KR101383476B1 - 면역억제 폴리펩티드 및 핵산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역억제 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 및 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 상기 폴리펩티드 및 핵산을 이용하는 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조문헌
본 출원은 2007년 11월 1일에 출원한 미국 임시 특허 출원 일련번호 제 60/984,631호 및 2008년 5월 7일에 출원한 미국 임시 특허 출원 일련번호 제 61/051,215호의 우선권과 이익을 주장하며, 이들 각각의 공개 내용은 그 전체가 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로서 병합되어 있다.
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배경기술
본 발명은 일반적으로 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 신규한 폴리펩티드, 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 그리고 그러한 폴리펩티드와 핵산을 만들고 이용하는 방법들에 관한 것이다.
T 세포는 면역 반응의 개시 및 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. T 세포의 완전한 활성화를 일으키기 위하여, 적어도 두 개의 분명한 시그널링 이벤트(signaling events)가 필요하다. 제1 신호는 T 세포 상에서 발현되는 T 세포 수용체(T cell receptors, TCR)와 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APCs) 상에서 발현되는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자의 맥락에서 제시되는 특이 항원(Ag)과의 상호작용에 의하여 생산된다. 제2(보조-자극(co-stimulation)) 신호는 APCs 상에 발현되는 보조 자극성 리간드와 T 세포 상에서 발현되는 그것들의 대응 수용체 사이의 상호작용으로부터 생겨난다. 우세한 보조-자극 경로는 CD28을 갖는 APCs 상에서 발현되는 CD80(B7-1 또는 B7.1) 및 CD86 (B7-2 또는 B7.2) 리간드와 T 세포 상에 주로 발현되는 CTLA-4(CD152라고도 알려짐) 사이의 상호작용을 포함한다. CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4; 세포독성 T-림프구 항원 4) 및 CD28은 CD80 및 CD86 리간드의 수용체로서 작용한다.
양성 시그널링은 CD28 수용체를 통하여 이루어진다. CD28에 CD80 및/또는 CD86 리간드(들)의 결합은 면역 시냅스의 형성을 촉진함으로써 T 세포 활성화의 한계치를 낮춘다(Viola A. 등, Science 283:680-682 (1999)). 추가적으로, CD28 보조-자극은, 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2), NF-κB, 및 Bcl-XL과 같이, T 세포 증식 및 생존에 중심적인 요소들의 생산을 활성화하거나 증진시킨다(Norton S. D. 등, J. Immunol. 149:1556-1561 (1992); Vella A. T. 등, J. Immunol. 158: 4714-4720 (1997)). 생체 내에서, CD28-결함 마우스는 심각하게 면역약화되고, 약한 항원-특이적 T 세포 반응을 보여준다(Green, J. M. 등, Immunity 1:501-508 (1994)). T 세포 아네르기(anergy) 또는 내성(tolerance)은 T 세포가 보조자극 신호의 부재 중에서 활성화될 때 일어날 수 있다.
음성 시그널링은 CTLA-4 수용체를 통하여 이루어진다. CD80 및 CD86 리간드(들) 각각은 CTLA-4에 높은 결합활성(avidity)으로 결합하고, CD28 시그널링으로부터 유도되는 면역증식성 반응(immunoproliferative responses)의 균형을 맞춘다. CTLA-4 시그널링의 잠재적인 메커니즘은 보조-자극 분자 CD80/CD86의 경쟁적 결합(Masteller, E. M. 등, J. Immunol. 164:5319 (2000)), 면역시냅스로 포스파타아제를 유도함으로써 생기는 TCR 시그널링의 저해(Lee K. M. 등, Science 282:2263 (1998)) 및 면역 시냅스의 파괴(Pentcheva-Hoang T. 등, Immunity 21:401 (2004); Chikuma S. 등, J. Exp. Med 197:129 (2003); Schneider H. 등, Science 313: 1972 (2006))를 포함한다. 생체 내에서, CTLA-4 결함 마우스는 대규모 조직 침투와 장기 파괴로 특징지어진 깊은 자가면역 표현형을 보여준다(Waterhouse P. 등, Science 270:985 (1995)).
가용성 인간 CTLA-4-Ig와 같이, CD80/CD86 보조-자극 경로에 길항하도록 설계된 치료적 제제는 자가면역 질환 및 장애의 치료를 위한 가능성을 가진다. 본 발명은 CD80/CD86 보조-자극 경로를 통하여 시그널링을 조절하거나 억제할 수 있는 능력을 개선시킨 이로운 분자와, T 세포 반응의 선택되고 차등된 조작을 위하여 그러한 분자를 이용하는 방법을 제공한다. 그러한 분자는 하기에 자세히 검토된 바와 같이 다양하게 응용되어 유익하게 사용될 수 있다.
본 발명의 개요
제1 양태에서, 본 발명은 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과는 15개의 아미노산 잔기까지 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 CTLA-4 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 분리형 또는 재조합형 CTLA-4 폴리펩티드는 CD80 또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나의 세포외 도메인에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는, 서열번호 36의 폴리펩티드 서열에 대하여, 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는 서열번호 36의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는, 서열번호 50의 폴리펩티드 서열에 대하여, 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는 서열번호 50의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는 인간 CD80 또는 인간 CD86 또는 이들 중 어느 하나의 세포외 도메인에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는 124개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는 서열번호 159에 대한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치들로 구성되는 그룹에서 선택되는 아미노산 위치에서 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드는 서열번호 159에 대한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치들로 구성되는 그룹에서 선택되는 아미노산 위치에서 두 개, 세 개 또는 네 개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 S70F와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 70에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 L104E와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 104에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 T30N/D/A 또는 치환 T30N과 같이, 서열번호 159에 대한 위치 30에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 S64P와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 64에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 A50M과 같이, 서열번호 159에 대한 위치 50에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 M54K/V 또는 치환 M54K와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 54에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 I65S와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 65에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 N56D와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 56에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 G55E와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 55에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 M85A와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 85에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, 치환 A24E/S 또는 치환 A24E와 같이, 서열번호 159에 대한 위치 24에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, CD86 또는 CD86 세포외 도메인에서의 모노머성 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 결합 친화도와 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86 또는 그의 세포외 도메인에서의 결합 친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는, CD80 또는 CD80 세포외 도메인에서의 모노머성 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 결합 친화도보다 큰, CD80 또는 그의 세포외 도메인에서의 결합 친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는 면역 반응을 억제하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드는 T 세포 활성화 또는 T 세포 증식을 저해하는 능력을 가질 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태의 적어도 두 개의 폴리펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드 멀티머(multimer)를 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은, (a) 본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩티드, 및 (b) 제2 폴리펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 제2 폴리펩티드는 Ig Fc 폴리펩티드이고, 상기 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 조절하거나 통제하는 능력을 가진다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제3 양태에 따른 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 다이머성 융합 단백질을 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 또는 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제5 양태의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질, 본 발명의 제5 양태의 핵산, 및/또는 본 발명의 제6 양태의 벡터를 포함하는 분리형 또는 재조합형 숙주 세포를 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제, 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 약학적으로 허용가능한 희석제 및 다음 것들 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질, 본 발명의 제5 양태의 핵산, 본 발명의 제6 양태의 벡터, 및/또는 본 발명의 제7 양태의 숙주 세포.
제9 양태에서, 본 발명은 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 B7-양성 세포를 다음 중 적어도 하나의 유효한 양과 접촉시켜 면역 반응을 억제하는 것을 포함하는데, 그렇게 함으로써 면역 반응을 억제한다: 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질, 본 발명의 제5 양태의 핵산, 본 발명의 제6 양태의 벡터, 및/또는 본 발명의 제7 양태의 숙주 세포.
제10 양태에서, 본 발명은, 면역 반응을 억제하는데 사용하기 위하여, 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질, 본 발명의 제5 양태의 핵산, 본 발명의 제6 양태의 벡터, 및/또는 본 발명의 제7 양태의 숙주 세포를 제공한다.
제11 양태에서, 본 발명은, 면역 반응을 억제하는 약제를 제조하는데 있어서, 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질, 본 발명의 제5 양태의 핵산, 본 발명의 제6 양태의 벡터, 및/또는 본 발명의 제7 양태의 숙주 세포의 이용을 제공한다.
제12 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 양태의 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태의 멀티머, 본 발명의 제3 양태의 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태의 다이머성 융합 단백질 및 그러한 폴리펩티드, 멀티머, 융합 단백질 또는 다이머성 융합 단백질에 공유적으로 부착되는 비폴리펩티드 성분(non-polypeptide moiety)을 포함하는 접합체(conjugate)를 제공하는데, 여기에서 상기 접합체는 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다.
본 발명의 다른 양태는 하기에 기술되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 CD80 또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나의 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 인간 CD86 세포외 도메인 또는 인간 CD80 세포외 도메인에서의 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 결합 친화도와 거의 동등하거나 그보다 큰, 인간 CD86 세포외 도메인 또는 인간 CD80 세포외 도메인에서의 결합 친화도를 각각 가지며, 상기 폴리펩티드는 선택적으로 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다. 그러한 폴리펩티드 일부는 인간 CD86 세포외 도메인에서의 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 결합 친화도보다 큰 인간 CD86 세포외 도메인에서의 결합 친화도를 가진다. 그러한 폴리펩티드 일부는 인간 CD80 세포외 도메인에서의 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 결합 친화도보다 큰 인간 CD80 세포외 도메인에서의 결합 친화도를 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 159에 나타난 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 서열번호 159에 대한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 변이체(mutant) CTLA-4 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 변이체 CTLA-4 폴리펩티드는 CD80 또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나의 세포외 도메인에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은, (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 및 (ii) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 상기 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하는 능력, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이들 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제할 수 있는 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 여기에서 상기 적어도 아미노산 치환은 S70F를 포함하고, 상기 아미노산 잔기 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨진다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 159에 나타난 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 11개, 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 서열번호 159에 대한 위치 24, 30, 32, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 잔기 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 변이체 CTLA-4 폴리펩티드는 CD80 또는 CD86 또는 이들 중 하나의 세포외 도메인에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 31에 나타난 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 다음의 것들 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공한다: 서열번호 31의 위치 50에 대응하는 위치에서 메티오닌 잔기, 서열번호 31의 위치 54에 대응하는 위치에서 리신 잔기, 서열번호 31의 위치 55에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 서열번호 31의 위치 64에 대응하는 위치에서 프롤린 잔기, 서열번호 31의 위치 65에 대응하는 위치에서 세린 잔기, 서열번호 31의 위치 70에 대응하는 위치에서 페닐알라닌 잔기, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 31에 따라 번호가 매겨지고, 상기 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 둘 중의 어느 하나 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 각 모노머성 변이체 융합 단백질에 존재하는 두 개의 시스테인 잔기들 사이에 형성되는 적어도 하나의 이황화 결합을 통하여 연결되는 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머를 제공하는데, 여기에서 각 모노머성 융합 단백질은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 (b) Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서 상기 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86, 및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머를 제공하는데, 그러한 모노머성 융합 단백질 각각은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 상기 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 그의 세포외 도메인에 결합하고 및/또는 면역 반응을 억제한다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머를 제공하는데, 여기에서 각 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기는 상기 선택된 폴리펩티드 서열의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일하며, 그리고 (2) Ig Fc 폴리펩티드, 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머를 제공하는데, 여기에서 각 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (i) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (ii) 서열번호 159의 폴리펩티드 서열에 대한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드; 및 (2) Ig Fc 폴리펩티드, 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해한다. 그러한 융합 단백질 다이머 일부는 (1) A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열번호 159에 대한 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환; 및 (2) Ig Fc 폴리펩티드, 여기에서 Ig Fc 폴리펩티드는 선택적으로 IgG2 Fc 폴리펩티드를 포함하고, 상기 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 26, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 50 및 서열번호 56으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 (i) CD80 및/또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 (ii) 면역 반응을 억제한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 (i) CD80 및/또는 CD86 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, (ii) CD80-Ig 융합 단백질 및/또는 CD86-Ig 융합 단백질에 결합하고, 및/또는 (iii) 면역 반응을 억제한다.
또한, 각 모노머성 변이체 융합 단백질에 존재하는 두 개의 시스테인 잔기들 사이에 형성되는 적어도 하나의 이황화 결합을 통하여 연결되는 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머가 제공되는데, 여기에서 각 모노머성 융합 단백질은 (a) 서열번호 79, 서열번호 197, 서열번호 198, 서열번호 199 및 서열번호 200으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서 상기 융합 단백질 다이머는 (i) CD80 및/또는 CD86, 및/또는 CD80 및/또는 CD86의 세포외 도메인에 결합하는 능력, (ii) CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig에 결합하는 능력, 및/또는 (iii) 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 그의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열; (b) (a)의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 단편을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 핵산은 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b), 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기가 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 상기 폴리펩티드 서열의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일하고, 여기에서 상기 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 서열번호 159에 대한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이들 중 어느 하나의 세포외 도메인에 결합하는 능력, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성 및 (ii) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 상기 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌 잔기를 가지는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86 또는 이들의 ECD에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하며, 여기에서 상기 아미노산 치환은 S70F를 선택적으로 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 폴리펩티드를 포함하는 재조합형 폴리펩티드 다이머를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 그러한 폴리펩티드 각각은 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기에서 상기 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86에 결합하며 및/또는 면역 반응을 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) Ig 폴리펩티드를 포함하는, 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 상기 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 31에 나타낸 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데: 서열번호 31의 위치 50에 대응하는 위치에서의 메티오닌 잔기, 서열번호 31의 위치 54에 대응하는 위치에서의 리신 잔기, 서열번호 31의 위치 55에 대응하는 위치에서의 글루탐산 잔기, 서열번호 31의 위치 64에 대응하는 위치에서의 프롤린 잔기, 서열번호 31의 위치 65에 대응하는 위치에서의 세린 잔기, 서열번호 31의 위치 70에 대응하는 위치에서의 페닐알라닌 잔기, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 31에 따라 번호가 매겨지고, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 벡터를 제공한다: (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 여기에서 상기 제1 폴리펩티드는 인간 CD86 및/또는 인간 CD80 및/또는 이들 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 억제하고, 및 (ii) 면역글로불린(immunoglobulin, Ig) 폴리펩티드의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 Ig 폴리펩티드는 선택적으로 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드이다.
다른 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질감염된 분리형 또는 재조합형 숙주 세포를 제공하는데, 상기 핵산은 다음을 포함한다: (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 여기에서 상기 제1 폴리펩티드는 인간 CD86 및/또는 인간 CD80 및/또는 이들 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 억제하는 능력을 가지며; 그리고 (ii) 면역글로불린(Ig) 폴리펩티드의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열, 상기 Ig 폴리펩티드는 선택적으로 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드이며, 여기에서 숙주 세포는 융합 단백질을 발현할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 B7-양성 세포를 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터 또는 세포의 유효한 양과 접촉시켜 면역 반응을 억제하는 방법을 포함하며, 여기에서 면역 반응을 그것에 의해 억제된다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 B7-양성 세포의 상호작용을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 B7-양성 세포를 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터 또는 세포의 유효한 양과 접촉시켜 B7-양성 세포와 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와의 상호작용을 조절하는 것을 포함하며, 여기에서 B7-양성 세포와 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와의 상호작용이 조절된다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와 B7-양성 세포의 상호작용을 저해하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 B7-양성 세포를 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터 또는 세포의 유효한 양과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와 B7-양성 세포의 상호작용은 저해된다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체 내에서 CD28-양성 T 세포와 B7-양성 세포의 상호작용을 저해하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 대상체에 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터 또는 세포의 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는데, 여기에서 대상체 내에서 내인성 CD28-양성 T 세포와 내인성 B7-양성 세포의 상호작용이 저해된다.
다른 양태에서, 본 발명은 내인성 T 세포와 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 내인성 세포의 상호작용에 의하여 조절되는 면역계 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 그러한 치료가 필요한 대상체에 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터 또는 세포의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 내인성 T 세포와 상기 CD80 및/또는 상기 CD86을 발현하는 내인성 세포 사이의 상호작용(들)은 저해되며, 따라서 대상체 내의 면역계 질환 또는 장애를 치료한다.
다른 양태에서, 본 발명은 수용자(recipient) 대상체에 의한 공여자(donor)의 조직 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 그것이 필요한 수용자 대상체에 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터 또는 세포의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하며, 그에 의하여 수용자 대상체에 의한 조직 또는 장기 이식의 거부를 저해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 만드는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (1) 배양 배지 내에서 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 것, 여기에서 핵산은 (i) 서열번호 1-73의 임의의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 여기서 폴리펩티드는 CD86 및/또는 CD80, 및/또는 CD86 또는 CD80 중 어느 하나의 세포외 도메인에 결합함, 및 (ii) 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Ig 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열, 그것에 의하여 핵산은 발현되고 융합 단백질은 생산됨; 그리고 (2) 융합 단백질을 회복하는 것.
또한 본 발명의 핵산을 세포의 집단에 도입하는 것, 여기에서 핵산은 핵산에 의하여 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 데 효과적인 조절 서열에 기능적으로 연결되어 있음; 세포를 배양 배지에서 배양하여 폴리펩티드를 생산하는 것; 그리고 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 분자(예, 변이체 CTLA-4 분자), 및 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 발명의 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 포함된다.
본 발명의 추가적인 양태는 하기에 기술되어 있다.
도 1은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 플라스미드 발현 벡터 pCDNA 변이체 CTLA-4-Ig의 도식이다. 도 1에서, 각 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 C-말단에서 인간 IgG2(hIgG2) Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합된 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다.
도 2a-2d는 각각 예시적인 hCD80-Ig, hCD86-Ig, LEA29Y-Ig 및 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질의 도식이다. 각 융합 단백질의 신호 펩티드, 세포외 도메인(ECD), 링커(만약 있다면) 및 Ig Fc 도메인이 도식적으로 나타나 있다. 신호 펩티드, ECD, 링커(만약 있다면) 및 Ig Fc 사이의 연결점(junction)에 존재하는 아미노산 잔기가 또한 나타나 있다. 각 융합 단백질의 신호 펩티드는 가공 중에 일반적으로 절단되며(cleaved), 따라서 분비(secreted)(성숙(mature)) 융합 단백질은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 도 2d는 C-말단에서 인간 IgG2 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 융합된 인간 CTLA-4 세포외 도메인(“hCTLA-4 ECD”)을 포함하는 인간 CTLA-4-IgG2(“hCTLA-4-IgG2”) 융합 단백질의 도식을 나타낸다. 이 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질의 예측된 폴리펩티드 서열은 서열번호 161에 나타냈으며, 다음 분절을 포함한다: hCTLA-4 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-37), hCTLA-4 ECD 폴리펩티드(아미노산 잔기 38-161) 및 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드(아미노산 잔기162-389). hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단과 인간 IgG2 Fc의 N-말단 사이에 어떠한 링커(예, 어떠한 아미노산 잔기(들))도 포함되지 않는다. 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG2의 힌지(hinge), CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 도 2d에, 이들 다양한 분절들 사이의 연결점에서의 아미노산 잔기가 나타나 있다. 특히, 신호 펩티드의 마지막 4개의 아미노산 잔기, hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 처음의 5개의 아미노산 잔기와 마지막 5개의 아미노산 잔기, 그리고 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 처음의 5개 아미노산 잔기와 마지막 5개의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
신호 펩티드는 일반적으로 가공 중에 절단되며, 따라서 hCTLA-4-IgG2의 분비 융합 단백질(성숙 융합 단백질)은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 이러한 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질의 성숙 또는 분비 형태의 폴리펩티드 서열이 서열번호 162에 나타나 있다. hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 서열은 서열번호 162의 아미노산 잔기 1-124를 포함하고, 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 서열은 서열번호 162의 아미노산 잔기 125-352를 포함한다. 다른 양태에서, 이 성숙 hCTLA-4 Ig 융합 단백질은 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며, 따라서 서열번호 162의 아미노산 잔기 1-351을 포함한다.
총 352개의 아미노산을 가진, 성숙 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질은, 서열번호 160에 나타낸 전장(full-length) WT hCTLA-4 단백질의 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 38-389를 포함하며, 메티오닌-히스티딘-발린-알라닌의 아미노산 서열로 시작한다. 원하면, 성숙 형태의 아미노산은, 서열번호 162에서와 같이, 첫 번째 잔기로서 Met를 지정하여, Met-His-Val-Ala 서열의 Met와 함께 시작하여 번호가 매겨질 수 있다(예를 들어, ECD는 1-124로 번호가 매겨진 아미노산 잔기들을 포함함). 성숙 Hctla-4IgG2 다이머는, 달리 명시되어 있지 않으면, 아래에 기술되는 실시예들의 분석에서 일반적으로 사용되는 융합 단백질의 형태이다. hIgG2 폴리펩티드로 융합된 hCTLA-4 ECD를 포함하는, hCTLA-4-IgG2 융합 단백질을 를 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호 163에 나타나 있다.
도 3은 다음 단백질의 SDS/PAGE 분석을 나타낸다: 다양한 중량(킬로달톤(kilodaltons, (kDa))의 분자량 마커(레인 1); 클론 D3에 기반하는 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(즉, D3-IgG2)(레인 2); 클론 D4에 기반하는 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(즉, D4-IgG2)(레인 3); 및 Orencia®(아바타셉트(Abatacept)) 융합 단백질(레인 4)(Bristol-Myers Squibb사, Princeton, NJ).
도 4는 SEC 분석으로부터 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(즉, D3-IgG2)의 용출 프로파일을 나타내는데, 이것은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이, 일시적으로 형질감염된(transiently-transfected) COS 세포로부터 정제될 때, 크기에 있어서 균질하다는 것을 입증한다.
도 5는 다음의 융합 단백질이 hCD86-Ig에 결합한 것에 대한 일반적인 BiacoreTM 분석을 나타낸 것이다: Orencia® 융합 단백질, LEA29Y-Ig 및 D3-IgG2. 분석의 해리 상태는 화살표로 표시된 시간에 시작한다. 변이체 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드로 융합된 야생형 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 구성된, Orencia® 융합 단백질은 야생형 인간 CTLA-4-Ig 대조군으로서 효과적으로 역할을 한다. Orencia® 융합 단백질보다 CD86-Ig에 대하여 더 높은 결합활성으로 결합하는, D3-IgG2와 같은, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia® 단백질보다 CD86-Ig로부터의 해리 속도가 더 낮다.
도 6은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-04-IgG2, D3-11-IgG2, D3-12-IgG2, D3-14-IgG2)을 수반하는 PBMC 증식 저해 분석(항-CD3 항체 자극을 이용)의 결과의 그래프를 표현한 것이다. 이러한 분석은 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는데 있어서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 Orencia® 및 LEA29Y-Ig보다 유의하게 더 효능이 있다는 것을 보여준다.
도 7은 본 발명의 예시적인 세트의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 수반하는 CD4+ T 세포 증식 저해 분석(항-CD3 자극 및 hB7.2-의존성 보조자극을 이용)의 그래프를 표현한 것이다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함시켰다.
도 8은 본 발명의 예시적인 세트의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 수반하는 PBMC 증식 저해 분석(PPD 항원 자극을 이용)의 그래프를 표현한 것이다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig를 비교를 위한 대조군으로서 포함시켰다.
도 9는 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-IgG2)을 수반하는 일-방향 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 증식 저해 분석의 그래프를 표현한 것이다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함시켰다.
도 10은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 구조를 보여 주는 도식이다. 두 개의 동일한 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 도식적으로 나타나 있는데, 각각은 C-말단에서 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합된 성숙 변이체 CTLA-4 ECD를 포함한다. 각 인간 IgG2 폴리펩티드는 IgG2 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. ECD 및 Ig Fc 폴리펩티드 사이의 연결점에 존재하는 예시적인 아미노산 잔기 또한 나타나 있다. 이들 성분들 사이의 연결점에서의 아미노산 잔기는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열 및/또는 Ig 폴리펩티드 서열에 따라 서로 다를 수 있다. 다이머성 융합 단백질은 두 개의 모노머에서 유사 위치(analogous positions)에서의 시스테인 잔기들 사이에 적어도 하나의 이황화 결합이 형성하는 것으로부터 온다. 두 개의 모노머들 사이에 이황화 결합을 형성하는 데에 잠재적으로 수반되는 시스테인(C) 잔기는 별표로 표시되어 있다. 각 모노머성 융합 단백질의 신호 펩티드는 일반적으로 가공 중에 절단되며, 따라서 분비(성숙) 융합 단백질은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다.
도 11은 hCTLA-4-IgG2, Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 수반하는 CD4+ T 세포 증식 분석(항-CD3 자극 및 hB7.2-의존성 보조자극을 이용)의 그래프를 표현한 것이다.
도 12a-12f는 야생형 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열(도면에서 “hCTLA4ECD”로 지정됨), LEA29Y 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열(도면에서 “LEA29YECD”로 지정됨) 및 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열의 배열을 나타낸다. 본 발명의 이러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 클론 이름은 좌측에 나타나 있다. 야생형 인간 CTLA-4 ECD의 것과 동일한 아미노산 잔기는 온점(.)으로 나타나 있다.
도 13은 BLOSUM62 매트릭스를 나타낸다.
도 14A-14D는 두 아미노산 서열에서 예시적인 배열 및 수작업 계산에 의하여 결정된 배열 점수를 보여준다.
도 15a-15b는 래트(rats)에 단일 (A) 정맥내(IV) 볼루스(bolus) 또는 (B) 피하(SC) 주사로서 1mg/kg으로 투여된 Orencia® 융합 단백질, 인간 CTLA-4-IgG2 및 본 발명의 대표적인 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에서의 약물동역학(PK) 프로파일을 보인 것이다.
도 2a-2d는 각각 예시적인 hCD80-Ig, hCD86-Ig, LEA29Y-Ig 및 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질의 도식이다. 각 융합 단백질의 신호 펩티드, 세포외 도메인(ECD), 링커(만약 있다면) 및 Ig Fc 도메인이 도식적으로 나타나 있다. 신호 펩티드, ECD, 링커(만약 있다면) 및 Ig Fc 사이의 연결점(junction)에 존재하는 아미노산 잔기가 또한 나타나 있다. 각 융합 단백질의 신호 펩티드는 가공 중에 일반적으로 절단되며(cleaved), 따라서 분비(secreted)(성숙(mature)) 융합 단백질은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 도 2d는 C-말단에서 인간 IgG2 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 융합된 인간 CTLA-4 세포외 도메인(“hCTLA-4 ECD”)을 포함하는 인간 CTLA-4-IgG2(“hCTLA-4-IgG2”) 융합 단백질의 도식을 나타낸다. 이 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질의 예측된 폴리펩티드 서열은 서열번호 161에 나타냈으며, 다음 분절을 포함한다: hCTLA-4 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-37), hCTLA-4 ECD 폴리펩티드(아미노산 잔기 38-161) 및 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드(아미노산 잔기162-389). hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단과 인간 IgG2 Fc의 N-말단 사이에 어떠한 링커(예, 어떠한 아미노산 잔기(들))도 포함되지 않는다. 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG2의 힌지(hinge), CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 도 2d에, 이들 다양한 분절들 사이의 연결점에서의 아미노산 잔기가 나타나 있다. 특히, 신호 펩티드의 마지막 4개의 아미노산 잔기, hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 처음의 5개의 아미노산 잔기와 마지막 5개의 아미노산 잔기, 그리고 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 처음의 5개 아미노산 잔기와 마지막 5개의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
신호 펩티드는 일반적으로 가공 중에 절단되며, 따라서 hCTLA-4-IgG2의 분비 융합 단백질(성숙 융합 단백질)은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 이러한 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질의 성숙 또는 분비 형태의 폴리펩티드 서열이 서열번호 162에 나타나 있다. hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 서열은 서열번호 162의 아미노산 잔기 1-124를 포함하고, 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 서열은 서열번호 162의 아미노산 잔기 125-352를 포함한다. 다른 양태에서, 이 성숙 hCTLA-4 Ig 융합 단백질은 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며, 따라서 서열번호 162의 아미노산 잔기 1-351을 포함한다.
총 352개의 아미노산을 가진, 성숙 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질은, 서열번호 160에 나타낸 전장(full-length) WT hCTLA-4 단백질의 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 38-389를 포함하며, 메티오닌-히스티딘-발린-알라닌의 아미노산 서열로 시작한다. 원하면, 성숙 형태의 아미노산은, 서열번호 162에서와 같이, 첫 번째 잔기로서 Met를 지정하여, Met-His-Val-Ala 서열의 Met와 함께 시작하여 번호가 매겨질 수 있다(예를 들어, ECD는 1-124로 번호가 매겨진 아미노산 잔기들을 포함함). 성숙 Hctla-4IgG2 다이머는, 달리 명시되어 있지 않으면, 아래에 기술되는 실시예들의 분석에서 일반적으로 사용되는 융합 단백질의 형태이다. hIgG2 폴리펩티드로 융합된 hCTLA-4 ECD를 포함하는, hCTLA-4-IgG2 융합 단백질을 를 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호 163에 나타나 있다.
도 3은 다음 단백질의 SDS/PAGE 분석을 나타낸다: 다양한 중량(킬로달톤(kilodaltons, (kDa))의 분자량 마커(레인 1); 클론 D3에 기반하는 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(즉, D3-IgG2)(레인 2); 클론 D4에 기반하는 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(즉, D4-IgG2)(레인 3); 및 Orencia®(아바타셉트(Abatacept)) 융합 단백질(레인 4)(Bristol-Myers Squibb사, Princeton, NJ).
도 4는 SEC 분석으로부터 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(즉, D3-IgG2)의 용출 프로파일을 나타내는데, 이것은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이, 일시적으로 형질감염된(transiently-transfected) COS 세포로부터 정제될 때, 크기에 있어서 균질하다는 것을 입증한다.
도 5는 다음의 융합 단백질이 hCD86-Ig에 결합한 것에 대한 일반적인 BiacoreTM 분석을 나타낸 것이다: Orencia® 융합 단백질, LEA29Y-Ig 및 D3-IgG2. 분석의 해리 상태는 화살표로 표시된 시간에 시작한다. 변이체 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드로 융합된 야생형 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 구성된, Orencia® 융합 단백질은 야생형 인간 CTLA-4-Ig 대조군으로서 효과적으로 역할을 한다. Orencia® 융합 단백질보다 CD86-Ig에 대하여 더 높은 결합활성으로 결합하는, D3-IgG2와 같은, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia® 단백질보다 CD86-Ig로부터의 해리 속도가 더 낮다.
도 6은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-04-IgG2, D3-11-IgG2, D3-12-IgG2, D3-14-IgG2)을 수반하는 PBMC 증식 저해 분석(항-CD3 항체 자극을 이용)의 결과의 그래프를 표현한 것이다. 이러한 분석은 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는데 있어서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 Orencia® 및 LEA29Y-Ig보다 유의하게 더 효능이 있다는 것을 보여준다.
도 7은 본 발명의 예시적인 세트의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 수반하는 CD4+ T 세포 증식 저해 분석(항-CD3 자극 및 hB7.2-의존성 보조자극을 이용)의 그래프를 표현한 것이다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함시켰다.
도 8은 본 발명의 예시적인 세트의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 수반하는 PBMC 증식 저해 분석(PPD 항원 자극을 이용)의 그래프를 표현한 것이다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig를 비교를 위한 대조군으로서 포함시켰다.
도 9는 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-IgG2)을 수반하는 일-방향 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 증식 저해 분석의 그래프를 표현한 것이다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함시켰다.
도 10은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 구조를 보여 주는 도식이다. 두 개의 동일한 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 도식적으로 나타나 있는데, 각각은 C-말단에서 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합된 성숙 변이체 CTLA-4 ECD를 포함한다. 각 인간 IgG2 폴리펩티드는 IgG2 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. ECD 및 Ig Fc 폴리펩티드 사이의 연결점에 존재하는 예시적인 아미노산 잔기 또한 나타나 있다. 이들 성분들 사이의 연결점에서의 아미노산 잔기는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열 및/또는 Ig 폴리펩티드 서열에 따라 서로 다를 수 있다. 다이머성 융합 단백질은 두 개의 모노머에서 유사 위치(analogous positions)에서의 시스테인 잔기들 사이에 적어도 하나의 이황화 결합이 형성하는 것으로부터 온다. 두 개의 모노머들 사이에 이황화 결합을 형성하는 데에 잠재적으로 수반되는 시스테인(C) 잔기는 별표로 표시되어 있다. 각 모노머성 융합 단백질의 신호 펩티드는 일반적으로 가공 중에 절단되며, 따라서 분비(성숙) 융합 단백질은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다.
도 11은 hCTLA-4-IgG2, Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 수반하는 CD4+ T 세포 증식 분석(항-CD3 자극 및 hB7.2-의존성 보조자극을 이용)의 그래프를 표현한 것이다.
도 12a-12f는 야생형 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열(도면에서 “hCTLA4ECD”로 지정됨), LEA29Y 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열(도면에서 “LEA29YECD”로 지정됨) 및 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열의 배열을 나타낸다. 본 발명의 이러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 클론 이름은 좌측에 나타나 있다. 야생형 인간 CTLA-4 ECD의 것과 동일한 아미노산 잔기는 온점(.)으로 나타나 있다.
도 13은 BLOSUM62 매트릭스를 나타낸다.
도 14A-14D는 두 아미노산 서열에서 예시적인 배열 및 수작업 계산에 의하여 결정된 배열 점수를 보여준다.
도 15a-15b는 래트(rats)에 단일 (A) 정맥내(IV) 볼루스(bolus) 또는 (B) 피하(SC) 주사로서 1mg/kg으로 투여된 Orencia® 융합 단백질, 인간 CTLA-4-IgG2 및 본 발명의 대표적인 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에서의 약물동역학(PK) 프로파일을 보인 것이다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어들은 단지 특별한 구체예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도하지 않는다는 것을 또한 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명과 관련된 기술 분야에서 통상의 기술자에 의하여 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
용어 “핵산”과 “폴리뉴클레오티드”는 상호교환적으로 사용되어 단일- 또는 이중-가닥 형태의 핵산 잔기의 폴리머(예, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 지칭한다. 특별히 제한하지 않으면, 이 용어는 참조(reference) 핵산과 유사한 결합 성질을 가지며 자연적으로-발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 표현되지 않는다면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 개질된 변형체(variant)(예, 축퇴성 코돈 치환(degenerate codon substitutions)) 및 상보적 핵산 서열은 물론이고 명백하게 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 성취될 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260:2605 2608 (1985); 및 Cassol 등 (1992); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91 98 (1994)). 용어 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 유전자에 의하여 인코딩된 cDNA 또는 mRNA와 함께 상호교환적으로 사용된다.
용어 “유전자”는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산 분절(예, DNA)을 광범위하게 지칭한다. 유전자는 발현을 위해 요구되는 코딩 서열(coding sequence) 및/또는 조절 서열(regulatory sequence)을 포함할 수 있다. 유전자는 또한 예로써, 다른 단백질(들)을 위한 인식 서열(예, 프로모터(promotor), 인핸서(enhancer) 또는 다른 조절 영역)을 형성하는 비발현된 DNA 핵산 분절(들)을 포함할 수 있다. 유전자는 관심의 소스로부터의 클로닝 또는 공지 또는 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하여, 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 원하는 파라미터를 가지도록 설계된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
용어 “폴리펩티드”, “펩티드” 및 “단백질”은 상호교환적으로 사용되어 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다. 이 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 당해 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학 의태체가 되는 아미노산 폴리머는 물론, 자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머에, 적용한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는, 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하여, 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하는데, 여기에서 아미노산 잔기들은 공유 펩티드 결합에 의하여 연결되어 있다.
주어진 아미노산 폴리머 또는 핵산 폴리머의 번호매김은, 임의의 주어진 폴리머 성분(예, 아미노산, 뉴클레오티드, 일반적으로 “잔기”로도 지칭됨)의 위치가, 주어진 폴리머에서 성분의 실제 수치 위치에 의한 것보다, 선택된 아미노산 또는 핵산 폴리머에서 동일한 또는 동등한 위치에 근거한 것에 의하여 지정될 때, 선택된 아미노산 폴리머 또는 핵산 폴리머의 번호 매김에 “대응”하거나 “관련”있다. 따라서, 예를 들어, 주어진 폴리펩티드 서열에서 주어진 아미노산 위치의 번호매김은 참조 서열로서 사용된 선택된 폴리펩티드 서열에서의 동일한 또는 동등한 아미노산 위치에 대응한다.
“동등한 위치”(예를 들어, “동등한 아미노산 위치” 또는 “동등한 핵산 위치” 또는 “동등한 잔기 위치”)는 본 명세서에서는, 본 명세서에 기술된 배열 알고리즘을 이용하여 배열될 때(바람직하게는 최적으로 배열됨), 참조 폴리펩티드(또는 참조 폴리뉴클레오티드) 서열의 대응 위치에 정렬되는 테스트 폴리펩티드(또는 테스트 폴리뉴클레오티드) 서열의 위치(아미노산 위치 또는 핵산 위치 또는 잔기 위치와 같은)로 정의된다. 테스트 폴리펩티드 서열의 동등한 아미노산 위치는 테스트 폴리펩티드의 대응 위치와 동일한 수치 위치 번호를 가질 필요가 없다. 마찬가지로, 테스트 폴리뉴클레오티드 서열의 동등한 핵산 위치는 테스트 폴리뉴클레오티드의 대응 위치와 동일한 수치 위치 번호를 가질 필요가 없다.
“변이체” 폴리펩티드는 부모 또는 참조 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열(예를 들어, 야생형(wide type, WT) 폴리펩티드 서열과 같은)과 하나 이상의 아미노산 잔기로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 부모 또는 참조 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 부모 또는 참조 폴리펩티드 서열의 잔기의 총 수의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30% 40%, 50% 또는 그 이상으로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 부모 또는 참조 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 부모 또는 참조 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 1개 내지 100개 이상의 아미노산 잔기(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 아미노산 잔기)로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 변이체 폴리펩티드는, 예컨대 부모 또는 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 아미노산 잔기)의 결실, 첨가 또는 치환, 또는 그러한 결실(들), 첨가(들) 및/또는 치환(들)의 임의의 조합에 의하여, 부모 또는 참조 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 상이한 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
“변이체” 핵산은 부모 또는 참조 핵산(WT 핵산과 같은)의 뉴클레오티드 서열과 하나 이상의 핵산 잔기로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 변이체 핵산은 부모 또는 참조 핵산의 뉴클레오티드 서열과 부모 또는 참조 뉴클레오티드 서열의 총 수의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30% 40%, 50% 또는 그 이상으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체 핵산은 부모 또는 참조 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체 핵산은 부모 또는 참조 핵산의 뉴클레오티드 서열과는 1개 내지 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기)로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 변이체 핵산은, 예컨대 부모 또는 참조 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기)의 결실, 첨가 또는 치환, 또는 그러한 결실(들), 첨가(들) 및/또는 치환(들)의 임의의 조합에 의하여, 부모 또는 참조 핵산의 것과 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산에 있어서의 변이는 뉴클레오티드의 대안적 스플라이싱(splicing) 또는 트렁케이션(truncation), 또는 뉴클레오티드의 가공 또는 절단(cleavage)에서의 에러로부터 일어날 수도 있다. 참조 또는 부모 핵산은 그 자체가 변이체 핵산이 될 수 있다.
대상에 적용되는 “자연적으로 발생하는”은 대상이 인간에 의하여 인공적으로 생산되는 것과 명백히 구별되는 자연적으로 발견된다는 것을 의미한다. 대상에 적용되는 “비-자연적으로 발생하는”은 대상이 자연적으로 발생하지 않는다(즉, 대상이 자연에서 발견될 수 없다)는 것을 의미한다. 예를 들어, 비자연적으로 발생하는 폴리펩티드는, 예컨대, 시험관 내에서 합성되거나 인공적으로 제조되었던 것과 같이, 인간에 의하여 제조되었던 폴리펩티드를 지칭한다.
관심의 서열의 “부분서열” 또는 “단편”은 관심의 전체 서열까지는 포함하지 않는, 전체 서열의 임의의 부분이다.
핵산, 단백질 또는 다른 성분은, 그것이 정상적으로 관련되어 있는 성분(다른 단백질, 핵산, 세포, 합성 시약 등)으로부터 그것이 부분적으로 또는 완전히 따로 떨어질 때, “분리(isolated)”된다. 몰 기준(molar basis)에서, 분리형 종(species)은 조성물에서 다른 종들보다 더 풍부하다. 예를 들어, 분리형 종은 존재하는 모든 거대분자 종들의 적어도 약 50%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(몰 기준)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 관심의 종은 기본적인 동질성(essential homogeneity)으로 정제된다(즉, 오염종은 통상적인 검출 방법에 의하여 조성물 내에서 검출될 수 없다). 순수성과 동질성은, 단백질 또는 핵산 샘플의 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은, 당해 분야에서 잘 알려진 많은 기술을 이용하여 결정되고, 염색시 시각화될 수 있다. 원한다면, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)와 같은 고-정밀도 기술이나 유사한 수단이 물질의 정제를 위하여 이용될 수 있다.
핵산이나 폴리펩티드에 적용되는 용어 “정제된”은, 당해 분야에서 잘 알려진 분석 기술에 의하여 결정될 때 다른 성분이 본질적으로 없는 핵산 또는 폴리펩티드를 나타낸다(예컨대, 정제된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 전기영동 겔, 크로마토그래프 용출물, 및/또는 밀도 경사 원심분리 처리 매질에서 불연속 밴드(discrete band)를 형성한다). 예를 들어, 전기영동 겔 내에서 본질적으로 하나의 밴드를 생기게 하는 핵산 또는 폴리펩티드는 “정제된” 것이다. 정제된 핵산 또는 폴리펩티드는 적어도 약 50% 순수하고, 보통은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 그 이상 순수하다(예컨대, 몰 기준으로 중량 퍼센트).
관련하여, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 본 발명의 하나 이상의 분자를 위한 조성물을 농축하는 방법을 제공한다. 정제 또는 농축 기술의 적용 후 분자의 농도의 실질적인 증가가 있을 때에 분자를 위한 조성물은 농축된다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 특정 조성물에 있어서 모든 거대분자 종의 중량에 대하여 (몰 기준으로) 적어도 약 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상을 포함할 것이다.
핵산 또는 폴리펩티드는, 그것이 인공적인 또는 가공적이거나, 인공적인 또는 가공적인 단백질 또는 핵산으로부터 유도될 때, “재조합형”이다.
세포에 관하여 사용될 때의 용어 “재조합형”은 일반적으로 세포가 이종 핵산(heterologous nucleic acid)을 복제하거나 이종 핵산에 의하여 인코딩된 폴리펩티드를 발현한다는 것을 나타낸다. 재조합형 세포는 세포의 고유(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 포함할 수 있다. 또한 재조합형 세포는 세포의 고유 형태에서 발견되나, 인공적인 수단에 의하여 변형되거나 세포 내로 재도입되는 유전자를 포함하는 것들을 포함한다. 또한 이 용어는, 세포에서 핵산을 제거하지 않고 변형된 세포에 대하여 내인성의 핵산을 포함하는 세포를 포함할 수 있다; 그러한 변형은 유전자 교체(gene replacement), 부위-지정 돌연변이(site-specific mutation) 및 당해 분야에서 통상의 기술자들에게 알려진 관련 기술에 의하여 얻어지는 것들을 포함한다. 재조합 DNA 기술은 시험관 내에서 재조합 DNA를 생산하고 그것이 발현되거나 번식될 수 있는 세포 내로 재조합 DNA를 운반하여, 그것에 의하여 재조합 폴리펩티드를 생산하는 기술을 포함한다.
“재조합 발현 카세트” 또는 간단히 “발현 카세트”는 그러한 서열과 양립할 수 있는 숙주 내의 구조 유전자의 발현을 가져올 수 있는 핵산 성분과 함께, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 핵산 구성체이다. 발현 카세트는 적어도 프로모터 및 선택적으로는 전사 종료 신호를 포함한다. 일반적으로, 재조합 발현 카세트는 전사될 핵산(희망하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산)과 프로모터를 포함한다. 발현을 가져오는 데 필요하거나 도움이 되는 추가 요소 또한 본 명세서에 기술되는 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 숙주 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 지시하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함할 수 있다. 전사 종료 신호, 인핸서 및 유전자 발현에 영향을 주는 다른 핵산 서열은, 또한 발현 카세트에 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 “외인성” 핵산, “외인성 DNA 분절”, “이종 서열(heterologous sequence)”, 또는 “이종 핵산”은, 특정 숙주 세포에 이질적인 소스로부터 기인하거나, 동일한 소스로부터 기인한 것이라면 그의 원형으로부터 변형되는 것이다. 따라서, 숙주 세포 내의 이종 유전자는 특정 숙주 세포에 내인성이지만, 변형된 유전자를 포함한다. 본 명세서에서 기술되는 응용에서의 이종 서열의 변형은 일반적으로 방향성 분자 진화(directed molecular evolution) 방법의 이용을 통하여 일어난다. 따라서, 상기 용어는 세포에 이질적이거나 이종인, 또는 상기 요소가 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내에 위치하는 것을 제외하고 세포에 동종인 DNA 분절을 지칭한다. 외인성 핵산 또는 외인성 DNA가 발현되어 외인성 폴리펩티드를 생산한다.
“벡터”는 숙주 세포에서 핵산을 전달하거나 유지할 수 있는 임의의 제제일 수 있으며, 예를 들어, 플라스미드(예, DNA 플라스미드), 네이키드 핵산, 바이러스 벡터, 바이러스, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 기타 분자와 복합된 핵산은 물론이고, 고체 상태 입자 상으로 고정화된 핵산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 벡터는 하기에 자세히 기술되어 있다. 벡터는 숙주 세포에서 외인성 유전자 및/또는 단백질을 전달하거나 유지하는 제제로서 유용할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입하거나(transducing), 형질감염하거나(transfecting), 형질전환하여(transforming), 세포가 세포에 고유한 것들 이외의 핵산 및/또는 단백질을 또는 세포에 고유하지 않는 방식으로 복제하거나 발현하게 한다. 벡터는, 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅, 등과 같이, 세포 내로 핵산이 인입하는 것을 돕는 물질을 포함할 수 있다. 세포 내로 핵산을 전달하는 임의의 방법이 사용될 수 있다; 달리 표시되지 않으면, 이 용어 벡터는 세포 내로 핵산을 운반하는 임의의 특정 방법을 의미하거나 임의의 특정 세포 타입이 형질도입의 주체라는 것을 의미하지 않는다. 본 발명은, 예컨대, CD80 및/또는 CD86 또는 그의 단편(예, CD80 ECD 또는 CD86 ECD)에 결합하는 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 또는 그의 단편(예, 변이체 CTLA-4 ECD)을 인코딩하는 핵산을 포함하여, 본 발명의 임의의 핵산을 운반하거나 유지하는 임의의 특정 벡터에 한정되지 않는다.
용어 “발현 벡터”는, 숙주 세포 내에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 성분과 함께, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는, 핵산 구성체 또는 서열을 일반적으로 지칭한다. 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결되는 전사될 핵산을 일반적으로 포함한다. 용어 “발현”은, 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및/또는 분비를 포함하나 이에 한정되지 않는, 폴리펩티드의 생산에 수반되는 임의의 단계를 포함한다.
“신호 펩티드”는 관심의 폴리펩티드에 일반적으로 선행하는 펩티드(또는 아미노산) 서열이며, 폴리펩티드와 결합되어 번역되며, 폴리펩티드를 분비 시스템으로 가게 하거나 그것을 용이하게 한다. 신호 펩티드는 일반적으로 관심의 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유적으로 부착되거나 융합되며, 숙주 세포로부터 관심의 폴리펩티드의 분비를 용이하게 한다. 신호 펩티드는 일반적으로 번역 후 관심의 폴리펩티드로부터 절단된다.
용어 “인코딩”은 하나 이상의 아미노산에 대한 뉴클레오티드 서열의 코드 능력을 지칭한다. 이 용어는 시작 또는 중지 코돈을 필요로 하지 않는다. 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 서열 및 그의 보체에 의하여 제공된 여섯 개의 상이한 리딩 프레임(reading frames) 중 임의의 하나에서 인코딩될 수 있다.
용어 “제어 서열(control sequence)”은 본 명세서에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 필요하거나 유리한, 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각 제어 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 고유하거나 이질적일 수 있다. 그러한 제어 서열은, 리더(leader), 폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence), 프로펩티드 서열(propeptide sequence), 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 종결자(transcription terminator)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 제어 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 함께 제어 서열의 결찰을 용이하게 하는 특이 제한 부위를 도입할 목적으로 링커와 함께 제공될 수 있다.
용어 “코딩 서열”은 그의 단백질 생산물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 서열의 경계는, ATG 시작 코돈과 함께 시작할 수 있는, 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)에 의하여 일반적으로 결정된다.
핵산은, 그것이 다른 핵산 서열과 함께 기능적 관계로 들어설 때, 또 다른 핵산 서열과 함께 “작동적으로 연결”되어 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는, 그것이 코팅 서열의 전사를 지시한다면, 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된다는 것은, 연결되어 있는 DNA 서열이, 두 단백질 코딩 영역의 결합이 필요한 곳에서, 일반적으로 인접하고 있으며, 리딩 프레임에서 인접하고 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 수 킬로베이스 만큼 프로모터로부터 떨어질 때 일반적으로 기능하며, 인트론 서열은 가변 길이를 가질 수 있으므로, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동적으로 연결되나 인접하지 않을 수 있다.
“숙주 세포”는 핵산과 함께 형질전환하기 쉬운 임의의 세포이다.
“실질적으로 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이” 또는 “실질적으로 폴리펩티드 서열의 전체 길이”는, 각각, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상을 지칭한다.
“항원”은 특정 면역원에 의하여 자극된 면역 반응의 생산물(들)과 반응하는 물질을 지칭한다. JULIUS CRUSE 등, ATLAS OF IMMUNOLOGY 60 (1999); RICHARD COICO 등, IMMUNOLOGY: A SHORT COURSE 27-30 (제5판. 2003)을 참조. 면역 반응은 체액 반응 및/또는 세포-매개성 면역 반응(예, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs))을 포함할 수 있다. 면역 반응의 생산물은 항체 및/또는 CTLs를 포함할 수 있다. 항원은 일반적으로 숙주에 이질적인 거대 분자(예, 폴리펩티드, 핵산, 복합 탄수화물, 인지질, 다당류)인데; 항원 결정자로 알려진 항원의 부분이, 항체 또는 T 림프구 상의 특이적 T 세포 수용체와 같은, 면역 반응의 생산물(들)과 반응한다(예, 결합한다). 항원은, 반드시 그런 것은 아니지만, 면역 반응을 유도하는 것은 물론이고 면역 반응의 생산물(들)과 반응한다. “항원성”은 항원성이 되는 상태 또는 성질- 즉, 항원의 성질을 가지는 것을 지칭한다. 항원의 특이성은 그의 항체에 대한 항원의 관계 또는 그 반대의 관계에서 보여질 수 있다; 항원은 일반적으로 그의 대응 항체와 높은 특이적 방식으로 반응하며 면역원에 의하여 유발되는 다른 항체와는 동일한 특이성 정도로 반응하지 않는다. “항원량”은 특이적 면역원에 의하여 자극되는 면역 반응의 생산물(들)과 검출가능하게 반응하는 항원의 양이다.
“면역원”은 면역 내성(immunological tolerance)보다 면역 반응을 유도할 수 있는 물질이다. 예컨대, 앞의 JULIUS CRUSE 등의 60-61; 앞의 RICHARD COICO의 27-30을 참조. 면역원은 또한 그것들에 대항하여 특이적으로 유도되는 유도된 면역 반응의 생산물(들)과 반응한다(예, 결합한다). 따라서, 모든 면역원은 항원이다. “면역원성”은 면역원성이 되는 상태 또는 성질- 즉, 면역원의 성질을 가지는 것을 지칭한다. “면역원량”은 검출가능한 면역 반응을 효과적으로 유도하는 면역원의 양이다. 면역원은, 적어도 하나의 병원체에 대한 적어도 부분적인 또는 완전한 방어 면역성과 같이, 대상체 내에서 강한 면역 반응을 일으킬 수 있다.
면역조절 폴리펩티드 또는 핵산과 같은, “면역조절제” 또는 “면역조절” 분자는 면역 반응을 조절한다. 면역 반응의 “조절” 또는 그것을 “조절하는 것”은 면역 반응을 변경하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 대상체 내에서 면역 반응의 “조절” 또는 그것을 “조절하는 것”은 대상체 내에서 면역 반응이 자극되거나, 유도되거나, 저해되거나, 감소되거나, 억제되거나, 증가되거나, 증진되거나, 그렇지 않으면 변경된다는 것을 일반적으로 의미한다. 면역 반응의 그러한 조절은, 하기에 기술된 것들을 포함하여, 당해 분야의 숙련된 자들에 알려진 수단에 의하여 평가될 수 있다. “면역억제자” 또는 “면역억제제”는, 면역 반응을 억제하는 폴리펩티드 또는 핵산과 같은, 분자이다.
본 명세서에 사용된 “항체”(“Ab”로 축약함)는, 자연적으로 또는 전적으로나 또는 부분적으로 합성으로 생산되든지 아니든지, 면역글로불린 단백질(“Ig”로 축약)을 지칭한다. 이 용어는 항원에 대한 특이적 결합 능력을 유지하는 그의 모든 유도체를 포함한다. 또한 이 용어는 면역글로불린 결합 도메인에 동질적이거나 대체로 동질적인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 그러한 단백질은 천연 원료로부터 유도되거나, 또는 부분적으로 또는 전적으로 합성으로 생산될 수 있다. 항체는 모노클론이거나 폴리클론일 수 있다. 항체는, 다음의 5개의 인간 클래스 중 임의의 하나를 포함하여, 임의의 면역글로불린 클래스의 멤버일 수 있다: IgA(서브클래스 IgA1 및 IgA2를 포함함), IgD, IgE, IgG(서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함함) 및 IgM. 항체는 쌍을 이룬 중 및 경의 폴리펩티드 사슬(heavy and light polypeptide chain)을 포함하며, 각각의 그러한 사슬은 개개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다. 각 사슬은 불변(constant, C) 영역 및 가변(variable, V) 영역을 포함한다. 일반적인 항체 구조 유닛은 테트라머(tetramer)를 포함한다. 각 테트라머는 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되어 있으며, 각 쌍은 하나의 “경”쇄(약 25kDa) 및 하나의 “중”쇄(약 50-70kDa)를 가진다. 중쇄는 항체 클래스에 따라 5개의 주요한 타입(γ, μ, δ, α 및 ε)으로 존재하며, 약 450-600개의 아미노산 잔기를 포함한다. 경쇄는 2 개의 주요한 타입(λ 및 κ)으로 되어 있으며 약 230개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예로써, IgG 항체는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 테트라머성 단백질이다. 각 IgG 중쇄는 N-말단부터 C-말단까지 다음의 순서로 연결되는 4개의 면역글로불린 도메인을 포함한다: VH-CH1-CH2-CH3 (종종 VH-CH1-CH2-CH3으로도 축약됨). 이러한 축약은 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 도메인 1, 중쇄 불변 도메인 2 및 중쇄 불변 도메인 3을 각각 지칭한다. 또한 중쇄는, 예컨대, IgG 항체의 감마(γ) 중쇄의 첫번째 불변 도메인을 나타내는 Cγ1과 같이, 항체 클래스로 지칭될 수 있다. 각 IgG 경쇄는 N-말단부터 C-말단까지 다음의 순서로 연결되는 2개의 면역글로불린 도메인을 포함한다: VH-CL, 여기에서 VH 및 CL은 각각 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 지칭한다.
각 폴리펩티드 사슬의 N-말단에서 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산을 일반적으로 포함하는 항체의 가변 영역은, 항원 결합 결정자를 포함하며, 따라서 항원 인식 및 특이성을 주로 담당하고 있다. 항체들 사이의 가장 큰 정도의 아미노산 서열 가변성은 가변 영역에서 발견된다. 대부분의 서열 가변성은 가변 영역에 위치하는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDRs)에서 일어난다. 각 중쇄에 3개의 CDRs, 그리고 각 경쇄에 3개의 CDRs, 총 6개의 CDRs가 있으며 이것들은 함께 항원-결합 부위를 형성한다. 중쇄 CDRs는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3로 지정되는 반면에, 경쇄 CDRs는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3로 지정된다. CDRs 외부에 위치하는 영역은 구조형성(framework, FR) 영역으로 지칭된다. 상이한 항체들의 구조형성 영역은 아미노산 잔기에서 변할 수 있으나, 아미노산 가변성의 정도는 상이한 항체들의 가변 영역 사이에 존재하는 그것 만큼은 아니다. 많은 경우에, 구조형성 영역은 CDRs에 의하여 제시되는 아미노산 다양성에서 안정한 또는 불변의 지지체(scaffold)를 제공한다.
용어 “항체 단편”은 전장보다 적은 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 항체 단편의 예는, 예컨대, VH-CH1 및 VH-CL을 포함하는 항원 결합 단편(Fab), VH 및 VL을 포함하는 가변 단편(Fv), 하나의 사슬에서 함께 연결된 VH 및 VL을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)은 물론이고, Fab', F(ab)2, F(ab')2, dsFv 디아바디(diabody), Fc 및 Fd 폴리펩티드 단편과 같은, 다른 V 영역 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. Scott, T.A. 및 Mercer, E.I., CONCISE ENCYCLOPEDIA: BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (de Gruyter, 제3판 1997), 및 Watson, J.D. 등, RECOMBINANT DNA (제2판 1992) (이하, “Watson”)을 참조.
항체 단편은 당해 분야에 알려진 임의의 수단에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한(intact) 항체의 단편화에 의하여 효소적으로 또는 화학적으로 생산되거나, 부분적인 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체의 단편은 펩티다제에 의한 소화에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 펩신은 힌지 영역에서 이황화 연결 아래의 항체를 소화하여 F(ab')2, 즉 그 자체가 이황화 결합에 의하여 VH-CH1에 결합되는 경쇄인 Fab 단편의 다이머를 생산한다. F(ab')2는 순한 조건(mild condition) 하에서 감소되어 힌지 영역에서 이황화 연결을 깨고, 그렇게 함으로써 (Fab')2 다이머를 Fab' 모노머로 전환시킬 수 있다. Fab' 모노머는 본질적으로 힌지 영역의 부분을 갖는 Fab 단편이다. 항체 및 항체 단편의 더 자세한 설명을 위하여 FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)을 참조. 다양한 항체 단편은 비손상된 항체의 소화라는 용어로 정의되지만, 숙련자는 그러한 Fab' 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 새로이 합성될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 이 용어는 또한, 전체 항체의 변경에 의하여 생산되거나 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 새로이 합성되는 항체 단편을 포함한다.
대안적으로, 항체 단편은 전적으로 또는 부분적으로 합성으로 생산된다. 항체 단편은 선택적으로 단쇄 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 단편은, 예를 들어, 이황화 연결에 의하여, 함께 연결된 다중쇄를 포함할 수 있다. 단편은 또한 선택적으로 다분자 복합체(multimolecular complex)일 수 있다. 기능적 항체 단편은 일반적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함할 것이며, 더 일반적으로 적어도 약 200 개의 아미노산을 포함할 것이다.
면역글로불린 또는 항체 분자의 Fc 영역 또는 도메인(Ig Fc 폴리펩티드 또는 Fc 폴리펩티드라고도 지칭됨)은 대체로 면역글로불린 중쇄의 불변 영역에 대응하며, 항체의 효과기(effector) 기능(들)을 포함하여, 다양한 기능을 담당하고 있다. 예를 들어, IgG 분자의 Ig Fc 영역은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3, 그리고 CH2로 이끄는 N-말단 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 중쇄 이황화 결합 사이를 포함하는 Fc와 CH1 사이의 중쇄의 일 부분이며, 항체 분자에 신축성을 준다. Fc 영역의 불변 도메인은 면역계의 세포와 상호작용한다. Fc 수용체는 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질이다. IgG 항체 클래스에서 Fc 수용체의 한 중요한 부류는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 포함한다. 세포 상에서 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 많은 항체 기능을 매개한다. 상이한 IgG 서브클래스는 Fc 감마 수용체에서 상이한 친화도를 나타낸다. 일반적으로, IgG1 및 IgG3은 IgG2 및 IgG4보다 더 큰 친화도로 수용체에 결합한다. Fc 수용체는, 예컨대, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구(neutrophils) 및 특정 림프구를 포함하는, 다양한 세포 상에서 발현된다. 그의 수용체에 대한 Ig Fc의 결합은 이들 효과기 세포를 결합된 항원의 부위로 가져가서, 긍극적으로, B 세포 활성화, 염증 반응, 세포독성 반응 및 포식 반응을 포함하는, 시그널링 및 면역 반응을 일으킨다.
Ig Fc 융합물은 면역글로불린 또는 항체의 Fc 영역에 작동적으로 연결된 하나 이상의 폴리펩티드(또는 하나 이상의 소분자)를 포함하는 분자이다. Chamow 등, 1996, Trends Biotechnol. 14:52-60을 참조. 따라서, Ig Fc 융합 단백질은 Ig Fc 영역에 작동적으로 연결된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 분자이다. Ig Fc 융합 단백질은, 예를 들어, (효과기 기능 및 약물동력성을 용이하게 하는) 항체의 Fc 영역, 그리고 수용체 단백질 또는 리간드 단백질 또는 다른 단백질 또는 그의 단편의 결합 영역 또는 결합 도메인을 포함할 수 있다. 결합 영역 또는 결합 도메인은(항원에서 항체의 항체 가변 영역의 것들과 비교하여) 타겟 수용체 또는 리간드의 인식을 매개한다. Ig Fc 영역은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 소분자(융합 파트너)에 간적접으로 또는 직접적으로 연결될 수 있다. 당해 분야에서 알려지고 하기에 더 자세히 기술되는 다양한 링커들은 Ig Fc를 융합 파트너에 연결하는데 사용되어 Ig Fc 융합물을 생성할 수 있다. Ig Fc 융합 단백질은 일반적으로, 적어도 하나의 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 공유하여 연결되는 Ig Fc 영역을 포함하는데, 이 폴리펩티드는 일반적으로 타겟 리간드 또는 수용체에 결합한다.
모노클론 또는 폴리클론 항체는 사용될 수 있는 당해 분야에서 알려진 임의의 기술에 의하여 제조될 수 있다(예컨대, Kohler & Milstein, Nature 256:495 497 (1975); Kozbor 등, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole 등 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)에서 pp. 77 96을 참조). 단쇄 항체의 생산을 위한 기술(미국특허번호 제 4,946,778호)을 개조하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생산할 수 있다. 덧붙여, 포유류를 포함하여, 유전자 이식성(transgenic) 마우스 또는 다른 유기체가 인간화 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 기술은 항체 및 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 헤테로머성(heteromeric) Fab 단편을 확인하는 데에 사용될 수 있다(예컨대, McCafferty 등, Nature 348:552 554 (1990); Marks 등, Biotechnology 10:779 783 (1992)을 참조).
용어 “에피토프”는 항체의 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결정자를 지칭한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당(sugar) 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성있는 표면 그룹들로 구성되고, 보통 특이적 3-차원 구조 특징은 물론이고 특이적 전하 특성을 가진다. 형태적(conformational) 및 비형태적(nonconformational) 에피토프는, 변성 용매가 있을 때에 후자가 아닌 전자와의 결합을 잃는다는 점에 있어서, 차이가 있다.
두 분자, 예컨대, 리간드와 수용체 사이의 “특이적 결합 친화도”는, 한 분자가 다른 분자보다 우세하게 결합한다는 것을 의미한다. 평형 결합 상수(예컨대, KA)가 약 104 내지 1013M-1, 약 106 내지 1012M-1, 약 108M-1 내지 1011M-1 또는 약 108 내지 1010M-1을 포함하여, 약 1 x 102M-1 내지 약 1 x 1013M-1 이상이면, 분자의 결합은 일반적으로 특이적라고 여겨진다. 항원과 항체 사이의 결합 상호작용에서 KA의 값은 일반적으로 약 105M-1 내지 약 1012M-1, 보통은 약 107M-1 내지 약 1011M-1, 그리고 흔히 약 108M-1 내지 약 1010M-1의 범위를 가진다. KA(M-1)는 ka/kd를 계산함으로써 결정되는데, 여기에서 ka는 결합 속도 상수이고 kd는 해리 속도 상수이다. ka 및 kd 의 단위는 각각 M-1 s-1 및 s-1이다. 평형 해리 상수, KD는 KA에 반비례한다. KD = kd /ka . 반응 A + B <=> AB(관심의 단일 단백질(예컨대, 수용체)에 대한 단일 리간드 결합을 나타냄)에 대하여, KD는 ([A].[B])/[AB]와 같다. 분자의 결합 친화도 및/또는 결합활성을 측정하는 잘 알려진 기술의 비제한적 예는, 예컨대, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 BiacoreTM 기술(GE Healthcare), 등온 적정 마이크로열량측정법(isothermal titration microcalorimetry)(MicroCal LLC, Northampton, MA USA), ELISA 및 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS) 방법을 포함한다. 예를 들어, FACS 또는 다른 분류 방법은, 결합된 결합 쌍 구성원(수용체, 예컨대 가용성 수용체와 같은)에 특이적으로 결합하는 분자들의 집단(예를 들어, 세포 표면-표시성 리간드(cell surface-displayed ligands))을 선택하는데 사용될 수 있다. 리간드-수용체 복합체는, 예컨대, 형광에 의하여(예, 복합체를 인식하는 형광 항체와 복합체를 반응시킴으로써), 검출되고 분류된다. 결합된 결합 쌍 구성원(예, 수용체)에 결합하는 관심의 분자들은 낮은 농도의 수용체가 있을 때에 모이고 재-분류된다. 감소하는 농도의 수용체(리간드-수용체 상호작용의 성질에 따라, 10-6M에서 10-13M로, 즉, 1 마이크로몰(μM)에서 1 나노몰(nM) 또는 이하(예컨대, 10-11M 또는 10-12M)로 내려가는 차수를 기준으로 하는 예시적 농도 범위)가 있을 때에 다중 라운드 분류(multiple rounds sorting)를 실시함으로써, 수용체에 대하여 특이적인 결합 친화도를 보이는 관심의 분자들의 집단이 분리될 수 있다.
