JP7249432B2 - 多価分子の機能分析のための、sprをベースとする結合アッセイ - Google Patents
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Description
表面プラズモン共鳴(SPR)は、リアルタイムのタンパク質間相互作用を測定するバイオセンサをベースとする技術である。SPR技術は、バイオ医薬品の研究開発において標準的なツールとなっており(例えば、M.A.Cooper,Nat.Rev.Drug Dis.1(2002)515-528;D.G.Myszka,J.Mol.Recognit.12(1999)390-408;R.L.Rich and D.G.Myszka,J.Mol.Recognit.13(2000)388-407;D.G.Myszka and R.L.Rich,Pharm.Sci.Technol.Today 3(2000)310-317;R.Karlsson and A.Faelt,J.Immunol.Meth.200(1997)121-133を参照されたい)、高分子相互作用の速度定数を測定するために一般的に使用されている。分子間相互作用の結合および解離速度を測定する能力は、複合体形成の機構への詳細な洞察を提供する(例えば、T.A.Morton,D.G.Myszka,Meth.Enzymol.295(1998)268-294を参照されたい)。この情報は、モノクローナル抗体および他の生物医薬製品の選択および最適化プロセスの不可欠な部分になりつつある(例えば、K.Nagata and H.Handa,in Real-time analysis of biomolecular interactions,Springer,2000;R.L.Rich and D.G.Myszka,Curr.Opin.Biotechnol.11(2000)54-61;A.C.Malmborg and C.A.Borrebaeck,J.Immunol.Meth.183(1995)7-13;W.Huber and F.Mueller,Curr.Pharm.Des.12(2006)3999-4021を参照されたい)。さらに、SPR技術は、例えば標的に結合する抗体の結合活性(結合能力)の決定を可能にする。
1)強力な相互作用の速度論的評価:本発明の融合ヘテロ二量体抗原によれば、融合ヘテロ二量体抗原の表面密度が非常に低くても、二重特異性抗体の2つの標的の共局在化が可能となる。異なる抗原の所定の近接性を有するこのような低い表面密度は、(抗原の1つの第二のコピーが近接しているために)物質移動を制限することなく、または再結合を妨害することなく、動的結合パラメータを決定するのに必要である。
2)標準品に対するサンプルの品質評価:第二の結合パートナーの局所濃度は、近接に起因して、最初の第一の結合事象の後に大幅に上昇するので、アビド結合が可能な抗体は、この設定では常に両方の特異性に結合する。アビディティ効果は、その抗原に対する抗体の解離速度定数kdに大きな影響を及ぼすため、SPR測定の解離段階で一つの応答値を読み取るだけで、抗体の効力と相関する相対活性を評価することが可能である。kdが平衡濃度に影響を及ぼすので、ELISAまたは同様の方法もまた、このアプローチを利用して、その標的のすべてに対する抗体の二重特異性結合能を評価し得る。
2の場合、サンプルを滴定する必要がない/滴定しない;
2の場合、相対活性を評価するために単一のサンプル濃度のみが必要である;
サンプルの評価は、動力学的適合を行うことを必要としない。
- 前記二重特異性結合剤を含む溶液を、第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドがコンジュゲートされた固相に適用して得られた表面プラズモン共鳴シグナルの変化から、前記二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定することを含む方法である。
a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程、
b)工程a)の固相に、二重特異性結合剤を含む溶液を適用し、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性結合剤複合体を形成し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程、
c)第一および第二の表面プラズモン共鳴応答の差から、前記第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定/算出する工程を含む、方法である。
a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉する(ベースライン表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する)工程、
b)工程a)の固相に、前記二重特異性結合剤を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程(これにより、前記第一の表面プラズモン共鳴応答は、前記二重特異性結合剤を固相に適用することによって得られる前記表面プラズモン共鳴応答の前記ベースライン表面プラズモン共鳴応答への変化である)、
c)前記捕捉した第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
d)前記二重特異性結合剤を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程b)およびc)を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
e)前の工程で決定した表面プラズモン共鳴応答から、第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定/算出する工程を含む、方法である。
i)第一のタンパク質性部分と、
ii)第二のタンパク質性部分と
を含み、
- 前記第一のタンパク質性部分および前記第二のタンパク質性部分は、
i)第一のタンパク質性部分に特異的に結合する第一の結合部位と、第二のタンパク質性部分に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、少なくとも二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原、または
ii)二価の単一特異性抗体の同じ抗原の2つのコピーであり、
- 前記第一のタンパク質性部分が、IgG1サブタイプの第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
- 前記第二のタンパク質性部分が、IgG1サブタイプの第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
- 第一および第二の重鎖Fc領域ポリペプチドは、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成し、
- 重鎖Fc領域ポリペプチドの一方または両方は、固相に固定化されるためのタグをそのC末端に含み、
- 前記第一のFc領域ポリペプチドおよび前記第二のFc領域ポリペプチドは、それぞれ変異T366WおよびT366S/L368A/Y407Vを含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドである。
a)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、および伴わない、少なくとも二重特異性結合剤を含む溶液を、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う少なくとも二重特異性結合剤をカラムから回収し、それにより、同じ第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴わない結合剤から、少なくとも二重特異性結合剤を分離/精製する工程を含む、方法である。
a)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤(ならびにプロセス関連不純物および/または生成物関連不純物)を本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、および
c)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムから回収し、それにより、少なくとも二重特異性結合剤を(生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から)精製する工程を含む、方法である。
- 直接または特異的結合対を介して、表面プラズモン共鳴チップの少なくとも1つのフローセルに、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを固定する工程を含む方法である。
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、またはその前にSPRシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を参照サンプルと比較し、それにより、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質を決定する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、またはその前にSPRシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して(共鳴単位で)結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定する工程、
決定された読み取り値を、平行線変換によって、同じ方法で分析および処理した参照サンプルの読み取り値と比較する工程、
それによって、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質/純度/均一性を決定する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む。
(異種の)少なくとも二価の二重特異性抗体を産生/発現/分泌する多数の組換え哺乳動物細胞株の別々の培養の個々の上清を提供する工程、
各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を1つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングするか、またはその前に、SPRシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を互いに比較し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を決定する工程、
