JP2022526555A - 多価分子の機能分析のための、ｓｐｒをベースとする結合アッセイ - Google Patents

多価分子の機能分析のための、ｓｐｒをベースとする結合アッセイ Download PDF

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Abstract

本明細書では、第一のタンパク質性部分と第二のタンパク質性部分とを含むヘテロ二量体融合ポリペプチドが報告され、ここで、前記第一のタンパク質性部分および前記第二のタンパク質性部分は、前記第一のタンパク質性部分に特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のタンパク質性部分に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第一および第二の抗原であり、前記第一のタンパク質性部分は、ＩｇＧ１サブタイプの第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、前記第二のタンパク質性部分は、ＩｇＧ１サブタイプの第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、前記第一および第二の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは、ジスルフィド結合したヘテロ二量体を形成し、前記重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方は、そのＣ末端で固相に固定されるためのタグを含み、前記第一および第二のＦｃ領域ポリペプチドは、それぞれ変異Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む。また、本明細書では、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、前記第一の抗原および前記第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において測定するための、前記融合ポリペプチドの使用が報告される。TIFF2022526555000002.tif90170

Description

本発明は機能アッセイの分野にある。本明細書では、多重特異性抗体とそれらの種々の抗原との同時相互作用を測定するための新規なＳＰＲをベースとする結合アッセイを報告する。この方法は、特に二重特異性抗体のアビディティに基づく結合強度の決定および測定に特に適している。
発明の背景
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、リアルタイムのタンパク質間相互作用を測定するバイオセンサをベースとする技術である。ＳＰＲ技術は、バイオ医薬品の研究開発において標準的なツールとなっており（例えば、Ｍ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓ．１（２００２）５１５－５２８；Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（１９９９）３９０－４０８；Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３（２０００）３８８－４０７；Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ３（２０００）３１０－３１７；Ｒ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｆａｅｌｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２００（１９９７）１２１－１３３を参照されたい）、高分子相互作用の速度定数を測定するために一般的に使用されている。分子間相互作用の結合および解離速度を測定する能力は、複合体形成の機構への詳細な洞察を提供する（例えば、Ｔ．Ａ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９５（１９９８）２６８－２９４を参照されたい）。この情報は、モノクローナル抗体および他の生物医薬製品の選択および最適化プロセスの不可欠な部分になりつつある（例えば、Ｋ．Ｎａｇａｔａ ａｎｄ Ｈ．Ｈａｎｄａ，ｉｎ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００；Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（２０００）５４－６１；Ａ．Ｃ．Ｍａｌｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８３（１９９５）７－１３；Ｗ．Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｆ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１２（２００６）３９９９－４０２１を参照されたい）。さらに、ＳＰＲ技術は、例えば標的に結合する抗体の結合活性（結合能力）の決定を可能にする。
１つの手法で２つ以上の相互作用の機能的評価を可能にする技術は２、３しか利用できない（例えば、Ｙ．Ｌｅｎｇ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ ４４（２０１５）に概説されているサスペンションアレイテクノロジー；時間分解蛍光アッセイ（例えば、Ｔ－Ｃ．Ｌｉｕ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７（２０１４）４３９－４４４を参照されたい））。これらの技術は、種々のフルオロフォアの並列検出を利用する。さらに、複数の相互作用のオンライン測定を可能にし、それによって連続測定が可能な光学バイオセンサが存在する（例えば、Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（１９９９）３９０－４０８；Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３（２０００）３８８－４０７；Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ３（２０００）３１０－３１７；Ｒ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｆａｅｌｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２００（１９９７）１２１－１３３を参照されたい）。
ＷＯ２００９／０５８５６４には、移動相中のセンサーチップおよび二量体分析物（例えば、本発明の変異ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ融合タンパク質）にコーティングされた二量体リガンド（例えば、ｈＣＤ８０－ｍＩｇ融合タンパク質またはｈＣＤ８６－ｍＩｇ融合タンパク質）の結合反応速度を測定するための反応速度アッセイが開示されている。
ＷＯ２００９／０６２９４２には、クロマトグラフィーに使用するための標的および捕捉リガンドに対してそれぞれ異なる結合アフィニティを有する半包括的二重アフィニティポリペプチドが開示されている。特異的で強力であるが、通常の溶出条件下で破壊し得ない結合ドメインを本発明で使用し得る。
ＷＯ２０１０／１１２１９３には、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異性抗体＜ＩＧＦ－１Ｒ－ＥＧＦＲ＞であって、チップに固定されている二重特異性抗体の同時結合を決定するためのＳＰＲをベースとするアッセイが開示されている。
ＷＯ２０１１／１４３５４５には、固定化抗原－Ｆｃ融合物と可溶性抗原－Ｆｃ融合物とを架橋する二重特異性抗体による２つの異なる抗原の同時結合を決定するためのＳＰＲをベースとするアッセイが開示されている。
ＷＯ２０１５／１０４４０６には、ビオチン化多重特異性ポリペプチドをセンサーチップ上に捕捉した表面プラズモン共鳴による、それぞれの標的、ヒトＨｅｒ２およびヒトＣＴＬＡ－４に対する多重特異性ポリペプチドの結合アフィニティの検出が開示されている。
Ｍｅｓｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｗ．らには、二重特異性分子の完全な機能分析を可能にする、ＳＰＲをベースとするアッセイが開示されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３２（２０１６）１４１－１４７）。
ＷＯ２０１６／０８２０４４には、第一の抗原結合部分および第二の抗原結合部分が同じ抗原上の異なるエピトープに結合するバイパラトピック抗ＨＥＲ２抗体が開示されている。バイパラトピック抗ＨＥＲ２抗体の個々の抗原結合部位の単量体および二量体ＨＥＲ２への結合を決定するために、ＨＥＲ２ ＥＣＤおよびＨＥＲ２－Ｆｃ融合物のいずれかをセンサーチップ上に固定化し、それぞれの一価または二価の単一特異性抗体と接触させる。これとは対照的に、二価のバイパラトピック抗体のシス結合特性およびトランス結合特性を決定するために、前記抗体を、抗ヒトＦｃ抗体によってセンサーチップ上に固定化する。
ＷＯ２０１６／０５９０６８には、ＶＥＧＦＲ－２結合ポリペプチドが開示されており、特に二量体成熟Ｚバリアントを作製し、ＳＰＲ分析を使用して特徴付けられている二量体Ｚバリアントはまた、哺乳動物細胞の表面に発現したＶＥＧＦＲ－２に結合し得ることが示されている。
ＷＯ２０１７／０２７４２２には、ＳＩＲＰ－アルファドメインまたはそのバリアントを有する構築物が開示されている。ＳＩＲＰ－アルファポリペプチドまたは構築物には、Ｆｃドメインモノマー、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ペプチド、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーと融合したＳＩＲＰ－アルファＤ１バリアントが含まれる。
米国特許出願公開第２０１４／０１９３４０８号明細書には、治療薬として使用するための可溶性タンパク質が開示されている。２つのヘテロ二量体の複合体を含む可溶性の多重特異性多価結合タンパク質が対象として特に開示され、各ヘテロ二量体は本質的に以下からなる：（ｉ）第一の一本鎖ポリペプチドであって：（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を有する抗体重鎖配列；および（ｂ）ＶＨ領域と融合した哺乳動物結合分子の一価の部分を含む第一の一本鎖ポリペプチド；ならびに（ｉｉ）第二の一本鎖ポリペプチドであって：（ｃ）ＶＬおよびＣＬ領域を有する抗体軽鎖配列；および（ｄ）ＶＬ領域と融合した哺乳動物結合分子の一価の部分であって；ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列の各対が抗原に対する特異性を有し、前記可溶性タンパク質の総結合価が６であることを特徴とする、第二の一本鎖ポリペプチド。
米国特許出願公開第２０１８／０００９８９２号には、抗ＲＯＲ１抗体が開示されている。
ＷＯ２０１６／００４３８３には、腫瘍選択的ＣＴＬＡ－４アンタゴニストが開示されている。
多価抗体とそれらの種々の抗原との同時相互作用を測定するための新規な結合アッセイを本明細書で報告する。この方法は、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合する二重特異性抗体を含む二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度の決定および測定に特に適している。
本明細書では、それぞれの抗原に同時にその結合部位の両方と結合するための少なくとも二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度、すなわち、アビド（ａｖｉｄ）結合に基づく結合アフィニティの増大を測定するための新規結合アッセイが報告される。一実施形態では、結合アッセイはＥＬＩＳＡまたはＳＰＲをベースとする結合アッセイである。
本明細書では、その標的／抗原の両方に同時に結合するための少なくとも二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度、すなわち、アビド結合に基づく結合アフィニティの増大を測定するための新規結合アッセイを報告する。一態様では、結合アッセイはＥＬＩＳＡまたはＳＰＲをベースとする結合アッセイである。
本発明は、少なくとも部分的には、２つの抗原がヘテロ二量体分子として、すなわち、例えば、固定された二重特異性抗原とともに、例えば、二重特異性Ｆｃ融合物として固定されている（ＳＰＲをベースとする方法の固定化がチップ表面上にある場合、およびＥＬＩＳＡ固定化が固相上にある場合）方法を使用することによって、アフィニティに基づく結合の影響から切り離して、アビディティに基づく結合強度を決定し得るという知見に基づく。１つの好ましい実施形態では、方法は表面プラズモン共鳴をベースとする方法であり、２つの抗原はチップ表面に固定化される。
連結された異なる抗原の定義された固定化を伴う本発明による設定、すなわち、個々の抗原が均一に分布する設定では、２つの抗原が適切に離間しているので、二価の二重特異性抗体は両方の抗原に同時に結合する。この定義された同時結合は、アフィン（ａｆｆｉｎｅ）結合とは無関係なアビド結合の決定を可能にする。さらに、二量体／二重特異性抗原は、任意の固定化レベルで均一かつ強力な相互作用を示す。
リンカーを介して連結された融合（異なる）抗原をバイオセンサーチップ上に固定化することにより、本発明による融合ヘテロ二量体抗原の表面密度とは無関係に、２つの抗原の単一コピーが互いに非常に近接した環境がもたらされる。これにより、例えば、以下のような新しい応用への道が開かれる。
１）強力な相互作用の速度論的評価：本発明の融合ヘテロ二量体抗原によれば、融合ヘテロ二量体抗原の表面密度が非常に低くても、二重特異性抗体の２つの標的の共局在化が可能となる。異なる抗原の所定の近接性を有するこのような低い表面密度は、（抗原の１つの第二のコピーが近接しているために）物質移動を制限することなく、または再結合を妨害することなく、動的結合パラメータを決定するのに必要である。
２）標準品に対するサンプルの品質評価：第二の結合パートナーの局所濃度は、近接に起因して、最初の第一の結合事象の後に大幅に上昇するので、アビド結合が可能な抗体は、この設定では常に両方の特異性に結合する。アビディティ効果は、その抗原に対する抗体の解離速度定数ｋｄに大きな影響を及ぼすため、ＳＰＲ測定の解離段階で一つの応答値を読み取るだけで、抗体の効力と相関する相対活性を評価することが可能である。ｋｄが平衡濃度に影響を及ぼすので、ＥＬＩＳＡまたは同様の方法もまた、このアプローチを利用して、その標的のすべてに対する抗体の二重特異性結合能を評価し得る。
１）および２）の違いは、
２の場合、サンプルを滴定する必要がない／滴定しない；
２の場合、相対活性を評価するために単一のサンプル濃度のみが必要である；
サンプルの評価は、動力学的適合を行うことを必要としない。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
－ 前記二重特異性結合剤を含む溶液を、第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドがコンジュゲートされた固相に適用して得られた表面プラズモン共鳴シグナルの変化から、前記二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定することを含む方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
ａ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相上に捕捉し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程、
ｂ）工程ａ）の固相に、二重特異性結合剤を含む溶液を適用し、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二価の二重特異性結合剤複合体を形成し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程、
ｃ）第一および第二の表面プラズモン共鳴応答の差から、前記第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定／算出する工程を含む、方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
