recognit.12(1999)390-408;R.L.Rich and D.G.Myszka,J.Mol.Recognit.13(2000)388-407;D.G.Myszka and R.L.Rich,Pharm.Sci.Technol.Today 3(2000)310-317;R.Karlsson and A.Faelt,J.Immunol.Meth.200(1997)121-133)。
WO 2009/058564公开了一种动力学测定法,其用于测量涂覆至传感器芯片的二聚体配体(例如hCD80-mIg融合蛋白或hCD86-mIg融合蛋白)和流动相中的二聚体分析物(例如此发明的突变型CTLA-4-Ig融合蛋白)的结合动力学。
WO 2009/062942公开了一种分别对靶标和捕获配体具有不同结合亲和力的半通用的双重亲和多肽,其用于色谱分析。此发明可以使用具有特异性且强固但在正常洗脱条件下不能被破坏的结合域。
WO 2010/112193公开了一种基于SPR的测定,用于确定双特异性抗体<IGF-1R-EGFR>与EGFR和IGF1R的同时结合,其中双特异性抗体固定于芯片。
WO 2011/143545公开了一种基于SPR的测定法,用于确定双特异性抗体对两种不同抗原的同时结合,其中双特异性抗体在固定的抗原-Fc-融合体和可溶性抗原-Fc-融合体之间桥接。
WO 2015/104406公开了通过表面等离子体共振检测多特异性多肽与相应靶标、人Her2和人CTLA-4的结合亲合力,其中生物素化的多特异性多肽被捕获在传感器芯片上。
Meschendoerfer,W.等人公开了能够进行双特异性分子的全功能分析的基于SPR的测定(J.Pharm.Biomed.Anal.132(2016)141-147)。
WO 2016/082044公开了双互补位抗HER2抗体,其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分与同一抗原上的不同表位结合。为了确定双互补位抗HER2抗体的单独互补位与单体和二聚体HER2的结合,将HER2 ECD和HER2-Fc融合体固定在传感器芯片上并与相应的单价单特异性或二价单特异性抗体接触。与此相反,为了确定双互补位二价抗体的顺式和反式结合特性,所述抗体通过抗人Fc抗体固定在传感器芯片上。
WO 2016/059068公开了VEGFR-2结合多肽,特别是产生二聚体成熟Z变体并使用SPR分析对其进行表征。还显示二聚体Z变体能够与在哺乳动物细胞表面上表达的VEGFR-2结合。
WO 2017/027422公开了具有SIRP-α结构域或其变体的构建体。SIRP-α多肽或构建体包括与Fc结构域单体、人血清白蛋白(HSA)、白蛋白结合肽或聚乙二醇(PEG)聚合物融合的SIRP-αD1变体。
US 2014/0193408公开了用作治疗剂的可溶性蛋白质。其特别公开了一种可溶性、多特异性、多价结合蛋白作为主题,该结合蛋白包含两个异二聚体的复合物,其中每个异二聚体基本上由以下各项组成:(i)第一单链多肽,其包括:(a)具有VH、CH1、CH2和CH3区的抗体重链序列;和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区;以及(ii)第二单链多肽,其包括:(c)具有VL和CL区的抗体轻链序列;和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区;其特征在于每对VH和VL CDR序列对抗原具有特异性,使得所述可溶性蛋白质的总价为六。
US 2018/0009892公开了抗ROR1抗体。
WO 2016/004383公开了肿瘤选择性CTLA-4拮抗剂。
发明内容
本文报道了一种新颖的结合测定,用于测量多价抗体与其不同抗原的同时相互作用。该方法特别适用于确定和测量双特异性抗体的基于亲合力的结合强度,包括那些与同一抗原上的两个不同表位结合的双特异性抗体。
本文报道了一种新颖的结合测定,用于测量以其两个结合位点同时结合到相应的一个或多个抗原的至少二价双特异性抗体的基于亲合力的结合强度(即基于亲合结合的结合亲和力的增益)。在一个实施例中,结合测定是ELISA或基于SPR的结合测定。
本文报道了一种新颖的结合测定,用于测量至少二价双特异性抗体的同时结合其靶标/抗原的基于亲合力的结合强度(即基于亲合结合的结合亲和力的增益)。在一个实施例中,结合测定是ELISA或基于SPR的结合测定。
本发明至少部分基于以下发现:可借由使用如下方法将基于亲合力的结合强度与基于亲和力的结合影响分开来确定,在该方法中,两个抗原作为异二聚体分子进行固定(如果是基于SPR的方法,则固定是在芯片表面上;如果是ELISA,则固定是在固相上),即例如使用固定的双特异性抗原,例如作为双特异性Fc融合体。在一个优选实施例中,该方法是基于表面等离子体共振的方法并且两个抗原固定在芯片表面上。
在根据本发明的设置中,其中连接的不同抗原限定固定,即在单独抗原均匀分布的设置中,二价双特异性抗体将同时结合两个抗原,因为两个抗原被适当地隔开。这种限定的同时结合允许独立于亲和结合而确定亲合结合。此外,二聚体/双特异性抗原在任何固定水平下都表现出同质和亲合的相互作用。
将通过连接基连接的融合(不同)抗原固定在生物传感器芯片上,这创造了一个环境,其中两个抗原的单个拷贝彼此非常接近,独立于根据本发明的融合异二聚体抗原的表面密度。这为新应用开辟了道路,例如,
1)亲合相互作用的动力学评估:根据本发明的融合异二聚体抗原允许双特异性抗体的两个靶标的共定位,甚至在融合异二聚体抗原的非常低的表面密度下。为了在不限制传质或干扰再结合的情况下确定动力学结合参数,需要这种具有不同抗原的限定接近的低表面密度(由于抗原中一个抗原的第二拷贝的紧密接近)。
2)样品相对于参考标准品的品质评估:在此设置中,能够进行亲合结合的抗体将始终与两种特异性结合,因为在最初的第一次结合事件后,由于紧密接近,第二结合配偶体的局部浓度大幅增加。亲合力效应对抗体与其抗原的解离速率常数kd有巨大影响,因此可以评估与抗体效能相关的相对活性,只需在SPR测量的解离阶段读出单个响应值即可。由于kd影响平衡浓度,ELISA或类似方法也可以利用这种方法来评估抗体与其所有靶标的双特异性结合能力。
1)和2)之间的区别如下:
-在2的情况下,样品不需要滴定/不滴定;
-在2的情况下,仅需要单一样品浓度来评估相对活性;
-样品评估不依赖于进行动力学拟合。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物的基于亲合力的结合强度的方法,该结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
-根据表面等离子体共振信号的变化确定双特异性结合物的基于亲合力的结合强度,该表面等离子体共振信号通过将包含双特异性结合物的溶液施加到与第一抗原-第二抗原融合多肽缀合的固相而获得。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)在固相上捕获第一抗原-第二抗原融合多肽并确定/测量/确认第一表面等离子体共振响应,
b)向步骤a)的固相施加包含双特异性结合物的溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物并且确定/测量/确认第二表面等离子体共振响应,
c)从第一和第二表面等离子体共振响应之间的差异确定/计算双特异性结合物对第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)在固相上捕获第一抗原-第二抗原融合多肽(并确定/测量/确认基线表面等离子体共振响应),
b)向步骤a)的固相施加包含第一浓度的双特异性结合物的第一溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物并且确定/测量/确认第一表面等离子体共振响应,(由此第一表面等离子体共振响应是通过将双特异性结合物施加到固相而获得的表面等离子体共振响应相对于基线表面等离子体共振响应的变化),
c)解离捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物,并由此再生固相,
d)至少用包含第二浓度的双特异性结合物的第二溶液重复步骤b)和c)并且确定/测量/确认第二表面等离子体共振响应,其中所有浓度均是不同的,
e)从如在先前步骤中确定的表面等离子体共振响应来确定/计算双特异性结合物对第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,至少双特异性结合物是双特异性抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,至少双特异性抗体是双特异性、二价抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,至少双特异性抗体是双特异性、三价抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,至少双特异性抗体是双特异性、四价抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一抗原至少是所述第一抗原的包含双特异性结合物的第一结合位点的表位的片段,并且第二抗原至少是所述第二抗原的包含双特异性结合物的第二结合位点的表位的片段。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一抗原和第二抗原不同。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一和第二抗原是非抗体抗原。术语“非抗体抗原”表示不是衍生自抗体的多肽,即非抗体蛋白,即不包含抗体或其片段的任何部分。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,固相是表面等离子体共振芯片。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第二浓度与第一浓度相差至少2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。
本发明的一个方面是双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽。
根据本发明的这种融合蛋白在本文中被称为“第一抗原-第二抗原融合多肽”。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,根据本发明的融合多肽包含至少第一抗原(包含至少双特异性结合物的第一结合位点的表位)的片段作为第一抗原,以及至少第二抗原(包含至少双特异性结合物的第二结合位点的表位)的片段作为第二抗原。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,根据本发明的融合多肽是线性多肽,其中第一抗原在C末端并且第二抗原在N末端,反之亦然。在一个实施例中,第一抗原和第二抗原通过肽连接基连接。在一个实施例中,肽连接基包含用于固定到固相的标签。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,融合多肽是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体多肽,该第一多肽是第一抗原和包含第一组异二聚化突变的第一抗体重链Fc区多肽的融合多肽,该第二多肽是第二抗原和包含第二组异二聚化突变的第二抗体重链Fc区多肽的融合多肽,第二组异二聚化突变与第一组异二聚化突变互补。在一个实施例中,第一抗原和第二抗原在相应第一或第二Fc区多肽的N末端。在一个实施例中,Fc区多肽中的一者或两者包含用于固定到固相的标签。在一个实施例中,标签位于相应Fc区多肽的C末端。在一个实施例中,Fc区属于人IgG1同种型。在一个实施例中,第一组和第二组异二聚化突变分别是T366W和T366S/L368A/Y407V,反之亦然。在一个实施例中,用于固定的标签是组氨酸标签或生物素。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,融合多肽是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体多肽,该第一多肽是第一抗原和包含第一组异二聚化突变的第一抗体重链恒定区多肽的融合多肽,该第二多肽是第二抗原和包含第二组异二聚化突变的第二抗体重链恒定区多肽的融合多肽,第二组异二聚化突变与第一组异二聚化突变互补。在一个实施例中,第一抗原和第二抗原位于相应第一或第二恒定区多肽的N末端。在一个实施例中恒定区多肽中的一者或两者包含用于固定到固相的标签。在一个实施例中,标签位于相应Fc区多肽的C末端。在一个实施例中,Fc区属于人IgG1同种型。在一个实施例中,第一组和第二组异二聚化突变分别是T366W和T366S/L368A/Y407V,反之亦然。在一个实施例中,用于固定的标签是组氨酸标签或生物素。