단백질을 지칭할 때, 항체에 “특이적으로(또는 선택적으로) 결합하는” 또는 항체와 “특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응하는”이라는 어구는, 단백질 및 다른 생물체의 이종 집단에서 단백질의 존재를 판별하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역분석 조건에서, 특정화된 항체는 배경(background)의 적어도 2배로 특정 단백질에 결합하고, 실질적으로는 샘플에 존재하는 다른 단백질에 상당한 양으로 결합하지 않는다. 그러한 조건 하에서의 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성으로 선택되는 항체를 요구할 수 있다. 다양한 면역분석 포맷이 특정 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, 고체-상태 ELISA 면역 분석이 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택하기 위하여 보통 사용될 수 있다(예컨대, 특이적 면역반응을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 면역분석 포맷 및 조건을 설명하기 위하여, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)을 참조). 보통, 특이적이거나 선택적인 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 2배일 것이고, 더 일반적으로는 배경의 10 내지 100 배 이상일 것이다.
용어 “사이토카인(cytokine)”은, 예컨대, 인터루킨, 인터페론(IFN), 케모킨, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factors, TNF) 및 , 형질전환 성장 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 이것들은 면역계의 세포의 성숙, 활성화, 증식 및 분화를 조절하는 소분자량 단백질이다.
용어 “스크리닝”은, 일반적으로, 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드, 그것을 포함하는 관련 융합 단백질 및 그러한 분자들 모두를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것과 같은, 본 발명의 최적 분자를 확인하는 공정을 설명한다. 각 분자들의 몇 가지 성질, 예를 들어, 테스트 시스템에서 또는 시험관, 시험관외 혹은 생체 내 적용에서 희망하는 면역 반응을 유도하거나 변경하는 각 분자의 능력이 선택 및 스크리닝에 이용될 수 있다. “선택”은 선택 마커의 발현에 의하여 확인과 물리적 분리를 동시에 이루는 스크리닝의 형태인데, 이것은, 일부 유전적 환경에서, 다른 세포는 죽는 반면에 마커를 발현하는 세포를 생존하게 한다(혹은 그 반대). 스크리닝 마커는, 예를 들어, 루시페라제, 베타-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질, 반응 기질, 등을 포함한다. 선택 마커는 약물 및 독성 내성(resistance) 유전자, 등을 포함한다. 선택의 다른 방식은, 수용체에 대한 리간드의 결합, 효소를 이용한 기질의 반응, 또는 검출가능한 신호를 직접적으로(예, 발색 기질 또는 리간드를 이용함으로써) 또는 간접적으로(예, 발색 이차 항체와 반응함으로써) 생성할 수 있는 다른 물리적 공정과 같은, 검출가능한 이벤트를 기반으로 하는 물리적 분류를 포함한다. 물리적 분류에 의한 선택은, 예컨대, 전체 세포 또는 미세액적(microdroplet) 포맷에서의 FACS를 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 방법에 의하여 이룰 수 있다.
일차 면역 반응을 연구하는 데 있어서의 제한 때문에, 시험관 내, 생체 내 연구가 스크리닝 방법에 특별히 유용하다. 일부 그러한 연구에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 테스트 대상체(예, 동물과 같은 포유류)로 우선 도입하고, 이어서 면역화된 동물에서의 면역 반응의 타입(예, 면역화된 동물의 혈청에서의 항체 생산, T 세포의 증식)을 분석함으로써, 또는 면역화된 동물에서 유도된 면역 반응의 질이나 세기(예, 유도된 항체 적정 수준)를 연구함으로써, 유도된 면역 반응을 연구할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 “대상체”는, 포유류 및 비-포유류를 포함하여, 유기체 또는 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류(예, 개코원숭이, 오랑우탄, 원숭이, 고릴라), 마우스, 개, 돼지, 소, 염소, 고양이, 토끼, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 말, 양 또는 다른 비-인간 포유류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비-포유류는 예를 들어 새(예, 닭이나 오리) 또는 어류와 같은, 비-포유류 무척추동물 및 비-포유류 척추동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 “약학적 조성물”은, 동물 또는 인간을 포함하여, 대상체에서 약학적 이용에 적합한 조성물을 지칭한다. 약학적 조성물은 일반적으로 유효한 양의 활성화제 및 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제는 일반적으로, 각각, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제이다.
용어 “유효한 양”은 희망하는 결과를 내는데 충분한 물질의 투여량(또는 용량) 또는 양을 지칭한다. 희망하는 결과는 투여량 또는 양을 수용하는 수용자의 객관적 또는 주관적 개선을 포함할 수 있다. 예를 들어, 희망하는 결과는 특정 항원 또는 면역원(또는 그의 조성물)의 투여량 또는 양을 투여한 대상체에서 면역 반응의 측정가능한, 검출가능한 또는 테스트가능한 유도(induction), 촉진(promotion), 증진(enhancement) 또는 조절(modulation)을 포함할 수 있다. 그러한 결과를 내는 데 충분한 면역원의 투여량(또는 용량) 또는 양은 “면역원성” 투여량(또는 용량) 또는 양으로 기술될 수 있다.
“예방적 치료”는 질환, 병리 또는 장애의 징후나 증상을 나타내지 않거나, 그것의 초기 징후나 증상만을 나타내는 대상체에 행해지는 치료인데, 그러한 치료는 질환, 병리 또는 장애가 발전될 위험을 방지하거나 감소시킬 목적으로 행해진다. 예방 치료는, 질환, 병리 또는 장애에 대항하는 방어 치료로서, 또는 질환, 병리 또는 장애의 추가적인 발전이나 증진을 저해하거나 감소시키는 치료로서, 기능한다. “예방적 활동”은, 제제를 병리, 질환 또는 장애의 징후나 증상을 나타내지 않거나, 그것의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에 투여하였을 때, 대상체가 병리, 질환 또는 장애를 발전시킬 위험을 막거나 줄이는 제제의 활동이다. “예방적으로 유용한” 제제(예, 핵산이나 폴리펩티드)는 질환, 병리 또는 장애의 발전을 막는데 유용한, 또는 질환, 병리 또는 장애의 추가적인 발전 또는 증진을 저해하거나 억제하는데 유용한 제제를 지칭한다.
“치료적 치료”는 병리, 질환 또는 장애의 증상이나 징후를 보이는 대상체에 행해지는 치료인데, 이러한 치료는 그러한 징후나 증상을 감소시키거나 제거할 목적으로 대상체에 행해진다. “치료적 활동”은 그러한 징후나 증상으로 고통받는 대상체에 투여될 때 병리, 질환 또는 장애의 징후나 증상을 제거하거나 감소시키는 제제의 활동이다. “치료적으로 유용한” 제제는 그 제제가 질환, 병리 또는 장애의 징후나 증상을 감소시키거나, 치료하거나, 제거하는 데에 유용하다는 것을 의미한다.
일반적으로, 본 명세서에 사용되는 명명법과 하기에 기술되는 세포 배양, 분자 유전학, 분자 생물학, 핵산 화학 및 단백질 화학에서의 많은 실험 과정은 잘 알려진 것이고 당해 분야에서 통상의 기술자들에 의하여 통상적으로 이용된다. Sambrook 등, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (제2판), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (이하 “Sambrool”) 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel 등, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates사와 John Wiley & Sons사 간의 합작 투자(1994년, 1999년까지 보충됨)(이하 “Ausubel”)에 기술된 것과 같은, 표준 기술이 재조합 핵산 방법, 핵산 합성, 세포 배양 방법 및 이식유전자 병합, 예컨대, 전기천공(electroporation), 주사, 유전자 총, 피부를 통한 임프레싱(impressing) 및 리포펙션(lipofection)에 이용된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성 및 정제 단계는 명세서에 따라 실시할 수 있다. 상기 기술 및 과정은 일반적으로 당해 분야의 통상적인 방법과 이 문헌을 통하여 제공된 다양한 일반 참조문헌에 따라 실시할 수 있다. 그 안에서의 과정은 당해 분야의 통상의 기술을 가진자에게 잘 알려져 있고 독자의 편의를 위하여 제공되는 것이라 믿어진다.
본 명세서에 다양한 추가 용어가 정의되어 있거나 그렇지 않으면 특징으로 묘사되어 있다.
본 발명의 분자들 및 방법
본 발명은, 예컨대, 면역계(예, T-세포 의존성 면역 반응)의 조절이 바람직한 것을 포함하여, 면역계의 질환, 장애 및 이상을 치료하는 분자 및 방법을 제공한다. 본 발명의 분자(예, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 접합체, 본 발명의 가용성 융합 단백질, 그러한 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산)는, 예컨대, 자가면역 질환, 장애 및 이상, 면역증식성 질환, 이식편-관련 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는, 면역 억제가 바람직한 면역계 질환, 장애 및 이상의 치료와, 공여자 조직, 세포, 장기 또는 이식편에 저항하는 수용자 내에서의 면역 반응의 억제가 바람직한 수용자에게 공여자로부터의 조직, 세포, 장기 또는 이식편 이식을 수반하는 치료 방법에 유용하다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 인간 CTLA-4의 세포외 도메인(“hCTLA-4 ECD”)과 같은, CD80 및/또는 CD86에 결합하는, 야생형 인간 CTLA-4 폴리펩티드(“hCTLA-4”) 또는 그의 단편과 같은, CTLA-4 분자에 비하여 개선된 성질을 갖는 신규한 변이체 CTLA-4 분자를 제공한다. 하기에 더 자세히 검토되는 바와 같이, 다양한 돌연변이생성(mutagenesis) 및 스크리닝 전략이 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 신규한 변이체 CTLA-4 분자를 만들고 확인하는 데 이용되었다. 특히, 그러한 전략은 인간 CTLA-4(“hCTLA-4”)에 비하여, CD80(B7-1) 및/또는 CD86(B7-2)에서 개선된 결합 활성을 가지며, 및/또는 hCTLA-4 ECD에 비하여, CD80 및/또는 CD86에서 개선된 결합 친화도를 가지는 CTLA-4 변이체 분자를 만들고 확인하는데 사용되었다. 항원-제시 세포 상에서 발현된 내인성 CD80 및/또는 CD86 리간드에 결합하는 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자는, 이들 리간드와 T 세포의 표면 상에서 발현되는 내인성 CD28 수용체의 상호작용을 효과적으로 저해하거나 차단한다. 그 결과, T 세포 표면 수용체 CD28과 B7 분자(즉, CD80 및 CD86)의 상호작용에 의하여 제공된 T 세포 활성화에 중요한 보조자극 신호는 저해되거나 차단된다. 그러한 T 세포는 선택적으로 활성화되지 않고 감소된 증식 능력을 가지게 된다.
CD80 또는 CD86 리간드와 CD28 수용체 사이의 시그널링이 차단되는 경우에, T 세포는 활성화되도록 최상으로 자극되지 않으며, 따라서 증식하도록 최상으로 유도되지 않는다. 유사하게, CD80 또는 CD86 리간드와 CD28 수용체 사이의 시그널링이 저해되는 경우에, T 세포의 활성화 및 증식이 저해된다. 하나의 양태에서, 본 발명은 CTLA-4 시그널링에 대하여 길항제로서 기능하는 변이체 CTLA-4 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 CD28 시그널링에 대하여 길항제로서 기능하여, T 세포-의존성 면역 반응을 억제하거나 차단하는 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데; 그러한 분자는 면역억제제로서 기능한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 CD80 및 CD86 둘 다에 결합하나, CD80에서보다 CD86에서 더 높은 결합 활성을 가지며, 따라서 CD80-의존성 보조자극보다 CD86-의존성 보조자극을 더 크게 저해한다. 본 발명의 그러한 변이체 CTLA-4 분자 모두가, 면역억제가 바람직하거나 이로울 것 같은 질환, 장애 또는 이상의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
인간 CTLA-4-Ig 융합 단백질 및 특이적 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질- 둘 다 Bristol-Myers Squibb사(Princeton, NJ)에 의하여 개발됨 -이 소정의 면역-관련 질환 또는 이상을 치료하는데 있어서 효과적이라고 보여졌다. Orencia® 융합 단백질(또한 아바타셉트(Abatacept, “ABA”)라고도 알려짐)(Bristol-Myers Squibb사(Princeton, NJ))은, 각 모노머성 융합 단백질에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 형성되는 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결된 두 개의 동일한 모노머성 면역글로불린(Ig) 융합 단백질로 구성되는 가용성 재조합형 다이머성 융합 단백질이다. ORENCIA는 Bristol-Myers Squibb사의 등록된 상표이다. Orencia® 다이머의 각 모노머성 Ig 융합 단백질은 C-말단에서 특이적인 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드(서열번호 186)의 N-말단으로 융합된 인간 CTLA-4(서열번호 159)의 세포외 도메인으로 구성되어 있다. 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질의 완전한 폴리펩티드 서열이 서열번호 164에 보인다. Orencia® 다이머는 포유류의 발현 시스템에서 생산되며 92kDa의 겉보기 분자량을 가진다. Orencia® 다이머의 두 개의 모노머성 Ig 융합 단백질이 각 hCTLA-4-변이체 IgG1 모노머의 위치 120에서의 시스테인 잔기 사이에 형성된 단일 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결되어 있고, 이황화 결합은 두 개의 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드 사이에 형성되지 않으리라 여겨진다.
Orencia® 다이머는 CD80과 CD86에 결합함으로써 T 세포 활성화를 저해하며 따라서 CD28과의 상호작용을 차단하는 선택적인 보조자극 조절제이다. Orencia® 다이머는 경등증 류마티스 관절염(RA)부터 중증 류마티스 관절염으로 고통받는 성인의 치료를 위하여 최근 승인되고 있다. Orencia® 다이머 및 그의 임상적인 징후 및 효과에 대한 추가적인 정보가 월드와이드 웹(worldwide web)상의 orencia.com 및 bms.com에 제공되어 있다.
상기에 주지된 바와 같이, Orencia® 다이머의 각 융합 단백질 모노머는 인간 CTLA-4 세포외 도메인을 포함한다. 인간 CTLA-4는 T 세포 상에서 일시적으로 발현되는 막 단백질이다. WT 전장 hCTLA-4의 전장 단백질 서열을 서열번호 160에 나타냈으며, WT 전장 hCTLA-4를 인코딩하는 핵산 서열을 서열번호 194에 나타내었다. 인간 CTLA-4는 신호 펩티드(SP), 세포외 도메인(ECD), 트랜스막(transmembrane) 도메인(TD) 및 세포질 도메인(CD)을 포함하는데, 이 순서대로 함께 공유적으로 연결되어 있다(예컨대, SP의 C-말단은 ECD의 N-말단에 공유적으로 연결되고, ECD의 C-말단은 TD의 N-말단에 공유적으로 연결되고, TD의 C-말단은 CD의 N-말단에 공유적으로 연결됨). WT hCTLA-4 ECD 폴리펩티드는 전장 hCTLA-4 단백질 서열(서열번호 160)의 잔기 38-161을 일반적으로 포함하고, 일반적으로 124개의 아미노산 잔기 길이를 가진다. 이 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 서열번호 159에 나타내었다. 서열번호 160의 아미노산 잔기 1-35 또는 1-37을 일반적으로 포함하는 전장 hCTLA-4 단백질의 신호 펩티드(SP)는 가공 중에 절단된다. 예컨대, Harper 등, J. Immunol. 147(3):1037-1044 (1991)를 참조. hCTLA-4 단백질의 아미노산 잔기 1-35 또는 1-37을 포함하는 인간 CTLA-4 신호 펩티드 서열을 서열번호 182 또는 서열번호 216에 각각 나타내었다. 신호 펩티드 서열이 서열번호 182에 나타낸 것이거나 서열번호 216에 나타낸 것이든지, 신호 펩티드가 절단되면, 성숙 hCTLA-4 단백질은 일반적으로 서열번호 160에 나타낸 전장 hCTLA-4 단백질 서열의 아미노산 위치 38에서의 메티오닌 잔기와 함께 시작한다. 따라서, hCTLA-4 신호 펩티드 서열이, hCTLA-4 단백질의 아미노산 잔기 1-35를 포함하는 서열번호 182의 것일지라도, 결과의 성숙 분비 hCTLA-4 단백질은 전장 hCTLA-4 단백질의 위치 38에 있는 메티오닌과 함께 시작한다. 전장 hCTLA-4 단백질의, 위치 36 및 37 각각에서의 리신(K)과 알라닌(A) 잔기는 성숙 hCTLA-4 단백질에 존재하지 않으며, 가공 중에 성숙 hCTLA-4 단백질로부터 절단되는 것으로 여겨진다. 따라서 성숙 hCTLA-4 단백질 서열의 아미노산 잔기는, 일반적으로, 전장 hCTLA-4 단백질의 위치 38에 존재하는 메티오닌 잔기를 첫 번째 아미노산(즉, 위치 1을 차지함)으로 시작하여, 번호가 매겨진다; 따라서, 히스티딘 잔기는 성숙 hCTLA-4 단백질, 등에서 아미노산 위치 2를 차지한다. Orencia® 다이머의 각 모노머는 서열번호 159에 나타낸 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 포함한다. 전장 WT hCTLA-4 단백질에서, 신호 펩티드는 서열번호 160의 아미노산 잔기 1-37을 포함하며, 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 잔기 38-161을 포함하고, 트랜스막 도메인(TD)은 아미노산 잔기 162-182를 포함하며, 세포질 도메인(CD)은 아미노산 잔기 183-223을 포함한다. hCTLA-4 단백질의 성숙 도메인(MD)은 일반적으로 서열번호 160의 아미노산 잔기 36-223, 어떤 경우에는, 아미노산 잔기 37-223 또는 38-223을 포함한다.
서열번호 194의 핵산은 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열(뉴클레오티드 잔기 1-111), hCTLA-4 ECD를 인코딩하는 핵산 서열(뉴클레오티드 잔기 112-483), hCTLA-4 트랜스막 및 세포질 도메인을 인코딩하는 핵산 서열(뉴클레오티드 잔기 484-669)을 포함하며; 마지막 3개의 C-말단 뉴클레오티드는 TGA 정지 코돈이다.
벨라타셉트(belatacept)(“LEA29Y-Ig”, “LEA-Ig” 또는 “A29YL104E-Ig”라고도 알려짐)(Bristol-Myers Squibb사(Princeton, NJ))는 각 모노머성 융합 단백질에서 시스테인 잔기 사이에 형성되는 이황화 결합에 의하여 함께 연결된 두 개의 동일한 Ig 융합 단백질로 구성되는 가용성 재조합형 다이머성 단백질이다. 각 모노머성 융합 단백질은, C-말단에서 특이적 변이체 IgG1 폴리펩티드의 N-말단으로 융합되는 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드로 구성된다. 변이체 CTLA-4 ECD의 폴리펩티드 서열은 WT 인간 CTLA-4 ECD의 폴리펩티드 서열과는 두 개의 돌연변이만큼, 특히, 위치 29에서 알라닌을 대신하는 티로신의 치환(치환 A29Y라고 축약) 및 위치 104에서 류신을 대신하는 글루타민의 치환(치환 L104E라고 축약)만큼 상이한데, 여기에서 인간 CTLA-4 ECD 내의 아미노산 잔기는 위치 1에서의 아미노산을 나타내는 N-말단에서의 메티오닌과 함께 번호가 매겨진다. 벨라타셉트의 각 모노머는 서열번호 186에 나타낸 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드 서열을 포함하며; 이 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드는 Orencia® 융합 단백질에 포함되는 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드와 동일하다. 따라서 벨라타셉트 모노머성 융합 단백질은 각 Orencia® 모노머성 융합 단백질과는 두 개의 아미노산만큼 상이하다. 벨라타셉트의 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질의 폴리펩티드 서열은 서열번호 166에 나타내었다. 따라서 명칭 “LEA29Y-Ig”는, 벨라타셉트 다이머의 각 모노머성 융합 단백질이 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열과 두 개의 돌연변이 L104E 및 A29Y만큼 상이한 변이체 CTLA-4 ECD로 구성된다는, 사실을 반영한다. 벨라타셉트는 Orencia® 다이머보다, 약 4배 이상의 결합활성으로 CD86에 결합하며 약 2배 이상의 결합활성으로 CD80에 결합하는 것으로 밝혀졌다(Larson 등, Amer. J. Transplant. 5:443-453, 444 (2005)). 벨라타셉트는, 시험관 내에서 T 세포 활성화를 저해하는데 있어서 Orencia® 다이머보다 약 10배 이상까지 더 효능이 있으며, T 세포-의존성 항체 반응을 저해하는 능력이 증가되었고 비-인간 영장류를 수반하는 임상 실험에서 신장의 동종이식편 생존(renal allograft survival)에 있어서의 그의 개선된 연장(prolongation)으로 알 수 있듯이, Orencia® 단백질에 비하여 개선된 생체 내 면역억제 효능을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 벨라타셉트와 그의 임상 징후 및 효과에 대한 추가의 정보가 월드와이드 웹 상의 bms.com에 제공되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 신규한 가용성 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는, 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 CD86에 대한 Orencia® 다이머(다이머성 hCTLA-4-Ig)의 결합 활성보다 큰 CD86에 대한 결합 활성을 가진다. 또한 본 발명은 신규한 가용성 재조합형 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는, 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 CD80에 대한 Orencia® 다이머의 결합 활성과 거의 동등하거나 이 보다 큰 CD80에 대한 결합 활성을 가진다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 신규한 가용성 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는, 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 Orencia®(아바타셉트)보다 하나 이상의 면역 반응(예, T 세포-의존성 면역 반응)을 억제하는 능력이 더 크다. Orencia® 다이머에 비하여 하나 이상의 개선된 성질을 갖는 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자는, 예컨대, 류마티스 관절염 및 건선을 포함하여, 자가면역 질환과 같이, Orencia® 다이머가 승인되고 및/또는 임상 혜택을 제공하는 것이 입증되는 질환, 장애 또는 이상을 포함하여, 면역억제가 바람직한 질환, 장애 또는 이상을 치료하는 데 있어서 Orencia® 다이머보다 더 효능이 강하며 따라서 더 효과적이고, 유용하며, 유리한 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 신규한 가용성 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는, 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 CD86에 대한 벨라타셉트(LEA29Y-Ig)의 결합 활성보다 큰 CD86에 대한 결합 활성을 가진다. 또한 본 발명은 본 명세서에 기술된 신규한 가용성 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는, 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 CD86에 대한 벨라타셉트의 결합 활성보다 큰 CD86에 대한 결합 활성을 가진다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술되는 신규한 가용성 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는, 변이체 CTLA-4 분자를 제공하는데, 이것은 벨라타셉트보다 하나 이상의 면역 반응(예, T 세포-의존성 면역 반응)을 억제하는 능력이 더 크다. 벨라타셉트에 비하여 하나 이상의 개선된 성질을 갖는 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자는, 비-인간 영장류 내의 신장의 동종이식편 생존과 같이, 벨라타셉트 융합 단백질이 임상 혜택을 제공하는 것이 입증되는 질환, 장애 또는 이상을 포함하여, 면역억제가 바람직한 질환, 장애 또는 이상을 치료하는 데 있어서, 벨라타셉트보다 더 효능이 강하며 따라서 벨라타셉트보다 더 효과적이고, 유용하며, 유리한 것으로 예상된다.
본 발명의 변이체 CTLA-4 분자(예, 하기에 자세히 기술되는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)와 같은, 본 발명의 분자의 안전성, 내성, 약물동력성, 면역원성 및 임상 효능은, 상기 분자의 특정 용량이 특정한 방식(예, 비경구적, 정맥내 또는 피하 투여)으로 투여되는 면역 질환 또는 장애(예, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선 등)를 가진 대상체에서, 유사한 대상체를 수반하는 Orencia®에서의 임상 실험에서 채용되는 것들과 비교될 만한 방법론을 사용하여 결정될 수 있다. 예컨대, 월드와이드 웹사이트 주소 bms.com 및 orencia.com을 참조. 예를 들어, 류마티스 관절염(RA)을 갖는 대상체에서 관절 손상의 진행을 줄이는 데 있어서, 통증 감소를 포함하는, RA의 징후 및 증상을 경감하는 데 있어서, 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자(예, 가용성 변이체 CTLA-4-Ig)가 효과적인 정도는 RA 환자를 수반하는 Orencia®임상 실험에 채용된 것들과 유사한 방법론을 이용하여, 평가될 수 있다.
본 발명의 분자(예, 하기에 자세히 기술되는 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)의 안전성, 내성, 약물동력성, 면역원성 및 임상 효능은, 면역억제가 바람직한 대상체(예, 공여자로부터의 조직, 세포, 장기, 이식편 이식을 받는 대상체)에서 그리고 상기 분자의 특정 용량이 특정한 방식(예, 비경구적, 정맥내 또는 피하 투여)으로 투여되는 대상체에서, 유사한 대상체를 수반하는 벨라타셉트에서의 임상 실험에서 채용되는 것들과 비교할 만한 방법론을 사용하여 결정될 수 있다. 예컨대, 월드와이드 웹사이트 주소 bms.com을 참조. 예를 들어, 신장 또는 신장 이식을 받은 수용자 환자에서의 신장 또는 신장 이식 거부를 줄이는 데 있어서, 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자(예, 가용성 변이체 CTLA-4-Ig)가 효과적인 정도는 신장 또는 신장 이식을 받은 환자를 수반하는 벨라타셉트 임상 실험에 채용된 것들과 유사한 방법론을 이용하여, 평가될 수 있다.
본 발명의 분자 및 방법 그리고 본 발명의 다른 양태는 하기에서 추가적으로 자세히 검토된다.
본 발명의 폴리펩티드
본 발명은 “본 발명의 폴리펩티드”로 총체적으로 지칭되는 신규한 폴리펩티드를 제공한다. 용어 “본 발명의 폴리펩티드”는 본 명세서에서 밝힌 폴리펩티드 서열의 변형체 및/또는 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 재조합형 비-자연적으로 발생하는 또는 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 포함하는 재조합형 융합 단백질을 포함하며, 그러한 융합 단백질의 모노머성 및 다이머성 형태를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 포함하는 멀티머를 포함한다. 또한 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 포함한다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드이다. 예를 들어, 하기에 더 자세히 기술되는 바와 같이, 본 발명은, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 용해도를 증진시키는 상이한 폴리펩티드(예컨대, 면역글로불린 폴리펩티드와 같은, 예컨대, Ig Fc 폴리펩티드와 같은)에 연결되는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함한다.
하기에 더 자세히 검토된 바와 같이, 본 발명의 하나의 양태에서, 다양한 돌연변이생성(mutagenesis) 및 스크리닝 전략이 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 신규한 폴리펩티드를 만들고 확인하는데 사용되었다. 특히, 그러한 전략은, CD80 및/또는 CD86에 대하여 개선된 결합 친화도 또는 결합 활성을 갖는 신규한 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 포함하여, CD80 및/또는 CD86에 결합하는 능력이 개선된 신규한 폴리펩티드를 만들고 확인하는데 사용되었다. 항원-제시 세포 상에서 발현되는 CD80 및/또는 CD86 리간드에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드는 이들 리간드와 T 세포 상에서 발현되는 CD28 수용체의 상호작용을 간섭하거나 차단한다. 그 결과, T 세포 표면 수용체 CD28과 B7 분자(즉, CD80 및 CD86)의 상호작용에 의하여 제공된 T 세포 보조자극성 신호가 저해되거나 차단된다. 그러한 폴리펩티드는, 면역계(예, T 세포 반응)의 조절이 이로운 질환, 장애 및 이상의 예방적 및 치료적 처리에 있어서 유용한 것으로 여겨진다.
변이체
CTLA
-4 폴리펩티드
하나의 태양에서, 본 발명은 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 이들 각각은 서열번호 1-73 (예, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 및 서열번호 73)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 또는 CD80 및/또는 CD86(또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD)의 폴리펩티드 단편에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 조절하거나 통제한다. 서열번호 1-73에 제시된 것들 각각과 같은, 일부 그러한 폴리펩티드는 분비 또는 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로서 기술되어 있다. 서열번호 1-73의 각각에 제시된 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함하지 않는데; 그것은 가공 중에 절단되었고, 그것에 의하여 성숙 또는 분비 폴리펩티드를 생산한다. CD80의 폴리펩티드 단편은, 예컨대 인간 CD80 ECD 폴리펩티드(“hCD80 ECD”)와 같은, 예컨대 CD80 폴리펩티드의 세포외 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. CD86의 폴리펩티드 단편은, 예컨대 인간 CD86 ECD 폴리펩티드(“hCD86 ECD”)와 같은, 예컨대 CD86 폴리펩티드의 세포외 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는, 포유류 CD80 및/또는 CD86, 또는 예컨대, 포유류 CD80 또는 CD86 ECD와 같은, 이들의 폴리펩티드 단편에 결합한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 WT 인간 CD80(“hCD80”) 및/또는 WT 인간 CD86(“hCD86”), 또는 예컨대, hCD80 ECD 또는 hCD86 ECD와 같은, 이들의 폴리펩티드 단편에 결합한다. 일부 그러한 방법에서, 적어도 하나의 면역 반응이 억제되거나 저해된다.
일부 그러한 폴리펩티드는 hCD80 또는 이의 단편에 대한 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 결합 친화도 또는 결합 활성에 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰 hCD80 또는 이의 단편(예, hCD80 ECD)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을, 각각 가진다. 차례로 함께 공유적으로 연결되어 있는 신호 펩티드, ECD, 트랜스막(transmembrane) 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 예측된(predicted) 전장 hCD80 폴리펩티드 서열이 서열번호 195에 제시되어 있다. 신호 펩티드는 서열번호 195의 아미노산 잔기 1-34를 포함하고, ECD는 아미노산 잔기 35-242를 포함하며, 트랜스막 도메인은 아미노산 잔기 243-263을 포함하고, 세포질 도메인은 아미노산 잔기 264-288을 포함한다. hCD80 ECD의 폴리펩티드 서열이 서열번호 174에 나타나 있다. 서열번호 173에 나타낸 핵산 서열은 WT 인간 CD80 신호 펩티드(N-말단에서) 및 인간 CD80 ECD를 인코딩한다.
일부 그러한 폴리펩티드는 hCD86 또는 이의 단편(예, ECD)에 대한 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 결합 친화도 또는 결합 활성에 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰 hCD86 또는 이의 단편(예, hCD80 ECD)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 각각 가진다. 차례로 함께 공유적으로 연결되어 있는 신호 펩티드, ECD, 트랜스막 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 예측된 전장 hCD86 폴리펩티드 서열이 서열번호 175에 제시되어 있으며, 예측된 전장 hCD86 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산이 서열번호 176에 나타나 있다. hCD86 ECD의 폴리펩티드 서열이 서열번호 180에 나타나 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는, hCD86에 대한 서열번호 168에 제시된 서열을 갖는 LEA29Y ECD 폴리펩티드의 결합 친화도 또는 결합 활성에 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰 hCD86에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다. hCD86 또는 hCD86 ECD에 대한 hCTLA-4 ECD 및 LEA29Y ECD(“A29YL104E” 또는 “L104EA29Y” ECD라고도 함)의 것들에 적어도 거의 동일하거나 그보다 큰 hCD86 또는 hCD86 ECD에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가지는 본 발명이 예시적인 폴리펩티드는, 각각, 예컨대, 서열번호 4, 10-12, 15, 17, 24, 26, 28, 35 및 61 중 임의의 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 실시예 4에서의 표 5를 참조. 표 5에 제시된 데이터는 대표적인 CTLA-4-Ig와 모노머성 CD86 ECD 사이의 모노머성 상호작용을 반영한다. 용어 LEA29Y(또는 A29YL104E 또는 L104EA29Y)는, 달리 표시되지 않으면, LEA29Y ECD(또는 A29YL104E 또는 L104EA29Y ECD)를 지칭한다.
일부 그러한 폴리펩티드는 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 아미노산 길이와 거의 동일한 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 기술될 수 있다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 약 110개 아미노산 내지 약 138개 아미노산 잔기, 약 112개 내지 약 136개 아미노산 잔기, 약 114개 내지 약 134개 아미노산 잔기, 약 116개 내지 약 132개 아미노산 잔기, 약 118개 내지 약 130개 아미노산 잔기, 약 119개 내지 약 129개 아미노산 잔기, 약 120개 내지 약 128개 아미노산 잔기, 약 121개 내지 약 127개 아미노산 잔기, 약 122개 내지 약 126개 아미노산 잔기, 약 123개 내지 약 125개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 124개 아미노산 잔기 길이를 갖는 서열을 포함한다. 예시적인 폴리펩티드는, 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기에서 그러한 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86(또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD)에 결합한다.
예컨대, 각각이 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이의 ECD에 결합하는, 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 포함하는, 상기에서 기술된 일부 그러한 폴리펩티드는 면역 반응을 조절하거나 통제한다. 예컨대, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인(cytokine) 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2 등의 생산), 다양한 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체 등)의 유도, 염증성 분자의 합성 또는 생산, 염증, 관절 부종, 관절 압통, 통증, 경직(stiffness), C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존성 항체 반응(들)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 다양한 면역 반응은 그러한 본 발명의 폴리펩티드에 의하여 조절되거나 통제될 수 있다. 어떤 경우에, 그러한 폴리펩티드는 적어도 하나의 그러한 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력이 hCTLA-4 또는 hCTLA-4 ECD보다 더 크다.
예를 들어, 일부 그러한 폴리펩티드는 시험관 내 분석에서 T 세포 활성화 또는 T 세포 증식을 저해할 수 있다. 예를 들어, 하기에 제시되는 실시예 4-9는, 본 명세서에 기술된 것들과 같은, 대표적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 대표적인 융합 단백질의 시험관 내에서의 T 세포 증식을 저해하는 능력을 입증한다. 일부 그러한 폴리펩티드는, 면역억제 치료가 필요한 대상체에 적어도 하나의 그러한 폴리펩티드를 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 통하여와 같이, 생체 내에서 대상체 내의 면역 반응을 저해하거나 억제할 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티는, 아래에 더 자세히 검토된 바와 같이, 예컨대, 면역조절이 바람직한 면역계 질환, 장애 및 이상을 치료하기 위한 예방적 및/또는 치료적 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 응용에서 유용한 것으로 예상된다. 그러한 폴리펩티드는 대상체 내의 면역 반응을 저해하거나 억제하는 예방적 및/또는 치료적 방법(예컨대, 면역저해 또는 면역억제가 바람직한, 예컨대 인간과 같은, 포유류의 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료에 있어서), 수용자에 의한(예컨대, 인간과 같은, 예컨대 포유류에 의한) 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법 및 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 다른 방법에 있어서 유용한 것으로 예상된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 그러한 폴리펩티드는, hCTLA-4 또는 hCTLA-4 ECD의 하나 이상의 타입의 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 예를 들어, 일부 그러한 폴리펩티드는, 상기에 기술되고 및 하기에 더 자세히 기술된 바와 같이, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 응용에서 T 세포 활성화 또는 증식을 저해하는 능력을 가지는데, 이는 그러한 응용에서 T 세포 활성화 또는 증식을 저해하는 hCTLA-4 또는 hCTLA-4 ECD의 능력과 적어도 거의 동등하거나 그보다 더 크다. 추가적으로, 일부 그러한 폴리펩티드는, LEA29Y 폴리펩티드- 서열번호 168에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 특이 변이체 CTLA-4 ECD -의 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력보다 더 큰, 면역 반응(예컨대, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, T 세포-의존성 항체 반응)을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다. 예를 들어, 하기에 제시된 실시예 4-9는, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 대표적인 융합 단백질의 시험관 내 T 세포 증식의 저해 능력을, hCTLA-4 ECD 또는 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 시험관 내 T 세포 증식의 저해 능력에 상대적으로 비교한다. 그러한 분자는, 자가면역 질환 및 장애의 치료, 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식 거부를 저해하는 예방적 및 치료적 방법을 포함하는, 다양한 치료적 응용에서 유용하게 이용되리라 예상된다.
일부 그러한 폴리펩티드는, 예컨대, 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환에 의하여 서로 상이할 수 있다. 아미노산 치환은 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 예컨대, “서열 변형”으로 제목을 붙인 섹션을 참조.
다른 양태에서, 또한 본 발명은, 각각이 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 상기 폴리펩티드는 모노머성 hCD80 또는 모노머성 hCD86 또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD에 결합한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 (1) 모노머성 hCD86 또는 이의 ECD에 대한 모노머성 hCTLA-4 또는 LEA29Y 폴리펩티드의 결합 친화도와 거의 동등하거나 그보다 큰 모노머성 hCD86에 대한 결합 친화도, 및 (2) 모노머성 hCD80에 대한 모노머성 hCTLA-4의 결합 친화도와 거의 동등하거나 그보다 큰 모노머성 hCD80에 대한 결합 친화도를, 가진다. LEA29Y 폴리펩티드는 서열번호 168의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 추가적으로, 일부 그러한 폴리펩티드는, 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4 ECD 또는 LEA29Y 폴리펩티드보다, 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 면역 반응(예컨대, T 세포 활성화/증식, 사이토카인 합성/생산, 활성화 마커의 유도, 염증성 분자의 생산, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, T 세포-의존성 Ab 반응)을 억제하는 능력이 더 크다.
또한 본 발명은, 각각이 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 hCD86 ECD 또는 hCD80 ECD에 대한 hCTLA-4 ECD의 결합 친화도와 거의 동등하거나 그보다 더 큰 hCD86 ECD 또는 hCD80 ECD에 대한 결합 친화도를 각각 가진다. 일부 그러한 폴리펩티드는 hCD86 ECD에 대한 hCTLA-4 ECD(서열번호 159) 또는 LEA29Y 폴리펩티드(서열번호 168)의 결합 친화도보다 큰 hCD86 ECD에 대한 결합 친화도를 가진다. 일부 그러한 폴리펩티드는 hCD80 ECD에 대한 hCTLA-4 ECD의 결합 친화도보다 큰 hCD80 ECD에 대한 결합 친화도를 가진다. 일부 그러한 폴리펩티드는, 어떤 경우에는, 상기 및 전체에 걸쳐 기술된 것들을 포함하여, 하나 이상의 면역 반응을 억제하는 능력이 hCTLA-4 ECD 또는 LEA29Y 폴리펩티드보다 더 크다.
다른 양태에서, 본 발명은, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 CTLA-4 폴리펩티드 변형체를 제공하는데, 이 폴리펩티드는, (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4 ECD의 폴리펩티드 서열과 15개 아미노산 잔기 이하, 14개 아미노산 잔기 이하, 13개 아미노산 잔기 이하, 12개 아미노산 잔기 이하, 11개 아미노산 잔기 이하, 10개 아미노산 잔기 이하, 9개 아미노산 잔기 이하, 8개 아미노산 잔기 이하, 7개 아미노산 잔기 이하, 6개 아미노산 잔기 이하, 5개 아미노산 잔기 이하(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개 또는 14개 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 여기에서, hCTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열(서열번호 159)의 위치 24, 30, 32, 39, 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 또는 106에서의 아미노산 잔기가 CTLA-4 폴리펩티드 변형체 서열 내의 상이한 아미노산 잔기로 치환되는데, 여기에서 CTLA-4 폴리펩티드 변형체의 아미노산 잔기 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨지며, 여기에서 CTLA-4 폴리펩티드 변형체는 CD80 또는 CD86 또는 이 둘 중 하나의 세포외 도메인 또는 단편에 결합하는 능력을 가지며 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 변형체는, A24E, A24S, S25A, G27H, K28N, T30N, T30D, T30A, V32I, Q39K, Q39E, D41G, D41N, D41S, A50M, A50G, M54K, M54E, M54V, G55E, G55K, N56D, D63K, S64P, I65S, I65F, I65T, S70F, M85A, M85V, M85A, L104E, L104D, 및 I106M, I106F 및 I106L로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개)의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 12개의 아미노산 잔기 이하(예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 서열번호 159의 아미노산 위치 24, 30, 32, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 104에 대응하는 아미노산 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 변이체 CTLA-4 폴리펩티드의 아미노산 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨지며, 여기에서 변이체 CTLA-4 폴리펩티드는 CD80 또는 CD86 또는 이 둘 중 하나의 세포외 도메인 또는 단편에 결합하는 능력을 가지며 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 이들 위치에서의 예시적인 아미노산 치환은, WT hCTLA-4 ECD 및/또는 A24S/E(즉, A24S 또는 A24E), T30N/D/A(즉, T30N 또는 T30D 또는 T30A), V32I/L/M/V, A50M/G, M54E/V/K, G55E/K/R, N56D/A, S64P/M/C, I65S/T/F/V, S70F/Y/W, L104E/M , 또는 이들의 치환의 임의의 조합 내에 존재하는 아미노산 잔기의 보존성 아미노산 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드(예컨대, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드)를 제공하는데, 이들 각각은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과는 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들) 이하로 상이하고, (b) 여기에서 아미노산 잔기 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서의 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기는 상기 선택된 폴리펩티드 서열(예컨대, 서열번호 1-73에서 선택된 폴리펩티드)에서의 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한, 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응(들)을 저해한다. 어떤 경우에, 폴리펩티드는 선택된 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1-73에서 선택됨)와는 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하나, 하나 이상의 아미노산 잔기 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 85를 차지하는 아미노산은 선택된 폴리펩티드 서열(예컨대, 서열번호 1-73에서 선택된 것) 내의 그 위치에 포함되는 아미노산 잔기와 동일하며, 결실되거나 다른 아미노산으로 치환되지 않는다. 일부 그러한 폴리펩티드는 선택된 폴리펩티드 서열과 10개, 9개, 8개, 7개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하며, 선택된 폴리펩티드 서열 내의 대응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한 하나 이상의 아미노산 잔기 위치 24, 30, 32, 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 및 106에서의 아미노산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함한다. 선택된 서열의 것과 동일한 아미노산을 갖는 그러한 폴리펩티드는 선택된 폴리펩티드 서열과는 특정되지 않은 위치(들)에서의 아미노산 결실(들), 첨가(들), 및/또는 아미노산 치환(들)에 의하여 상이할 수 있다. hCD86 또는 이의 단편(예, ECD)에 대한 hCTLA-4 ECD 또는 LEA29Y 폴리펩티드의 결합 친화도 또는 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰 hCD86 또는 이의 단편(예, hCD86 ECD)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 갖는 그러한 폴리펩티드가, 각각 포함된다. 일부 그러한 폴리펩티드는 hCD80 또는 이의 단편에 대한 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 결합 친화도 또는 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰 hCD80 또는 이의 단편(예, hCD80 ECD)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을, 각각 가진다. 일부 그러한 폴리펩티드는, hCTLA-4 ECD의 아미노산 길이에 거의 동등한 길이, 예컨대, 예컨대, 118-130개, 119-129개, 120-128개, 121-127개, 122-126개, 123-125개 또는 124개의 아미노산 잔기 길이를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 그러한 폴리펩티드는, T 세포 활성화, T 세포 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 염증성 분자의 생산, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응(들)을 포함하는, 하나 이상의 다양한 면역 반응을 억제할 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 hCTLA-4, hCTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 LEA29Y 폴리펩티드보다 하나 이상의 그러한 면역 반응을 저해하는 능력이 더 크다. 예를 들어, 일부 그러한 폴리펩티드는 시험관 내 분석에서 T 세포 활성화 또는 T 세포 증식을 저해할 수 있다. 예컨대, 실시예 4-9는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 대표적인 융합 단백질의 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는 능력을, hCTLA-4 ECD 또는 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 그렇게 하는 능력과 비교한다. 일부 그러한 폴리펩티드는, 면역억제 치료가 필요한 대상체에 적어도 하나의 그러한 폴리펩티드를 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 통하여와 같이, 생체 내에서 대상체 내의 면역 반응을 저해하거나 억제할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는, 예컨대, 자가면역 질환 및 장애를 치료하기 위한 예방적 및/또는 치료적 방법, 수용자에 의한(예컨대, 인간과 같은, 포유류에 의한) 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법, 및 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 다른 방법을 포함하여, 면역 반응의 억제가 바람직한 면역계의 질환, 장애 및 이상을 치료하는 예방적 및/또는 치료적 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 응용에서 유용한 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 분리성 또는 재조합형 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드)를 제공하는데, 그 각각은 (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 10개 아미노산 잔기 이하, 9개 아미노산 잔기 이하, 8개 아미노산 잔기 이하, 7개 아미노산 잔기 이하, 6개 아미노산 잔기 이하, 5개 아미노산 잔기 이하, 4개 아미노산 잔기 이하, 3개 아미노산 잔기 이하, 2개 아미노산 잔기 이하, 또는 1개 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 서열번호 159의 폴리펩티드 서열에 관한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 잔기 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는, hCD80 및/또는 hCD86 및/또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 하기에 더 자세히 기술되는 시험관 내 및/또는 생체 내 방법 및/또는 분석에서와 같이, 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 염증성 분자의 생산, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응)을 저해한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 124개의 아미노산 잔기 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 아미노산 잔기 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 85로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 제시된 폴리펩티드 서열에 관한 위치에서의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는, 서열번호 159에 관한 위치 104 및/또는 30에 대응하는 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는, 위치 70(선택적으로 S70F), 위치 64(선택적으로 S64P), 위치 50(선택적으로 A50M/G, 예컨대, A50M, A50G), 위치 54(선택적으로 M54K/V, 예컨대, M54K), 위치 65(선택적으로 I65S), 위치 56(선택적으로 N56D), 위치 55(선택적으로 G55E/K, 예컨대, G55E, G55K), 위치 85(선택적으로 M85A), 및/또는 위치 24(선택적으로 A24E/S, 예컨대, A24E)에서 서열번호 159에 관하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 그러한 폴리펩티드는, 위치 104(선택적으로 L104E/D, 예컨대, L104E), 위치 30(선택적으로 T30N/D/A, 예컨대, T30N, T30D, 또는 T30A), 및/또는 위치 32(선택적으로 V32I)에서 서열번호 159에 관하여 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 폴리펩티드는 A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는, CD86 또는 CD86 ECD에 대한 모노머성 hCTLA-4 ECD의 결합 친화도에 거의 동등하거나 그보다 큰 CD86(예, hCD86) 또는 CD86 ECD(예, hCD86 ECD)에 대한 결합 친화도를 각각 나타낸다. 일부 그러한 폴리펩티드는, CD80 또는 CD80 ECD에 대한 모노머성 hCTLA-4 ECD의 결합 친화도보다 큰 CD80(예, hCD80) 또는 CD80 ECD(예, hCD80 ECD)에 대한 결합 친화도를 각각 나타낸다.
일부 그러한 폴리펩티드는, 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서와 같이, 하나 이상의 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산 등)을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 폴리펩티드는 하나 이상의 그러한 면역 반응을 hCTLA-4, hCTLA-4 ECD 또는 LEA29Y 폴리펩티드보다 더 높은 정도로 저해한다. 그러한 폴리펩티드는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하기 위한 예방적 및/또는 치료적 방법, 또는 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식 거부를 저해하기 위한 예방적 및/또는 치료적 방법을 포함하여, 다양한 치료적 응용에 유용하게 이용되리라 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드)를 제공하는데, 그 각각은 (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 6개 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서의 하나 이상의 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86 또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 시험관 내 분석 및/또는 생체 내 방법에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산, 활성화 마커의 유도, 염증성 분자의 생산, 염증, 관절 부종 또는 압통, 통증, 경직, C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 Ab 단백질의 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응 등)을 저해한다. 그러한 폴리펩티드는, 예컨대, 자가면역 질환 및 장애를 치료하기 위한 치료적 및 예방적 방법, 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 예방적 및 치료적 방법을 포함하여, 면역억제 치료가 유리할 것 같은 질환, 장애 또는 이상으로 고통 받는 대상체를 치료하는 데 유용한 것으로 예상된다.
또한 본 발명은 (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 임의의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 및 (ii) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 상기 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서의 페닐알라닌 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86 또는 이의 세포외 도메인에 결합하며, 및/또는 시험관 내 분석에서 및/또는 생체 내 방법에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산, 활성화 마커의 유도, 염증성 분자의 생산, 염증, 관절 부종 또는 압통, 통증, 경직, C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 Ab 단백질의 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응 등)을 저해한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 선택된 서열에 관한 다음 것들 중 하나 이상을 포함한다: 위치 24에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루탐산 잔기; 위치 30 에 대응하는 아미노산 위치에서의 아스파라긴 잔기; 위치 32 에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 잔기; 위치 50 에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 잔기; 위치 54 에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 잔기; 위치 55 에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루탐산 잔기; 위치 56 에 대응하는 아미노산 위치에서의 아스파르트산 잔기; 위치 64 에 대응하는 아미노산 위치에서의 프롤린 잔기; 위치 65 에 대응하는 아미노산 위치에서의 세린 잔기; 및 위치 104 에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루탐산 잔기. 그러한 폴리펩티드는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법, 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에 유용하게 이용되리라 예상된다.
예를 들어, 하나의 비-제한된 양태에서, 본 발명은, (i) 서열번호 24의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성 및 (ii) 서열번호 24의 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서의 페닐알라닌 잔기를, 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)를 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86 및/또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD에 결합하며, 및/또는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응을 저해한다. 폴리펩티드는 서열번호 24에 관한 적어도 하나의 다음의 것을 포함한다: 위치 24에서의 글루탐산 잔기; 위치 30에서의 아스파라긴 잔기; 위치 32에서의 이소류신 잔기; 위치 50에서의 메티오닌 잔기; 위치 54에서의 리신 잔기; 위치 55에서의 글루탐산 잔기; 위치 56에서의 아스파르트산 잔기; 위치 64에서의 프롤린 잔기; 위치 65에서의 세린 잔기; 및 위치 104에서의 글루탐산 잔기.
또한 본 발명은 hCD80 및/또는 hCD86 (및/또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD)에 결합하며, 및/또는, 예컨대, 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응(상기에서 기술됨)을 저해하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드)를 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는, (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, (b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 여기에서 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 S70F를 포함하고, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨진다. 폴리펩티드는 A24E, T30N, V32I, D41G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E 및 I106F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 그러한 폴리펩티드는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법, 및 장기, 세포 또는 조직, 또는 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용한 것으로 여겨진다.
또한 본 발명은, (a) 서열번호 31에 나타낸 폴리펩티드 서열과는 6개 아미노산 잔기 이하로 상이하고, (b) 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 포함하는데: 서열번호 31의 위치 50에 대응하는 위치에서 메티오닌 잔기, 서열번호 31의 위치 54에 대응하는 위치에서 리신 잔기, 서열번호 31의 위치 55에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 서열번호 31의 위치 64에 대응하는 위치에서 프롤린 잔기, 서열번호 31의 위치 65에 대응하는 위치에서 세린 잔기, 서열번호 31의 위치 70에 대응하는 위치에서 페닐알라닌 잔기, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 31에 따라 번호가 매겨지며, 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 상기에 기술된 면역 반응을 저해한다. 폴리펩티드는, 서열번호 31의 위치 104에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 위치 30에 대응하는 위치에서의 아르파라긴산 잔기, 및/또는 위치 32에 대응하는 위치에서의 이소류신 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는, 류마티스 질환 및 장애를 치료하는 방법, 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용한 것으로 여겨진다.
다른 양태에서, 본 발명은, (i) 서열번호 36-46 및 55로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성, 및 (ii) 상기 선택된 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 55에서의 글루탐산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 억제한다. 억제될 수 있는 면역 반응은, 예컨대, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 염증성 분자의 생산, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T-세포 의존성 Ab 반응을 포함한다. 그러한 폴리펩티드 서열은 아미노산 위치 70에서 페닐알라닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드 서열은 위치 64에서 프롤린 잔기 및/또는 위치 30에서 아스파라긴 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드 서열은 위치 50에서 메티오닌 잔기 및/또는 위치 54에서 리신 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은, (i) 서열번호 28, 30, 36-46, 55-57 및 65-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성, 및 (ii) 상기 선택된 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 55에서의 글루탐산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하며, 및/또는, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 염증성 분자의 생산, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T-세포 의존성 Ab 반응과 같은, 면역 반응을 억제한다. 그러한 폴리펩티드 서열은 아미노산 위치 70에서 페닐알라닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드 서열은 잔기 64에서 프롤린 잔기 및/또는 위치 30에서 아스파라긴 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드 서열은 위치 50에서 메티오닌 잔기 및/또는 위치 54에서 리신 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 분비를 용이하게 하는 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 상기에서 기술된 임의의 폴리펩티드(예, 상기에서 기술된 변이체 CTLA-4 ECD), 및 (b) 숙주 세포로부터 발현 폴리펩티드의 분비를 용이하게 하는 펩티드를 포함하는, 분리형 또는 조합형 폴리펩티드를 제공한다. 펩티드는 선택적으로 신호 펩티드이다. 신호 펩티드의 C-말단은 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 연결되어 있다. 신호 펩티드는 서열번호 182 또는 서열번호 216의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열번호 160의 아미노산 잔기 1-35, 1-36 또는 1-37을 포함하는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기에 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드는 트랜스막 도메인 및/또는 세포질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 상기에서 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드(예, 상기에서 기술된 변이체 CTLA-4 ECD), 및 (b) 트랜스막 도메인을 포함하는, 분리형 또는 조합형 폴리펩티드를 제공한다. 그러한 단백질은 선택적으로 상기에서 기술된 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있는데, 여기에서 신호 펩티드의 C-말단은 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 연결되어 있다. 신호 펩티드의 C-말단은 일반적으로 트랜스막 도메인의 N-말단에 공유적으로 연결되어 있다. 트랜스막 도메인의 C-말단은 일반적으로 세포질 도메인의 N-말단에 공유적으로 연결되어 있다. 일부 경우에, 트랜스막 도메인은 서열번호 160의 아미노산 잔기 162-182를 포함하는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 세포질 도메인은 서열번호 160의 아미노산 잔기 183-223을 포함하는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 상기-기술된 폴리펩티드는 글리코실화되거나(glycosylated) 페길화된(pegylated) 아미노산 잔기 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드 멀티머를 포함하는데, 여기에서 멀티머의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 본 명세서에서 기술된 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드이다(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig). 그러한 멀티머는 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하며, 본 발명의 폴리펩티드일 필요가 없는 적어도 하나의 부가적인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 멀티머는 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드 및 예컨대, 야생형 폴리펩티드(예, hCTLA-4 ECD 또는 hCTLA-4-Ig)일 수 있는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드 및/또는 (본 발명의 폴리펩티드가 아닌 변이체 폴리펩티드와 같은) 적어도 하나의 다른 변이체 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 멀티머(또는 멀티머성 폴리펩티드) 내의 폴리펩티드의 일부 또는 모두는 서로 동일할 수 있으며, 또는 일부 경우에, 멀티머 내의 모든 폴리펩티드는 서로 상이할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드 멀티머는 본 발명의 폴리펩티드 두 개를 포함하는 다이머인데, 이는 선택적으로 동일한 폴리펩티드(즉, 호모다이머(homodimer)) 또는 상이한 폴리펩티드(즉, 헤테로다이머(heterodimer))일 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드 멀티머는 본 발명의 폴리펩티드 네 개를 포함하는 테트라머이다. 테트라머는 네개의 동일한 폴리펩티드(즉, 호모테트라머(homotetramer)) 또는, 적어도 하나의 폴리펩티드가 다른 세 개의 폴리펩티드와 동일하지 않는(즉, 헤테로테트라머(heterotetramer)) 본 발명의 폴리펩티드 네 개의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 네 개의 동일한 WT CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, hCTLA-4 ECD) 또는 네 개의 동일한 WT CTLA-4-Ig(예, hCTLA-4-Ig)을 포함하는 테트라머를 포함한다. 일부 경우에, 멀티머는 CD80 및/또는 CD86 (또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD)에 결합할 수 있으며, 및/또는 시험관 내 및/또는 생체 내 방법에서 면역 반응(예, T 세포 증식 또는 활성화, 사이토카인 생산 등)을 억제하거나 저해할 수 있다. 일부 그러한 멀티머는 hCTLA-4 또는 hCTLA-4-Ig (예, hCTLA-4-IgG2 또는 Orencia®단백질)보다 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력이 더 크다. 멀티머의 폴리펩티드는 공유 결합 같은 것에 의하여, 하나 이상의 폴리펩티드 내의 하나 이상의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합 같은 것을 통하여, 함께 연결될 수 있다.
본 발명의 일부 그러한 테트라머는 항체의 것과 도식적으로 유사한 구조를 포함하나, 항체의 가변 도메인은 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 각각 대체되어 있다. 항체의 중쇄는, 힌지로 융합되는, 면역글로불린(Ig) CH1 도메인(예, IgG2 CH1)으로 융합된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 힌지는 Ig CH2 도메인(예, IgG2 CH2)으로 융합되고, 이것은 Ig CH3 도메인(예, IgG2 CH3)으로 융합된다. 항체의 경쇄는 Ig C 카파(Cκ) 또는 C 람다(Cλ) 도메인으로 융합된 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄는 중쇄 및 경쇄에서 시스테인 잔기를 통하여 형성된 하나 이상의 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결되어 있다. 본 발명은, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각이 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 대체되어 있는 변이체 CTLA-4 테트라머를 포함한다. 따라서, 그러한 테트라머는 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄를 포함한다. 경쇄 각각은 Ig Cκ 또는 Cλ 도메인으로 융합된 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 중쇄 각각은, 힌지에 융합되는, Ig CH1 도메인(예, IgG2 CH1)으로 융합된 변이체 CTLA-4 ECD를 포함한다. 힌지는 Ig CH2 도메인(예, IgG2 CH2)으로 융합되고, 이것은 Ig CH3 도메인(예, IgG2 CH3)으로 융합된다. 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄는 중쇄 및 경쇄 내의 시스테인 잔기를 통하여 형성된 하나 이상의 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결되어 있다. 그러한 테트라머는 CTLA-4-Ig 테트라머로서 기술될 수 있다. 그러한 CTLA-4-Ig 테트라머를 구성하는 방법은 공지되어 있으며, 당해 분야에서 통상의 기술자에 의하여 이해될 수 있을 것이다. CD4 폴리펩티드를 포함하고 일차 HIV 타입 1 분리체를 중화시키는, 테트라머성 CD4-Ig 구성체가 Allaway, G.P. 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses 11(5):533-9 (1995)에 기술되어 있다. 테트라머는 본 발명의 네 개의 동일한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 또는 적어도 하나의 변이체 CTLA-4 ECD가 다른 세 개의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드와 동일하지 않도록 하는 네 개의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 그러한 테트라머는 hCTLA-4 (또는 hCTLA-4-Ig)보다 높은 결합 활성으로 CD80 및/또는 CD86에 결합할 수 있다. 일부 그러한 테트라머는 면역 반응을 억제하거나 저해할 수 있는데, 어떤 경우에, 그러한 테트라머는 시험관 내 분석에서 또는 생체에 응용에서 면역 반응(예, T 세포 증식 또는 활성화, 사이토카인 생산 등)을 억제하거나 저해하는 능력이 hCTLA-4 또는 hCTLA-4-Ig(예, hCTLA-4-IgG2 또는 Orencia®)보다 더 크다. 본 발명의 멀티머는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법, 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용하게 이용되리라 예상된다.
또한 본 발명은 둘 이상의 접합체를 포함하는 분리형 또는 재조합형 접합체 멀티머를 포함하는데, 여기에서 접합체의 적어도 하나는 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig)를 포함하는 본 발명의 접합체이다. 멀티머 내의 접합체의 일부 또는 모두는 서로 동일할 수 있거나, 멀티머 내의 모든 접합체는 서로 상이할 수 있다. 일부 경우에, 접합체 멀티머는 본 발명의 두 개의 접합체를 포함하는 다이머 또는 본 발명의 네 개의 접합체를 포함하는 테트라머이다. 일부 그러한 접합체 다이머는 CD80 및/또는 CD86(또는 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD)에 결합할 수 있으며, 및/또는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응을 억제하거나 저해할 수 있다. 멀티머 내의 접합체 분자는, 공유 결합 같은 것에 의하여, 하나 이상의 접합체에서 하나 이상의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합 같은 것을 통하여, 함께 연결될 수 있다.
본 발명은 상기에 기술된 본 발명의 임의의 두 개의 폴리펩티드(예, 상기에서 기술된 변이체 CTLA-4 ECD)를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드 다이머를 포함하는데, 여기에서 다이머는, 인간 CD86 또는 이의 세포외 도메인에 대한 두 개의 인간 CTLA-4 세포외 도메인을 포함하는 다이머의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, 인간 CD86 또는 이의 세포외 도메인에 대한 결합 활성을, 각각 가진다.
본 발명은 상기에서 기술된 본 발명의 폴리펩티드(예, 상기에서 기술된 변이체 CTLA-4 ECD) 두 개를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드 다이머를 포함하는데, 여기에서 다이머는, hCD80 또는 이의 ECD에 대한 두 개의 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드(서열번호 159)를 포함하는 다이머의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD80 또는 이의 ECD에 대한 결합 활성을 각각 가진다. 예를 들어, 비제한적 양태에서, 다이머는 두 개의 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 여기에서 각 폴리펩티드는 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 각 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해한다. 다른 비제한적 양태에서, 다이머는 두 개의 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 여기에서 각 폴리펩티드는 hCTLA-4 ECD(서열번호 159)의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하며, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함하고; 상기 폴리펩티드는 선택적으로 치환 L104E를 추가로 포함하며, 각 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다.
일부 경우에, 다이머는, hCD80 또는 이의 ECD에 대한 두 개의 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 다이머의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD80 또는 이의 ECD에 대한 결합 활성을, 각각 가진다. 일부 경우에, 다이머는, hCD86 또는 이의 ECD에 대한 두 개의 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 다이머의 결합 활성보다 큰, hCD86 또는 이의 ECD에 대한 결합 활성을 각각 가지는데, 여기에서 각 LEA29Y 폴리펩티드는 서열번호 168에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 다이머는, 두 개의 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 다이머가 결합하고 있는 hCD86 또는 이의 ECD로부터 해리하는 속도보다 작은 속도로, 결합하고 있는 hCD86 또는 이의 ECD로부터 각각 해리한다. 일부 경우에, 다이머는, 두 개의 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 다이머가 결합하고 있는 hCD86 또는 이의 ECD로부터 해리하는 속도보다 작은 속도로, 결합하고 있는 hCD86 또는 이의 ECD로부터 각각 해리하는데, 여기에서 각 LEA29Y 폴리펩티드는 서열번호 168에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 다이머는, 두 개의 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 다이머가 hCD86 또는 이의 ECD에 결합하는 속도보다 큰 속도로, hCD86 또는 이의 ECD에 각각 결합한다. 일부 경우에, 다이머는, 두 개의 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 다이머가 hCD86 또는 이의 ECD에 결합하는 속도보다 큰 속도로, hCD86 또는 이의 ECD에 각각 결합하는데, 여기에서 각 LEA29Y 폴리펩티드는 서열번호 168에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 변이체 CTLA-4 ECD를 포함하는 그러한 다이머는, 두 개의 인간 CTLA-4 세포외 도메인 또는 두 개의 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 다이머보다 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산 등)을 억제하는 능력이 더 크다.
일부 그러한 다이머는, 두 개의 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 두 개의 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 다이머의 CD86 평형 해리 상수(KD)보다 작은 CD86 평형 해리 상수(KD)를 가진다. 일부 그러한 다이머는 두 개의 LEA29Y 폴리펩티드를 포함하는 다이머의 CD86 평형 해리 상부(KD)보다 작은 CD86 평형 해리 상수(KD)를 가지는데, 각 LEA29Y 폴리펩티드는 서열번호 168에 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
적어도 두 개의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 일부 그러한 멀티머(예, 두 개의 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 다이머)는 동일한 결합가(valency)의 전장 hCTLA-4의 멀티머(즉, 전장 CTLA-4 폴리펩티드의 동일한 수를 포함하는 멀티머)에 비하여 면역 반응을 억제하는 능력이 증진되어 있다. 적어도 두 개의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 일부 그러한 멀티머는 동일한 결합가의 hCTLA-4 ECD의 멀티머(즉, hCTLA-4 ECD 폴리펩티드의 동일한 수를 포함하는 멀티머)에 비하여 면역 반응을 억제하는 능력이 증진되어 있다.