ａ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相上に捕捉する（ベースライン表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する）工程、
ｂ）工程ａ）の固相に、前記二重特異性結合剤を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程（これにより、前記第一の表面プラズモン共鳴応答は、前記二重特異性結合剤を固相に適用することによって得られる前記表面プラズモン共鳴応答の前記ベースライン表面プラズモン共鳴応答への変化である）、
ｃ）前記捕捉した第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
ｄ）前記二重特異性結合剤を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程ｂ）およびｃ）を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
ｅ）前の工程で決定した表面プラズモン共鳴応答から、第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定／算出する工程を含む、方法である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、少なくとも二重特異性結合剤は二重特異性抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、少なくとも二重特異性抗体は二重特異性二価抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、少なくとも二重特異性抗体は二重特異性三価抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、少なくとも二重特異性抗体は二重特異性四価抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原は、二重特異性結合剤の第一の結合部位のエピトープを含む第一の抗原の少なくとも断片であり、第二の抗原は、二重特異性結合剤の第二の結合部位のエピトープを含む第二の抗原の少なくとも断片である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は異なる。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は非抗体抗原である。「非抗体抗原」という用語は、抗体に由来しない、すなわち非抗体タンパク質、すなわち抗体またはその断片のいかなる部分をも含まないポリペプチドを表す。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップである。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第二の濃度は、第一の濃度と少なくとも２、３、４、５または１０倍異なる。
本発明の一態様は、二重特異性結合剤の第一の抗原と第二の抗原との融合ポリペプチドである。
本発明によるそのような融合タンパク質は、本明細書では「第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド」と呼ばれる。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、本発明による融合ポリペプチドは、第一の抗原として、少なくとも二重特異性結合剤の第一の結合部位のエピトープを含む第一の抗原の少なくとも１つの断片を含み、第二の抗原として、少なくとも二重特異性結合剤の第二の結合部位のエピトープを含む第二の抗原の少なくとも１つの断片を含む。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、本発明による融合ポリペプチドは、第一の抗原がＣ末端にあり、第二の抗原がＮ末端にあるか、またはその逆である直鎖状ポリペプチドである。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原はペプチドリンカーにより結合している。一実施形態では、ペプチドリンカーは、固相に固定化するためのタグを含む。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、融合ポリペプチドは、第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドポリペプチドとの融合ポリペプチドである第一のポリペプチド、ならびに第二の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである第二のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドである。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原はそれぞれの第一または第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端にある。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方が、固相への固定化のためのタグを含む。一実施形態では、タグはそれぞれのＦｃ領域ポリペプチドのＣ末端にある。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態では、第一のセットおよび第二のセットのヘテロ二量体化変異は、それぞれＴ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖであり、またはその逆である。一実施形態では、固定化のためのタグはヒスチジンタグまたはビオチンである。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、融合ポリペプチドは、第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第一の抗体重鎖定常領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである第一のポリペプチド、ならびに第二の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第二の抗体重鎖定常領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである第二のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドである。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原はそれぞれの第一または第二の定常領域ポリペプチドのＮ末端にある。一実施形態では、定常領域ポリペプチドの一方または両方が、固相への固定化のためのタグを含む。一実施形態では、タグはそれぞれのＦｃ領域ポリペプチドのＣ末端にある。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態では、第一のセットおよび第二のセットのヘテロ二量体化変異は、それぞれＴ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖであり、またはその逆である。一実施形態では、固定化のためのタグはヒスチジンタグまたはビオチンである。
したがって、一般的に言えば、本発明の一態様は、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
ｉ）第一のタンパク質性部分と、
ｉｉ）第二のタンパク質性部分と
を含み、
－ 前記第一のタンパク質性部分および前記第二のタンパク質性部分は、
ｉ）第一のタンパク質性部分に特異的に結合する第一の結合部位と、第二のタンパク質性部分に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、少なくとも二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原、または
ｉｉ）二価の単一特異性抗体の同じ抗原の２つのコピーであり、
－ 前記第一のタンパク質性部分が、ＩｇＧ１サブタイプの第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
－ 前記第二のタンパク質性部分が、ＩｇＧ１サブタイプの第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
－ 第一および第二の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成し、
－ 重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方は、固相に固定化されるためのタグをそのＣ末端に含み、
－ 前記第一のＦｃ領域ポリペプチドおよび前記第二のＦｃ領域ポリペプチドは、それぞれ変異Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、タンパク質性部分はポリペプチドである。
そのようなヘテロ二量体融合ポリペプチドは、少なくとも二重特異性結合剤／抗体の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドである。
同様に、そのようなヘテロ二量体融合ポリペプチドは、二価の単一特異性結合剤／抗体の抗原の２コピーの融合ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、本発明による融合ポリペプチドは、１つのみ、すなわち正確に１つの第一の抗原、および１つのみ、すなわち正確に１つの第二の抗原を含む。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じポリペプチドではない。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一のタンパク質性部分および第二のタンパク質性部分は同じポリペプチドに由来しない。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対する、アビディティに基づく結合強度を決定するための表面プラズモン共鳴法における、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドの使用である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対する、アビディティに基づく結合強度を決定するためのＥＬＩＳＡ法における、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドの使用である。
本発明の一態様は、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドをクロマトグラフィーリガンドとして含むアフィニティークロマトグラフィーカラムである。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤を、同じ第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴わない少なくとも二重特異性結合剤から分離／精製する方法であって、
ａ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、および伴わない、少なくとも二重特異性結合剤を含む溶液を、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う少なくとも二重特異性結合剤をカラムから回収し、それにより、同じ第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴わない結合剤から、少なくとも二重特異性結合剤を分離／精製する工程を含む、方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤を（生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から）精製する方法であって：
ａ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤（ならびにプロセス関連不純物および／または生成物関連不純物）を本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、および
ｃ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムから回収し、それにより、少なくとも二重特異性結合剤を（生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から）精製する工程を含む、方法である。
本発明の一態様は、少なくとも１つのフローセルに固定化された本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを含む表面プラズモン共鳴チップである。
本発明の一態様は、少なくとも１つのフローセルに固定化された本発明の少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを含む表面プラズモン共鳴チップの製造方法であって、
－ 直接または特異的結合対を介して、表面プラズモン共鳴チップの少なくとも１つのフローセルに、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを固定する工程を含む方法である。
本発明の一態様は、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を評価する方法であって、
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、またはその前にＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を参照サンプルと比較し、それにより、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質を決定する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
一実施形態では、方法は、
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、またはその前にＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して（共鳴単位で）結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を２パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、ｙ軸切片を読み取り値として決定する工程、
決定された読み取り値を、平行線変換によって、同じ方法で分析および処理した参照サンプルの読み取り値と比較する工程、
それによって、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質／純度／均一性を決定する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む。
本発明の一態様は、少なくとも二価の二重特異性抗体を産生／発現／分泌する細胞株を選択する方法であって、
（異種の）少なくとも二価の二重特異性抗体を産生／発現／分泌する多数の組換え哺乳動物細胞株の別々の培養の個々の上清を提供する工程、
各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を１つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングするか、またはその前に、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を互いに比較し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を決定する工程、
産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも１つの細胞株を選択する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
一実施形態では、方法は、
（異種の）少なくとも二価の二重特異性抗体を産生／発現／分泌する多数の組換え哺乳動物細胞株の別々の培養の個々の上清を提供する工程、