因此,一般而言,本发明的一个方面是异二聚体融合多肽,其包含
i)第一蛋白质性部分,和
ii)第二蛋白质性部分,
其中
-第一蛋白质性部分和第二蛋白质性部分是
i)至少双特异性抗体的第一和第二抗原,该至少双特异性抗体包含与第一蛋白质性部分特异性结合的第一结合位点和与第二蛋白质性部分特异性结合的第二结合位点,或
ii)二价单特异性抗体的同一抗原的两个拷贝,
-第一蛋白质性部分融合到IgG1亚型的第一抗体重链Fc区多肽的N末端,
-第二蛋白质性部分融合至IgG1亚型的第二抗体重链Fc区多肽的N末端,
-第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽形成二硫键连接的异二聚体,
-重链Fc区多肽中的一者或两者在其C末端包含用于固定到固相的标签,并且
-第一Fc区多肽和第二Fc区多肽分别包含突变T366W和T366S/L368A/Y407V。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,蛋白质性部分是多肽。
这种异二聚体融合多肽是至少双特异性结合物/抗体的第一抗原和第二抗原的融合多肽。
同样,这种异二聚体融合多肽是二价单特异性结合物/抗体的抗原的两个拷贝的融合多肽。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,根据本发明的融合多肽包含仅一个(即恰好一个)第一抗原和仅一个(即恰好一个)第二抗原。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一抗原和第二抗原不是同一多肽。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一蛋白质性部分和第二蛋白质性部分不是来自同一多肽。
本发明的一个方面是在表面等离子体共振方法中使用根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,以确定至少双特异性结合物对所述第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点。
本发明的一个方面是在ELISA方法中使用根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,以确定至少双特异性结合物对所述第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点。
本发明的一个方面是亲和色谱柱,其包含根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,该融合多肽作为色谱分析配体。
本发明的一个方面是用于将对第一和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物从对同一第一和第二抗原不具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物中分离/纯化的方法,所述对第一和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将包含至少双特异性结合物的溶液施加至根据本发明的亲和色谱柱,所述结合物对第一和第二抗原具有和不具有基于亲合力的结合,
b)从柱中回收对第一和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物,从而将至少双特异性结合物从对同一第一和第二抗原不具有基于亲合力的结合的结合物中分离/纯化。
本发明的一个方面是用于(从产物相关和/或方法相关杂质中)纯化对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物的方法,所述至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将包含对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物(和方法相关和/或产物相关杂质)的溶液施加至根据本发明的亲和色谱柱,
b)任选地洗涤柱,其中对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物保持与柱结合,并且
c)从柱中回收对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物,并由此(从产物相关和/或方法相关杂质中)纯化至少双特异性结合物。
本发明的一个方面是固定在至少一个流动池中的包含根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽的表面等离子体共振芯片。
根据本发明的一个方面是用于生成固定在至少一个流动池中的包含根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽的表面等离子体共振芯片的方法,所述方法包括以下步骤:
-在表面等离子体共振芯片的至少一个流动池中直接或通过特异性结合对来固定根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽。
根据本发明的一个方面是一种用于评估包含至少二价双特异性抗体的样品的品质的方法,所述方法包括以下步骤:
-分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到其上已固定有所述二价双特异性抗体的SPR芯片,并随后监测SPR信号,反之亦然,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,
以及
-将所确定的读数与参考样品进行比较,并由此确定包含所述至少二价双特异性抗体的所述样品的品质,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
在一个实施例中,该方法包括以下步骤:
-分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到其上已固定有所述二价双特异性抗体的SPR芯片,并随后监测SPR信号,反之亦然,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,
-根据相应的样品浓度对结合响应(以共振单位为单位)作图,
-使用2参数线拟合来拟合所获得的图的数据点,并确定y轴截距作为读数,
-通过平行线变换将所确定的读数与以相同方式分析和处理的参考样品的读数进行比较,
由此确定包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
根据本发明的一个方面是用于选择产生/表达/分泌至少二价双特异性抗体的细胞系的方法,所述方法包括以下步骤:
-提供产生/表达/分泌(异源的)至少二价双特异性抗体的大量重组哺乳动物细胞系中的细胞系的分离培养的相应上清液,
-对于每个细胞系,分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到SPR芯片,并随后监测SPR信号,反之亦然,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,来自所述细胞系的培养上清液的所述二价双特异性抗体已固定在所述SPR芯片上
-相互比较所确定的读数,并由此确定由每个细胞系所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质,
以及
-基于所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质来选择至少一个细胞系,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
在一个实施例中,该方法包括以下步骤:
-提供产生/表达/分泌(异源的)至少二价双特异性抗体的大量重组哺乳动物细胞系中的细胞系的分离培养的相应上清液,
-对于每个细胞系,分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到SPR芯片,并随后监测SPR信号,反之亦然,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,来自所述细胞系的培养上清液的所述二价双特异性抗体已固定在所述SPR芯片上,
-根据相应的样品浓度对结合响应(以共振单位为单位)作图,
-使用2参数线拟合来拟合所获得的图的数据点,并确定y轴截距作为读数,由此确定由每个细胞系所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质,
以及
-基于所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质来选择至少一个细胞系,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
在使用SPR之前,所概述的全部方法同样可以用于ELISA形式,其中读数是测定信号(颜色强度)而不是SPR信号。
具体实施方式
本文报道了一种新颖的基于SPR的结合测定,用于测量至少二价或至少双特异性抗体的基于亲合力的结合强度,即基于亲合结合的结合亲和力的增益,该至少二价或至少双特异性抗体分别以其两个结合位点同时结合或结合到其两个靶标/抗原。
本发明至少部分基于以下发现:通过使用基于表面等离子体共振的方法,可以将基于亲合力的结合强度与基于亲和力的结合影响分开来确定,其中二价单特异性抗体的抗原作为二聚体固定在芯片表面上,即使用固定的二价二聚体抗原,例如作为二聚体Fc融合体。
本发明至少部分基于以下发现:通过使用基于表面等离子体共振的方法,可以将基于亲合力的结合强度与基于亲和力的结合影响分开来确定,其中至少双特异性抗体的两个抗原作为双特异性分子固定在芯片表面上,即使用固定的双特异性抗原,例如作为双特异性Fc融合体。
本发明至少部分基于以下发现:通过在SPR芯片表面上呈递共价连接形式的二价单特异性抗体的抗原,可以确定通过与两个结合位点同时结合而获得的亲合力。
本发明至少部分基于以下发现:通过在SPR芯片表面上呈递共价连接形式的至少双特异性结合物的两个抗原,可以确定通过同时双特异性结合而获得的亲合力。
本发明进一步至少部分基于以下发现:利用根据本发明的SPR测定,可以确定二价单特异性或至少双特异性结合物的亲合力驱动的结合改善。这个概念允许选择例如具有增加的靶标特异性的双特异性结合物,并由此减少脱靶结合和副作用。
定义
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于:Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置可根据Kabat,等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号,并且在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体地,将Kabat编号系统(参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL,并且将Kabat的EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3,这在本文中通过在此情况下称为“根据Kabat的EU索引编号”而进一步分类)。