상기에서 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드는, 면역글로불린(Ig) 폴리펩티드 서열과 같이, 용해도를 증진시키는 부가적인 폴리펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있는데, 그렇게 함으로써, 아래에 더 자세히 검토되는 바와 같은, 예컨대, 가용성 융합 단백질을 형성한다. 폴리펩티드 멀티머의 각 폴리펩티드는, Ig 폴리펩티드 서열과 같이, 용해도를 증진시키는 부가적인 폴리펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있는데, 그렇게 함으로써, 예컨대, 가용성 융합 단백질을 형성한다. 따라서, 예를 들어, 상기에 기술된 바와 같이, 둘 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 다이머의 각 폴리펩티드는, Ig 폴리펩티드 서열과 같이, 용해도를 증진시키는 부가적인 폴리펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있는데, 그렇게 함으로써, 예컨대, 가용성 융합 단백질을 형성한다.
본 발명의 그러한 폴리펩티드 및 다이머는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용하게 이용되리라 예상된다.
이전에 검토된 바와 같이, 성숙 hCTLA-4 단백질 서열은 일반적으로 서열번호 160에 나타낸 전장 hCTLA-4 단백질 서열의 아미노산 위치 38에서의 메티오닌 잔기와 함께 시작하며, 성숙 hCTLA-4 단백질 서열의 아미노산 잔기는 일반적으로 첫 번째 아미노산(즉, 아미노산 위치 1을 차지함)으로서 이 메티오닌 잔기로 시작하여 번호가 매겨진다.
일부 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드(모노머성 및 다이머성 융합 단백질 및 멀티머성 폴리펩티드를 포함함)는, 예를 들면, 아미노산 위치 24, 41, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 85의 임의의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전형적인 hCTLA-4/hB7-2 결합 계면의 외부에 있는 성숙 hCTLA-4 단백질 서열 내의 아미노산 위치에 대응하는 아미노산 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다(예컨대, Schwartz 등, Nature 410:604-608 (2001)을 참조). 일반적으로, 당해 분야에서의 통상의 기술자는, 상기-언급한 위치(24, 41, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 및/또는 85) 중 임의의 것에서의 아미노산 치환 또는 위치 24, 41, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 85의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환의 임의의 조합이, hB7-2에 대한 hCTLA-4의 결합 친화도 또는 결합 활성을 증진시키는 능력을 가지거나, B7-2-양성 세포와의 CD28-양성의 상호작용을 저해하는 능력을 증진시키거나, 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산, 활성화 마커의 유도, 염증성 분자의 합성 또는 생산, 항-콜라겐 항체 생산, T 세포-의존성 항체 반응, 등)을 억제하거나 저해하는 능력이, 예컨대, hCTLA-4 ECD 또는 hCTLA-4-Ig보다 더 클 것이라는 것을, 예측하지 못했을 것이다. 또한, 당해 분야에서의 통상의 기술자는, 상기-언급한 위치(24, 41, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 및/또는 85) 중 임의의 것 또는 그러한 위치의 임의의 조합에서의 본 명세서에서 기술된 특정 아미노산 치환(들) 또는 특정 아미노산 치환의 조합이, hB7-2에 대한 hCTLA-4의 결합 친화도 또는 결합 활성을 증진시키는 능력을 가지거나, B7-2-양성 세포와의 CD28-양성의 상호작용을 저해하는 능력을 증진시키거나, 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력이, 예컨대, hCTLA-4 ECD 또는 hCTLA-4-Ig보다 더 크다라는 것을, 예측하지 못했을 것이다.
변이체
CTLA
-4 융합 단백질
본 발명은 또한 상기에 및 전체에 걸쳐 기술되는 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 같은, 예컨대, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드와 같은)의 적어도 하나인 제1 폴리펩티드를 포함하는 신규한 분리형 및 재조합형 융합 단백질을 제공하는데, 이 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 연결되거나 융합되어 융합 단백질을 형성한다. 제2 폴리펩티드는 일반적으로 제1 폴리펩티드의 분비 또는 발현을 용이하게 한다. 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 1-73으로 확인된 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명은, 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드와 같은, 본 발명의 생물학적 활성 성분(moieties)에 융합되거나 부착되는, Ig Fc 도메인과 같은, 면역글로불린(Ig) 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은, 진단 분석에서, 면역조절 및/또는 면역억제가 이로운 다양한 면역계 질환 및 장애 및 이상의 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 예방적 및/또는 치료적 제제로서, 그리고 본 명세서의 다른 부분에 더 자세히 검토되는 면역조절의 및/또는 면역억제의 활성 또는 성질을 갖는 약제 또는 제제의 제조를 위하여, 유용한 것으로 여겨진다.
변이체 CTLA-4 폴리펩티드 및 Ig 폴리펩티드(예, Ig Fc)를 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 일반적으로 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질로 지칭된다. 하기에서 및 실시예에서 더 자세하게 기술되는 본 발명의 모노머성 및 다이머성 융합 단백질을 포함하여, 본 발명의 임의의 융합 단백질은, 본 명세서에 그리고 상기 및 하기의 다른 부분에 기술되어 있는, 예컨대, Ig Fc 폴리펩티드와 같은, Ig 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드으로 직접 연결될 수 있다. 예를 들어, 제2 폴리펩티드(예컨대, Ig Fc 폴리펩티드와 같은, Ig 폴리펩티드)의 N-말단은 본 발명의 제1 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드)의 C-말단으로 직접 공유적으로 융합될 수 있다. 대안적으로, 제2 폴리펩티드는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 링커 아미노산 서열이 제1 및 제2 폴리펩티드 사이에 포함되는 곳과 같은, 제1 폴리펩티드로 간접적으로 연결될 수 있다. 링커가 포함되는 경우에, 아미노산 링커 서열의 N-말단은 일반적으로 제1 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)의 C-말단으로 공유적으로 융합되며, 제2 폴리펩티드(예, Ig Fc와 같은, Ig 폴리펩티드)의 N-말단은 일반적으로 아미노산 링커 서열의 C-말단으로 공유적으로 융합되어 있다.
일부 경우에, 제2 폴리펩티드는, 예컨대, Ig 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 도메인과 같은, Ig 폴리펩티드의 적어도 일부분을 포함한다. 제2 폴리펩티드는 Ig 폴리펩티드의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 제2 폴리펩티드는, 예컨대, WT 인간 Ig 폴리펩티드(즉, WT 인간 Ig Fc 폴리펩티드)의 Fc 도메인과 같은, WT Ig 폴리펩티드(즉, WT Ig Fc 폴리펩티드)의 Fc 도메인을 포함한다. 다른 부분에 검토된 바와 같이, Ig 폴리펩티드는, 예컨대 포유류, 예컨대 인간, 마우스, 비-인간 영장류(예, 원숭이, 고릴라), 고양이, 개, 말 등을 포함하는, 다양한 종으로부터 올 수 있으며, 다양한 클래스(예, IgG, IgM, IgE 등) 및 서브클래스(예, IgG의 경우 IgG1, IgG2, IgG4 등을 포함함)에서 올 수 있고, 임의의 그러한 Ig 폴리펩티드의 Fc 도메인 또는 부분을 포함할 수 있다. 그러한 다양한 종의 Ig 폴리펩티드의 아미노산 및 핵산 서열은 당해 분야에 알려져 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 신규한 분리형 또는 재조합형 융합 단백질을 제공하는데, 각각은 C-말단에서 Ig Fc 폴리펩티드, 즉 Ig 폴리펩티드의 Fc 도메인의 N-말단으로, 직접적으로 또는 간접적으로(아미노산 링커 서열을 통하여), 공유적으로 연결되거나 융합된, 상기에 기술된 본 발명의 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)를 포함한다. 하기에 그리고 실시예에 더 자세히 기술되는 본 발명의 모노머성 및 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하여, 본 발명의 임의의 융합 단백질은 본 명세서에서 그리고 상기 및 하기의 다른 부분에서 기술된 Ig Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. Ig Fc 폴리펩티드는 일반적으로 Ig 폴리펩티드의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. Ig Fc 폴리펩티드는, 예컨대, 인간, 쥐, 영장류 등을 포함하여, 다양한 종에서 유래될 수 있으며, 야생형 Ig Fc 폴리펩티드(예, WT IgG1, IgG2, 또는 IgG4)를 포함할 수 있다. 예시적인 인간 IgG Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 인간 IgG1 Fc의 폴리펩티드 서열은 서열번호 185에 제시되어 있다. 예시적인 인간 IgG2 Fc의 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열은 서열번호 184 및 218에 각각 제시되어 있다. 대안적으로, Ig Fc 폴리펩티드는 변이체 Ig 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산(예, 세린 잔기)로 치환되어 두 개의 Ig 사슬 사이에 형성된 하나 이상의 이황화 결합을 제거하거나, 하나 이상의 프롤린 잔기가 다른 아미노산(예, 프롤린)으로 치환되어 효과기(effector) 기능을 감소시키는(Fc 수용체 결합 감소), 변이체 IgG1 Fc가 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 포함될 수 있다. 예시적인 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열이 서열번호 186에 나타나 있다. 본 발명은 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 또는 변이체 CTLA-4-Ig 모노머와 같은, 분리형 또는 재조합형 융합 단백질을 포함하는데, 이것은 C-말단에서, 서열번호 184(인간 IgG2 Fc 폴리펩티드), 185(인간 IgG1 Fc 폴리펩티드), 186(변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드) 및 218(C-말단 리신(K) 잔기가 없는 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합형 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 연결되는 상기 기술된 적어도 하나의 재조합형 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 예측된 폴리펩티드 서열은 다음의 분절을 포함한다: 융합 단백질의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드 서열(예, hCTLA-4 신호 펩티드(서열번호 182 또는 서열번호 216)); 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 여기에서 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 반드시 그런 것을 아니지만 일반적으로, 약 118개 내지 130개 아미노산 잔기를 포함하고, 보통 124개 아미노산 잔기 길이를 가짐; 및 Ig Fc 폴리펩티드. 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 상기에서 그리고 하기에서 기술된 것들을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단과 인간 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단 사이에 아미노산 링커 서열은 없다; 즉, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 내의 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 직접 공유적으로 융합되어 있다. 그러나, 원한다면, 변이체 CTLA-4-Ig는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단과 인간 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단 사이에 링커(예, 하나 이상의 아미노산 잔기)를 포함할 수 있다. 본 발명의 예측된 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 신호 펩티드는 일반적으로 가공 중에 변이체 CTLA-4 Ig 융합 단백질의 N-말단으로부터 절단되며, 그럼으로써 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 성숙 형태 또는 분비 형태가 보통 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 두 개의 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질 다이머는, (1) 변이체 CTLA-4 ECD와 하나의 그러한 모노머성 융합 단백질의 IgG2 Fc 내의 시스테인 잔기 및 (2) 변이체 CTLA-4 ECD와 제2 (반드시 그런 것은 아니나 일반적으로 동일한) 모노머성 융합 단백질의 IgG2 Fc 내의 시스테인 잔기 사이에 공유성 이황화 결합을 생성함으로써, 세포 가공 중에 일반적으로 형성된다.
본 발명은, 각각이 두 개의 본 발명의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질(융합 단백질 다이머라고도 지칭됨)을 포함한다. 다이머는 두 개의 동일한 또는 상이한 모노머성 융합 단백질을 포함할 수 있다. 다이머성 융합 단백질은 두 개의 모노머성 융합 단백질 사이의 연결(들)에 의하여 형성된다. 두 개의 그러한 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질은, 일반적으로, 하나의 모노머성 융합 단백질 내의 시스테인 잔기와 제2 모노머성 융합 단백질 내의 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합을 생성함으로써, 세포 가공 중에 형성된다. 따라서, 일부 경우에, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 본 발명의 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머로서 발현된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 각 모노머성 융합 단백질은, C-말단에서 Ig Fc 폴리펩티드로 융합되는, 상기에 그리고 추가로 하기에 자세히 기술된 바와 같은, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 다이머는, 변이체 CTLA-4 ECD 내의 시스테인 잔기와 하나의 모노머성 융합 단백질의 Ig Fc, 그리고 변이체 CTLA-4 ECD 내의 시스테인 잔기와 제2 모노머성 융합 단백질의 Ig Fc 사이에 공유 이황화 결합을 생성함으로써, 세포 가공 중에 형성된다. 두 개의 모노머성 융합 단백질은, 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로, 동일한 서열을 포함한다. 신호 펩티드가 일반적으로 가공 중에 단백질의 N-말단으로부터 절단되므로, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 분비 형태 또는 성숙 형태는 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 예측된 변이체 CTLA-4-Ig 융합은 신호 펩티드를 포함하는데, C-말단은 일반적으로 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 N-말단으로 공유적으로 연결된다. 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 각 모노머성 N-말단은 일반적으로 메티오닌(M)을 포함한다.
비제한적 실시예로써, 본 발명은 두 개의 모노머성 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 각 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 C-말단에서 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 연결되는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 1-73의 임의의 것으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 그러한 다이머성 융합 단백질에서, 두 개의 모노머성 융합 단백질은 각 CTLA-4 변이체 ECD 폴리펩티드 서열 내의 위치 120에서 시스테인 잔기 사이에서 세포 가공 중에 형성된 공유 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결된다. 대안적으로 또는 덧붙여서, 두 개의 모노머성 융합 단백질은 제1 모노머성 융합 단백질의 Ig Fc 폴리펩티드 내의 하나 이상의 시스테인 잔기와 제2 모노머성 융합 단백질의 Ig Fc 폴리펩티드 내의 하나 이상의 시스테인 잔기 사이에 형성된 공유 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결되어 있다. 모노머성 융합 단백질은 그들의 각 Ig Fc 폴리펩티드 내에 존재하는 시스테인 잔기들 사이에 세포 가공 중에 형성된 다중 이황화 결합(예, 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 이황화 결합)에 의하여 함께 연결될 수 있다. 일부 경우에, 각 모노머성 융합 단백질은 동일한 Ig Fc 폴리펩티드(예, 예컨대, 서열번호 184 또는 218에 나타나 있는 인간 IgG2 Fc)로 구성되어 있으며, 공유 이황화 결합(들)은 각 Ig Fc 폴리펩티드 내의 동등한 위치에서의 시스테인 잔기들 사이에 세포 가공 중에 생성될 수 있다.
예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열을 포함하는 D3-12 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드이다. 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은, C-말단에서 서열번호 218에 나타낸 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 직접(링커 없이) 공유적으로 연결되거나 융합되어 서열번호 205에 나타낸 D3-12-IgG2 융합 단백질을 형성하거나, C-말단에서 서열번호 184에 나타낸 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 직접(링커 없이) 공유적으로 연결되거나 융합되어 서열번호 74에 나타낸 D3-12-IgG2 융합 단백질을 형성하는, D3-12 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드이다. 서열번호 74의 서열은 서열번호 205의 그것과는 하나의 잔기만큼 상이하다 - 즉, 부가적인 리신 잔기는 서열번호 74의 C-말단에 존재한다. 우리는, 예컨대, 서열번호 11에 나타낸 D3-12 ECD 폴리펩티드 서열 및 서열번호 184에 나타낸 hIgG2 Fc 폴리펩티드와 같은, 변이체 CTLA-4-ECD를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 형질감염함으로써 CHO 세포 내에서 만들어진 성숙 CTLA-4-Ig 융합 단백질이, 서열번호 184에 나타낸 hIgG2 Fc 서열에 기반하여 예측되었을, 예측된 C-말단 리신(K) 잔기를 일반적으로 포함하지 않는다는 것을, 액체 크로마토그래피 질량 분광계(liquid chromatography mass spectrometry, LCMS) 분석 등에 의하여 실험적으로 밝혔다.
예를 들어, 서열번호 153의 뉴클레오티드 서열은 hCTLA-4 신호 펩티드 및 D3-12-IgG2 융합 단백질을 인코딩하며, C-말단에서 정지 코돈 TAA를 포함한다. 리신 잔기를 위하여 코드하는 코돈 AAA는, 서열번호 153의 서열에서 정지 코돈 TAA에 즉시 선행한다. 서열번호 153의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 CHO 세포로 형질감염함으로써 생산되는 성숙 D3-12-IgG2 융합 단백질의 예측된 폴리펩티드 서열이 서열번호 74에 나타나 있다. 신호 펩티드는, 성숙 융합 단백질을 형성하기 위하여 가공 중에 절단되었으므로, D3-12-IgG2 융합 단백질의 성숙 형태에는 존재하지 않는다. 그러나, 우리는, 그런 경우에 성숙 D3-12-IgG2가, 일반적으로 서열번호 153의 뉴클레오티드 서열에 기반하여 예측되었을, 예측된 C-말단 리신 잔기를 일반적으로 포함하지 않는다는 것을, LCMS 분석에 기반하여, 밝혔다. 오히려, 그러한 방법에 의하여 생산된 결과의 성숙 D3-12-IgG2 폴리펩티드 서열이 서열번호 205에 나타낸 것이다. IgG2 Fc 폴리펩티드의 C-말단 리신은 가공 중에 또는 분비 전에 절단된 것으로 여겨진다.
서열번호 153의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그러한 벡터를 그러한 포유류 세포(예, COS 세포 등)로 형질감염함으로써 다른 포유류 세포를 이용하는 D3-12-IgG2 단백질의 생산은 유사한 가공 또는 분비 시스템(machinery)에 의하여 예측된 C-말단 리신 잔기가 결여된 유사한 D3-12-IgG2 융합 단백질을 생산할 것이리라 여겨진다.
다이머성 D3-12-IgG2 융합 단백질은 시스테인 잔기들 사이에 공유 이황화 결합을 생성함으로써 세포 가공 중에 형성된 하나 이상의 이황화 결합에 의하여 함께 연결된 두 개의 그러한 D3-12-IgG2 모노머를 포함한다. D3-12-IgG2 및 본 발명의 다른 융합 단백질은, 예컨대 실시예 3에 제시된 방법을 이용함으로써, 만들어질 수 있다. 예를 들어, D3-12 폴리펩티드(예, 서열번호 90)를 인코딩하는 핵산 서열은 IgG2 Fc 융합 벡터로 클로닝될 수 있고, 포유류 세포는 벡터에 의하여 형질감염될 수 있으며, 결과의 융합 단백질은, 실시예 3에 기술된 바와 같이, 발현되고(일반적으로 다이머성 형태로), 정제되고, 평가된다.
다른 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 36의 폴리펩티드 서열을 포함하는 D3-54 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드이며, 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 그의 C-말단에서 서열번호 218에 나타나 있는 hIgG2 Fc 폴리펩티드(C-말단 리신이 없는)의 N-말단으로 직접(링커 없음) 공유적으로 연결되거나 융합되어 서열번호 211에 나타낸 D3-54-IgG2 융합 단백질을 형성하거나, C-말단에서 서열번호 184에 나타나 있는 hIgG2 Fc 폴리펩티드(C-말단 리신이 있는)의 N-말단으로 직접(링커 없이) 공유적으로 연결되거나 융합되어 서열번호 197에 나타낸 D3-54-IgG2 융합 단백질을 형성하는, D3-54 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 상기에 검토된 바와 같이, CHO 세포 내에서 만들어진 성숙 D3-54-IgG2 융합 단백질이 일반적으로 예측된 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는다는 것을 실험 분석이 알려 준다. hIgG2 Fc의 C-말단 리신은 가공 중에 또는 분비 전에 절단되어 서열번호 211에 나타낸 D3-54-IgG2 융합 단백질 서열을 형성하는 것으로 여겨진다. 또한, 상기에 주지된 바와 같이, D3-29-IgG2는 실시예 3의 방법을 이용함으로써 만들어질 수 있다. 다이머성 D3-54-IgG2 융합 단백질은, 시스테인 잔기들 사이에 공유 이황화 결합을 생성함으로써 세포 가공 중에 형성된 하나 이상의 이황화 결합에 의하여 함께 연결된 두 개의 D3-54-IgG2 모노머를 포함한다. 서열번호 201에 나타낸 핵산 서열은 서열번호 197 및 211에 나타낸 융합 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 다른 융합 단백질은 hIgG2(서열번호 218 또는 184)에 연결되거나 융합되는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 유사하게 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 성숙 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질은, 예컨대, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 각각의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222의 폴리펩티드 서열의 각각은 C-말단 리신 잔기를 포함하는데; 이 C-말단 리신 잔기는 일반적으로 가공 중에 또는 분비 전에 절단되어 서열번호 205-210, 211-214, 219 및 221에 각각 나타낸 C-말단 리신이 없는 폴리펩티드 서열을 만든다.
도 10은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질의 예시적인 형상 또는 구조를 보여주는 도식이다. 두 개의 동일한 모노머성 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질이 도식적으로 나타나 있으며, 각각은 C-말단에서 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결된 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 각 인간 IgG2 폴리펩티드는 인간 IgG2 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. ECD와 Ig Fc 폴리펩티드 사이의 연결점에 존재하는 예시적인 아미노산 잔기가 또한 나타나 있다. 이러한 성분들 사이의 연결점에서의 아미노산 잔기는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열 및/또는 Ig 폴리펩티드 서열에 따라 상이할 수 있다. 이 다이머성 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질은 두 개의 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질 모노머 내의 상사(analogous) 위치에서의 시스테인 잔기들 사이에 적어도 하나의 이황화 결합을 형성하는 것에 기인한다. 두 개의 모노머들 사이에 이황화 결합을 형성하는데 잠재적으로 참여한 시스테인(C) 잔기가 별표로 표시되어 있다. 각 모노머성 융합 단백질의 신호 펩티드는 가공 중에 일반적으로 절단되며, 따라서 분비(성숙) 융합 단백질은 일반적으로 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 인간 IgG2의 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 IgG2 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열이 서열번호 184에 나타나 있다. 대안적인 양태에서, 인간 IgG2의 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 IgG2 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열이 서열번호 218에 나타나 있으며; 이 경우에, IgG2 폴리펩티드는, 서열번호 184의 서열에 비할 때, C-말단 리신(K)을 포함하지 않는다.
다른 부분에서 자세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 성질은, 예컨대, hCTLA-4-IgG1, hCTLA-4-IgG2, Orencia® 융합 단백질 및 LEA29Y-Ig와 같은, 하나 이상의 참조 Ig 융합 단백질의 성질에 비교될 수 있다. 비교될 수 있는 성질은, 예컨대, CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하는 능력, 및/또는 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산 등)을 저해하거나 억제하는 능력을 포함한다. 성숙 hCTLA-4-IgG1 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 hCTLA-4-IgG1 단백질을 포함하는 hCTLA-4-IgG1 융합 단백질 다이머로서 용액에 존재하는데, 각 모노머성 hCTLA-4-IgG1 융합 단백질은 IgG1 Fc 폴리펩티드에 연결되는 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드(서열번호 159)를 포함한다. 성숙 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 hCTLA-4-IgG2 단백질을 포함하는 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질 다이머로서 용액에 존재하는데, 각 모노머성 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질(서열번호 162)은 IgG2 Fc 폴리펩티드에 연결되는 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드(서열번호 159)를 포함한다. 성숙 Orencia® 융합 단백질은 두 개의 동일한 모노머성 Orencia® 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질 다이머인데, 각 모노머성 융합 단백질(서열번호 164)은 특이적 변이체 IgG1 폴리펩티드(서열번호 186)에 연결되는 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드(서열번호 159)를 포함한다. 성숙 LEA29Y-Ig 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 포함하는 LEA29Y-Ig 융합 단백질 다이머로서 용액에 존재하는데, 각 모노머성 LEA29Y-Ig 융합 단백질(서열번호 166)은 특이적 변이체 IgG1 폴리펩티드(서열번호 186)에 연결되는 특이적 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(서열번호 168)를 포함한다. Orencia® 다이머의 두 개의 융합 단백질 모노머가 각 hCTLA-4-변이체 IgG1 모노머의 위치 120에서의 시스테인 잔기 사이에 형성된 단일 이황화 결합에 의하여 함께 공유적으로 연결되어 있고, 두 개의 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드의 사이에 이황화 결합이 형성되지 않는다고 여겨진다.
일부 변이체 CTLA-4 융합 단백질은 CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86)에 결합한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 CD80-Ig 융합 단백질 및/또는 CD86-Ig 융합 단백질에 결합한다. 예시적인 CD80-Ig 융합 단백질은, 쥐(murine)의 Ig Fc 폴리펩티드에 연결되는 인간 CD80 ECD를 포함하는 hCD80-mIg 융합 단백질(서열번호 225); 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드에 연결되는 hCD80 ECD의 서열을 포함하는 hCD80-hIgG1 융합 단백질(서열번호 171)을 포함한다. 예시적인 CD86-Ig 융합 단백질은, 쥐(murine)의 Ig Fc 폴리펩티드에 연결되는 hCD86 ECD(서열번호 180)를 포함하는 hCD86-mIg 융합 단백질(서열번호 226); 및 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드(서열번호 185)에 연결되는 hCD86 ECD의 서열을 포함하는 성숙 hCD86-hIgG1 융합 단백질(서열번호 178)을 포함한다. hCD86-mIg 및 hCD80-mIg 융합 단백질을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열이 서열번호 227 및 228에 각각 나타나 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) Ig Fc 폴리펩티드(예, hIgG2 Fc)를 포함하는, 분리형 또는 재조합형 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86, 및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig 융합 단백질에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 보인다. Ig Fc 폴리펩티드는 서열번호 184, 185, 186 및 218의 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, (a)의 폴리펩티드의 C-말단은 (b)의 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결된다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 포유류 CD80 및/또는 CD86(예, hCD80 및/또는 hCD86), 및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig 융합 단백질에 결합한다. CD80-Ig는, 예컨대, Ig Fc에 연결된 인간 CD80 ECD(예, hCD80-Ig)를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, hCD80-Ig는 인간 Ig Fc에 연결되는 인간 CD80 ECD(hCD80-hIg)이며; 다른 양태에서, hCD80-Ig는 쥐의 Ig Fc에 연결되는 인간 CD80 ECD(hCD80-mIg)이다. 하나의 양태에서, hCD86-Ig는 인간 Ig Fc에 연결되는 인간 CD86 ECD(hCD86-hIg)이며; 다른 양태에서, hCD86-Ig는 쥐의 Ig Fc에 연결되는 인간 CD86 ECD(hCD86-mIg)이다. 일부 그러한 융합 단백질은, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서, 예컨대, T 세포 활성화, T 세포 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성 마커(예, CD25, IL-2 수용체) 또는 염증성 분자의 유도, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응(들)과 같은, 하나 이상의 다양한 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다. 그러한 융합 단백질은, 하기에 검토된 바와 같이, 면역계 질환 및 장애(예, 자가면역 질환)를 치료하는 방법 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용하게 이용되리라 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은, 각 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 내에 존재하는 두 개의 시스테인 잔기 사이에 형성된 적어도 하나의 이황화 결합을 통하여 연결된 두 개의 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머를 제공한다. 각 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 모노머는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 및 (b) Ig Fc 폴리펩티드(예, hIgG2 Fc), 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86, 및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 일부 경우에, (a)의 폴리펩티드의 C-말단은 (b)의 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결되거나 융합된다. Ig Fc 폴리펩티드는 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 융합 단백질 다이머는 각 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 120에서 또는 서열번호 159에 나타낸 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열에 관한 각 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열 내의 위치 120에 대응되는 아미노산 위치에서 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합에 의하여 형성된다. 일부 그러한 융합 단백질 다이머는, 예를 들어 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서 T 세포 활성화, T 세포 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체) 또는 염증성 분자의 유도, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응(들)과 같은, 하나 이상의 다양한 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다. 그러한 융합 단백질 다이머는, 하기에 검토되는 바와 같이, 면역계 질환 및 장애(예, 자가면역 질환)를 치료하는 방법, 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용하게 이용할 것으로 예상된다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 모노머는, hCD86 또는 hCD86 ECD에 대한 hCTLA-4 ECD 및 LEA29 각각의 결합 친화도와 적어도 동등하거나 그보다 큰, hCD86 또는 hCD86 ECD에 대한 결합 친화도를 가진다. 예컨대, 실시예 4의 표 5를 참조. 일부 그러한 다이머성 및 모노머성 융합 단백질 내에 존재하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 hCTLA-4 ECD의 아미노산 길이에 거의 동등한 아미노산 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 약 110개 내지 138개, 112개 내지 136개, 114개 내지 134개, 116개 내지 132개, 118개 내지 130개, 119개 내지 129개, 120개 내지 128개, 121개 내지 127개, 122개 내지 126개, 또는 123개 내지 125개의 아미노산 잔기 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 124개의 아미노산 잔기의 서열을 포함한다. 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 예를 들어 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것들을, 포함하나 이에 한정되지 않으며, 여기에서 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86(또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는, hCD86 및/또는 hCD86-Ig에 대한 hCTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머, 및/또는 LEA29Y-Ig 다이머 각각의 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD86 및/또는 hCD86-Ig에 대한 결합 활성을 가진다. 일부 그러한 융합 단백질 다이머는, hCD86 및/또는 hCD86-mIg에 대한 Orencia® 다이머의 결합 활성보다 2-10 배(2x-10x), 5-10 배(5x-10x), 10-20 배(10x-20x), 20-40 배(20x-40x) 또는 40배 이상(>40x)으로 큰, hCD86 및/또는 hCD86-mIg에 대한 결합 활성을 가진다. 예컨대, 하기 표 3에서 본 발명의 예시적인 다이머성 융합 단백질을 참조. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 그러한 융합 단백질 다이머는, hCD80 및/또는 hCD80-Ig에 대한 hCTLA-4-Ig 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머, 및/또는 LEA29Y-Ig 다이머 각각의 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD80 및/또는 hCD80-Ig에 대한 결합 친화도를 가진다. 일부 그러한 융합 단백질 다이머는, hCD86 및/또는 hCD86-mIg에 대한 Orencia® 다이머의 결합 활성보다 0.5-2 배(0.5x-2x), 2-4 배(2x-4x) 또는 2배 이상(>2x)으로 큰, hCD80 및/또는 hCD80-mIg에 대한 결합 활성을 가진다. 예컨대, 하기 표 4에서 본 발명의 예시적인 다이머성 융합 단백질을 참조.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는, hCTLA-4-Ig 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머 및/또는 LEA29Y-Ig 다이머가 결합한 hCD86 및/또는 hCD86-Ig로부터, 각각 해리하는 속도보다 작은 속도로 결합한 hCD86 및/또는 hCD86-Ig로부터 해리한다. 일부 그러한 융합 단백질은, hCTLA-4-Ig 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머 및/또는 LEA29Y-Ig 다이머가 hCD86 및/또는 hCD86-Ig와 각각 결합하는 속도와 적어도 동등하거나 그보다 큰 속도로 hCD86 및/또는 hCD86-Ig와 결합하거나 그것에 결합한다. 일부 그러한 융합 단백질 다이머에 있어서, CD86(또는 CD86-Ig)과 본 발명의 융합 단백질 다이머 사이의 결합 반응에서의 평형 해리 상수(KD)는, CD86(또는 CD86-Ig)과 hCTLA-4-Ig 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머 및/또는 LEA29Y-Ig 다이머 사이의 결합 반응에서의 평형 해리 상수(KD)보다 작다. 예컨대, 표 3에서 본 발명의 예시적인 융합 단백질 다이머를 참조. 일부 그러한 융합 단백질 다이머에 있어서, CD80(또는 CD80-Ig)과 본 발명의 융합 단백질 다이머 사이의 결합 반응에서의 평형 해리 상수(KD)는, CD80(또는 CD80-Ig)과 hCTLA-4-Ig 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머 또는 LEA29Y-Ig 다이머 사이의 결합 반응에서의 평형 해리 상수(KD)와 거의 동등하거나 그보다 작다. 예컨대, 표 4에서 본 발명의 예시적인 융합 단백질 다이머를 참조.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는 면역 반응을 저해하거나 억제하는(예, T 세포 활성화 또는 증식을 저해하는, 사이토카인 생산을 저해하는 등) 능력을 가지는데, 이것은 hCTLA-4-Ig 다이머(예, hCTLA-4-IgG2 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머), Orencia® 다이머 및/또는 LEA29Y-Ig 다이머 각각의 상기 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력과 적어도 거의 동등하거나 그보다 크다. 예를 들어, 일부 그러한 융합 단백질 다이머는 시험관 내 분석에서 T 세포 활성화 또는 T 세포 증식을 저해할 수 있다. 예를 들어, 하기 제시된 실시예 4-9는, 대표적인 변이체 CTLA-4 ECD 펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 대표적인 융합 단백질 다이머의 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는 능력을 입증한다. 면역억제 치료가 필요한 대상체에 적어도 하나의 그러한 다이머를 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 투여하는 것과 같은 것을 통하여, 일부 그러한 다이머는 생체 내에서 대상체 내의 면역 반응을 저해하거나 억제할 수 있다. 일부 그러한 융합 단백질 다이머는, 예컨대, 면역억제가 바람직한 면역계 질환 또는 장애(예, 자가면역 질환)로 고통받는 대상체에서 면역 반응을 저해하거나 억제하는 예방적 및/또는 치료적 방법 및 수용자에 의한 공여자로부터의 조직, 세포 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 응용에서 유용한 것으로 예상된다.
일부 그러한 다이머는 CD80 및 CD86에 대한 상이한 상대적 결합 활성을 가지고 있기 때문에, CD28을 통하여 시그널링을 조절하거나 억제하는 능력이 다르다. 그러한 다이머는, 예컨대, 면역결핍 질환 및 장애(예, RA, MS, 건선(psoriasis) 등)와 같은, 면역계 질환 및 장애를 치료하는 치료적 및 예방적 방법을 포함하여, T 세포 반응의 차등된 조작(differential manipulation)이 바람직한 응용에서 유용하다. 상기-기술된 차등된(differential) CD80/CD86 결합 활성 및 면역저해 성질의 일부를 가지는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 예시적인 다이머성 융합 단백질이 실시예 4에 나타나 있다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는, 한 가지 이상 타입의 면역 반응을 억제하거나 저해하는 hCTLA-4 단백질 또는 hCTLA-4-Ig 다이머의 능력과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 예를 들어, 일부 그러한 다이머는 상기에서 및 하기에서 기술되는 것들과 같이, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 응용에서 T 세포 활성화 또는 증식을 억제하는 능력을 가지는데, 이것은 그러한 응용에서 T 세포 활성화 또는 증식을 저해하는 hCTLA-4 단백질 또는 hCTLA-4-Ig 다이머(예, Orencia®, hCTLA-4-IgG2 다이머 또는 hCTLA-4-IgG1 다이머)의 능력과 적어도 거의 동등하거나 그보다 크다. 추가적으로, 일부 그러한 다이머는 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, T 세포-의존성 항체 반응)을 저해하거나 억제하는 능력을 가지는데, 이것은 면역 반응을 저해하거나 억제하는 LEA29Y-Ig 다이머의 능력보다 더 크다. 예컨대, 실시예 4-9는, 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는 다이머성 hCTLA-4-IgG2, Orencia® 및 LEAY29-Ig의 능력에 대하여 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 대표적인 다이머성 융합 단백질의 능력을 비교한다. 예컨대, 하기 표 6-9를 참조. 일부 그러한 다이머는, hCD80 및/또는 hCD86(또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하는 능력 및 상기에 기술된 그리고 하기에 더 자세히 기술되는 것들(예, 적어도 하나의 그러한 다이머가 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 투여되는 생체 내 방법)과 같은, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 응용에서 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력 둘 다를 가진다. 일부 그러한 다이머는, hCD80 및/또는 hCD86(또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 대한 hCTLA-4 단백질, 다이머성 hCTLA-4-Ig(예, hCTLA-4-IgG2, Orencia®) 또는 다이머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰 hCD80 및/또는 hCD86(또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 대한 결합 활성, 및 hCTLA-4 단백질, 다이머성 hCTLA-4-Ig(예, hCTLA-4-IgG2, Orencia®) 또는 다이머성 LEA29Y-Ig의 면역 반응을 저해하는 능력과 적어도 동등하거나 그보다 큰, 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는, 아래에 더 자세히 검토되는 바와 같이, 예컨대, 면역계 질환, 장애 및 이상을 치료하는 예방적 및/또는 치료적 방법을 포함하는, 다양한 응용에서 유용한 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질(예, 두 개의 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)를 제공하는데, 여기에서 각 그러한 모노머성 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 상기 다이머는 CD80 및/또는 CD86(및/또는, 각각, hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg와 같은 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 상기에서 그리고 하기에서 더 기술되는 것들을 포함하여, 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222에 제시된 폴리펩티드 서열 각각은, C-말단에서 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합되는 성숙 변이체 CTLA-4 ECD이며, 각각의 그러한 서열은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질로 지칭될 수 있다. 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222 각각의 폴리펩티드 서열은, 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222의 각각이 C-말단에서 리신을 포함하는 것을 제외하고, 서열번호 205-214, 219 및 221과 동일하다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222 중 임의의 것의 아미노산 잔기 1-351을 포함하는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 모노머를 제공하는데, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86(및/또는 각각 hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg와 같은 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 상기에서 그리고 하기에서 더 기술되는 것들을 포함하는, 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머를 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222 중 임의의 것의 아미노산 잔기 1-351을 포함하는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 상기 융합 단백질 다이머 단백질은 CD80 및/또는 CD86(및/또는 각각 hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg와 같은 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 상기에서 그리고 하기에서 더 기술되는 것들을 포함하는, 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다.
또한, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 모노머성 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 제공되는데, 여기에서 상기 모노머성 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86(및/또는 각각 hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg와 같은 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 융합 단백질 모노머 및 다이머는, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서(예컨대, 면역억제 치료가 이로울 질환, 장애 또는 이상으로 고통받고, 하기에 더 자세히 검토되는 바와 같이 그러한 다이머성 융합 단백질을 치료적으로 유효한 양으로 투여받는 대상체 내의 생체 내에서), 예컨대 T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응(들)을 포함하는, 하나 이상의 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다. 그러한 융합 단백질 모노머 및 다이머는, 하기에 검토되는 것들을 포함하여, 면역계 질환을 치료하는 치료적 및/또는 예방적 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용하게 이용될 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)를 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 6개 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산 잔기 이하)로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드)이고, 여기서 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서의 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기는 상기 선택된 폴리펩티드 서열(예, 서열번호 1-73으로부터 선택된 폴리펩티드)의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일하며, 그리고 (2) Ig Fc 폴리펩티드(예, IgG2 Fc), 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 하기에 자세히 검토되는 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커 또는 염증성 분자의 유도, 항-콜라겐 Ab 생산, T 세포-의존성 Ab 반응 등)을 저해한다. 본 발명은 또한 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고 및/또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 유도하는, 상기에서 기술된 분리형 또는 재조합형 모노머성 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질 다이머에서, 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 변이체 CTLA-4-Ig 모노머)은 선택적으로 각 모노머 내의 시스테인 잔기를 통하여 하나 이상의 이황화 결합에 의하여 공유적으로 함께 연결되어 있으며, 두 개의 모노머는 일반적으로 서로 동일하다. 일부 경우에, 그러한 융합 단백질 다이머 또는 모노머 내의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 선택된 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73으로부터 선택됨)과 6개 아미노산 잔기 이하로 상이하나, 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85를 차지하는 아미노산은 선택된 폴리펩티드 서열 내의 그 위치에 포함된 아미노산 잔기와 동일한다; 즉, 그러한 위치에서의 아미노산 잔기는 결실되거나 치환될 수 없다. 그러한 융합 단백질 내의 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 선택된 폴리펩티드 서열과 6개 아미노산 잔기 이하만큼 상이하고 선택된 폴리펩티드 서열 내의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한 위치 24, 30, 32, 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 및 106에서의 아미노산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함한다. 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 아미노산 결실(들), 추가(들), 및/또는 아미노산 치환(들)에 의하여, 선택된 폴리펩티드 서열과 상이할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 예컨대, “서열 변형” 섹션을 참조. 일부 그러한 다이머성 융합 단백질은, hCD86 또는 hCD86-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig, 다이머성 LEA29Y-Ig 또는 Orencia® 단백질 각각의 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD86 또는 hCD86-Ig에 대한 결합 활성을 가진다. 일부 그러한 모노머성 융합 단백질은, hCD86, hCD86-Ig 또는 hCD86 ECD에 대한 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig, 또는 모노머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD86, hCD86-Ig 또는 hCD86 ECD에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 그러한 다이머성 융합 단백질은, hCD80에 대한 hCTLA-4 또는 hCTLA-4-Ig 각각의 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD80 또는 hCD80-Ig에 대한 결합 활성을 가진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 그러한 모노머성 융합 단백질은, hCD80, hCD80-Ig 또는 hCD80 ECD에 대한 모노머성 hCTLA-4 또는 모노머성 hCTLA-4-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성과 적어도 거의 동등하거나 그보다 큰, hCD80, hCD80-Ig 또는 hCD80 ECD에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다. 일부 경우에, 그러한 융합 단백질 다이머 또는 모노머 내의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 예컨대, 약 118개-130개, 119개-129개, 120개-128개, 121개-127개, 122개-126개, 123개-125개 또는 124개의 아미노산 잔기 길이부터, hCTLA-4 ECD의 아미노산 길이와 거의 동등한 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. Ig Fc 폴리펩티드(예, IgG2 Fc, IgG1 Fc, IgG4 Fc 또는 효과기(effector) 기능 또는 Fc 수용체 결합을 감소시키는 변이체 IgG Fc)의 N-말단은 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단으로 공유적으로 연결되거나 직접적으로 또는 간접적으로(예, 1개 내지 10개 아미노산 잔기를 포함하는 링커를 통하여) 융합될 수 있다. Ig Fc 폴리펩티드는, 서열번호 184-186 내지 218, 예컨대 서열번호 184, 185, 186 및 218의 임의의 것으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머 및 모노머는, 예컨대 T 세포 활성화, T 세포 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체) 또는 염증성 분자의 유도, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응(들)을 포함하는, 하나 이상의 다양한 면역 반응을 억제할 수 있다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig 또는 다이머성 LEA29Y-Ig보다 하나 이상의 그러한 면역 반응을 저해하는 능력이 더 크다. 예컨대, 실시예 4-9는, 시험관 내에서 T 세포 증식을 저해하는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 대표적인 다이머성 융합 단백질의 능력을, 그렇게 하는 다이머성 hCTLA-4-Ig 또는 다이머성 LEA29Y-Ig의 능력과 비교하는 데이터를 제공한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 모노머는 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 또는 모노머성 LEA29Y-Ig보다 하나 이상의 그러한 면역 반응을 저해하는 능력이 더 크다. 일부 그러한 모노머 및 다이머는 면역억제 치료를 필요로 하는 대상체에 적어도 하나의 그러한 폴리펩티드를 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 통하여와 같이, 생체 내에서 대상체 내의 면역 반응을 저해하거나 억제할 수 있다. 그러한 융합 단백질은, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 예방적 및/또는 치료적 방법 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법과 같이, 면역억제 치료가 유용한 질환, 장애 또는 이상을 치료하는 방법을 포함하는 다양한 응용에서 유용하게 이용될 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 두 개의 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)를 제공하는데, 여기에서 각각 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고, (b) 서열번호 159의 폴리펩티드 서열에 관한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 세포외 도메인(ECD) 폴리펩티드; 및 (2) Ig Fc 폴리펩티드, 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 하기에 더 자세히 기술되는 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커의 유도, 염증, 항-콜라겐 항체 생산, T 세포-의존성 항체 반응 등)을 저해한다. 본 발명은 또한, 상기 기술된 바와 같이, CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고 및/또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 유도하는, 분리형 또는 재조합형 모노머성 융합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, CD80은 hCD80이고 CD86은 hCD86이다. 융합 단백질 다이머에서, 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 변이체 CTLA-4-Ig 모노머)은 선택적으로 각 모노머 내의 시스테인 잔기를 통한 하나 이상의 이황화 결합에 의하여 공유적으로 함께 연결되며, 두 개의 모노머는 일반적으로 서로 동일하다. Ig Fc 폴리펩티드(예, IgG2 Fc, IgG1 Fc, IgG4 Fc 또는 효과기 기능 또는 Fc 수용체 결합을 감소시키는 변이체 IgG Fc)의 N-말단은, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단에 공유적으로 연결되거나 직접적으로 또는 간접적으로(예, 1개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 링커를 통하여) 융합될 수 있다. Ig Fc 폴리펩티드는 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 그러한 융합 단백질 다이머 또는 모노머는, hCTLA-4 ECD의 아미노산 길이, 예컨대, 118개-130개, 119개-129개, 120개-128개, 121개-127개, 122개-126개 또는 123개-125개 아미노산 잔기 길이와 거의 동등한 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 융합 단백질 다이머 또는 모노머 내의 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 124개의 아미노산 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드는, 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 85로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 제시된 서열에 관한 위치에서 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산 치환을 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 159에 관한 위치 104 및/또는 30에 대응하는 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 위치 70(선택적으로 S70F), 위치 64(선택적으로 S64P), 위치 50(선택적으로 A50M), 위치 54(선택적으로 M54K/V, 예컨대, M54K), 위치 65(선택적으로 I65S), 위치 56(선택적으로 N56D), 위치 55(선택적으로 G55E), 위치 85(선택적으로 M85A) 및/또는 위치 24(선택적으로 A24E/S, 예컨대, A24E)에서 서열번호 159에 관한 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 위치 104(선택적으로 L104E/D, 예컨대, L104E), 위치 30(선택적으로 T30N/D/A, 예컨대, T30N, T30D 또는 T30A), 및/또는 위치 32(선택적으로 V32I)에서 서열번호 159에 관한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 치환을 포함한다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는, CD86 또는 다이머성 CD86-Ig에 대한 hCTLA-4 단백질, 다이머성 hCTLA-4-Ig(예, CTLA-4-IgG1 또는 CTLA-4-IgG2), Orencia® 단백질 또는 다이머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 다이머성 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 활성을 각각 나타낸다. 일부 그러한 다이머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig, Orencia® 단백질 및/또는 다이머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 다이머성 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 활성을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 모노머는, CD86 또는 CD86-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 또는 모노머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 나타낸다. 일부 그러한 모노머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4 또는 모노머성 hCTLA-4-Ig(예, 모노머성 CTLA-4-IgG1 또는 CTLA-4-IgG2) 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서(예, 면역억제 치료가 이로울 질환, 장애 또는 이상으로 고통받고 적어도 하나의 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머가 치료적으로 유효한 양으로 투여되는 대상체 내의 생체 내에서), 상기에서 및 본 명세서 전체에 걸쳐 기술된 것들(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커의 유도, 염증, 항-콜라겐 항체 생산, T 세포-의존성 항체 반응)을 포함하는, 하나 이상의 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는, hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig(예, 다이머성 CTLA-4-IgG1 또는 CTLA-4-IgG2), Orencia® 단백질 및/또는 다이머성 LEAY29-Ig보다 더 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 저해한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 모노머는, 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 및/또는 모노머성 LEAY29-Ig보다 더 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 저해한다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 유용하게 이용될 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)를 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 임의의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지며, (ii) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 상기 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서의 페닐알라닌 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 세포외 도메인); 및 (2) Ig Fc 폴리펩티드(예, IgG2 Fc, IgG1 Fc, IgG4 Fc, 또는 효과기 기능 또는 Fc 수용체 결합을 감소시키는 변이체 IgG Fc), 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86)(및/또는 CD80-Ig, 예, hCD80-Ig, 및/또는 CD86-Ig, 예, hCD86-Ig)에 결합하며, 및/또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 본 발명은 또한 CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86)(및/또는 CD80-Ig, 예, hCD80-Ig, 및/또는 CD86-Ig, 예, hCD86-Ig)에 결합하며, 및/또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 유도하는, 상기에서 기술된 분리형 또는 재조합형 모노머성 융합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, Ig Fc 폴리펩티드는, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다. Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단은 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단에 공유적으로 연결되거나 직접적으로 또는 간접적으로(예, 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 링커를 통하여) 융합될 수 있다.
일부 그러한 변이체 CTL-4-Ig 다이머 또는 모노머에서, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 상기 선택된 폴리펩티드 서열에 관한 다음의 것들을 하나 이상 포함한다: 위치 24에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산 잔기; 위치 30 에 대응하는 아미노산 위치에서 아스파라긴 잔기; 위치 32 에 대응하는 아미노산 위치에서 이소류신 잔기; 위치 50 에 대응하는 아미노산 위치에서 메티오닌 잔기; 위치 54 에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 잔기; 위치 55 에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산 잔기; 위치 56 에 대응하는 아미노산 위치에서 아스파르트산 잔기; 위치 64 에 대응하는 아미노산 위치에서 프롤린 잔기; 위치 65 에 대응하는 아미노산 위치에서 세린 잔기; 및 위치 104 에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산 잔기. 예를 들어, 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 또는 모노머 내의 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, (i) 서열번호 24의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지며, (ii) 서열번호 24의 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 여기에서 융합 단백질 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86(및/또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하며, 및/또는 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서 면역 반응을 저해한다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 또는 모노머 내의 일부 그러한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 24에 관한 다음의 것들을 하나 이상 포함한다: 위치 24에서 글루탐산 잔기; 위치 30에서 아스파라긴 잔기; 위치 32에서 이소류신 잔기; 위치 50에서 메티오닌 잔기; 위치 54에서 리신 잔기; 위치 55에서 글루탐산 잔기; 위치 56에서 아스파르트산 잔기; 위치 64에서 프롤린 잔기; 위치 65에서 세린 잔기; 및 위치 104에서 글루탐산 잔기.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는, CD86 또는 다이머성 CD86-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig, Orencia® 단백질 또는 다이머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 다이머성 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 활성을 나타낸다. 일부 그러한 다이머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig 또는 Orencia® 단백질 각각의 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 다이머성 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 활성을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 모노머는, CD86 또는 CD86-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig, 및/또는 모노머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 나타낸다. 일부 그러한 모노머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4 또는 모노머성 hCTLA-4-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서(예, 면역억제 치료가 유용할 면역계 질환, 장애 또는 이상으로 고통받고 적어도 하나의 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머가 치료적으로 유효한 양으로 투여되는 대상체 내의 생체 내에서), 하나 이상의 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커의 유도, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, T 세포-의존성 Ab 반응)을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는, hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig(예, 다이머성 CTLA-4-IgG1 또는 CTLA-4-IgG2), Orencia® 단백질 및/또는 다이머성 LEAY29-Ig보다 더 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 모노머는, 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 및/또는 모노머성 LEAY29-Ig보다 더 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 예컨대, 자가면역 질환을 치료하는 방법 및 장기, 세포 또는 조직 이식편 이식의 거부를 저해하는 방법을 포함하여, 면역억제 치료가 이로울 질환 또는 장애를 치료하는 다양한 치료적 및/또는 예방적 방법에 유익하게 이용될 것으로 예상된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)를 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, (b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 세포외 도메인), 여기에서 상기 적어도 아미노산 치환은 S70F를 포함하며, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨지며; 및 (2) IgG Fc 폴리펩티드(예, IgG2 Fc, IgG1 Fc, IgG4 Fc 또는 효과기 기능 또는 Fc 수용체 결합을 감소시키는 변이체 IgG Fc), 여기에서 상기 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86(및/또는 hCD86-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하고, 및/또는, 하기에 자세히 검토되는 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커의 유도, 염증, 항-콜라겐 항체 생산, T 세포-의존성 항체 반응 등)을 저해한다. 본 발명은 또한 CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86) (및/또는 CD80-Ig, 예, hDC80-Ig, 및/또는 CD86-Ig, 예, hCD86-Ig)에 결합하고 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 유도하는, 상기에서 기술된 분리형 또는 재조합형 모노머성 융합 단백질을 포함한다. Ig Fc 폴리펩티드는, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단은 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단으로 공유적으로 연결되거나 직접적으로 또는 간접적으로(예컨대, 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 링커를 통하여) 융합될 수 있다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 또는 모노머에서, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, A24E, T30N, V32I, D41G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E 및 I106F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 또는 모노머에서, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 치환 L104E 및/또는 다음의 치환의 그룹으로부터 선택된 두 개, 세 개 또는 네 개의 추가적인 치환을 추가로 포함한다: T30N, V32I, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P 및 I65S.
일부 그러한 다이머는, CD86 또는 다이머성 CD86-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig 및/또는 Orencia® 단백질 각각의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 다이머성 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 활성을 가진다. 일부 그러한 다이머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig 및/또는 Orencia® 각각의 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 다이머성 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 활성을 가진다. 일부 그러한 모노머는, CD86 또는 CD86-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 또는 모노머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 나타낸다. 일부 그러한 모노머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4 또는 모노머성 hCTLA-4-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 시험관 내 및/또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서(예, 면역억제 치료가 이로울 면역계 질환, 장애 또는 이상으로 고통받고 적어도 하나의 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머가 치료적으로 유효한 양으로 투여되는 대상체 내의 생체 내에서), 하나 이상의 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커의 유도, 염증, 항-콜라겐 항체 생산, T 세포-의존성 항체 반응)을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 다이머는, hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig(예, 다이머성 CTLA-4-IgG1 또는 CTLA-4-IgG2), Orencia® 단백질 및/또는 다이머성 LEAY29-Ig보다 더 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 모노머는, 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 및/또는 모노머성 LEAY29-Ig보다 더 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 예컨대, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법 및 장기 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법을 포함하여, 면역억제 치료가 이로울 질환 또는 장애를 치료하는 다양한 치료적 및/또는 예방적 방법에 유익하게 이용될 것으로 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)를 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 31의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, 및 (b) 다음 것들 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 세포외 도메인): 서열번호 31의 위치 50에 대응하는 위치에서 메티오닌 잔기, 서열번호 31의 위치 54에 대응하는 위치에서 리신 잔기, 서열번호 31의 위치 55에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 서열번호 31의 위치 64에 대응하는 위치에서 프롤린 잔기, 서열번호 31의 위치 65에 대응하는 위치에서 세린 잔기, 서열번호 31의 위치 70에 대응하는 위치에서 페닐알라닌 잔기, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 31에 따라 번호가 매겨지며; 및 (2) Ig Fc 폴리펩티드, 여기에서 상기 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86(및/또는 hCD86-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하고, 및/또는, 면역 반응을 저해한다. 본 발명은 또한, CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86)(및/또는 CD80-Ig, 예, hDC80-Ig, 및/또는 CD86-Ig, 예, hCD86-Ig)에 결합하고 및/또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 유도하는, 상기에서 기술된 분리형 또는 재조합형 모노머성 융합 단백질을 포함한다. Ig Fc 폴리펩티드는, IgG2 Fc, IgG1 Fc, IgG4 Fc, 또는 효과기 기능 또는 Fc 수용체 결합을 감소시키는 변이체 IgG Fc를 포함할 수 있다. Ig Fc 폴리펩티드는 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단은 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 C-말단으로 공유적으로 연결되거나 직접적으로 또는 간접적으로(예컨대, 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 링커를 통하여) 융합될 수 있다. 일부 그러한 다이머 또는 모노머에서, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는, 서열번호 31의 위치 104에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 위치 30에 대응하는 위치에서 아스파라긴산 잔기, 및/또는 위치 32에 대응하는 위치에서 이소류신 잔기를 포함한다.
일부 그러한 다이머는, CD86 또는 다이머성 CD86-Ig에 대한 hCTLA-4 단백질, 다이머성 hCTLA-4-Ig, Orencia® 단백질 및/또는 다이머성 LEAY29-Ig 각각의 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 다이머성 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 활성을 가진다. 일부 그러한 다이머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig 및/또는 Orencia® 단백질 각각의 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 다이머성 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 활성을 가진다. 일부 그러한 모노머는, CD86 또는 CD86-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4, 모노머성 hCTLA-4-Ig 또는 모노머성 LEA29Y-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성과 거의 동등하거나 그보다 큰, CD86(예, hCD86) 또는 CD86-Ig(예, hCD86-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 나타낸다. 일부 그러한 모노머는, CD80 또는 다이머성 CD80-Ig에 대한 모노머성 hCTLA-4 또는 모노머성 hCTLA-4-Ig 각각의 결합 친화도 또는 결합 활성보다 큰, CD80(예, hCD80) 또는 CD80-Ig(예, hCD80-Ig)에 대한 결합 친화도 또는 결합 활성을 가진다.
일부 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는, 하기에 검토되는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 하나 이상의 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 생산, 활성화 마커의 유도, 염증, 항-콜라겐 항체 생산, T 세포-의존성 항체 반응)을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 일부 그러한 다이머는 hCTLA-4, 다이머성 hCTLA-4-Ig, Orencia® 단백질 및/또는 다이머성 LEAY29-Ig보다 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다. 일부 그러한 모노머는 모노머성 hCTLA-4 또는 모노머성 hCTLA-4-Ig보다 큰 정도로 하나 이상의 그러한 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 다이머 및 모노머는 면역억제 치료가 이로울 면역계 질환 또는 장애를 치료하는 다양한 치료적 및/또는 예방적 방법(예, 자가면역 질환 및 장애 및 장기 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 방법)에 유용하게 이용될 것으로 예상된다.
상기에 기술되는 임의의 그러한 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머 또는 모노머는, 숙주 세포로부터 융합 단백질의 분비를 용이하게 하는 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 펩티드는 선택적으로 신호 펩티드이다. 신호 펩티드의 C-말단은 일반적으로 융합 단백질의 N-말단으로 공유적으로 연결된다. 신호 펩티드는 서열번호 182 또는 서열번호 216의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열번호 160의 아미노산 잔기 1-35, 1-36 또는 1-37을 포함하는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 하기에 검토된 바와 같이, 상기 기술되는 임의의 그러한 모노머성 또는 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 글리코실화 또는 페길화되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 352개의 아미노산 길이를 가지고 있으며, 124개의 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 및 228개의 아미노산 잔기를 포함하는 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드를 포함하는, 성숙/분비 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질을 제공한다. 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 1-73 중 임의의 것에 의하여 확인되는 서열을 포함하는 그런 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222 중 임의의 것에 의하여 확인되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 원한다면, 성숙 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질의 아미노산은 변이체 CTLA-4-IgG2의 첫 번째 아미노산 잔기(즉, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 첫 번째 잔기)로 시작하여 번호가 매겨진다. 일부 양태에서, 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질(또는 변이체 CTLA-4 ECD)의 첫 번째 잔기는 메티오닌이며, 따라서 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질(또는 변이체 CTLA-4 ECD)의 아미노산의 번호매김은 메티오닌(아미노산 잔기 1로 지정됨)으로 시작할 것이다.
본 발명은 또한 상기에서 기술되는 둘 이상의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 분리형 또는 재조합형 멀티머성 융합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 멀티머는, 동일한 융합 단백질(즉, 호모다이머) 또는 상이한 융합 단백질(즉, 헤테로다이머)일 수 있는, 두 개의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질 다이머이다. 일부 경우에, 멀티머는 테트라머성 융합 단백질로서, 이는 본 발명의 4개의 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드를 포함한다. 테트라머는, 본 발명의 4개의 동일한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(즉, 호모테트라머), 또는 4개 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 모두가 동일하지 않은 본 발명의 4개의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 임의의 조합(즉, 헤테로테트라머)을 포함할 수 있다. 일부 그러한 멀티머는 CD80 및/CD86(및/또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하며 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해한다.
본 발명은 상기에서 기술된 폴리펩티드, 융합 단백질 및 멀티머 중 임의의 것의 가용성 형태를 포함한다. 또한 하기에서 기술되는 본 발명의 접합체에 대한 가용성 형태가 포함된다. 본 발명의 가용성 분자- 예컨대, 본 발명의 가용성 폴리펩티드, 다이머성 융합 단백질, 모노머성 융합 단백질, 멀티머 및 접합체 -는 세포에 연결되거나 합쳐지거나 결합되지 않는다. 일부 그러한 가용성 분자는 용액에 있을 수 있거나 예컨대, 유체에서(예, 대상체의 몸에서) 순환할 수 있다. 신호 펩티드는 일반적으로 그러한 분자의 분비를 용이하게 하는데 사용될 수 있으나, 신호 펩티드는 숙주 세포로부터의 분자의 분비 중에 절단된다. 따라서, 대부분의 경우에, 가용성 폴리펩티드, 다이머성 융합 단백질, 모노머성 융합 단백질 또는 멀티머와 같은, 가용성 분자는 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 상기에서 검토된 바와 같이, 본 발명의 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드는, 가용성 융합 단백질이 되는, 예컨대 Ig Fc 폴리펩티드와 같은, Ig 폴리펩티드의 일부분을 포함하는, Ig 분자에 연결될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은, 예컨대, 야생형 Ig Fc(예, 인간 IgG2 Fc) 또는 변이체 Ig Fc 폴리펩티드와 같은, Ig 폴리펩티드의 적어도 일 부분에 융합되거나 연결되는 본 명세서에서 기술되는 본 발명의 임의의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함한다. 그러한 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은, 모노머성 또는 다이머성 융합 단백질일 수 있으며, 하기 실시예를 포함하여, 상기에서 또는 다른 부분에서 자세히 기술되는 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 모노머 및 다이머를 포함한다. 본 명세서의 상기에서 그리고 다른 부분에서 자세히 기술되는 바와 같이, 일부 그러한 가용성 모노머성 및 다이머성 융합 단백질은, CD80 및/또는 CD86에 결합하는 능력 및/또는 시험관 내 및/또는 생체 내 응용에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식)을 억제하거나 저해하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 그러한 가용성 분자는, 예컨대 면역계 질환 및 장애(예, 자가면역 질환)를 치료하는 치료적 및 예방적 방법 및 세포, 장기 또는 조직 이식편 이식을 저해하는 예방적 및 치료적 방법을 포함하여, 다양한 응용에서 특히 이로울 것으로 예상된다. CD80 및/또는 CD86에 결합하는, 본 발명의 가용성 분자- 예, 가용성 재조합형 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 모노머성 및 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질, 변이체 CTLA-4 ECD 접합체, 변이체 CTLA-4-Ig 접합체, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig를 포함하는 멀티머, 본 발명의 변이체 CTLA-4 접합체 또는 변이체 CTLA-4-Ig 접합체를 포함하는 멀티머 -는, 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 대상체에 투여될 때, 내인성 CD80 및/또는 CD86과 내인성 CD28 사이의 상호작용을 저해하며, 따라서 대상체 내에서 대상체의 건강한 신체 조직, 장기 및/또는 세포에 대한 면역계 반응 또는 면역계 공격을 억제한다. 대상체가 공여자로부터의 건강한 신체 조직, 장기 및/또는 세포의 수용자인 경우에(예, 대상체 수용자가 공여자 조직 이식편 또는 세포 또는 장기 이식을 받은 경우와 같이), 그러한 가용성 분자는 내인성 CD80 및/또는 CD86과 내인성 CD28 사이의 상호작용을 저해하며, 따라서 공여자에 의하여 대상체에 공여된 건강한 신체 조직, 장기, 또는 세포에 대한 대상체의 면역계에 의하여 유해한 반응 또는 공격을 저해한다. 건강한 신체 조직에 대한 면역계 반응 또는 공격을 억제함으로써, 대상체 내의 건강한 조직, 장기 또는 세포에 대한 그러한 면역계 반응 또는 공격과 관련된 부작용(예, 통증, 관절 염증, 등)을 감소될 수 있으며, 그러한 반응 또는 공격으로 인한 손상은 지연되거나 차단될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 다이머성 및 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 및 멀티머를 포함하여, 상기에 기술된 본 발명의 폴리펩티드의 결합 친화도 및 활성을 측정하는 방법은, 당해 분야에서의 통상의 기술자들에서 알려져 있으며, 예컨대, BiacoreTM 기술(GE Healthcare), 등온 적정 미세열량측정계(isothermal titration microcalorimetry)(MicroCal LLC, Northampton, MA), ELISA, 결합 친화도 파지 디스플레이 방법(binding affinity phage display method) 및 FACS 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. Biacore 방법은 하기 실시예 4에 자세히 기술되어 있다. FACS 또는 다른 분류 방법은 상기에서 그리고 본 명세서의 다른 부분에서 더 자세히 기술되어 있다. 파지 ELISA에 의하여 hCD80 및/또는 hCD86에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하는 방법은 하기 실시예 2에 기술되어 있다.
본 발명의 분자(예컨대, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 다이머성 및 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질, 및 멀티머를 포함함)에 의하여 유도되는 T 세포 반응을 검출하고 측정하는 방법은 당해 분야의 기술자들에서 잘 알려져 있다. T 세포 활성화는 보통, 예컨대, T 세포-관련 사이토카인 합성(예, IFN-γ 생산) 및 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도를 포함하는 생리적 사건에 의하여 특징지어진다. CD4+ T 세포는 MHC 클래스 II 분자의 맥락 속에서 그것들의 면역성 펩티드를 인식하며, 반면에 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I 분자의 맥락 속에서 그것들의 면역성 펩티드를 인식한다. T 세포 활성화 및/또는 T 세포 증식을 저해하거나 억제하는 또는 CD86 및/또는 CD80을 통하여 시그널링을 차단하는 상기에 기술된 본 발명의 분자의 능력을, 평가하고 측정하는 예시적인 방법은 본 명세서의 실시예 5-8 및 다른 부분에 기술되어 있다.