各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を１つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングするか、またはその前に、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して（共鳴単位で）結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を２パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、ｙ軸切片を読み取り値として決定し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質を決定する工程、
産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも１つの細胞株を選択する工程を含み、
前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
ＳＰＲを使用する前に概説されたすべての方法は、読み取り値がＳＰＲ信号の代わりにアッセイ信号（色強度）であるＥＬＩＳＡフォーマットに同様に採用し得る。
本発明の具体的な実施形態の説明
本明細書では、その結合部位の両方、またはその標的／抗原の２つにそれぞれ同時に結合するための少なくとも二価または少なくとも二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度、すなわち、アビド結合に基づく結合アフィニティの増大を測定するための新規なＳＰＲをベースとする結合アッセイを報告する。
本発明は、少なくとも部分的には、二価の単一特異性抗体の抗原が、二量体として、すなわち、固定化された二価の二量体抗原と共に、例えば二量体Ｆｃ融合物として、チップ表面に固定化されている、表面プラズモン共鳴をベースとする方法を使用することによって、アビディティに基づく結合強度をアフィニティに基づく結合の影響から切り離して決定し得るという知見に基づいている。
本発明は、少なくとも部分的には、少なくとも二重特異性抗体の２つの抗原が、二重特異性分子として、すなわち、固定化二重特異性抗原とともに、例えば二重特異性Ｆｃ融合物としてチップ表面上に固定化されている、表面プラズモン共鳴をベースとする方法を使用することによって、アビディティに基づく結合強度をアフィニティに基づく結合の影響から切り離して決定し得るという知見に基づいている。
本発明は、少なくとも部分的には、共有結合した形態の二価の単一特異性抗体の抗原をＳＰＲチップの表面に提示することによって、両方の結合部位との同時結合によって得られるアビディティを測定することが可能であるという知見に基づく。
本発明は、少なくとも部分的には、ＳＰＲチップの表面上に共有結合した形態で少なくとも二重特異性結合剤の２つの抗原を提示することによって、二重特異性結合によって得られるアビディティを同時に測定することが可能であるという知見に基づく。
本発明はさらに、少なくとも部分的には、本発明によるＳＰＲアッセイを用いて、二価の単一特異性結合剤または少なくとも二重特異性結合剤の結合活性駆動結合改善を決定し得るという知見に基づく。この概念は、例えば、標的特異性が増加し、それによって標的外結合および副反応が減少した二重特異性結合剤の選択を可能にする。
定義
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に与えられる。重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔ番号付けシステムにより番号付けすることができ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０ページを参照されたい）は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３ページを参照されたい）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている）に使用される。
「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を表す。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を表す。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を表す。
「アフィニティ」または「結合アフィニティ」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用する場合、「結合アフィニティ」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合アフィニティを指す。分子Ｘの結合対Ｙに対する分子Ｘのアフィニティは概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価のアフィニティは、異なる速度定数を含み得る。アフィニティは、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で一般的な方法によって測定し得る。アフィニティを測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）、および抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
抗体は一般に、２つのいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、抗原と相互作用し得る結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）食細胞などのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞への、またはｉｉ）ブランベル受容体としても知られる新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞への抗体の結合を媒介する。重鎖の定常領域はまた、成分（Ｃ１ｑ）などの古典的補体系の因子を含むいくつかの因子への結合を媒介する。抗体重鎖の定常ドメインは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むのに対して、軽鎖は、カッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプであり得るただ１つの定常ドメインＣＬを含む。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラスがあり、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
一実施形態では、「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおける、抗体が表面に結合し、抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される結合アッセイにおける、抗体のその抗原への結合を示す。結合は、例えば、標的Ａもしくは標的Ｂに対する、または捕捉分子、例えば、抗体に対する抗ヒトＦａｂ捕捉に対する抗体の結合能の測定を意味する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた（これらに限定されない）多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、および／または構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。本発明の例示的なＨＶＲとして、以下のものが挙げられる。
（ａ） アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）および９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ） アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）および９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；
（ｃ） アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）および９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ） （ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組合せ、ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）および９４－１０２（Ｈ３）を含む。
特に示されない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔらに従って本明細書では番号付けされる。
「価数」との用語は、本出願で使用される場合、（抗体）分子内の特定数の結合部位の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」および「六価」との用語は、（抗体）分子中のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位および６個の結合部位の存在を示す。本明細書において報告されるような二重特異性抗体は、１つの好ましい実施形態では、「二価」である。
「結合アフィニティ」という用語は、単一の結合部位とそのそれぞれの標的との相互作用の強さを表す。実験的には、アフィニティは、例えば平衡状態における抗体と抗原との結合（ｋＡ）および解離（ｋＤ）の速度定数を測定することによって決定し得る（図２参照）。
「結合アビディティ」という用語は、１つの分子（抗体）の複数の結合部位と同じ標的との相互作用の複合強度を表す。したがって、アビディティは、結合の合計ではなく、結合アフィニティの組み合わせた相乗的強度である。アビディティに必要なものは、抗体などの分子、または１つの標的（抗原）に対する機能的多量体の多価性、１つの可溶性標的上の複数のアクセス可能なエピトープ、または様々な固定化標的上のそれぞれ１つのエピトープに対する抗体の複数の結合である。
複合体結合は、アフィン結合とアビド結合との間で異ならない。しかしながら、アビド結合のための複合体解離は、関与するすべての結合部位の同時解離に依存する。したがって、（アフィン結合と比較して）アビド結合による結合強度の増加は、解離速度論／複合体安定性に依存する：複合体安定性が大きい（高い）ほど、関与するすべての結合部位の同時解離は起こりにくい。非常に安定な複合体の場合、アフィン結合対アビド結合の差は本質的に０になる；複合体の安定性が小さい（低い）ほど、関与するすべての結合部位の同時解離である可能性が高い；アフィン結合対アビド結合の差が増大する。
多重特異性抗体
特定の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の１つは第一の抗原に対するものであり、他は、異なる第二の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞障害性物質を局在化させ得る。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７－５４０、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照されたい）、および「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作すること（ＷＯ２００９／０８９００４）；２つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋結合すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）８１－８３参照）；二重特異性抗体を作製するためにロイシンジッパーを使用すること（例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術を使用すること（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えばＧｒｕｂｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）５３６８－５３７４参照）；ならびに例えばＴｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載のように三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。
抗体または断片はまた、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、またはＷＯ２０１０／１４５７９３に記載されているような多重特異性抗体であり得る。
抗体またはその断片は、ＷＯ２０１２／１６３５２０に開示されている多重特異性抗体（「ＤｕｔａＦａｂ」とも呼ばれる）であり得る。
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
異なる二重特異性抗体の形態が知られている。
本明細書に報告されるような方法に使用され得る例示的な二重特異性抗体の形態は以下の通りである。
－ ドメイン交換形式：第一のＦａｂ断片および第二のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第一のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置換されているのみ（すなわち、第一のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、第一のＦａｂ断片の重鎖はＶＨドメインおよびＣＬドメインを含む。）；
ｂ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが互いに置換されているのみ（すなわち、第一のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメインおよびＣＬドメインを含み、第一のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。）；または
ｃ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置換され、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに置換されており（すなわち、第一のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、第一のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む。）；および
第二のＦａｂ断片が、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第一の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第二の重鎖を含み得、両方のＣＨ３ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されており、したがって、第一重鎖および修飾第二重鎖のヘテロ二量体化が指示されており、このことは、例えばＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、またはＷＯ２０１３／０９６２９１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている；
－ 一アーム一本鎖形式（＝一アーム一本鎖抗体）：第一のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである。
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 二アーム一本鎖形式（＝２アーム一本鎖抗体）：第一のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ１（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ２（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性形式（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：第一のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第一の結合部位および第二のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第二の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、二重特異性抗体はドメイン交換抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、二重特異性抗体は１アーム一本鎖抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、二重特異性抗体は２アーム一本鎖抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、二重特異性抗体は一般的な軽鎖二重特異性抗体である。