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20%范围。在一个实施例中,术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10%范围。在一个实施例中,术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5%范围。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,否则如本文所用,“结合亲和力”是指内在结合亲和力,其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示,所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此,等效亲和力可以包括不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量,包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用,并且包括各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段,只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
抗体通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链多肽和轻链多肽中的每一者都含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分),该可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。重链多肽和轻链多肽中的每一者都包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带Fcγ受体(FcγR)的细胞(诸如吞噬细胞)或ii)与携带新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合。它还介导与一些因子的结合,这些因子包括经典补体系统的因子,诸如组分(C1q)。抗体重链的恒定结构域包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域,而轻链仅包含一个恒定结构域CL,它可以是κ同种型或λ同种型。
免疫球蛋白轻链或重链的可变结构域又包含不同的区段,即四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1,以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“(与抗原的)结合”表示抗体在体外测定中与其抗原的结合,在结合测定的一个实施例中,其中抗体与表面结合并且抗原与抗体的结合是通过表面等离子体共振(SPR)测量的。结合是指例如抗体对靶标A或靶标B或对捕获分子(例如抗体的抗人Fab捕获)的结合能力的测量。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即,除了可能的变异抗体(例如,含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生,此类变体通常以少量形式呈递)之外,包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备,包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法,以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的抗体可变结构域的区域每一种。通常,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3),并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括:
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991));
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明,否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人编号。
如在本申请中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此,术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如本文所报道的双特异性抗体是“二价”的一个优选实施例。
术语“结合亲和力”表示单个结合位点与其相应靶标的相互作用的强度。实验上,可以确定亲和力,例如通过测量平衡状态下抗体和抗原的缔合(kA)和解离(kD)动力学常数(见图2)。
术语“结合亲合力”表示一个分子(抗体)的多个结合位点与同一靶标的相互作用的组合强度。因此,亲合力是键亲和力的组合协同强度,而不是键的总和。亲合力的必要条件是:分子(例如抗体)或功能性多聚体对一个靶标(抗原)的多价性,-一个可溶性靶标上的多个可接近表位或抗体对各位于多个固定靶标上的一个表位的多重结合。
亲和结合和亲合结合之间的复合物缔合没有区别。然而,亲合结合的复合物解离取决于所涉及的所有结合位点的同时解离。因此,由于亲合结合(与亲和结合相比)引起的结合强度的增加取决于解离动力学/复合物稳定性:复合物稳定性越大(越高),所有相关结合位点同时解离的可能性就越小;对于非常稳定的复合物,亲和结合与亲合结合的差异基本上为零;-复合物稳定性越小(越低),所有相关结合位点同时解离的可能性就越大;亲和结合与亲合结合的差异增加。
多特异性抗体
在某些实施例中,抗体是多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中,结合特异性中的一个针对第一抗原,而另一个针对不同的第二抗原。在某些实施例中,多特异性抗体可以与同一抗原的两个不同的表位结合。多特异性抗体还可用于将细胞毒性剂定位到表达抗原的细胞。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829,以及Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵臼结构”工程化(参见例如US 5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下方法来制备:工程化静电操纵效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004);交联两个或更多个抗体或片段(参见例如US 4,676,980,以及Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83);使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553);使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448);使用单链Fv(scFv)二聚体(Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374);以及如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
抗体或片段也可以是多特异性抗体,如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO2010/145792或WO 2010/145793中所述。
抗体或其片段也可以是如WO 2012/163520中公开的多特异性抗体(也称为“DutaFab”)。
双特异性抗体通常是与同一抗原上的两个不同的、不重叠的表位或与不同抗原上的两个表位特异性结合的抗体分子。
不同的双特异性抗体形式是已知的。
可使用本文报道的方法的示例性双特异性抗体形式是:
-结构域交换形式:包含第一Fab片段和第二Fab片段的多特异性IgG抗体,其中在第一Fab片段中
a)仅CH1和CL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域,并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域);
b)仅VH和VL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CL结构域,并且第一Fab片段的重链包含VL和CH1结构域);或
c)CH1和CL结构域相互替换并且VH和VL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CH1结构域,并且第一Fab片段的重链包含VL和CL结构域);并且
其中第二Fab片段包含轻链和重链,所述轻链包含VL和CL结构域,所述重链包含VH和CH1结构域;
结构域交换抗体可包含第一重链和第二重链,所述第一重链包含CH3结构域,所述第二重链包含CH3结构域,其中两个CH3结构域通过各自的氨基酸取代以互补方式工程化,以支持第一重链和修饰的第二重链的异二聚化,例如如WO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、或WO 2013/096291中公开的(以引用方式并入本文);
-单臂单链形式(=单臂单链抗体):包含第一结合位点和第二结合位点的抗体,所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合,所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合,由此单独的链如下:
-轻链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-组合轻链/重链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有杵突变的CH3)
-重链(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有臼突变的CH3);
-双臂单链形式(=双臂单链抗体):包含第一结合位点和第二结合位点的抗体,所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合,所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合,由此单独的链如下:
-组合轻链/重链1(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有臼突变的CH3)
-组合轻链/重链2(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有杵突变的CH3);
-共同轻链双特异性形式(=共同轻链双特异性抗体):包含第一结合位点和第二结合位点的抗体,所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合,所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合,由此单独的链如下:
-轻链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域)
-重链1(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有臼突变的CH3)