産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも1つの細胞株を選択する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
(異種の)少なくとも二価の二重特異性抗体を産生/発現/分泌する多数の組換え哺乳動物細胞株の別々の培養の個々の上清を提供する工程、
各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を1つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングするか、またはその前に、SPRシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して(共鳴単位で)結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質を決定する工程、
産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも1つの細胞株を選択する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
[本発明1001]
少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する方法であって、
前記二価の二重特異性抗体を含む溶液を、
前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
をコンジュゲートしている固相に適用し、
その後、表面プラズモン共鳴(SPR)シグナルをモニタリングする
ことによって得られる前記SPRシグナルから、前記二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度を測定する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。
[本発明1002]
a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉する工程、
b)工程a)の固相に、前記二価の二重特異性抗体を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性抗体複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を測定する工程、
c)前記捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性抗体複合体を解離させて固相を再生する工程、
d)前記二価の二重特異性抗体を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程b)およびc)を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を測定する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
e)前の工程で測定した前記表面プラズモン共鳴応答から、前記少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、各共有結合性融合ポリペプチドが、前記固相に別々にコンジュゲートされている、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記第一の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第一の結合部位のエピトープを含む前記第一の抗原の少なくとも断片であり、前記第二の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第二の結合部位のエピトープを含む前記第二の抗原の少なくとも断片である、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記第一の抗原が、第二の抗原と異なる、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記固相が、表面プラズモン共鳴チップである、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドが、
前記第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第一のポリペプチド、および
前記第二の抗原と、前記第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第二のポリペプチド
を含む、ヘテロ二量体ポリペプチド
である、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、それぞれの前記第一または第二のFc領域ポリペプチドのN末端にある、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドが、固相への固定化のためのタグを含む、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記タグが、それぞれのFc領域ポリペプチドのC末端にある、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記Fc領域が、ヒトIgG1アイソタイプのものである、本発明1007~1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記第一および前記第二のセットのヘテロ二量体化変異が、それぞれT366WおよびT366S/L368A/Y407Vであるか、またはその逆である、本発明1007~1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
i)第一のポリペプチドと、
ii)第二のポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
- 前記第一のポリペプチドおよび前記第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドに特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のポリペプチドに特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原であり、
- 前記第一のポリペプチドが、IgG1サブタイプの第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端と融合しており、
- 前記第二のポリペプチドが、IgG1サブタイプの第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端と融合しており、
- 前記第一および第二の重鎖Fc領域ポリペプチドが、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成しており、
- 前記重鎖Fc領域ポリペプチドの一方または両方が、固相に固定化されるためのタグをそのC末端に含み、
- 前記第一および第二のFc領域ポリペプチドが、それぞれ変異T366WおよびT366S/L368A/Y407Vを含み、かつ
- 前記第一の抗原が、前記第二の抗原と異なっている、
ヘテロ二量体融合ポリペプチド。
[本発明1014]
第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、前記第一の抗原および前記第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において測定するための、本発明1013のヘテロ二量体融合ポリペプチドの使用。
[本発明1015]
第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、二重特異性抗体を、生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から精製する方法であって、
a)前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体と、プロセス関連不純物および/または生成物関連不純物とを含む溶液を、クロマトグラフィーリガンドとして本発明1013のヘテロ二量体融合ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに、適用する工程、
b)前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、ならびに
c)前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を、前記カラムから回収し、それにより(生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から)二重特異性抗体を精製する工程
を含む、方法。
[本発明1016]
少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を評価する方法であって、
- 前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、および
- 測定された読み取り値を参照サンプルと比較し、それにより、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を判定する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。
[本発明1017]
- 前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、
- それぞれのサンプル濃度に対して結合応答をプロットする工程、
- 得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定する工程、
- 決定された読み取り値を、同じ方法で分析および処理した参照サンプルの読み取り値と、平行線変換によって比較し、それによって、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質を判定する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
本発明1016の方法。
[本発明1018]
少なくとも二価の二重特異性抗体を産生する細胞株を選択する方法であって、