상기에서 검토된 것들을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드, 모노머성 및 다이머성 융합 단백질 및 멀티머는, 선택적으로, N-말단 및/또는 정제 또는 확인(identification)을 위한 펩티드 태그(tag)에 첨가된, 메티오닌과 같은, 부가적인 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 검토된 것들을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드는, 선택적으로, 예컨대 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열 및 GST 융합으로부터 선택된 서열과 같은, 폴리펩티드 정제 부분서열을 추가로 포함한다.
덧붙여, 하기에서 더 자세히 검토되는 바와 같이, 본 발명은, 상기에서 그리고 하기에서 추가적으로 자세히 기술되는 본 발명의 모든 폴리펩티드, 융합 단백질 및 멀티머를 인코딩하는 분리형, 재조합형 또는 합성 핵산을 포함한다.
서열 동일성
상기에서 검토된 바와 같이, 하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 또는 CD86 또는 둘 중 하나의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다. 다른 양태에서, 하기에 자세히 기술되는 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 그의 ECD에 결합하는 능력을 가지며, 및/또는 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다.
서열(폴리펩티드 또는 핵산)이 다른 것에 유사한 정도(degree)는, 두 개의 서열에서의 유사한 구조적 및 기능적 성질을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 임의의 주어진 예시적인 서열에 대하여 유사한 서열을 가지는 서열은 본 발명의 특징이다. 하기에서 정의되는 퍼센트 서열 동일성을 가지는 서열은 본 발명의 특징이다. 수작업 정렬(manual alignment) 및 컴퓨터 보조 서열 정렬 및 분석을 포함하여, 서열 관계를 결정하는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 서열 정렬을 실시하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램은 이용가능하거나, 기술자에 의하여 만들어질 수 있다.
상기에서 주지된 바와 같이, 대상 발명에 채용되는 핵산 및 폴리펩티드의 서열은 본 발명의 핵산이나 본 발명의 폴리펩티드의 대응 서열에 각각 동일할 필요가 없거나, 실질적으로 동일할 수 없다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는, 보존적이거나 비보존적인, 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환과 같은, 다양한 변화를 겪을 수 있는데, 이는, 예컨대 그러한 변화가 그것들의 치료적 또는 예방적 이용 또는 투여 또는 진단 응용에서와 같이, 그것들의 이용에 소정의 이익을 제공할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한 하나 이상의 코돈에서 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 치환과 같은, 다양한 변화를 겪어서, 특정 코돈이 동일한 또는 상이한 아미노산을 인코딩하여 잠재적 변형(silent variation)(예, 핵산 서열 내의 변이는, 예컨대, 인코딩된 아미노산이 핵산 변이에 의하여 변경되지 않을 때, 아미노산 서열에서의 잠재적 변이를 일으킴) 또는 비-잠재적 변형, 서열 내에서의 하나 이상의 핵산(또는 코돈)의 하나 이상의 결실, 서열 내에서 하나 이상의 핵산(또는 코돈)의 하나 이상의 추가 또는 삽입, 서열 내에서 하나 이상의 핵산(또는 코돈)의 하나 이상의 트렁케이션(truncation)의 절단을 만든다. 또한, 핵산은, 원한다면, 상기 하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산(들)을 여전히 인코딩하는 동안에, 발현 시스템(예, 박테리아 또는 포유류) 내의 최적 발현을 위하여 제공하는 하나 이상의 코돈을 포함하도록 변형된다. 그러한 핵산 변화는 그것들의 치료적 또는 예방적 이용 또는 투여, 또는 진단 응용에 있어서 소정의 이점을 제공할 수 있다. 핵산 및 폴리펩티드는, 그것들이 본 발명의 각각의 핵산 또는 폴리펩티드 내에서 서열에 대하여 실질적으로 동일한(하기에서 설명됨) 서열을 포함하는 한, 많은 수의 방법으로 변형될 수 있다.
두 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 “동일한” 또는 “동일성”은, 하기에 기술되는 서열 비교 알고리즘을 이용하여 또는 시각적 검사(visual inspection)에 의하여 결정되는 바와 같이, 최대 유사성으로 비교되고 정렬될 때, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산의 특정 퍼센트를 가지는 둘 이상의 서열을 지칭한다. 참조(즉, 질의) 서열에 대한 대상체 서열의 “퍼센트 서열 동일성”(“% 동일성”)은, 비교 길이에 대하여 대상체 서열이 질의 서열에 대하여 특정 퍼센트만큼 동일하다(즉, 폴리펩티드 서열에서 아미노산-대-아미노산 기준, 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기준)는 것을 의미한다.
질의 서열에 대한 대상체 서열의 퍼센트 서열 동일성(“% 서열 동일성” 또는 “% 동일성”)은 다음과 같이 계산될 수 있다. 우선, 두 개의 서열의 최적 정렬은 특정 정렬 파라미터를 가지는 서열 비교 알고리즘을 이용하여 결정된다. 최적 정렬의 이러한 결정은 컴퓨터을 이용하여 실시하거나, 하기에 기술되는 바와 같이, 수작업으로 계산될 수 있다. 이어서, 비교 길이에 관하여 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 잔기가 두 서열 내에 일어나는 최적 정렬에서의 위치의 수를 결정하는데, 이것은 일치된(matched) 위치의 수를 제공한다. 이어서 일치된 위치의 수를(달리 특정되지 않으면, 질의 서열의 길이인) 비교 길이의 위치의 총 수로 나누고, 이어서 그 결과에 100을 곱하여, 질의 서열에 대한 대상체 서열의 퍼센트 서열 동일성을 산출한다.
폴리펩티드 서열에 관하여, 일반적으로 하나의 서열은, 하나 이상의 다른 서열, 즉, “대상체 서열(들)”(예를 들어, 서열 데이터베이스 내에 존재하는 서열)이 비교되는 “질의 서열”(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 서열)로서 간주된다. 서열 비교 알고리즘은 지정된 정렬 파라미터를 이용하여 질의 서열과 대상체 서열(들) 사이에 최적 정렬을 결정한다. 질의 서열을, 예컨대, GENBANK® 데이터베이스(유전자 서열 데이터 뱅크; 미국 보건복지부(U.S. Department of Health and Human Services)) 또는 GENESEQ® 데이터베이스(Thomson Derwent; 또한 STN 상에서 DGENE® 데이터베이스로서 이용가능)와 같은, 서열 데이터베이스에 대하여 비교할 때, 항상 질의 서열과 정렬 파라미터만이 컴퓨터에 입력되고; 질의 서열과 각각의 대상체 서열 사이의 최적 정렬은 대상체 서열의 특정 개수까지 되돌려진다.
1. 최적 정렬의 결정
두 개의 폴리펩티드 서열은 그 서열 쌍에서의 가능한 최고 유사 점수(highest similarity score)에 도달하도록, 그것들이, 정의된 파라미터, 즉 정의된 아미노산 치환 매트릭스, 갭 존재 벌점(gap existence penalty)(갭 오픈 벌점(gap open penalty)이라고도 지칭됨) 및 갭 확장 벌점(gap extension penalty)을 이용하여 정렬될 때, “최적으로 정렬”된다. BLOSUM62 매트릭스(Henikoff와 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915-10919)는 종종 (하기에 기술되는 BLASTP와 같은) 폴리펩티드 서열 정렬 알고리즘에서 디폴트 득점 치환 매트릭스(default scoring substitution matrix)로 이용된다. 갭 존재 벌점은 정렬된 서열 중의 하나 내의 단일 아미노산 갭의 유도에 부과되며, 갭 확장 벌점은 갭에서 각 잔기 위치에 부과된다. 달리 언급하지 않으면, 본 명세서에 사용되는 정렬 파라미터는 다음과 같다: BLOSUM62 득점 매트릭스, 갭 존재 벌점 = 11, 및 갭 확장 벌점 = 1. 정렬 점수는, 최고 가능 유사성 점수에 도달하도록 정렬이 시작하고 끝나는 각 서열의 아미노산 위치(예, 정렬 윈도우(alignment window))에 의하여 그리고 선택적으로 하나 또는 둘 다의 서열에 갭 또는 다중 갭(multiple gap)의 삽입에 의하여 정의된다.
둘 이상의 서열 사이의 최적 정렬은 (하기에 기술되는 바와 같이) 수작업으로 결정될 수 있지만, 그 과정은, BLAST®(미국 국립의약연구소(National Library of Medicine)), 예컨대 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기술된, 폴리펩티드 서열에서 BLASTP 그리고 핵산 서열에서 BLASTN과 같은, 컴퓨터-실행 정렬 알고리즘을 사용함으로써 용이하게 이루어지고, 미국 국립 생물 기술정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 웹사이트와 같은, 다양한 소스들을 통하여 공중에 이용가능하게 된다. 전산화된 BLAST 인터페이스를 사용할 때, “저 복잡도 필터(low complexity filter)”를 이용할 옵션이 존재한다면, 이 옵션은 꺼야 된다(즉, 필터 없음).
또한 두 폴리펩티드 서열 사이의 최적 정렬은, 상기에서 특정화된 동일한 정렬 파라미터(매트릭스 = BLOSUM62, 갭 오픈 벌점 = 11, 및 갭 확장 벌점 = 1)를 이용하여 BLASTP 알고리즘의 수작업 계산에 의하여(즉, 컴퓨터 보조 없이), 결정될 수 있다. 처음에, 두 서열은 시각적 검사에 의하여 초기에 정렬한다. 이어서 초기 정렬 점수는 다음과 같이 계산된다: 정렬의 각 개별 위치에서(즉, 정렬된 잔기의 각 쌍에서), 수치 값은 BLOSUM62 매트릭스에 따라 할당된다(도 13). 정렬에서 잔기들의 각쌍에 할당된 값들의 합이 정렬 점수이다. 정렬되고 있는 두 개의 서열이 매우 유사하다면, 종종 이 초기 정렬은 최고 가능 정렬 점수를 제공한다. 최고 가능 정렬 점수를 가지는 정렬은 채용된 정렬 파라미터에 근거한 최적 정렬이다.
두 개의 서열에서 정렬 점수의 수작업 계산의 예들이 도 14A-14D에 제공되어 있다. 도 14A는, 인간 CTLA-4 ECD 서열(서열번호 159)의 잔기 39-53으로 본 명세서에서 확인된 “질의” 서열 및 D3(서열번호 61)의 잔기 40-54로 본 명세서에서 확인된 “대상체” 서열의 임의의 정렬(정렬 14A)에서 정렬 점수의 계산을 보여 준다. 아미노산의 각 정렬된 쌍에서 BLOSUM62 매트릭스에 의하여 할당된 수치 값이 정렬의 각 위치 아래에 나타나 있다.
도 14B는 동일한 두 개의 서열의 최적 정렬에서 정렬 점수를 보여 준다. 시각화를 도모하기 위하여, 정렬에서 아미노산의 각 동일한 쌍이 볼드체로 나타나 있다. 하기 도 14B(정렬 14B)의 정렬은 이러한 두 서열의 최고 가능 정렬 점수(각 정렬된 위치 아래에 나타낸 값들의 합)를 가져 온다; 이러한 두 서열의 다른 정렬은, 갭이 있거나 없거나, 더 낮은 정렬 점수를 가져올 것이다.
일부 경우에, 더 높은 정렬 점수는 정렬에 하나 이상의 갭을 도입함으로써 얻어질 수 있다. 갭이 정렬에 도입될 때는 언제나, 갭 오픈 벌점이 할당되며, 추가적으로 갭 확장 벌점이 그 갭 내의 각 잔기 위치에서 평가된다. 그러므로, 상기에 기술되는 정렬 파라미터를 이용하여(갭 오픈 벌점 = 1 및 갭 확장 벌점 = 1을 포함함), 정렬 내의 한 잔기의 갭은 그 갭에 할당된 - (11+(1 x 1)) = -12의 값에 대응할 것이며; 두 잔기의 갭은 그 갭에 할당된 - (11+(2 x 1)) = -13의 값에 대응할 것이며, 기타 등도 이와 같다. 이러한 계산은 정렬에 도입된 각 새로운 갭에서 반복된다.
다음은, 갭 벌점에도 불구하고, 정렬에 갭을 어떻게 도입하는 것이 더 높은 정렬 점수를 가져 오게 할 수 있는지를 입증하는, 예이다. 도 14C는 인간 CTLA-4 ECD 서열(서열번호 159)의 잔기 39-53으로 본 명세서에서 확인된 “질의” 서열 및 D3(서열번호 61)의 잔기 41-55로 본 명세서에서 확인된 “대상체” 서열의 정렬(정렬 14C)를 보여 주는데, 이 경우에 아미노산 49-50이 결실되어 있다.임의의 갭의 도입 없이 최상의 가능한 정렬인 정렬 14C는 34의 정렬 점수를 가져 온다.
도 14D의 정렬(정렬 14D)은 정렬 점수에 대한 더 낮은 서열의 두-잔기 갭의 도입의 효과를 보여 준다. 13의 총 갭 벌점(11의 갭 오픈 벌점, 및 1의 갭 확장 벌점의 2배)에 불구하고, 두 서열의 전체 정렬 점수는 43으로 증가한다. 하기 정렬 D는 최고 가능한 정렬 점수를 가져 오며, 따라서 이러한 두 서열의 최적 정렬이 되고; 이러한 두 서열의 다른 정렬(갭이 있거나 없거나)은 더 낮은 정렬 점수를 가져 올 것이다.
상대적으로 짧은 서열을 이용하는, 상기에서 기술된 서열 정렬 계산의 예들은 단지 설명하기 위한 목적만으로 제공된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 채용된 정렬 파라미터(BLOSUM62 매트릭스, 갭 오픈 벌점 = 11, 및 갭 확장 벌점 = 1)는 일반적으로 폴리펩티드 서열 85개의 아미노산 길이 이상일 것으로 의도된다. NCBI 웹사이트는, 상기에서 기술된 동일한 과정을 이용하여, 컴퓨터-보조는 물론 수작업 작업 정렬 계산에 적합한, 다른 길이의 서열에서 다음의 정렬 파라미터를 제공한다. 50-85개 아미노산 길이의 서열에서, 최적 파라미터는 BLOSUM80 매트릭스(앞의 Henikoff와 Henikoff), 갭 오픈 벌점 = 10, 및 갭 확장 벌점 = 1이다. 35-50개 아미노산 길이의 서열에서, 최적 파라미터는 PAM70 매트릭스(Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) “A model of evolutionary change in proteins” in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5권, suppl. 3, M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC.), 갭 오픈 벌점 = 10, 및 갭 확장 벌점 = 1이다. 35개 아미노산 길이 이하의 서열에서, 최적 파라미터는 PAM30 매트릭스(앞의 Dayhoff, M.O.), 갭 오픈 벌점 = 9, 및 갭 확장 벌점 = 1이다.
2. 퍼센트 동일성의 계산
서열이 최적으로 정렬되면, 질의 서열에 관한 대상체 서열의 퍼센트 동일성은, 동일한 잔기 쌍을 포함하는 최적 정렬 내의 위치의 수를 계수하고, 그것을, 달리 특정되지 않으면, 질의 서열 내의 잔기의 수인 비교 길이(비교 윈도우라고도 지칭됨) 내의 잔기의 수로 나누고, 그 결과의 수에 100을 곱함으로써, 계산된다. 상기 정렬로 돌아가 참조하면, 각 예에서 질의(상부) 서열로 지정된 서열은 15개의 아미노산 길이이다. 정렬 B에서, 12쌍의 정렬된 아미노산 잔기(볼드체로 나타냄)는 대상체 서열(하부)에 대한 질의 서열(상부)의 최적 정렬과 동일하다. 따라서, 이러한 특정한 대상체 서열은 15개-잔기 질의 서열의 전체 길이에 대하여 (12/15) x 100 = 80% 동일성을 가진다; 즉, 정렬 B 내의 대상체 서열은 질의 서열에 대하여 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 가진다. 정렬 D에서, 최적 정렬에서 11쌍의 아미노산 잔기(볼드체로 나타냄)는 동일하다; 따라서 이러한 특정한 대상체 서열은 15개-잔기 질의 서열의 전체 길이에 대하여 (11/15) x 100 = 73.3% 동일성을 가진다; 즉, 정렬 D내의 대상체 서열은 질의 서열에 대하여 적어도 73% 아미노산 서열 동일성을 가진다.
폴리펩티드에 적용하면, 용어 “실질적인 동일성”(또는 “실질적으로 동일한”)은 일반적으로, 두 개의 아미노산 서열(즉, 질의 서열과 대상체 서열)이 상기에서 기술된 적절한 파라미터를 이용한 BLASTP 알고리즘(수작업으로 또는 컴퓨터를 통하여)을 이용하여 최적으로 정렬된다는 것을 의미하는데, 대상체 서열은 질의 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 가진다. 일부 경우에, 실질적인 동일성은, 예컨대, 적어도 110개, 115 개, 118 개, 119 개, 120 개, 121 개, 122 개, 123 개, 124 개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 200개, 250개, 300개, 345개, 346개, 347개, 348개, 349개, 350개, 351개, 352개, 353개, 354개, 355개, 356개, 357개, 358개, 359개, 360개, 375개, 400개, 450 또는 500개의 아미노산 잔기와 같은, 적어도 100개의 아미노산 잔기의 비교 길이에 대하여 존재한다.
유사하게, 두 개의 핵산 서열의 맥락에서 적용하면, 용어 실질적인 동일성(또는 실질적으로 동일한)은, 두 개의 핵산 서열(즉, 질의 및 대상체 서열)이 하기에서 기술되는 적절한 파라미터를 이용한 BLASTN 알고리즘(수작업으로 또는 컴퓨터를 통하여)을 이용하여 최적으로 정렬된다는 것을 의미하는데, 대상체 서열은 질의 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 핵산 서열 동일성을 가진다. 핵산 서열 정렬에 사용되는 파라미터는 다음과 같다: 매치 보상(match reward) 1, 미스매치(mismatch) 벌점 -3, 갭 존재 벌점 5, 갭 확장 벌점 2(치환 매트릭스는 BLASTN 알고리즘에 사용되지 않는다). 일부 경우에, 실질적인 동일성은 적어도 300개의 뉴클레오티드 잔기, 예컨대 적어도 330개, 345개, 354개, 357개, 360개, 363개, 366개, 369개, 362개, 365개, 375개, 390개, 405개, 420개, 435개, 450개, 600개, 750개, 900개, 1035개, 1038개, 1041개, 1044개, 1047개, 1050개, 1053개, 1056개, 1059개, 1062개, 1065개, 1068개, 1071개, 1074개, 1077개, 1080개, 1200개, 1350개 또는 1500개의 뉴클레오티드 잔기의 비교 길이에 대하여 존재한다.
당해 분야에 알려진 다른 서열 정렬 프로그램이 이용될 수 있다. ALIGN 프로그램은, Myers 및 Miller CABIOS 4:11-17 (1988)에 의하여 기술되는 역학 프로그래밍 알고리즘의 변형을 이용하여 두 개의 선택된 단백질 또는 핵산 서열의 최적의 글로벌(전체) 정렬을 생산한다. ALIGN 프로그램은, 필수적인 것은 아니지만, 일반적으로 가중 엔드-갭(weighted end-gaps)과 함께 이용된다. 갭 오프닝 및 갭 확장 벌점이 가능하다면, 그것들은, 종종, 아미노산 서열 정렬에서 각각 약 -5와 -15 사이에 그리고 0과 -3 사이에, 더 바람직하게는 약 -12와 -0.5 내지 -2 사이에서 각각 설정되며, 핵산 서열 정렬에서는, 각각 -10 내지 -20과 -3 내지 -5 사이에, 더 일반적으로는 약 -16과 -4 사이에 각각 설정된다. ALIGN 프로그램은 Pearson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)과 Pearson 등, Meth. Enzymol. 18:63-98 (1990)에 추가로 기술되어 있다.
대안적으로, 그리고 특히 다중 서열 분석(즉, 3개 이상의 서열의 비교)에서, CLUSTALW 프로그램(예, Thompson 등, Nucl. Acids Res. 22:4673-4680 (1994)에 기술됨)이 이용될 수 있다. CLUSTALW 프로그램은 다중 DNA 및 아미노산 서열 정렬에 적합한 알고리즘이다(Thompson 등, Nucl. Acids Res. 22:4673-4680 (1994)). CLUSTALW는 서열 그룹들 사이에서 다중 쌍대 비교(multiple pairwise comparisons)를 실시하고 그것들을 모아서 동종성(homology)에 기반한 다중 정렬을 만든다. 하나의 양태에서, 갭 오픈 및 갭 확장 벌점은 각각 10 및 0.05에서 설정된다. 대안적으로 또는 추가적으로, CLUSTALW 프로그램은 “역학적인”(대 “빠른”) 셋팅을 이용하여 실행된다. 일반적으로, CLUSTALW을 이용한 뉴클레오티드 서열 분석은 BESTFIT 매트릭스를 이용하여 실시되며, 반면에 아미노산 서열은 서열들 사이의 동일성 수준에 따라 다양한 세트의 BLOSUM 매트릭스를 이용하여 평가된다(예, San Diego Supercomputer Center (SDSC)를 통하여 이용 가능한 CLUSTALW 버전 1.6 프로그램 또는 European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK으로부터 이용 가능한 버전 W 1.8로 이용됨과 같음). 바람직하게는, CLUSTALW 세팅은 SDSC CLUSTALW 디폴트 셋팅(예, 아미노산 서열 분석에서 특별한 친수성 갭 벌점에 관하여)으로 설정된다. CLUSTALW 프로그램은, 예컨대, Higgins 등, CABIOS 8(2):189-91 (1992), Thompson 등, Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1994), 및 Jeanmougin 등, Trends Biochem. Sci. 2:403-07 (1998)에 추가로 기술되어 있다.
대안적인 포맷에서, 특정한 쌍의 정렬된 아미노산 서열들 사이의 동일성 또는 퍼센트 동일성은 CLUSTALW 분석(예, 버전 W 1.8)에 의하여 얻어지는 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 지칭하는데, 이것은 정렬에서 동일한 일치의 수를 계수하고 그러한 동일한 일치의 수를 (i) 정렬된 서열의 길이와 (ii) 96 중 더 큰 것으로 나누고, 다음 디폴트 ClustalW 파라미터를 이용하여 느리고/정확한 쌍대 정렬을 얻는다 - 갭 오픈 벌점:10; 갭 확장 벌점:0.10; 단백질 가중치 매트릭스(protein weight matrix): Gonnet 시리즈; DNA 가중치 매트릭스: IUB; Toggle Slow/Fast 쌍대 정렬 = SLOW 또는 FULL 정렬.
퍼센트 동일성 또는 퍼센트 유사성을 결정하기에 유용한 다른 알고리즘은, Pearson 등, Proc Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 및 Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996)에 기술된, FASTA 알고리즘이다. 퍼센트 동일성을 계산하기 위하여 DNA 서열의 FASTA 정렬에 사용되는 일반적인 파라미터는, BL50 매트릭스 15: -5, k-tuple = 2; 참여 벌점(joining penalty) = 40, 최적화(optimization) = 28; 갭 벌점 = -12, 갭 길이 벌점 = -2; 및 폭 = 16으로, 최적화된다.
다른 적합한 알고리즘은, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하는데, 이것들은 선택된 서열을 데이터베이스(예, GenSeq) 내의 다중 서열에 대하여 정렬함으로써, 또는 두 개의 선택된 서열 사이에 BL2SEQ와 같은 추가 알고리즘에 의해 변형될 때, 적어도 두 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 분석을 용이하게 한다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 기술정보센터(NCBI)(월드와이드 웹사이트 주소 ncbi.nlm.nih.gov)를 통하여 공개적으로 이용 가능하다. BLAST 알고리즘은, 질의 서열 내에 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(high scoring sequence pair HSP)을 우선 정의하는 것을 수반하는데, 이는 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 글자에 정렬될 때 일부 양성-치 임계값 점수 T를 매치하거나 만족시킨다. T는 이웃 단어 점수 임계값(아래, Altschul 등)으로 지칭된다. 이러한 초기 이웃 단어 히트(hits)는 그것들을 포함한 더 긴 HSP를 찾기 위한 연구를 초기화하는 시드(seeds)로 작동한다. 단어 히트는, 누적 정렬 점수가 증가하는 한 각각의 서열을 따라 두 방향으로 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열에서, 파라미터 M(한 쌍의 매칭 잔기에서의 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭에서의 벌점 점수: 항상 < 0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열에서, 득점 매트릭스는 누적 점수를 계산하는데 이용된다. 각 방향에서의 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 그의 최대로 달성된 값으로부터 양 X만큼 떨어지거나; 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 누적으로 인하여, 누적 점수가 0 또는 그 이하로 가거나; 둘 중 하나의 서열의 끝이 도착될 때, 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램은(뉴클레오티드 서열에 있어서) 11의 단어 길이(W), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교값을 가지고 이용될 수 있다. 아미노산 서열에서, BLASTP 프로그램(예, BLASTP 2.0.14; 2000년 6월 29일)은 3의 단어 길이 및 10의 기대값(E)을 가지고 이용될 수 있다. BLOSUM62 득점 매트릭스(Henikoff & Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 참조)는 50의 정렬(B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교값을 이용한다. 다시, 다른 적합한 알고리즘도 마찬가지로, 비교의 엄중도(stringency)는, 프로그램이 본 명세서에 열거한 서열(예, 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224의 임의의 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 85, 90, 91, 92, 93, 49, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산) 내의 것들과 더 밀접하게 관련된 서열만을 확인할 때까지, 증가될 수 있다
또한 BLAST 알고리즘은 두 개의 서열들 사이의 유사성 또는 동일성의 통계 분석을 실시한다(예, Karlin & Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787을 참조). BLAST 알고리즘에 의하여 제공된 유사성 또는 동일성에 대한 한 측정법은 최소 총합 확률(smallest sum probability (P(N))인데, 이것은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어나는 확률을 나타낸다. 예를 들어, 참조 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서 최소 총합 확률(smallest sum probability (P(N))이 약 0.1 이하이거나 약 0.001 이하인 경우와 같이, 약 0.2이하라면, 핵산은 참조 서열에 유사한 것으로 여겨진다.
또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램 분석은, 바람직하게는 BLAST 프로그램 기능에 통합된, DUST 또는 SEG 프로그램과 같은 저 복잡도 필터링 프로그램에 의하여 변형될 수 있다(예, Wootton 등, Comput. Chem. 17:149-63 (1993), Altschul 등, Nat. Genet. 6:119-29 (1991), Hancock 등, Comput. Appl. Biosci. 10:67-70 (1991), 및 Wootton 등, Meth. Enzymol. 266:554-71 (1996)을 참조). 그러한 양태에서, 람다 비율이 이용되면, 그 비율을 위한 유용한 셋팅은 0.8과 0.9 사이를 포함하여, 0.75와 0.95 사이이다. 갭 존재 비용(또는 갭 점수)이 그러한 양태에 이용된다면, 갭 존재 비용을 일반적으로 약 -5와 -15, 더 일반적으로 약 -10 사이에서 설정되고, 잔기당 갭 비용은 일반적으로, 0과 -3 사이와 같은, 약 0 내지 -5 사이에서 설정된다(예, -0.5). 유사한 갭 파라미터가 적절한 다른 프로그램과 함께 이용될 수 있다. BLAST 프로그램 및 그것들의 근간이 되는 원칙이, 예컨대, Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990), Karlin과 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 (199)(Karlin과 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)에 의하여 변경됨), 및 Altschul 등, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1997)에 추가로 기술되어 있다.
유용한 알고리즘의 다른 예가 PILEUP 소프트웨어에 통합되어 있다. PILEUP 프로그램은, 점진적인, 페어-방식(pair-wise) 정렬을 이용하여 관련 서열의 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성하여 관계 및 퍼센트 서열 동일성 또는 퍼센트 서열 유사성을 보여 준다. PILEUP는, Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153에 의하여 기술된 방법과 유사한, Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360의 점진적인 정렬 방법의 단순화를 이용한다. 프로그램은 300개의 서열, 각각의 최대 길이 5,000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산까지 정렬할 수 있다. 다중 정렬 과정은 두 개의 가장 유사한 서열의 페어 방식 정렬로 시작하는데, 두 개의 정렬된 서열의 클러스터를 생산한다. 이어서 이러한 클러스터는 정렬된 서열의 다음으로 가장 관련되는 서열 또는 클러스터에 정렬된다. 서열의 두 개의 클러스터는 두 개의 개별적인 서열의 페어 방식 정렬의 간단한 확장에 의하여 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 점진적인, 페어 방식 정렬에 의하여 성취될 수 있다. 서열 비교의 영역에서 특정 서열 및 그것들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정함으로써 그리고 프로그램 파라미터를 지정함으로써, 프로그램이 실행된다. PILEUP를 이용하여, 참조 서열을 다른 테스트 서열에 비교하여 특정 파라미터를 이용하여 퍼센트 서열 동일성(또는 퍼센트 서열 유사성) 관계를 결정한다. PILEUP 프로그램에서의 예시적인 파라미터는 다음과 같다: 디폴트 갭 가중치(3.00), 디폴트 갭 길이 가중치(0.10), 및 가중된 엔드 갭. PILEUP는 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대, 버전 7.0(Devereaux 등 (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-395)의 요소이다.
동일성 분석을 실시하기 위한 다른 유용한 알고리즘은, Smith와 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482의 국부적 동종성 알고리즘(local homology algorithm), Needleman과 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 동종성 정렬 알고리즘(homology alignment algorithm) 및 Pearson과 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법에 대한 연구를, 포함한다. 이들 알고리즘(예, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 전산화된 실행은 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI에 제공되어 있다.
서열 변형
상기에서 검토된 바와 같이, 하나의 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 6개 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산 잔기 이하)로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 둘 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해한다. 그러한 아미노산 치환(들)은 보존적 아미노산 치환(들)을 포함한다.
비-제한적 예로써, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1과 총 6개의 아미노산(상기에서 기술된 것들을 포함하여, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 조합일 수 있음)까지 상이한 폴리펩티드 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 치환의 어느 것도 하기에 정의된 치환 그룹에 따른 치환이 아니거나, 치환의 일부 또는 모두가 하기에 정의된 치환 그룹에 따른 치환이다.
본 발명에 따른 아미노산 치환은, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보존적 아미노산 잔기 치환은 일반적으로 동일한 기능적 클래스에 속하는 잔기에서 하나의 기능적 클래스의 아미노산 잔기 내에서 멤버를 교환하는 것을 수분한다(동일한 아미노산 잔기는 기능적으로 동종성이거나 퍼센트 기능적 동종성을 계산하는 데 있어서 보존적임). 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 한 예가 표 1에 제공되어 있는데, 이것은 서로 “보존적 치환”이라고 여겨질 수 있는 아미노산을 포함하는 6개의 예시적인 그룹을 제시한다.
| 1 | 알라닌(A) 글리신(G) 세린(S) 트레오닌(T) |
| 2 | 아스파르트산(D) 글루탐산(E) |
| 3 | 아스파라긴(N) 글루타민(Q) |
| 4 | 아르기닌(R) 리신(K) 히스티딘(H) |
| 5 | 이소류신(I) 류신(L) 메티오닌(M) 발린(V) |
| 6 | 페닐알라닌(F) 티로신(Y) 트립토판(W) |
아미노산의 다른 치환 그룹은 예상할 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 기능 또는 화학적 구조 또는 조성물(예, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황-함유성)에 의하여 그룹지어질 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹은 다음을 포함할 수 있다: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I). 서로 보존적 치환이라 여겨지는 아미노산을 포함하는 다른 그룹은 다음을 포함한다: 방향족: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황-함유성: 메티오닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 비-극성 비전하성 잔기(non-polar uncharged residue): 시스테인(C), 메티오닌(M) 및 프롤린(P); 친수성 비전하성 잔기: 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q). 또한, 아미노산의 추가적인 그루핑을 위하여, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company을 참조. 본 명세서에서 폴리펩티드 서열의 열거는, 상기 치환 그룹과 함께, 모든 보존적으로 치환된 폴리펩티드 서열의 분명한 열거를 제공한다.
또한 또는 대안적으로 적합할 수 있는, 더 보존적인 치환이 상기 기술되는 아미노산 잔기 클래스 내에 존재한다. 더 보존적인 치환을 위한 보존성 그룹은 다음을 포함한다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민. 따라서, 예를 들어, 하나의 특정한 양태에서, 본 발명은 서열번호 1(또는 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 임의의 것)에 대하여 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 가지며, 전반적이지는 않지만, 그러한 더 보존적인 아미노산 치환에 의하여, 서열번호 1의 서열에 대하여 대부분(예, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%) 상이한, 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공한다.
또한 적절한 아미노산 치환의 추가적인 그룹이, 예컨대 Creighton (1984) PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company에 기술되는 원칙을 이용하여, 결정될 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 서열 변형체 내의 치환의 적어도 33%, 50%, 60%, 70% 또는 그 이상(예, 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 그 이상)은, 본 발명의 폴리펩티드 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의, 그것들이 교환한 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 같은, 동일한 기능적 동종 클래스(상기에서 기술된 것들과 같은, 임의의 적합한 분류 시스템에 의하여 결정됨) 내에 있는 잔기로의 치환을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 서열의 보존적으로 치환된 변형은, 적은 퍼센트, 일반적으로 폴리펩티드 서열의 아미노산의 10%, 9%, 8%, 7% 또는 6% 이하, 또는 더 일반적으로 폴리펩티드 서열의 아미노산의 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하의, 동일한 보존적 치환 그룹의 보존적으로 선택된 아미노산으로의 치환을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 본 발명의 폴리펩티드 서열의 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 상기에서 검토된 바와 같이, 하나의 양태에서, 본 발명은 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드와 같은, 변이체 CLTA-4 폴리펩티드)를 제공하는데, 그 각각은 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 또는 CD80 및/또는 CD86의 폴리펩티드 단편(또는 둘 중의 하나 또는 둘 다의 ECD)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제한다. 그러나 그러한 폴리펩티드는 그 폴리펩티드가 기술된 기능적 성질을 가진다면, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 치환을 포함하여, 하나 이상의 아미노산 결실, 첨가 또는 치환에 의하여 변할 수 있다. 특정한 양태에서, 본 발명은, 예컨대, 서열번호 1-73의 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것과 같은 본 명세서에 기술된 임의의 그러한 폴리펩티드의 보존적으로 변형된 변형을 포함하는 폴리펩티드 변형체를 제공한다.
또한, 상기에 검토된 바와 같이, 다른 양태에서, 본 발명은 분리형 또는 재조합형 융합 단백질(예, 변이체 CLTA-4-Ig 융합 단백질)을 제공하는데, 각각은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제한다. 그러나, 그러한 융합 단백질은 그 융합 단백질이 기술된 기능적 성질을 가진다면, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 치환을 포함하여, 하나 이상의 아미노산 결실, 첨가 또는 치환에 의하여 변할 수 있다. 특별한 양태에서, 본 발명은, 예컨대, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 것과 같은, 본 명세서에 기술된 임의의 그러한 융합 단백질의 보존적으로 변형된 변형을 포함하는 폴리펩티드 변형체를 제공한다.
또한, 본 명세서에서 상기에 또는 다른 부분에 기술된 본 발명의 임의의 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드의 폴리펩티드 변형체가 제공되는데, 여기에서 폴리펩티드 변형체의 아미노산 서열은, 비록 비보존적 치환이 가끔 허용가능하거나 심지어 바람직하다 할 지라도(그러한 비보존적 치환의 예가 본 명세서에서 추가로 검토됨), 참조 폴리펩티드의 각각의 폴리펩티드 서열과 하나 이상의 보존적 아미노산 잔기 치환만큼 상이하다. 예를 들면, 폴리펩티드 변형체의 서열은, 유사 중량을 가지는 하나 이상의 아미노산 잔기(즉, 교체하는 각각의 폴리펩티드 서열 내의 잔기에 중량 동종성을 가지는 잔기)를 가지는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환에 의하여, 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 서열과 다를 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 중량(및 대응적으로 크기)은 폴리펩티드의 구조에 상당히 영향을 줄 수 있다. 중량-기반 보존성 또는 동종성은 비-동일한 대응 아미노산이 본 명세서에 기술된 중량-기반 매트릭스(예, BLOSUM50 매트릭스; PAM250 매트릭스)의 하나에 대한 양성 점수와 관련이 있는가의 여부에 기초한다.
상기-기술된 기능적 아미노산 클래스에 유사한, 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기는 (“강한” 및 “약한” 보존성 그룹 사이에서 분리되는) 중량-기준 보존성 그룹으로 분리될 수 있다. 8개의 일반적으로 사용되는 중량-기준 강한 보존성 그룹은 Ser Thr Ala, Asn Glu Gln Lys, Asn His Gln Lys, Asn Asp Glu Gln, Gln His Arg Lys, Met Ile Leu Val, Met Ile Leu Phe, His Tyr, 및 Phe Tyr Trp이다. 중량-기준 약한 보존성 그룹은 Cys Ser Ala, Ala Thr Val, Ser Ala Gly, Ser Thr Asn Lys, Ser Thr Pro Ala, Ser Gly Asn Asp, Ser Asn Asp Glu Gln Lys, Asn Asp Glu Gln His Lys, Asn Glu Gln His Arg Lys, Phe Val Leu Ile Met, 및 His Phe Tyr을 포함한다. CLUSTAL W 서열 분석 프로그램의 일부 버전은 정렬의 출력에서 중량-기준 강한 보존성 및 약한 보존성 그룹의 분석을 제공하여, 중량-기준 보존성을 결정하는 편리한 기술을 제공한다(예, 일반적으로 SDSC 디폴트 셋팅과 함께 이용되는, SDSC에 의하여 제공되는 CLUSTAL W). 일부 경우에, 그러한 폴리펩티드 변형체에서 치환의 적어도 33%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 치환을 포함하는데, 여기에서 중량-기준 보존성 내의 잔기는, 동일한 중량-기준 보존성 그룹 내에 있는 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기를 바꾼다. 즉, 치환의 그러한 퍼센트는 아미노산 잔기 중량 특성에 의하여 보존된다.
폴리펩티드 변형체의 서열은, 변이체 CTLA-4 폴리펩티드의 치환된 (원래의) 잔기와 유사한 하이드로파시 프로파일(hydropathy profile)을 가지는(즉, 유사한 친수성을 보이는) 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지는 하나 이상의 아미노산 치환에 의하여, 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드와는 상이하다. 하이드로파시 프로파일은 Kyte & Doolittle 지표를 이용하여 결정될 수 있는데, 그 지표 내의 각 자연적으로 발생하는 아미노산의 점수는 다음과 같다: I (+4.5), V (+4.2), L (+3.8), F (+2.8), C (+2.5), M (+1.9); A (+1.8), G (-0.4), T (-0.7), S (-0.8), W (-0.9), Y (-1.3), P (-1.6), H (-3.2); E (-3.5), Q (-3.5), D (-3.5), N (-3.5), K (-3.9), 및 R (-4.5) (예, 추가 검토를 위하여 미국특허번호 제 4,554,101호 및 Kyte & Doolittle, J. Molec. Biol. 157:105-32 (1982)을 참조). 동종체(homolog)가 서열번호 1-73의 임의의 것으로부터 선택될 수 있는, 본 명세서에서 공지된 동일한 또는 기능적으로 동종성인 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 서열 내의 대응 잔기와 동일하지 않은 변형체 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기의 적어도 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% 또는 100%는(“가장 관련있는 동종체(most related homolog)”), 가장 관련있는 동종체 내의 대응 위치에서의 비-동일한 아미노산 잔기에 관하여, +/-1 이하의 친수성 변화 및 +/-0.5 이하의 친수성 변화를 포함하여, +/-2 이하의 친수성 변화를 나타낸다. 변형체 폴리펩티드는, 약 150 이하, 약 100 이하, 및/또는 약 50이하(예, 약 30, 20 또는 10 이하)의 서열번호 1-73의 그룹으로부터 선택된 그의 가장 관련된 동종체에 관하여 친수성의 총 변화를 보여 줄 수 있다.
유사하거나 동일한 친수성을 지닌 일반적인 아미노산 치환의 예는 아르기닌-리신 치환, 글루타메이트-아스파테이트 치환, 세린-트레오닌 치환, 글루타민-아스파라긴 치환 및 발린-류신-이소류신 치환을 포함한다. SDSC를 통하여 이용가능한 GREASE 프로그램과 같은, 알고리즘 및 소프트웨어는 아미노산 서열의 하이드로파시 프로파일을 신속히 평가하기 위한 편리한 방법을 제공한다. 폴리펩티드 변형체의 서열 내의 대부분(적어도 50%) 또는 거의 모두(예, 약 65, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99%)는 아니지만, 실질적인 부분(예, 적어도 약 33%)이 종종, 그것들이 (참조) 폴리펩티드 서열에서 바꾸는 아미노산 잔기와 유사한 하이드로파시 점수를 가질 것이므로, 폴리펩티드 변형체의 서열은 폴리펩티드 서열과 유사한 GREASE 프로그램 출력을 보일 것으로 예상된다. 예를 들어, 특별한 양태에서, 서열번호 61의 폴리펩티드 변형체는 WT CTLA-4 폴리펩티드(예, hCTLA-4)를 이용하여 얻어진 것보다 서열번호 61의 폴리펩티드 서열을 입력함으로써 얻어진 GREASE 출력과 더 같은 GREASE 프로그램 (또는 유사한 프로그램) 출력을 가지는 것으로 예상될 수 있는데, 이는 테스트 변형체 서열 및 서열번호 1을 프로그램에 입력함으로써 제공되는 그래픽(예, 그래픽 오버레이/정렬) 및/또는 수치적 출력의 시각적 검사 또는 컴퓨터-보조 비교에 의하여 결정될 수 있다.
또한, 기능적 동종성, 중량 동종성 및 하이드로파시 특징에 있어서 아미노산 잔기의 보존성은, 예컨대, 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열의 폴리펩티드 서열 변형체를 포함하나 이에 한정되지 않는, 본 발명에 의하여 제공되는 다른 폴리펩티드 서열 변형체에 적용한다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 재조합형 폴리펩티드 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 그러한 폴리펩티드 변형체를 포함하는데, 여기에서 변형체의 아미노산 서열은 상기에서 검토되는 중량-기준 보존성 또는 동종성 또는 유사한 하이드로파시 프로파일에 따라 선택된 적어도 하나의 그러한 아미노산 잔기 치환을 가진다. 상기에서 기술된 그러한 폴리펩티드 변형체는, 상기에서 그리고 하기 실시예에서 더 자세히 기술되는 바와 같이, 일반적으로 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 능력 및/또는 적어도 한 타입의 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다.
신호 펩티드 서열
또한 본 발명의 폴리펩티드는, 하나 이상의 펩티드 단편과 같은, 임의의 적합한 수 및 타입의 부가적인 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 그러한 폴리펩티드는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 재조합형 폴리펩티드가 동물 세포에서 발현될 때, 신호 펩티드는 재조합형 폴리펩티드를 소포체(endoplasmic reticulum)로 유도한다(direct). 세포 내에서 발현 중에 폴리펩티드의 적어도 하나의 부분의 소기관 수송(organelle trafficking) 및/또는 분비를 유도하는 신호 펩티드가 포함될 수 있다. 일반적으로 그러한 서열은 폴리펩티드의 미성숙한(즉, 충분히 가공되지 않은) 형태로 존재하며, 후속하여, 세포 프로테아제에 의하여 제거/분해되어 단백질의 성숙한 형태에 도달한다. 예를 들어, 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 또는 융합 단백질은, 폴리펩티드가 소포체 또는 분비 경로(예, ER, 골지, 및 기타 분비 관련 소기관 및 세포 구획)(예컨대, 단백질이 그것에 의하여 가공되고 그것으로부터 방출됨), 세포핵으로 수송되게(예, 이동시킴(translocated)) 유도하는 서열과 같은, 폴리펩티드를 세포내 구획으로 유도하는, 및/또는 폴리펩티드가 세포로부터 분비되거나, 세포막 내에서 이동되거나, 단백질을 분비하는 세포로부터 떨어진 제2 세포를 표적화하는, 신호 서열의 임의의 적합한 신호 서열 또는 조합을 포함할 수 있다. 이 점에서, 폴리펩티드는 세포내 표적화 서열(또는 “분류 신호(sorting signal)”)을 포함할 수 있는데, 이것은, 리소좀 결합성 막 단백질 1(예, LAMP-1 - 예컨대, Wu 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1161-75 (1995) 및 Ravipraskash 등, Virology 290:74-82 (2001)를 참조), 그의 일부 또는 동종체(예, 미국특허번호 제 5,633,234호를 참조), 또는 다른 적합한 리조솜, 엔도좀 및/또는 ER 표적화 서열(예, 미국특허번호 제 6,248,565호를 참조)로부터 유래되는 리소좀/엔도좀-표적화 분류 신호와 같이, 폴리펩티드를 엔도좀 및/또는 리소좀 구획(들), 또는 MHC II 내의 풍부한 다른 구획으로 유도하여 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 제시 및 반응을 촉진한다. 일부 양태에서, 세포내 표적화 서열이, 당해 분야에서 알려진 기술에 의하여 확인될 수 있는, 폴리펩티드 내의 증명된/확인된 에피토프 서열(들)의 근처에 또는 이에 근접하게 위치하여, 그러한 에피토프(들)를 포함하는 폴리펩티드 단편의 T 세포 제시의 가능성을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는, 본 명세서에서 추가로 기술된, 예컨대, 하나 이상의 유전자 전달 벡터를 포함하는, 하나 이상의 뉴클레오티드 전달 벡터에 의하여 숙주 세포로 전달된 분리형, 재조합형 또는 합성 DNA 또는 RNA로부터 발현될 수 있다.
폴리펩티드가 포유류 세포 내에서 발현될 때, 폴리펩티드를 소포체(ER)로 유도하는(예, 폴리펩티드의 ER 이동을 용이하게 하는) 신호 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 적합한 ER-표적화 서열을 포함할 수 있다. 많은 ER-표적화 서열이 당해 분야에서 알려져 있다. 그러한 신호 서열의 예들이 미국특허번호 제 5,846,540호에 기술되어 있다. 통상적으로 채용되는 ER/분비 신호 서열은 이스트 알파 인자 신호 서열과, 헤르페스(herpes) 바이러스 gD 신호 서열과 같은 포유류 바이러스 신호 서열을 포함한다. E. coli 생산을 위한 예시적인 신호 펩티드는 E. coli.의 STII 또는 Ipp 신호 서열을 포함한다. 신호 서열의 추가적인 예는 미국특허번호 제 4,690,898호, 제 5,284,768호, 제 5,580,758호, 제 5,652,139호 및 제 5,932,445호에 기술되어 있다. 적합한 신호 서열은 당해 분야에서 알려진 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, cbs.dtu.dk/services/SignalP로 지정된 월드와이드 웹사이트 주소에서 Biological Sequence Analysis의Center를 통하여 공개적으로 이용가능한 SignalP 프로그램(예, Nielsen 등 (1997) Protein Engineering 10:1-6에 기술되어 있음), 또는 신호-서열-유사 도메인(signal-sequence-like domains)을 확인할 수 있는 유사한 서열 분석 프로그램이 이용될 수 있다. 적합한 신호 펩티드를 확인하기 위한 관련 기술이 Nielsen 등, Protein Eng. 10(1):1-6 (1997)에 제공되어 있다. 예컨대, 유럽특허출원(Appn)번호 제 0 621 337호, Zheng 및 Nicchitta (1999) J. Biol. Chem. 274(51): 36623-30, 및 Ng 등(1996) J. Cell Biol. 134(2):269-78에서 기술된 바와 같이, 서열은 신호 서열과 통상적으로 결합된 특징에 대하여 수작업으로 분석될 수 있다.
부가적인 양태
본 발명의 임의의 폴리펩티드(본 발명의 임의의 융합 단백질을 포함함)는, 폴리펩티드의 안정화 또는 검출 또는 정제를 위한 하나 이상의 도메인 또는 서열을 추가할 때 일어나는 것과 같이, 더 큰 폴리펩티드 서열의 부분으로서 존재할 수 있다. 그러한 도메인 또는 부분서열은 본 발명의 폴리펩티드에 공유적으로 융합될 수 있는데, 이는 기술자가 용이하게 이해할 수 있으며 구성할 수 있는 것이다. 폴리펩티드 정제 부분서열은, 예컨대, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열, GST 융합물, 또는 당해 분야에서 알려진 임의의 다른 검출/정제 부분서열 또는 “태그”를 포함할 수 있다. 이러한 부가적인 도메인 또는 부분서열은 본 발명의 폴리펩티드의 활성에 거의 영향이 없거나 전혀 영향이 없으며, 또는 프로테아제에 의한 처리, 인테인(intein)의 내포(inclusion) 등과 같은 합성후 가공 단계(post synthesis processing steps)에 의하여 제거될 수 있다.
또한 본 발명의 임의의 폴리펩티드(본 발명의 임의의 융합 단백질을 포함함)는 하나 이상의 변형 아미노산(modified amino acid)을 포함할 수 있다. 변형 아미노산은, 예컨대, 글리코실화 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화(farnesylated) 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오티닐화 아미노산, 지질 성분에 접합된 아미노산, 및/또는 유기성 유도화 제제(organic derivatizing agent)에 접합된 아미노산일 수 있다. 변형 아미노산의 존재는, 예를 들어, (a) 폴리펩티드 혈청 반감기 및/또는 기능적인 생체 내 반감기를 증가시킴, (b) 폴리펩티드 항원성 또는 면역원성을 감소시킴, (c) 폴리펩티드 저장 안정성을 증가시킴, (d) 생체이용률을 증가시킴, (e) 효과기 기능을 감소시킴, 및/또는 (f) 본 발명의 둘 이상의 분자들 사이에서(본 발명의 둘 이상의 융합 단백질 사이에서 같은) 원하지 않는 자기-결합(self-association)(예, 응집체 형성)을 감소시키거나 저해함에 있어서 유익할 수 있다. 아미노산(들)은 예를 들어, 재조합 생산(예컨대, 포유류 세포 내의 발현 중에 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결성 글리코실화) 중에 번역에 수반하여(co-translationally) 또는 번역 후에(post-translationally) 변형되거나 합성 수단에 의하여 변형된다.
본 명세서에 기술되는 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 포함함)는 다양한 방법으로, 예컨대 번역후 변형 및/또는 합성 변형 또는 변이에 의하여 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질은, 일반적으로, 포유류 세포 내의 발현을 통하여, 적합하게 글리코실화될 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은, 본 명세서의 다른 부분에 기술된 바와 같이, CD86 및/또는 CD80에 결합할 수 있으며, 및/또는 면역 반응(예, T 세포 증식 또는 활성화)을 억제하는 능력을 가지는, 글리코실화 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 각각의 상기 글리코실화 폴리펩티드는 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 번역후 및/또는 합성 변형 또는 변형에 적합한 임의의 수의 부가적 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 단백질 의태체(protein mimetics)를 제공한다. 펩티드 의태체는 미국특허번호 제 5,668,110호와 그것에 인용된 참조문헌에 기술되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질은, 보호기(protecting groups)를 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 하나 이상의 아미노산의 측쇄에 첨가함으로써, 변형될 수 있다. 그러한 보호기는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 친수성을 감소시키고 친유성(lipophilicity)을 증가시킴으로써, 막(들)을 통한, 원한다면 소정의 조직(들)을 통한, 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 수송을 용이하게 할 수 있다. 적합한 보호기의 예는 당해 분야에서 알려진, 에스테르 보호기, 아민 보호기, 아실 보호기 및 카르복실 보호기(예, 미국특허번호 제 6,121,236호를 참조)를 포함한다. 본 발명의 합성 융합 단백질은 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 그의 자연적으로 발생하는 형상에서 구조적으로 변형되어 사이클 펩티드 또는 다른 구조적으로 변형된 펩티드를 형성할 수 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드는, 예컨대, 미국특허번호 제 4,179,337호, 제 4,301,144호, 제 4,496,689호, 제 4,640,835호, 제 4,670,417호 및 제 4,791,192호에 기술되는 바와 같이, 당해 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여, 하나 이상의 비단백질성 폴리머(nonproteinaceous polymers), 일반적으로 친수성 합성 폴리머, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에, 또는 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 유사한 폴리머에 연결될 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig, 멀티머성 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 멀티머성 변이체 CTLA-4-Ig) 및 비폴리펩티드 성분을 포함하는 접합체를 포함한다. 용어 “접합체”(또는 상호교환적으로 “접합성 폴리펩티드”)는 하나 이상의 폴리펩티드(들)를 하나 이상의 비폴리펩티드 성분에 공유적으로 부착시킴으로써 형성된 이종성(합성물 또는 키메라(chimeric)의 의미에서) 분자를 가리키는 것으로 의도된다. 용어 “공유 부착”은, 폴리펩티드와 비폴리펩티드 성분이, 서로 직접 공유적으로 합쳐지거나, 또는 폴리펩티드에 존재하는 부착기(attachment group)를 이용하여 다리, 스페이서 또는 연결 성분과 같은 개재 성분 또는 성분들을 통하여 서로 간접적으로 공유적으로 합쳐지는 것을, 의미한다. 바람직하게, 접합체는 적절한 농도 및 조건에서 가용성인데, 즉 혈액과 같은 생리적 유체에서 가용성이다. 본 발명의 접합 폴리펩티드의 예는 글리코실화 및/또는 페길화 폴리펩티드를 포함한다. 용어 “비접합 폴리펩티드”는 접합체의 폴리펩티드 부분에 대하여 사용될 수 있다. 그러한 접합체는 일반적으로 CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86) 및/또는 둘 중 하나의 또는 둘 다의 세포외 도메인(hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig을 포함함)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 그러한 면역 반응은, 예컨대, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성/생산, 활성화 마커의 유도, 염증성 분자의 생산, 염증, 항-콜라겐 Ab 생산, 및/또는 T 세포-의존성 Ab 반응을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 것들을 포함한다.
용어 “비폴리펩티드 성분”은 본 발명의 폴리펩티드의 부착기에 접합할 수 있는 분자를 가리키는 것으로 의도된다. 그러한 분자의 바람직한 예는 폴리머 분자, 당 성분, 친유성 화합물 또는 유기성 유도화 제제를 포함한다. 본 명세서에 기술된 접합체의 맥락에서 사용될 때, 비폴리펩티드 성분이 폴리펩티드의 부착기를 통하여 접합체의 폴리펩티드 부분에 연결된다는 것을 이해하게 될 것이다.
용어 “폴리머 분자”는 둘 이상의 모노머의 공유 연결에 의하여 형성된 분자로 정의되는데, 여기에서 모노머의 어떤 것도, 폴리머가 인간 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질인 경우를 제외하고는, 아미노산 잔기가 아니다. 용어 “폴리머”는 용어 “폴리머 분자”와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
N-글리코실화 자리는 서열 N-X-S/T/C를 가지는데, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이며, N은 아스파라긴이고, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌, 가장 바람직하게는 트레오닌이다.
“O-글리코실화 자리”는 세린 또는 트레오닌 잔기의 OH-기를 포함한다.
용어 “부착기”는, 폴리머 분자 또는 당 성분과 같이, 적절한 비폴리펩티드 성분과 결합할 수 있는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 기(group)를 가리키는 것으로 의도된다. 유용한 부착기의 비-제한적 예 및 일부 대응하는 비폴리펩티드 성분이 하기 표 2에 제공되어 있다.
| 부착기 | 아미노산 | 대응하는 비폴리펩티드 성분의 예 | 접합 방법/활성화 PEG의 예 | 참조문헌 |
| -NH2 | N-말단, Lys | PEG와 같은 폴리머 | mPEG-SPA mPEG2-NHS mPEG2- butyrALD |
Nektar Inc. 2003 카탈로그; 또한, Nektar Therapeutics, 2005-06 카탈로그를 참조 |
| -COOH | C-말단, Asp, Glu | PEG와 같은 폴리머, 당 성분 | mPEG-Hz 시험관 내 결합 |
Nektar, Inc. 2003 카탈로그; 또한 Nektar Therapeutics 2005-06 카탈로그를 참조 |
| -SH | Cys | PEG와 같은 폴리머, 당 성분 |
mPEG-VS mPEG2-MAL (mPEG-말레이미드) 시험관 내 결합 |
Nektar Inc. 2003 카탈로그; Nektar Therapeutics 2005-2006 카탈로그; Delgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4):249-304 (1992) |
| -OH | Ser, Thr, OH- | 당 성분 | 생체 내 O-연결성 글리코실화 | |
| -CONH2 | N-글리코실화 자리의 부분으로서 Asn | 당 성분 | 생체 내 N-글리코실화 | |
| 방향성 잔기 | Phe, Tyr, Trp | 당 성분 | 시험관 내 결합 | |
| -CONH2 | Gln | 당 성분 | 시험관 내 결합 | Yan과 Wold, Biochemistry, 1984, Jul 31; 23(16): 3759-65 |
| 알데하이드 케톤 | 산화 탄수화물 | PEG와 같은 폴리머, PEG-하이드라지드 | 페길화 | Andresz 등, 1978, Makromol. Chem. 179:301; WO 제 92/16555호, WO 제 00/23114호 |
| 구아니디노 | Arg | 당 성분 | 시험관 내 결합 | Lundblad와 Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI |
| 이미다졸 고리 | His | 당 성분 | 시험관 내 결합 | 구아니딘에 관함 |
생체 내 N-글리코실화에서, 용어 “부착기”는 N-글리코실화 자리(서열 N-X-S/T/C를 가짐, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이며, N은 아스파라긴이고, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌, 가장 바람직하게는 트레오닌임)를 구성하는 아미노산 잔기를 가리키는 독특한 방법에서 사용된다. N-글리코실화 자리의 아스파라긴 잔기가, 당 성분이 글리코실화 중에 부착되는 것일지라도, N-글리코실화 자리의 다른 아미노산 잔기가 존재하지 않는다면, 그러한 부착은 이루어질 수 없다. 따라서, 비폴리펩티드 성분이 당 성분이고 접합이 N-글리코실화에 의하여 이루어질 때, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변경과 연결되어 사용되는 용어 “비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기”는 N-글리코실화 자리를 구성하는 아미노산 잔기의 하나, 둘 또는 모두가, 기능적 N-글리코실화 자리가 아미노산 서열로 도입, 상기 서열로부터 제거되거나, 기능적 N-글리코실화 자리가 아미노산 서열에 유지되는(예, 이미 N-글리코실화 자리의 부분을 구성하는 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하거나 그 반대의 경우로 치환함으로써) 방식으로, 변경되는 것으로 이해될 것이다.
용어 “도입하다”(즉, “도입된” 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 “도입”)는 기존 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하나, 또한 부가적인 아미노산 잔기의 삽입을 의미하는 것으로 주로 의도된다.
용어 “제거하다”(즉, “제거된” 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 “제거”)는 제거될 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하나, 또한 제거될 아미노산의 결실(치환 없이)을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 “비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기”는 아미노산 잔기가, 비폴리펩티드 성분이 결합하거나(도입된 아미노산 잔기의 경우에) 결합했던(제거된 아미노산 잔기의 경우에) 것이라는 것을 가리키는 것으로 의도된다.
비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기를 제거 및/또는 도입함으로써, 분자를 선택의 비폴리펩티드 성분에 더 쉽게 접합하도록 본 발명의 폴리펩티드를 명확하게 적응시켜, 접합 패턴을 최적화시키는 것(예, 폴리펩티드의 표면 상에서 비폴리펩티드 성분의 최적 분포를 확보하고 따라서, 예컨대, 에피토프와 폴리펩티드의 다른 표면 부분을 그의 기능을 크게 손상시키지 않고 효과적으로 보호하는 것)이 가능하다. 예컨대, 부착기의 도입에 의하여, 폴리펩티드는 적절한 비폴리펩티드 성분이 결합하는 특이적 아미노산 잔기의 내용에 있어서 변경되고, 그것에 의하여 더 효율적이고, 특이적이고, 및/또는 광범위한 접합이 성취된다. 하나 이상의 부착기의 제거에 의하여, 그러한 접합이 불리한 폴리펩티드의 부분에서 비폴리펩티드 성분, 예컨대, 폴리펩티드의 기능적 자리에 또는 그 근처에 위치하는 아미노산 잔기로의 접합을 회피하는 것이 가능하다(그러한 자리에서의 접합은 CD80- 또는 CD86- 결합을 비활성화하거나 감소시키거나, 혹은 그 결과의 접합체의 면역억제 활성을 감소시키므로). 추가적으로, 다른 부착기에 근접하여 위치하는 부착기를 제거하는 것이 유리할 수 있다.
기존 잔기, 또는 제거된 혹은 도입된 잔기이건 간에, 비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기는 비폴리펩티드 성분의 성질에 근거하여, 그리고 일부 경우에는, 이용될 접합 방법에 근거하여 선택된다. 예를 들어, 비폴리펩티드 성분이, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리알킬렌 산화물(polyalkylene oxide, POA) 유도성 분자와 같은, 폴리머 분자일 때, 부착기로서 기능할 수 있는 아미노산 잔기는 시스테인, 리신(및/또는 폴리펩티드의 N-말단 아미노기), 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘 및 아르기닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 비폴리펩티드 성분이 당 성분일 때, 부착기는 생체 내 또는 시험관 내 N- 또는 O- 글리코실화 자리, 바람직하게는 N-글리코실화 자리이다.
일부 경우에, 본 발명의 접합체의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 부분에서, 수용체 결합 자리에 또는 그 근처에 위치하는 부착기는, 그러한 기를 포함하는 아미노산 잔기의 치환과 같은 것에 의하여, 제거된다. 일부 경우에, 시스테인 또는 리신과 같은, 비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기는 종종 변이체 CTLA-4 폴리펩티드의 수용체 결합 자리에서 또는 그 근처에서 종종 도입되지 않는다.
본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드는 보호하기 위하여 변형될 수 있고 따라서, 비폴리펩티드 성분으로의 접합에 의하여, 변이체 CTLA-4 폴리펩티드에 존재하는 에피토프를 변형하거나 파괴시키거나, 그렇지 않으면 불활성화시킨다. 변이체 CTLA-4 폴리펩티드의 에피토프는, 당해 분야에서 알려진 방법은 물론이고, 에피토프 맵핑으로 알려진 방법을 이용함으로써, 확인될 수 있다. 예컨대, Romagnoli 등, J. Biol. Chem. 380(5):553-9 (1999), DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11-20, Van de Water 등, Clin. Immunol. Immunopathol. 85(3):229-35 (1997), Saint-Remy JM, Toxicology 119(1):77-81 (1997)을 참조.
접합에 이용가능하고 변이체 CTLA-4 폴리펩티드에 존재하는 부착기의 정확한 수는, 접합에 의하여 달성되기 원하는 효과에 의존한다. 얻어질 효과는, 예컨대, 접합의 성질 및 정도(예, 비폴리펩티드 성분의 동일성, 접합되어야 할 또는 접합이 회피되어야 하는 곳에서, 폴리펩티드에 대한 접합체에 바람직한 또는 가능한 비폴리펩티드 성분의 수 등)에 의존한다. 예를 들어, 감소된 면역원성을 원한다면, 부착기의 수(및 위치)는 대부분 또는 모든 에피토프를 보호하기에 충분해야 한다. 이것은, 변이체 CTLA-4 폴리펩티드의 더 큰 부분이 보호될 때, 정상적으로 얻어진다. 에피토프의 효과적인 보호는, 접합에 이용가능한 부착기의 총 수가 1개-6개의 부착기의 범위, 예컨대, 1개, 2개 또는 3개의 부착기와 같이, 1개-3개의 범위 내에서와 같은, 1개-5개 의 범위 내에 있을 때, 정상적으로 얻어진다.
기능적인 생체 내 반감기는 접합체의 분자량에 의존할 수 있으며, 증가된 반감기를 제공하는데 필요한 부착기의 수는 의문의 비폴리펩티드 성분의 분자량에 의존한다. 일부 그러한 접합체는 1개-6개, 예컨대, 1개, 2개 또는 3개의 비폴리펩티드 성분의 1개-3개와 같은 1개-5개를 포함하는데, 각각은 약 200Da, 약 300Da, 400Da, 약 600Da, 약 900Da, 약 1000Da과 같은 약 100-2000달톤(Da), 또는 약 2kDa, 약 5kDa, 약 12kDa, 약 15kDa, 약 20kDa, 약 30kDa, 약 40kDa과 같은 약 2-40kDa, 또는 약 60kDa의 분자량을 가진다.
본 발명의 접합체에서, 일부, 대부분 또는 실질적으로 모든, 접합 가능한 부착기를 적절한 비폴리펩티드 성분이 차지한다.