-重链2(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有杵突变的CH3)。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,双特异性抗体是结构域交换抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,双特异性抗体是单臂单链抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,双特异性抗体是双臂单链抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,双特异性抗体是共同轻链双特异性抗体。
现有技术的表面等离子体共振方法
可以例如通过使用BIAcore仪器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)进行表面等离子体共振来研究抗体对相应抗原的动力学结合参数。
简而言之,对于亲和力测量,抗IgG抗体(例如抗人IgG或抗小鼠IgG抗体)通过胺偶联固定在CM5芯片上,用于待分析的相应抗体的捕获和呈递。
例如,大约2000-12000响应单位(RU)的10-30μg/ml抗IgG抗体在BIAcore B4000仪器中以pH 5.0和流速10-30μl/min偶联到CM5传感器芯片的流动池的一些检测点上(例如检测点1和5是活性检测点,检测点2和4是参照检测点,或检测点1和2是反应检测点,检测点3和4是参照检测点等):使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒。
在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES,150mM NaCl,0.005%Tween 20,pH 7.4)、或HBS-EP+(0.01M HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05%v/v表面活性剂PS20,pH 7.4)、或HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005%w/v Tween 20))中,在25℃(或可替代地在12℃至37℃范围内的不同温度下)测量结合。
此后,抗体以10nM至1μM范围内的浓度注射30秒,并与每个流动池的反应检测点结合。
然后根据抗体的亲和力将对应的抗原以各种浓度加入溶液中,例如144nM、48nM、16nM、5.33nM、1.78nM、0.59nM、0.20nM和0nM。
通过以10-30μl/min的流速注射抗原20秒至10分钟来测量缔合。
通过用相应的缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离。
利用制造商的软件和说明,通过1:1Langmuir结合模型来估计KD值。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)用于系统固有基线漂移的校正和噪声信号降低。
根据本发明的方法
新型生物治疗药物诸如双特异性抗体或融合蛋白的日益增加的复杂性对功能表征提出了新的挑战。与标准抗体相比,双特异性单克隆抗体需要考虑两种单独的相互作用。
本文报道了一种新颖的基于SPR的结合测定,用于测量至少双特异性抗体的同时结合其两个靶标/抗原的基于亲合力的结合强度(即基于亲合结合的结合亲和力的增益)。
本发明至少部分基于以下发现:通过使用基于表面等离子体共振的方法,可以将基于亲合力的结合强度与基于亲和力的结合影响分开来确定,其中两个抗原作为双特异性分子固定在芯片表面上,即使用固定的双特异性抗原,例如作为双特异性Fc融合体。
在本发明之前,确定/测量双特异性结合物例如双特异性抗体的基于亲合力的活性是不可能的。确定分离的单特异性结合位点的结合仅提供分离的结合亲和力值但不允许获得结合亲合力值。当将抗原混合物施加至已固定双特异性结合物(例如双特异性抗体)的传感器表面时,情况也是如此。
此外,在本发明之前,确定/测量分离的基于亲合力的结合强度(即限定的亲合力结合值)是不可能的。例如,使用具有抗原随机分布的传感器表面不允许确定/测量限定的基于亲合力的结合强度,因为所获得的结果受到亲和结合的影响。尽管相互作用的异质性随着芯片表面上的捕获试剂密度(即固定水平)的增加而降低,但随机分布芯片上的同质相互作用只能在高密度(响应水平)(即抗原固定水平)下实现,在该抗原固定水平下,结合相互作用的动力学评估是不可能的。
因此,在单独抗原随机固定的SPR设置中,即具有不同抗原的不均匀分布,将有仅结合一个抗原的抗体,因为两个抗原相距太远。这种非限定、非同时结合的结果是确定亲和结合和亲合结合的混合物(参见图2A)。
与此相反,在根据本发明的具有连接抗原的限定固定的SPR设置中,即具有不同抗原的均匀分布,抗体将同时结合两个抗原,因为两个抗原被适当地隔开。这种限定的同时结合允许确定亲合结合(图2B)。此外,双特异性抗原在任何固定水平下都表现出同质和亲合的相互作用。
本发明至少部分基于以下发现:通过在SPR芯片表面上以共价连接的形式呈递至少双特异性结合物的两个抗原,可以确定通过同时双特异性结合而获得的亲合力。
本发明进一步至少部分基于以下发现:利用根据本发明的SPR测定,可以确定至少双特异性结合物的亲合力驱动的选择性增益(ADSG)。这个概念允许选择具有增加的靶特异性的至少双特异性结合物,从而减少脱靶结合和副作用。
已经发现,通过确定和比较至少双特异性结合物(样品)及其各自靶标的解离常数与双特异性靶标的解离常数,可以评估通过同时以所有化合价结合而提供的亲合力增益。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物的基于亲合力的结合强度的方法,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
-根据表面等离子体共振信号的变化确定至少双特异性结合物的基于亲合力的结合强度,该表面等离子体共振信号通过将包含至少双特异性结合物的溶液施加到与第一抗原-第二抗原融合多肽缀合的固相而获得。
当应用本领域已知的标准方法时,不能确定至少双特异性抗体与其两个抗原同时结合的亲合力,因为获得的结果不是决定性的。
图3示意性地示出了通常用于确定至少双特异性抗体的亲合结合的SPR芯片的表面。两个抗原固定不动地未连接。为了捕获,每个抗原都包含一个标签并使用抗标签抗体进行捕获。由此产生随机表面,其包含仅具有第一抗原或仅具有第二抗原或具有两个抗原的抗标签抗体的混合物。因此,没有获得同质表面,而是获得表面上抗原的不均匀分布。
抗原在SPR芯片表面上的这种不均匀分布的结果是无法观察到同质结合。图4示出了由芯片表面上抗原的不均匀分布而导致的不同结合模式:1和2:仅以一个结合位点结合;3:以两个结合位点同时结合到单个复合物;4:以两个结合位点同时结合到两个不同的复合物。因此,最多可以预期至多50%的双特异性抗体同时结合并且至多25%的抗体结合到单个双特异性抗原复合物。
因此,表面上抗原的不均匀分布导致至少双特异性抗体的结合事件的混合,这又导致非结论性传感图。图5示出了在相同条件下使用相同双特异性抗体获得的两个传感图的重叠,不同之处仅在于芯片表面上捕获的抗原的形式:一个是根据现有技术的参考方法使用抗原混合物而获得的,而另一个是根据本发明的方法使用第一和第二抗原的融合多肽而获得的。可以看出,传感图明显不同。仅在根据本发明的方法使用第一和第二抗原的融合多肽而获得的传感图中获得同质且可分析的响应曲线(图6)。在使用参考方法而获得的传感图中,可以看到不同的、重叠的解离过程(以及动力学),这导致了不可分析的响应曲线。
从图7(与图5相同的实验条件;区别仅在于抗原的固定形式)可以看出,用抗原混合物获得的非同质解离动力学是亲合结合和亲和结合事件的混合结果,因为仅使用一个抗原获得相同的传感图。
图5和7中的传感图是在5-15RU的低捕获水平下获得的。提高捕获级别,例如到50-120RU(图8)或甚至300-600RU(图9),不会改变传感图。
使用动力学速率图分析相互作用时可以看到相同的结果。从图10可以看出,只有在应用根据本发明的方法的情况下,才能分析未受影响的亲合结合事件。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,所述至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)在固相上捕获第一抗原-第二抗原融合多肽并确定/测量/确认第一表面等离子体共振响应,
b)向步骤a)的固相施加包含至少双特异性结合物的溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物并且确定/测量/确认第二表面等离子体共振响应,
c)从第一和第二表面等离子体共振响应之间的差异确定/计算至少双特异性结合物对第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,所述至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)在固相上捕获第一抗原-第二抗原融合多肽(并确定/测量/确认基线表面等离子体共振响应),
b)向步骤a)的固相施加包含第一浓度的至少双特异性结合物的第一溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物并且确定/测量/确认第一表面等离子体共振响应,(由此第一表面等离子体共振响应是通过将双特异性结合物施加到固相而获得的表面等离子体共振响应相对于基线表面等离子体共振响应的变化),
c)解离捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物,并由此再生固相,
d)至少用包含第二浓度的至少双特异性结合物的第二溶液重复步骤b)和c)并且确定/测量/确认第二表面等离子体共振响应,由此第一和第二浓度是不同的,
e)从如在先前步骤中确定的表面等离子体共振响应来确定/计算至少双特异性结合物对第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,至少双特异性结合物是双特异性抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一抗原至少是所述第一抗原的包含双特异性结合物的第一结合位点的表位的片段,并且第二抗原至少是所述第二抗原的包含双特异性结合物的第二结合位点的表位的片段。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,固相是表面等离子体共振芯片。
本发明的一个方面是至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽。
根据本发明的这种融合蛋白在本文中被称为“第一抗原-第二抗原融合多肽”。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,根据本发明的融合多肽包含至少第一抗原(包含至少双特异性结合物的第一结合位点的表位)的片段作为第一抗原,以及至少第二抗原(包含至少双特异性结合物的第二结合位点的表位)的片段作为第二抗原。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,根据本发明的融合多肽是线性多肽,其中第一抗原在C末端并且第二抗原在N末端,反之亦然。在一个实施例中,第一抗原和第二抗原通过肽连接基连接。在一个实施例中,肽连接基包含用于固定到固相的标签。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,融合多肽是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体多肽,该第一多肽是第一抗原和包含第一组异二聚化突变的第一抗体重链Fc区多肽的融合多肽,该第二多肽是第二抗原和包含第二组异二聚化突变的第二抗体重链Fc区多肽的融合多肽,第二组异二聚化突变与第一组异二聚化突变互补。在一个实施例中,第一抗原和第二抗原在相应第一或第二Fc区多肽的N末端。在一个实施例中,Fc区多肽中的一者或两者包含用于固定到固相的标签。在一个实施例中,标签位于相应Fc区多肽的C末端。在一个实施例中,Fc区属于人IgG1同种型。在一个实施例中,第一组和第二组异二聚化突变分别是T366W和T366S/L368A/Y407V,反之亦然。在一个实施例中,用于固定的标签在组氨酸标签或生物素上。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,融合多肽是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体多肽,该第一多肽是第一抗原和包含第一组异二聚化突变的第一抗体重链恒定区多肽的融合多肽,该第二多肽是第二抗原和包含第二组异二聚化突变的第二抗体重链恒定区多肽的融合多肽,第二组异二聚化突变与第一组异二聚化突变互补。在一个实施例中,第一抗原和第二抗原位于相应第一或第二恒定区多肽的N末端。在一个实施例中恒定区多肽中的一者或两者包含用于固定到固相的标签。在一个实施例中,标签位于相应Fc区多肽的C末端。在一个实施例中,Fc区属于人IgG1同种型。在一个实施例中,第一组和第二组异二聚化突变分别是T366W和T366S/L368A/Y407V,反之亦然。在一个实施例中,用于固定的标签在组氨酸标签或生物素上。