- 少なくとも二価の二重特異性抗体を発現する多数の組換え哺乳動物細胞株の細胞株の別々の培養液の個々の上清を提供する工程、
- 各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングするか、またはその前に、SPRシグナルをモニタリングする工程、
- 測定された読み取りを互いに比較し、それによって、各細胞株によって産生された少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を判定する工程、および
- 産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質に基づいて、少なくとも1つの細胞株を選択する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。
[本発明1019]
- 少なくとも二価の二重特異性抗体を発現する多数の組換え哺乳動物細胞株の細胞株の別々の培養液の個々の上清を提供する工程、
- 各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングするか、またはその前に、SPRシグナルをモニタリングする工程、
- それぞれのサンプル濃度に対して結合応答をプロットする工程、
- 得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を判定する工程、および
- 産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも1つの細胞株を選択する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
本発明1018の方法。
本明細書では、その結合部位の両方、またはその標的/抗原の2つにそれぞれ同時に結合するための少なくとも二価または少なくとも二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度、すなわち、アビド結合に基づく結合アフィニティの増大を測定するための新規なSPRをベースとする結合アッセイを報告する。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Kabat E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)に与えられる。重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed.、Public Health Service,National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)において説明されるKabat番号付けシステムにより番号付けすることができ、本明細書では「Kabatによる番号付け」と称される。具体的には、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed.、Public Health Service,National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)のKabatナンバリングシステム(647~660ページを参照されたい)は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに使用し、Kabat EUインデックスナンバリングシステム(661~723ページを参照されたい)は、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2およびCH3であって、本明細書では、この場合には、「Kabat EUインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている)に使用される。
(a) アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)および96-101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b) アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)および95-102(H3)に存在するCDR(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991));
(c) アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)および93-101(H3)で生じる抗原接触(MacCallumら、J.Mol.Biol.、262:732-745(1996));ならびに
(d) (a)、(b)および/または(c)の組合せ、HVRアミノ酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)および94-102(H3)を含む。
特定の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の1つは第一の抗原に対するものであり、他は、異なる第二の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞障害性物質を局在化させ得る。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
- ドメイン交換形式:第一のFab断片および第二のFab断片を含む多重特異性IgG抗体であって、第一のFab断片において、
a)CH1ドメインとCLドメインが互いに置換されているのみ(すなわち、第一のFab断片の軽鎖はVLドメインおよびCH1ドメインを含み、第一のFab断片の重鎖はVHドメインおよびCLドメインを含む。);
b)VHドメインおよびVLドメインが互いに置換されているのみ(すなわち、第一のFab断片の軽鎖はVHドメインおよびCLドメインを含み、第一のFab断片の重鎖はVLドメインおよびCH1ドメインを含む。);または
c)CH1ドメインとCLドメインが互いに置換され、VHドメインとVLドメインが互いに置換されており(すなわち、第一のFab断片の軽鎖はVHドメインおよびCH1ドメインを含み、第一のFab断片の重鎖はVLドメインおよびCLドメインを含む。);および
第二のFab断片が、VLドメインおよびCLドメインを含む軽鎖と、VHドメインおよびCH1ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換抗体は、CH3ドメインを含む第一の重鎖およびCH3ドメインを含む第二の重鎖を含み得、両方のCH3ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されており、したがって、第一重鎖および修飾第二重鎖のヘテロ二量体化が指示されており、このことは、例えばWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、またはWO2013/096291(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている;
- 一アーム一本鎖形式(=一アーム一本鎖抗体):第一のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである。
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖カッパ定常ドメイン)
- 軽鎖/重鎖の組み合わせ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
- 重鎖(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3);
- 二アーム一本鎖形式(=2アーム一本鎖抗体):第一のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである
- 軽鎖/重鎖の組み合わせ1(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3);
- 軽鎖/重鎖の組み合わせ2(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
- 一般的な軽鎖二重特異性形式(=一般的な軽鎖二重特異性抗体):第一のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第一の結合部位および第二のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第二の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン)
- 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
- 重鎖2(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH 2+ノブ変異を有するCH3)。
それぞれの抗原に対する、抗体の動力学的結合パラメータは、BIAcore装置(GE Healthcare Biosciences AB、Uppsala、Sweden)を用い、表面プラズモン共鳴によって検討された。
二重特異性抗体または融合タンパク質などの新規生物治療薬の複雑さが増大するにつれ、機能的特徴付けのための新たな課題が生じる。標準的な抗体と比較した場合、二重特異性モノクローナル抗体について2つの個々の相互作用を考慮する必要がある。
- 少なくとも二重特異性結合剤を含む溶液を、第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドがコンジュゲートされた固相に適用することによって得られる表面プラズモン共鳴シグナルの変化から、少なくとも二重特異性結合剤のアビディティに基づく結合強度を決定することを含む、方法である。
a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程、
b)工程a)の固相に、二重特異性結合剤を含む溶液を適用し、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を形成し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程、
c)第一および第二の表面プラズモン共鳴応答の差から、前記第一の抗原および第二の抗原に対する少なくとも二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定/算出する工程を含む、方法である。