본 발명의 접합체는 다음 개선된 성질 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: (a) 증가된 혈청 반감기 및/또는 기능적인 생체 내 반감기, (b) 감소된 항원성 또는 면역원성, (c) 증가된 저장 안정성, (d) 증가된 생체이용률, (e) 감소된 효과기 기능, 또는 (f) 본 발명의 둘 이상의 분자들 사이에서의 감소된 또는 저해된 자기-결합(self-association)(예, 감소된 응집물 형성). 예를 들어, 접합체는, hCTLA-4와 비교하여 또는 대응하는 비접합체 폴리펩티드와 비교하여 감소된 면역원성, 예컨대 적어도 25%의 감소, 적어도 50%의 감소와 같은, 적어도 10%의 감소를, 예컨대 비접합 폴리펩티드에 비하여 또는 hCTLA-4에 비하여 적어도 75%의 감소를 나타낼 수 있다. 접합체는, hCTLA-4와 같은 참조 분자와 비교하여 또는 대응하는 비접합 폴리펩티드와 비교하여 증가된 기능적 생체 내 반감기 및/또는 증가된 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 특히 바람직한 접합체는, 상기 접합체의 기능적 생체 내 반감기(또는 혈청 반감기)와 상기 참조 분자의 기능적 생체 내 반감기(또는 혈청 반감기) 사이의 비율이 적어도 1.50와 같은, 적어도 1.75와 같은, 적어도 2와 같은, 적어도 3과 같은, 적어도 4와 같은, 적어도 5와 같은, 적어도 6과 같은, 적어도 7과 같은, 적어도 8과 같은, 적어도 1.25일 경우의, 그러한 접합체이다. 반감기는 래트(rat) 또는 원숭이과 같은, 실험 동물에서 통상적으로 결정되고, 정맥내 또는 피하 투여에 근거할 수 있다. 추가적인 양태에서, 접합체는 hCTLA-4 또는 대응하는 비접합체 폴리펩티드와 같은 참조 분자에 비하여 증가된 생체이용률을 나타낼 수 있다.
폴리펩티드에 결합될 폴리머 분자는, 일반적으로, 300-20,000Da과 같은 300-100,000Da의 범위, 더 바람직하게는 500-10,000Da의 범위, 더욱 더 바람직하게는 500-5000Da의 범위의 분자량을 가지는, 천연 또는 합성 호모폴리머 또는 헤테로폴리머와 같은, 임의의 적합한 폴리머 분자일 수 있다.
호모폴리머의 예는 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, poly-COOH)을 포함한다. 헤테로폴리머는, 예컨대 하이드록실기 및 아민기와 같은 하나 이상의 상이한 결합기를 포함하는 폴리머이다. 적합한 폴리머 분자의 예는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 폴리프로필렌 글리콜(PPG)과 같은, 폴리알킬렌 글리콜(PAG)을 포함하는 폴리알킬렌 산화물(polyalkylene oxide, PAO), 분지형 PEGs, 폴리-비닐 알코올(PVA), 폴리-카르복실레이트, 폴리-(비닐피롤리돈), 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말산 무수물, 카르복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 또는 면역원성을 감소시키고 및/또는 기능적 생체 내 반감기 및/또는 혈청 반감기를 증가시키기에 적합한 임의의 다른 생체폴리머로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리머 분자를 포함한다. 폴리머 분자의 다른 예는 인간 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질이다. 일반적으로, 폴리알킬렌 글리콜-유도성 폴리머는 생적합성(biocompatible)이고, 비-독성이고, 비-항원성이고, 비-면역원성이고, 다양한 수용성 성질을 가지며, 살아있는 유기체로부터 용이하게 분비된다.
PEG는, 예컨대 덱스트란 등과 같은 다당류에 비하여 가교-결합(cross-linking)할 수 있는 반응기가 거의 없기 때문에, 사용하기에 바람직한 폴리머이다. 특히, 단일기능성 PEG, 예컨대 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)은, 그의 결합 화학적 성질이 상대적으로 간단하기 때문에(하나의 반응기만이 폴리펩티드 상의 부착기와 접합하는데 이용가능함), 흥미롭다. 결과적으로, 가교-결합의 위험이 제거되고, 그 결과의 폴리펩티드 접합체는 더욱 동종적이며, 폴리머 분자와 폴리펩티드의 반응은 조절하기 더 쉬워진다. 분자가 페길화되면, 그것은 보통 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함한다. 각 PEG 분자는 약 5kDa(킬로달톤) 내지 100kDa, 예컨대 약 10kDa, 약 12kDa, 약 20kDa, 약 40kDa을 포함하는 분자량을 가질 수 있다. 적합한 PEG 분자는 Shearwater Polymers사 및 Enzon사로부터 입수가능하며, SS-PEG, NPC-PEG, 알데하이드-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, 트레실화(tresylated) mPEG(미국특허번호 제 5,880,255호), 또는 옥시카르보닐-옥시-N-디카르복시이미드-PEG (미국특허번호 제 5,122,614호)로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리형 또는 합성 접합체를 제공한다: (a) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig, 멀티머성 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 멀티머성 변이체 CTLA-4-Ig); 및 (b) 예컨대, 폴리펩티드에 부착된 1-10개, 1-9개, 1-8개, 1-7개, 1-7개, 1-6개, 1-5개, 1-4개, 1-3개, 1개, 2개, 또는 3개의 비폴리펩티드 성분과 같은, 적어도 하나의 비폴리펩티드 성분, 여기에서 접합체는 CD80(예, hCD80) 및/또는 CD86(예, hCD86) 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 세포외 도메인(hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig을 포함함)에 결합하고, 및/또는 면역 반응(예, T 세포-의존성 면역 반응)을 유도하는 능력을 가진다. 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 것들을 포함한다. 일부 경우에, 접합체는 하나의 비폴리펩티드 성분을 포함한다. 일부 경우에, 접합체는 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 비폴리펩티드 성분을 포함한다. 일부 경우에, 접합체의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는데, 그 각각은 비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 도입한다(예, 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기를 비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 상이한 잔기로 치환함으로써, 또는 비폴리펩티드 성분에 대한 부착기를 포함하는 부가적인 아미노산 잔기를 폴리펩티드 서열로 삽입함으로써).
접합체는 본 발명의 둘 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 비폴리펩티드 성분은 그러한 폴리펩티드의 둘 중의 하나 또는 둘 다에 공유적으로 부착된다. 접합체가 본 발명의 둘 이상의 동일한 폴리펩티드를 포함한다면, 동일한 타입 및 수의 비폴리펩티드 성분은 일반적으로 각각의 그러한 폴리펩티드에, 보통 각 폴리펩티드 상의 대응하는 부착기(들)에 동일한 방식으로, 부착된다. 상기에 주지된 바와 같이, 비폴리펩티드 성분은, 예컨대 N-글리코실화 자리에 선택적으로 부착될 수 있는 당 성분, 또는 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 성분과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 성분은 본 발명의 폴리펩티드의 시스테인 잔기 또는 리신 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 경우에, 폴리에틸렌 글리콜 성분은 폴리펩티드의 N-말단 아미노기에 공유적으로 부착된다. 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig를 포함하는 접합체는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 접합체로서 기술될 수 있다. 또한 접합체의 멀티머가 포함된다. 멀티머성 접합체는 둘 이상의 접합체를 포함하는데, 여기에서 적어도 하나의 접합체는 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 접합체이다. 멀티머성 접합체 내의 접합체는, 그럴 필요는 없지만, 서로 동일할 수 있다.
상기에서 검토된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는, 통상적으로 글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 융합 단백질은, 예컨대, 수산화(hydroxylation), 지질 또는 지질 유도-부착, 메틸화, 미리스틸화(myristylation), 페길화, 인산화 및 황산화(sulfation)를 포함하는 번역후 변형(post-translational modification)의 다른 형태를 받을 수 있다(또는 받도록 변형됨). 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질이 받게 될 수 있는 다른 번역후 변형은, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화(ribosylation), 아미드화(amidation), 플라빈의 공유 부착, 헴(heme) 성분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨(phosphotidylinositol)의 공유 부착, 가교-결합, 사이클화(cyclization), 이황화 결합 형성, 디메틸화(demethylation), 포르밀화(formylation), GPI 고착(anchor) 형성, 요오드화(iodination), 산화(oxidation), 단백질분해 가공(proteolytic processing), 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 셀레노일화(selenoylation), 아르기닐화(arginylation) 및 유비큐틴화(ubiquitination)를 포함한다. 다른 통상적인 단백질 변형은, 예컨대, 상기 Creighton, Seifter 등, Meth. Enzymol. 18:626-646 (1990), 및 Rattan 등, Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62 (1992)에 기술되어 있다. 숙주 세포 내의 핵산으로부터 발현되는 폴리펩티드 또는 융합 단백질에서의 번역후 변형은 펩티드가 어떤 종류의 숙주 또는 숙주 세포 타입에서 발현되는가에 따라 다양하다. 예를 들어, 글리코실화는 E. coli 같은 박테리아 숙주 내에서는 자주 일어나지 않으며, 포유류 세포 시스템에 비하여 베큘로바이러스(baculovirus) 시스템에서 상당히 변한다. 따라서, 글리코실화(보통 본 발명의 대부분의 폴리펩티드에서의 경우에)를 원한다면, 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 글리코실화 숙주, 일반적으로 진핵생물 세포(예, 포유류 세포 또는 곤충 세포) 내에서 발현(생산)되어야 한다. 번역후 변형의 관점에서 폴리펩티드 또는 융합 단백질로의 변형은, 예컨대, X-레이 회절, NMR 이미징, 질량 분석계, 및/또는 크로마토그래피(예, 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 또는 GLC)를 포함하여, 임의의 적합한 기술에 의하여 증명될 수 있다.
또한 또는 대안적으로, 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 임의의 적합한 수의 비-자연적으로 발생하는 아미노산(예, β 아미노산) 및/또는 대체 아미노산(예, 셀레노시스테인(selenocysteine)), 또는 MANUAL OF PATENT EXAMINING PROCEDURE § 2422 (7번째 수정 - 2000)에 열거된 것들과 같은, 아미노산 유사체를 포함할 수 있는데, 이것은 고체 상태 단백질 합성(solid phase protein synthesis)(예, Merrifield, Adv. Enzymol. 32:221-296 (1969) 및 본 명세서에 인용된 다른 참조문헌에 기술됨)과 같은 것을 통하여, 단백질 합성에 의하여 편입된다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 추가로 적어도 하나의 변형 아미노산의 내포(inclusion)에 의하여 변형될 수 있다. 하나 이상의 변형 아미노산의 내포는, 예를 들어, (a) 폴리펩티드 또는 융합 단백질 혈청 반감기를 증가시킴, (b) 폴리펩티드 또는 융합 단백질 항원성을 감소시킴, 또는 (c) 폴리펩티드 또는 융합 단백질 저장 안정성을 증가시킴에 있어서 이로울 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합 생산(예컨대, 포유류 세포 내의 발현 중에 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결성 글리코실화 자리) 중에 번역에 수반하여(co-translationally) 또는 번역 후에(post-translationally) 변형되거나 합성 수단에 의하여 변형된다. 변형 아미노산의 비-제한적인 예는 글리코실화 아미노산, 황산화 아미노산, 프레닐화(예, 파르네실화, 제라닐제라닐화(geranylgeranylated)) 아미노산, 아세틸화 아미노산, 아실화 아미노산, 페길화 아미노산, 비오티닐화 아미노산, 카르복실화 아미노산, 포스포릴화 아미노산 등을 포함한다. 아미노산의 변형에서 기술자를 가이드하기에 적절한 참조문헌은 문헌들 전체에 걸쳐 풍부하게 있다. 예시적인 프로토콜이 Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, Towata, NJ에 있다. 변형 아미노산은 글리코실화 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오티닐화 아미노산, 지질 성분에 접합되는 아미노산, 및 유기성 유도화 제제에 접합되는 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드 (또는 융합 단백질)의 생물학적 기능(예, 면역원성, 표적화(targeting) 및/또는 반감기)에 영향을 주는 부가적인 아미노산 서열을 추가로 포함하는 상기-기술된 특징들을 가지는 폴리펩티드(융합 단백질을 포함함)를 추가로 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질은, 신호 서열 이외에 또는 이에 덧붙여서 표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 특정 세포 타입(예, 단핵백혈구(monocyte), 수지상 세포(dendritic cell) 또는 관련 세포) 상의 수용체를 표적화하여 그러한 세포 및/또는 관련 조직으로 폴리펩티드를 표적 운송하는 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 상기에 기술되어 있고, 막 위치결정(localization)/고착(anchor) 서열(예, 정지 운송 서열, GPI 고착 서열) 등을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 포함함)에 대한 특히 유용한 융합 파트너는 폴리펩티드, 예컨대, 폴리펩티드 정제 부분서열의 정제를 용이하게 하는 펩티드 서열이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예컨대, 인코딩된 폴리펩티드의 정제를 용이하게하는 마커 아미노산 서열에 프레임 내로(in frame) 융합된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 그러한 정제 용이화 펩티드 도메인 또는 폴리펩티드 정제 부분서열은, 헥사-히스티딘 펩티드 또는 다른 폴리히스티딘 서열과 같이, 고정화 금속 상에서 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩티드(metal chelating peptide), 그러한 태그가 QIAGEN사(Chatsworth, California)로부터 입수가능한 pQE 벡터 내에 편입되는 서열 인코딩, 글루타티온(glutathione)(예, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST))에 결합하는 서열, 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 태그(인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도되는 에피토프에 대응함; Wilson 등, Cell 37:767 (1984)), 말토오스 결합 단백질 서열, FLAGS 확장/친화도 정제 시스템(Immunex사, Seattle, WA)에 이용되는 FLAG 에피토프(통상적으로 입수가능한 FLAG 에티토프는 Kodak (New Haven, Connecticut)을 통하여도 입수 가능함), E-에피토프 태그(E-tag), 티오레독신(TRX), 아비딘, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 정제-용이화 에피토프 태그는 당해 분야에서 기술되어 있었다(예, Whitehorn 등, Biotechnology 13:1215-19 (1995)을 참조). 폴리펩티드는 e-his 태그를 포함할 수 있는 데, 이는 폴리히스티딘 서열 및 항-e-에피토프 서열(Pharmacia Biotech 카탈로그)을 포함할 수 있으며; e-his 태그는 표준 기술에 의하여 만들어질 수 있다. 정제 도메인과 폴리펩티드 사이의 프로테아제-절단성 폴리펩티드 링커 서열의 내포는 정제를 용이하게 하는데 유용하다. 히스티딘 잔기는 IMIAC(Porath 등 Protein Expression and Purification 3:263-281 (1992)에 기술된, 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피(immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)) 상에서 정제를 용이하게 하는데, 반면에 엔테로키나아제 절단 자리는 융합 단백질로부터 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다. 또한 pGEX 벡터(Promega; Madison, WI)는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase, GST)를 가지는 융합 단백질로서 외부 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이며, 리간드-아가로스 비드(예, GST-융합의 경우 글루타티온-아가로스)로의 흡착에 의하여 이어서 자유 리간드의 존재하에서의 용출에 의하여, 용해된 세포(lysed cells)로부터 쉽게 정제될 수 있다. 폴리펩티드 정제 용이화 부분서열의 부가적인 예와 단백질 정제에서 그의 이용은, 예컨대, 국제특허출원 공개번호 제 WO 00/15823호에 기술되어 있다. 관심의 폴리펩티드의 발현 및 그러한 융합 파트너에 의하여 또는 그렇지 않다면 상기에서 기술된 것에 의한 그것의 분리 후에, 단백질 리폴딩(refolding) 단계는, 원한다면, 성숙 단백질의 형상을 완성하는데에 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질의 검출을 증진시키는 하나 이상의 부가적인 펩티드 단편 또는 펩티드 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 펩티드 단편 또는 부분(예, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), β-갈락토시다아제 또는 그의 검출가능한 도메인)은 융합 단백질에 편입될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 접합될 수 있는 부가적인 마커 분자는 방사성핵종(radionuclides), 효소, 형광물질(fluorophores), 소분자 리간드, 등을 포함한다. 그러한 검출-증진성 융합 파트너는 본 명세서의 다른 부분에서 검토된 진단 기술에 사용되는 융합 단백질에 특히 유용하다.
다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 안정성, 폴리펩티드의 분비(신호 표적화에 의한 것 이외에), 또는 둘 다를 증진시키는 융합 파트너를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는, Fc 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG 폴리펩티드와 같은, 면역글로불린(Ig) 도메인을 포함할 수 있는데, 이는 폴리펩티드의 안정성 및/또는 분비를 증진시킨다.
융합 단백질 펩티드 단편들 또는 펩티드 부분들은 임의의 적합한 방식으로 결합될 수 있다. 융합 단백질의 다양한 폴리펩티드 단편들 또는 부분들은 공유적으로 결합될 수 있다(예, 펩티드 또는 이황화 결합에 의하여). 폴리펩티드 단편들 또는 부분들은 직접적으로 융합될 수 있다(예, 본 발명의 항원성 또는 면역원성 서열의 C-말단은 정제 서열 또는 이종 면역원성 서열의 N-말단으로 융합될 수 있음). 융합 단백질은 펩티드 부분들 사이에서 또는 그 안에서, 임의의 적합한 수의 변형 결합, 예컨대, 등입체(isosteres)를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 융합 단백질은, 생물학적으로 활성인 펩티드 부분들의 일부를 형성하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 단편들 또는 부분들 사이의 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 펩티드 링커가 이용될 수 있다. 그러한 링커는 임의의 적합한 크기일 수 있다. 일반적으로, 링커는 약 30개 아미노산 잔기 이하, 약 20개 아미노산 잔기 이하, 및/또는 10개 아미노산 잔기 이하이다. 링커는 대부분 중성 아미노산 잔기를 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 적합한 링커는 일반적으로, 예컨대, 미국특허번호 제 5,990,275호, 제 6,010,883호, 제 6,197,946호, 및 유럽특허출원번호 제 0 035 384호에 기술되어 있다. 펩티드 단편들 또는 펩티드 부분들의 분리를 원한다면, 분리를 용이하게 하는 링커가 이용될 수 있다. 그러한 링커의 예가 미국특허번호 제 4,719,326호에 기술되어 있다. 글리세린 및/또는 세린 잔기의 조합으로 일반적으로 이루어진, “유연한(flexible)” 링커가 유익할 수 있다. 그러한 링커의 예가, 예컨대, McCafferty 등, Nature 348:552-554 (1990), Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988), Glockshuber 등, Biochemistry 29:1362-1367 (1990), 및 Cheadle 등, Molecular Immunol. 29:21-30 (1992), Bird 등, Science 242:423-26 (1988), 및 미국특허번호 제 5,672,683호, 제 6,165,476호 및 제 6,132,992호에 기술되어 있다.
또한 링커의 이용은 두 개의 펩티드 단편 또는 펩티드 부분의 융합에 의하여 생성되는 융합 단백질에 대한 원하지 않는 면역 반응을 감소시킬 수 있는데, 이것은 융합 단백질에 존재하는 의도하지 않은 MHC I 및/또는 MHC II 에피토프를 생기게 할 수 있다. 링커의 이용에 더하여, 확인된 원하지 않은 에피토프 서열 또는 이웃한 서열은 페길화되어(예, PEG 부착을 증진시키기 위한 리신 잔기의 삽입에 의하여) 확인된 에피토프를 노출로부터 보호할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 면역원성을 감소시키기 위한 다른 기술은 융합 단백질의 투여와 결합하여 이용될 수 있고, 미국특허번호 제 6,093,699호에 제공된 기술을 포함한다.
폴리펩티드의 제조
본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 포함함)를 생산하고 분리하기 위한 재조합 방법이 하기에 기술되어 있다. 재조합 생산에 더하여, 폴리펩티드는 고체-상태 기술(solid-phase techniques)을 이용하여 직접 펩티드 합성에 의하여 생산될 수 있다(예, Stewart 등 (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co, San Francisco; Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc 85:2149-2154를 참조). 펩티드 합성은 수작업 기술을 이용하여 또는 자동화에 의하여 실시될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들면, 제조업자에 의하여 제공된 지시에 따라 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 이용하여, 성취될 수 있다. 예를 들면, 부분서열(subsequences)은 별도로 화학적으로 합성되며 화합적인 방법을 이용하여 조합되어 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 대안적으로, 그러한 서열은 폴리펩티드의 생산을 전문으로 하는 임의의 수의 회사로부터 주문될 수 있다. 가장 통상적으로, 예컨대, 하기에 기술되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 코딩 핵산을 발현하고 폴리펩티드를 회수함으로써 생산된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(융합 단백질을 포함함)를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 그러한 방법은, 조절 서열에 기능적으로 연결되어 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는, 본 명세서에 기술된 임의의 핵산을 세포의 집단에 도입하고, 그 세포를 배양 배지에서 배양하여 폴리펩티드를 생산하고, 이어서 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함한다. 세포 (형질감염) 및/또는 폴리펩티드의 발현에 의하여 흡수를 용이하게 하는데 충분한 핵산의 양이 이용된다. 배양 배지는 본 명세서 및 실시예들에서 기술될 수 있다. 부가적인 배지가 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다. 핵산은, 예컨대, 주사, 무침 주사 장치(needleless injection device), 유전자총(gene gun), 전기천공(electroporation)(예, DNA 전기천공 장치, Inovio Biomedical사 (San Diego)), 경피 전달(transdermal delivery), 수동 흡수(passive uptake) 등을 포함하여, 본 명세서에 기술된 임의의 전달 방법에 의하여 그러한 세포로 도입된다. 본 발명의 핵산은, DNA 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 벡터를 포함하여, 재조합 발현 벡터와 같은, 벡터의 부분일 수 있다. 핵산 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터는, 본 명세서에서, 상기에서, 그리고 하기 실시예들에서 기술된 바와 같이 제조되고 제형화될 수 있다. 그러한 핵산 또는 발현 벡터가 생체 내에서 포유류의 세포의 집단에 도입될 수 있거나, 포유류의 선택된 세포(예, 종양 세포)가 포유류 또는 인코딩된 폴리펩티드가 흡수하고 발현하도록 하는 충분한 양으로 그러한 세포의 집단으로 생체 외에서 도입된 핵산 발현 벡터로부터 제거될 수 있다. 또는, 핵산 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터는 배양된 세포를 이용하여 시험관 내에서 생산된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법은 세포의 집단으로 본 명세서에 기술된 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를, 벡터의 흡수 및 폴리펩티드의 발현이 일어나게 될 양 및 제조법(formula)으로, 도입하고; 본 명세서에 기술된 임의의 도입/전달 포맷에 의하여 발현 벡터를 포유류에 투여하며; 및 포유류로부터 또는 포유류의 부산물로부터 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함한다. 적합한 숙주 세포, 발현 벡터, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 감염하는 방법, 세포 배양, 및 세포 배양에서 그러한 폴리펩티드를 생산하고 회수하는 절차는 하기의 “본 발명의 핵산”이라 제목지어진 섹션에서 자세히 기술되어 있다. 추가적인 생산 방법은 아래의 실시예에 검토되어 있다.
상기에 주지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 포함함)는, 보존적이거나 비보존적인, 하나 이상의 아미노산 또는 핵산 삽입, 결실, 및 치환과 같은, 다양한 변화를 받게 되는데, 이는, 예컨대 그러한 변화가 그것들의 이용에서, 예컨대 그것들의 치료적 또는 예방적 이용 또는 투여 또는 진단 응용에서 소정의 이점을 제공할 수 있는 곳을 포함한다. 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 추가를 이용하여 폴리펩티드의 변형체를 만드는 절차는 당해 분야에서는 흔히 있는 것이다. 본 명세서의 다른 부분에서 자세히 기술된 바와 같이, CD80 및/또는 CD86, 또는 그의 단편(예, ECD)에 결합하는 능력 또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 억제하는 능력을 원하는 정도로 가지는, 폴리펩티드 및 그의 변형체는, 당해 분야의 기술자들에게 알려진 분석에 의하여 그리고 본 명세서에 기술된 분석에 의하여 용이하게 확인된다. 예컨대, 하기 실시예에 제시된 분석을 참조.
또한, 아래에서 더 자세히 검토되는, 본 발명의 핵산은, 특정 코돈이 동일한 또는 상이한 아미노산을 인코딩하여 보존적인 또는 비보존적인 치환을 하게 되는, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 치환, 또는 서열 내의 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 결실과 같은 다양한 변화를 받을 수 있다. 또한 핵산은 발현 시스템(예, 포유류 세포 또는 포유류 발현 시스템)에서 최적의 발현을 위해 제공하는 하나 이상의 코돈을 포함하도록 변형될 수 있는데, 원한다면, 상기 하나 이상의 코돈은 여전히 동일한 아미노산(들)을 인코딩한다. 핵산 치환, 결실, 삽입 및 추가를 이용함으로써 핵산의 변형체를 만들고 코돈을 축퇴시키는 절차는 당해 분야에서 흔히 있는 것이며, 본 명세서에서 기술되는 원하는 성질(예, CD80 및/또는 CD86에 결합하고, 및/또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응을 억제하는 능력)을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 변형체는 본 명세서에서 기술된 분석을 이용하여 용이하게 확인된다. 그러한 핵산 변화는 그의 치료적 또는 예방적 이용 또는 투여, 또는 진단 응용에서 소정의 이점을 제공할 수 있다. 하나의 양태에서, 핵산과 폴리펩티드는, 그것들이 본 발명의 각각의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 변이체CTLA-4 폴리펩티드의 핵산 서열과 실질적으로 동일한 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 각각 포함하는 한, 수 많은 방법으로 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산
본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는, “본 발명의 핵산”(또는 “본 발명의 폴리뉴클레오티드”)으로 총괄적으로 지칭되는, 분리형 또는 재조합형 핵산(본 명세서에서 폴리뉴클레오티드라고도 지칭됨)을 제공한다. 하기 기술된 모든 것으로 포함하는, 본 발명의 핵산은, 일반적으로 폴리펩티드 또는 그의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드 발현 벡터의 발현을 통하여; 치료법으로서; 예방법으로서; 진단 도구로서; 상보적인 또는 부분적으로 상보적인 핵산(야생형 CTLA-4 핵산의 검출을 포함함)의 존재를 위한 진단 프로브(probe)로서, 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산(예, 발현)에 있어서 유용하다. 예를 들면, 하기에 기술된 모든 것을 포함하는, 본 발명의 핵산은, 그것들이, 시험관 내 및/또는 생체 내 응용에서, 예컨대, 면역 반응의 억제가 바람직한 면역계 질환, 장애 및 이상을 치료하는 예방적 및/또는 치료적 방법(예, 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 방법 및 수용자에 의한 공여자로부터의 조직, 세포 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법)을 포함하여, 면역 반응(예, T 세포 활성화, T 세포 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존성 항체 반응)을 억제하거나 저해하는 데에 유용한 폴리펩티드를 인코딩하기 때문에, 유용하다. 또한 본 발명의 핵산은 유전자 치료, DNA 백신, 및 면역억제 치료에 유용한 발현 벡터로 편입될 수 있다. 그러한 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 및 벡터의 추가적인 이용이 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 “본 발명의 폴리펩티드”로 제목지어진 섹션 및 본 명세서의 다른 부분에서 상기에 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드(임의의 융합 단백질 등을 포함함)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 상기에서 그리고 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 본 발명의 둘 이상의 임의의 폴리펩티드(임의의 융합 단백질을 포함함)의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공한다. 또한, 예컨대, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질과 같은, 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함되는데, 이것은 인간과 같은, 포유류 숙주에서 발현에 실질적으로 최적화된 코돈의 서열을 포함한다.
예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은, 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서, 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 또는 CD80 및/또는 CD86의 폴리펩티드 단편(예, CD80 및/또는 CD86의 세포외 도메인)에 결합하고, 및/또는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응을 억제한다. 그러한 폴리펩티드의 기능적 성질 및 특징에 관한 추가적으로 상세한 내용이 상기 “본 발명의 폴리펩티드”에서 검토되어 있다. 일부 그러한 핵산은, hCTLA-4 ECD의 아미노산 잔기 길이; 예컨대, 110-138개, 112-132개, 118-130개,119-129개, 120-128개, 121-127개, 122-126개, 123-125개, 또는 124개의 아미노산 잔기에 거의 동일한 아미노산 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 서열번호 1-73에 제시된 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 예시적인 핵산은, 각각, 서열번호 80-152에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산이지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 서열번호 1(클론 D3-1)에 나타낸 폴리펩티드를 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 80에 나타낸 핵산이다. 또한, 임의의 그러한 핵산의 단편이 포함되는데, 여기에서 그러한 단편은 CD80 및/또는 CD86 및/또는 둘 중의 하나 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하는 능력을 가진 폴리펩티드를 인코딩한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 잔기 이하)로 상이하고 (b) 여기에서 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서의 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기가 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 상기 폴리펩티드 서열의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응을 저해한다. 즉, 그러한 선택된 폴리펩티드 서열 내의 그러한 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서의 아미노산 잔기는 결실되거나 치환되지 않는다. 일부 그러한 핵산은, 선택된 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하며, 선택된 폴리펩티드 서열 내의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 위치 24, 30, 32, 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70, 85, 104 및 106으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및/또는 14개의 위치에서 아미노산 잔기를 포함하는, 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 그러한 폴리펩티드는 아미노산 결실(들), 추가(들), 및/또는 아미노산 치환(들)에 의하여 선택된 폴리펩티드 서열과 상이할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 예시적인 보존적 치환은 “서열 변형”으로 제목지어진 섹션에서 검토되어 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 약 118-130개, 119-129개, 120-128개, 121- 127개, 122-126개, 123-125개 또는 124개 아미노산 잔기의 길이를 가지는 서열을 포함한다. 그러한 폴리펩티드의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적인 상세한 설명은 상기에 검토되어 있다. 예시적인 핵산은 서열번호 80-152에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고 (b) 서열번호 159의 폴리펩티드 서열에 관하여 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 면역 반응을 저해한다. 일부 그러한 핵산은 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 및 85로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 제시된 서열에 관한 위치에서 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 그러한 핵산은 서열번호 159에 관하여 위치 104 및/또는 30에 대응하는 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 그러한 핵산은 위치 70(예, S70F), 위치 64(예, S64P), 위치 50(예, A50M), 위치 54(예, M54K/V), 위치 65(예, I65S), 위치 56(예, N56D), 위치 55(예, G55E), 위치 85(예, M85A), 및/또는 위치 24(예, A24E)에서 서열번호 159에 관한 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 그러한 폴리펩티드는 위치 104(선택적으로 L104E/D, 예, L104E), 위치 30 (예, T30N/D/A), 및/또는 위치 32(예, V32I)에서 서열번호 159에 관한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 그러한 핵산은 A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 그러한 인코딩된 폴리펩티드는 약 118-130개, 119-129개, 120-128개, 121- 127개, 122-126개, 123-125개, 또는 124개의 아미노산 잔기의 아미노산 길이를 가지는 서열을 포함한다. 그러한 폴리펩티드의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적으로 상세한 내용이 상기에 검토되어 있다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 임의의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성, 및 (ii) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 상기 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌 잔기를, 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86 또는 그의 ECD에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해한다. 일부 그러한 핵산은 선택된 서열에 관한 다음 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다: 위치 24에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산 잔기; 위치 30에 대응하는 아미노산 위치에서 아스파라긴 잔기; 위치 32에 대응하는 아미노산 위치에서 이소류신 잔기; 위치 50에 대응하는 아미노산 위치에서 메티오닌 잔기; 위치 54에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 잔기; 위치 55에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산 잔기; 위치 56에 대응하는 아미노산 위치에서 아스파르트산 잔기; 위치 64에 대응하는 아미노산 위치에서 프롤린 잔기; 위치 65에 대응하는 아미노산 위치에서 세린 잔기; 위치 104에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산 잔기. 일부 그러한 핵산은 약 118-130개, 119-129개, 120-128개, 121- 127개, 122-126개, 123-125개, 또는 124개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 그러한 폴리펩티드의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적인 상세한 것은 상기에 검토되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, (b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 S70F이며, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨지고, 여기에서 폴리펩티드는 hCD80 및/또는 hCD86(및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD)에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 저해한다. 일부 그러한 핵산은, A24E, T30N, V32I, D41G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E 및 I106F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 그러한 핵산은 약 118-130개, 119-129개, 120-128개, 121- 127개, 122-126개, 123-125개, 또는 124개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 그러한 폴리펩티드의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적으로 상세한 내용이 상기에 검토되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 31에 나타낸 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, (b) 서열번호 31의 위치 50에 대응하는 위치에서 메티오닌 잔기; 서열번호 31의 위치 54에 대응하는 위치에서 리신 잔기; 서열번호 31의 위치 55에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기; 서열번호 31의 위치 64에 대응하는 위치에서 프롤린 잔기; 서열번호 31의 위치 65에 대응하는 위치에서 세린 잔기; 서열번호 31의 위치 70에 대응하는 위치에서 페닐알라닌 잔기 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데: 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 31에 따라 번호가 매겨지며, 여기에서 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD에 결합하며, 및/또는 면역 반응을 저해한다. 일부 그러한 인코딩된 폴리펩티드는 서열번호 31의, 위치 104에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 위치 30에 대응하는 위치에서 아스파라긴산 잔기, 및/또는 위치 32에 대응하는 위치에서 이소류신 잔기를 포함한다. 일부 그러한 핵산은 약 118-130개, 119-129개, 120-128개, 121- 127개, 122-126개, 123-125개, 또는 124개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 그러한 폴리펩티드의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적으로 상세한 내용이 상기에 검토되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은, 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서, 핵산은 hCD80 및/또는 hCD86 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 서열번호 80-158에 의하여 확인된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산은, 각각, 서열번호 1-79에 의하여 확인된 폴리펩티드 서열을 포함하는 예시적인 폴리펩티드를 인코딩한다. 서열번호 201-204에 의하여 확인된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산은, 각각, 서열번호 197-200에 의하여 확인된 폴리펩티드 서열을 포함하는 예시적인 폴리펩티드를 인코딩한다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 포함하는데: (a) RNA 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기에서 RNA 폴리뉴클레오티드 서열은, DNA 서열 내의 모든 티민 뉴클레오티드 잔기가 우라실 뉴클레오티드 잔기로 대체된, 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하며; (b) (a)의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 단편, 여기에서 핵산은 (i) CD80 및/또는 CD86 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 (ii) 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응(예, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 활성화 마커의 유도(예, CD25, IL-2 수용체), 염증, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존성 항체 반응)을 억제하는 능력을 가지는, 폴리펩티드 또는 그의 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩한다.
본 발명은 상기에 기술된 본 발명의 임의의 폴리펩티드의 임의의 멀티머(예, 다이머, 테트라머 등)를 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 포함한다. 다른 부분에서 더 자세히 검토되는, 본 발명의 두 개의 폴리펩티드(두 개의 융합 단백질을 포함함)를 포함하는 다이머는, 일반적으로, 하나의 폴리펩티드 내에서의 시스테인 잔기(들)과 제2 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기(들) 사이의 하나 이상의 이황화 결합의 생성에 의하여 세포 가공 중에 형성된다. 다른 멀티머는 유사하게 형성될 수 있다. 예를 들어, 비-제한적 양태에서, 본 발명은, 두 개의 폴리펩티드를 포함하는 재조합형 폴리펩티드 다이머를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 폴리펩티드는, 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기에서 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86에 결합하며 및/또는 면역 반응을 저해한다. 또한 두 개의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다이머를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산이 포함되는데, 여기에서 각각의 그러한 폴리펩티드는 hCTLA-4 ECD(서열번호 159)의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하며 A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함하고, 이 폴리펩티드는 선택적으로 치환 L104E를 추가로 포함하며, 여기에서 상기 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해한다. 그러한 다이머의 기능적 성질에 대한 추가적으로 상세한 내용이 상기에 검토되어 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 임의의 멀티머성 융합 단백질(예, 다이머, 테트라머 등)을 포함하여, 본 발명의 임의의 융합 단백질을 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 (b) Ig 폴리펩티드를 포함하는, 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하는 능력을 가진다. Ig 폴리펩티드는, 예컨대, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는, Ig Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 두 개의 그러한 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질은, 일반적으로, 하나의 모노머성 융합 단백질 내에서의 시스테인 잔기와 제2 모노머성 융합 단백질 내의 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합의 생성에 의하여 세포 가공 중에 형성된다. 다른 멀티머는 유사하게 형성될 수 있다. 그러한 융합 단백질의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적으로 상세한 내용이 상기에 검토되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 각 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD), 및 (b) Ig 폴리펩티드, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력을 가진다. 두 개의 모노머성 융합 단백질은, 발현 시에, 각 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 내에 존재하는 두 개의 시스테인 잔기들 사이에 형성되는 적어도 하나의 이황화 결합을 통하여 함께 연결된다. Ig 폴리펩티드는, 예컨대, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함하는 Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는, Ig Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, (a)의 폴리펩티드의 C-말단은 (b)의 Ig Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결되거나 융합되어 있다. 그러한 다이머의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적으로 상세한 내용이 상기에 검토되어 있다.
서열이 관심의 단백질의 발현을 위한 발현 벡터에 포함될 때, 각 핵산 서열의 C-말단에 정지 코돈(예, tga)이 일반적으로 포함되어 있다. 예를 들어, 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4 융합 단백질을 인코딩하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 각각은 선택적으로 TAA와 같은, C 말단에서의 정지 코돈을 추가로 포함한다. TGA 정지 코돈과 같은, 다른 정지 코돈이 TAA를 대신할 수 있다. 또한 야생형 융합 단백질(예, hCTLA-4-Ig, hCD86-Ig 등)을 인코딩하는 핵산 서열은 C-말단에 정지 코돈을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 각각은 선택적으로 N-말단에 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하여, 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 분비를 용이하게 할 수 있다.
예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 예시적인 핵산이, 각각, 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224에 제시되어 있다. 서열번호 205-210, 211-214, 219 및 221의 융합 단백질 서열은, 서열번호 205-210의 단백질 서열이 C-말단 리신(K)을 포함하지 않는다는 것을 제외하고는, 각각, 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222의 단백질 서열과 동일한데; 상기에 설명된 바와 같이, 각각의 그러한 폴리뉴클레오티드 서열의 TAA 정지 코돈 직전의 AAA 코돈에 의하여 인코딩되는, 예측된 C-말단 리신 잔기가, 가공 또는 분비 중에 그 결과의 융합 단백질로부터 절단된다고 여겨진다. 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224의 핵산 서열은, 각각, 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222의 융합 단백질 서열을 인코딩하는데, C-말단 K 잔기의 절단/손실 후의 그것들 각각은 서열번호 205-210, 211-214, 219 및 221에 나타낸 융합 단백질 서열을 각각 만든다.
또한, 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224의 폴리뉴클레오티드 서열의 각각은 N-말단에서 서열번호 181 또는 215에 나타낸 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이 신호 펩티드는 궁극적으로 절단되어 성숙 융합 단백질을 형성한다. 각각 그러한 폴리뉴클레오티드 서열(뉴클레오티드 잔기 1-111은 서열번호 215에 제시되어 있음)의 N-말단에서부터 계수되는, 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224의 폴리뉴클레오티드 서열의 각각의 뉴클레오티드 잔기 1-111은, 서열번호 216에 나타낸 37-아미노산 잔기 WT hCTLA-4 신호 펩티드를 인코딩하는데, 이 신호 펩티드는 궁극적으로 성숙 변이체 CTLA-4 융합 단백질 모노머 또는 다이머의 발현 시에 절단되며; 따라서, 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224의 핵산 서열의 각각에서, 성숙 IgG2 융합 단백질의 첫 번째 아미노산 잔기(메티오닌)를 인코딩하는 첫 번째 코돈은 상기 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기 112-114로 구성된다. 상기에 주지된 바와 같이, 일부 경우에, 신호 펩티드 서열은 서열번호 182에 나타낸 아미노산 잔기 1-35만을 포함할 수 있으며, 이러한 35-아미노산 잔기 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 181에 나타나 있다. 그럼에도 불구하고, 위치 36 및 37에서 인코딩된 리신(K) 및 알라닌(A) 잔기(두 개의 코돈 AAA-GCC에 의하여 인코딩됨)는, 각각, 그 결과의 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 존재하지 않으며, 가공 중에 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질로부터 절단된다고 여겨진다. 성숙 변이체 CTLA-4 단백질 서열은 일반적으로 인코딩된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 아미노산 잔기 위치 38에 존재하는 메티오닌 잔기로 시작한다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 또한 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가지는 그러한 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산이 제공된다. 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는 서열번호 74-79, 197-200, 220 및 222에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 것들을 포함하며; 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머로서 발현되는, 그러한 변이체 CTLA-4 Ig 융합 단백질을 인코딩하는 예시적인 핵산은, 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것들을 각각 포함한다. 부가적으로 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은, 융합 단백질 다이머로서 발현되는, 서열번호 205-210, 211-214, 219 및 222의 폴리펩티드 서열을 포함하는데; 이들 융합 단백질은 C-말단 리신 잔기가 부족한데, 그것은 일반적으로 가공 중에 또는 분비 전에 절단되기 때문이다. C-말단 리신(리신은 후속해서 절단됨)을 가지는 이들 융합 단백질 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224의 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 상기 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 153-158, 201-204 및 223-224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 그러한 핵산은, CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가지는, 변이체 CTLA-4-Ig 단백질 다이머를 인코딩한다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD), 여기에서 위치 41, 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에서 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기는 상기 선택된 폴리펩티드 서열(예, 서열번호 1-73으로부터 선택된 폴리펩티드)의 대응 위치에서의 아미노산 잔기와 동일하며, 및 (2) Ig Fc 폴리펩티드, 여기에서 다이머는 CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해한다. 그러한 다이머의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적인 상세한 내용은 상기에서 검토되어 있다. 또한, CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진 그러한 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합형 또는 분리형 핵산이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 두 개의 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1)(a) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, 및 (b) 서열번호 159의 폴리펩티드 서열에 관한 위치 50, 54, 55, 56, 64, 65, 70 또는 85에 대응하는 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드; 및 (2) Ig 폴리펩티드, 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다. 그러한 다이머의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적인 상세한 내용은 상기에 검토되어 있다. Ig 폴리펩티드는, 예컨대, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함하는 Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는, Ig Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. (a)의 일부 그러한 폴리펩티드는 A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S 및 S70F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열번호 159에 관한 아미노산 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함한다. (a)의 일부 그러한 폴리펩티드는, 위치 104(예, L104E/D), 위치 30(예, T30N/D/A), 및/또는 위치 32(예, V32I)에서 서열번호 159에 관한 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 또한, CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가지는 그러한 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 재조합형 또는 분리형 핵산이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지며, (ii) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 상기 폴리펩티드 서열의 위치 70에 대응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD); 그리고 (2) Ig 폴리펩티드, 여기에서 융합 단백질 다이머는 CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진다. 인코딩된 Ig 폴리펩티드는, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 Ig Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 그러한 인코딩된 다이머는, (1)(i)의 상기 선택된 폴리펩티드 서열에 관한 다음 중 하나 이상을 포함한다: 위치 24에 대응하는 위치에서 Glu 잔기; 위치 30에 대응하는 위치에서 Asn 잔기; 위치 32에 대응하는 위치에서 Ile 잔기; 위치 50에 대응하는 위치에서 Met 잔기; 위치 54에 대응하는 위치에서 Lys 잔기; 위치 55에 대응하는 위치에서 Glu 잔기; 위치 56에 대응하는 위치에서 Asp 잔기; 위치 64에 대응하는 위치에서 Pro 잔기; 위치 65에 대응하는 위치에서 Ser 잔기; 위치 104에 대응하는 위치에서 Glu 잔기. 그러한 다이머의 기능적 성질 및 특징에 관한 추가적인 상세한 내용은 상기에 검토되어 있다. 또한, CD80 및/또는 CD86 (및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가지는 그러한 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합형 또는 분리형 핵산이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 159에 나타낸 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, 및 (b) 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD); 및 (2) IgG Fc 폴리펩티드, 여기에서 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 S70F를 포함하고, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 159에 따라 번호가 매겨지며, 여기에서 상기 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86(및/또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다. Ig Fc 폴리펩티드는, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. (1)의 인코딩된 폴리펩티드는, A24E, T30N, V32I, D41G, A50M, M54K, G55E, N56D, S64P, I65S, M85A, L104E 및 I106F로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 다이머의 기능적 성질 및 특징에 관한 추가적인 상세한 내용은 상기에 검토되어 있다. 또한, CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가지는 그러한 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합형 또는 분리형 핵산이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 두 개의 모노머성 융합 단백질(예, 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig)을 포함하는 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머)를 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는데, 여기에서 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 다음을 포함한다: (1) (a) 서열번호 31의 폴리펩티드 서열과 6개의 아미노산 잔기 이하로 상이하고, (b) 서열번호 31의 위치 50에 대응하는 위치에서 메티오닌 잔기; 서열번호 31의 위치 54에 대응하는 위치에서 리신 잔기; 서열번호 31의 위치 55에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기; 서열번호 31의 위치 64에 대응하는 위치에서 프롤린 잔기; 서열번호 31의 위치 65에 대응하는 위치에서 세린 잔기; 서열번호 31의 위치 70에 대응하는 위치에서 페닐알라닌 잔기 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD):, 여기에서 아미노산 잔기 위치는 서열번호 31에 따라 번호가 매겨지며; (2) Ig 폴리펩티드, 여기에서 상기 다이머는 hCD80 및/또는 hCD86 (및/또는 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해한다. Ig 폴리펩티드는, 예컨대, 서열번호 184-186 및 218로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함하는 Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는, Ig Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 그러한 다이머 또는 모노머에서, (1)의 폴리펩티드는, 서열번호 31의, 위치 104에 대응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 위치 30에 대응하는 위치에서 아스파라긴산 잔기, 및/또는 위치 32에 대응하는 위치에서 이소류신 잔기를 포함한다. 그러한 다이머의 기능적 성질 및 특징에 대한 추가적인 상세한 내용은 상기에 검토되어 있다. 또한, CD80 및/또는 CD86(및/또는 CD80-Ig 및/또는 CD86-Ig)에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가지는 그러한 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합형 또는 분리형 핵산이 제공된다.
또한, 상기에서 기술된 본 발명의 임의의 그러한 핵산의 단편이 본 발명에 포함되어 있는데, 여기에서 그러한 단편은, hCD80 및/또는 hCD86 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 ECD에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제하거나 저해하는 능력을 가지는, 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 핵산의 많은 단편들은 hCD80 및/또는 hCD86 또는 그의 ECD에 결합하거나 면역 반응을 억제하는, 폴리펩티드를 발현할 것인데, 이것들의 성질은 적정한 실험으로 용이하게 확인될 수 있다. 뉴클레오티드 단편은 일반적으로 적어도 250개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 950개, 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 염기들을 포함한다.
본 발명은, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질과 같은, 본 발명의 신호 펩티드 및 폴리펩티드(본 발명의 다이머성 또는 모노머성 융합 단백질을 포함함)를 포함하는 단백질을 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 포함하는데, 이것은 본 명세서의 다른 부분에서 자세히 기술되는 바와 같이 CD80 및/또는 CD86에 결합하고, 및/또는 시험관 내 또는 생체 내 분석 및/또는 방법에서 면역 반응을 억제한다. 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통하여 성숙 폴리펩티드의 분비를 유도하는, 인코딩된 신호 펩티드 서열은, 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유적으로 연결되어 있다. 예컨대, 서열번호 181에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의하여 인코딩되는, 예컨대 서열번호 182에 제시된 신호 펩티드 서열, 또는 예컨대, 서열번호 215에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의하여 인코딩되는, 예컨대 서열번호 216에 제시된 신호 펩티드 서열을 포함하는, 다양한 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기에서 자세히 검토된 바와 같이, 신호 펩티드, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 트랜스막 도메인, 및/또는 세포질 도메인을 포함하는 단백질을 인코딩하는 분리형 또는 재조합형 핵산을 포함한다.
전장 인간 CTLA-4 단백질의 신호 펩티드 서열은 본 발명의 재조합형 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 발현 또는 분비를 유도하는 데에 이용될 수 있다. 하나의 양태에서, hCTLA-4 단백질의 신호 펩티드(SP)는 hCTLA-4 단백질의 아미노산 잔기 1-37을 포함하는데; 이 신호 펩티드 서열이 서열번호 216에 나타나 있다. 이 경우에, 성숙 hCTLA-4 단백질은 일반적으로 위치 38에서 메티오닌 잔기로 시작하며, 성숙 hCTLA-4 단백질의 아미노산 잔기는 첫번째 아미노산(즉, 위치 1을 차지함)으로 지정된 이 메티오닌 잔기로 시작하는 것에 따라서 번호가 매겨진다. 따라서, 서열번호 216에 나타낸 펩티드 서열을 포함하는 신호 펩티드는, 공유 연결과 같은 것에 의하여, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 아미노(N) 말단에 융합되거나 연결되어, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 발현 또는 분비를 각각 용이하게 할 수 있다. 서열번호 216의 hCTLA-4 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산이 서열번호 215에 제시되어 있다.
상기 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 발현 또는 분비 시에, 서열번호 216의 신호 펩티드 서열이 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 N-말단에 융합되어 연결될 때, 신호 펩티드는 절단되며; 그 결과의 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 일반적으로 위치 38에서 메티오닌 잔기로 시작하고, 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 아미노산 잔기는, 첫번째 아미노산(즉, 위치 1을 차지함)으로 지정된 이 메티오닌 잔기로 시작하는 것에 따라서 번호가 매겨진다.
본 발명은 신호 펩티드(예, 서열번호 216) 및 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73의 그룹으로부터 선택된 서열)를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서 신호 펩티드는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 또한, 신호 펩티드(예, 서열번호 216) 및 변이체 CTLA-4-Ig(예, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 서열)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드가 포함되어 있는데, 여기에서 신호 펩티드는 변이체 CTLA-4-Ig의 N-말단에 공유적으로 연결되어 있다. 또한, 신호 펩티드(예, 서열번호 216)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 215), 및 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73의 그룹으로부터 선택된 서열) 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 서열)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산이 제공된다.
대안적인 양태에서, 전장 hCTLA-4 단백질의 신호 펩티드는 전장 hCTLA-4 단백질의 잔기 1-35를 포함하는데; 이 신호 펩티드는 서열번호 182에 나타낸 펩티드 서열을 포함한다. 이 경우에, hCTLA-4 단백질의 위치 36 및 37 각각에서의 두 개의 아미노산 잔기 리신(K) 및 알라닌(A)은, 그럼에도 불구하고, 단백질 서열화(sequencing)에 의하여 결정된 성숙 분비된 hCTLA-4 단백질에 일반적으로 존재하지 않는다. 따라서, 결과의 성숙 hCTLA-4 단백질은 유사하게 위치 38에서 메티오닌 잔기로 시작하고, 성숙 hCTLA-4 단백질의 아미노산 잔기는 성숙 hCTLA-4 단백질의 첫번째 아미노산으로 지정된 hCTLA-4의 위치 38에서 이러한 메티오닌 잔기로 시작하는 것에 따라 번호가 매겨진다. 전장 hCTLA-4 단백질의 위치 36 및 37 각각에서의 아미노산 잔기 리신(K) 및 알라닌(A)이 그 결과의 성숙 hCTLA-4 단백질 내에 존재하지 않기 때문에, 그것들은 가공 중에 성숙 hCTLA-4 단백질로부터 절단되는 것으로 여겨진다. hCTLA-4 신호 펩티드 서열(서열번호 182)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산이 서열번호 181에 나타나 있다.
서열번호 182에 나타낸 펩티드 서열을 포함하는 신호 펩티드는, 공유 연결과 같은 것에 의하여, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 N-말단에 융합되거나 연결되어, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 발현 또는 분비를 각각 용이하게 할 수 있다. 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 발현 또는 분비 시에, 서열번호 182의 신호 펩티드 서열이 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 N-말단에 융합되거나 연결될 때, 신호 펩티드는 절단되며; 그 결과의 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 그럼에도 불구하고 일반적으로 위치 38에서 메티오닌 잔기로 시작하고, 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 아미노산 잔기는, 첫번째 아미노산(즉, 위치 1을 차지함)으로 지정된 이러한 메티오닌 잔기로 시작하는 것에 따라서 번호가 매겨진다. 전장 hCTLA-4 단백질의 위치 36 및 37에서 아미노산 잔기 리신(K) 및 알라닌(A)은, 각각, 그 결과의 성숙 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 성숙 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 내에 존재하지 않기 때문에, 그것들은 가공 중에 상기 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질로부터 절단되는 것으로 여겨진다.
본 발명은 신호 펩티드(예, 서열번호 182) 및 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73의 그룹으로부터 선택된 서열)를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 포함하는데, 여기에서 신호 펩티드는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결되어 있다. 또한, 신호 펩티드(예, 서열번호 182) 및 변이체 CTLA-4 Ig(예, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 서열)을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드가 포함되는데, 여기에서 신호 펩티드는 변이체 CTLA-4-Ig의 N-말단으로 공유적으로 연결되어 있다. 또한, 신호 펩티드(예, 서열번호 182)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 181), 및 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73의 그룹으로부터 선택된 서열) 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222의 그룹으로부터 선택된 서열)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리형 또는 재조합형 핵산이 제공된다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 적합한 부가적인 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 포함함)가, 예컨대, 폴리펩티드 정제 부분서열(예, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열 및 GST 융합물로부터 선택된 부분서열), 신호 펩티드 서열, 등과 같은, 하나 이상의 부가적인 폴리펩티드 서열을 포함한다면, 본 발명은 그러한 부가적인 서열을 포함하는 모든 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 발현 시에 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결되는, 예시적인 신호 펩티드가 상기에 검토되어 있다. 예를 들어, 서열번호 1-79, 197-200, 205-214 및 219-222 중 임의의 것의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산은, 예컨대, 서열번호 181에 제시된 뉴클레오티드 서열과 같은, 서열번호 182의 신호 펩티드 서열, 또는 예컨대, 서열번호 215에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의하여 인코딩되는, 서열번호 216에 제시된 신호 펩티드 서열과 같은, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 뉴클레오티드 서열은 적절한 리딩 프레임(reading frame) 내에서 직접적으로 함께 융합되어, 그 결과의 핵산은 본 발명의 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산은 임의의 적합한 기술에 의하여 분리될 수 있는데, 그 중 몇가지는 당해 분야에 알려져 있다. 본 발명의 분리형 핵산(예, 숙주 세포에서 제조되고 후속하여 임의의 적합한 핵산 정제 기술에 의하여 실질적으로 정제된 핵산)은 숙주 세포 내로 재도입되거나 세포적 또는 다른 생물학적 환경 또는 조성물 내로 재도입될 수 있는데, 여기에서 그것은 더 이상 우세한 핵산 종(species)이 아니거나 더 이상 다른 핵산으로부터 분리되지 않는다.
대체로 본 발명의 임의의 분리형 또는 재조합형 핵산은, 표준 기술을 이용하여 적합한 더 큰 핵산 분자(예컨대, 염색체, 플라스미드, 발현 벡터 또는 카세트, 바이러스 게놈, 유전자 서열, 선형 발현 요소, 박테리아 게놈, 식물 게놈, 또는 포유류 인공 염색체(mammalian artificial chromosome, MAC)와 같은 인공 염색체, 또는 그의 이스트 및 박테리아 대응물(즉, YAC 또는 BAC)을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 삽입되거나 융해되어, 재조합형 핵산을 형성한다. 다른 예로써, 본 발명의 분리형 핵산은, 프로모터 서열, 면역조절 서열, 및/또는, 다른 항원 에피토프 및/또는 링커 서열과 같은 다른 아미노산을 인코딩하는 서열과 같은, 더 작은 뉴클레오티드 서열에 융합되어, 재조합형 핵산을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 재조합형 또는 합성 핵산은, 숙주 세포의 맥락 밖에서 적용되는 화학 합성 기술(예, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 또는, 예가 본 명세서에 추가로 기술되는 화학 합성 기술을 통하여 생산되는 핵산)에 의하여 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드(융합 단백질을 포함함)를 인코딩하는 핵산은, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 또는 다른 원하는 생물학적 활성(예, 다른 핵산과의 혼성화(hybridization))을 허용하는 임의의 적합한 화학적 조성물을 가질 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있으며, mRNA, cRNA, 재조합형 또는 합성 RNA 및 DNA, 그리고 cDNA를 포함한다. 본 발명의 핵산은 일반적으로 DNA 분자이며, 보통 이중-가닥 DNA 분자이다. 그러나, 본 발명의 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일-가닥 DNA, 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA 및 혼성 DNA/RNA 핵산 또는 그의 조합이 또한 제공된다. 본 발명의 핵산은 임의의 적합한 뉴클레오티드 염기, 염기 유사체, 및/또는 주쇄(backbone)(예, 포스포디에스테르(phosphodiester)보다는, 포스포티오에이트(phosphothioate) 연결, 예컨대, 포스포티오에이트 또는 포스포로티오에이트 주쇄에 의하거나 또는 그것에 포함함으로써 형성되는 주쇄)를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은, 단일-가닥이라면, 코딩 가닥 또는 비-코딩(즉, 안티센스(antisense) 또는 상보적인) 가닥일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig의 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열)에 더하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 부가적인 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 예컨대, 융합 단백질, 표적화 서열(신호 서열 이외에), 등(더 특별한 예가 본 명세서에 추가로 논의됨)을 인코딩할 수 있으며, 및/또는, 인트론, 종결자 서열, 또는 적합한 숙주 내에서 코딩 서열의 발현에 효과적일 수 있는 5' 및/또는 3' 비번역 영역, 및/또는, 프로모터(예, 자연적으로 발생하는 또는 재조합형 또는 셔플된(shuffled) 프로모터)와 같은 조절 요소와 같은, 비-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
핵산에 대한 변형은 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 코돈 서열의 세 번째 위치에서 특별히 용인된다. 특별한 양태에서, 핵산의 적어도 일부분은, 핵산 서열 내에서 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 자리에서 또는 그에 더하여서 적어도 하나의 합성 뉴클레오티드 유사체를 편입한, 포스포로티오에이트 주쇄를 포함한다. 또한 또는 대안적으로, 핵산은 구아닌, 아데닌, 우라실, 티민 및 시토신이외의 염기의 추가를 포함할 수 있다. 그러한 변형은 더 긴 반감기와 연관될 수 있으며, 따라서 본 발명의 핵산 벡터에서 바람직할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 재조합형 핵산 및 핵산 벡터(하기에서 더 검토됨)를 제공하는데, 이 핵산 또는 벡터는 앞에서 언급한 변형의 적어도 하나 또는 그의 임의의 적합한 조합을 포함하며, 여기에서 핵산은 그러한 변형 또는 변형들 없이 실질적으로 동일한 핵산보다 포유류 숙주에서 더 오래 지속한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 편입될 수 있는 변형된 및/또는 비-시토신, 비-아데닌, 비-구아닌, 비-티민 뉴클레오티드의 예는, 예컨대 MANUAL OF PATENT EXAMINING PROCEDURE § 2422(7판 개정 - 2000)에 제공되어 있다.
상기에서 및 본 명세서의 다른 부분에서 기술되는 것들을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 포함함)의 적어도 하나를 인코딩하는 핵산은, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 또는 생산을 위하여 직접 코드하는 서열에 한정되지 않는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 인테인-유사 발현(intein-like expression)을 통하여 본 발명의 폴리펩티드를 만드는 뉴클레오티드 서열(예컨대, Colson 및 Davis (1994) Mol. Microbiol. 12(3):959-63, Duan 등 (1997) Cell 89(4):555-64, Perler (1998) Cell 92(1):1-4, Evans 등 (1999) Biopolymers 51(5):333-42, 및 de Grey, Trends Biotechnol. 18(9):394-99 (2000)에서 기술됨), 또는 중간 재조합형 폴리펩티드-인코딩 서열을 형성하는, 자기-스플라이싱(self-splicing) 인트론(또는 다른 자기-스플라이싱된 RNA 전사체)을 포함하는 뉴클레오티드 서열(미국특허번호 제 6,010,884호에 기술됨)을 포함할 수 있다. 또한 또는 대안적으로 핵산은, 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 전사체를 생산하기 위한 RNA 수준에서의 및/또는 전사 전에 트랜스-스플라이싱(trans-splicing) 메커니즘(그러한 메커니즘과 관련된 원칙이 예컨대, Chabot, Trends Genet. (1996) 12(11):472-78, Cooper (1997) Am. J. Hum. Genet. 61(2):259-66, 및 Hertel 등 (1997) Curr. Opin. Cell. Biol. 9(3):350-57에 기술되어 있음)에 의한 DNA 수준에서의 다른 스플라이스 변형을 만드는 서열을 포함할 수 있다. 유전자 코드의 고유한 축퇴(inherent degeneracy)로 인하여, 몇 개의 핵산은 본 발명의 임의의 특정한 폴리펩티드를 코드할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 특정한 핵산 중 임의의 것은, 하나 이상의 코돈을 등가의 코돈(코돈에 의하여 요구되는 아미노산을 기준으로)으로 치환함으로써, 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드 서열과 동일한 또는 기능적으로 동등한 서열을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열은 그러한 폴리펩티드를 합성하고, 클론화하고 및 발현하는데 이용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig를 인코딩하는 핵산)를 인코딩하는 상기-언급한 핵산에 관하여 본 명세서에서 예시된 기술을 사용하여, 본 발명의 핵산 중 임의의 것은 변형되어 특정 숙주에서 발현을 증가시킬 수 있다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 핵산 중 임의의 것은 특정 포유류(보통은 인간) 내의 발현을 위하여 최적화된 코돈일 수 있다. 코돈 최적화을 위한 다양한 기술이 당해 분야에 알려져 있다. 특정 숙주에서 가장 흔히 이용되는 코돈은 최적 코돈으로 불리우며, 매우 흔히 이용되지 않는 것들은 드문(rare) 또는 저-사용 코돈으로 분류된다(예, Zhang, S. P. 등 (1991) Gene 105:61-72을 참조). 코돈은, 숙주의 바람직한 코돈 사용, 즉 “코돈 최적화” 또는 “종 코돈 편향을 위한 제어(controlling for species codon bias)”라 불리우는 과정을 반영하도록 치환될 수 있다. 특정 진핵생물 또는 원핵생물 숙주에 의해 선호되는 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열은, 비-최적화된 서열로부터 생산된 전사에 비하여, 번역의 비율을 높이거나, 더 긴 반-감기와 같은, 원하는 성질을 가지는 재조합 RNA 전사체를 생산하도록 이용될 수 있다. 코돈-최적화 서열을 생산하는 기술은 알려져 있다(예, E. 등 (1989) Nuc. Acids Res. 17:477-508을 참조). 또한 번역 정지 코돈은 숙주 선호도를 반영하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, S. cerevisiae 및 포유류에서 선호되는 정지 코돈은 각각 UAA 및 UGA이다. 외떡잎 식물에서 선호되는 정지 코돈은 UGA이며, 반면에 곤충과 E. coli는 정지 코돈으로서 UAA 사용을 선호한다(예, Dalphin, M.E. 등 (1996) Nuc. Acids Res. 24:216-218을 참조). 또한 다른 코돈의 맥락에서 코돈의 배열은 핵산 서열의 생물학적 성질에 영향을 줄 수 있으며, 또한, 특정 숙주에서 통상적인 코돈 문맥 배열(codon context arrangement)을 제공하기 위하여, 핵산의 변형이 본 발명자에 의하여 고려된다. 따라서, 본 발명의 핵산 서열은 코돈 최적화성 뉴클레오티드 서열, 즉, 특정 종을 위하여 최적화된 코돈 빈도(codon frequency) 및/또는 최적화된 코돈 쌍(즉, 코돈 문맥)을 포함할 수 있다(예, 폴리펩티드는, Buckingham 등 (1994) Biochimie 76(5):351-54 및 미국특허번호 제 5,082,767호, 제 5,786,464호, 및 제 6,114,148호에 기술되는 것들과 같은 기술을 이용하는 것과 같이, 코돈 빈도, 또는 코돈 문맥에 근거한 “드문” 인간 코돈의 치환에 의하여 인간 내에서의 발현을 위하여 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현될 수 있음).
본 발명의 핵산은 트렁케이션(truncation) 또는 서열의 C-말단 부분의 하나 이상의 잔기에 의하여 변형될 수 있다. 추가적인, 다양한 정지 또는 종결 코돈이 하기에 더 검토된 뉴클레오티드 서열의 끝에 포함될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 핵산은, 본 발명의 코딩 뉴클레오티드 서열이 이종성 유전자인, 벡터, 세포 또는 숙주 환경에 포함될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 CD80 및/또는 CD86에 결합하고 및/또는 면역 반응을 억제하는 본 발명의 임의의 폴리펩티드(또는 그의 폴리펩티드 단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 적어도 엄밀한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 하나 이상의 그러한 폴리뉴클레오티드 서열로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 임의의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 상기의 모든 것의 변형체, 유사체 및 동종성 유도체를 포함한다. 코딩 서열은 특정 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 도메인, 부분서열, 영역 또는 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 서열은, CD80 및/또는 CD86에 결합하고 및/또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 능력과 같은, 기능적 성질을 가지는 변이체 CTLA-4 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대하여 코드할 수 있다. 본 발명의 핵산은 본 발명의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드, 및 그의 변형체, 유사체, 및 동종성 유도체의 각 코딩 서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산은, 당해 분야의 통상의 기술자들에게 알려진 바와 같이, 담체, 완충제, 보조제, 부형제, 희석제 등이 존재하는 것을 포함하여, 핵산의 일반적인 조성물적 제형과 조합하여 발견될 수 있다.