最先端の表面プラズモン共鳴法
それぞれの抗原に対する、抗体の動力学的結合パラメータは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、表面プラズモン共鳴によって検討された。
簡単に説明すると、アフィニティ測定のために、抗ＩｇＧ抗体、例えば抗ヒトＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ抗体を、分析されるそれぞれの抗体の捕捉および提示のためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。
例えば、１０～３０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ抗体の約２０００～１２０００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによって、１０～３０μｌ／分でｐＨ５．０のＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００機器内のＣＭ５センサーチップのフローセル（例えば、スポット１および５は活性であり、スポット２および４は参照スポットであるか、またはスポット１および２は反応性であり、スポット３および４は参照スポットであるなどである）のいくつかのスポット上にカップリングさせる。
結合は、２５℃（またはその代わりに１２℃～３７℃の範囲の異なる温度で）のＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）、またはＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤ＰＳ２０、ｐＨ７．４）、またはＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０））中で測定される。
その後、抗体を１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度で３０秒間注入し、各フローセルの反応スポットに結合させた。
次いで、対応する抗原を、抗体のアフィニティに応じて、例えば１４４ｎＭ、４８ｎＭ、１６ｎＭ、５．３３ｎＭ、１．７８ｎＭ、０．５９ｎＭ、０．２０ｎＭおよび０ｎＭなどの様々な濃度で溶液中に添加する。
結合は、１０～３０μｌ／分の流速で２０秒～１０分の抗原注入によって測定される。
解離は、チップ表面をそれぞれの緩衝液で３～１０分間洗浄することによって測定される。
ＫＤ値は、製造業者のソフトウェアおよび説明書を使用して１：１ラングミュア結合モデルを使用して推定される。システム固有のベースラインドリフトの補正およびノイズシグナル低減のために、サンプル曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。
本発明による方法
二重特異性抗体または融合タンパク質などの新規生物治療薬の複雑さが増大するにつれ、機能的特徴付けのための新たな課題が生じる。標準的な抗体と比較した場合、二重特異性モノクローナル抗体について２つの個々の相互作用を考慮する必要がある。
本明細書では、その標的／抗原の両方に同時に結合するための少なくとも二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度、すなわち、アビド結合に基づく結合アフィニティの増大を測定するための新規なＳＰＲをベースとする結合アッセイを報告する。
本発明は、少なくとも部分的には、２つの抗原が、チップ表面上に二重特異性分子として、すなわち、固定化二重特異性抗原とともに、例えば二重特異性Ｆｃ融合物として固定化される、表面プラズモン共鳴をベースとする方法を使用することによって、アビディティに基づく結合強度をアフィニティに基づく結合の影響から切り離して決定し得るという知見に基づいている。
本発明以前には、二重特異性抗体などの二重特異性結合剤のアビディティに基づく活性の決定／測定は不可能であった。単離された単一特異的結合部位の結合の決定は、単離された結合アフィニティ値のみを提供し、結合アビディティ値を得ることを可能にしなかった。これは、二重特異性結合剤、例えば二重特異性抗体が固定化されたセンサ表面に抗原の混合物を適用する場合にも当てはまる。
さらに、本発明以前には、アビディティに基づく結合強度のみを、すなわちアビディティ結合値を限定して決定／測定することは不可能であった。例えば、抗原のランダムな分布を有するセンサ表面の使用は、得られた結果がアフィン結合の影響によって損なわれたため、アビディティに基づく結合強度を限定して決定／測定することを可能にしなかった。相互作用の不均一性は、チップ表面上の捕捉試薬密度、すなわち固定化レベルが増加するにつれて減少するが、ランダムな分配チップ上の均一な相互作用は、結合相互作用の速度論的評価が不可能な高密度（応答レベル）、すなわち抗原固定化レベルでのみ達成し得る。
例えば、個々の抗原のランダムな固定化を伴うＳＰＲ設定、すなわち異なる抗原の不均一な分布を有するＳＰＲ設定では、２つの抗原が離れすぎているため、１つの抗原にのみ結合する抗体が存在する。この限定されていない非同時結合により、アフィン結合とアビジン結合との混合物の決定がもたらされる（図２Ａを参照）。
これとは対照的に、連結された抗原の明確な固定化、すなわち異なる抗原の均一な分布を有する本発明によるＳＰＲ装置では、２つの抗原が適切に離間しているため、抗体は両方の抗原に同時に結合する。この定義された同時結合により、アビド結合の決定が可能になる（図２Ｂ）。さらに、二重特異性抗原は、任意の固定化レベルで均一かつアビドな相互作用を示す。
本発明は、少なくとも部分的には、ＳＰＲチップの表面上に共有結合した形態で少なくとも二重特異性結合剤の２つの抗原を提示することによって、二重特異性結合によって得られるアビディティを同時に測定することが可能であるという知見に基づく。
本発明はさらに、少なくとも部分的には、本発明によるＳＰＲアッセイを用いて、少なくとも二重特異性結合剤のアビディティ駆動選択的増加（ＡＤＳＧ）を決定し得るという知見に基づく。この概念は、標的特異性が増加し、それによって標的外結合および副反応が減少した少なくとも二重特異性結合剤の選択を可能にする。
少なくとも二重特異性結合剤（サンプル）およびそれらの個々の標的の解離定数を決定し、二重特異性標的の解離定数と比較することによって、同時にすべての原子価と結合することによってもたらされるアビディティの増大を評価し得ることが見出された。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤のアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
－ 少なくとも二重特異性結合剤を含む溶液を、第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドがコンジュゲートされた固相に適用することによって得られる表面プラズモン共鳴シグナルの変化から、少なくとも二重特異性結合剤のアビディティに基づく結合強度を決定することを含む、方法である。
当技術分野で公知の標準的なアプローチを適用する場合、得られた結果は決定的ではないので、少なくとも二重特異性抗体のその２つの抗原への同時結合のアビディティを決定することはできない。
図３は、少なくとも二重特異性抗体のアビド結合の決定に一般的に使用されるＳＰＲチップの表面を概略的に示す。２つの抗原は、連結されずに固定化される。捕捉のために、各抗原はタグを含み、抗タグ抗体を使用して捕捉される。それにより、第一の抗原のみまたは第二の抗原のみまたは両方の抗原との抗タグ抗体の混合物を含むランダムな表面が生成される。したがって、均一な表面ではなく、表面上の抗原の不均一な分布が得られる。
ＳＰＲチップ表面上の抗原のこの不均一な分布は、結果として、均一な結合を観察することができない。図４は、チップ表面上の抗原の不均一な分布から生じる、以下のような種々の結合様式を示す。１および２：１つの結合部位のみとの結合；３：単一複合体への２つの結合部位との同時結合；４：２つの異なる複合体への２つの結合部位との同時結合。したがって、多くとも５０％の二重特異性抗体が同時に結合し、多くとも２５％の抗体が単一の二重特異性抗原複合体に結合すると予想され得る。
したがって、表面上の抗原の不均一な分布は、少なくとも二重特異性抗体の結合事象の混合されたものをもたらし、その結果、決定的でないセンソグラムがもたらされる。図５は、チップ表面上に捕捉された抗原の形態のみが異なる同じ二重特異性抗体を用いて同一の条件下で得られた２つのセンソグラムの重ね合わせを示す：一方は標準的な最先端の方法に従って抗原の混合物を用いて得られ、他方は本発明による方法を用いて第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを用いて得られた。センソグラムは著しく異なることが分かる。第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを使用する本発明による方法で得られたセンソグラムにおいてのみ、均一で分析可能な応答曲線が得られる（図６）。参照方法で得られたセンソグラムでは、異なる重なり合う解離プロセス（およびそれによって速度論）が見られ、分析不可能な応答曲線が得られる。
図７（図５と同じ実験条件；相違点は、抗原の固定化形態のみである）から、抗原の混合物を用いて得られた不均一な解離速度論は、抗原のうちの１つのみを使用することによって同じセンソグラムが得られるので、アビド結合事象とアフィン結合事象とが組み合わされた結果であることが分かる。
図５および図７のセンソグラムは、５～１５ＲＵの低い捕捉レベルで得られている。捕捉レベルを、例えば５０～１２０ＲＵ（図８）、またはさらには３００～６００ＲＵ（図９）に増大させても、センソグラムは変化しない。
運動速度マップを使用して相互作用を分析すると、同じ結果が得られる。図１０から、本発明による方法が適用される場合にのみ、損なわれていないアビド結合事象を分析し得ることが分かる。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
ａ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相上に捕捉し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程、
ｂ）工程ａ）の固相に、二重特異性結合剤を含む溶液を適用し、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を形成し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程、
ｃ）第一および第二の表面プラズモン共鳴応答の差から、前記第一の抗原および第二の抗原に対する少なくとも二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定／算出する工程を含む、方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
ａ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相上に捕捉する（ベースライン表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する）工程、
ｂ）工程ａ）の固相に、少なくとも二重特異性結合剤を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程（これにより、第一の表面プラズモン共鳴応答は、二重特異性結合剤を固相に適用することによって得られた表面プラズモン共鳴応答のベースライン表面プラズモン共鳴応答への変化である）、
ｃ）前記捕捉した第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
ｄ）少なくとも二重特異性結合剤を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて工程ｂ）およびｃ）を繰り返し、第一および第二の濃度が異なる第二の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程
ｅ）前の工程で決定した表面プラズモン共鳴応答から、第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤抗体の、アビディティに基づく結合強度を決定／算出する工程を含む、方法である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、少なくとも二重特異性結合剤は二重特異性抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原は、二重特異性結合剤の第一の結合部位のエピトープを含む第一の抗原の少なくとも断片であり、第二の抗原は、二重特異性結合剤の第二の結合部位のエピトープを含む第二の抗原の少なくとも断片である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップである。
本発明の一態様は、少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドである。
本発明によるそのような融合タンパク質は、本明細書では「第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド」と呼ばれる。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、本発明による融合ポリペプチドは、第一の抗原として、少なくとも二重特異性結合剤の第一の結合部位のエピトープを含む第一の抗原の少なくとも断片を含み、第二の抗原として、少なくとも二重特異性結合剤の第二の結合部位のエピトープを含む第二の抗原の少なくとも断片を含む。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、本発明による融合ポリペプチドは、第一の抗原がＣ末端にあり、第二の抗原がＮ末端にあるか、またはその逆である直鎖状ポリペプチドである。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原はペプチドリンカーにより結合している。一実施形態では、ペプチドリンカーは、固相に固定化するためのタグを含む。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、融合ポリペプチドは、第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドポリペプチドとの融合ポリペプチドである第一のポリペプチド、ならびに第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである第二のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドである。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原はそれぞれの第一または第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端にある。一実施形態では、Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方が、固相への固定化のためのタグを含む。一実施形態では、タグはそれぞれのＦｃ領域ポリペプチドのＣ末端にある。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態では、第一のセットおよび第二のセットのヘテロ二量体化変異は、それぞれＴ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖであり、またはその逆である。一実施形態では、固定化のためのタグはヒスチジンタグまたはビオチン上にある。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、融合ポリペプチドは、第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第一の抗体重鎖定常領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである第一のポリペプチド、ならびに第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む、第二の抗体重鎖定常領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである第一のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドである。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原はそれぞれの第一または第二の定常領域ポリペプチドのＮ末端にある。一実施形態では、定常領域ポリペプチドの一方または両方が、固相への固定化のためのタグを含む。一実施形態では、タグはそれぞれのＦｃ領域ポリペプチドのＣ末端にある。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態では、第一のセットおよび第二のセットのヘテロ二量体化変異は、それぞれＴ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖであり、またはその逆である。一実施形態では、固定化のためのタグはヒスチジンタグまたはビオチン上にある。