a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉する(ベースライン表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する)工程、
b)工程a)の固相に、少なくとも二重特異性結合剤を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程(これにより、第一の表面プラズモン共鳴応答は、二重特異性結合剤を固相に適用することによって得られた表面プラズモン共鳴応答のベースライン表面プラズモン共鳴応答への変化である)、
c)前記捕捉した第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
d)少なくとも二重特異性結合剤を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて工程b)およびc)を繰り返し、第一および第二の濃度が異なる第二の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程
e)前の工程で決定した表面プラズモン共鳴応答から、第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤抗体の、アビディティに基づく結合強度を決定/算出する工程を含む、方法である。
i)第一のタンパク質性部分と、
ii)第二のタンパク質性部分と
を含み、
- 第一のタンパク質性部分および第二のタンパク質性部分は、前記第一のタンパク質性部分に特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のタンパク質性部分に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性抗体の、第一および第二の抗原であり、
- 前記第一のタンパク質性部分が、IgG1サブタイプの第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
- 前記第二のタンパク質性部分が、IgG1サブタイプの第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
- 第一および第二の重鎖Fc領域ポリペプチドは、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成し、
- 重鎖Fc領域ポリペプチドの一方または両方は、固相に固定化されるためのタグをそのC末端に含み、
- 前記第一のFc領域ポリペプチドおよび前記第二のFc領域ポリペプチドは、それぞれ変異T366WおよびT366S/L368A/Y407Vを含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドである。
a)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、および伴わない、少なくとも二重特異性結合剤を含む溶液を、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う少なくとも二重特異性結合剤をカラムから回収し、それにより、同じ第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴わない二重特異性結合剤から、少なくとも二重特異性結合剤を分離/精製する工程を含む、方法である。
a)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤(ならびにプロセス関連不純物および/または生成物関連不純物)を本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、および
c)第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムから回収し、それにより、二重特異性結合剤を(生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から)精製する工程を含む、方法である。
- 直接または特異的結合対を介して、表面プラズモン共鳴チップの少なくとも1つのフローセルに、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを固定する工程を含む方法である。
- 第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを含む溶液を、二重特異性結合剤がコンジュゲートされた固相に適用することによって得られる表面プラズモン共鳴シグナルの変化から、アビディティに基づく結合強度を決定することを含む、方法である。
a)少なくとも二重特異性結合剤を固相に捕捉し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程、
b)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを含む溶液を、工程a)の固相に適用し、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を形成し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程、
c)第一および第二の表面プラズモン共鳴応答の差から、前記第一の抗原および第二の抗原に対する少なくとも二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定/算出する工程を含む、方法である。
a)少なくとも二重特異性結合剤を固相に捕捉する(ベースライン表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する)工程、
b)工程a)の固相に、第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを第一の濃度で含む第一の溶液を適用して捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程(これにより、第一の表面プラズモン応答は、
第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相に適用することによって得られるベースライン表面プラズモン共鳴応答への変化である。)、
c)前記捕捉した第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二重特異性結合剤複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
d)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程b)およびc)を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定/測定/確立する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
e)前の工程で決定した表面プラズモン共鳴応答から、第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤抗体の、アビディティに基づく結合強度を決定/算出する工程を含む、方法である。
第二の結合パートナーの局所濃度は、近接に起因して、最初の第一の結合事象の後に大幅に上昇するので、アビド結合が可能な抗体は、この設定では常に両方の特異性に結合する。アビディティ効果は、その抗原に対する抗体の解離速度定数kdに大きな影響を及ぼすため、SPR測定の解離段階で一つの応答値を読み取るだけで、抗体の効力と相関する相対活性を評価することが可能である。kdが平衡濃度に影響を及ぼすので、ELISAまたは同様の方法もまた、このアプローチを利用して、その標的のすべてに対する抗体の二重特異性結合能を評価し得る。
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を(同じ方法で得られた)参照サンプルの読み取り値と比較し、それによって少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質/純度/均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を1つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を、少なくとも2種の異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して(共鳴単位で)結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定する工程、
平行線変換により、決定された読み取り値を参照サンプル(同じ方法で分析された)のものと比較し、それにより、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質/純度/均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
二価の二重特異性抗体を種々の濃度で含む溶液を、二価の二重特性抗体の第一の抗原を1つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドが固定されているSPRチップに別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を(同じ方法で得られた)参照サンプルの読み取り値と比較し、それによって少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質/純度/均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
二価の二重特異性抗体を少なくとも2種の異なる濃度で含む溶液を、二価の二重特性抗体の第一の抗原を1つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドが固定されているSPRチップに別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して(共鳴単位で)結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定する工程、
平行線変換により、決定された読み取り値を参照サンプル(同じ方法で分析された)のものと比較し、それにより、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質/純度/均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
本発明の少なくとも一部は以下に関する。
1.