因此,一般而言,本发明的一个方面是异二聚体融合多肽,其包含
i)第一蛋白质性部分,和
ii)第二蛋白质性部分,
其中
-第一蛋白质性部分和第二蛋白质性部分是至少双特异性抗体的第一抗原和第二抗原,该至少双特异性抗体包含与第一蛋白质性部分特异性结合的第一结合位点和与第二蛋白质性部分特异性结合的第二结合位点,
-第一蛋白质性部分融合到IgG1亚型的第一抗体重链Fc区多肽的N末端,
-第二蛋白质性部分融合至IgG1亚型的第二抗体重链Fc区多肽的N末端,
-所述第一重链Fc区多肽和所述第二重链Fc区多肽形成二硫键连接的异二聚体,
-重链Fc区多肽中的一者或两者在其C末端包含用于固定到固相的标签,并且
-第一Fc区多肽和第二Fc区多肽分别包含突变T366W和T366S/L368A/Y407V。
这种异二聚体融合多肽是至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,根据本发明的融合多肽包含仅一个(即恰好一个)第一抗原和仅一个(即恰好一个)第二抗原。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一抗原和第二抗原不是同一多肽。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一蛋白质性部分和第二蛋白质性部分不是来自同一多肽。
本发明的一个方面是在表面等离子体共振方法中使用根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,以确定至少双特异性结合物对所述第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点。
本发明的一个方面是亲和色谱柱,其包含根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,该融合多肽作为色谱分析配体。
本发明的一个方面是用于将对第一和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物从对同一第一和第二抗原不具有基于亲合力的结合的双特异性结合物中分离/纯化的方法,所述对第一和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将包含至少双特异性结合物的溶液施加至根据本发明的亲和色谱柱,所述结合物对第一和第二抗原具有和不具有基于亲合力的结合,
b)从柱中回收对第一和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物,从而将至少双特异性结合物从对同一第一和第二抗原不具有基于亲合力的结合的双特异性结合物中分离/纯化。
本发明的一个方面是用于(从产物相关和/或方法相关杂质中)纯化对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物的方法,所述至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将包含对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物(和方法相关和/或产物相关杂质)的溶液施加至根据本发明的亲和色谱柱,
b)任选地洗涤柱,其中对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物保持与柱结合,并且
c)从柱中回收对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的至少双特异性结合物,并由此(从产物相关和/或方法相关杂质中)纯化双特异性结合物。
一种表面等离子体共振芯片,其包含根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,该融合多肽固定在至少一个流动池中。
一种生成表面等离子体共振芯片的方法,该表面等离子体共振芯片包含根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽,该融合多肽固定在至少一个流动池中,所述方法包括以下步骤:
-在表面等离子体共振芯片的至少一个流动池中直接或通过特异性结合对来固定根据本发明的至少双特异性结合物的第一抗原和第二抗原的融合多肽。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物的基于亲合力的结合强度的方法,该结合物包括与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
-根据表面等离子体共振信号的变化确定至少双特异性结合物的基于亲合力的结合强度,该表面等离子体共振信号通过将包含第一抗原-第二抗原融合多肽的溶液施加到与双特异性结合物缀合的固相而获得。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,所述至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)在固相上捕获至少双特异性结合物并确定/测量/确认第一表面等离子体共振响应,
b)向步骤a)的固相施加包含第一抗原-第二抗原融合多肽的溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物并且确定/测量/确认第二表面等离子体共振响应,
c)从第一和第二表面等离子体共振响应之间的差异确定/计算至少双特异性结合物对第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度。
本发明的一个方面是用于确定至少双特异性结合物对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,所述至少双特异性结合物包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)在固相上捕获至少双特异性结合物(并确定/测量/确认基线表面等离子体共振响应),
b)向步骤a)的固相施加包含第一浓度的第一抗原-第二抗原融合多肽的第一溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物并且确定/测量/确认第一表面等离子体共振响应,(由此第一表面等离子体共振响应是通过将第一抗原-第二抗原融合多肽施加到固相而获得的表面等离子体共振响应相对于基线表面等离子体共振响应的变化),
c)解离捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-双特异性结合物复合物,并由此再生固相,
d)至少用包含第二浓度的第一抗原-第二抗原融合多肽的第二溶液重复步骤b)和c)并且确定/测量/确认第二表面等离子体共振响应,其中所有浓度均是不同的,
e)从如在先前步骤中确定的表面等离子体共振响应来确定/计算至少双特异性结合物对第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,至少双特异性结合物是双特异性抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,第一抗原至少是所述第一抗原的包含至少双特异性结合物的第一结合位点的表位的片段,并且第二抗原至少是所述第二抗原的包含至少双特异性结合物的第二结合位点的表位的片段。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中,固相是表面等离子体共振芯片。
样品相对于参考品的品质评估
在此设置中,能够进行亲合结合的抗体将始终与两种特异性结合,因为在最初的第一次结合事件后,由于紧密接近,第二结合配偶体的局部浓度大幅增加。亲合力效应对抗体与其抗原的解离速率常数kd有巨大影响,因此可以评估与抗体效能相关的相对活性,只需在SPR测量的解离阶段读出单个响应值即可。由于kd影响平衡浓度,ELISA或类似方法也可以利用这种方法来评估抗体与其所有靶标的双特异性结合能力。
因此,根据本发明的一个方面是一种用于评估包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性的方法,所述方法包括以下步骤:
-分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到其上已固定有二价双特异性抗体的SPR芯片,并随后监测SPR信号,该共价融合多肽在一个末端包含二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含二价双特异性抗体的第二抗原,
以及
-将所确定的读数与参考样品的读数(以相同方式获得)进行比较,并由此确定包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
在一个实施例中,该方法包括以下步骤:
-分别以至少两种不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到其上已固定有二价双特异性抗体的SPR芯片,并随后监测SPR信号,该共价融合多肽在一个末端包含二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含二价双特异性抗体的第二抗原,
-根据相应的样品浓度对结合响应(以共振单位为单位)作图,
-使用2参数线拟合来拟合所获得的图的数据点,并确定y轴截距作为读数,
-通过平行线变换将所确定的读数与参考样品(以相同方式分析)的读数进行比较,并由此确定包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
该方法基于SPR测定。
在第一步中,抗体与所讨论的抗体特异性结合,例如如果所讨论的抗体在其Fc区中包含突变LALA(L234A/L235A)和PG(P329G),则将与样品抗体Fc区中的LALA突变或PG突变特异性结合的抗体根据制造商的说明固定到SPR传感器芯片。在该实例中,使用在Fc区中具有突变P329G和L234A/L235A的结构域交换形式的二价双特异性抗体(在本文中表示为LALAPG;根据Kabat编号)。同样,可以使用Fc区中的任何其他突变,只要有与其特异性结合的捕获试剂即可。
应至少固定16000RU(“响应结合”)以确保抗原捕获不受固定化的限制。以相同方式处理参考对照流动池。最后,两个表面都被封闭。优选的固定缓冲液是HBS-EP+(10mMHEPES,150mM NaCl pH 7.4,GE Healthcare)。
其次,注射二价双特异性抗体。
第三,将根据本发明的抗原1-抗原2Fc区融合体以不同浓度注射到第二流动池上。
检测到SPR信号。抗原1-抗原2Fc区融合体的结合响应(共振单位,RU)与二价双特异性抗体的量相关,并根据所使用的样品浓度范围作图。得到的线性图通过适当的计算机软件(例如XLfit4、IDBS软件)进行分析,该软件拟合2参数线,因此可以确定y轴截距,这相当于生物结合活性(=效能)读数。使用例如平行线变换,可以确定样品与抗体参考标准品相比的相对效能(=可报告效能)。