したがって、一般的に言えば、本発明の一態様は、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
ｉ）第一のタンパク質性部分と、
ｉｉ）第二のタンパク質性部分と
を含み、
－ 第一のタンパク質性部分および第二のタンパク質性部分は、前記第一のタンパク質性部分に特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のタンパク質性部分に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性抗体の、第一および第二の抗原であり、
－ 前記第一のタンパク質性部分が、ＩｇＧ１サブタイプの第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
－ 前記第二のタンパク質性部分が、ＩｇＧ１サブタイプの第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
－ 第一および第二の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成し、
－ 重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方は、固相に固定化されるためのタグをそのＣ末端に含み、
－ 前記第一のＦｃ領域ポリペプチドおよび前記第二のＦｃ領域ポリペプチドは、それぞれ変異Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドである。
そのようなヘテロ二量体融合ポリペプチドは、少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、本発明による融合ポリペプチドは、１つのみ、すなわち正確に１つの第一の抗原、および１つのみ、すなわち正確に１つの第二の抗原を含む。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じポリペプチドではない。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一のタンパク質性部分および第二のタンパク質性部分は同じポリペプチドに由来しない。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位および第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位を含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対する、アビディティに基づく結合強度を決定するための表面プラズモン共鳴法における、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドの使用である。
本発明の一態様は、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドをクロマトグラフィーリガンドとして含むアフィニティークロマトグラフィーカラムである。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、二重特異性結合剤を、同じ第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴わない少なくとも二重特異性結合剤から分離／精製する方法であって、
ａ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、および伴わない、少なくとも二重特異性結合剤を含む溶液を、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う少なくとも二重特異性結合剤をカラムから回収し、それにより、同じ第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴わない二重特異性結合剤から、少なくとも二重特異性結合剤を分離／精製する工程を含む、方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤を（生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から）精製する方法であって：
ａ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、少なくとも二重特異性結合剤（ならびにプロセス関連不純物および／または生成物関連不純物）を本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、および
ｃ）第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、前記少なくとも二重特異性結合剤を前記カラムから回収し、それにより、二重特異性結合剤を（生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から）精製する工程を含む、方法である。
少なくとも１つのフローセルに固定化された本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを含む表面プラズモン共鳴チップ。
本発明の一態様は、少なくとも１つのフローセルに固定化された本発明の少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを含む表面プラズモン共鳴チップの製造方法であって、
－ 直接または特異的結合対を介して、表面プラズモン共鳴チップの少なくとも１つのフローセルに、本発明による少なくとも二重特異性結合剤の第一の抗原および第二の抗原の融合ポリペプチドを固定する工程を含む方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
－ 第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを含む溶液を、二重特異性結合剤がコンジュゲートされた固相に適用することによって得られる表面プラズモン共鳴シグナルの変化から、アビディティに基づく結合強度を決定することを含む、方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
ａ）少なくとも二重特異性結合剤を固相に捕捉し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程、
ｂ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを含む溶液を、工程ａ）の固相に適用し、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を形成し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程、
ｃ）第一および第二の表面プラズモン共鳴応答の差から、前記第一の抗原および第二の抗原に対する少なくとも二重特異性結合剤の、アビディティに基づく結合強度を決定／算出する工程を含む、方法である。
本発明の一態様は、第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む少なくとも二重特異性結合剤の、第一の抗原および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
ａ）少なくとも二重特異性結合剤を固相に捕捉する（ベースライン表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する）工程、
ｂ）工程ａ）の固相に、第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを第一の濃度で含む第一の溶液を適用して捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程（これにより、第一の表面プラズモン応答は、
第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相に適用することによって得られるベースライン表面プラズモン共鳴応答への変化である。）、
ｃ）前記捕捉した第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二重特異性結合剤複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
ｄ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程ｂ）およびｃ）を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定／測定／確立する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
ｅ）前の工程で決定した表面プラズモン共鳴応答から、第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性結合剤抗体の、アビディティに基づく結合強度を決定／算出する工程を含む、方法である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、少なくとも二重特異性結合剤は二重特異性抗体である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第一の抗原は、少なくとも二重特異性結合剤の第一の結合部位のエピトープを含む第一の抗原の少なくとも断片であり、第二の抗原は、少なくとも二重特異性結合剤の第二の結合部位のエピトープを含む第二の抗原の少なくとも断片である。
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップである。
基準に対するサンプルの品質評価
第二の結合パートナーの局所濃度は、近接に起因して、最初の第一の結合事象の後に大幅に上昇するので、アビド結合が可能な抗体は、この設定では常に両方の特異性に結合する。アビディティ効果は、その抗原に対する抗体の解離速度定数ｋｄに大きな影響を及ぼすため、ＳＰＲ測定の解離段階で一つの応答値を読み取るだけで、抗体の効力と相関する相対活性を評価することが可能である。ｋｄが平衡濃度に影響を及ぼすので、ＥＬＩＳＡまたは同様の方法もまた、このアプローチを利用して、その標的のすべてに対する抗体の二重特異性結合能を評価し得る。
したがって、本発明による一態様は、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質／純度／均一性を評価する方法であって：
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を（同じ方法で得られた）参照サンプルの読み取り値と比較し、それによって少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質／純度／均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
一実施形態では、方法は、
前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、前記二価の二重特異性抗体の第一の抗原を１つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドを含む溶液を、少なくとも２種の異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して（共鳴単位で）結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を２パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、ｙ軸切片を読み取り値として決定する工程、
平行線変換により、決定された読み取り値を参照サンプル（同じ方法で分析された）のものと比較し、それにより、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質／純度／均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
この方法は、ＳＰＲアッセイをベースとする。
第一の工程では、問題になっている抗体に特異的に結合する抗体、例えば問題になっている抗体がそのＦｃ領域に変異ＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）およびＰＧ（Ｐ３２９Ｇ）を含む場合、サンプル抗体のＦｃ領域のＬＡＬＡ変異またはＰＧ変異に特異的に結合する抗体を、製造業者の指示に従ってＳＰＲセンサーチップに固定化する。この例では、Ｆｃ領域に変異Ｐ３２９ＧおよびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを有するドメイン交換形式の二価の二重特異性抗体を使用する（本明細書ではＬＡＬＡ ＰＧと表記され、ナンバリングはＫａｂａｔによる）。同様に、Ｆｃ領域に特異的に結合する捕捉試薬が利用可能である限り、Ｆｃ領域の他の変異を使用し得る。
抗原捕捉が固定化によって制限されないことを確実にするために、少なくとも１６，０００ＲＵ（「応答限界」）を固定化すべきである。参照対照フローセルも同様に処理する。最後に、両表面がブロックされる。好ましい固定化緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。
第二に、二価の二重特異性抗体を注入する。
第三に、本発明による抗原１抗原２－Ｆｃ領域融合物を、種々の濃度で第二のフローセルに注入する。
ＳＰＲ信号を検出する。抗原１抗原２－Ｆｃ領域融合物の結合応答（共振ユニット、ＲＵ）は、二価の二重特異性抗体の量と相関関係があり、使用されるサンプル濃度範囲に対してプロットされる。得られた線形プロットを、適切なコンピュータソフトウェア（例えば、ＸＬｆｉｔ４、ＩＤＢＳソフトウェア）によって分析を、これは２パラメトリックラインに適合しており、したがって、生物学的結合活性（＝効力）の読み取り値と同等であるｙ軸切片の決定が可能となる。例えば、平行線変換を使用して、抗体参照標準と比較したサンプルの相対効力（＝報告可能な効力）を決定し得る。
抗原１および抗原２は、捕捉された二価の二重特異性抗体に同時に結合する。標的結合応答を最終アッセイの読み取り値として使用する。
上記の方法は、Ｇａｓｓｎｅｒら（Ｇａｓｓｎｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１０２（２０１５）１４４－１４９）によって公開されているように、効力放出アッセイについてのＵＳＰ１０３２の基準を満たすように設計されている。しかしながら、単一の濃度を測定し、それを参照標準の検量線に対してプロットすることは、ＵＳＰ１０３２基準を満たす必要がない場合には十分である。
本発明による一態様は、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質／純度／均一性を評価する方法であって：
二価の二重特異性抗体を種々の濃度で含む溶液を、二価の二重特性抗体の第一の抗原を１つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドが固定されているＳＰＲチップに別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