少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
前記二価の二重特異性抗体を含む溶液を、
前記第一の抗原を1つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
をコンジュゲートしている固相に適用し、
その後、表面プラズモン共鳴(SPR)シグナルをモニタリングする
ことによって得られる前記SPRシグナルから、前記二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度を決定する工程
を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。
a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉する工程、
b)工程a)の前記固相に、前記二価の二重特異性抗体を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性抗体複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定する工程、
c)前記捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性抗体複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
d)前記二価の二重特異性抗体を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程b)およびc)を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
e)前の工程で測定した前記表面プラズモン共鳴応答から、前記少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する工程
を含む、項目1に記載の方法。
前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、各共有結合性融合ポリペプチドが、前記固相に別々にコンジュゲートされている、項目1~2のいずれか1つに記載の方法。
前記第一の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第一の結合部位のエピトープを含む前記第一の抗原の少なくとも断片であり、前記第二の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第二の結合部位のエピトープを含む前記第二の抗原の少なくとも断片である、項目1~3のいずれか1つに記載の方法。
前記第一の抗原が、第二の抗原と異なる、項目1~4のいずれか1つに記載の方法。
前記固相が、表面プラズモン共鳴チップである、項目1~5のいずれか1つに記載の方法。
前記第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドが、
前記第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第一のポリペプチド、および
前記第二の抗原と、前記第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第二のポリペプチド
を含む、ヘテロ二量体ポリペプチド
である、項目1~6のいずれか1つに記載の方法。
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、それぞれの前記第一または第二のFc領域ポリペプチドのN末端にある、項目7に記載の方法。
前記第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドが、固相への固定化のためのタグを含む、項目1~8のいずれか1つに記載の方法。
前記タグが、それぞれのFc領域ポリペプチドのC末端にある、項目9に記載の方法。
前記Fc領域が、ヒトIgG1アイソタイプのものである、請項目7~10のいずれか1つに記載の方法。
前記第一のセットおよび前記第二のセットのヘテロ二量体化変異が、それぞれT366WおよびT366S/L368A/Y407Vであるか、またはその逆である、項目7~11のいずれか1つに記載の方法。
i)第一のポリペプチドと、
ii)第二のポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
- 前記第一のポリペプチドおよび前記第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドに特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のポリペプチドに特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原であり、
- 前記第一のポリペプチドが、IgG1サブタイプの第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端と融合しており、
- 前記第二のポリペプチドが、IgG1サブタイプの第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端と融合しており、
- 前記第一および第二の重鎖Fc領域ポリペプチドが、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成しており、
- 前記重鎖Fc領域ポリペプチドの一方または両方が、固相に固定化されるためのタグをそのC末端に含み、
- 前記第一のFc領域ポリペプチドおよび前記第二のFc領域ポリペプチドが、それぞれ変異T366WおよびT366S/L368A/Y407Vを含み、かつ
- 前記第一の抗原が、前記第二の抗原と異なっている、
ヘテロ二量体融合ポリペプチド。
第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、前記第一の抗原および前記第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において決定するための、項目13に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドの使用。
第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、前記第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、二重特異性抗体を、生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から精製する方法であって、
a)前記第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う二重特異性抗体と、プロセス関連不純物および/または生成物関連不純物とを含む溶液を、クロマトグラフィーリガンドとして項目13に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに、適用する工程、
b)前記第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、ならびに
c)前記第一の抗原および前記第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を、前記カラムから回収し、それにより(生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から)二重特異性抗体を精製する工程
を含む、方法。
SPR実験はすべて、BIAcore T200装置(GE Healthcare)で25℃で行った。抗体は、特に明記しない限り、ドイツ、マンハイムのRoche Diagnostics GmbHによって製造された。
標準的な方法を使用し、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載のように、DNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)またはSequiserve GmbH(Vaterstetten,Germany)で行われた二本鎖シークエンシングによって決定された。
発現ベクター、発現および精製
発現ベクター
記載されたポリペプチド/抗体の発現のために、一過性発現のための発現プラスミド(例えば、HEK293)を適用した。
-- 大腸菌(E.Coli)においてプラスミドの複製を可能にする複製起源、
-- 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
- 5’末端の固有の制限部位
- ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期遺伝子およびプロモーター、
- 続いてイントロンA配列、
- ヒト抗体遺伝子の5’-未翻訳領域、
- 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- 核酸をコードするそれぞれの抗体鎖
- ポリアデニル化シグナル配列を有する3’未翻訳領域、
- 3’末端の固有の制限部位。
標準的な細胞培養技術は、Current Protocols in Cell Biology(2000)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.およびYamada,K.M.(編集)、John Wiley&Sons,Inc.に記載されているように使用した。