抗原1和抗原2同时与捕获的二价双特异性抗体结合。靶标结合响应用作最终测定读数。
上述方法旨在满足USP 1032的效能释放测定标准,如Gassner等人所公开(Gassner,C.,et al.J.Pharm.Biomed.Anal.102(2015)144–149)。但是,如果不需要满足USP 1032标准,则测量单个浓度并根据参考标准品的校准曲线对其作图就已足够。
在替代的设置中,根据本发明的一个方面是一种用于评估包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性的方法,所述方法包括以下步骤:
-分别以不同的浓度将包含二价双特异性抗体的溶液施加到其上已固定有共价融合多肽的SPR芯片,并随后监测SPR信号,该共价融合多肽在一个末端包含二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含二价双特异性抗体的第二抗原,
以及
-将所确定的读数与参考样品的读数(以相同方式获得)进行比较,并由此确定包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
在一个实施例中,该方法包括以下步骤:
-分别以至少两种不同的浓度将包含二价双特异性抗体的溶液施加到其上已固定有共价融合多肽的SPR芯片,并随后监测SPR信号,该共价融合多肽在一个末端包含二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含二价双特异性抗体的第二抗原,
-根据相应的样品浓度对结合响应(以共振单位为单位)作图,
-使用2参数线拟合来拟合所获得的图的数据点,并确定y轴截距作为读数,
-通过平行线变换将所确定的读数与参考样品(以相同方式分析)的读数进行比较,并由此确定包含至少二价双特异性抗体的样品的品质/纯度/同质性,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
该方法基于SPR测定。
在第一步中,抗体与抗原1-抗原2Fc区融合体特异性结合,例如如果抗原1-抗原2Fc区融合体在其Fc区中包含突变LALA(L234A/L235A)和PG(P329G),则将与样品抗体Fc区中的LALA突变或PG突变特异性结合的抗体根据制造商的说明固定到SPR传感器芯片。应至少固定16000RU(“响应结合”)以确保抗体捕获不受固定化的限制。以相同方式处理参考对照流动池。最后,两个表面都被封闭。优选的固定缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mMNaCl pH 7.4,GE Healthcare)。
其次,注射根据本发明的抗原1-抗原2Fc区融合体。
第三,以不同浓度注射二价双特异性抗体。
检测到SPR信号。二价双特异性抗体的结合响应(共振单位,RU)与抗原1-抗原2Fc区融合体的量相关,并根据所使用的样品浓度范围作图。得到的线性图通过适当的计算机软件(例如XLfit4、IDBS软件)进行分析,该软件拟合2参数线,因此可以确定y轴截距,这相当于生物结合活性(=效能)读数。使用例如平行线变换,可以确定样品与抗体参考标准品相比的相对效能(=可报告效能)。
捕获的抗原1和抗原2同时与二价双特异性抗体结合。靶标结合响应用作最终测定读数。
上述方法旨在满足USP 1032的效能释放测定标准,如Gassner等人所公开(Gassner,C.,et al.J.Pharm.Biomed.Anal.102(2015)144–149)。但是,如果不需要满足USP 1032标准,则测量单个浓度并根据参考标准品的校准曲线对其作图就已足够。
概述
本发明的至少一部分涉及:
1.一种用于确定至少二价双特异性抗体对其第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,所述方法包括
-根据表面等离子体共振信号确定所述二价双特异性抗体的所述基于亲合力的结合强度,所述SPR信号通过将包含所述二价双特异性抗体的溶液施加到共价融合多肽所缀合的固相并随后监测所述SPR信号而获得,所述共价融合多肽在一个末端包含所述第一抗原并且在不同的第二末端包含所述第二抗原,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
2.根据项1所述的方法,其进一步包括以下步骤:
a)在固相上捕获第一抗原-第二抗原融合多肽,
b)向步骤a)的所述固相施加包含第一浓度的所述二价双特异性抗体的第一溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-二价双特异性抗体复合物并且确定第一表面等离子体共振响应,
c)解离所述捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-二价双特异性抗体复合物,并由此再生所述固相,
d)至少用包含第二浓度的所述二价双特异性抗体的第二溶液重复步骤b)和c)并且确定第二表面等离子体共振响应,其中所有浓度均是不同的,
e)根据如在先前步骤中所确定的所述表面等离子体共振响应来确定所述至少二价双特异性抗体对所述第一抗原和所述第二抗原的所述基于亲合力的结合强度。
3.根据项1至2中任一项所述的方法,其中在一个末端包含第一抗原并且在不同的第二末端包含第二抗原的每个共价融合多肽分别与固相缀合。
4.根据项1至3中任一项所述的方法,其中第一抗原至少是所述第一抗原的包含二价双特异性抗体的第一结合位点的表位的片段,并且第二抗原至少是所述第二抗原的包含二价双特异性抗体的第二结合位点的表位的片段。
5.根据项1至4中任一项所述的方法,其中第一抗原与第二抗原不同。
6.根据项1至5中任一项所述的方法,其中固相是表面等离子体共振芯片。
7.根据项1至6中任一项所述的方法,其中第一抗原-第二抗原融合多肽是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体多肽,该第一多肽是第一抗原和包含第一组异二聚化突变的第一抗体重链Fc区多肽的融合多肽,该第二多肽是第二抗原和包含第二组异二聚化突变的第二抗体重链Fc区多肽的融合多肽,第二组异二聚化突变与第一组异二聚化突变互补。
8.根据项7所述的方法,其中第一抗原和第二抗原在相应第一或第二Fc区多肽的N末端。
9.根据项1至8中任一项所述的方法,其中第一抗原-第二抗原融合多肽包含用于固定到固相的标签。
10.根据项9所述的方法,其中标签在相应Fc区多肽的C末端。
11.根据项7至10中任一项所述的方法,其中Fc区属于人IgG1同种型。
12.根据项7至11中任一项所述的方法,其中第一组和第二组异二聚化突变分别为T366W和T366S/L368A/Y407V,反之亦然。
13.一种异二聚体融合多肽,其包含
i)第一多肽,和
ii)第二多肽,
其中
-所述第一多肽和所述第二多肽是双特异性抗体的第一抗原和第二抗原,所述双特异性抗体包含与所述第一多肽特异性结合的第一结合位点和与所述第二多肽特异性结合的第二结合位点,
-所述第一多肽融合到IgG1亚型的第一抗体重链Fc区多肽的N末端,
-所述第二多肽融合到IgG1亚型的第二抗体重链Fc区多肽的N末端,
-所述第一重链Fc区多肽和所述第二重链Fc区多肽形成二硫键连接的异二聚体,
-所述重链Fc区多肽中的一者或两者在其C末端包含用于固定到固相的标签,
-所述第一Fc区多肽和所述第二Fc区多肽分别包含突变T366W和T366S/L368A/Y407V,并且
-所述第一抗原与所述第二抗原不同。
14.根据项13所述的异二聚体融合多肽用于在表面等离子体共振方法中确定双特异性抗体对所述第一和第二抗原的基于亲合力的结合强度的用途,该双特异性抗体包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点。
15.一种用于从产物相关和/或方法相关杂质中纯化对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体的方法,所述双特异性抗体包含与所述第一抗原特异性结合的第一结合位点和与所述第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将包含对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体以及方法相关和/或产物相关杂质的溶液施加到包含作为色谱分析配体的根据项13所述的异二聚体融合多肽的亲和色谱柱,
b)任选地洗涤所述柱,其中所述对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体保持与所述柱结合,并且
c)从所述柱中回收所述对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体,并由此(从产物相关和/或方法相关杂质中)纯化双特异性抗体。
***
提供以下实例和附图以帮助理解本发明,本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是,在不脱离本发明精神的前提下,可以对阐明的程序进行修改。
附图说明
图1:基于亲和力的结合和基于亲合力的结合的示意图。
图2:A:具有抗原混合物的随机固定的SPR设置。在具有单独抗原的随机固定的SPR设置中,即具有不同抗原的不均匀分布,将存在仅与一个抗原结合的抗体,因为两个抗原相距太远,导致确定亲和结合和亲合结合的混合物。
B:具有连接抗原的非限定固定的SPR设置。在具有连接抗原的限定固定的SPR设置中,即具有不同抗原的均匀分布,抗体将同时与两个抗原结合,因为两个抗原被适当地隔开,导致确定亲合结合。
图3:通过固定未连接抗原获得的SPR芯片的表面的示意图。为了捕获,每个抗原都包含一个标签并使用抗标签抗体进行捕获。由此产生随机表面,其包含仅具有第一抗原或仅具有第二抗原或具有两个抗原的抗标签抗体的混合物。因此,没有获得同质表面,而是获得表面上抗原的不均匀分布。
图4:由SPR芯片表面上抗原的不均匀分布而导致的双特异性抗体的不同结合模式:
1和2:仅与一个结合位点结合;
3:同时以两个结合位点结合到单个复合物;
4:同时以两个结合位点结合到两个不同的复合物。
图5:在相同条件下使用相同双特异性抗体获得的两个传感图的SPR传感图重叠,不同之处仅在于芯片表面上捕获的抗原的形式:
上传感图:使用抗原混合物获得;
下传感图:使用根据本发明的融合多肽获得;
只有在使用根据本发明的方法获得的传感图中才能获得同质且可分析的响应曲线。
固定水平5-15RU。
图6:与图5相同的传感图,带有附加注释。
图7:在相同条件下使用相同双特异性抗体获得的四个传感图的SPR传感图重叠,不同之处仅在于芯片表面上捕获的抗原的形式:
1:仅抗原1;
2:仅抗原2;
3:抗原混合物;
4:根据本发明的融合多肽;
只有在使用根据本发明的方法获得的传感图中才能获得同质且可分析的响应曲线。
(与图5相同的实验条件)
图8:与图7相同,但在50-120RU固定水平下获得。
1:仅抗原1;
2:仅抗原2;
3:抗原混合物;
4:根据本发明的融合多肽;
只有在使用根据本发明的方法获得的传感图中才能获得同质且可分析的响应曲线。
图9:与图7相同,但在300-600RU固定水平下获得。
1:仅抗原1;
2:仅抗原2;
3:抗原混合物;
4:根据本发明的融合多肽;
只有在使用根据本发明的方法获得的传感图中才能获得同质且可分析的响应曲线。
图10:相互作用的动力学速率图:
A:仅抗原1;
B:仅抗原2;
C:根据本发明的融合多肽;
使用相同的双特异性抗体。
实例
设备和试剂
所有SPR实验均在BIAcore T200仪器(GE Healthcare)上于25℃下进行。如果没有另外提及,抗体由Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,Germany)制造。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA,如在Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:Alaboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)或SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)处执行的双链测序来确定DNA序列。