決定された読み取り値を（同じ方法で得られた）参照サンプルの読み取り値と比較し、それによって少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質／純度／均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
一実施形態では、方法は、
二価の二重特異性抗体を少なくとも２種の異なる濃度で含む溶液を、二価の二重特性抗体の第一の抗原を１つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む共有結合性融合ポリペプチドが固定されているＳＰＲチップに別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
それぞれのサンプル濃度に対して（共鳴単位で）結合応答をプロットする工程、
得られたプロットのデータ点を２パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、ｙ軸切片を読み取り値として決定する工程、
平行線変換により、決定された読み取り値を参照サンプル（同じ方法で分析された）のものと比較し、それにより、少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質／純度／均一性を決定する工程を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、方法である。
この方法は、ＳＰＲアッセイをベースとする。
第一の工程では、抗原１－抗原２－Ｆｃ領域融合物に特異的に結合する抗体、例えば、抗原１－抗原２－Ｆｃ領域融合物がそのＦｃ領域に変異ＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）およびＰＧ（Ｐ３２９Ｇ）を含む場合、サンプル抗体のＦｃ領域のＬＡＬＡ変異またはＰＧ変異に特異的に結合する抗体を、製造業者の指示に従ってＳＰＲセンサーチップに固定化する。抗体捕捉が固定化によって制限されないことを確実にするために、少なくとも１６，０００ＲＵ（「応答限界」）を固定化すべきである。参照対照フローセルも同様に処理する。最後に、両表面がブロックされる。好ましい固定化緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。
第二に、本発明による抗原１－抗原２－Ｆｃ領域融合物を注入する。
第三に、二価の二重特異性抗体を種々の濃度で注入する。
ＳＰＲ信号を検出する。二価の二重特異性抗体の結合応答（共振ユニット、ＲＵ）は、抗原１－抗原２－Ｆｃ領域融合物の量と相関関係があり、使用されるサンプル濃度範囲に対してプロットされる。得られた線形プロットを、適切なコンピュータソフトウェア（例えば、ＸＬｆｉｔ４、ＩＤＢＳソフトウェア）によって分析を、これは２パラメトリックラインに適合しており、したがって、生物学的結合活性（＝効力）の読み取り値と同等であるｙ軸切片の決定が可能となる。例えば、平行線変換を使用して、抗体参照標準と比較したサンプルの相対効力（＝報告可能な効力）を決定し得る。
捕捉された抗原１および抗原２は、二価の二重特異性抗体に同時に結合する。標的結合応答を最終アッセイの読み取り値として使用する。
上記の方法は、Ｇａｓｓｎｅｒら（Ｇａｓｓｎｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１０２（２０１５）１４４－１４９）によって公開されているように、効力放出アッセイについてのＵＳＰ１０３２の基準を満たすように設計されている。しかしながら、単一の濃度を測定し、それを参照標準の検量線に対してプロットすることは、ＵＳＰ１０３２基準を満たす必要がない場合には十分である。
概要
本発明の少なくとも一部は以下に関する。
１．
少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合強度を決定する方法であって、
前記二価の二重特異性抗体を含む溶液を、
前記第一の抗原を１つの末端に、第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
をコンジュゲートしている固相に適用し、
その後、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルをモニタリングする
ことによって得られる前記ＳＰＲシグナルから、前記二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度を決定する工程
を含み、
少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
方法。
２．
ａ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相上に捕捉する工程、
ｂ）工程ａ）の前記固相に、前記二価の二重特異性抗体を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二価の二重特異性抗体複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を決定する工程、
ｃ）前記捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二価の二重特異性抗体複合体を解離させて、それにより固相を再生する工程、
ｄ）前記二価の二重特異性抗体を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程ｂ）およびｃ）を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を決定する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
ｅ）前の工程で測定した前記表面プラズモン共鳴応答から、前記少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する工程
を含む、項目１に記載の方法。
３．
前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、各共有結合性融合ポリペプチドが、前記固相に別々にコンジュゲートされている、項目１～２のいずれか１つに記載の方法。
４．
前記第一の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第一の結合部位のエピトープを含む前記第一の抗原の少なくとも断片であり、前記第二の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第二の結合部位のエピトープを含む前記第二の抗原の少なくとも断片である、項目１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．
前記第一の抗原が、第二の抗原と異なる、項目１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．
前記固相が、表面プラズモン共鳴チップである、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．
前記第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドが、
前記第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第一のポリペプチド、および
前記第二の抗原と、前記第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第二のポリペプチド
を含む、ヘテロ二量体ポリペプチド
である、項目１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、それぞれの前記第一または第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端にある、項目７に記載の方法。
９．
前記第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドが、固相への固定化のためのタグを含む、項目１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．
前記タグが、それぞれのＦｃ領域ポリペプチドのＣ末端にある、項目９に記載の方法。
１１．
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである、請項目７～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．
前記第一のセットおよび前記第二のセットのヘテロ二量体化変異が、それぞれＴ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖであるか、またはその逆である、項目７～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．
ｉ）第一のポリペプチドと、
ｉｉ）第二のポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
－ 前記第一のポリペプチドおよび前記第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドに特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のポリペプチドに特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原であり、
－ 前記第一のポリペプチドが、ＩｇＧ１サブタイプの第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、
－ 前記第二のポリペプチドが、ＩｇＧ１サブタイプの第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、
－ 前記第一および第二の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成しており、
－ 前記重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方が、固相に固定化されるためのタグをそのＣ末端に含み、
－ 前記第一のＦｃ領域ポリペプチドおよび前記第二のＦｃ領域ポリペプチドが、それぞれ変異Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、かつ
－ 前記第一の抗原が、前記第二の抗原と異なっている、
ヘテロ二量体融合ポリペプチド。
１４．
第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、前記第一の抗原および前記第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において決定するための、項目１３に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドの使用。
１５．
第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、前記第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、二重特異性抗体を、生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から精製する方法であって、
ａ）前記第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う二重特異性抗体と、プロセス関連不純物および／または生成物関連不純物とを含む溶液を、クロマトグラフィーリガンドとして項目１３に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに、適用する工程、
ｂ）前記第一の抗原および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、ならびに
ｃ）前記第一の抗原および前記第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を、前記カラムから回収し、それにより（生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から）二重特異性抗体を精製する工程
を含む、方法。
以下の実施例および図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加え得ることが理解される。
アフィニティに基づく結合およびアビディティに基づく結合のスキーム。 Ａ：抗原混合物のランダム固定化を用いたＳＰＲの設定。個々の抗原をランダムに固定する、すなわち種々の抗原が不均一に分布しているＳＰＲ装置では、２つの抗原が離れすぎてアフィン結合とアビド結合の混合物が決定されるため、１つの抗原にのみ結合する抗体が存在する。Ｂ：連結された抗原が限定して固定化されたＳＰＲの設定。連結された抗原が限定して固定化されたＳＰＲでは、すなわち、種々の抗原が不均一に分布しているＳＰＲでは、２つの抗原が適切に離間しており、その結果、抗体は両方の抗原に同時に結合し、アビド結合が決定される。 結合していない抗原を固定化することによって得られたＳＰＲチップの表面のスキーム。捕捉のために、各抗原はタグを含み、抗タグ抗体を使用して捕捉される。それにより、第一の抗原のみまたは第二の抗原のみまたは両方の抗原との抗タグ抗体の混合物を含むランダムな表面が生成される。したがって、均一な表面ではなく、表面上の抗原の不均一な分布が得られる。 ＳＰＲにおける、チップ表面上の抗原の不均一な分布に起因する二重特異性抗体の異なる結合様式。１および２：１つの結合部位のみとの結合；３：単一複合体への両方の結合部位との同時結合；４：２つの異なる複合体に対する両方の結合部位との同時結合。 チップ表面に捕捉された抗原の形式のみが異なる同じ二重特異性抗体を用いて同一の条件下で得られた２つのセンソグラムのＳＰＲセンソグラムのオーバーレイ。上側のセンソグラム：抗原混合物を用いて得られる；下側のセンソグラム：本発明による融合ポリペプチドを用いて得られる；本発明による方法で得られたセンソグラムにおいてのみ、均一で分析可能な応答曲線が得られる。固定レベル５～１５ＲＵ。 追加の注釈付きの図５と同じセンソグラム。 チップ表面に捕捉された抗原の形式のみが異なる同じ二重特異性抗体を用いて同一の条件下で得られた４つのセンソグラムのＳＰＲセンソグラムのオーバーレイ。１：抗原１のみ；２：抗原２のみ；３抗原混合物；４：本発明の融合ポリペプチド。本発明による方法で得られたセンソグラムにおいてのみ、均一で分析可能な応答曲線が得られる。（図５と同じ実験条件） 図７と同じであるが、５０～１２０ＲＵの固定化レベルで得られた。１：抗原１のみ；２：抗原２のみ；３抗原混合物；４：本発明の融合ポリペプチド。本発明による方法で得られたセンソグラムにおいてのみ、均一で分析可能な応答曲線が得られる。 図７と同じであるが、３００～６００ＲＵの固定化レベルで得られた。１：抗原１のみ；２：抗原２のみ；３抗原混合物；４：本発明の融合ポリペプチド。本発明による方法で得られたセンソグラムにおいてのみ、均一で分析可能な応答曲線が得られる。 相互作用の運動速度マップ。Ａ：抗原１のみ；Ｂ：抗原２のみ；Ｃ：本発明の融合ポリペプチド。同じ二重特異性抗体を含む。 図１０Ａの説明を参照のこと。 図１０Ａの説明を参照のこと。
装置および試薬
ＳＰＲ実験はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃で行った。抗体は、特に明記しない限り、ドイツ、マンハイムのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨによって製造された。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載のように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行われた二本鎖シークエンシングによって決定された。
実施例１
発現ベクター、発現および精製
発現ベクター
記載されたポリペプチド／抗体の発現のために、一過性発現のための発現プラスミド（例えば、ＨＥＫ２９３）を適用した。
抗体／ポリペプチド発現カセットの他、ベクターには以下のものが含まれていた。
－－ 大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）においてプラスミドの複製を可能にする複製起源、
－－ 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子。
抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成されていた。
－ ５’末端の固有の制限部位
－ ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期遺伝子およびプロモーター、
－ 続いてイントロンＡ配列、
－ ヒト抗体遺伝子の５’－未翻訳領域、
－ 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ 核酸をコードするそれぞれの抗体鎖
－ ポリアデニル化シグナル配列を有する３’未翻訳領域、
－ ３’末端の固有の制限部位。
本明細書に記載される抗体および融合ポリペプチドをコードする融合遺伝子は、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成によって作成され、それぞれのベクター中の固有の制限部位を用いて、核酸セグメントにしたがって接続することによって、既知の組換え方法および技術によって構築されたサブクローン化された核酸配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。一時的なトランスフェクションのために、大量のプラスミドが、トランスフェクションされた大腸菌培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）からプラスミド調製によって調製された。
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。
二重特異性抗体および融合ポリペプチドを、以下に記載されるように、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３－Ｆ細胞におけるそれぞれの発現プラスミドの一過性共トランスフェクションによって発現させた。
ＨＥＫ２９３系における一時的なトランスフェクション
すべての二重特異性抗体および融合ポリペプチドは、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって作成された。ここで、２９３Ｆ細胞をＦ１７培地中で培養し、２９３Ｆｒｅｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）でトランスフェクションし、ＶＰＡ ４ｍＭを用いて４時間後に供給し、１６時間後にＦｅｅｄ ７と０．６％のグルコースを供給した。更に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。ここで、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞をＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って移した。７日後に細胞上清を集め、標準的な方法によって精製した。
タンパク質定量
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Ｐａｃｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４、２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定された。
上清中の抗体濃度決定
細胞培養液の上清中の抗体の濃度は、プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた免疫沈降によって推定された。６０μＬのプロテインＡアガロースビーズを、ＴＢＳ－ＮＰ４０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｎｔ－Ｐ４０）で３回洗浄した。その後、１～１５ｍＬの細胞培養物上清を、ＴＢＳ－ＮＰ４０中であらかじめ平衡状態にしたプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温で１時間インキュベートした後、ビーズを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－フィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で、０．５ｍＬのＴＢＳ－ＮＰ４０で１回、０．５ｍＬの２ｘリン酸緩衝化生理食塩水（２ｘＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ）で２回洗浄し、０．５ｍＬの１００ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）で４回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、３５μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって溶出させた。サンプルの半分をそれぞれＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル還元剤と合わせ、または還元させず、７０℃で１０分間加熱した。その結果、５～３０μｌを４～１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＭＯＰＳ緩衝液および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＳ緩衝液を含む）に適用し、クーマシーブルーで染色した。
細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度は、アフィニティＨＰＬＣクロマトグラフィーによって定量的に測定された。簡単に言うと、プロテインＡに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養物上清を、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラムに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムで、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２．５）を用いてマトリックスから溶出させた。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準ＩｇＧ１抗体を、標準として与えた。
または、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度は、サンドイッチ－ＩｇＧ－ＥＬＩＳＡによって測定された。簡単に言うと、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａ－９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ－Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で、０．１μｇ／ｍＬで室温で１時間かけて、または４℃で一晩かけてコーティングし、その後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を用いて３回洗浄した。細胞培養物上清を含有するそれぞれの抗体の１００μＬ／ウェルのＰＢＳでの希釈系列をウェルに加え、室温で、マイクロタイタープレート上、１～２時間インキュベートした。ウェルを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、結合した抗体を、検出抗体として０．１μ／ｍＬの１００μｌのＦ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて、マイクロタイタープレート振とう機上で、室温で１～２時間かけて検出した。未結合の検出抗体を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、結合した検出抗体は、１００μＬのＡＢＴＳ／ウェルを加えることによって検出した。吸光度の決定は、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、測定波長４０５ｎｍ（参照波長４９２ｎｍ）で行った。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ２．８で達成され、その後、サンプルを即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、または２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０分子量カットオフ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、凍結させ、－２０℃または－８０℃で保存した。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、または質量分析による、後続のタンパク質分析および分析による特性決定のために、サンプルの一部を提供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％または４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）またはＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。
実施例２
アッセイ手順
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００ ＣＭ５センサーチップは、製造業者の指示に従って、標準的なアミンカップリング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：アミンカップリングキット、タイプ１；Ｎｏ．ＢＲ１０００５０）を使用してフローセル３および４に約３０００～５０００ＲＵの抗ＨＩＳ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｈｉｓ捕捉キット；Ｎｏ．２８９９５０５６）を固定化することによって調製した。
すべてのサンプルおよび先行する始動サイクルは、以下の４つのコマンドからなっていた：
１．捕捉１０秒後、安定化期間中、可変溶液を第二のフローセルに、流速１０μｌ／分で３０秒間注入した。
２．サンプル：４つの異なる濃度（０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、５００ｎＭ）からなる単一サイクル動態（ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ）を３０μｌ／分の流速でフローセル３および４に注入した。結合時間および解離時間を１８０秒および１２００秒に設定した。
３．再生：ｐＨ１．５の１００ｍＭグリシン－ＨＣｌを両方のフローセルに、流速３０μｌ／分で４０秒間注入した。
４．再生：前のコマンドと同じ設定に１０秒の長い期間を加えた。
４つの異なる抗原１）単量体ｈｕＡＧ１－Ｈｉｓ－ｔａｇ、２）単量体ｈｕＡＧ２－Ｈｉｓ－ｔａｇ、３）単量体ｈｕＡＧ１－Ｈｉｓ－ｔａｇと単量体ｈｕＡＧ２－Ｈｉｓ－Ｔａｇとの混合物、および４）ｈｕＡＧ１－ｈｕＡＧ２－二重特異性－Ｆｃ－融合－Ｈｉｓ－ｔａｇからなるサンプルセットを、捕捉工程において１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭの種々の濃度で使用して、センサ表面を生成した。
その後、一連の濃度の二重特異性抗ＡＧ１／ＡＧ２抗体を注入し、その後の測定サイクルで単一抗原、抗原混合物、および抗原融合物に結合させた。後の参照のためにそれぞれのブランクサイクルを常に一緒に行った。
得られたデータを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて評価した。可能であれば、１：１のラングミュアフィットを作成した。
実施例３
参照標準に対するサンプルの品質評価
本発明による方法は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する本実施例に例示されるＳＰＲアッセイをベースとする。他のあらゆる装置も同様に使用し得る。
この例では、Ｆｃ領域に変異Ｐ３２９ＧおよびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを有するドメイン交換形式の二価の二重特異性抗体を使用する（本明細書ではＬＡＬＡ ＰＧと表記され、ナンバリングはＫａｂａｔによる）。同様に、Ｆｃ領域に特異的に結合する捕捉試薬が利用可能である限り、Ｆｃ領域の他の変異を使用し得る。
第一の工程において、Ｆｃ領域中のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＰ３２９Ｇ変異のいずれかを標的とする抗体を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから提供されたアミンカップリング化学反応を用いてＣＭ５センサーチップに固定化する。フローセルを、０．４Ｍ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．１Ｍ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物を用いて５μｌ／分の流速で活性化した。抗ＬＡＬＡ抗体または抗ＰＧ抗体を酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に５０μｇ／ｍｌで１２００秒間注入し、約１８，０００ＲＵの表面密度を得た。抗体捕捉が固定化によって制限されないことを確実にするために、少なくとも１６，０００ＲＵ（「応答限界」）を固定化すべきである。参照対照フローセルを前述と同じ方法で処理した。最後に、両表面を１Ｍエタノールアミン／ＨＣｌ ｐＨ８．５を注入してブロッキングした。固定化緩衝液として、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
第二に、Ｆｃ領域にＬＡＬＡ ＰＧ変異を含むドメイン交換形式の二価の二重特異性抗体をＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で希釈し、５μｌ／分の流量で６０秒間注入した。
第三に、本発明による抗原１－抗原２－Ｆｃ融合物を、１５μｇ／ｍｌの濃度で６０秒間注入した。解離時間（ランニング緩衝液で洗浄）は、流速３０μｌ／分で６００秒であった。すべての相互作用は２５℃で実施された。
第四に、１０ｍＭ ＮａＯＨの再生溶液を３０μｌ／分の流速で３０秒間に２回注入して、各結合サイクル後に非共有結合タンパク質を除去し、続いて４０秒間の安定化期間を設けてベースラインを安定化させた。
シグナルは毎秒１シグナルの速度で検出された。抗原１－抗原２－Ｆｃ領域融合物の結合応答（共振ユニット、ＲＵ）は、二価の二重特異性抗体の量と相関関係があり、使用されるサンプル濃度範囲に対してプロットされる。得られた線形プロットを、２パラメトリックラインに適合させ、それによって、生物学的結合活性（＝効力）読み取り値としてのｙ軸切片の決定を可能にする適切なコンピュータソフトウェア（例えば、ＸＬｆｉｔ４、ＩＤＢＳソフトウェア）によって分析した。平行線変換後、抗体参照標準と比較したサンプルの相対効力を報告し得る（＝報告可能な効力）。
抗原１および抗原２は、捕捉された二価の二重特異性抗体に同時に結合する。標的結合応答を最終アッセイの読み取り値として使用する。
上記の方法は、Ｇａｓｓｎｅｒら（Ｇａｓｓｎｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１０２（２０１５）１４４－１４９）によって公開されているように、効力放出アッセイについてのＵＳＰ１０３２の基準を満たすように設計されている。しかしながら、単一の濃度を測定し、それを参照標準の検量線に対してプロットすることは、ＵＳＰ１０３２基準を満たす必要がない場合には十分である。
実施例４
参照標準に対するサンプルの品質評価
本発明による方法は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する本実施例に例示されるＳＰＲアッセイをベースとする。他のあらゆる装置も同様に使用し得る。
本実施例では、Ｆｃ領域に変異Ｐ３２９ＧおよびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを有する抗原１－抗原２－Ｆｃ融合物使用する（本明細書ではＬＡＬＡ ＰＧと表記され、ナンバリングはＫａｂａｔによる）。同様に、Ｆｃ領域に特異的に結合する捕捉試薬が利用可能である限り、Ｆｃ領域の他の変異を使用し得る。