すべての二重特異性抗体および融合ポリペプチドは、Freestyle系(ThermoFisher)を用い、293F細胞の一過性トランスフェクションによって作成された。ここで、293F細胞をF17培地中で培養し、293Free(Novagen)でトランスフェクションし、VPA 4mMを用いて4時間後に供給し、16時間後にFeed 7と0.6%のグルコースを供給した。更に、Expi293F(商標)Expression System Kit(ThermoFisher)を使用した。ここで、Expi293F(商標)細胞をExpi293(商標)Expression Medium中で培養し、ExpiFectamine(商標)293 Transfection Kitを用い、製造業者の指示に従って移した。7日後に細胞上清を集め、標準的な方法によって精製した。
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Paceら、Protein Science、1995、4、2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を決定することによって決定された。
細胞培養液の上清中の抗体の濃度は、プロテインAアガロースビーズ(Roche)を用いた免疫沈降によって推定された。60μLのプロテインAアガロースビーズを、TBS-NP40(50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1% Nonident-P40)で3回洗浄した。その後、1~15mLの細胞培養物上清を、TBS-NP40中であらかじめ平衡状態にしたプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間インキュベートした後、ビーズを、Ultrafree-MC-フィルターカラム(Amicon)上で、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2xリン酸緩衝化生理食塩水(2xPBS、Roche)で2回洗浄し、0.5mLの100mMクエン酸Na(pH5.0)で4回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、35μlのNuPAGE(登録商標)LDS Sample Buffer(Invitrogen)を加えることによって溶出させた。サンプルの半分をそれぞれNuPAGE(登録商標)サンプル還元剤と合わせ、または還元させず、70℃で10分間加熱した。その結果、5~30μlを4~12%NuPAGE(登録商標)Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(非還元SDS-PAGE用のMOPS緩衝液および還元SDS-PAGE用のNuPAGE(登録商標)抗酸化ランニング緩衝液添加剤(Invitrogen)を含むMES緩衝液を含む)に適用し、クーマシーブルーで染色した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Protein A Sepharoseカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶離は、pH2.8で達成され、その後、サンプルを即時中和した。凝集したタンパク質は、PBS中での、または20mM ヒスチジン、150mM NaCl(pH6.0)中でのサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えば、MILLIPORE Amicon Ultra(30分子量カットオフ)遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、凍結させ、-20℃または-80℃で保存した。例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、または質量分析による、後続のタンパク質分析および分析による特性決定のために、サンプルの一部を提供した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造元の説明書により使用した。特に、10%または4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)、およびNuPAGE(登録商標)MES(還元型ゲル、NuPAGE(登録商標)酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加)またはMOPS(非還元型ゲル)ランニングバッファーを使用した。
アッセイ手順
BIAcore T200 CM5センサーチップは、製造業者の指示に従って、標準的なアミンカップリング(GE Healthcare:アミンカップリングキット、タイプ1;No.BR100050)を使用してフローセル3および4に約3000~5000RUの抗HIS抗体(GE Healthcare:His捕捉キット;No.28995056)を固定化することによって調製した。
1.捕捉10秒後、安定化期間中、可変溶液を第二のフローセルに、流速10μl/分で30秒間注入した。
2.サンプル:4つの異なる濃度(0.5nM、5nM、50nM、500nM)からなる単一サイクル動態(single cycle kinetic)を30μl/分の流速でフローセル3および4に注入した。結合時間および解離時間を180秒および1200秒に設定した。
3.再生:pH1.5の100mMグリシン-HClを両方のフローセルに、流速30μl/分で40秒間注入した。
4.再生:前のコマンドと同じ設定に10秒の長い期間を加えた。
参照標準に対するサンプルの品質評価
本発明による方法は、BIAcore装置(GE Healthcare)を使用する本実施例に例示されるSPRアッセイをベースとする。他のあらゆる装置も同様に使用し得る。
参照標準に対するサンプルの品質評価
本発明による方法は、BIAcore装置(GE Healthcare)を使用する本実施例に例示されるSPRアッセイをベースとする。他のあらゆる装置も同様に使用し得る。
Claims (19)
- 少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する方法であって、
前記二価の二重特異性抗体を含む溶液を、
第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドをコンジュゲートしている固相に適用し、
その後、表面プラズモン共鳴(SPR)シグナルをモニタリングする
ことによって得られる前記SPRシグナルから、前記二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度を測定する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。 - a)第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドを固相上に捕捉する工程、
b)工程a)の固相に、前記二価の二重特異性抗体を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性抗体複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を測定する工程、
c)前記捕捉された第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチド-二価の二重特異性抗体複合体を解離させて固相を再生する工程、
d)前記二価の二重特異性抗体を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程b)およびc)を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を測定する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
e)前の工程で測定した前記表面プラズモン共鳴応答から、前記少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、各共有結合性融合ポリペプチドが、前記固相に別々にコンジュゲートされている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第一の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第一の結合部位のエピトープを含む前記第一の抗原の少なくとも断片であり、前記第二の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第二の結合部位のエピトープを含む前記第二の抗原の少なくとも断片である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の抗原が、第二の抗原と異なる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固相が、表面プラズモン共鳴チップである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドが、
前記第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第一のポリペプチド、および
前記第二の抗原と、前記第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第二のポリペプチド
を含む、ヘテロ二量体ポリペプチド
である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第一の抗原および前記第二の抗原が、それぞれの前記第一または第二のFc領域ポリペプチドのN末端にある、請求項7に記載の方法。
- 前記第一の抗原-第二の抗原-融合ポリペプチドが、固相への固定化のためのタグを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タグが、それぞれのFc領域ポリペプチドのC末端にある、請求項9に記載の方法。