实例1
表达载体、表达和纯化
表达载体
为了表达所述多肽/抗体,应用了用于瞬时表达的表达质粒(例如在HEK293中)。
除抗体/多肽表达盒外,载体还包含:
-复制起点,其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制,以及
-β-内酰胺酶基因,其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
抗体基因的转录单位由以下元件组成:
-5’端的独特限制性位点,
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子,
-之后是内含子A序列,
-人抗体基因的5'非翻译区,
-免疫球蛋白重链信号序列,
-相应的抗体链编码核酸
-具有聚腺苷酸化信号序列的3'非翻译区,以及
-3'端的独特限制性位点。
通过PCR和/或基因合成产生编码如本文所述的抗体和融合多肽的融合基因,并将所述融合基因通过已知的重组方法和技术,通过例如使用相应载体中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行装配。通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染,通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)。
细胞培养技术
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑),John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。
如下所述,通过在悬浮生长的HEK293-F细胞中瞬时共转染相应的表达质粒来表达双特异性抗体和融合多肽。
HEK293系统中的瞬时转染
通过使用Freestyle系统(ThermoFisher)瞬时转染293F细胞来产生所有双特异性抗体和融合多肽。在此将293F细胞在F17培养基中培养,用293Free(Novagen)转染,并在4小时后饲以VPA 4mM和Feed 7,且在16h后饲以0.6%的葡萄糖。此外,使用Expi293FTM表达系统试剂盒(ThermoFisher)。在此,将Expi293FTM细胞在Expi293TM表达培养基中培养,并根据制造商的说明使用ExpiFectamineTM293转染试剂盒进行转染。7天后收获细胞上清液,并通过标准方法纯化。
蛋白质测定
通过使用根据Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数测定280nm处的光密度(OD),来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。
上清液中的抗体浓度测定
通过用蛋白A琼脂糖珠粒(罗氏(Roche))进行免疫沉淀来估计细胞培养物上清液中抗体的浓度。将60μL蛋白A琼脂糖珠粒在TBS-NP40(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl、1%Nonidet-P40)中洗涤三次。随后,将1-15mL的细胞培养上清液施加至在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠粒。在室温下孵育1小时后,将珠粒在Ultrafree-MC-过滤器柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤一次,用0.5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2x PBS,罗氏)洗涤两次,并用0.5mL pH 5.0的100mM柠檬酸钠短暂洗涤四次。通过添加35μl的LDS样品缓冲液(Invitrogen)来洗脱结合的抗体。将一半样品分别与样品还原剂混合或保持不还原,并在70℃下加热10分钟。由此,将5-30μl施加至4-12%Bis-TrisSDS-PAGE(Invitrogen)(使用MOPS缓冲液进行非还原SDS-PAGE,并使用具有抗氧化剂电泳缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液进行还原SDS-PAGE),并用考马斯蓝染色。
通过亲和HPLC色谱法定量地测量细胞培养上清液中的抗体和衍生物的浓度。简而言之,将含有与蛋白质A结合的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加至200mM KH2PO4、100mM柠檬酸钠,pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱,并在Agilent HPLC 1100系统上用200mM NaCl、100mM柠檬酸,pH 2.5从基质中洗脱。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。将纯化的标准IgG1抗体用作标准品。
或者,通过Sandwich-IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简而言之,将StreptaWell High Bind Streptavidin A-96孔微量滴定板(罗氏)用100μL/孔的0.1μg/mL的生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)在室温下包被1小时或在4℃下包被过夜,随后用200μL/孔的PBS、0.05%的吐温(PBST,Sigma)洗涤三次。将100μL/孔的含有相应抗体的PBS(Sigma)稀释系列的细胞培养上清液加入到孔中,并在室温下在微量滴定板振荡器上孵育1-2小时。将孔用200μL/孔的PBST洗涤三次,并用100μl0.1μg/mL的F(ab’)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体,在室温下在微量滴定板振荡器上1-2小时来检测结合的抗体。用200μL/孔的PBST洗去未结合的检测抗体三次,并通过加入100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗体。在Tecan Fluor光谱仪上,在405nm的测量波长(参考波长为492nm)下执行吸光度测定。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之,将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱,之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mMNaCl pH 6.0中将聚集的蛋白与单体抗体分离。将单体抗体级分合并,使用例如MILLIPOREAmicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要),冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen)。具体地,使用10%或4-12%Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和MES(还原凝胶,具有抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
实例2
测定程序
BIAcore T200 CM5传感器芯片是通过使用标准胺偶联(GE Healthcare:胺偶联试剂盒,1型;No.BR100050)根据制造商的说明在流动池三和四上固定大约3000–5000RU的抗HIS抗体(GE Healthcare:His捕获试剂盒;No.28995056)进行制备的。
所有样品周期和前期启动周期都包含四个命令:
1.捕获:10秒稳定期后,将可变溶液以10μl/min的流速注入第二流动池30秒。
2.样品:由四种不同浓度(0.5nM、5nM、50nM、500nM)组成的单循环动力学以30μl/min的流速注入流动池三和四。缔合和解离时间设置为180秒和1200秒。
3.再生:将pH 1.5的100mM甘氨酸-HCl以30μl/min的流速注射到两个流动池中40秒。
4.再生:与上一个命令相同的设置加10秒稳定期。
由四个不同抗原1)单体huAG1-His-tag、2)单体huAG2-His-tag、3)单体huAG1-His-tag和单体huAG2-His-Tag的混合物、以及4)huAG1-huAG2-双特异性-Fc融合-His-tag组成的样品集在捕获步骤中以10nM、100nM和1000nM的不同浓度使用以生成传感器表面。
然后,注射双特异性抗AG1/AG2抗体浓度系列,并使其与单个抗原、抗原混合物以及随后的测量周期中的抗原融合体结合。总是伴随着相应的空白循环供后续参考。
然后使用BIAcore T200评估软件处理所得数据。如果可能,创建1:1郎格缪尔拟合(Langmuir fit)。
实例3
样品相对于参考标准品的品质评估
根据本发明的方法是基于在本实例中举例说明的使用BIAcore仪器(GEHealthcare)的SPR测定。同样可以使用任何其他仪器。
在该实例中,使用在Fc区中具有突变P329G和L234A/L235A的结构域交换形式的二价双特异性抗体(在本文中表示为LALA PG;根据Kabat编号)。同样,可以使用Fc区中的任何其他突变,只要有与其特异性结合的捕获试剂即可。
在第一步中,使用GE Healthcare提供的胺偶联化学过程将靶向Fc区中L234A/L235A突变或P329G突变的抗体固定于CM5传感器芯片。使用0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1:1混合物以5μl/min的流速将流动池活化。将抗LALA抗体或抗PG抗体以50μg/ml的浓度注射到pH 5.0的醋酸钠中1200秒,结果表面密度约为18000RU。应至少固定16000RU(“响应结合”)以确保抗体捕获不受固定化的限制。参考对照流动池以前述相同方式进行处理。最后,通过注射1M乙醇胺/HCl pH 8.5封闭两个表面。使用HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl pH 7.4,GE Healthcare)作为固定缓冲液。
其次,将包含Fc区中LALA PG突变的结构域交换形式的二价双特异性抗体在HBS-EP+(GE Healthcare)中稀释并以5μl/min的流速注射60秒。
第三,以15μg/ml的浓度注射根据本发明的抗原1-抗原2Fc融合体60秒。在30μl/min的流速下,解离时间(用运行缓冲液洗涤)为600秒。所有相互作用均在25℃下进行。
第四,在每个结合循环后,以30μl/min的流速注射10mM NaOH的再生溶液两次,每次30秒,以去除任何非共价结合的蛋白质,然后是40秒的稳定期以稳定基线。
以每秒一个信号的速率检测信号。抗原1-抗原2Fc融合体的结合响应(共振单位,RU)与二价双特异性抗体的量相关,并根据所使用的样品浓度范围作图。得到的线性图通过适当的计算机软件(例如XLfit4、IDBS软件)进行分析,该软件拟合2参数线,因此可以确定y轴截距作为生物结合活性(=效能)读数。在平行线变换之后,可以报告样品与抗体参考标准品相比的相对效能(=可报告效能)。
抗原1和抗原2同时与捕获的二价双特异性抗体结合。靶标结合响应用作最终测定读数。
上述方法旨在满足USP 1032的效能释放测定标准,如Gassner等人所公开(Gassner,C.,et al.J.Pharm.Biomed.Anal.102(2015)144–149)。但是,如果不需要满足USP 1032标准,则测量单个浓度并根据参考标准品的校准曲线对其作图就已足够。
实例4
样品相对于参考标准品的品质评估
根据本发明的方法是基于在本实例中举例说明的使用BIAcore仪器(GEHealthcare)的SPR测定。同样可以使用任何其他仪器。