第一の工程において、抗原１－抗原２－Ｆｃ融合物のＦｃ領域中のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＰ３２９Ｇ変異のいずれかを標的とする抗体を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから提供されたアミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサーチップに固定化する。フローセルを、０．４Ｍ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．１ ＭＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物を用いて５μｌ／分の流速で活性化した。抗ＬＡＬＡ抗体または抗ＰＧ抗体を酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に５０μｇ／ｍｌで１２００秒間注入し、約１８，０００ＲＵの表面密度を得た。抗体捕捉が固定化によって制限されないことを確実にするために、少なくとも１６，０００ＲＵ（「応答限界」）を固定化すべきである。参照対照フローセルを前述と同じ方法で処理した。最後に、両表面を１Ｍエタノールアミン／ＨＣｌ ｐＨ８．５を注入してブロッキングした。固定化緩衝液として、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
第二に、本発明による抗原１－抗原２－Ｆｃ融合物を、５μｌ／分の流量で６０秒間注入した。
第三に、ドメイン交換形式の二価の二重特異性抗体を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で希釈し、種々の濃度で、１５μｇ／ｍｌの濃度で６０秒間注入した。解離時間（ランニング緩衝液で洗浄）は、流速３０μｌ／分で６００秒であった。すべての相互作用は２５℃で実施された。
第四に、１０ｍＭ ＮａＯＨの再生溶液を３０μｌ／分の流速で３０秒間に２回注入して、各結合サイクル後に非共有結合タンパク質を除去し、続いて４０秒間の安定化期間を設けてベースラインを安定化させた。
シグナルは毎秒１シグナルの速度で検出された。二価の二重特異性抗体の結合応答（共振ユニット、ＲＵ）は、抗原１－抗原２－Ｆｃ融合物の量と相関関係を有し、使用されるサンプル濃度範囲に対してプロットされる。得られた線形プロットを、２パラメトリックラインに適合させ、それによって、生物学的結合活性（＝効力）読み取り値としてのｙ軸切片の決定を可能にする適切なコンピュータソフトウェア（例えば、ＸＬｆｉｔ４、ＩＤＢＳソフトウェア）によって分析した。平行線変換後、抗体参照標準と比較したサンプルの相対効力を報告し得る（＝報告可能な効力）。
捕捉された抗原１および２は、二価の二重特異性抗体に同時に結合する。標的結合応答を最終アッセイの読み取り値として使用する。
上記の方法は、Ｇａｓｓｎｅｒら（Ｇａｓｓｎｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１０２（２０１５）１４４－１４９）によって公開されているように、効力放出アッセイについてのＵＳＰ１０３２の基準を満たすように設計されている。しかしながら、単一の濃度を測定し、それを参照標準の検量線に対してプロットすることは、ＵＳＰ１０３２基準を満たす必要がない場合には十分である。

Claims (19)

  1. 少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する方法であって、
    前記二価の二重特異性抗体を含む溶液を、
    前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
    をコンジュゲートしている固相に適用し、
    その後、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルをモニタリングする
    ことによって得られる前記ＳＰＲシグナルから、前記二価の二重特異性抗体の、アビディティに基づく結合強度を測定する工程
    を含み、
    前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
    方法。
  2. ａ）第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドを固相上に捕捉する工程、
    ｂ）工程ａ）の固相に、前記二価の二重特異性抗体を第一の濃度で含む第一の溶液を適用して、捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二価の二重特異性抗体複合体を形成し、第一の表面プラズモン共鳴応答を測定する工程、
    ｃ）前記捕捉された第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチド－二価の二重特異性抗体複合体を解離させて固相を再生する工程、
    ｄ）前記二価の二重特異性抗体を第二の濃度で含む第二の溶液を少なくとも用いて、工程ｂ）およびｃ）を繰り返し、第二の表面プラズモン共鳴応答を測定する工程であって、ここで、すべての濃度は異なる、工程、
    ｅ）前の工程で測定した前記表面プラズモン共鳴応答から、前記少なくとも二価の二重特異性抗体の、第一および第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を測定する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、各共有結合性融合ポリペプチドが、前記固相に別々にコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記第一の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第一の結合部位のエピトープを含む前記第一の抗原の少なくとも断片であり、前記第二の抗原が、前記二価の二重特異性抗体の前記第二の結合部位のエピトープを含む前記第二の抗原の少なくとも断片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第一の抗原が、第二の抗原と異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記固相が、表面プラズモン共鳴チップである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドが、
    前記第一の抗原と、第一のセットのヘテロ二量体化変異を含む第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第一のポリペプチド、および
    前記第二の抗原と、前記第一のセットのヘテロ二量体化変異に相補的な第二のセットのヘテロ二量体化変異を含む第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとの融合ポリペプチドである、第二のポリペプチド
    を含む、ヘテロ二量体ポリペプチド
    である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第一の抗原および前記第二の抗原が、それぞれの前記第一または第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端にある、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第一の抗原－第二の抗原－融合ポリペプチドが、固相への固定化のためのタグを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記タグが、それぞれのＦｃ領域ポリペプチドのＣ末端にある、請求項９に記載の方法。
  11. 前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第一および前記第二のセットのヘテロ二量体化変異が、それぞれＴ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖであるか、またはその逆である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ｉ）第一のポリペプチドと、
    ｉｉ）第二のポリペプチドと
    を含む、ヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、
    － 前記第一のポリペプチドおよび前記第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドに特異的に結合する第一の結合部位と、前記第二のポリペプチドに特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第一の抗原および第二の抗原であり、
    － 前記第一のポリペプチドが、ＩｇＧ１サブタイプの第一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、
    － 前記第二のポリペプチドが、ＩｇＧ１サブタイプの第二の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、
    － 前記第一および第二の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、ジスルフィド結合ヘテロ二量体を形成しており、
    － 前記重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方が、固相に固定化されるためのタグをそのＣ末端に含み、
    － 前記第一および第二のＦｃ領域ポリペプチドが、それぞれ変異Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、かつ
    － 前記第一の抗原が、前記第二の抗原と異なっている、
    ヘテロ二量体融合ポリペプチド。
  14. 第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む二重特異性抗体の、前記第一の抗原および前記第二の抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において測定するための、請求項１３に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドの使用。
  15. 第一の抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含み、前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う、二重特異性抗体を、生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から精製する方法であって、
    ａ）前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体と、プロセス関連不純物および／または生成物関連不純物とを含む溶液を、クロマトグラフィーリガンドとして請求項１３に記載のヘテロ二量体融合ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに、適用する工程、
    ｂ）前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を前記カラムに結合させたまま、前記カラムを洗浄する任意選択的工程、ならびに
    ｃ）前記第一および第二の抗原へのアビディティに基づく結合を伴う前記二重特異性抗体を、前記カラムから回収し、それにより（生成物関連不純物および／またはプロセス関連不純物から）二重特異性抗体を精製する工程
    を含む、方法。
  16. 少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を評価する方法であって、
    － 前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、
    前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
    を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、および
    － 測定された読み取り値を参照サンプルと比較し、それにより、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含むサンプルの品質を判定する工程
    を含み、
    前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
    方法。
  17. － 前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、
    前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
    を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
    － それぞれのサンプル濃度に対して結合応答をプロットする工程、
    － 得られたプロットのデータ点を２パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、ｙ軸切片を読み取り値として決定する工程、
    － 決定された読み取り値を、同じ方法で分析および処理した参照サンプルの読み取り値と、平行線変換によって比較し、それによって、前記少なくとも二価の二重特異性抗体を含む前記サンプルの品質を判定する工程
    を含み、
    前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
    請求項１６に記載の方法。
  18. 少なくとも二価の二重特異性抗体を産生する細胞株を選択する方法であって、
    － 少なくとも二価の二重特異性抗体を発現する多数の組換え哺乳動物細胞株の細胞株の別々の培養液の個々の上清を提供する工程、
    － 各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、
    前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
    を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングするか、またはその前に、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
    － 測定された読み取りを互いに比較し、それによって、各細胞株によって産生された少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を判定する工程、および
    － 産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質に基づいて、少なくとも１つの細胞株を選択する工程
    を含み、
    前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
    方法。
  19. － 少なくとも二価の二重特異性抗体を発現する多数の組換え哺乳動物細胞株の細胞株の別々の培養液の個々の上清を提供する工程、
    － 各細胞株について、前記細胞株の前記培養液の上清由来の前記二価の二重特異性抗体が固定化されているＳＰＲチップに、
    前記二価の二重特異性抗体の前記第一の抗原を１つの末端に、前記第二の抗原を異なる第二の末端に含む、共有結合性融合ポリペプチド
    を含む溶液を、異なる濃度で別々に適用し、その後、ＳＰＲシグナルをモニタリングするか、またはその前に、ＳＰＲシグナルをモニタリングする工程、
    － それぞれのサンプル濃度に対して結合応答をプロットする工程、
    － 得られたプロットのデータ点を２パラメトリックラインフィットを用いて当てはめ、ｙ軸切片を読み取り値として決定し、それによって、各細胞株によって産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の相対的品質を判定する工程、および
    － 産生された前記少なくとも二価の二重特異性抗体の前記相対的品質に基づいて、少なくとも１つの細胞株を選択する工程
    を含み、
    前記少なくとも二価の二重特異性抗体は、第一の非抗体抗原に特異的に結合する第一の結合部位と、第二の異なる非抗体抗原に特異的に結合する第二の結合部位とを含む、
    請求項１８に記載の方法。
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