- 前記Fc領域が、ヒトIgG1アイソタイプのものである、請求項7~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一および前記第二のセットのヘテロ二量体化変異が、それぞれT366WおよびT366S/L368A/Y407Vであるか、またはその逆である、請求項7~11のいずれか一項に記載の方法。
- i)第一のポリペプチドと、
ii)第二のポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
- 前記第一のポリペプチドおよび前記第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドに特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のポリペプチドに特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原であり、
- 前記第一のポリペプチドが、IgG1サブタイプの第一の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端と融合しており、
- 前記第二のポリペプチドが、IgG1サブタイプの第二の抗体重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端と融合しており、
- 前記第一および第二の重鎖Fc領域ポリペプチドが、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成しており、
- 前記重鎖Fc領域ポリペプチドの一方または両方が、固相に固定化されるためのタグをそのC末端に含み、
- 前記第一および第二のFc領域ポリペプチドが、それぞれ変異T366WおよびT366S/L368A/Y407Vを含み、かつ
- 前記第一の抗原が、前記第二の抗原と異なっている、
ヘテロ二量体融合ポリペプチド。 - 第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、前記第一の抗原および前記第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において測定するための、請求項13に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドの使用。
- 第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、二重特異性抗体を、生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から精製する方法であって、
a)前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体と、プロセス関連不純物および/または生成物関連不純物とを含む溶液を、クロマトグラフィーリガンドとして請求項13に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに、適用する工程、
b)前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、ならびに
c)前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を、前記カラムから回収し、それにより(生成物関連不純物および/またはプロセス関連不純物から)二重特異性抗体を精製する工程
を含む、方法。 - 少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を評価する方法であって、
- 前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、および
- 測定された読み取り値を参照サンプルと比較し、それにより、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を判定する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。 - - 前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングする工程、
- それぞれのサンプル濃度に対して結合応答をプロットする工程、
- 得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定する工程、
- 決定された読み取り値を、同じ方法で分析および処理した参照サンプルの読み取り値と、平行線変換によって比較し、それによって、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質を判定する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
請求項16に記載の方法。 - 少なくとも二価の二重特異性抗体を産生する細胞株を選択する方法であって、
- 少なくとも二価の二重特異性抗体を発現する多数の組換え哺乳動物細胞株の別々の培養液の個々の上清を提供する工程、
- 各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングするか、またはその前に、SPRシグナルをモニタリングする工程、
- 測定された読み取りを互いに比較し、それによって、各細胞株によって産生された少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を判定する工程、および
- 産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質に基づいて、少なくとも1つの細胞株を選択する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。 - - 少なくとも二価の二重特異性抗体を発現する多数の組換え哺乳動物細胞株の細胞株の別々の培養液の個々の上清を提供する工程、
- 各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているSPRチップに、
前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を1つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、SPRシグナルをモニタリングするか、またはその前に、SPRシグナルをモニタリングする工程、
- それぞれのサンプル濃度に対して結合応答をプロットする工程、
- 得られたプロットのデータ点を2パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、y軸切片を読み取り値として決定し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を判定する工程、および
- 産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも1つの細胞株を選択する工程
を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
請求項18に記載の方法。
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CN115819572A (zh) * | 2022-03-01 | 2023-03-21 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 分离酶裂解的蛋白水解产物表观基因组定位的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013539461A (ja) | 2010-08-16 | 2013-10-24 | ノビミューン エスアー | 多重特異性多価抗体の生成方法 |
JP2015514102A (ja) | 2012-04-05 | 2015-05-18 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ヒトtweak及びヒトil17に対する二重特異性抗体並びにその使用 |
WO2016059068A1 (en) | 2014-10-13 | 2016-04-21 | Affibody Ab | Vegfr-2 binding polypeptides |
JP2018525382A (ja) | 2015-08-07 | 2018-09-06 | アレキソ セラピューティクス インク. | Sirp−アルファドメインまたはそのバリアントを有する構築物 |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
DK0979281T3 (da) | 1997-05-02 | 2005-11-21 | Genentech Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele |
EP3050963B1 (en) | 2005-03-31 | 2019-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for production of polypeptide by regulation of assembly |
AR060070A1 (es) | 2006-03-24 | 2008-05-21 | Merck Patent Gmbh | Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria |
JP2009541275A (ja) | 2006-06-22 | 2009-11-26 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 二重特異性抗体の生産 |