在该施例中,使用在Fc区中具有突变P329G和L234A/L235A的抗原1-抗原2Fc融合体(在本文中表示为LALA PG;根据Kabat编号)。同样,可以使用Fc区中的任何其他突变,只要有与其特异性结合的捕获试剂即可。
在第一步中,使用GE Healthcare提供的胺偶联化学过程将靶向抗原1-抗原2Fc融合体的Fc区中L234A/L235A突变或P329G突变的抗体固定于CM5传感器芯片。使用0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1:1混合物以5μl/min的流速将流动池活化。将抗LALA抗体或抗PG抗体以50μg/ml的浓度注射到pH 5.0的醋酸钠中1200秒,结果表面密度约为18000RU。应至少固定16000RU(“响应结合”)以确保抗体捕获不受固定化的限制。参考对照流动池以前述相同方式进行处理。最后,通过注射1M乙醇胺/HCl pH 8.5封闭两个表面。使用HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl pH 7.4,GEHealthcare)作为固定缓冲液。
其次,以5μl/min的流速注射根据本发明的抗原1-抗原2Fc融合体60秒。
第三,将结构域交换形式的二价双特异性抗体在HBS-EP+(GE Healthcare)中稀释,并以不同浓度注射60秒,浓度为15μg/ml。在30μl/min的流速下,解离时间(用运行缓冲液洗涤)为600秒。所有相互作用均在25℃下进行。
第四,在每个结合循环后,以30μl/min的流速注射10mM NaOH的再生溶液两次,每次30秒,以去除任何非共价结合的蛋白质,然后是40秒的稳定期以稳定基线。
以每秒一个信号的速率检测信号。二价双特异性抗体的结合响应(共振单位,RU)与抗原1-抗原2Fc融合体的量相关,并根据所使用的样品浓度范围作图。得到的线性图通过适当的计算机软件(例如XLfit4、IDBS软件)进行分析,该软件拟合2参数线,因此可以确定y轴截距作为生物结合活性(=效能)读数。在平行线变换之后,可以报告样品与抗体参考标准品相比的相对效能(=可报告效能)。
捕获的抗原1和抗原2同时与二价双特异性抗体结合。靶标结合响应用作最终测定读数。
上述方法旨在满足USP 1032的效能释放测定标准,如Gassner等人所公开(Gassner,C.,et al.J.Pharm.Biomed.Anal.102(2015)144–149)。但是,如果不需要满足USP 1032标准,则测量单个浓度并根据参考标准品的校准曲线对其作图就已足够。
Claims (19)
1.一种用于确定至少二价双特异性抗体对其第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的方法,所述方法包括
-根据表面等离子体共振信号确定所述二价双特异性抗体的所述基于亲合力的结合强度,所述SPR信号通过将包含所述二价双特异性抗体的溶液施加到共价融合多肽所缀合的固相并随后监测所述SPR信号而获得,所述共价融合多肽在一个末端包含所述第一抗原并且在不同的第二末端包含所述第二抗原,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
2.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括以下步骤:
a)在固相上捕获第一抗原-第二抗原融合多肽,
b)向步骤a)的所述固相施加包含第一浓度的所述二价双特异性抗体的第一溶液以形成捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-二价双特异性抗体复合物并且确定第一表面等离子体共振响应,
c)解离所述捕获的第一抗原-第二抗原融合多肽-二价双特异性抗体复合物,并由此再生所述固相,
d)至少用包含第二浓度的所述二价双特异性抗体的第二溶液重复步骤b)和c)并且确定第二表面等离子体共振响应,其中所有浓度均是不同的,
e)根据如在先前步骤中所确定的所述表面等离子体共振响应来确定所述至少二价双特异性抗体对所述第一抗原和所述第二抗原的所述基于亲合力的结合强度。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中在一个末端包含所述第一抗原并且在不同的第二末端包含所述第二抗原的每个共价融合多肽分别与所述固相缀合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述第一抗原至少是所述第一抗原的包含所述二价双特异性抗体的所述第一结合位点的表位的片段,并且所述第二抗原至少是所述第二抗原的包含所述二价双特异性抗体的所述第二结合位点的表位的片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述固相是表面等离子体共振芯片。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述第一抗原-第二抗原融合多肽是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体多肽,所述第一多肽是所述第一抗原和包含第一组异二聚化突变的第一抗体重链Fc区多肽的融合多肽,所述第二多肽是所述第二抗原和包含第二组异二聚化突变的第二抗体重链Fc区多肽的融合多肽,所述第二组异二聚化突变与所述第一组异二聚化突变互补。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述第一抗原和所述第二抗原在相应的所述第一Fc区多肽或所述第二Fc区多肽的N末端。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述第一抗原-第二抗原融合多肽包含用于固定到固相的标签。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述标签在相应的所述Fc区多肽的C末端。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法,其中所述Fc区属于人IgG1同种型。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法,其中所述第一组异二聚化突变和所述第二组异二聚化突变分别是T366W和T366S/L368A/Y407V,反之亦然。
13.一种异二聚体融合多肽,其包含
i)第一多肽,和
ii)第二多肽,
其中
-所述第一多肽和所述第二多肽是双特异性抗体的第一抗原和第二抗原,所述双特异性抗体包含与所述第一多肽特异性结合的第一结合位点和与所述第二多肽特异性结合的第二结合位点,
-所述第一多肽融合到IgG1亚型的第一抗体重链Fc区多肽的N末端,
-所述第二多肽融合到IgG1亚型的第二抗体重链Fc区多肽的N末端,
-所述第一重链Fc区多肽和所述第二重链Fc区多肽形成二硫键连接的异二聚体,
-所述重链Fc区多肽中的一者或两者在其C末端包含用于固定到固相的标签,
-所述第一Fc区多肽和所述第二Fc区多肽分别包含突变T366W和T366S/L368A/Y407V,并且
-所述第一抗原与所述第二抗原不同。
14.根据权利要求13所述的异二聚体融合多肽用于在表面等离子体共振方法中确定双特异性抗体对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的用途,所述双特异性抗体包含与所述第一抗原特异性结合的第一结合位点和与所述第二抗原特异性结合的第二结合位点。
15.一种用于从产物相关和/或方法相关杂质中纯化对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体的方法,所述双特异性抗体包含与所述第一抗原特异性结合的第一结合位点和与所述第二抗原特异性结合的第二结合位点,所述方法包括以下步骤:
a)将包含所述对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体以及方法相关和/或产物相关杂质的溶液施加到包含作为色谱分析配体的根据权利要求13所述的异二聚体融合多肽的亲和色谱柱,
b)任选地洗涤所述柱,其中所述对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体保持与所述柱结合,并且
c)从所述柱中回收所述对第一抗原和第二抗原具有基于亲合力的结合的双特异性抗体,并由此(从产物相关和/或方法相关杂质中)纯化双特异性抗体。
16.一种用于评估包含至少二价双特异性抗体的样品的品质的方法,所述方法包括以下步骤:
-分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到其上已固定有所述二价双特异性抗体的SPR芯片,并随后监测SPR信号,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,
以及
-将所确定的读数与参考样品进行比较,并由此确定包含所述至少二价双特异性抗体的所述样品的品质,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述方法包括以下步骤
-分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到其上已固定有所述二价双特异性抗体的SPR芯片,并随后监测SPR信号,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,
-根据相应的样品浓度对结合响应作图,
-使用2参数线拟合来拟合所获得的图的数据点,并确定y轴截距作为读数,
-通过平行线变换将所确定的读数与以相同方式分析和处理的参考样品的读数进行比较,
由此确定包含所述至少二价双特异性抗体的所述样品的品质,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
18.一种用于选择产生至少二价双特异性抗体的细胞系的方法,所述方法包括以下步骤:
-提供表达至少二价双特异性抗体的大量重组哺乳动物细胞系中的细胞系的分离培养的相应上清液,
-对于每个细胞系,分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到SPR芯片,并随后监测SPR信号,反之亦然,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,来自所述细胞系的培养上清液的所述二价双特异性抗体已固定在所述SPR芯片上
-相互比较所确定的读数,并由此确定由每个细胞系所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质,
以及
-基于所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质来选择至少一个细胞系,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述方法包括以下步骤
-提供表达至少二价双特异性抗体的大量重组哺乳动物细胞系中的细胞系的分离培养的相应上清液,
-对于每个细胞系,分别以不同的浓度将包含共价融合多肽的溶液施加到SPR芯片,并随后监测SPR信号,反之亦然,所述共价融合多肽在一个末端包含所述二价双特异性抗体的第一抗原并且在不同的第二末端包含所述二价双特异性抗体的第二抗原,来自所述细胞系的培养上清液的所述二价双特异性抗体已固定在所述SPR芯片上,
-根据相应的样品浓度对结合响应作图,
-使用2参数线拟合来拟合所获得的图的数据点,并确定y轴截距作为读数,由此确定由每个细胞系所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质,
以及
-基于所产生的所述至少二价双特异性抗体的相对品质来选择至少一个细胞系,
其中所述至少二价双特异性抗体包含与第一非抗体抗原特异性结合的第一结合位点和与不同的第二非抗体抗原特异性结合的第二结合位点。
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