달리 지시되지 않으면, 본 명세서에 기술되는 특정 핵산 서열은 또한 명백히 지시한 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변형체(예, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 함축적으로 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을, 생산함으로써 성취될 수 있다(Batzer 등 (1991) Nucl. Acid Res. 19:5081; Ohtsuka 등 (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol 등 (1992); Rossolini 등 (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
핵산
혼성화
상기에 주지된 바와 같이, 본 발명은, 예컨대, 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열과 같은, 본 발명의 표적 핵산을 혼성화하는 핵산을 포함하는데, 여기에서 혼성화는 실질적으로 표적 핵산의 전체 길이 이상이다. 혼성화하는 핵산은, 적어도 엄밀한(stringent) 조건 하에서 또는 적어도 고도로 엄밀한 조건 하에서, 예컨대, 서열번호 80의 그것과 같은, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 혼성화할 수 있다. 핵산 혼성화 실험에서 적당히 엄밀한, 엄밀한, 및 고도로 엄밀한 혼성화 조건은 알려져 있다. 엄밀함의 그러한 수준을 달성하도록 조합될 수 있는 인자의 예는 본 명세서에 간단히 검토되어 있다.
핵산은, 그것들이 일반적으로 용액에서 결합(associate)할 때, “혼성화한다”. 수소 결합, 용매 배제(solvent exclusion), 염기 스택킹(base stacking) 등과 같은, 다양한 좋은 특성의 물리-화학적 힘으로 인하여, 핵산은 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 넓은 지침은, P. Tijssen (1993) LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, 24권, part I, chapter 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” (Elsevier, NY)(이하, “Tijssen”)은 물론이고, 위의 Ausubel에 있으며, Hames와 Higgins (1995) GENE PROBES 1, Oxford 대학 출판사의 IRL Press, Oxford, England(Hames와 Higgins 1), 및 Hames와 Higgins (1995) GENE PROBES 2, Oxford 대학 출판사의 IRL Press, Oxford, England(Hames와 Higgins 2)는 올리고뉴클레오티드를 포함하여, DNA 및 RNA의 합성, 라벨링, 검출 및 정량화에 대한 자세한 내용을 제공한다.
두 개의 핵산이 실질적으로 동일하다는 말은, 두 개의 분자가 적어도 엄밀한 조건에서 서로 혼성화한다는 것이다. 어구 “특이적으로 혼성화하는 것”은, 서열이 복합 혼합물(예, 총 세포의) DNA 또는 RNA에 존재할 때 엄밀한 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합하거나, 이중화하거나, 또는 혼성화하는 것을 지칭한다. “실질적으로 결합한다”는, 프로브(probe) 핵산과 표적 핵산 사이의 상보적 혼성화를 지칭하며, 혼성화 배지의 엄밀성을 감소시켜 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 원하는 검출을 성취할 수 있음으로써 수용될 수 있는 경미한 불일치(minor mismatches)를 포함한다.
서던(southern) 및 노던(northern) 혼성화와 같은, 핵산 혼성화 실험의 맥락에서 “엄밀한 혼성화 세척 조건” 및 “엄밀한 혼성화 조건”은, 종속적인 서열이며, 상이한 환경 파라미터 하에서 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 넓은 지침이 위의 Tijssen(1993) 및 위의 Hames와 Higgins 1및 Hames와 Higgins 2에 있다.
일반적으로, 고도의 엄밀성(stringency) 조건은 약 5℃, 또는 정의된 이온 강도 및 pH에서의 특정 서열에 대한 열적 융해 온도(thermal melting point)(Tm) 이하에서 혼성화가 일어나도록 선택된다. Tm은 테스트 서열의 50%가 완전히 일치된 프로브로 혼성화하는 온도(정의된 이온 세기 및 pH 하에서)이다. 즉, Tm은 핵산 듀플렉스(duplex)가 주어진 조건 하에서 50% 변성되는 온도를 가리키며, 핵산 하이브리드의 안정성의 직접적인 측정을 나타낸다. 따라서, Tm은 헬릭스(helix)에서 랜덤 코일(random coil)로의 전이(transition)에서의 중간점에 대응하는 온도에 대응하는데; 그것은 긴 뉴클레오티드에서의 길이, 뉴클레오티드 조성물 및 이온 세기에 의존한다. 일반적으로, “엄밀한 조건”하에서, 프로브는, 다른 서열이 아닌, 그의 표적 서열에 혼성화할 것이다. “매우 엄밀한 조건”은 특정 프로브에서의 Tm에 같도록 선택된다.
식 (1)을 이용하여 DNA-DNA 듀플렉스의 Tm가 추정될 수 있다: Tm(℃) = 81.5℃ + 16.6 (log10M) + 0.41 (%G + C) - 0.72 (%f) - 500/n, 여기에서 M은 일가 양이온(보통 Na+)의 몰농도, (%G + C)는 구아노신(G)과 시토신(C) 뉴클레오티드의 퍼센트이며, (%f)는 포름아미드의 퍼센트이고, n은 하이브리드의 뉴클레오티드 염기의 수(즉, 길이)이다. Rapley, R. 및 Walker, J.M. eds., MOLECULAR BIOMETHODS HANDBOOK (1998), Humana Press사(이후 Rapley와 Walker), 위의 Tijssen (1993)을 참조. RNA-DNA 듀플렉스의 Tm은 식 (2)를 이용하여 추정될 수 있다: Tm (℃) = 79.8℃ + 18.5 (log10M) + 0.58 (%G + C) - 11.8(%G + C)2 - 0.56 (%f) - 820/n, 여기에서 M은 일가 양이온(보통 Na+)의 몰농도, (%G + C)는 구아노신(G)과 시토신(C) 뉴클레오티드의 퍼센트이며, (%f)는 포름아미드의 퍼센트이고, n은 하이브리드의 뉴클레오티드 염기의 수(즉, 길이)이다. 상기 식 1 및 2는 일반적으로 약 100-200개의 뉴클레오티드보다 긴 하이브리드 듀플렉스에서만 정확하다. 50개의 뉴클레오티드보다 짧은 뉴클레오티드 서열의 Tm은 다음과 같이 계산될 수 있다: Tm (℃) = 4(G + C) + 2(A + T), 여기에서 A(아데닌), C, T(티민), 및 G는 대응 뉴클레오티드의 수이다.
일반적으로, 비-혼성화된 핵산 물질은 일련의 세척에 의하여 제거되는데, 그의 엄밀성은, 혼성화 분석을 실시하는 경우에 있어서의 원하는 결과에 의존하여 조정될 수 있다. 저 엄밀성 세척 조건(예, 더 높은 염 및 더 낮은 온도를 이용함)은 민감도(sensitivity)를 증가시키나, 비특이적 혼성화 신호 및 높은 배경 신호를 생산할 수 있다. 더 높은 엄밀성 조건(예, 혼성화 온도에 더 가까운 더 낮은 염 및 더 높은 온도를 이용함)은 배경 신호를 낮추고, 일반적으로 특이 신호만을 남게 한다. 그러한 혼성화 기술에 관한 지침에 유용한 추가 내용이, 위의 Rapley와 Walker, (특히, 그러한 혼성화 실험에 관하여, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"), Elsevier, New York은 물론이고, 위의 Ausubel, 위의 Sambrook, 위의 Watson, Hames및 Higgins (1995) GENE PROBES 1, IRL Press, Oxford Univ. Press, Oxford, England, 그리고 Hames와 Higgins (1995) GENE PROBES 2, IRL Press, Oxford Univ. Press, Oxford, England에 제공되어 있다.
적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 두 개의 핵산의 분석에서 예시적인 엄밀한(또는 보통의 엄밀함) 조건은, 42℃에서 1 밀리그램의 헤파린을 가지는 50% 포르말린(또는 포름아미드)을 포함하는, 서던 또는 노던 블랏(Southern or northern blot)에서 용액에 또는 필터 상에서의 항온처리를 포함하며, 혼성화는 밤새 실시된다. 보통의 엄밀성 세척은, 예컨대 0.2x SSC 세척을 포함하는 용액을 이용하여 약 65℃에서 약 15분 동안 실시될 수 있다(SSC 버퍼의 설명을 위하여, 위의 Sambrook을 참조). 종종, 보통의 엄밀성 세척은 저 엄밀성 세척에 의하여 진행되어 배경 프로브 신호를 제거한다. 저 엄밀성 세척은, 예를 들어, 40℃에서 약 15분 동안 1x SSC를 포함하는 용액에서 실시될 수 있다. 고도로 엄밀한 세척은 0.15M NaCl을 포함하는 용액을 이용하여 약 72℃에서 약 15분 동안 실시될 수 있다. 예컨대, 100개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스에서, 상기에서 기술된 보통의 엄밀성 세척보다 덜 엄밀한, 예시적인 중간의(보통의) 엄밀성 세척은 45℃에서 15분 동안 1x SSC를 포함하는 용액에서 실시될 수 있다. 예컨대, 100개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스에서의 예시적인 저 엄밀성 세척은, 40℃에서 15분 동안 4-6x SSC의 용액에서 실시된다. 짧은 프로브(예, 약 10-50개의 뉴클레오티드)에서, 엄밀한 조건은 일반적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M Na+ 이온 이하의 염 농도, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0M Na+ 이온 농도(또는 다른 염)를 수반하며, 온도는 일반적으로 적어도 30℃이다. 또한 엄밀한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화 제제를 첨가함으로써 이룰 수 있다.
예시적인 온건한 엄밀성 조건은 37℃에서, 20% 포르말린(또는 포름아미드), 0.5x SSC, 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 설페이트, 및 20mg/ml 변성 전단 연어 정자(sheared salmon sperm) DNA를 포함하는 용액에서 밤새 항온처리하고, 이어서 약 37-50℃ 또는 실질적으로 유사한 조건, 예컨대, 위의 Sambrook 및/또는 위의 Ausubel에 기술된 온건하게 엄밀한 조건에서, 1x SSC 내에서 필터를 세척하는 것을 포함한다.
고 엄밀성 조건은, 예를 들어, (1) 50℃에서의 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)와 같은, 세척을 위한 낮은 이온 세기 및 높은 온도를 이용하거나, (2) 혼성화 중에 포름아미드와 같은 변성화 제제, 예를 들어, 0.1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 가지는 50%(v/v) 포름아미드/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)/ 750mM 염화나트륨을 가지는 pH 6.5에서의 50mM 인산나트륨 버퍼, 75mM 시트르산나트륨을 42℃에서 채용하거나, (3) 50% 포름아미드, 5x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 42℃에서 채용하며, (i) 42℃에서 0.2x SSC내에서, (ii) 55℃에서 50% 포름아미드 내에서, 및 (iii) 55℃에서 0.1x SSC (바람직하게는 EDTA와 조합하여) 내에서 세척하는 것을 이용하는 조건이다.
일반적으로, 특정 혼성화 분석에서 비관련된 프로브에서 관찰되는 것보다 2x 또는 2.5x-5x(또는 더 높은)의 신호 대 잡음 비율은 특이적 혼성화의 검출을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 두 개의 서열 사이의 적어도 엄밀한 혼성화의 검출은, 예컨대 본 발명의 핵산에 대한 상대적으로 강한 구조적인 유사성 또는 동종성을 나타낸다.
주지된 바와 같이, “고도로 엄밀한” 조건은 약 5℃, 또는 정의된 이온 세기 및 pH에서 특이 서열에 대한 열적 융해 온도(Tm)보다 더 낮게 되도록 선택된다. 관심의 뉴클레오티드 서열(예, “프로브”)과 밀접하게 관련되어 있거나 동일한 표적 서열은 고도의 엄밀성 조건 하에서 확인될 수 있다. 더 낮는 엄밀성 조건은 덜 상보적인 서열에 적절하다. 예컨대, 모두 상기된 Rapley와 Walker; Sambrook 참조.
비교 혼성화(comparative hybridization)는 본 발명의 핵산을 확인하는데 이용될 수 있으며, 이러한 비교 혼성화 방법은 본 발명의 핵산을 구별하는데 바람직한 방법이다. 본 발명의 맥락에서 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 고도로 엄밀한 혼성화의 검출은, 예컨대, 본 명세서에 열거된 서열 내에 제공된 핵산에 대한 상대적으로 강한 구조적 유사성/동종성을 나타낸다. 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 고도로 엄밀한 혼성화는, 엄밀한 혼성화 조건에 의하여 검출되는 것보다 더 큰 구조, 뉴클레오티드 염기 조성물, 배열 또는 순서에 대한 유사성 또는 동종성의 정도를 입증한다. 특히, 본 발명의 맥락에서 고도로 엄밀한 혼성화의 검출은, 예컨대, 본 명세서에 열거된 서열에 제공되는 핵산에 대한 강한 구조적 유사성 또는 구조적 동종성(예, 뉴클레오티드 구조, 염기 조성물, 배열 또는 순서)을 나타낸다. 예를 들어, 엄밀한 조건 하에서 본 명세서에서의 예시적인 핵산에 혼성화하는 테스트 핵산을 확인하는 것이 바람직하다.
따라서, 엄밀한 혼성화의 한 기준은, 고도로 엄밀한 조건(또는 매우 엄밀한 조건, 또는 초-고도 엄밀성 혼성화 조건, 또는 초-초-고도 엄밀성 혼성화 조건)하에서, 본 발명의 핵산(예, 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)에 혼성화하는 능력이다. 엄밀한 혼성화(예, 고도로 엄밀한, 초-고도 엄밀성, 또는 초-초 고도 엄밀성 혼성화 조건을 포함함) 및 세척 조건은 임의의 테스트 핵산에 대하여 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다.
예를 들어, 고도로 엄밀한 혼성화 및 세척 조건을 결정함에 있어서, 선택된 기준에 맞출 때까지 혼성화 및 세척 조건은 점차 증가된다(예, 혼성화 또는 세척에 있어서, 온도를 증가시키고, 염 농도를 감소시키며, 세제 농도를 증가시키고, 및/또는, 포르말린과 같은 유기 용매의 농도를 증가시킴으로써). 예를 들면, 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브가, 불일치 표적에 대한 프로브의 혼성화에서 관찰되는 것에 적어도 2.5x, 및 선택적으로 5x, 또는 그 이상으로 높은 신호 대 잡음 비율로, 완전히 일치된 상보적 표적(다시, 서열번호 80-158, 201-204, 223 및 224로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 서열 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)에 결합할 때까지, 혼성화 및 세척 조건은 점점 증가된다. 불일치 표적은, 예컨대, CTLA-4 폴리펩티드-인코딩 핵산 서열에 대응하는 핵산을 포함할 수 있다.
보통, 공지된 참조(또는 알려진) 뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 80)에 완전히 상보적인 서열을 포함하는 핵산이, 참조 핵산과 적어도 약 80% 또는 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 대하여 완전히 상보적인 핵산의 혼성화에서 관찰되는 것보다 적어도 약 5배, 7배 또는 10배 높은 신호-대-잡음 비율로, 재조합 항원-인코딩 서열(예, 서열번호 80의 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 변형체)과 혼성화하도록 선택된, 혼성화 조건 하에서, 혼성화 분석이 실시된다. 그러한 조건은 특이적 혼성화를 나타내는 것으로 생각될 수 있다.
혼성화 핵산 서열의 선택에 있어서 임의의 원하는 수준의 엄밀성을 성취하기 위하여, 상기-기술된 혼성화 조건이 조정되거나, 대안적인 혼성화 조건이 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기-기술된 고도로 엄밀한 혼성화 및 세척 조건은, 선택된 기준에 맞출 때까지, 점차 증가된다(예, 혼성화 또는 세척에 있어서, 온도를 증가시킴, 염 농도를 감소시킴, 세제 농도를 증가시킴, 및/또는, 포르말린과 같은, 유기 용매의 농도를 증가시킴으로써). 예를 들면, 원하는 프로브가, WT CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 같은, 본 발명의 것이 아닌 핵산에 대한 프로브의 혼성화로부터 관찰되는 신호-대-잡음 비율에 적어도 약 2.5x, 및 선택적으로 적어도 약 5x(예, 약 10x, 약 20x, 약 50x, 약 100x, 또는 심지어 약 500x)만큼 높은 비율의 신호-대-잡음 비율로, 일치된 상보적 표적에 결합할 때까지, 혼성화 및 세척 조건은 점점 증가된다.
핵산의 제조 및 변형
본 발명의 핵산은 임의의 적합한 합성, 조작, 및/또는 분리 기술 또는 그의 조합을 적용함으로써 얻어지고 및/또는 생성될 수 있다. 예시적인 절차가 아래에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 당해 분야에서 알려진 고체-상태 합성(solid-phase synthesis) 기술과 같은 표준 핵산 합성 기술을 통하여 생산된다. 그러한 기술에서, 약 100개 염기까지의 단편은 보통 개별적으로 합성되고, 이어서, 합쳐져서(예, 효소적 또는 화학적 결찰(ligation) 방법, 또는 중합효소(polymerase) 매개 재조합 방법에 의하여), 본질적으로 임의의 원하는 연속된 핵산 서열을 형성한다. 또한 본 발명의 핵산의 합성은, 예컨대, Beaucage 등 (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-69에서 기술된 예컨대, 전통적인 포스포라미다이트(phosphoramidite) 방법, 또는 예컨대, 자동화 합성 방법에서 일반적으로 행해지는, Matthes 등 (1984) EMBO J. 3:801-05에 의하여 기술된 방법을 이용한 화학적 합성에 의하여, 용이하게 될 수 있다(또는 대안적으로 성취될 수 있다). 또한 본 발명의 핵산은 자동 DNA 합성기를 사용함으로써 생산될 수 있다. 핵산을 합성하는 다른 기술 및 관련 원리들이, 예컨대, Itakura 등, Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), Itakura 등, Science 198:1056 (1984), 및 Ike 등, Nucl. Acid Res. 11:477 (1983)에 기술되어 있다.
편리하게, 주문 제작 핵산은, The Midland Certified Reagent 회사(mcrc@oligos.com), Great American Gene 회사(월드와이드 웹사이트 주소 genco.com), ExpressGen사(월드와이드 웹사이트 주소 expressgen.com), Operon Technologies사(Alameda, CA)와 같은, 다양한 상업용 공급처로부터 주문될 수 있다. 유사하게, 주문 제작 펩티드 및 항체는, 임의의 다양한 공급처, 예컨대, PeptidoGenic(pkim@ccnet.com), HTI Bio-products사(월드와이드 웹사이트 주소 htibio.com), 및 BMA Biomedicals사(U.K.), Bio.Synthesis사로부터 주문 제작될 수 있다.
또한 본 발명의 소정의 뉴클레오티드는, 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 PCR-증폭 폴리뉴클레오티드를 이용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. cDNA 클론을 스크리닝하고 분리하는 절차 및 PCR 증폭 절차는 당해 분야의 기술자들에게 잘 알려져 있으며; 예시적인 절차가 아래(예, 하기 실시예에서 기술되는 절차를 참조)에 기술되어 있다. 그러한 기술은, 예컨대, Berger와 Kimmel, “Guide to Molecular Cloning Techniques,” in Methods in Enzymol. 152권, Acad. 출판사, San Diego, CA (“Berger”); 위의 Sambrook; 및 위의 Ausubel에 기술되어 있다. 본 발명의 일부 핵산은, 예컨대, 돌변변이생성, 시험관 내 재조합(예, 셔플링(shuffling)), 또는 올리고뉴클레오티드 재조합에 의하여, 자연적으로 발생하는 주쇄를 변경함으로써 얻어질 수 있다. 다른 경우, 그러한 폴리뉴클레오티드는 실리코 내에서(in silico) 또는 본 명세서에서 인용된 참조문헌에 기술된 올리고뉴클레오티드 재조합 방법을 통하여 만들어질 수 있다.
핵산의 변형에 유용한 재조합 DNA 기술은 당해 분야에서 잘 알려져 있다(예, 제한 효소(restriction endonuclease) 분해, 결찰, 역전사 및 cDNA 생산, 및 PCR). 유용한 재조합 DNA 공학 기술 및 그것에 관련된 원리들이, 예컨대, Mulligan (1993) Science 260:926-932, Friedman (1991) THERAPY FOR GENETIC DISEASES, Oxford University 출판, Ibanez 등 (1991) EMBO J. 10:2105-10, Ibanez 등 (1992) Cell 69:329-41 (1992), 및 미국특허번호 제 4,440,859호, 제 4,530,901호, 제 4,582,800호, 제 4,677,063호, 제 4,678,751호, 제 4,704,362호, 제 4,710,463호, 제 4,757,006호, 제 4,766,075호, 및 제 4,810,648호에 제공되어 있고, Sambrook 등 (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor 출판, 및 그의 세 번째 편집판(2001), Ausubel 등 (1994-1999), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience 출판사(Greene Publishing Associates과 함께 일부 편집), 위의 Berger, 및 위의 Watson에 더 자세하게 기술되어 있다.
변형 코딩 서열
적절한 위치에서, 본 발명의 핵산은, 핵산의 발현을 원하는 특성 숙주(들)를 고려할 때, 코돈 이용 및/또는 코돈 맥락에 관하여 서열의 변형에 의하여 특정 숙주 내에서 발현을 증가시키거나 증진시키도록 변형될 수 있다. 특정 숙주에서 가장 흔히 이용되는 코돈이 최적 코돈이라 불리어지고, 가장 흔히 이용되지 않는 것들은 드문(rare) 또는 저-사용 코돈(low-usage codons)으로 분류된다(예, Zhang, S. P. 등 (1991) Gene 105:61-72을 참조). 코돈은 숙주의 선호된 코돈 이용, “코돈 최적화” 또는 “종 코돈 편향성(species codon bias)에 대한 조절”이라 불리는 과정을 반영하도록 치환될 수 있다.
특정 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에 의하여 선호된 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열은, 비-최적화된 서열로부터 생산된 전사체에 비하여, 번역의 비율을 증가시키거나, 더 긴 반감기와 같은, 원하는 성질을 가지는 재조합 RNA 전사체를 생산하도록 이용될 수 있다. 코돈-최적화 서열을 생산하는 기술은 알려져 있다(예, Murray, E. 등 (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508을 참조). 또한 번역 정지 코돈은 숙주 선호성을 반영하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, S. cerevisiae 및 포유류에서 선호되는 정지 코돈은 각각 UAA 및 UGA이다. 외떡잎 식물에서 선호되는 정지 코돈은 UGA이며, 반면에 곤충 및 E. coli는 정지 코돈으로서 UAA를 사용하는 것을 선호한다(예, 검토를 위하여, Dalphin, M.E. 등 (1996) Nucl. Acids Res. 24:216-218을 참조). 또한 다른 코돈에 대한 맥락 내에서의 코돈의 배열은 핵산 서열의 생물학적 성질에 영향을 줄 수 있으며, 또한 특정 숙주에 통상적인 코돈 맥락 배열을 제공하기 위한 핵산의 변형이 발명자에 의하여 고려된다. 따라서, 본 발명의 핵산 서열은 코돈 최적화성 뉴클레오티드 서열, 즉 특정 종에 최적화된 코돈 빈도 및/또는 최적화된 코돈쌍(즉, 코돈 문맥)을 포함할 수 있다(예, 폴리펩티드는, 코돈 빈도 또는 코돈 문맥에 근거하여 “드문” 인간 코돈의 치환에 의하여, 예를 들어, Buckingham 등 (1994) Biochimie 76(5):351-54 및 미국특허번호 제 5,082,767호, 제 5,786,464호, 및 제 6,114,148호에 기술된 것들과 같은 기술을 이용함으로써, 인간 내에서의 발현을 위하여 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현될 수 있음). 예를 들어, 본 발명은 서열번호 80의 뉴클레오티드 서열 변형체를 포함하는 핵산을 제공하는데, 여기에서 뉴클레오티드 서열 변형체는, 특정 숙주에서의 “드문” 코돈을 숙주에서 통상적으로 발현되는 코돈으로 치환함으로써, 서열번호 80의 뉴클레오티드 서열과 상이하며, 이 코돈은 서열번호 80 내의 치환된 “드문” 코돈과 동일한 아미노산 잔기를 인코딩한다.
벡터, 벡터 성분 및 발현 시스템
또한, 본 발명은 상기에서 넓게 기술된 본 발명의 핵산 중 하나 이상을 포함하는 재조합 구성체를 포함한다. 본 발명의 적어도 하나의 핵산 서열이, 순 또는 역 배향으로, 삽입되는, 그러한 구성체는, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC), 이스트 인공 염색체(yeast artificial chromosome, YAC) 등과 같은 벡터, 또는 리포좀, 네이키드(naked) 또는 접합 DNA, DNA-미립자와 같은 비-복제 벡터를 포함할 수 있다. 이 구체예의 특정한 양태에서, 구성체는, 예를 들어, 본 발명의 핵산 서열(예, 분리형 또는 재조합형 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig를 인코딩하는 핵산)과 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함하여, 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 분야의 기술자들에게 알려져 있으며, 상업적으로 입수가 가능하다. 일부 경우에, 예컨대, 바이러스 또는 바이러스-유사 입자와 같은 벡터는, 또한 또는 대안적으로, 예컨대, 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 피막에 편입된 것 같은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 벡터는 외인성 유전자 또는 단백질의 대상체로의 운반 또는 투여를 위한 운반 제제로서 유용할 수 있다. 본 명세서에 기술된 것들을 포함하여, 본 발명의 벡터는, 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드의 운반 또는 투여를 위한 운반 제제로서 유용하다.
벡터, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제의 사용을 포함하여, 본 명세서에서 유용한 분자 생물학적 기술을 설명하는 일반적인 문서는, 위의 Berger, 위의 Sambrook (1989) 및 위의 Ausubel를 포함한다. 예컨대, 본 발명의 동종적인 핵산의 생산을 위하여, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), Q∃-레플리카아제 증폭(Q∃-replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소 매개 기술(예, NASBA)을 포함하는, 시험관 내 증폭 방법을 통하여 기술자들을 지도하는데 충분한 기술의 예는, 모두 상기한 Berger, Sambrook 및 Ausubel는 물론이고, Mullis 등 (1987) 미국특허번호 제 4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis 등, eds.) Academic 출판사 San Diego, CA (1990) (“Innis”); Arnheim와 Levinson (1990년 10월 1일) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177; Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; Lomeli 등 (1989) J. Clin. Chem. 35:1826-1831; Landegren 등 (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu와 Wallace (1989) Gene 4:560-569; Barringer 등 (1990) Gene 89:117-122, 및 Sooknanan와 Malek (1995) Biotechnology 13:563-564에 있다.
PCR은 일반적으로, 핵산의 특정한 부분(예, RNA 또는 DNA)의 미량이 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 의하여 증폭되는 것을 지칭한다(예, 미국특허번호 제 4,683,195호 및 상기 인용된 다른 참조문헌을 참조). 일반적으로, 관심의 영역의 말단에서부터 또는 그 이상에서의 서열 정보가 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)의 설계를 위하여 이용된다. 그러한 프라이머는 증폭될 주형(template)의 반대 가닥에 대하여 서열에 있어서 동일하거나 유사할 것이다. 반대 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 끝과 부합할 수 있다. PCR은, 특이적 RNA 또는 특이적 DNA 서열, 재조합 DNA 또는 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 DNA 및 RNA 서열, 및 총 세포 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열로부터 전사된 cDNA 등을 증폭하기 위하여 이용될 수 있다. PCR은 다른(예, 알려진) 핵산을 프라이머로서 이용하는 것을 포함하는 핵산 테스트 샘플을 증폭하는 핵산 중합효소 반응 방법의 한 예이나 유일한 예는 아니다. 증폭된 핵산을 시험관 내에서 클로닝하는 개선된 방법이 Wallace 등, 미국특허번호 제 5,426,039호에 기술되어 있다. PCR에 의하여 핵산을 크게 증폭하는 개선된 방법은 Cheng 등 (1994) Nature 369:684 685 및 그것에 인용된 참조문헌에 요약되어 있는데, 거기에서는 40킬로베이스(kb)까지의 PCR 증폭이 생성된다. 역전사 효소 및 중합 효소를 이용하여 본질적으로 임의의 RNA가 제한효소 분해(restriction digestion), PCR 확장(PCR expansion) 및 서열화에 적합한 이중-가닥 DNA로 전환될 수 있다는 것을 기술자는 이해할 것이다. 모두 상기한 Ausubel, Sambrook 및 Berger를 참조.
본 발명의 핵산은 다양한 벡터, 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하여, 폴리펩티드를 발현하기 위한 발편 벡터 중 임의의 하나로 편입될 수 있다. 원핵생물 숙주 세포와 양립할 수 있는 발현 벡터가 이용될 수 있는데; 그러한 원핵생물 발현 벡터는 당해 분야에서 알려져 있으며 상업적으로 입수가 가능하다. 그러한 벡터는, 예컨대, BLUESCRIPT 벡터(Stratagene), T7 발현 벡터(Invitrogen), pET 벡터(Novagen) 및 유사한 원핵생물 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
대안적으로 진핵생물 숙주 세포에 양립할 수 있는 발현 벡터가 이용될 수 있다; 그러한 진핵생물 발현 벡터가 당해 분야에서 알려져 있으며 상업적으로 입수가 가능하다. 그러한 벡터는, 예컨대, pCMV 벡터(예, Invitrogen), pIRES 벡터(Clontech), pSG5 벡터(Stratagene), pCDNA3.1(Invitrogen Life Technologies), pCDNA3(Invitrogen Life Technologies), Ubiquitous Chromatin Opening Element(UCOETM) 발현 벡터(Millipore) 및 유사한 진핵생물 발현 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로 UCOETM 벡터는 포유류 세포(예, CHO 세포)에서의 단백질 생산에 이용된다. Millipore에 따르면, UCOETM 발현 기술은 트랜스유전자 침묵(transgene silencing)을 방해하며, 염색체 통합(chromosomal integration)의 자리를 무시하고, 안정한 높은-수준의 유전자 발현을 제공한다. 월드와이드 웹 주소 millipore.com에서의 Millipore 웹사이트를 참조. 예를 들어, 본 발명의 핵산이 편입될 수 있는 예시적인 UCOE 발현 벡터는 CET1019AS-puro-SceI로 명명된 UCOE 발현 벡터이며, 이것은 Millipore의 허가 하에 입수가 가능하다. UCOE 발현 벡터 CET1019AS-puro-SceI에 대한 정보는, 예컨대, John Wynne, “UCOETM Technology Maximizes Protein Expression,” BioProcess International 4(7):104-105 (2006년 7월/8월)(RP1725EN00)(월드와이드 웹 주소 millipore.com/bibliography/tech1/rp1725en00에서 이용가능함)에 있으며; 이러한 벡터에 대한 추가 정보 및 이러한 벡터에 대한 Millipore으로부터의 허가는, 월드와이드 웹 주소 millipore.com/company/cp3/ucoe_licensing 및 millipore.com/techpublications/tech1/ps1013en00을 포함하는, Millipore 웹사이트에서 찾을 수 있다. 따라서, 예를 들어, IgG2 Fc 폴리펩티드(예, 서열번호 184)를 인코딩하는 DNA 서열에 융합되어, 서열번호 201의 DNA 서열이 되는, 변이체 CTLA-4 ECD(예, 서열번호 36 및 서열번호 50)를 인코딩하는 DNA 서열은 UCOE CET1019AS 벡터(Millipore)에 삽입되며, 그 결과의 DNA 플라스미드가 숙주 세포의 형질감염을 위하여 이용될 수 있다.
발현 벡터는 염색체의, 비염색체의 및 합성의 DNA 서열, 예컨대, SV40의 유도체, 박테리아 벡터(예, S. typhimurium , S. typhi , S. flexneri , Listeria monocytogenes, B. anthracis ); 플라스미드; 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 베큘로바이러스; 이스트 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터; 예컨대, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 아데노바이러스, 셈리키-삼림열 바이러스(Semliki-Forest virus)(예, Notka 등, Biol. Chem. 380:341-52 (1999), 폭스바이러스(pox virus)(예, MVA), 알파바이러스(alphavirus)(예, 베네쥬엘라 말뇌염바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEE), 서부말뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus, WEE), 동부말뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEE)), 소낭성구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 계두바이러스(fowl pox virus), 가성광견병(pseudorabies), 단순포진바이러스(herpes simplex viruses), 레트로바이러스(retroviruses) 및 많은 다른 것들을 포함하는 바이러스 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 세포로 유전 물질을 형질도입하는 임의의 벡터 및, 복제를 원한다면, 관련 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 것이 이용될 수 있다. 운반 기구(delivery vehicles)로 기능하는 바이러스 및 박테리아성 벡터는 감쇄될 수 있는데; 원하지 않는 질환 증상의 유도를 제거하지 않는다면, 감쇄는 충분히 줄어야 한다. 도 1은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig를 인코딩하는 예시적인 플라스미드 발현 벡터 pCDNA 변이체 CTLA-4-Ig의 도해이다. 적절한 발현 벡터에 관한 추가적으로 상세한 내용은, 실시예를 포함하여, 하기에 제공되어 있다.
본 명세서에 기술되는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 벡터를 물론이고, 적절한 프로모터 또는 조절 서열이, 적절한 숙주를 형질변형시켜 숙주가 단백질을 발현하게 허용하도록, 이용될 수 있다. 적절한 발현 숙주의 예는 다음을 포함한다: E. coli, Streptomyces 및 Salmonella typhimurium과 같은 박테리아 세포; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris 및 Neurospora crassa과 같은 진균 세포; Drosophila 및 Spodoptera frugiperda과 같은 곤충 세포; 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO)(예, CHO-K1), COS(예, COS-1, COS-7), 새끼 햄스터 신장(baby hamster kidney, BHK) 및 인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney, HEK)(예, HEK 293)과 같은 포유류 세포, 보우스씨 흑색세포종 세포(Bowes melanoma cells) 및 식물 세포. 모든 세포 또는 세포주가 본 발명의 기능적 폴리펩티드 또는 그의 단편을 충분히 생산할 수 있을 필요는 없다는 것이 이해된다. 본 발명은 채용된 숙주 세포에 의하여 한정되지 않는다. 적합한 숙주 세포에 대한 부가적인 상세한 내용이 하기에 제공되어 있다.
박테리아 시스템에서, 많은 발현 벡터는 원하는 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 의도된 이용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 특정 폴리펩티드 또는 그의 단편이 항체의 유도를 위하여 요구될 때, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터는, 관심의 뉴클레오티드 코딩 서열(예, 재조합 변이체 CTLA-4-Ig를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열)이 베타-갈락토시다아제의 아미노-말단 Met 및 이어진 7개의 잔기의 서열과 프레임 내로(in-frame) 벡터에 결찰되어 하이브리드 단백질을 생산할 수 있는, BLUESCRIPT(Stratagene); pIN 벡터(Van Heeke와 Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); pET 벡터(Novagen, Madison WI); 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
유사하게, 이스트 Saccharomyces cerevisiae에서, 알파 인자, 알코올 옥시다아제 및 PGH와 같은 구성 또는 유도성 프로모터를 포함하는 많은 벡터가 본 발명의 폴리펩티드의 생산에 이용될 수 있다. 검토를 위하여, 위의 Ausubel, 위의 Berger 및 Grant 등 (1987) Meth. Enzymol. 153:516-544을 참조
포유류 숙주 세포에서, 바이러스-기반 시스템과 같은, 많은 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 이용되는 경우에, 코딩 서열을 선택적으로 최근 프로모터 및 삼부 리더(tripartite leader) 서열로 구성되는 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내에 결찰된다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역에서의 삽입은 생존가능한 바이러스가 감염된 숙주 세포에서 관심의 폴리펩티드를 발현할 수 있게 한다(Logan과 Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). 추가적으로, 로스 육아종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서가 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시키는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터, 예컨대 발현 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 일반적으로, 재조합형 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 핵산과 같은, 본 발명의 핵산 서열에 결합되고 및/또는 작동적으로 연결되어 있다. 발현 조절 서열은 다른 뉴클레오티드 서열의 발현을 촉진, 증진, 또는 제어하는 뉴클레오티드 서열이다. 채용될 수 있는 적합한 발현 조절 서열은, 구성 프로모터, 유도성 프로모터 및/또는 억제 프로모터, 발현을 증폭시키는 인핸서, 개시 서열, 종결 번역 서열, 스플라이싱 조절 서열, 등을 포함하는 프로모터를 포함한다.
본 발명의 핵산이 벡터에 포함될 때, 핵산은 일반적으로 적절한 전사 조절 서열(프로모터)에 기능적으로 연결되어 mRNA 합성을 유도한다. 프로모터는 재조합 폴리펩티드 발현의 수준에 특히 중요한 영향을 준다. 임의의 적합한 프로모터가 이용될 수 있다. 적합한 프로모터의 예는, 첫 번째 인트론(intron A)을 가지거나 가지지 않는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, HIV 긴 말단 반복 프로모터(long terminal repeat promoter), 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터, 로스 육아종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터, 예컨대 RSV 긴 말단 반복(LTR) 프로모터 같은 것, SV40 프로모터, 마우스 유방암 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV) 프로모터, HSV 프로모터, 예컨대 Lap2 프로모터 또는 헤르페스 티미딘 키나아제(herpes thymidine kinase) 프로모터(예, Wagner 등 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 78:144-145에 기술됨) 같은 것, SV40 또는 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus)에서 유도된 프로모터, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 프로모터, 예컨대 p5 프로모터 같은 것, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터(예, 양 메탈로티오네인 프로모터 또는 마우스 메탈로티오네인 프로모터(예, Palmiter 등 (1983) Science 222:809-814을 참조)), 인간 유비퀴틴(ubiquitin) C 프로모터, E. coli 프로모터, 예를 들어 lac 및 trp 프로모터 같은 것, 파지 람다 PL 프로모터, 및 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 다른 프로모터(세포에서 직접적으로 또는 세포를 감염시킨 바이러스에서)를 포함한다. 포유류, 특히 인간에서, 강한 구성적 기저값(baseline) 발현을 보이는 프로모터, 예컨대 CMV 즉시-초기 프로모터(예, 미국특허번호 제 5,168,062호, 제 5,385,839호, 제 5,688,688호 및 제 5,658,759호에 기술되어 있음)와 같은, CMV 프로모터, 및 그러한 CMV 프로모터와 실질적으로 서열 동일성을 가지는 프로모터가 채용될 수 있다. 또한, 국제특허공개번호 제 WO 02/00897호와 같은 것에서, 증진된 성질을 가지는 재조합 프로모터가 이용될 수 있다.
핵산의 발현을 위하여 본 발명의 핵산에 작동적으로 연결되는 프로모터는 임의의 적합한 작용 메커니즘을 가질 수 있다. 따라서, 프로모터는, 예를 들면, “유도성” 프로모터(예, 성장 호르몬 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열 충격 단백질 프로모터(heat shock protein promoter), E1B 프로모터, 하이폭시아 유도성 프로모터(hypoxia induced promoter), 방사 유도성 프로모터(radiation inducible promoter), 또는 아데노바이러스 MLP 프로모터 및 삼부 리더), 유도-억제 프로모터(inducible-repressible promoter), 발생 단계-관련 프로모터(developmental stage-related promoter)(예, 글로빈 유전자 프로모터), 또는 조직 특이 프로모터(예, 평활근 세포 α-액틴 프로모터(smooth muscle cell α-actin promoter), 미오신 경쇄 1A 프로모터, 또는 혈관 내피 카데린(vascular endothelial cadherin) 프로모터)일 수 있다. 적합한 유도성 프로모터는 엑디손(ecdysone) 및 엑디손-유사체-유도성 프로모터(ecdysone-analog-inducible promoters)를 포함한다. 엑디손-유사체-유도성 프로모터는, 예컨대, Stratagene(La Jolla, CA)을 통하여, 상업적으로 입수가 가능하다. 원한다면, 본 발명의 핵산은 유도성 온- 및 오프- 유전자 발현 시스템을 이용함으로써 유도될 수 있다. 그러한 온- 및 오프- 유전자 발현 시스템의 예는, Tet-OnTM Gene Expression System 및 Tet-OffTM Gene Expression System을 각각 포함한다(Clontech, Palo Alto, CA; 예, 각 그러한 시스템의 자세한 설명을 위하여 Clontech 카탈로그 2000, pg. 110-111을 참조). 유도성 프로모터는, 적절한 신호에 답하여 상승- 및/또는 하강-조절되는(up- and/or downregulated) 임의의 프로모터일 수 있다. 추가적인 유도성 프로모터는, 아라비노스-유도성 프로모터(arabinose-inducible promoter), 스테로이드-유도성 프로모터(steroid-inducible promoter)(예, 글루코코르티코이드-유도성 프로모터(glucocorticoid-inducible promoter))는 물론이고, pH, 스트레스 및 열-유도성 프로모터를 포함한다.
그리고, 특히 숙주에 규칙적으로 존재하지 않는 서열에 대한 숙주 면역 반응으로 인한 유전자 발현 침묵의 엄밀한 회피가 관심이 되는 경우에, 종종, 프로모터는 숙주-자생 프로모터(host-native promoter) 또는 특정 숙주(예, 인간 베타 액틴 프로모터, 인간 EF1α 프로모터, 또는 관심의 핵산에 작동적으로 연결되는 인간 AAV로부터 유도되는 프로모터)를 감염시키는 바이러스로부터 유도되는 프로모터일 수 있다. 또한 관심의 다중 뉴클레오티드 서열에 연결된 양-방향 프로모터 시스템(예, 미국특허번호 제 5,017,478호에 기술됨)이 이용될 수 있다.
다른 적합한 프로모터 및 적합한 프로모터의 선택, 이용 및 구성과 관련된 원리들이, 예컨대, Werner (1999) Mamm Genome 10(2):168-75, Walther 등 (1996) J. Mol. Med. 74(7):379-92, Novina (1996) Trends Genet. 12(9):351-55, Hart (1996) Semin. Oncol. 23(1):154-58, Gralla (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6(5):526-30, Fassler 등 (1996) Methods Enzymol 273:3-29, Ayoubi 등 (1996), 10(4) FASEB J 10(4):453-60, Goldsteine 등 (1995) Biotechnol. Annu. Rev. 1:105-28, Azizkhan 등 (1993) Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 3(4):229-54, Dynan (1989) Cell 58(1):1-4, Levine (1989) Cell 59(3):405-8, 및 Berk 등 (1986) Annu. Rev. Genet. 20:45-79은 물론이고, 미국특허번호 제 6,194,191호에 제공되어 있다. 다른 적합한 프로모터가, 진핵생물 프로모터 데이터베이스(Eukaryotic Promoter Database)(배포 68)(월드와이드 웹사이트 주소 epd.isb-sib.ch/)에서 접근 가능함) 및 다른 유사 데이터베이스, 전자 조절 영역 데이터베이스(Transcription Regulatory Regions Database, TRRD)(버전 4.1)(월드와이드 웹사이트 주소 bionet.nsc.ru/trrd/에서 이용가능함) 및 전사 인자 데이터베이스(transcription factor database, TRANSFAC)(월드와이드 웹사이트 주소 transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html에서 이용가능함)와 같은, 다른 유사한 데이터베이스의 이용에 의하여 확인될 수 있다.
프로모터에 대한 대안으로서, 특히, RNA 벡터 및 구성체에서, 본 발명의 벡터 또는 핵산은 하나 이상의 내부 리보솜 침입 부위(internal ribosome entry sites, IRESs), IRES-인코딩 서열, 또는 RNA 서열 인핸서(Kozak 공통 서열 유사체), 예컨대 타바코 모자이크 바이러스 오메가 프라임 서열(tobacco mosaic virus omega prime sequence)을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, Gal4 활성자(activator) 서열(예, 미국특허번호 제 6,133,028호를 참조)과 같은 상류 활성자 서열(upstream activator sequence, UAS)와 다른 적합한 상류 조절 서열(미국특허번호 제 6,204,060호를 참조)을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는 포유류 세포에서 기능적인 Kozak 공통 서열을 포함할 수 있다. Kozak 서열은, 미국특허번호 제 6,107,477호에 기술된 변형 Kozak 공통 서열과 같은, 자연적으로 발생하는 또는 변형된 서열일 수 있다.
특이적 개시 신호는, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드-인코딩 뉴클레오티드 서열과 같은, 본 발명의 코딩 서열의 효율적인 번역에 있어서 도움을 줄 수 있다. 그러한 신호는 본 발명의 벡터에 포함될 수 있다. 이러한 신호는, 예컨대, ATG 개시 코돈 및 이웃한 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열, 그의 개신 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터에 삽입되는 경우, 추가적인 번역 조절 신호가 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 오직 코딩 서열(예, 성숙 단백질 코딩 서열) 또는 그의 일부만이 삽입되는 경우에, ATG 개신 코돈을 포함하는 외인성 핵산 전사 조절 서열이 제공되어야 한다. 또한, 개신 코돈은 정확한 리딩 프레임에 있어서 전체 삽입물(insert)의 전사를 확보해야 한다. 외인성 전사 성분 및 개시 코돈은 다양한, 예컨대 자연적인 그리고 합성적인 기점(origin)일 수 있다. 발현의 효율성은, 사용 중인 세포 시스템에 대하여 적절한 인핸서를 내포함으로써, 증진될 수 있다(예, Scharf 등, Results Probl. Cell. Differ. 20:125-62 (1994); 및 Bittner 등, Meth. Enzymol. 153:516-544 (1987)을 참조). 적합한 인핸서는 로스 육아종 바이러스(RSV) 인핸서 및 미국특허번호 제 6,225,082호에 기술된 RTE 인핸서를 포함한다.
숙련된 기술자는, 서열이 포유류 세포에서 발현될 때(시작 코돈에서의 포르밀-메티오닌(formyl-methionine) 잔기의 도입과 같은, 다른 변형은 박테리아 및/또는 다른 진핵생물 세포에서 일어날 수 있음), 관심의 특정 뉴클레오티드 서열의 5 말단으로 시작 코돈(ATG)을 도입하는 것은 종종 인코딩된 아미노산으로 N-말단 메티오닌의 첨가를 만든다는 것을, 인식할 것이다. 진핵생물 세포에서 본 발명의 핵산의 발현을 위하여, 시작 코돈 및 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 본 발명의 핵산 서열(예, 서열번호 80)의 5' 말단에 포함되며, 종결 코돈은 일반적으로 핵산(예, 서열번호 80)의 C 말단에 포함된다. 예시적인 신호 펩티드 서열은 hCTLA-4 신호 펩티드 서열(서열번호 182)이며; 조직 플라스미노겐 활성자 신호 펩티드(tissue plasminogen activator signal peptide)를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 181에 나타나있다. 다른 예시적인 신호 펩티드 서열은 hCTLA-4 신호 펩티드 서열(서열번호 216)이며, 이것은 서열번호 215에 나타낸 핵산 서열에 의하여 인코딩된다.
종결 서열은 하기에서 자세히 검토된다.
그러한 요소가 선택의 벡터 구성체에 포함될 수 있다. 발현 시에, 핵산(예, 서열번호 80)에 의하여 인코딩된 폴리펩티드 변형체는 처음에 N-말단 메티오닌 잔기 및 신호 펩티드 서열을 포함할 것이다. 그러나, N-말단 메티오닌과 신호 펩티드 서열은 분비 중에 절단될 것이고, 그렇게 함으로써 인코딩된 폴리펩티드(예, 서열번호 1)를 생성한다.
본 발명의 핵산(또는 본 발명의 대응 폴리펩티드)의 발현 수준은 임의의 적합한 기술에 의하여 평가될 수 있다. 예는 노던 블랏 분석(Northern Blot analysis)(예, McMaster 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(11):4835-38 (1977) 및 아래의 Sambrook에서 검토됨), 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)(미국특허번호 제 5,601,820호 및 Zaheer 등, Neurochem. Res. 20:1457-63 (1995)에 기술됨), 및 인-시츄(in situ) 혼성화 기술(예, 미국특허번호 제 5,750,340호 및 제 5,506,098호에 기술됨)을 포함한다. 또한, 단백질의 정량화는 Lowry 분석 및 다른 단백질 정량 분석(예, Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976); Lowry 등, J. Biol. Chem. 193:265 (1951)을 참조)에 의하여 성취될 수 있다. 재조합형 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 세포의 용해물로부터 얻은 본 발명의 재조합형 폴리펩티드의 웨스턴 블랏 분석은, 재조합형 폴리펩티드 발현의 수준을 평가하기 위한 또 다른 적합한 기술이다.
본 발명의 벡터, 예컨대, 발현 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, 번역 개시 및 전사-종결 영역을 위한 리보좀-결합 자리(ribosome-binding site)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 전사-종결 영역은, DNA 서열로부터 생산된 RNA 전사체의 절단 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 용이하게 하는 폴리아데닐화 서열이다. 합성 최적화 서열은 물론, BGH(소 성장 호르몬(Bovine Growth Hormone))의 폴리아데닐화 서열, 인간 성장 호르몬 유전자, 폴리오마(polyoma) 바이러스, TK(티미딘 키나아제(Thymidine Kinase)), EBV(엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)), 래빗 베타 글로빈(rabbit beta globin), 그리고 인간유두종바이러스(human papillomaviruses) 및 BPV(소유두종바이러스(Bovine Papilloma Virus)를 포함하는 유두종바이러스(papillomaviruses)를 포함하는, 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 이용될 수 있다. 또한 적합한 폴리아데닐화(polyA) 서열은 SV40(인간 육종 바이러스-40) 폴리아데닐화 서열 및 BGH polyA 서열을 포함한다. 그러한 polyA 서열이, 예컨대, Goodwin 등 (1998) Nucleic Acids Res. 26(12):2891-8, Schek 등 (1992) Mol. Cell. Biol. 12(12):5386-93, 및 van den Hoff 등 (1993) Nucleic Acids Res. 21(21):4987-8에 기술되어 있다. 적절한 폴리아데닐화 서열의 선택에 관련된 추가적인 원리들이, 예컨대 Levitt 등 (1989) Genes Dev. 1989 3(7):1019-1025, Jacob 등 (1990) Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1(1):49-59, Chen 등 (1995) Nucleic Acids Res. 23(14):2614-2620, Moreira 등 (1995) EMBO J. 14(15):3809-3819, Carswell 등 (1989) Mol. Cell. Biol. 9(10):4248-4258에 기술되어 있다.
본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, 미국특허번호 제 4,959,317호, 제 5,801,030호 및 제 6,063,627호, 유럽특허출원번호 제 0 987 326호 및 국제특허출원공개번호 제 WO 97/09439호에 기술된 바와 같이, 관심의 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는데 사용될 수 있는, 부위-특이적 재조합 자리(site-specific recombination sites)를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, 원하는 세포 구획, 막, 또는 세포 기관에 폴리펩티드 발현을 표적화하거나, 주변세포질(periplasmic) 공간 또는 세포 배양 배지 내로 폴리펩티드 분비를 유도하기 위하여, 분비/위치이동 서열을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 그러한 서열은 당해 분야에서 알려져 있으며, 분비 리더(secretion leader) 펩티드 또는 신호 펩티드, 세포 기관 표적화 서열(예, 핵 위치이동 서열(nuclear localization sequence), ER 보유 신호(ER retention signal), 미토콘드리아 수송 서열, 엽록체 수송 서열), 막 위치이동/고착 서열(예, 정지 운반 서열, GPI 고착 서열) 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분비 및/또는 위치이동 서열을 인코딩하는 그러한 핵산에 프레임 내로(in-frame) 융합될 수 있다. 본 발명의 그러한 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 분비 및/또는 위치이동 서열(들)에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
덧붙여, 디하이드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase resistance) 내성, 네오마이신(neomycin) 내성, G418 내성, 푸로마이신(puromycin) 내성, 및/또는 진핵생물 세포 배양에서 블라스티시딘(blasticidin) 내성과 같이, 또는 E. coli에서 테트라사이클린(tetracycline) 또는 앰피실린(ampicillin) 내성과 같이, 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성(phenotypic trait)을 제공하기 위하여, 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택 마커 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는 미생물에서 증식에 유용한 복제 기점(origin of replication)을 포함할 수 있다. 이용되는 박테리아의 복제 기점(Ori)은 바람직하게는, 포유류 세포 내에서 유전자 발현에 불리하게 영향을 주지 않는 것이다. 유용한 복제 기점 서열의 예는 f1 파지 ori, RK2 oriV, pUC ori, 및 pSC101 ori을 포함한다. 복제 기점 서열은 ColEI ori 및 p15(플라스미드 pACYC177, New England Biolab사로부터 입수 가능함)를 포함하며, 대안적으로 다른 저 복제 ori 서열(p15에 유사함)은 일부 맥락에 있어서 바람직하다. 이러한 점에 있어서 핵산은 셔틀 벡터로서 바람직하게 작용하며, 진핵생물 및 원핵생물 숙주 둘 다(예, 진핵생물 및 원핵생물 둘 다에서 인식되는 복제 기점 서열을 포함하는 벡터)에서 복제하고 및/또는 발현될 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 핵산을 포함하여, 예를 들어, 선형 발현 요소를 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터(예, Sykes와 Johnston (1997) Nat Biotech 17:355-59에서 기술됨), 탄탄한(compacted) 핵산 벡터(예, 미국특허번호 제 6,077,835호 및/또는 국제특허출원공개번호 제 WO 00/70087호에 기술됨), pCDNA3.1, pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, “깔따구(midge)” 소형-크기 핵산 벡터(예, Schakowski 등 (2001) Mol. Ther. 3:793-800에서 기술됨)와 같은, 또는 CaPO4 침전 구성체(예, 국제특허출원번호 제 WO 00/46147호, Benvenisty와 Reshef (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9551-55, Wigler 등 (1978), Cell 14:725, 및 Coraro와 Pearson (1981) Somatic Cell Genetics 7:603)와 같은 침전 핵산 벡터 구성체와 같은 플라스미드 벡터를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 CMV 프로모터 또는 CMV 프로모터 변형체 및 적합한 폴리아데닐화 서열과 작동적으로 연결된 서열번호 80을 포함하는 네이키드 DNA 플라스미드를 제공한다. 네이키드 뉴클레오티드 벡터 및 그의 이용은 당해 분야에서 알려져 있다(예, 미국특허번호 제 5,589,466호 및 제 5,973,972호를 참조).
본 발명의 벡터는 일반적으로, 박테리아 시스템, 진핵생물 시스템, 포유류 시스템, 또는 다른 시스템에서 발현에 적합한 발현 벡터일 수 있다(클로닝 벡터로 지칭될 수 있는, 발현 없이 핵산 서열을 복제하는 것으로 설계된 벡터와는 대조적임). 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열(예, 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig를 인코딩하는 핵산 서열)을 포함하는 박테리아 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 적합한 벡터는, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수준을 유도하는 벡터(예, BLUESCRIPT(Stratagene)와 같은 다기능적 E. coli 클로닝 및 발현 벡터, pIN 벡터(Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989); pET 벡터(Novagen, Madison WI); 등)를 포함한다. 그러한 박테리아 발현 벡터가 본 발명의 특정 폴리펩티드를 발현하는 데 있어서 유용할 수 있는 반면에, 본 발명의 글리코단백질(glycoproteins)은 바람직하게는 진핵생물 세포에서 발현될 수 있으며, 또한 그러한 본 발명은 진핵생물 발현 벡터를 제공한다.
발현 벡터는 이스트 세포에서 본 발명의 핵산의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 이스트 시스템에서 발현에 적합한 임의의 벡터가 채용될 수 있다. 예컨대, Saccharomyces cerevisiae에서 사용되기에 적합한 벡터는, 알파 인자, 알코올 옥시다아제 및 PGH와 같은, 예컨대, 구성 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터를 포함한다(위의 Ausubel, 위의 Berger, 및 Grant 등, Meth. Enzymol. 153:516-544 (1987)에서 검토됨). 보통, 발현 벡터는, 곤충 세포(예, SF-9 세포) 또는 포유류 세포(예, CHO 세포, 293 세포, HeLa 세포, 인간 섬유아 세포(human fibroblast cell), 또는 유사한 좋은 특성을 가지는 세포)와 같은, 동물 세포에서 본 발명의 핵산의 발현에 적합한 벡터일 것이다. 적합한 포유류 발현 벡터가 당해 분야에서 알려져 있다(예, Kaufman, Mol. Biotechnol. 16(2):151-160 (2000), Van Craenenbroeck, Eur. J. Biochem. 267(18):5665-5678 (2000), Makrides, Protein Expr. Purif. 17(2):183-202 (1999), 그리고 Yarranton, Curr. Opin. Biotechnol. 3(5):506-511 (1992)을 참조). 또한, 적합한 곤충 세포 플라스미드 발현 벡터가 알려져 있다(Braun, Biotechniques 26(6):1038-1040:1042 (1999)).
발현 벡터는 일반적으로, 진핵생물 세포(포유류 세포, 이스트 세포, 또는 식물 세포와 같은) 또는 박테리아 세포와 같은 원핵생물 세포일 수 있는, 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 숙주 세포 내로의 핵산 벡터 또는 발현 벡터의 도입(예, 형질감염)은, 인산칼슘 형질감염(예, Graham 등, Virology 52:456-457 (1973)의 인산칼슘 공동-침전 방법을 참조), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 전기천공, 유전자 또는 백신 총(gun), 주입, 지질감염(lipofection) 및 바이오리스틱(biolistics) 또는 다른 통상의 기술(예, Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION: A LABORATORY MANUAL, Stockton Press (1990)을 참조; 생체 내, 생체 외, 및 시험관 내 방법의 설명을 위하여 Davis, L., Dibner, M., 및 Battey, I., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986)을 참조)에 의하여 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 이러한 및 다른 벡터들을 포함하는 세포들은 본 발명의 중요한 부분을 이룬다.
하나의 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 벡터를 제공한다: (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96% 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 여기에서 상기 제1 폴리펩티드는 인간 CD86 및/또는 인간 CD80 및/또는 둘 중의 하나의 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하고 및/또는 면역 반응을 억제하며, (ii) 면역글로불린(Ig) 폴리펩티드의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열. Ig 폴리펩티드는 선택적으로 인간 Ig Fc 폴리펩티드(예, IgG1, IgG2, IgG4 등) 또는 변이체 Ig Fc 폴리펩티드(예, 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산(예, 세린 잔기)로 치환되어 두 개의 Ig 사슬들 사이에 형성되는 하나 이상의 이황화 결합을 제거하거나, 하나 이상의 프롤린 잔기가 다른 아미노산(예, 프롤린)으로 치환되어 효과기 기능을 감소시키는(감소된 Fc 수용체 결합), Ig Fc 폴리펩티드)이다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 의하여 제공되는 추가적인 핵산은 코스미드(cosmids)를 포함한다. 임의의 적합한 코스미드 벡터가 본 발명의 핵산 서열을 복제하고, 운반하고 발현하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로, 코스미드는 박테리아 oriV, 항생제 선택 마커, 클로닝 자리, 및 박테리오파지 람다에서 유도되는 하나 또는 두 개의 cos 자리를 포함한다. 코스미드는 SV40 oriV를 포함하여, 셔틀 코스미드 또는 포유류 코스미드일 수 있으며, 바람직하게는, 적합한 포유류 선택 마커(들)일 수 있다. 코스미드 벡터는 Hohn 등 (1988) Biotechnology 10:113-27에서 추가로 기술되어 있다.
본 발명의 핵산은 숙주 또는 숙주 세포에 포함되고, 및/또는 적절한 운반 기구(즉, 벡터)의 형태로 숙주 또는 숙주 세포에 투여될 수 있다. 벡터는, 염색체, 비-염색체, 임의의 합성 핵산 벡터, 또는 상기에서 기술된 다른 벡터를 포함하는, 임의의 적합한 벡터일 수 있으며, 상기-서술한 발현 요소 및/또는 다른 형질감염-용이화 및/또는 발현-증진 서열 요소를 포함할 수 있다. 그러한 벡터의 예는, 바이러스, 박테리아 플라스미드, 파지, 코스미드, 파지미드(phagemids), SV40의 유도체, 베큘로바이러스, 이스트 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터, 폴리리신, 및 박테리아 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 DNA 서열의 운반은, 본 명세서에서 추가로 검토된 바와 같이, 네이키드 DNA 플라스미드 또는 하나 이상의 형질감염-향상 제제(transfection-enhancing agents)와 결합된 플라스미드를 이용하여 달성될 수 있다. 플라스미드 DNA 벡터는 임의의 적합한 특징들의 조합을 가질 수 있다. 플라스미드 DNA 벡터는 강한 프로모터/인핸서 영역(예, 인간 CMV, RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 또는 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리(A) 종결 서열, E. coli에서 플라스미드 생산을 위한 복제 기점, 선택 마커로서 항생제 내성 유전자, 및 편리한 클로닝 자리(예, 폴리링커)를 포함할 수 있다. 이러한 관점에서 본 발명의 핵산의 운반을 위한 특정 플라스미드 벡터가 도 1에 나타나 있다; 이 벡터의 구성 및 특징은 하기 실시에에 기술되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 비-핵산 벡터를 제공한다. 그러한 비-핵산 벡터는, 예컨대, 재조합 바이러스, 바이러스 핵산-단백질 접합체(때때로, 재조합 바이러스 입자를 가지는 바이러스 벡터라고 지칭될 수 있음), 또는 재조합(및 보통은 감쇄된) Salmonella, Shigella, Listeria, 및 Bacillus Calmette - Guerin(BCG) 박테리아 세포와 같은 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은, 본 발명의 서열의 핵산을 포함하는, 바이러스 벡터, 곤충 벡터, 박테리아 벡터, 또는 식물 벡터를 제공한다. 이러한 관점에서 임의의 적합한 바이러스, 곤충, 식물, 또는 박테리아 벡터가 이용될 수 있으며, 많은 수가 당해 분야에 알려져 있다. 바이러스 벡터는, 임의의 수의 바이러스 폴리뉴클레오티드를, 단독으로(바이러스 핵산 벡터) 또는, 더 통상적으로는 원하는 숙주 세포에서 본 발명의 핵산의 운반, 복제, 및/또는 발현을 용이화시키는, 하나 이상(일반적으로 둘, 셋 또는 그 이상)의 바이러스 단백질과 조합하여, 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 세포내 박테리아(예, Listeria monocytogenes)는 본 발명의 핵산을 운반하기 위하여 이용될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 핵산의 플라스미드 DNA 운반을 위한 예시적인 박테리아 벡터는 Listeria monocytogenes(Lieberman 등, Vaccine 20:2007-2010 (2002))이다.
본 발명은, 본 발명의 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하도록 변형된 재조합형 또는 분리형 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는, 바이러스 게놈, 바이러스 단백질/핵산 접합체, 바이러스-유사 입자(virus-like particle, VLP), 미국특허번호 제 5,849,586호 및 국제특허출원번호 제 WO 97/04748호에 기술된 것들과 유사한 벡터, 또는 하나 이상의 바이러스 핵산을 포함하는 비손상(intact) 바이러스 입자 들 중 모두 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 바이러스 벡터는 일반적으로 본 발명의 적어도 하나의 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하도록 조작된다. 바이러스 벡터(즉, 재조합 바이러스)는 야생형 바이러스 입자 또는 변형 바이러스 입자를 포함할 수 있는데, 그의 특정 예가 하기에 검토되어 있다. 일반적으로 많은 바이러스가, 본 명세서에 기술된 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig를 인코딩하는 핵산과 같은, 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 외인성 핵산의 운반을 위한 벡터로서 이용된다. 그러한 벡터는, 일반적으로 baculoviridiae, parvoviridiae, picomoviridiae, herpesveridiae, poxviridae, adenoviridiae, 또는 picornnaviridiae에서 선택된, 재조합적으로 변형된 피막성(enveloped) 또는 비-피막성(non-enveloped) DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터는 재조합 핵산 기술에 의하여 변형되어 복제 결핍(replication deficient)이거나, 복제 가능(replication competent)이거나, 또는 조건부로 복제할 수 있다.
바이러스 벡터는, 다른 벡터 또는, 아데노바이러스 벡터 앰플리콘(amplicon)과 같은, 복제 및/또는 발현을 위한 야생형 바이러스(즉, 헬퍼-의존성 바이러스(helper-dependent virus))의 존재를 요구하는 벡터일 수 있다. 일반적으로, 그러한 바이러스 벡터는, 야생형 바이러스 입자, 또는, 단백질 및/또는 핵산 내용물 안에서 변형되어 트랜스유전자 능력을 증가시키거나 핵산의 형질감염 및/또는 발현에 있어서 도움을 주는, 바이러스 입자를 포함한다(그러한 벡터의 예는 헤르페스 바이러스/AAV 앰플리콘을 포함함). 바이러스 게놈은, 소정 조건 하에서만 복제 또는 발현을 달성하는 유도성 프로모터를 포함하도록 변형될 수 있다.