PT2222697E (pt) | 2007-11-01 | 2013-02-15 | Perseid Therapeutics Llc | Polipeptídeos imunossupressores e ácidos nucleicos |
CA2705334C (en) | 2007-11-12 | 2018-04-17 | Novozymes A/S | Dual affinity polypeptides for purification |
US8227577B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
US8242247B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-08-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US9266967B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
DK2235064T3 (en) | 2008-01-07 | 2016-01-11 | Amgen Inc | A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects |
CN102369215B (zh) | 2009-04-02 | 2015-01-21 | 罗切格利卡特公司 | 包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体 |
PT2417156E (pt) | 2009-04-07 | 2015-04-29 | Roche Glycart Ag | Anticorpos trivalentes, biespecíficos |
EP2424567B1 (en) | 2009-04-27 | 2018-11-21 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Method for making heteromultimeric molecules |
SG176219A1 (en) | 2009-05-27 | 2011-12-29 | Hoffmann La Roche | Tri- or tetraspecific antibodies |
US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
US8703132B2 (en) | 2009-06-18 | 2014-04-22 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific, tetravalent antigen binding proteins |
CN103124743A (zh) | 2009-12-29 | 2013-05-29 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | Ron结合构建物及其使用方法 |
WO2011143545A1 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Rinat Neuroscience Corporation | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them |
DK2635607T3 (da) | 2010-11-05 | 2019-11-18 | Zymeworks Inc | Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet |
PL2726510T3 (pl) | 2011-05-27 | 2023-05-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Kierowanie podwójne |
BR112013031762A2 (pt) * | 2011-06-16 | 2016-09-13 | Novartis Ag | proteínas solúveis para utilização como terapêuticos |
JP6541974B2 (ja) | 2011-12-20 | 2019-07-10 | メディミューン,エルエルシー | 二重特異的抗体足場用改変ポリペプチド |
US9248181B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-02-02 | Merus B.V. | Methods and means for the production of Ig-like molecules |
RU2639287C2 (ru) * | 2012-06-27 | 2017-12-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения |
CN105143262A (zh) * | 2013-04-29 | 2015-12-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法 |
CN105829889B (zh) * | 2013-12-13 | 2019-03-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于测定多价、多特异性分子的生物活性的基于spr的桥接测定法 |
US10927154B2 (en) | 2014-01-13 | 2021-02-23 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
WO2016004383A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | City Of Hope | Tumor-selective ctla-4 antagonists |
WO2016082044A1 (en) | 2014-11-27 | 2016-06-02 | Zymeworks Inc. | Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2 |
EP3297671A4 (en) | 2015-05-18 | 2019-02-06 | Eureka Therapeutics, Inc. | ANTI-ROR1 ANTIBODY |
WO2017097918A1 (en) * | 2015-12-09 | 2017-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for determining the in vivo interaction mode |
SG11201903302UA (en) * | 2016-10-14 | 2019-05-30 | Xencor Inc | Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments |
EP3606562A4 (en) * | 2017-04-03 | 2020-11-11 | Acceleron Pharma Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF SPINAL MUSCLE ATROPHY |
-
2020
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2021
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013539461A (ja) | 2010-08-16 | 2013-10-24 | ノビミューン エスアー | 多重特異性多価抗体の生成方法 |
JP2015514102A (ja) | 2012-04-05 | 2015-05-18 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ヒトtweak及びヒトil17に対する二重特異性抗体並びにその使用 |
WO2016059068A1 (en) | 2014-10-13 | 2016-04-21 | Affibody Ab | Vegfr-2 binding polypeptides |
JP2018525382A (ja) | 2015-08-07 | 2018-09-06 | アレキソ セラピューティクス インク. | Sirp−アルファドメインまたはそのバリアントを有する構築物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Gassner et al.,Development and validation of a novel SPR-based assay principle for bispecific molecules,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2015年,102,144-149 |
JI-HEE HA; ET AL,IMMUNOGLOBULIN FC HETERODIMER PLATFORM TECHNOLOGY: FROM DESIGN TO APPLICATIONS IN THERAPEUTIC ANTIBODIES AND PROTEINS,FRONTIERS IN IMMUNOLOGY,2016年10月06日,VOL:7,PAGE(S):394(1-16),https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00394 |
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