바이러스 벡터는, 보통 동물, 바람직하게는, 예컨대 인간을 포함하는 포유류와 같은 척추동물을 감염시키는 바이러스로부터 유래하거나, 그것을 포함할 수 있다. 이러한 관점에서 적합한 바이러스 벡터 입자는, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자(adenoviridae의 임의의 바이러스를 포함하거나 또는 그것의 바이러스로부터 유도됨), 아데노-관련 바이러스 벡터 입자(adeno-associated viral)(AAV 벡터 입자) 또는 다른 파보바이러스 및 파보바이러스 벡터 입자, 유두종바이러스 벡터 입자, 셈리키-삼림열(Semliki-Forest) 바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터(flaviviral vector), 피코르나바이러스 벡터(picornaviral vector), 알파바이러스 벡터(alphaviral vector), 헤르페스 바이러스 벡터(herpes viral vector), 폭스 바이러스 벡터(pox virus vector), 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 포함하는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)를 포함한다. 그러한 바이러스 및 바이러스 벡터의 예가, 예컨대 위의 Fields Virology, Fields 등, eds., Virology, Raven Press사, New York (1996년 3판 및 2001년 4판), ENCYCLOPEDIA OF VIROLOGY, R.G. Webster 등, eds., Academic Press(1999년 2판), FUNDAMENTAL VIROLOGY, Fields 등, eds., Lippincott-Raven (3rd ed., 1995), Levine, "Viruses," Scientific American Library No. 37 (1992), MEDICAL VIROLOGY, D.O. White 등, eds., Academic Press (1994년 2판), 및 INTRODUCTION TO MODERN VIROLOGY, Dimock, N.J. 등, eds., Blackwell Scientific Publications사 (1994)에 제공되어 있다.
본 발명 및 본 명세서에 기술된 방법의 핵산과 함께 채용될 수 있는 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함하는데, 이것은, 예컨대, Carter (1992) Curr. Opinion Biotech. 3:533-539 (1992) 및 Muzcyzka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129 (1992)에 검토되어 있다. AAV 벡터의 부가적인 타입 및 양태는, 예컨대, Buschacher 등, Blood 5(8):2499-504, Carter, Contrib. Microbiol. 4:85-86 (2000), Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3(1):41-49 (2001), Taj, J. Biomed. Sci. 7(4):279-91 (2000), Vigna 등, J. Gene Med. 2(5):308-16 (2000), Klimatcheva 등, Front. Biosci. 4:D481-96 (1999), Lever 등, Biochem. Soc. Trans. 27(6):841-47 (1999), Snyder, J. Gene Med. 1(3):166-75 (1999), Gerich 등, Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 5(2):118-23 (1998), 및 During, Adv. Drug Deliv. Review 27(1):83-94 (1997), 그리고 미국특허번호 제 4,797,368호, 제 5,139,941호, 제 5,173,414호, 제 5,614,404호, 제 5,658,785호, 제 5,858,775호, 및 제 5,994,136호는 물론이고, 본 명세서의 다른 부분에서 검토된 참조문헌에 검토되어 있다. 아데노-관련 바이러스 벡터는, 예를 들면, 미국특허번호 제 4,797,368호 및 Laughlin 등, Gene 23:65-73 (1983)호에 제시된 방법을 이용하여, 구성되고 및/또는 정제될 수 있다.
알파바이러스 벡터는 다른 맥락에서 유전자 운반 벡터일 수 있다. 알파바이러스 벡터는 당해 분야에서 알려져 있으며, 예컨대, Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3:533-539, Schlesinger Expert Opin. Biol. Ther. (2001) 1(2):177-91, Polo 등, Dev. Biol. (Basel). 2000;104:181-5, Wahlfors 등, Gene Ther. (2000) 7(6):472-80, 국제특허출원공개번호 제 WO 01/81609호, 제 WO 00/39318호, 제 WO 01/81553호, 제 WO 95/07994호, 제 WO 92/10578호에 기술되어 있다.
바이러스 벡터의 다른 이로운 그룹은 헤르페스 바이러스 벡터이다. 예들이, 예컨대, Lachmann 등, Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1(5):622-32, Fraefel 등, Adv. Virus Res. (2000) 55:425-51, Huard 등, Neuromuscul. Disord. (1997) 7(5):299-313, Frenkel 등, Gene Ther. (1994) Suppl 1:S40-6, 미국특허번호 제 6,261,552호 및 제 5,599,691호에 기술되어 있다.
또한, 렌티바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터는 특정한 맥락에서 바람직한 유전자 운반 수단일 수 있다. 당해 분야에서 알려진 많은 레트로바이러스 벡터가 있다. 레트로바이러스 벡터의 예가, 예컨대, Miller, Curr Top Microbiol. Immunol. (1992) 158:1-24, Weber 등, Curr. Opin. Mol. Ther. (2001) 3(5):439-53, Hu 등, Pharmacol. Rev. (2000) 52(4):493-511, Kim 등, Adv. Virus Res. (2000) 55:545-63, Palu 등, Rev. Med. Virol. (2000) 10(3):185-202, Takeuchi 등, Adv. Exp. Med. Biol. (2000) 465:23-35, 미국특허번호 제 6,326,195호, 제 5,888,502호, 제 5,580,766호 및 제 5,672,510호에 기술되어 있다.
바큘로바이러스 벡터는, 특히 본 발명의 폴리펩티드의 생산에 유리한 또 다른 바이러스 벡터 그룹이다. 바큘로바이러스 벡터의 생산 및 이용은 알려져 있다(예컨대, Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 10(5):428-433 (1999); Jones, Curr. Opin. Biotechnol. 7(5):512-516 (1996)을 참조). 벡터가 치료적 이용을 위하여 사용되는 경우, 원하는 치료적 효과를 바라는 표적 세포를 충분히 감염(또는 핵산 벡터의 경우 형질감염 또는 형질변형)시킬 수 있도록 하는 벡터가 선택될 것이다.
또한, 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 적합한 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, 예컨대, Graham 등 (1995) Mol. Biotechnol. 33(3):207-220, Stephenson (1998) Clin. Diagn. Virol. 10(2-3):187-94, Jacobs (1993) Clin Sci (Lond). 85(2):117-22, 미국특허번호 제 5,922,576호, 제 5,965,358호 및 제 6,168,941호, 그리고 국제특허출원 제 WO 98/22588호, 제 WO 98/56937호, 제 WO 99/15686호, 제 WO 99/54441호, 및 제 WO 00/32754호에 기술되어 있다. 본 발명의 실시에 유용하며 본 발명의 핵산의 유기체적인 생체 내 형질도입 및 발현에 적합한, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터는, 예컨대, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64, Latchman (1994) Molec. Biotechnol. 2:179-195, 및 Johanning 등 (1995) Nucl. Acids Res. 23:1495-1501에 일반적으로 기술되어 있다.
바이러스 벡터는 숙주 세포에서 복제-결핍일 수 있다. 보완적인(complementing) 아데노바이러스 또는 적어도 아데노바이러스 유전자 생산물(예컨대, 헬퍼 바이러스(helper virus), 플라스미드, 또는 상보성 세포(complementation cell)에 의하여 제공됨)의 부재에서는 자연적으로 복제-결합이 되는, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터가 포함된다. “복제-결핍”은, 바이러스 벡터가 적어도 하나의 복제-필수 유전자(replication-essential gene) 기능이 결여된 게놈을 포함한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 유전자, 유전자 기능, 또는 유전자 또는 게놈 영역에서의 결핍은, 핵산 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 결실되어 있는, 유전자의 기능에 손상을 주거나 없애기에 충분한 바이러스 게놈의 유전적 물질의 결실로 정의된다. 복제-필수(replication-essential) 유전자 기능은 복제-결핍 바이러스 벡터의 복제(즉, 증식)에 필요한 유전자 기능이다. 바이러스 벡터 입자의 필수적인 유전자 기능은 문제가 되는 바이러스 벡터 입자의 타입에 따라 변한다. 복제-결핍 바이러스 벡터 입자의 예가, 예컨대, Marconi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(21):11319-20 (1996), Johnson과 Friedmann, Methods Cell Biol. 43 (pt. A):211-30 (1994), Timiryasova 등, J. Gene Med. 3(5):468-77 (2001), Burton 등, Stem Cells 19(5):358-77 (2001), Kim 등, Virology 282(1):154-67 (2001), Jones 등, Virology 278(1):137-50 (2000), Gill 등, J. Med. Virol. 62(2):127-39 (2000)에 기술되어 있다. 다른 복제-결핍 벡터는 단순한 MLV 벡터(Miller 등 (1990) Mol. Cell Biol. 10:4239; Kolberg (1992) J. NIH Res. 4:43, 및 Cornetta 등 (1991) Hum. Gene. Ther. 2:215)에 기반한다. 카나리 폭스(canary pox) 벡터는 인간 세포를 감염시키는 데 유리하나, 그 안에서 자연적으로 복제할 수 없다(즉, 유전적 변형이 없이).
재조합 바이러스 벡터의 기본 구성은 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, 예컨대, Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press 1989)과 그의 3판(2001), Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley Interscience Publishers 1995), 및 위의 Watson, 그리고 본 명세서에 언급된 몇 개의 다른 참조문헌에 기술된 것들과 같은, 표준 분자 생물학적 기술을 이용하는 것을 수반한다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는, 예컨대, Graham 등, Mol. Biotechnol. 33(3):207-220 (1995), 미국특허번호 제 5,965,358호, Donthine 등, Gene Ther. 7(20):1707-14 (2000), 그리고 본 명세서에 기술된 다른 참조문헌에 제시된 방법들을 이용하여, 구성되고 및/또는 정제될 수 있다. 아데노-관련 바이러스 벡터는, 예를 들어, 미국특허번호 제 4,797,368호 및 Laughlin 등, Gene 23:65-73 (1983)에 제시된 방법들을 이용하여 구성되고 및/또는 정제될 수 있다. 다른 바이러스 벡터에 관한, 특히 헤르페스 바이러스 벡터(예컨대, Lachman 등, Curr. Opin. Mol. Ther. 1(5):622-32 (1999)), 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터에 관한, 유사한 기술이 당해 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터는 핵산의 삽입(예를 들면, 야생형 아데노바이러스 벡터는 결실 없이 3 KB까지의 삽입을 포함할 수 있음)을 포함하며, 또는 더 일반적으로, 바이러스 게놈의 하나 이상의 결실을 포함하여, 원한다면, 핵산 및 부가적인 핵산의 삽입을 수용하고, 숙주 세포에서 복제를 방지한다.
또한, 예컨대, DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜과 같은 운반 수단과 복합된 핵산과 같은, 비-바이러스 벡터는, 벡터를 숙주(예컨대, 특정 장기, 조직 및/또는 세포 타입) 내의 특정 영역에 표적화하는 분자들과 결합되어 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드는, 수용체에 결합하는 바이러스 단백질, 또는 특정 표적의 수용체에 결합하는(예, Wu 등, J. Biol. Chem. 263(29):14621-24 (1988)의 기술의 변형에 의하여) 단백질과 같은, 표적화 단백질에 접합될 수 있다. 표적화된 양이온성 지질 조성물은 알려져 있다(예, 미국특허번호 제 6,120,799호를 참조). 표적화 유전적 구성체를 위한 다른 기술이 국제특허출원번호 제 WO 99/41402호에 제공되어 있다.
발현 숙주
또한 본 발명은, 본 발명의 벡터(예, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터) 또는 본 발명의 핵산으로 형질도입되거나, 형질감염되거나, 형질전환된, 조작된 숙주 세포를 제공한다. 조작된 숙주 세포는, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 관심의 핵산을 증폭하기에 적당하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH, 등과 같은, 배양 조건은 발현을 위하여 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것들이며, 당해 분야의 기술자들에게, 그리고 예컨대, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3판, Wiley - Liss, New York 및 그것에 인용된 참조문헌을 포함하는 본 명세서에 인용된 참조문헌에서 분명할 것이다. 본 발명의 그러한 벡터 또는 핵산에 의하여 인코딩된 본 발명의 폴리펩티드는 그러한 숙주 세포에서 발현되고, 표준 기술에 의하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물로 방출된 폴리펩티드는 초원심분리(ultracentrifugation) 또는 유사한 기술에 의한 배양물로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 인간 및 비-인간 영장류 세포를 포함하는 포유류 세포(예, CHO 세포)와 같은 동물 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 발현 숙주에서, 그리고, 식물, 이스트, 균류, 박테리아, 등과 같은 비-동물 세포에서 생산될 수 있다. 적합한 발현 숙주의 예는, E. coli, Streptomyces, 및 Salmonella typhimurium과 같은 박테리아 세포; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, 및 Neurospora crassa과 같은 진균 세포; Drosophila 및 Spodoptera frugiperda과 같은 곤충 세포; CHO(예, CHO-K1), COS (예, COS-1, COS-7), BHK, 및 HEK (예, HEK 293) 세포와 같은 포유류 세포, 보우스씨 흑색세포종 세포(Bowes melanoma cells), 및 식물 세포를 포함한다. 상기에서 주지된 바와 같이, 본 발명은 채용된 숙주 세포로 한정되지 않는다. 모두 상기한 Sambrook, Berger 및 Ausubel에 덧붙여, 세포 배양에 관한 자세한 내용은, 예컨대, Payne 등 (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons사 New York, NY; Gamborg과 Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg NY); Atlas & Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL에 있다. 그러한 숙주 세포는, 당해 분야에서 알려진 절차를 이용하여, 예컨대 화학적 규명(chemically defined, CD) 배지(예, CD OptiCHOTM (Invitrogen, #12681)과 같은)과 같은, 무-혈청, 무-단백질 매질, 무-동물 성분 매질에서의 성장에 적합하게 할 수 있다.
본 발명은, 본 명세서에 기술된 본 발명의 핵산, 벡터, 또는 다른 구성체(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig를 발현하는 구성체) 또는 그의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함하는 세포(들)를 제공한다. 또한, 본 명세서에 기술된 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 또는 융합 단백질, 또는 다른 구성체, 또는 이러한 것들의 하나 이상의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 세포가 포함된다. 본 발명의 세포는 일반적으로 분리형 또는 재조합형 세포이며, 숙주 세포를 포함할 수 있다. 그러한 세포, 예컨대, 재조합형 세포는, 형질전환, 형질감염, 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 핵산, 벡터, 또는 다른 구성체에 의한 감염에 의하여 변형될 수 있다. 그러한 세포는 진핵생물 세포(예, 포유류, 이스트 또는 식물 세포) 또는 원핵생물 세포(예, 박테리아 세포)일 수 있으며, 예컨대 인산칼슘 형질감염(예, 인산칼슘 공동-침전 방법을 참조), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 전기천공(Irving 등, Cell 64:891-901 (1991)), 유전자 또는 백신 총, 주사, 지질감염 및 바이오리스틱(biolistics) 또는 상기에 주지된 다른 통상의 기술을 포함하여, 다양한 알려진 방법을 이용하여 본 발명의 임의의 그러한 구성체로 형질전환될 수 있다. 또한, 월드와이드 웹사이트 주소 inovio.com에서 Inovio Biomedical사 전기천공 방법 및 기술을 참조.
숙주 세포 종(strain)은 선택적으로 그의 능력에 따라 선택되어 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 발현된 단백질을 원하는 방법으로 가공한다. 단백질의 그러한 변형은, 아세틸화(acetylation), 카르복실화(carboxylation), 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 지질화(lipidation) 및 아실화(acylation)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. E. coli, Bacillus sp ., 이스트, 또는 CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK 293, WI38, 등과 같은 포유류 세포와 같은, 상이한 숙주 세포는, 특이적인 세포 기구 및 그러한 번역후 활동에 대한 특징적인 메커니즘을 가지며, 정확한 변형 및 도입된 외부 단백질의 가공을 확보하도록 선택될 수 있다.
본 발명의 핵산은 적절한 숙주 세포에 삽입되어(배양에서 또는 숙주 유기체에서) 숙주가 관심의 단백질(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig)을 발현하도록 허용할 수 있다. 임의의 적합한 숙주 세포는 본 발명의 핵산에 의하여 형질전환되고 및/또는 형질도입된다. 적절한 발현 숙주의 예는 다음을 포함한다: E. coli, Streptomyces, Bacillus sp ., 및 Salmonella typhimurium과 같은 박테리아 세포; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, 및 Neurospora crassa와 같은 진균 세포; Drosophila 및 Spodoptera frugiperda와 같은 곤충 세포; Vero 세포, HeLa 세포, CHO 세포(예, CHO-K1), COS 세포, WI38 세포, NIH-3T3 세포(및 MRC-5 세포와 같은 다른 섬유아 세포), MDCK 세포, KB 세포, SW-13 세포, MCF7 세포, BHK 세포, HEK-293 세포와 같은 포유류 세포, 보우스씨 흑색세포종 세포(Bowes melanoma cells) 및 식물 세포 등.
또한 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 또는 벡터로 형질도입되거나, 형질전환되거나 형질감염되는 숙주 세포를 제공한다. 상기에 검토된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 일반적으로 본 발명의 핵산을 포함한다. 숙주 세포는, 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 이용하여 조작된다(예, 형질도입되거나, 형질전환되거나, 감염되거나, 형질감염된다). 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파지, 감쇄된 박테리아, 또는 임의의 다른 적합한 타입의 벡터의 형태일 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 및/또는 본 발명의 바이러스 벡터의 복제를 위한 본 발명의 바이러스 벡터를 이용한 형질도입 및/또는 감염에 적합한 숙주 세포는 상기-기술된 세포를 포함한다. 바이러스 벡터 입자의 패키징(packaging)에 적합한 것으로 입증된 세포의 예는, 예컨대, Polo 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 96(8):4598-603 (1999), Farson 등, J. Gene Med. 1(3):195-209 (1999), Sheridan 등, Mol. Ther. 2(3):262-75 (2000), Chen 등, Gene Ther. 8(9):697-703 (2001), 및 Pizzaro 등, Gene Ther. 8(10):737-745 (2001)에 기술되어 있다. AAV 벡터와 같은 복제-결핍 바이러스 벡터에 있어서, 보완적인 세포주, 헬퍼 바이러스로 형질전환된 세포주, 또는 필수 유전자를 인코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포주가 바이러스 벡터의 복제에 필요하다.
조작된 숙주 세포는, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 관심의 핵산을 증폭하기에 적절하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 숙주 세포는 혈청-함유한 배지 또는 무-혈청 배지에서 배양될 수 있다. 숙주 세포는, 예컨대, 화학적 규명 배지(예, CD OptiCHOTM (Invitrogen, #12681))를 포함하는 무-혈청, 무-단백질, 무-동물 성분 배지에서 배양될 수 있다. 세포 배양 배지는, 원한다면, 예컨대, L-글루타민(예, 2% v/v 200mM L-글루타민(Invitrogen, #25031))과 같은 하나 이상의 아미노산(들)과 같은, 숙련자들에게 알려진 보충제로 보충될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은, 발현을 위하여 선택된 숙주 세포를 이용하여 이전에 이용된 것들이며, 당해 분야의 기술자들에게 그리고, 예컨대, ANIMAL CELL TECHNOLOGY, Rhiel 등, eds., (Kluwer Academic Publishers 1999), Chaubard 등, Genetic Eng. News 20(18) (2000), Hu 등, ASM News 59:65-68 (1993), Hu 등, Biotechnol. Prog. 1:209-215 (1985), Martin 등, Biotechnol. (1987), Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE, 4판, (Wiley, 2000), Mather, INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE: THEORY AND TECHNIQUE, (Plenum Press, 1998), Freshney, CULTURE OF IMMORTALIZED CELLS, 3판, (John Wiley & Sons, 1996), CELL CULTURE: ESSENTIAL TECHNIQUES, Doyle 등, eds. (John Wiley & Sons 1998), 및 GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE, Harrison 등, eds., (Cambridge Univ. Press 1997)을 포함하여, 본 명세서에 인용된 참조문헌들에 확실할 것이다.
또한 핵산은 식물 세포에 포함되어 있고, 복제되고, 및/또는 발현될 수 있다. 식물 세포의 배양에 관련된 기술은, 예컨대, Payne 등 (1992) PLANT CELL AND TISSUE CULTURE IN LIQUID SYSTEMS John Wiley & Sons사 New York, NY; Gamborg 및 Phillips (eds.) (1995) PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE: FUNDAMENTAL METHODS SPRINGER LAB MANUAL, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 그리고 Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6에 기술되어 있다. 세포 배양 배지는 일반적으로 Atlas 및 Parks (eds.) THE HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (1993) CRC Press, Boca Raton, FL에 제시되어 있다.
재조합 단백질의 장-기간 고-수율 생산을 위하여, 안정한 발현 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기점 및/또는 내인성 발현 요소와 선택 마커 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질도입될 수 있다. 벡터의 도입에 이어서, 세포주의 세포는, 선택 배지로 바꾸기 전에 영양 강화된 배지에서 1-2일 동안 성장할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택물에 내성을 부여하는 것이며, 그것의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포를 성장시키고 회수하게 한다. 예를 들어, 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 집괴(resistant clumps)가 세포 타입에 적절한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다. 무-혈청 배지는 용이하게 입수가 가능하다(예, JRH Biosciences, SAFC Biosciences, Sigma-Aldrich Corporation, 월드와이드 웹 sigmaaldrich.com에서). 무-혈청 배지 또는 순화 배지(예, 형질감염되지 않은 또는 순수한 세포 배양으로부터 미리 수확된 성장 배지)는 일부 경우에 단백질 생산 또는 세포-뱅킹(cell-banking)에서 바람직할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드(예, 다이머성 또는 모노머성 융합 단백질 및 멀티머성 폴리펩티드를 포함함), 접합체, 핵산 또는 벡터를 포함하는 무한증식 세포(immortalized cells) 또는 세포주를 포함한다.
발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포는, 세포 배양물로부터 인코딩된 단백질의 발현 및 회수에 적절한 조건 하에서 선택적으로 배양될 수 있다. 그러한 재조합 세포에 의하여 생산되는 폴리펩티드 또는 그의 단편은, 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라, 분비되거나, 막-결합하거나(membrane-bound) 또는 세포내에 포함될 수 있다. 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는, 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통하여 성숙 폴리펩티드의 분비를 유도하는 신호 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 그러한 신호 서열은 일반적으로, 신호 서열이 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단에서 표현되도록 벡터 내로 편입된다. 그러한 신호 서열에 관련된 원칙들이 본 명세서의 다른 부분에서 검토되어 있다.
폴리펩티드 생산 및 회수
적합한 숙주 종의 형질도입 및 숙주종의 적절한 세포 밀도로의 성장에 이어서, 선택된 프로모터가 적절한 수단(예, 온도 이동(temperature shift) 또는 화학적 유도)에 의하여 유도되며, 세포는 추가 기간 동안에 배양된다. 세포는 일반적으로 원심분리에 의하여 수확되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의하여 파괴되고, 추가적인 정제를 위하여 그 결과의 조(crude) 추출물을 보유한다. 단백질의 발현에 채용된 미생물 세포는, 냉동-해동 순환(freeze-thaw cycling), 초음파 분해, 기계적 파괴, 또는 세포 용해 제제의 이용, 또는 당해 분야에서 기술자들에게 잘 알려진 다른 방법을 포함하는, 임의의 통상적인 방법에 의하여, 파괴될 수 있다.
주지된 바와 같이, 박테리아, 식물, 동물(특히, 포유류) 및 고세균 기원의 세포를 포함하는, 많은 세포의 배양 및 생산에 대한 많은 참조문헌이 이용가능하다. 예컨대, Sambrook, Ausubel, 및 Berger(모두 상기함)는 물론이고, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3판, Wiley-Liss, New York 및 그것에 인용된 참조문헌; Doyle 및 Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques, John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, 4판 W.H. Freeman and Company; 그리고 Ricciardelli, 등, (1989) In vitro Cell Dev. Biol. 25:1016 1024을 참조. 식물 세포 배양 및 재생을 위하여, Payne 등 (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons사 New York, N.Y.; Gamborg 및 Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 및 Plant Molecular Biology (1993) R. R. D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6을 참조. 세포 배양 배지는, Atlas 및 Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla에 일반적으로 제시되어 있다. 세포 배양에 대한 부가적인 정보는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, Mo.) ("Sigma-LSRCCC")의 Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998), 그리고 예컨대, 또한 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, Mo.) ("Sigma-PCCS")의 Plant Culture Catalogue and supplement (1997)과 같은 이용가능한 상업적 인쇄물에 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피(phosphocellulose chromatography), 소수성 상호작용 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피(예, 본 명세서에 주지된 태깅 시스템(tagging system)의 임의의 것을 이용함), 하이드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography) 및 렉틴 크로마토그래피(lectin chromatography)를 포함하여, 당해 분야에 잘 알려진 수 많은 방법 중 임의의 것에 의하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계는 원한다면, 성숙 단백질의 형상을 완성하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에서 채용될 수 있다. 위의 주지된 참조문헌에 더하여, 다양한 정제 방법이 예컨대 Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press사; 및 Bollag 등 (1996) Protein Methods, 보충 2판 Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris 및 Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris 및 Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 보충 3판 Springer Verlag, NY; Janson 및 Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, 2판 Wiley-VCH, NY; 그리고 Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ를 포함하여. 당해 분야에 잘 알려져 있다.
기술자는, 본 발명의 융합 단백질(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)이, 예컨대, LEA29Y-Ig을 만들기 위한 실시예 1에서 제시된 것들을 포함하여, 본 명세서에 기술된 다양한 방법들에 의해 만들어질 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, LEA29Y-인코딩 핵산의 경우, 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, D3-54 폴리펩티드)를 인코딩하는 핵산 서열은 IgG2 Fc 융합 벡터로 클론화되어 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, D3-54-IgG2)을 인코딩하는 벡터를 생산할 수 있으며, 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 발현하는 안정한 CHO-K1 세포는 그러한 세포를 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질-인코딩 벡터로 형질감염함으로써 만들어질 수 있고, 그 결과의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, D3-54-IgG2)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 발현되고(일반적으로 다이머성 형태로) 정제될 수 있다.
시험관 내 발현 시스템
또한 무-세포 전사/번역 시스템이 채용되어 본 발명의 DNA들 및/또는 RNA들 또는 그의 단편을 이용하여 본 발명의 재조합 폴리펩티드 또는 그의 단편을 생산할 수 있다. 몇 개의 그러한 시스템은 상업적으로 입수가 가능하다. 시험관 내 전사 및 번역 프로토콜에 대한 일반적인 지침은, Tymms (1995) IN VITRO TRANSCRIPTION AND TRANSLATION PROTOCOLS: METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 37권, Garland Publishing, New York에 있다.
본 발명의 방법
본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 다이머성 및 모노머성 융합 단백질 및 멀티머성 폴리펩티드를 포함), 접합체, 조성물, 핵산, 벡터, 및 세포는 다양한 성질 및 특성을 나타내고 예를 들어 면역계 및 면역계 반응의 조절 및 통제가 유리할 수 있는 다양한 면역계 질환, 장애 및 이상을 치료하기 위한 예방적 또는 치료적 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 응용에서 유용한 것으로 여겨진다. 예를 들어, CD80 및/또는 CD86 또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 ECD 에 결합하는 능력 및/또는 면역 반응을 저해하는 능력을 가진 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 조성물, 핵산, 벡터, 및 세포는 대상체에서 면역 반응을 저해하거나 억제하는 예방적 및/또는 치료적 방법, 수용자에 의한 공여자로부터의 조직, 세포, 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법, 및 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 다른 방법에 있어서 유용한 것으로 여겨진다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드, 접합체, 조성물, 핵산, 벡터, 및 세포는 CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용을 조절 또는 저해하는 방법을 위한 방법에서 유용한 것으로 예상된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 치료적 또는 예방적 방법은 면역 반응을 억제하거나 저해하는 적어도 하나의 그러한 폴리펩티드(예를 들어, 융합 단백질, 멀티머 등을 포함), 접합체, 조성물, 핵산, 벡터, 및/또는 세포의 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 수반한다. 치료적 맥락에서, 대상체는 일반적으로 면역계 질환, 장애, 또는 이상을 겪는 자이고, 투여는 질환, 장애 또는 이상의 더 이상의 진행을 예방하도록 행해진다. 예를 들어, 면역계 질환(예, 자가면역 질환)으로 고통받는 대상체에게 본 발명의 분자의 투여는 이와 관련된 그러한 면역계 공격 또는 생물학적 반응의 억제 또는 저해할 수 있다. 건강한 신체 조직에 대한 이러한 면역계 공격을 억제함으로써, 건강한 조직에 대한 그러한 공격으로 인한 또는 이와 관련된 그 결과의 신체 증상(예, 통증, 관절 염증, 관절 부종 또는 압통)을 감소하거나 또는 완화할 수 있고, 면역계 공격으로 인한 또는 이와 관련된 생물학적 및 신체적 손상을 감소, 지연 또는 정지시킬 수 있다.
예방적 맥락에서, 대상체는 면역계 질환, 장애 또는 이상을 겪거나, 이를 나타내기 쉽거나, 또는 이를 나타낸다고 여겨지는 자이고, 투여는 일반적으로 상기 질환, 장애 또는 이상의 진행을 방지, 이와 관련된 증상, 징후, 또는 생물학적 반응을 저해 또는 완화, 잠재적으로 이로 인한 신체 손상을 방지, 및/또는 대상체의 신체 기능을 유지 또는 개선하도록 행해진다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 B7-양성 세포를 다음의 것 중 적어도 하나를 유효한 양으로 접촉시켜 B7-양성 세포와 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와의 상호작용을 조절하는 것을 포함한다: (1) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질); (2) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 멀티머(예, 임의의 두 개의 그러한 폴리펩티드의를 포함하는 다이머 또는 임의의 네 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 테트라머); (3) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 접합체; (4) 본 발명의 핵산(예, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산); (5) 본 발명의 핵산을 포함하는 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터; (6) 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 접합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단; 및/또는 (7) 본 발명의 조성물, 여기에서 B7-양성 세포와 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와의 상호작용은 조절된다. 일반적으로, 조절 효과는 B7-양성 세포와 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와의 상호작용이 저해되는 저해 효과이다. 일부 경우에서, B7-양성 세포는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APC)이다. 일부 그러한 방법에서, B7-2-양성 세포(예, B7-2(CD86)를 발현하는 APC)와 CD28-양성 T 세포와의 상호작용은 저해된다. 일부 그러한 방법에서, B7-1-양성 세포(예, B7-1(CD80)을 발현하는 APC)와 CD28-양성 T 세포와의 상호작용은 저해된다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용을 저해하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 B7-양성 세포(예, B7-1-양성 세포 및/또는 B7-2-양성 세포)를 다음의 본 발명의 분자 또는 성분 중 적어도 하나를 유효한 양으로 접촉시켜 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용을 저해하는 것을 포함한다: (1) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질); (2) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 멀티머(예, 임의의 두 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 다이머 또는 임의의 네 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 테트라머); (3) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 접합체; (4) 본 발명의 핵산(예, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산); (5) 본 발명의 핵산을 포함하는 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터; (6) 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 접합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단; 및/또는 (7) 본 발명의 조성물, 여기에서 CD28-양성 T 세포 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용은 저해된다. 일부 경우에서, B7-양성 세포는 APC이다. 일부 경우에서, CD28-양성 T 세포와 hB7-1-양성 세포 및/또는 hB7-2-양성 세포와의 상호작용은 저해된다. 일부 그러한 방법에서, CD28-양성 T 세포와 hB7-1-양성 세포 및/또는 hB7-2-양성 세포와의 상호작용의 저해는 다음의 것들 중 하나 이상을 억제 또는 저해한다: T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2의 생산), 다양한 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체)의 유도, 염증, 관절 부종 또는 압통, C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존성 항체 반응(들).
일부 그러한 방법에서, 적어도 하나의 그러한 본 발명의 분자 또는 성분은 유효한 양으로 대상체에 투여되어 대상체에서 내인성 CD28-양성 T 세포와 내인성 B7-1-양성 세포 및/또는 B7-2-양성 세포와의 상호작용을 저해한다. 일부 그러한 방법에서, 내인성 CD28-양성 T 세포와 B7-2(CD86) 또는 B7-1(CD80)을 발현하는 내인성 B7-양성 세포와의 상호작용은 저해된다. 일부 경우에, B7-양성 세포는 B7-2 또는 B7-1을 발현하는 APC이고, B7-2 또는 B7-1와 CD28-양성 T 세포와의 상호작용은 저해된다. 일부 경우에서, APC에서 발현되는 B7-2 및 B7-1 모두와 CD28-양성 T 세포와의 상호작용은 저해된다.
다른 양태에서, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 본 발명의 분자 또는 성분 중 적어도 하나를 유효한 양으로 B7-양성 세포와 접촉시켜 면역 반응을 억제하는 것을 포함한다: (1) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질); (2) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 멀티머(예, 임의의 두 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 다이머 또는 임의의 네 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 테트라머); (3) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 접합체; (4) 본 발명의 핵산(예, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산); (5) 본 발명의 핵산을 포함하는 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터; (6) 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 접합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단; 및/또는 (7) 본 발명의 조성물, 여기에서 그렇게 함으로써 면역 반응은 억제된다. 예를 들어, T 세포 반응, T 세포 증식 또는 활성화, 사이토카인 합성 또는 생산, 염증, 관절 부종 또는 압통, C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존성 항체 반응(들)을 포함하여, 하나 이상의 면역 반응이 억제될 수 있다. B7-양성 세포를 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 그러한 방법에서, 폴리펩티드는 B7-양성 세포 상에서 발현되는 B7-1(예, 인간 B7-1)을 결합하고, 및/또는 B7-양성 세포 상에서 발현되는 B7-2(예, 인간 B7-2)를 결합한다. 일부 경우에서, B7-양성 세포는 APC이다. 일부 경우에서, 면역 반응은, 예를 들어, 본 명세서의 다른 부분에 상세히 기술된 것들을 포함하여 시험관 내 분석에서와 같이, 시험관 내에서 억제된다(하기 실시예 참조). 일부 경우에서, 면역 반응은, 예를 들어, 본 발명의 다른 부분에 상세히 검토된 치료적 또는 예방적 치료 방법(예, 류마티스관절염과 같은 류마티스성 질환, 또는 다른 자가면역 질환을 치료하는 방법)에서와 같이, 면역 반응을 억제하는 유효한 양이 투여된 대상체의 생체 내에서 억제된다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체(예, 인간과 같은 포유류)에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에서 면역 반응을 억제하는 다음의 본 발명의 분자 또는 성분 중 적어도 하나를 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양(예, 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 용량)으로 상기 방법을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질); (2) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 멀티머(예, 임의의 두 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 다이머 또는 임의의 네 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 테트라머); (3) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 접합체; (4) 본 발명의 핵산(예, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산); (5) 본 발명의 핵산을 포함하는 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터; (6) 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 접합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단; 및/또는 (7) 본 발명의 조성물, 여기에서 그렇게 함으로써 대상체에서 면역 반응은 억제된다.
다른 양태에서, 본 발명은 내인성 T 세포와 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 내인성 세포와의 상호작용으로 조절된 면역계 질환 또는 장애를 가지는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 치료적으로 유효한 양을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다: (1) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 다이머 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질); (2) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 멀티머(예, 임의의 두 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 다이머 또는 임의의 네 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 테트라머); (3) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 접합체; (4) 본 발명의 핵산(예, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산); (5) 본 발명의 핵산을 포함하는 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터; (6) 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 접합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단; 및/또는 (7) 본 발명의 조성물, 그렇게 함으로써 대상체에서 면역계 질환 또는 장애를 치료한다. 대상체가 인간이라면, CD80은 인간 CD80이고, CD86은 인간 CD86이며, CD28은 인간 CD28이다. 일부 그러한 방법에서, CD28을 발현하는 내인성 T 세포와 CD86을 발현하는 내인성 세포 및/또는 CD80을 발현하는 내인성 세포 사이의 상호작용은 저해된다.
류마티스성 또는 자가면역계 질환 또는 장애를 포함하여 다양한 면역계 질환 또는 장애는 예를 들어, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73 중 임의의 것, 예를 들어, D3-54(서열번호 36), D3-69(서열번호 50), 또는 D3-27(서열번호 24) 변이체 CTLA-4 ECD), 또는 이의 융합 단백질(예, D3-54-IgG2(서열번호 197 또는 211), D3-69-IgG2(서열번호 199 또는 213), D3-29-IgG2(서열번호 79 또는 210))와 같은, 본 명세서에 개시된 본 발명의 하나 이상의 분자를 사용하여 효과적으로 치료될 수 있을 것으로 여겨진다. 면역계 질환 또는 장애는, 예를 들어 에디슨 병, 알레르기, 원형 탈모증, 알츠하이머병, 항중성구세포질항체(Antineutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)-관련 혈관염, 강직성척추염, 항인지질항체증후군(휴즈 증후군), 관절염, 천식, 죽상경맥동화증, 죽상경화판(Atherosclerotic plaque), 자가면역질환(예, 루푸스, RA, MS, 그레이브스병, 등), 자가면역용혈성빈혈, 자가면역성간염, 자가면역내이질환(Autoimmune inner ear disease), 자가면역림프세포증식증후군, 자가면역심근염, 자가면역성난소염, 자가면역고환염, 무정자증, 베체트병, 버거스씨병, 수포성유천포창, 심근증, 심혈관계질환, 비열대스프루/세리악 병(Celiac Sprue/Coeliac disease), 만성피로면역이상증후군(Chronic Fatigue Immune Dysfunction Syndrome, CFIDS), 만성특발성다발성신경염, 만성염증성탈수초성다발성신경병증(Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradicalneuropathy, CIDP), 만성재발성다발성신경병증(길리안바레 증후군), 처그-스트라우스증후군(Churg-Strauss Syndrome, CSS), 흉터성유사천포창, 저온응집병(Cold Agglutinin Disease, CAD), COPD, CREST증후군, 크론병, 포진상피부염(Dermatitis Herpetiformus), 피부근염, 당뇨병, 원판상루푸스, 습진, 후천성수포성표피박리증, 원발성혼합한랭글로불린증, 에반증후군, 안구돌출증, 섬유근육통, 굳파스튜어증후군, 이식편-관련 질환 또는 장애(graft-related disease or disorder), 그레이브스병, GVHD, 하시모토씨갑상선염, 특발성폐섬유화증, 특발성혈소판감소성자반증(Idiopathic Thrombocytopenia Purpura, ITP), IgA신염, 면역증식성질환 또는 장애(예, 건선), 염증성장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 인슐린의존성당뇨병(Insulin Dependent Diabetes Mellitus, IDDM), 간질성폐질환, 소아당뇨병, 소아관절염, 소아특발성관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA), 가와사키병, 람버트-이튼 근무력성 증후군, 편평태선, 루푸스, 루푸스신염, 림프구성뇌하수체염, 메니에르병, 밀러피셔증후군(Miller Fisher Syndrome)/급성파종성뇌척수신경근질환(acute disseminated encephalomyeloradiculopathy), 혼합결합조직병, 다발성경화증(Multiple Sclerosis, MS), 근육류머티즘, 근육통성뇌척수염(Myalgic encephalomyelitis, ME), 중증근무력증, 안구염증, 낙엽상천포창, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발성동맥염, 다발연골염, 다분비성증후군(휘터커증후군), 류마티스성다발성근육통, 다발성근염, 원발성무감마글로불린증(Primary Agammaglobulinemia), 원발성담즙성경화/자가면역성담관염, 건선, 건선성관절염, 레이노증후군, 라이터증후군/반응성관절염, 재협착(Restenosis), 류머티즘열, 류마티스성질환, 류마티스관절염, 유육종증, 슈미트증후군, 피부경화증, 쇼그렌증후군(Sjogren's Syndrome), 고형장기이식거부(신장, 심장, 간, 폐, 등), 근육강직증후군(Stiff-Man Syndrome), 전신성홍반성루푸스(Systemic Lupus Erythematosus, SLE), 전신성피부경화증, 다카야스동맥염, 측두동맥염/거대세포동맥염, 갑상선염, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 궤양성대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 수용자 대상체에 의한 공여자의 조직, 세포, 이식편, 또는 장기 이식의 거부와 관련된 면역 반응을 방지 또는 억제하는 것이거나 이를 수반할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이식-관련 질환 또는 장애는 예를 들어, 골수이식과 관련된 이식편대숙주질환(graft versus host disease, GVDH), 및 예를 들어 피부, 근육, 신경 세포, 섬(islet), 장기, 간의 실질세포(parenchymal cell) 등을 포함하여, 장기, 조직, 또는 세포 이식편(예, 조직 또는 세포 동종이식편 또는 이종이식편)으로 인한 또는 이와 관련된 면역 장애를 포함한다. 수용자 대상체에서 공여자 조직, 세포, 이식편 또는 고형장기 이식과 관련하여, 본 명세서에 개시된 본 발명의 상기 분자(예, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)는 수용자에서 상기 이식의 급성 거부를 방지 및/또는 이에 의하여 수용자에서 그러한 이식의 거부를 방지(예, 당뇨병으로 고통받는 대상체 수용자에서 공여자로부터의 인슐린 생산 섬세포(insulin-producing islet cell) 이식의 거부를 저해)하여 장기간 유지하는데 효과적일 것이다.
본 발명은 적어도 하나의 상기 면역계 질환 또는 장애와 관련된 면역 반응을 억제하는데 사용하는 본 발명의 임의의 상기 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함한다. 또한 적어도 하나의 상기 면역계 질환 또는 장애와 함께 면역 반응을 억제하는 약제의 제조에서 본 발명의 임의의 상기 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 사용이 제공된다.
본 명세서에 기술된 방법에서 대상체에서 면역 반응을 억제하거나 대상체에서 내인성 T세포와 CD80 및/또는 CD86을 발현하는 내인성 세포와의 상호작용에 의해 조절된 면역계 질환 또는 장애를 치료하기 위한 본 발명의 분자, 예를 들어 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, D3-54, D3-69, D3-29, D3-56, D3-75) 또는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 Ig 융합 단백질(예, 각각 D3-54-IgG2, D3-69-IgG2, D3-29-IgG2, D3-56-IgG2, D3-75-IgG2)과 같은 분자의 유효한 양은 대상체의 체중의 kg당 약 0.0001mg(mg/kg) 내지 대상체의 체중의 kg당 약 200mg(mg/kg), 예를 들어 대상체의 체중의 kg당 약 0.001mg(mg/kg) 내지 대상체의 체중의 kg당 약 100mg(mg/kg), 또는 예를 들어 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 대상체의 체중에 대하여 적어도 약 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 또는 75mg/kg을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 반응, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산(예, TNF-α, IFN-γ, IL-2 등의 생산), 다양한 활성화 마커(예, CD25, IL-2 수용체 등)의 유도, 염증성 분자의 합성 또는 생산, 염증, 관절 부종, 관절 압통, 통증, 경직(stiffness), C-반응성 단백질의 혈청 수준, 항-콜라겐 항체 생산, 및/또는 T 세포-의존 항체 반응(들)을 포함하여, 하나 이상의 면역 반응이 대상체에서 억제될 수 있다. 면역 반응을 억제하기 위한 본 발명의 분자 또는 성분의 유효한 양은 검출가능하거나 또는 측정가능한 양으로서 이의 면역 반응 또는 증상 또는 징후를 억제하는 양일 수 있다. 면역 반응은 부분적으로 또는 완전히 억제될 수 있다. 면역계 질환 또는 장애를 치료하기 위한 유효한 양은 질환 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 증상 또는 생물학적 반응을 덜어주거나, 줄이거나 또는 완화시키거나, 질환 또는 장애의 진행을 방지하거나, 또는 대상체의 신체적 기능을 개선시키는 양일 수 있다.
CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용을 조절하거나 또는 저해하기 위한 본 발명의 분자 또는 성분의 유효한 양은 B7-양성 세포 및 CD28-양성 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포 사이의 결합을 각각 조절하거나 또는 저해하는 양일 수 있다.
일부 그러한 방법에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 변이체 단백질 다이머는 면역 반응을 억제, T 세포와 B7-발현 세포와의 상호작용으로 조절된 면역계 질환 또는 장애를 치료, 또는 CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 B7-양성 세포와의 상호작용을 조절 또는 저해하기에 충분한 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양(또는 용량)으로 대상체에 투여된다. 투여되는 융합 단백질 다이머는 일반적으로 가용성 Ig 융합 단백질 다이머이다. 일부 그러한 방법에서, 본 발명의 융합 단백질 다이머의 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중의 kg당 약 0.001mg(mg/kg) 내지 대상체(예를 들어, 인간)의 체중의 kg당 약 200mg(mg/kg) 또는 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 약 300mg/kg을 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질 다이머의 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 대상체(예를 들어, 성인을 포함하여 인간)의 체중에 대하여 적어도 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 또는 300mg/kg을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 유효한 양 또는 용량은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 대상체(예, 인간)의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 100mg/kg, 대상체의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg, 또는 대상체의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 25mg/kg을 포함하여, 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 약 50mg/kg이고; 예를 들어 대상체(예, 성인 환자)의 체중에 대하여 약 0.05mg/kg, 0.075mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1mg/kg, 1.5mg/kg, 2mg/kg, 2.5mg/kg, 3mg/kg, 5mg/kg, 약 10mg/kg, 20mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 75mg/kg 또는 100mg/kg이 대상체에 투여된다. 일부 경우에서, 융합 단백질 다이머의 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중에 대하여 약 2 내지 10mg/kg, 약 3 내지 10mg/kg, 약 3 내지 5mg/kg, 약 5 내지 10mg/kg, 0.1 내지 5mg/kg, 약 0.05 내지 1.0mg/kg, 약 0.05 내지 3mg/kg, 약 0.05 내지 2.0mg/kg, 약 0.05 내지 1.0mg/kg, 약 0.1 내지 2.0mg/kg, 약 0.1 내지 3.0mg/kg, 약 0.1 내지 0.5mg/kg, 약 0.1 내지 0.8mg/kg, 약 0.1 내지 0.6mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 0.05mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 0.1mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 0.05mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 0.01 내지 약 5mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 3mg/kg, 약 0.05mg/kg 내지 약 2.5mg/kg, 약 0.1mg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 0.1mg/kg 내지 약 5mg/kg, 약 0.2 내지 1mg/kg, 약 0.2 내지 0.6mg/kg, 약 0.2 내지 0.5mg/kg, 약 0.3 내지 1mg/kg, 약 0.3 내지 0.6mg/kg, 약 0.3 내지 0.5mg/kg이다. 일부 경우에서, 유효한 양 또는 용량은 체중이 60kg 미만인 대상체에 대하여 약 500mg 미만(예, 약 100mg, 75mg, 50mg, 25mg, 12.5mg, 또는 10mg 미만), 체중이 60-100kg 사이인 대상체에 대하여 약 750mg 미만(예, 약 150mg, 100mg, 75mg, 37.5mg, 또는 20mg 미만), 또는 체중이 100kg 초과인 대상체에 대하여 약 1000mg 미만(예, 약 500mg, 100mg, 50mg, 25mg, 또는 10mg 미만)이다.
다른 양태에서, 본 발명의 일부 그러한 방법에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양 또는 용량으로, 즉, 예를 들어 면역 반응을 억제, T 세포와 B7-발현 세포와의 상호작용으로 조절된 면역계 질환 또는 장애를 치료, CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 또는 B7-양성 세포와의 상호작용을 조절 또는 저해하기에 충분한 양 또는 용량으로 대상체에 투여된다. 보통 가용성 융합 단백질인 융합 단백질의 유효한 양 또는 용량은 대상체(예, 인간)의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 약 300mg/kg, 약 0.001mg/kg 내지 약 200mg/kg, 또는 약 0.001mg/kg 내지 약 300mg/kg을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 융합 단백질의 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 적어도 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 또는 300mg/kg을 포함한다. 다른 양태에서, 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 100mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg, 또는 약 0.01mg/kg 내지 약 25mg/kg이다. 예시적인 용량 또는 양은 대상체(예, 성인)의 체중에 대하여 약 0.05mg/kg, 0.075mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1mg/kg, 1.5mg/kg, 2mg/kg, 2.5mg/kg, 3mg/kg, 5mg/kg, 약 10mg/kg, 20mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 75mg/kg, 및 100mg/kg을 포함한다. 다른 양태에서, 융합 단백질의 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중에 대하여 약 2 내지 10mg/kg, 약 3 내지 10mg/kg, 약 3 내지 5mg/kg, 약 5 내지 10mg/kg, 0.1 내지 5mg/kg, 약 0.05 내지 1.0mg/kg, 약 0.05 내지 3mg/kg, 약 0.05 내지 2.0mg/kg, 약 0.05 내지 1.0mg/kg, 약 0.1 내지 2.0mg/kg, 약 0.1 내지 3.0mg/kg, 약 0.1 내지 0.5mg/kg, 약 0.1 내지 0.8mg/kg, 약 0.1 내지 0.6mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 0.05mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 0.1mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 0.05mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 0.01 내지 약 5mg/kg, 약 0.01mg/kg 내지 약 3mg/kg, 약 0.05mg/kg 내지 약 2.5mg/kg, 약 0.1mg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 0.1mg/kg 내지 약 5mg/kg, 약 0.2 내지 1mg/kg, 약 0.2 내지 0.6mg/kg, 약 0.2 내지 0.5mg/kg 약 0.3 내지 1mg/kg, 약 0.3 내지 0.6mg/kg, 약 0.3 내지 0.5mg/kg이다. 일부 양태에서, 유효한 양 또는 용량은 체중이 60kg 미만인 대상체에 대하여 약 500mg 미만(예, 약 100mg, 75mg, 50mg, 25mg, 12.5mg, 또는 10mg 미만), 체중이 60-100kg 사이인 대상체에 대하여 약 750mg 미만(예, 약 150mg, 100mg, 75mg, 37.5mg, 또는 20mg 미만), 또는 체중이 100kg 초과인 대상체에 대하여 약 1000mg 미만(예, 약 500mg, 100mg, 50mg, 25mg, 또는 10mg 미만)이다.
유사하게 면역 반응을 억제 또는, T 세포와 B7-발현 세포와의 상호작용으로 조절된 면역계 질환 또는 장애를 조절, 치료, 또는 CD28 및/또는 CTLA-4를 발현하는 T 세포와 B7-양성 세포의 상호작용을 조절 또는 저해하기에 충분한 본 발명의 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포의 유효한 양 또는 용량이 결정될 수 있다. 예를 들어, 만약 본 발명의 상기 융합 단백질 다이머를 인코딩하는 벡터를 대상체에 투여하면, 융합 단백질 다이머의 원하는 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양이 대상체에서 초래할 수 있는 범위에서 당해 분야에서 숙련된 자는 투여될 벡터의 양을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 예시적인 융합 단백질 다이머는 예를 들어, 두 개의 동일한 융합 단백질 모노머를 포함하는 융합 단백질 다이머를 포함하여, 상기 및 본 명세서에 상세하게 기술된 임의의 것들을 포함하며, 여기에서 각 융합 단백질 모노머는 C-말단에서 Ig Fc 폴리펩티드(예, 효과기(effector) 기능을 감소시키는 IgG2 Fc, IgG1, IgG4 또는 변이체 Ig Fc 폴리펩티드)의 N-말단으로 융합된 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드는 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 것이다. 예시적인 융합 단백질 다이머는 두 개의 융합 단백질 모노머를 포함하는 것이며, 여기에서 각 융합 단백질 모노머는 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222로 구성되는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일반적으로 다이머성 융합 단백질에서 두 개의 모노머성 융합 단백질은 각 모노머에 존재하는 시스테인 잔기(들) 사이에 형성된 적어도 하나의 이황화 결합을 통해 함께 공유적으로 연결되어 있다.
상기된 임의의 방법에서, 본 발명의 분자 또는 성분(예, 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 다이머성 또는 모노머성 융합 단백질 또는 폴리펩티드 멀티머를 포함), 접합체, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포)은 조성물로서 대상체에 투여될 수 있다. 조성물은 일반적으로 적어도 하나의 그러한 분자 또는 성분 및 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함한다. 조성물은 적어도 하나의 그러한 분자 또는 성분 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제(예, PBS)를 포함하는 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 pH는, 예를 들어 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5을 포함하여 일반적으로 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.0의 범위이고, 보통 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0의 범위이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물의 pH는 일반적으로 약 pH 3 내지 약 pH 10, 약 pH 4 내지 약 pH 10, 약 pH 5 내지 약 pH 9, 약 pH 6 내지 약 pH 9, 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.2 내지 약 pH 8.7, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.3 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.8, 및 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.4의 범위이다. 하나의 양태에서, 예를 들어, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질과 같은 본 발명의 적어도 하나의 상기 분자 또는 성분을 포함하는 조성물의 pH는 pH 5.5, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0, pH 9.1, pH 9.2, pH 9.3, pH 9.4, pH 9.5, pH 9.6, pH 9.7, pH 9.8, pH, 9.9, 또는 pH 10.0이다. 본 발명의 일부 조성물은 하나 이상의 염(예, 염화나트륨, 인산나트륨, 염화칼슘 등), 하나 이상의 완충제(예, HEPES, 시트르산나트륨, 인산나트륨(예, Na2HPO4/Na3PO4), 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스(Tris)) 등), 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 이상의 당류 또는 당(예, 수크로오스, 만노오스, 말토오스, 트레할로오스, 덱스트로오스 등), 및/또는 하나, 둘, 셋, 넷 이상의 폴리알코올 또는 당알코올(예, 만니톨, 소르비톨, 글리콜, 글리세롤, 아라비톨, 에리스리톨, 자일리톨, 리비톨, 락티톨 등)을 포함한다. 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 이상의 단당류, 이당류 및/또는 다당류는 상기 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 대상체에 투여될 때 면역 반응을 억제하는데 유효한 임의의 농도의 상기 분자 또는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 그러한 방법에서(예를 들어, 면역억제가, 이에 한정되지는 않지만, 예를 들어 류마티스관절염 또는 유사한 면역 장애의 치료, 또는 수용자 대상체에 의한 공여자로부터의 조직, 세포, 이식편, 또는 장기 이식의 거부를 저해하는데 바람직한 방법을 포함), 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제 및 본 발명의 융합 단백질 다이머를 포함하는 약학적 조성물이 대상체에 투여되고(예, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내 등), 여기에서 약학적 조성물은 본 발명의 융합 단백질 다이머를 약 0.001mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 0.001mg/ml 내지 약 300mg/ml, 약 0.01mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 0.01mg/ml 내지 약 250mg/ml, 약 0.1mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 0.001mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 0.001mg/ml 내지 약 90mg/ml, 약 0.01mg/ml 내지 약 90mg/ml, 약 0.01mg/ml 내지 약 75mg/ml, 약 0.1 내지 약 80mg/ml, 약 0.1 내지 약 75mg/ml, 약 0.1 내지 약 60mg/ml, 약 0.1 내지 약 50mg/ml, 약 0.1 내지 약 40mg/ml, 약 0.1 내지 약 30mg/ml, 약 1 내지 약 90mg/ml, 약 1 내지 약 80mg/ml, 약 1 내지 약 75mg/ml, 약 1 내지 약 60mg/ml, 약 1 내지 약 50mg/ml, 약 1 내지 약 40mg/ml, 약 1 내지 약 30mg/ml, 약 1 내지 약 20mg/ml, 약 1 내지 약 10mg/ml, 약 1 내지 약 5mg/ml, 약 5 내지 약 90mg/ml, 약 5 내지 약 80mg/ml, 약 5 내지 약 75mg/ml, 약 5 내지 약 60mg/ml, 약 5 내지 약 50mg/ml, 약 5 내지 약 40mg/ml, 약 5 내지 약 30mg/ml, 약 5 내지 약 20mg/ml, 약 5 내지 약 10mg/ml, 약 1 내지 약 5mg/ml, 약 10 내지 약 75mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 75mg/ml, 약 30mg/ml 내지 약 60mg/ml, 약 25 내지 약 50mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 100mg/ml의 농도로 포함하며, 이는 예를 들어, 약 1mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 약 15mg/ml, 약 25mg/ml, 약 30mg/ml, 약 40mg/ml, 약 50mg/ml, 약 60mg/ml, 약 70mg/ml, 약 80mg/ml, 약 90mg/ml, 또는 100mg/ml를 포함한다. 다른 농도들이 고려된다. 일부 치료적 또는 예방적 방법을 포함하여, 본 명세서에 기술된 본 발명의 일부 방법에서, 본 발명의 융합 단백질을 약 0.01ml 내지 약 10ml, 약 0.01ml 내지 약 5ml, 약 0.1ml 내지 약 5ml, 약 0.5ml 내지 약 2ml, 약 1ml 내지 약 2ml의 범위에서, 예를 들어 0.01ml, 0.025ml, 0.05ml, 0.1ml, 0.2ml, 0.3ml, 0.4ml, 0.5ml, 0.75ml, 1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml, 50ml, 75ml, 100ml, 200ml, 250ml, 300ml, 500ml, 1000ml 등의 부피를 포함한 범위에서, 임의의 상기 조성물의 부피를 단일의 정맥내, 피하, 근육내, 또는 복강내 주사를 통하여 대상체에 투여한다. 본 발명의 예시적인 조성물의 더 상세한 내용은 본 명세서의 다른 부분에서 검토된다.
특정 대상체에 투여되는 본 발명의 분자의 유효한 양 또는 용량은 예를 들어, 치료될 질환, 장애, 또는 이상, 투여될 본 발명의 특정 변이체 CTLA-4 분자(예, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)의 효능(즉, 효험), 본자의 투여 방식, 및 특정 분자의 구체적인 양을 견디는 대상체의 개인의 능력에 따라서 변할 수 있다. 예를 들어, 류마티스관절염(rheumatoid arthritis, RA)를 가지는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 반응 또는 RA를 치료하는 방법에서, 대상체에 투여될 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머(예, D3-29-IGg2, D3-54-IgG2, D3-56-IgG2, D3-69-IgG2, D3-75-IgG2 등)의 유효한 양 또는 용량은 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 효능, 다이머의 투여 방식, 및/또는 류마티스관절염의 대상체의 증상 또는 징후의 심각도를 포함하여, 다양한 인자에 기초하여 결정할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 특정 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 유효한 양 또는 용량은 Orencia® 다이머의 효능과 상기 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 효능을 비교함으로써 결정할 수 있다. 류마티스관절염 및 관련 장애를 치료하는데 효과적인 Orencia®의 용량은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Orencia® 다이머는 일반적으로 류마티스관절염으로 고통받는 인간에게 인간의 체중에 대하여 kg당 약 10mg Orencia®의 용량으로 정맥으로 투여한다. Orencia®보다 약 "X" 배 더 효능이 있는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 류마티스관절염으로 고통받는 인간에게 Orencia®다이머의 용량보다 "X" 배 더 적은 용량으로 투여(예, 정맥내, 피하, 또는 본 명세서에 기술된 다른 방식으로)되어 Orencia® 다이머의 치료적 효과와 거의 동등한 치료적 효과(예, 면역 반응을 억제)를 얻을 수 있다. 만약 더 큰 치료적 효과를 원한다면, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 비례적으로 증가된 양 또는 용량이 용이하게 결정되어 인간에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 방법에서, 본 발명의 분자 또는 성분(예, 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 다이머 또는 모노머성 융합 단백질 또는 폴리펩티드 멀티머를 포함), 접합체, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포)은 비경구, 피하, 또는 정맥내, 또는 본 명세서의 다른 부분에 기술된 바와 같이 투여될 수 있다. 본 발명의 분자 또는 성분은 치료적으로 유효한 양으로 한달에 한 번, 두 번, 세 번 또는 네 번, 일주일에 두 번, 이주일에 한 번, 또는 두 달에 한 번으로 투여될 수 있다. 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12달 또는 그 이상(예를 들어, 대상체의 수명을 포함하여, 일 년, 이 년, 삼 년, 사 년 이상)의 기간동안 지속될 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 방법은 적어도 하나의 추가적인 치료적 또는 면역억제 제제 또는 화합물의 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 면역 반응을 억제하는 것을 필요로 하는 대상체에게 (1) 유효한 양의 적어도 하나의 제1의 면역억제제, 여기에서 각각의 그러한 제1의 면역억제제는 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포이고, 및 (2) 유효한 양의 적어도 하나의 제2의 면역억제제를 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하며, 여기에서 대상체에서의 면역 반응은 억제된다.
다양한 (본 발명의 분자가 아닌) 추가적인 치료적 또는 면역억제 제제는 본 발명의 분자(예, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포)와 함께 사용되거나 투여될 수 있다. 그러한 제제는 예를 들어, 질환-변형 항-류마티스 약물(disease-modifying anti-rheumatic drug, DMARD)(예를 들어, 메토트렉사트(MTX), 사이토카인 길항제(예, IL-2 또는IL-6 길항제), 스테로이드성 화합물(예컨대, 코르티코스테로이드, 글루코코스테로이드, 예, 프레드니손 또는 메틸프레드니손), 비스테로이드성 화합물, 살리실산나트륨, 살리실산 마그네슘, 이부프로펜, 아세틸살리실산, 아세트아미노펜, 항체, 항염증 사이토카인의 합성 또는 생산을 차단하는 생물학적 제제, 렙티바® 에팔리주맙(Raptiva® efalizumab), 항염증 제제 또는 화합물, 및 비스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)을 포함한다. 상기 추가적인 치료적 또는 면역억제 제제는 추가적인 제제 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하여 약학적 조성물로 대상체에 투여될 수 있다. 투여될 제제의 유효한 양 및 용량은 구체적인 제제에 따라 다를 것이다. 일부 그러한 제제는 현재 면역억제 치료에 사용되고 적절한 투여량은 치료될 질환, 장애 또는 이상 및 구체적인 양 또는 용량을 견디는 대상체의 능력, 및 제제의 면역억제 유효성에 기초하여 결정될 수 있다. 본 발명의 분자가 아닌 상기 기술된 면역억제제에 대한 예시적인 용량은 알려져 있다. 본 발명의 분자가 아닌 추가적인 면역억제제는 본 발명의 분자(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)의 투여와 함께 동시에 또는 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
예를 들어 용량을 포함하여 투여 섭생, 투여 스케줄, 투여 방법(예, 정맥 주사, 피하 주사 등) 및 본 발명의 적어도 하나의 상기 분자 또는 성분을 포함한 약학적 조성물은 치료될 질환, 장애 또는 이상에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 그러한 분자 또는 성분은 대상체에 투여될 수 있고; 각각의 그러한 분자 또는 성분은 동일한 약학적 제형에서, 동일한 투여 방법으로, 동일한 양으로, 또는 동일한 투약 빈도 스케줄에 의해 투여될 필요는 없다.
일부 그러한 방법에서, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제 및 농도가 약 50mg/ml인 본 발명의 융합 단백질 다이머를 포함하는 약 1ml의 약학적 조성물은 면역억제의 필요가 있는 대상체(예, 성인)(예, 류마티스관절염으로 고통받는 대상체)에 피하로 투여된다. 그러한 초기 용량은 융합 단백질 다이머의 50mg이다. 체중이 100kg인 대상체에 대하여, 이 초기 용량은 대상체의 체중에 대하여 kg 당 0.5mg 융합 단백질 다이머에 대응한다. 동일한 양의 제2 투여는 제1 투여 후 일 주 또는 이 주에 피하로 투여된다. 추가 투여는 매주, 이주에 한 번, 또는 한달에 한 번, 또는 필요에 따라 더 자주 또는 덜 자주 피하로 투여된다. 그러한 조성물 및 투여 포맷은 예를 들어 면역억제가 바람직한 류마티스관절염 또는 다른 면역 장애로 고통받는 인간을 치료하는데, 또는 인간 수용자에 의한 인간 공여자로부터의 조직, 세포, 이식편, 또는 장기 이식의 거부를 저해하는데 유용한 것으로 여겨진다.
류마티스관절염을
치료하는 방법
류마티스관절염은 가장 흔한 전신성 염증성 자가면역 질환 중의 하나이고 성인 인구의 1-2%에서 발생하는 것으로 추정된다. 예를 들어, Dipiro, J.T., Rheumatoid arthritis, in PHARMACOTHERAPY: A PATHOPHYSIOLOGIC APPROACH, 1671-1682(Talbert, R.T. 등 eds., McGraw-Hill, New York, 6th ed. 2005)참고. 상기 질환은 활성화된 윤활막 증식(synovial membrane hyperplasia) 및 활성화된 T 세포를 포함하여, 염증 세포의 침윤을 특징으로 한다. 활성화된 T 세포는 다양한 세포 타입을 자극함으로써 류마티스관절염의 진행에서 중심이 되는 역할을 하여 IL-1, IL-6, 및 TNF-알파, 자가항체, 및 매트릭스 메탈로프로테이나제와 같은 염증전 사이토카인을 생산한다(Hoffman, R.W., Front. Biosci. 6:1369-1378 (2001); Choy, E.K. 등, N. Engl. J. Med 344:907-916 (2001)). 류마티스관절염의 진행에 대한 T 세포의 강한 기여는 T 세포 활성화를 치료적 개입에 대하여 합리적인 표적으로 만들었다. 그러한 염증성 분자는 류마티스관절염과 관련된 염증성 반응, 조직 손상(예, 관절 손상), 및 통증을 야기하는 것으로 여겨진다.
CD28 수용체 및 CD80 및/또는 CD86 리간드(들) 사이의 상호작용에 의해 매개된 T 세포의 보조-자극은 대부분의 T 세포의 활성화에 대하여 필수적이다(Riley, J.L. 등, Blood 105:13-21 (2005)). 가용성 다이머성 hCTLA-4-Ig 융합 단백질인 Orencia® 아바타셉트) 융합 단백질과 같은 CD80/CD86 - CD28 보조-자극 경로를 길항하는 치료적 또는 예방적 제제는 류마티스관절염의 치료에 임상적으로 효과적임이 나타나 있다(Kremer, J.M. 등, Ann. Intern. Med. 144:865-876 (2006); Genovese, M.C. 등, N. Engl. J. Med. 353:1114-1123 (2005)). 아바타셉트는 생체 내에서 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양으로 대상체(예, 성인)에 투여될 때 항원-제시 세포에서 CD80 및/또는 CD86 리간드에 결합함으로써 면역억제 기능을 발휘하고, 따라서 이들 리간드 중 하나 또는 둘 다와 T 세포 상의 CD28 수용체와의 상호작용을 예방하는 것으로 여겨진다.
아바타셉트는 메토트렉사트 또는 TNF 길항제와 같은 하나 이상의 DMARD에 대한 부적당한 반응을 가진 중등도 내지 심한 정도의 활성 RA를 가진 성인 환자를 치료하는데 현재 승인되어 있다. 아바타셉트는 정맥내 주입으로 대상체의 체중에 대하여 10mg/kg의 용량으로 어른 RA 환자에게 투여한다. 제1 용량 후에 10mg/kg의 융합 단백질의 제2 및 제3 용량은 제1용량 후 각각 2주 및 4주에 대상체에게 투여한다. 그 다음의 용량은 4주에 한 번(즉, 한달에 한 번) 투여한다. 아바타셉트의 정맥내 주입은 류마티스관절염 치료에서 바람직한 효험을 얻는데 필요한 고용량 수준을 운반하는데 필수적이라고 여겨진다.
류마티스관절염에 대한 다른 현재 치료법은 메토트렉사트, 및 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증 약물과 같은 비특이적인 면역억제제의 투여를 포함한다. 추가적으로, TNF-α(예, 레미케이드® 인플릭시맵(Remicade® infliximab), 엔브렐® 이타너셉트(Enbrel® etanercept), 휴미라® 아달리무맙(Humira® adalimumab)) 및 IL-1(예, 키네렛® 아나킨라(Kineret® anakinra))과 같은 특이적 염증전 사이토카인을 표적으로 하는 생물학적 제제가 승인되어 있다. 그러나, 이러한 치료법 중 많은 것이 특히 장기간에 걸쳐 투여될 때 유의한 부작용(이들 중 일부는 독성임)을 가진다.
다양한 치료법의 이용가능성에도 불구하고, RA의 치료에 대하여 유의한 충족되지 않은 수요가 존재한다. 예를 들어, 이전에 DMARD 치료를 실패한 인간 RA 환자의 60% 및 이전에 항-TNF 치료를 실패한 인간 RA 환자의 80%가 Orencia로 6개월간의 치료 후 ACR50 점수를 얻지 못했다(Kremer J.M. 등, Ann. Intern. Med. 144:865-876 (2006); Genovese, M.C. 등, N. Engl. J. Med. 353:1114-11 (2005)). 어른에서의 RA 치료에서 아바타셉트 및 벨라타셉트(LEA29Y-Ig) 융합 단백질을 사용한 용량 반응 연구는 효험이 용량 의존적이고 테스트된 최고 용량 수준에서 포화되지 않음을 나타내었다(Kremer, J.M. 등, N. Engl. J. Med. 349:1907-1915(2003); Moreland, L.W. 등, Arthrit. Rheum. 46:1470-1479 (2002)).
아바타셉트보다 hCD80 및/또는 hCD86에 대한 더 높은 결합 활성을 가지는 본 발명의 가용성 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig는 RA를 가진 대상체에게 투여될 때 아바타셉트보다 더 강력한 면역억제 효과를 발휘할 수 있다고 예상된다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig은 아바타셉트보다 더 낮은 농도에서 유사한 수의 CD80 및/또는 CD86 리간드를 결합한다.
CD80 또는 CD86에 대하여 각각 더 높은 결합 활성을 가지고 CD80 또는 CD86으로부터 더 느린 해리 속도를 가지는 변이체 CTLA-4-Ig은 그러한 리간드에서 더 긴 체류 시간을 가진다. 이러한 더 긴 체류 시간은 생체 내에서 더 높은 효험과 관련된 것으로 예상된다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig은 아바타셉트보다 더 낮은 용량에서 RA를 가진 대상체를 치료적으로 또는 예방적으로 치료하는데 효과적일 수 있다고 여겨진다. 즉, 그러한 변이체 CTLA-4-Ig은 대상체의 체중에 대하여 10mg/kg의 아바타셉트의 용량보다 더 적은 용량에서 RA 대상체에 투여될 때 아바타셉트의 효험의 정도와 동등한 효험의 정도를 얻을 수 있다. 본 발명은 hCD80 및/또는 hCD86에 대하여 변화된 결합 활성의 가용성 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 제공한다. 아바타셉트보다 hCD86에 대하여 실질적으로 더 높은 결합 활성을 가지는 가용성 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 아바타셉트의 용량보다 실질적으로 더 적은 용량에서 RA 대상체에 투여될 때 아바타셉트의 효험의 정도와 동등한 효험의 정도를 제공할 수 있다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig의 더 낮은 용량의 투여는 아바타셉트의 투여에 현재 사용되는 방법(정맥 주사)보다 더 편리한 투여 방법(예, 피하 주사)이 사용되는 것을 허용할 수 있다.
아바타셉트 또는 벨라타셉트 융합 단백질 보다 더 높은 면역억제 효능을 가진 본 발명의 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 RA 환자의 치료에서 더 높은 수준의 효험을 얻게 할 수 있을 것으로 여겨진다. 더 높은 면역억제의 변이체 CTLA-4-Ig은 아바타셉트보다 더 효과적으로 RA와 관련된 증상을 완화시키고 RA의 해로운 신체적 효과의 진행을 저해할 수 있을 것으로 예상된다. 그러한 변이체 CTLA-4-Ig은 0.1-200mg/ml의 범위의 농도에서 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제, 또는 담체(예, PBS)에서 제형화될 수 있다. RA를 가진 대상체의 치료는 대상체에 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양(용량)의 변이체 CTLA-4-Ig를 피하 주사 또는 정맥내 주입으로 적절하게 결정된 투약 빈도(예, 초기 투약 후 한달에 2 내지 4번 투약, 한달에 한 번 투약, 또는 두 달에 한 번 투약)로 투여함으로써 이루어질 수 있다. 상기 용량은 대상체의 질환 또는 증상의 심각도에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 대상체의 체중에 대하여 약 10mg/kg 이하(예를 들어, 약 1mg/kg, 0.5mg/kg, 0.25mg/kg, 1mg/kg, 2mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg, 7mg/kg, 8mg/kg, 또는 9mg/kg을 포함)의 변이체 CTLA-4-Ig의 양 또는 용량이 투여될 수 있다. 더 면역억제하는 변이체 CTLA-4-Ig은 일반적으로 아바타셉트로 사용된 투약 스케줄보다 덜 빈번한 투약 스케줄(예, 두달에 한 번)을 고려할 수 있다. 대안적으로, 대상체의 체중에 대하여 약 10mg/kg보다 더 큰 변이체 CTLA-4-Ig의 양 또는 용량(예를 들어 약 10mg/kg 내지 약 100mg/kg, 약 10mg/kg 내지 약 25mg/kg, 약 10mg/kg 내지 약 50mg/kg, 약 10mg/kg 내지 약 75mg/kg 등, 예컨대, 약 15mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg, 40mg/kg, 50mg/kg, 60mg/kg, 70mg/kg, 75mg/kg, 80mg/kg, 90mg/kg, 100mg/kg을 포함)이 대상체의 질환 상태 및/또는 증상이 상기 양 또는 용량을 보증한다면 RA를 가진 대상체에 투여될 수 있다.
RA으로 고통받는 인간에서 RA를 치료하기 위한 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 유효한 양 또는 용량은, 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 효능, 상기 다이머의 투여 방식, 및/또는 류마티스관절염에 대한 대상체의 증상 또는 징후의 심각도와 같은 다양한 인자에 기초하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 유효한 양 또는 용량은 Orencia® 다이머의 효능과 상기 다이머의 효능을 비교 및 RA의 유사한 증상 또는 징후를 보이는 인간 대상체에게 일반적으로 투여될 Orencia®의 양 또는 용량에 기초하여 Orencia®와 비교하여 바람직한 면역억제 효과(예를 들어, 개선된 효과 또는 대략적으로 동등한 효과)를 가져오는 변이체 CTLA-4-Ig 다이머의 양 또는 용량을 결정함으로써 확인할 수 있다.
하나의 구체예에서, 예를 들어, 본 발명은 류마티스관절염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 류마티스관절염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 가용성 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단밸질의 유효한 양을 예를 들어 정맥주사 또는 피하주사로 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 유효한 양 또는 용량은, 대상체의 체중 kg당 약 0.001mg 내지 약 10mg을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 대상체의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 10mg/kg을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 성인 환자의 체중에 대하여 약 0.05mg/kg, 0.1mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.5mg/kg, 1mg/kg, 2mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg, 7mg/kg, 8mg/kg, 9mg/kg, 또는 10mg/kg을 대상체에게 투여한다. 일부 경우에서, 유효한 양 또는 용량은 대상체의 체중에 대하여 약 2 내지 10mg/kg, 약 3 내지 10mg/kg, 약 3 내지 5mg/kg, 약 5 내지 10mg/kg, 체중에 대하여 0.1 내지 5mg/kg, 약 0.05 내지 1.0mg/kg, 체중에 대하여 약 0.05 내지 3mg/kg, 약 0.05 내지 2.0mg/kg, 약 0.05 내지 1.0mg/kg, 약 0.05 내지 2.0mg/kg, 약 0.1 내지 2.0mg/kg, 약 0.1 내지 3.0mg/kg, 약 0.1 내지 0.5mg/kg, 약 0.1 내지 0.8mg/kg, 약 0.1 내지 0.6mg/kg, 약 0.2 내지 1mg/kg, 약 0.2 내지 0.6mg/kg, 약 0.2 내지 0.5mg/kg 약 0.3 내지 1mg/kg, 약 0.3 내지 0.6mg/kg, 약 0.3 내지 0.5mg/kg이다. 일부 경우에서, 유효한 양 또는 용량은 체중이 60kg 미만인 대상체에 대하여 약 500mg 미만(예, 약 100mg, 75mg, 50mg, 25mg, 또는 12.5mg 미만), 체중이 60-100kg 사이인 대상체에 대하여 약 750mg 미만(예, 약 150mg, 100mg, 75mg, 37.5mg, 또는 20mg 미만), 또는 체중이 100kg 초과인 대상체에 대하여 약 1000mg 미만(예, 약 500mg, 100mg, 50mg, 25mg, 또는 10mg 미만)이다. 제1 투약 후에, 그 다음의 동등한 용량이 1, 2, 4, 8, 10, 12, 14, 또는 16주의 간격으로 투여한다. 다음의 투약 빈도는 필요에 따라 결정할 수 있다.
그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제와 함께 제형화되어 대상체(예, 인간을 포함한 포유류)에 투여하기에 적합한 약학적 조성물을 생산할 수 있다. 상기 조성물에서 융합 단백질의 농도는 약 0.01mg/ml 내지 약 300mg/ml 또는 약 0.01mg/ml 내지 약 200mg/ml의 범위일 수 있으며, 이는, 예를 들어 약 0.1mg/ml 내지 약 300mg/ml, 약 0.1mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 0.1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 50mg/ml, 약 1 내지 약 100mg/ml, 약 1 내지 약 75mg/ml, 약 5 내지 약 75mg/ml, 약 10 내지 약 75mg/ml, 약 10 내지 약 60mg/ml, 약 25 내지 약 60mg/ml, 약 30 내지 약 60mg/ml, 약 25 내지 약 50mg/ml, 약 40 내지 약 50mg/ml, 약 25mg/ml, 또는 약 50mg/ml를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 및 하기에서 검토되는 조성물들을 포함하여, 다른 조성물들이 또한 고려된다.
그러한 치료는 대상체에서 류마티스관절염과 관련된 하나 이상의 징후 및/또는 증상, 예를 들어 염증, 관절 압통, 관절 부종, 통증, 및 경직과 같은 징후 및/또는 증상을 감소시킬 것으로 예상된다. 그러한 치료는 환자에서 질환의 더 이상의 진행을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 그러한 치료는 환자에서 구조적 손상의 진행을 감소시킬 수 있다. 그러한 치료는 대상체의 신체적 기능을 개선시킬 수 있다.
조직, 세포,
이식편
, 또는 장기 이식 거부를 저해하는 방법
다른 양태에서, 본 발명은 수용자 대상체에 의한 공여자로부터의 조직, 세포, 피부이식편(skin graft), 또는 장기 이식의 거부를 저해하거나, 또는 수용자 대상체에 의한 공여자의 조직, 세포, 피부이식편(skin graft), 또는 장기 이식과 관련된 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 다음의 것 중 하나 이상을 수용자 대상체에 투여하는 것을 포함한다: (1) 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-ECD 폴리펩티드 또는 다이머성 또는 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질); (2) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 멀티머(예, 임의의 두 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 다이머 또는 임의의 네 개의 그러한 폴리펩티드를 포함하는 테트라머); (3) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 접합체; (4) 본 발명의 핵산(예, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산); (5) 본 발명의 핵산을 포함하는 또는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터; (6) 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 접합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포 또는 세포 집단; 및/또는 (7) 본 발명의 조성물, 그렇게 함으로써 수용자 대상체에 의한 조직, 세포, 피부이식편, 또는 장기 이식의 거부를 저해한다. 공여자 또는 수용자는 같은 종(species) 또는 다른 종일 수 있다. 공여자 또는 수용자는, 인간, 비인간 영장류(예, 원숭이, 고릴라), 양, 고양이, 개, 돼지, 소, 말, 등과 같은 포유류일 수 있다. 일부 그러한 방법에서, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 벡터, 및/또는 세포는 조직, 세포, 피부이식편, 또는 장기 이식 전에, 이와 동시에, 또는 후에 수용자 대상체에 투여할 수 있다. 유효한 양은 일반적으로 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 대상체의 체중에 대하여 약 200mg/kg을 포함한다. 일부 그러한 방법에서, 예를 들어, 유효한 양은 대상체의 체중의 kg당 약 0.001mg(mg/kg) 내지 대상체의 체중의 kg당 적어도 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 또는 300mg(mg/kg)을 포함한다. 일부 그러한 방법에서, 유효한 양은 대상체의 체중의 kg당 약 0.001mg(mg/kg) 내지 대상체의 체중의 kg당 적어도 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 50, 또는 75mg(mg/kg)을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 및/또는 세포는 이식 동안에, 이식 전에, 또는 이식 후 즉시 수용자 대상체에 투여할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 그러한 분자는 필요에 따라, 이식 후 1시간 이상 후에, 이식 다음 날에, 및/또는 그 후 매일, 또는 이식 후 적어도 일주일에 한 번, 적어도 이주일에 한 번, 또는 적어도 한달에 한 번, 필요에 따라 12개월, 24개월, 또는 36개월 또는 그 이상까지의 동안에 투여할 수 있다. 장기 이식은 예를 들어, 신장, 간, 심장, 또는 폐와 같은 임의의 장기를 수반할 수 있다.
이식 거부를 저해(또는 그러한 이식과 관련된 면역 반응을 억제)하기 위하여 장기, 조직, 또는 세포 이식 수용자 대상체에 투여될 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머)의 유효한 양 또는 용량은 일반적으로 그러한 분자의 효능, 투여 방식, 이식 타입(예, 세포, 조직, 장기), 대상체의 내력, 및/또는 이식 거부를 연상시키는 면역 반응(들)에 대한 이식 수용자 대상체의 증상 또는 징후의 심각도에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머(예, D3-29-IGg2, D3-54-IgG2, D3-56-IgG2, D3-69-IgG2, D3-75-IgG2 다이머 등)의 유효한 양 또는 용량은 벨라타셉트 다이머의 효능과 상기 다이머의 효능을 비교함으로써 결정할 수 있다. 신장(kidney/renal) 이식과 관련된 면역 반응을 방지 또는 억제하는데 유용한 벨라타셉트의 유효한 용량은 알려져 있다. 예를 들어, 벨라타셉트는 신장 공여자로부터 인간에서의 신장 이식 후 인간에게 한달에 인간의 체중의 kg당 약 5mg 또는 10mg의 양 또는 용량으로 정맥내 주입으로 투여한다. 벨라타셉트보다 약 "X" 배 더 효능이 있는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 벨라타셉트 용량보다 약 "X" 배 더 적은 양 또는 용량으로 신장 이식을 받은 사람에게 투여(예, 정맥내, 피하, 또는 본 명세서에 기술된 다른 방식으로)되어 벨라타셉트의 치료 효과와 거의 동등한 치료 효과(예, 면역 반응을 억제)를 얻을 수 있다. 만약 더 큰 치료 효과를 원한다면, 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머의 비례적으로 증가된 양 또는 용량을 결정하여 투여할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 공여자로부터 조직, 세포, 또는 장기를 받은 대상체에서 조직, 세포, 또는 장기 이식 거부(예, 고형장기이식거부(예, 신장, 간, 폐, 심장 등))를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 및/또는 세포의 치료적으로 유효한 양을 수용자에게 투여하는 것을 포함하고, 그렇게 함으로써 수용자 대상체에 의한 공여자의 조직, 세포, 또는 장기 이식의 거부를 저해한다. 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 및/또는 세포는 세포, 조직 또는 장기 이식 전, 이와 동시에, 또는 후에 대상체에 투여할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 섬세포(islet cell) 이식 거부를 저해할 필요가 있는 수용자 대상체에서 공여자로부터의 섬세포(islet cell) 이식의 거부를 방지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로 공여자의 췌장으로부터의 섬세포(들)의 이식 전, 이와 동시에, 또는 후에 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)의 유효한 양 또는 용량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 대상체(예, 사람)는 일반적으로 당뇨병(예, IDDM)으로 고통받으며, 그러한 방법은 당뇨병으로 진단을 받거나 당뇨병으로 고통받는 대상체를 치료하는데 유용하다. 섬 이식 절차는 당해 분야에 알려져 있다. 일반적으로 섬(islet)은 사망한 장기 공여자의 췌장에서 제거되어, 정제 및 처리되고, 당뇨병으로 고통받는 수용자 대상체로 이식된다. 이식 후에, 섬에서 베타 세포가 인슐린을 생산 및 분비하기 시작하고, 그렇게 함으로써 인슐린에 대한 수용자 대상체의 수요를 감소시킨다.
이식 거부를 저해하는 그러한 방법에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4 분자(예, 변이체 CTLA-4-Ig)는 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제와 함께 제형화되어 대상체(예, 사람을 포함한 포유류)에의 투여에 적합한 약학적 조성물을 생산할 수 있다. 일부 그러한 방법은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제 및 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 다이머를 포함하는 약학적 조성물의 투여를 포함하며, 상기 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 약 0.01mg/ml 내지 약 300mg/ml 또는 약 0.01mg/ml 내지 약 200mg/ml의 농도를 가지고, 이는 예를 들어 약 0.1mg/ml 내지 약 300mg/ml, 약 0.1mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 0.1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 0.5mg/ml 내지 약 50mg/ml, 약 1 내지 약 100mg/ml, 약 1 내지 약 75mg/ml, 약 5 내지 약 75mg/ml, 약 10 내지 약 75mg/ml, 약 10 내지 약 60mg/ml, 약 25 내지 약 60mg/ml, 약 30 내지 약 60mg/ml, 약 25 내지 약 50mg/ml, 약 40 내지 약 50mg/ml, 약 25mg/ml, or 약 50mg/ml를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 및 하기에서 검토되는 조성물들을 포함하여, 다른 조성물들이 또한 고려된다.
면역 반응을 저해하는 방법
다른 양태에서, 본 발명은 포유류(예, 인간 또는 비인간 영장류)에서 면역 반응을 저해 또는 억제하는 약제의 제조를 위하여 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어 다이머성 또는 모노머성 융합 단백질 또는 멀티머성 폴리펩티드를 포함), 접합체, 핵산, 벡터, 또는 세포의 사용을 포함한다. 억제될 수 있는 면역 반응은, 예를 들어, T 세포 활성화 또는 증식, 사이토카인 합성 또는 생산, 활성화 마커의 유도, 염증성 분자의 합성 또는 생산, 염증, 항-콜라겐 Ab 생성, T 세포-의존성 Ab 반응을 포함한다.
또한 본 발명은 면역계 질환 또는 장애를 치료하는 약제의 제조를 위하여 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어 다이머성 또는 모노머성 융합 단백질 또는 멀티머성 폴리펩티드를 포함), 접합체, 핵산, 벡터, 또는 세포의 사용을 포함한다. 면역계 질환 또는 장애는 포유류에서 T 세포와 CD80-양성 세포 및/또는 CD86-양성 세포와의 상호작용으로 매개된다. 면역계 질환 또는 장애는 류마티스성 질환 또는 장애 또는 자가면역 질환 또는 자가면역 장애와 같은, 면역계 질환 또는 장애일 수 있다. 그러한 면역계 질환 또는 장애는, 예를 들어 에디슨병, 알레르기, 원형탈모증, 알츠하이머병, 항중성구세포질항체(Antineutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)-관련 혈관염, 강직성척추염, 항인지질항체증후군(휴즈증후군), 관절염, 천식, 죽상경맥동화증, 죽상경화판(Atherosclerotic plaque), 자가면역(예, 루푸스, RA, MS, 그레이브스병 등), 자가면역용혈성빈혈, 자가면역성간염, 자가면역내이질환(Autoimmune inner ear disease), 자가면역림프세포증식증후군, 자가면역심근염, 자가면역성난소염, 자가면역고환염, 무정자증, 베체트병, 베체트증후군, 버거스씨병, 수포성 유천포창, 심근증, 심혈관계질환, 비열대스프루/세리악병(Celiac Sprue/Coeliac disease), 만성피로면역이상증후군(Chronic Fatigue Immune Dysfunction Syndrome, CFIDS), 만성특발성다발성신경염, 만성염증성탈수초성다발성신경병증(Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradicalneuropathy, CIDP), 만성재발성다발성신경병증(길리안바레증후군), 처그-스트라우스증후군(Churg-Strauss Syndrome, CSS), 흉터성유사천포창, 저온응집병(Cold Agglutinin Disease, CAD), COPD, CREST증후군, 크론병, 포진상피부염, 피부근염, 당뇨병, 원판상루푸스, 습진, 후천성수포성표피박리증, 원발성혼합한랭글로불린증, 에반증후군, 안구돌출증, 섬유근육통, 굳파스튜어증후군, 이식편-관련 질환 또는 장애, 그레이브스병, GVHD, 하시모토씨갑상선염, 특발성폐섬유화증, 특발성혈소판감소성자반증(Idiopathic Thrombocytopenia Purpura, ITP), IgA 신염, 면역증식성질환 또는 장애(예, 건선), 염증성장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 인슐린의존성당뇨병(Insulin Dependent Diabetes Mellitus, IDDM), 간질성폐질환, 소아당뇨병, 소아관절염, 소아특발성관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA), 가와사키병, 람버트-이튼근무력성증후군, 편평태선, 루푸스, 루푸스신염, 림프구성뇌하수체염(Lymphocytic Hypophysitis), 메니에르병, 밀러피셔증후군(Miller Fisher Syndrome)/급성파종성뇌척수신경근질환(acute disseminated encephalomyeloradiculopathy), 혼합결합조직병, 다발성경화증(Multiple Sclerosis, MS), 근육류머티즘, 근육통성뇌척수염(Myalgic encephalomyelitis, ME), 중증근무력증, 안구염증, 낙엽상천포창, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발성동맥염, 다발연골염, 다분비성증후군(휘터커 증후군), 류마티스성다발성근육통, 다발성근염, 원발성무감마글로불린증(Primary Agammaglobulinemia), 원발성담즙성경화/자가면역성담관염, 건선, 건선성관절염, 레이노증후군, 라이터증후군/반응성관절염, 재협착(Restenosis), 류머티즘열, 류마티스성질환, 류마티스관절염, 유육종증, 슈미트증후군, 피부경화증, 쇼그렌증후군, 고형장기이식거부(신장, 심장, 간, 폐, 등), 근육강직증후군(Stiff-Man Syndrome), 전신성홍반성루푸스(Systemic Lupus Erythematosus, SLE), 전신성피부경화증, 다카야스동맥염, 측두동맥염/거대세포동맥염, 갑상선염, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 궤양성대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 수용자 대상체에 의한 공여자의 조직, 세포, 이식편, 또는 장기 이식의 거부와 관련된 면역 반응을 예방 또는 억제하는 것이거나 이를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 CD80-양성 세포 및/또는 CD86-양성 세포와 CD28-양성 및/또는 CTLA-4-양성 T 세포와의 상호작용을 저해하는 약제의 제조를 위하여 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 또는 세포의 사용을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 포유류에서 조직 또는 장기 이식 거부(예, 고형장기이식거부(예, 신장, 폐, 간, 심장 등))를 치료하는 약제의 제조를 위하여 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 또는 세포의 사용을 포함한다.
면역 반응의 평가
본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 바이러스, 슈도바이러스, VLP, 또는 조성물로 억제된 면역 반응은 임의의 적합한 기술로 측정될 수 있다. 체액성 면역 반응을 평가하는데 유용한 기술의 예는 유세포분석법, 면역블랏팅분석, 면역조직화학분석, 면역침강분석, 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 및 효소 면역측정법을 포함한다. 효소면역측정법은 및 효소결합 면역유동분석법(enzyme-linked immunoflow assays, ELIFA) 및 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA) 및 경쟁적 ELISA(competitive ELISA) 분석법을 포함한 효소결합면역흡착분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 포함한다. 또한 HPLC 및 모세관전기영동(capillary electrophoresis, CE)이 면역분석법에서 사용되어 항체 및 표적 물질의 복합체를 검출할 수 있다. 그러한 기술 및 관련 원리를 실행하는 일반적인 지침은 예를 들어, Harlow 및 Lane (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York, Hampton R 등 (1990) SEROLOGICAL METHODS A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul Minn., Stevens (1995) CLINICAL IMMUNOLOGY AND SEROLOGY: A LABORATORY PERSPECTIVE, CRC press, Bjerrum (1988) HANDBOOK OF IMMUNOBLOTTING OF PROTEINS, Vol. 2, Zoa (1995) DIAGNOSTIC IMMUNOPATHOLOGY: LABORATORY PRACTICE AND CLINICAL APPLICATION, Cambridge University Press, Folds (1998) CLINICAL DIAGNOSTIC IMMUNOLOGY: PROTOCOLS IN QUALITY ASSURANCE AND STANDARDIZATION, Blackwell Science Inc., Bryant (1992) LABORATORY IMMUNOLOGY & SEROLOGY 3rd edition, W B Saunders Co., 및 Maddox D E 등 (1983) J. Exp. Med. 158:1211에 기술되어 있다. ELISA 기술 및 관련 원리에 대한 지침은 예를 들어, Reen (1994) Methods Mol. Biol. 32:461-6, Goldberg 등 (1993) Curr. Opin. Immunol. 5(2):278-81, Voller 등 (1982) Lab. Res. Methods Biol. Med. 5:59-81, Yolken 등 (1983) Ann. NY Acad. Sci. 420:381-90, Vaughn 등 (1999) Am. J. Trop. Med. Hyg. 60(4):693-8, 및 Kuno 등 (1991) J. Virol. Methods 33(1-2):101-13에 기술되어 있다. 유세포분석 기술에 대한 지침은 예를 들어, Diamond (2000) IN LIVING COLOR : PROTOCOLS IN FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING, Springer Verlag, Jaroszeki (1998) FLOW CYTOMETRY PROTOCOLS, 1st Ed., Shapiro (1995) PRACTICAL FLOW CYTOMETRY, 3rd edition, Rieseberg 등 (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56(3-4):350-60, Scheffold 및 Kern (2000) J. Clin. Immunol. 20(6):400-7, 및 McSharry (1994) Clin. Microbiol. Rev. (4):576-604에 제공되어 있다.
또한 세포독성 및 다른 T 세포 면역 반응은 임의의 적합한 기술로 측정될 수 있다. 그러한 기술의 예는 ELISpot 분석법(특히, IFN-감마 ELISpot), 세포내 사이토카인 염색법(intracellular cytokine staining, ICC)(특히, FACS 분석법과 조합하여), CD8+ T 세포 테트라머 염색/FACS, 표준 및 변형된 T 세포 증식 측정법, 크로뮴 방출 CTL 분석법(chromium release CTL assay), 한계희석법(limiting dilution analysis, LDA), 및 CTL 살해능 분석법(CTL killing assay)을 포함한다. T 세포 증식 측정법과 관련한 지침 및 원리는 예를 들어, Plebanski 및 Burtles (1994) J. Immunol. Meth. 170:15, Sprent 등 (2000) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 355(1395):317-22 및 Messele 등 (2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(4):687-92에 기술되어 있다. LDA는 예를 들어, Sharrock 등 (1990) Immunol. Today 11:281-286에 기술되어 있다. ELISpot 분석법 및 관련 원리는 예를 들어, Czerinsky 등 (1988) J. Immunol. Meth. 110:29-36, Olsson 등 (1990) J. Clin. Invest. 86:981-985, Schmittel 등 (2001) J. Immunol. Meth. 247(1-2):17-24, Ogg 및 McMichael (1999) Immunol. Lett. 66(1-3):77-80, Schmittel 등 (2001) J. Immunol. Meth. 247(1-2):17-24, Kurane 등 (1989) J. Exp. Med. 170(3):763-75, Chain 등 (1987) J. Immunol. Meth. 99(2):221-8, Czerkinsky 등 (1988) J. Immunol. Meth. 110:29-36, 및 미국특허 제5,750,356호 및 제6,218,132호에 기술되어 있다. 테트라머 분석법은 예를 들어, Skinner 등 (2000) J. Immunol. 165(2):613-7에서 검토된다. 다른 T 세포 분석 기술은 Hartel 등 (1999) Scand. J. Immunol. 49(6):649-54 및 Parish 등 (1983) J. Immunol. Meth. 58(1-2):225-37에 기술되어 있다.
또한 T 세포 활성화는 CTL 활성 또는 IL-2 수용체, CD69 또는 HLA-DR 분자와 같은 활성화 항원의 발현을 측정함으로써 분석할 수 있다. 정제된 T 세포의 증식은 혼합림프구반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석법에서 측정할 수 있으며; 상기 분석법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
ELISpot 분석법은 T-세포 효과기의 마커로서의 역할을 하는, IFN-γ 또는 TNF-α와 같은 특이적인 사이토카인을 분비하는 T-세포의 수를 측정한다. 사이토카인-특이적 ELISA 키트는 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, IFN-γ-특이적 ELISPot는 미국 미네소타주 미니애폴리스의 R&D Systems를 통해 입수가능하다).
T 세포 활성화 및/또는 T 세포 증식을 억제하거나 또는 저해하는 본 발명의 분자(예를 들어, 예컨대 본 발명의 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함한, 본 발명의 폴리펩티드)의 능력을 평가하고 측정하는 추가적인 방법은 아래 실시예 섹션에서 실시예 5-8에 기술되어 있다.
투여 방법
본 명세서 기술된 임의의 방법에서, 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체(예, PBS) 및 본 발명의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 모노머성, 다이머성, 또는 멀티머성 변이체 CTLA-4-Ig) 또는 접합체와 같은 본 발명의 분자의 유효한 양을 포함하는 주사가능한 약학적 조성물은 비경구적으로, 근육내료, 복강내로, 정맥내로, 피하로(subdermally), 경피로, 피하로(subcutaneously), 또는 피내로 숙주에게 투여할 수 있다. 대안적으로, 바이오리스틱(biolistic) 단백질 전달 기술(백신 총 전달(vaccine gun delivery))을 사용할 수 있다(이의 예는 본 명세서의 다른 부분에서 검토함). 또한 임의의 다른 적합한 기술을 사용할 수 있다. 폴리펩티드 투여는 리포솜을 통해 용이하게 할 수 있다. 임의의 그러한 전달 기술은 본 명세서에 기술된 임의의 치료적 또는 예방적 방법과 함께 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 전달하는데 사용할 수 있다.
다음의 검토는 우선 핵산에 관한 것이지만, 이는 본 발명의 핵산 벡터에 동등하게 적용함을 이해할 것이다. 본 발명의 핵산 또는 이의 조성물은 임의의 적합한 투여 경로로 숙주에게 투여할 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 핵산의 투여는 비경구(예, 피하(subcutaneous, s.c.), 근육내(intramuscular, i.m.), 또는 피내(intradermal, i.d.)), 국부적(topical), 또는 경피(transdermal)이다. 핵산은 바늘 또는 다른 유사한 장치를 이용한 주사로써 근육과 같은 조직내로 직접적으로 도입할 수 있다. 예를 들어, 상기한 Nabel 등 (1990); Wolff 등 (1990) Science 247:1465-1468, Robbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, NJ, 및 Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England, 및 미국특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호 참조. “바이오리스틱” 또는 입자-매개 형질전환(particle-mediated transformation)과 같은 다른 방법은 예를 들어, 미국특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호, Sanford 등, J. Particulate Sci. Tech. 5:27-37 (1987), Yang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-72 (1990), 및 Williams 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30 (1991) 참조. 이들 방법은 생체 내에서 포유류와 같은 대상체로의 DNA 도입 뿐만 아니라, 생체 외에서 포유류로의 재도입을 위한 세포의 변형(이는 본 명세서의 다른 부분에서 더 검토함)에도 유용하다.
표준 유전자 총(gene gun) 투여에 대하여, 관심의 벡터 또는 핵산은 미세한 금속 비드의 표면상으로 침전된다. 미세발사체(microprojectile)는 충격파(shock wave) 또는 확장한 헬륨 기체로 가속화되고 수개의 세포층 깊이로 조직을 통과한다. 예를 들어, 미국 위스콘신주 미들턴에 위치한 Agacetus, Inc.에 의해 제조된 AccelTM 유전자 전달 장치가 이 구체예에서의 사용에 적합하다. 핵산 또는 벡터는 그러한 기술로, 예를 들어 근육내로, 피내로, 피하로(subdermally), 피하로(subcutaneously), 및/또는 복강내로 투여할 수 있다. 바이오리스틱 전달과 관련된 추가적인 장치 및 기술은 국제특허출원공개 제WO 99/2796호, 제WO 99/08689호, 제WO 99/04009호, 및 제WO 98/10750호, 및 미국특허 제5,525,510호, 제5,630,796호, 제5,865,796호, 및 제6,010,478호에서 제공된다.
핵산은 형질감염-촉진제(transfection-facilitating agent)와 공동으로 투여될 수 있으며, 형질감염-촉진제의 예는 상기에서 검토하였다. 핵산은 국부적으로 및/또는 액체 입자 전달(liquid particle delivery)(고체 입자 바이오리스틱 전달에 반대됨)로 투여할 수 있다. 본 발명의 핵산에 대한 전달 수단으로서 적합할 수 있는 상기 핵산 전달 기술, 조성물, 및 추가적인 구성체(construct)의 예는 예를 들어, 미국특허 제5,591,601호, 제5,593,972호, 제5,679,647호, 제5,697,901호, 제5,698,436호, 제5,739,118호, 제5,770,580호, 제5,792,751호, 제5,804,566호, 제5,811,406호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,830,877호, 제5,846,949호, 제5,849,719호, 제5,880,103호, 제5,922,687호, 제5,981,505호, 제6,087,341호, 제6,107,095호, 제6,110,898호, 및 국제특허출원공개 제WO 98/06863호, 제WO 98/55495호, 및 제WO 99/57275호에서 제공된다.
대안적으로, 핵산은 리포솜-기반 유전자 전달의 방법으로 숙주에 투여할 수 있다. 리포솜-기반 유전자 전달과 관련된 예시적인 기술 및 원리는 예를 들어, Debs 및 Zhu (1993) 제WO 93/24640호; Mannino 및 Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682-691; Rose 미국특허 제5,279,833호; Brigham (1991) 국제특허출원공개 제WO 91/06309호; Brigham 등 (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Nabel 등 (1990) Science 249:1285-1288; Hazinski 등 (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol. 4:206-209; 및 Wang 및 Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 및 Felgner 등 (1987) Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:7413-7414)에서 제공된다. 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 적합한 리포솜의 약학적으로 허용가능한 조성물은 본 명세서의 다른 부분에 더 기술되어 있다.
본 발명의 임의의 양의 핵산을 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 예를 들어 충분한 핵산은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체에서 제형화되어 대상체로 투여되어 인코딩된 폴리펩티드 또는 접합체는, 예를 들어 대상체에서 면역 반응을 억제, 대상체에서 내인성 B7-양성 세포 및 CD28-양성 세포 사이의 상호작용을 저해, 또는 조직, 세포, 장기, 또는 이식편 이식의 거부를 저해하는데 유효하다고 여겨지는 양으로 대상체에서 생산된다. 하나의 포맷에서, 핵산을 주사로 투여할 때, 약 50㎍ 내지 100mg의 핵산을 투여한다. 하나의 예시적인 응용에서, 면역 반응을 억제하기 위하여, PBS 및 유효한 양의 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 벡터의 양을 포함하는 약학적 조성물은 주사 또는 전기 천공법 또는 다른 적합한 전달 방법(예, 유전자 총, 피부를 통한 영향, 및 리포펙션(lipofection))으로 치료가 필요한 대상체(예, 면역억제 치료가 바람직한 면역계 질환 또는 장애를 겪는 대상체)에게 투여한다. 예시적인 벡터가 도 1에 나타나 있다.
투여가 유전자 총을 통해 이루어지는 본 발명의 방법에서의 사용을 위한 DNA 플라스미드의 양은 예를 들어, 종종 직접 주사(예, 표준 바늘 주사를 통함)에서 사용되는 양보다 약 100 내지 약 1000배 적다. 그러한 민감도에도 불구하고, 핵산의 적어도 약 1㎍이 상기 바이오리스틱 전달 기술에서 사용될 수 있다.
RNA 또는 DNA 바이러스 시스템이 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 전달하는데 유용할 수 있다. 바이러스 벡터는 생체 내에서 대상체에 직접적으로 투여할 수 있거나 시험관 내에서 세포를 치료하는데 사용할 수 있고 변형된 세포는 세포외 포맷에서 대상체에 투여한다. 유용한 바이러스 벡터는 아데노 연관(adeno-associated) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 단순포진바이러스(herpes simplex virus) 벡터와 같이 상기 검토된 것들을 포함한다. 그러한 바이러스 벡터와 함께, 본 발명의 핵산은 대상체의 표적 세포 및 조직으로 용이하게 전달될 수 있다. 추가적으로, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노 연관 바이러스 유전자 전달(gene transfer) 방법과 함께 본 발명의 핵산은 숙주 게놈으로 통합되는 것이 가능할 수 있고, 그렇게 함으로써 삽입된 핵산의 발현이 계속된다.
본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터의 대상체로의 전달은 벡터가 투여된 대상체에서 면역 반응을 억제할 수 있는 것으로 여겨진다. 선택적으로, 본 발명의 일부 예방적 및/또는 치료적 방법은 검출가능한 면역 반응을 저해하기에 충분한 적합한 바이러스 벡터의 용량으로 실행한다. 임의의 적합한 농도로 본 발명의 핵산을 포함하는 임의의 적합한 바이러스 벡터는 면역 반응을 억제하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 집단(이의 예는 예를 들어, Buchscher 등 (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739, Johann 등 (1992) J. Virol. 66 (5):1635-1640 (1992), Sommerfelt 등, (1990) Virol. 176:58-59, Wilson 등 (1989) J. Virol. 63:2374-2378, Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224 (1991), Wong-Staal 등, PCT/US94/05700, Rosenburg 및 Fauci (1993) in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, THIRD EDITION Paul (ed.) Raven Press, Ltd., New York 및 그 가운데의 참조문헌에 기술되어 있음), AAV 벡터 집단(예를 들어, West 등 (1987) Virology 160:38-47, Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801, Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351, Tratschin 등 (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260, 미국특허 제4,797,368호 및 제5,173,414호, 및 국제특허출원공개 제WO 93/24641호에 기술되어 있는 바와 같음), 또는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Berns 등 (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:95-104; Ali 등 (1994) Gene Ther. 1:367-384; 및 Haddada 등 (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199 ( Pt 3):297-306에 기술되어 있는 바와 같음)의 집단을 대상체 숙주로 투여할 수 있으며, 핵산 발현의 면역억제 수준은 벡터 결과물에 포함되고, 그렇게 함으로써 바람직한 면역억제 반응을 얻는다. 바이러스 벡터의 다른 적합한 타입은 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다(적합한 레트로바이러스 벡터, AAV 벡터, 및 아데노바이러스 벡터의 대안적인 예를 포함함).
바이러스 벡터 입자의 이들 및 다른 타입에 대한 적합한 감염 조건은 예를 들어, Bachrach 등, J. Virol., 74(18), 8480-6 (2000), Mackay 등, J. Virol., 19(2), 620-36 (1976), 및 상기한 FIELDS VIROLOGY에 기술되어 있다. 바이러스 벡터의 생산 및 바이러스 벡터의 응용에 유용한 추가적인 기술은 예를 들어, “Practical Molecular Virology: Viral Vectors for Gene Expression” in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 8, Collins, M. Ed., (Humana Press 1991), VIRAL VECTORS: BASIC SCIENCE AND GENE THERAPY, 1st Ed. (Cid-Arregui 등, Eds.) (Eaton Publishing 2000), “Viral Expression Vectors,” in CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, Oldstone 등, Eds. (Springer-Verlag, NY, 1992), 및 “Viral Vectors” in CURRENT COMMUNICATIONS IN BIOTECHNOLOGY, Gluzman 및 Hughes, eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)에 기술되어 있다.
본 발명의 하나 이상의 분자를 포함하는 벡터 또는 바이러스의 독성 및 치료적 효험은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차를 사용하여 결정한다. 당업자는 MLD50(집단의 50%가 사망하는 최소 용량) 및/또는 ED50(집합의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 본 명세서에서 제시된 절차 및 그외 당해 분야에 알려진 절차를 사용하여 결정할 수 있다. 또한 알려진 바이러스 백신에 대한 제안된 용량에 대하여 S. Plotkin 및 W. Orenstein, VACCINES(W. B. Saunders Co. 1999 3d ed.) 참조. 본 발명의 핵산, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 형질도입된 세포 및 다른 제형은, 대중 및 환자의 전반적인 건강상태에 적용되는 대로, 예를 들어 제형의 MLD50, 및 다양한 농도에서의 이의 부작용으로 결정된 양으로 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하는 바이러스유사 입자(virus-like particle) 또는 바이러스(예, 감약된 또는 복제-결핍 바이러스)의 집단을 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물의 ED50과 동등하거나 그보다 큰 용량을 투여함으로써 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 투여는 단일 투여 또는 분할된 투여(공동-투여, 연속 투여, 또는 이의 조합 중 하나에 의함)를 통해 이루어질 수 있다. 투여 기술 및 프로토콜은 예를 들어, 상기한 Plotkin (VACCINES) 및 본 명세서에 인용된 다른 참조문헌에 기술되어 있다. 관련된 의미에서, 면역력을 유도하는데 효과적인 핵산, 폴리펩티드, 벡터, 및 세포 조성물의 용량을 평가하는 기술은 예를 들어 유럽특허출원 제1 156 333호 및 그 가운데 인용된 참조문헌에 기술되어 있다.
바이러스 벡터는 대상체, 예를 들어 포유류의 특정 조직, 세포, 및/또는 장기로 표적화할 수 있다. 그러한 벡터의 예는 상기에 기술되어 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 핵산 벡터는 선택적으로 사용되어 단핵백혈구(monocyte), 수지상 세포(dendritic cell), 수지상 세포와 관련된 세포(예, 랑게르한스 세포와 관련된 케라티노사이트), T-세포, 및/또는 B-세포로 본 발명의 핵산 서열을 전달할 수 있다. 바이러스 벡터는 복제-결핍 바이러스 벡터일 수 있다. 또한 바이러스 벡터 입자는 변형되어 바이러스 벡터에 대한 숙주 면역 반응을 감소시킬 수 있으며, 그렇게 하여 끊임없는 유전자 발현을 이룰 수 있다. 그러한 “스텔스(stealth)” 벡터는 예를 들어, Martin, Exp. Mol. Pathol. 66(1):3-7 (1999), Croyle 등, J. Virol. 75(10):4792-801 (2001), Rollins 등, Hum. Gene Ther. 7(5):619-26 (1996), Ikeda 등, J. Virol. 74(10):4765-75 (2000), Halbert 등, J. Virol. 74(3):1524-32 (2000), 및 국제특허출원공개 제WO 98/40509호에 기술되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 바이러스 벡터 입자는 선택된 계획으로 투여하여 벡터 입자에 대한 숙주 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 숙주에 대한 투여시 바이러스 벡터 입자에 대한 면역 반응을 감소시키는 계획은 예를 들어, Maione 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(11):5986-91 (2001), Morral 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(22):2816-21 (1999), Pastore 등, Hum. Gene Ther. 10(11):1773-81 (1999), Morsy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7866-71 (1998), Joos 등, Hum. Gene Ther. 7(13):1555-66 (1996), Kass-Eisler 등, Gene Ther. 3(2):154-62 (1996), 미국특허 제6,093,699호, 제6,211,160호, 제6,225,113호, 미국특허출원공개 제2001-0066947A1호에서 제공된다.
피부 및 근육은 일반적으로 임의의 적합한 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 및 벡터의 투여에 바람직한 표적이다. 따라서, 대상체(예, 포유류)의 피부내로 또는 피부를 통한 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 또는 벡터의 전달은 본 발명의 특징이다. 본 발명의 그러한 분자는 피부내로 또는 피부를 통하여, 예를 들어 근육내로 또는 복강내로 약학적으로 허용가능한 주사가능한 용액으로 투여할 수 있다. 또한 투여는 대상체의 피부로, 피부내로, 또는 피부를 통하여 또는 대상체의 노출된 근육내로 경피 장치로, 또는 보다 일반적으로, 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 및/또는 벡터의 바이오리스틱 전달로 이루어질 수 있다. 본 명세서의 다른 부분에 기술된, 본 발명에 의해 제공되는 경피 장치는 예를 들어, 적합한 기간 동안 숙주의 피부에 적용되어 대상체로 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터의 충분한 전달이 일어날 수 있고, 그렇게 함으로써 개체 내의 면역 반응을 억제하거나 또는 이식편, 세포 또는 조직 이식의 거부를 저해할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는 액체 용액의 주사는 근육 투여를 보다 일반적으로 용이하게 한다. 표적이 될 수 있는 특정 세포는 수지상 세포, 다른 APC, B 세포, 단핵백혈구, T 세포(T 헬퍼 세포를 포함함), 및 그러한 면역계 세포와 관련된 세포(예, 케라티노사이트 또는 랑게르한스 세포와 관련된 다른 피부 세포)를 포함한다. 본 발명의 벡터 및 핵산의 표적화는 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다. 그러한 표적화된 투여는 세포 및/또는 조직-특이적 프로모터와 작동적으로 연결된 핵산을 포함하는 핵산 또는 벡터로 실행될 수 있으며, 상기 핵산 또는 벡터의 예는 당해 분야에 알려져 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 운반 시스템으로 투여되어, 재조합형 폴리펩티드의 발현이 숙주에서 일어나 면역 반응의 억제, B7-양성 세포와 CD28-양성 세포 사이의 상호작용의 저해, 또는 조직, 세포, 장기, 또는 이식편 이식 거부의 저해를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산을 포함하는 박테리아 세포의 유효한 양의 집단을 대상체에 투여하여 본 발명의 재조합형 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 발현하고, 대상체에서 면역 반응을 억제할 수 있다. 포유류 유전자 운반을 위하여 개발된 박테리아 세포는 당해 분야에 알려져 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 개체로의 투여는 유효한 수의 세포 또는 유효한 조직 표적으로 전기천공법의 적용으로 용이하게 되어, 핵산 및/또는 벡터는 세포에 의해 흡수되고, 그 세포 내에서 발현되어, 그 세포 내에서 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생산하게 되며 이어서 대상체 내에서 면역 반응이 억제된다.
제조 및 정제 방법
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 및 세포를 만들고 정제하는 방법을 추가로 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 배양 배지 내의 세포 집단 내로 도입하고, 배지 내에서 세포를 배양하여 (원하는 수준의 유전자 발현에 적합한 시간 동안 및 조건 하에서) 폴리펩티드를 생산하고, 세포, 배양 배지, 또는 둘 다로부터 폴리펩티드를 분리함으로써 본 발명의 재조합형 폴리펩티드를 만드는 방법을 제공한다. 상기 핵산은 일반적으로 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 발현하는데 효과적이도록 조절 서열에 기능적으로 연결되어 있다.
폴리펩티드는 세포 용해물, 세포 상청액, 및/또는 세포 배양 배지로부터, 예를 들어 세포 용해물 및/또는 세포 상청액의 다양한 크로마토그래피를 포함하여 당해 분야에 알려진 다양한 적합한 기술로 분리할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 먼저 원심분리기(Amicon)를 이용하여 배양 배지를 농축하거나, 대안적으로 황산암모늄 또는 폴리에틸렌 글리콜로 폴리펩티드를 침전시킨 다음 PBS 또는 다른 적합한 완충제 내에서 폴리펩티드를 재현탁함으로써 세포 용해물 및/또는 세포 배양 배지로부터 분리할 수 있다. 그 다음 폴리펩티드는 예를 들어 Hjorth, R. 및 J. Moreno-Lopez, J. Virol. Methods 5:151-158 (1982)에 기술된 바와 같은 세파크릴 S-400 컬럼(Amersham Biosciences) 상에서의 크기-배제 크로마토그래피 또는 다른 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 또는 예를 들어, Konish 등, Virology 188:714-720 (1992)에 기술된 바와 같은 20-60% 수크로오스 경사를 통한 원심분리법으로 정제할 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 포함하는 부분은 ELISA 또는 SDS-PAGE에 의한 다음 단백질 은 염색(protein silver stain) 및 면역블로팅에 의하여 확인할 수 있다. 원하는 부분은 모여있고 추가로 농축되어 있다. 경사 원심분리 부분 내의 수크로오스는 PD-10 컬럼(Amersham Biosciences) 겔 여과를 이용하여 제거할 수 있다. 추가적인 정제 기술은 하기 실시예에 기술된 것들 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(Diogo, M. M, 등, J. Gene Med. 3:577-584 (2001)), 및 당해 분야에 알려진 임의의 다른 적절한 기술을 포함한다.
또한 당해 분야에 알려진 임의의 적합한 정제 기술을 사용할 수 있다. 당해 분야에 알려진 폴리펩티드 정제 방법은 예를 들어 Sandana (1997) BIOSEPARATION OF PROTEINS, Academic Press, Inc., Bollag 등 (1996) PROTEIN METHODS, 제2판 Wiley-Liss, NY, Walker (1996) THE PROTEIN PROTOCOLS HANDBOOK Humana Press, NJ, Harris 및 Angal (1990) PROTEIN PURIFICATION APPLICATIONS: A PRACTICAL APPROACH IRL Press at Oxford, Oxford, England, Scopes (1993) PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE 제3판 Springer Verlag, NY, Janson 및 Ryden (1998) PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES, HIGH RESOLUTION METHODS AND APPLICATIONS, 제2판 Wiley-VCH, NY; 및 Walker (1998) PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM Humana Press, NJ에 제시된 것들을 포함한다. 폴리펩티드 생산에 적합한 세포는 당해 분야에 알려져 있으며 본 명세서의 다른 부분에서 검토된다(예를 들어, 베로(Vero) 세포, 293 세포, BHK, CHO(예, CHO-K1), 및 COS 세포들이 적합할 수 있다). 세포는 예컨대, 초음파처리, 미세유동법(microfluidization), 물리적 전단력(physical shear), 프렌치 프레스 용해(French press lysis), 또는 세제-기반 용해(detergent-based lysis)를 포함하여 임의의 적합한 기술로 용해할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공하며, 이는 적합한 숙주 세포를 숙주 세포(예, CHO 세포 또는 293 세포)에서 본 발명의 핵산(예, 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합형 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합형 핵산)으로 형질전환하고, 적합한 용해 기술(예, 초음파처리, 세제 용해, 또는 다른 적절한 기술)로 세포를 용해하며 용해물을 본 발명의 적어도 하나의 신규한 항체(보통 본 발명의 모노클론성 항체) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 수지를 포함하는 크로마토그래피 컬럼으로 친화성 정제하는 것을 포함하며, 상기 용해물은 원하는 폴리펩티드(예, 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드)에 대하여 농축된다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 표적 폴리펩티드를 정제하는 방법-상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드(예, 서열번호 1) 및 적합한 태그(예, e-에피토프/his 태그)를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이라는 점에서 상기한 방법과 다름- 및 면역친화성, 렌틸-렉틴 친화성 컬럼 크로마토그래피(lentil-lectin affinity column chromatography), 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC), 또는 금속-킬레이트 친화성 크로마토그래피(metal-chelating affinity chromatography, MCAC) 농축 기술로 상기 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 추가적인 정제 방법이 본 명세서의 다른 부분에 개시되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법-본 발명의 핵산을 포함하는 재조합형 발현 벡터를 세포 집단 내로 도입하는 것을 포함함-, 벡터로부터 핵산의 발현 및 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 생산에 적절하게 충분한 조건 하에서 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법, 및 세포, 배양 배지, 또는 둘 다로부터 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다. 선택된 세포는 폴리펩티드의 원하는 가공에 기초하며 적절한 벡터(예를 들어, E. coli 세포는 박테리아 플라스미드에 대하여 바람직한 반면, 293 세포는 포유류 셔틀 플라스미드(shuttle plasmid) 및/또는 아데노바이러스, 특히 E1-결핍 아데노바이러스에 대하여 바람직하다)에 기초한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 폴리펩티드를 제조하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 재조합형 발현 벡터를 세포의 집단 내로 도입하는 단계; (b) 발현 벡터를 포유류 내로 투여하는 단계; 및 (c) 포유류로부터 또는 포유류의 부산물로부터 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계.
또한 본 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 발현에 충분한 조건 하에서 본 발명의 세포 또는 세포의 집단(예를 들어, 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 핵산으로 형질전환됨)을 배양하고 당해 분야에 알려진 표준 기술을 이용하여 세포 내에서 또는 세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 회수함으로써 생산할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 본 발명의 핵산을 세포의 집단 내로 도입하는 단계, 여기에서 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 효과적으로 생산하도록 핵산은 조절 서열에 기능적으로 연결되어 있음; (b) 배양 배지에서 세포를 배양하여 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및 (c) 세포 또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계. 또한 본 발명의 벡터(예, 본 발명의 발현 벡터)가 도입된 배양된 세포를 포함한다.
또한 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 배지 내에서 핵산의 발현을 허용하는 세포의 집단 내로 도입하는 단계, 핵산이 발현되는 조건 하에서 세포를 유지하는 단계, 및 그 후에 배지로부터 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 만드는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음을 포함한다: (1) 배양 배지에서 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 여기에서 상기 핵산은 다음을 포함한다: (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95% 동일성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 상기 폴리펩티드는 CD86 및/또는 CD80, 및/또는 CD86 또는 CD80의 세포외 도메인에 결합함, 및 (ii) 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 Ig Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열, 그것에 의하여 핵산은 발현되고 융합 단백질이 제조됨; 및 (2) 융합 단백질을 회수하는 단계. 임의의 Ig Fc 폴리펩티드가 예를 들어, IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG4 Fc, 또는 변이체 Ig Fc 폴리펩티드를 포함하여 임의로 채용될 수 있다. 일부 그러한 방법에서, 핵산은 융합 단백질에 작동적으로 연결된 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 융합 단백질은 동일한 제1 및 제2 융합 단백질을 포함하는 이황화-결합된 융합 단백질 다이머로서 숙주 세포로부터 분비되며, 상기 이황화-결합된 융합 단백질 다이머는 배양 배지로부터 회수된다. 일부 그러한 방법에서, 이황화-결합된 융합 단백질 다이머는 제1 융합 단백질의 시스테인 잔기와 제2 융합 단백질의 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합을 통해 형성된다. 일부 그러한 방법에서, 상기 융합 단백질은 배양 배지, 숙주 세포, 또는 숙주 세포 주변 세포질(periplasm)로부터 회수된다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 핵산 분자를 제공한다: (i) 서열번호 1-73으로 구성되는 그룹에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 여기에서 제1 폴리펩티드는 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합함, 및 (ii) IgG 폴리펩티드의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드. 제2 폴리펩티드는 서열번호 184 또는 서열번호 218의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 포함하여 본 명세서의 다른 부분에 검토된 임의의 적합한 Ig 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 가용성 융합 단백질 다이머를 만드는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 가용성 융합 단백질 다이머를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222의 임의의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 상기 벡터는 융합 단백질의 발현을 용이하게 하는 뉴클레오티드 서열(예, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열)을 포함한다. 융합 단백질은 두 개의 동일한 융합 단백질을 포함하는 이황화-결합된 융합 단백질로서 숙주 세포로부터 분비되고, 이황화-결합된 융합 단백질 다이머는 배양 배지로부터 회수된다. 일부 그러한 방법에서, 이황화-결합된 융합 단백질 다이머는 각 융합 단백질 상의 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합을 통해 형성된다. 융합 단백질 다이머는 일반적으로 배양 배지, 숙주 세포, 또는 숙주 세포 주변 세포질(periplasm)로부터 회수된다. 실시예 12는 본 발명의 변이체 CTLA4-Ig 융합 단백질을 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포주를 만들고, 변이체 CTLA4-Ig 융합 단백질을 생산하며, 배양으로부터 변이체 융합 단백질을 정제하는 예시적인 절차를 제공한다.
재조합 생산에 더하여, 본 발명의 폴리펩티드는 고체-상태 기술(solid-phase technique)(예를 들어, Stewart 등 (1969) SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, W.H. Freeman Co, San Francisco 및 Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154을 참조)을 사용하여 직접적인 펩티드 합성으로 생산할 수 있다. 펩티드 합성은 수동 기술을 사용하여 또는 자동화에 의하여 실행될 수 있다. 자동화된 합성은 예를 들어, 제조자에 의해 제공된 지시에 따라 Applied Biosystems사의 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 부분서열(subsequence)은 화학적 방법을 사용하여 개별적으로 및 결합하여 화학적으로 합성하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 생산할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드의 생산을 전문으로 하는 다수의 회사 중에서 합성된 폴리펩티드를 주문할 수 있다. 가장 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 상기한 바와 같이, 코딩 핵산을 발현하고 폴리펩티드를 회수함으로써 생산한다.
본 발명은 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터, 또는 이의 조합을 포유류(예로써 래트, 비인간 영장류, 박쥐, 마모셋원숭이, 돼지, 또는 닭을 포함)와 같은 동물 내로 도입하여, 본 발명의 폴리펩티드를 동물 내에서 발현시키고, 상기 폴리펩티드를 동물 또는 동물의 부산물로부터 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 포함한다. 동물 또는 동물 부산물로부터의 상기 폴리펩티트의 분리는 임의의 적합한 기술로 할 수 있으며, 이는 동물 및 원하는 회수 계획에 따라 다르다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 마우스, 원숭이, 또는 돼지의 혈청으로부터 회수할 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 유전자이식성 동물(전술한 포유류를 포함)이 본 발명에 의해 제공된다. 유전자이식성 동물은 그것의 숙주 게놈 내로 통합된 (예를 들어, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, 통합-촉진 서열(integration-promoting sequence)로 실행된 바이오리스틱 기술 등에 의함) 핵산을 가질 수 있거나 또는 에피크로모좀으로(epichromosomally) 유지된(예를 들어, 비통합 플라스미드 벡터에서 또는 비통합 바이러스 벡터에서의 삽입에 의해) 핵산을 가질 수 있다. 벡터를 통합하는 것보다 더 일시적인 유전자 발현을 위하여 에피크로모좀 벡터를 조작할 수 있다. RNA-기반 벡터는 이러한 점에서 특정 이점을 제공한다.
조성물
본 발명은, 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드(예컨대 융합 단백질 및 멀티머성 폴리펩티드를 포함), 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP), 및/또는 세포와 같은 본 발명의 적어도 하나의 성분, 또는 이의 임의의 조합 및 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 신규하고 유용한 조성물을 추가로 제공한다. 담체, 부형제 또는 희석제는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제일 수 있다. 그러한 조성물은 임의의 적합한 수의 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 및/또는 세포를 임의의 적합한 양으로 포함할 수 있다. 또한 적어도 하나의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 및/또는 세포, 또는 이의 임의의 조합, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 그러한 조성물은, 예를 들어 면역 반응을 억제하는 방법을 포함하여, 본 명세서에 기술된 본 발명의 방법에 유용하다.
예를 들어, 하나의 비제한적인 구체예에서, 본 발명은 부형제, 희석제, 또는 담체 및, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, 서열번호 1-73 중 임의의 것) 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222 중 임의의 것)과 같은 적어도 하나의 본 발명의 상기 폴리펩티드(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 폴리펩티드)를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 적어도 하나의 폴리펩티드는, 조성물이 투여되는 대상체에서 예를 들어, 이식 거부 및/또는 자가면역에 수반되는 면역 반응(들)을 포함한 면역 반응을 억제, 기증받은 조직, 세포, 또는 장기 이식의 거부를 저해, 또는 내인성 B7-양성 세포와 CD28-양성 T 세포와의 상호작용을 저해하는데 효과적인 양으로 조성물에 존재한다.
또한 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체 및 하나 이상의 본 발명의 상기 성분의 유효한 양을 포함하는 약학적 조성물이 포함된다. 유효한 양은, 자가면역 질환을 치료하는 방법 또는 수용자 대상체에 의한 공여자의 조직, 세포, 이식편, 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법과 같은 본 명세서의 다른 부분에 기술된 치료적 또는 예방적 방법에서의 이용을 위하여 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양 또는 용량일 수 있다.
조성물(또는 약학적 조성물)은 여기에 포함된 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 또는 세포의 면역억제 성질을 방해하지 않는 임의의 비독성 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 하나 이상의 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함한다. 광범위의 다양한 허용가능한 담체, 희석제, 및 부형제는 당해 분야에 알려져 있고 본 발명의 조성물 및 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다양한 수성 담체를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 증류수 또는 정제수, 멸균 생리식염수(sterile saline), 인산염-완충 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)와 같은 완충 생리식염수(buffered saline) 등이 본 발명의 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 및/또는 세포의 주사가능한 제형에 유리하다. 치료적 단백질의 투여를 위한 다수의 적합한 부형제, 담체, 및 희석제가 당해 분야에 알려져 있다. 그러한 용액은 바람직하게 멸균 상태이고 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없다. 조성물은 종래의, 잘 알려진 멸균 기술로 멸균할 수 있다. 본 발명의 조성물은 필요에 따라, 약학적으로 허용가능한 보조 물질을 포함하여 생리학 조건에 접근시킬 수 있다. 그러한 물질은 예를 들어, pH 조절제, 완충제 및 장력 조절제(tonicity adjusting agent)를 포함하며, 이들은 예컨대, 아세트산나트륨, 아스코르브산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 포함한다. 약학적 조성물을 포함한 본 발명의 조성물은 또한 희석제, 충전제(filler), 염, 완충제(buffer), 계면활성제, 유화제, 세제(detergent)(예컨대, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 플루로닉 F-68 등과 같은 비이온성 세제 또는 유화제), 안정화제(예컨대, 당(sugar) 또는 무단백질 아미노산(protein-free amino acid)), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 다른 물질과 같은 약학적 조성물에서 포함되기에 적합한 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
약학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 성분의 예는 예를 들어, Berge 등, J. Pharm. Sci. 66(1):1-19 (1977), Wang 및 Hanson, J. Parenteral. Sci. Tech. 42:S4-S6 (1988), 미국특허번호 제6,165,779호 및 제6,225,289호, 및 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다. 또한 약학적 조성물은 보존제(예, 벤질 알코올, 아지드화나트륨, m-크레졸 등), 항산화제, 금속킬레이트제(예, 메티오닌, EDTA 등), 및/또는 당해 분야의 숙련된 자들에게 알려진 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물에서의 사용에 적당한 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 예를 들어, Urquhart 등, Lancet 16:367 (1980), Lieberman 등, PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS - DISPERSE SYSTEMS (제2판, Vol. 3, 1998), Ansel 등, PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS (제7판. 2000), Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA (제31판), Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES (제16-20판), THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman 및 Gilman, Eds. (제9판. - 1996), WILSON AND GISVOLDS TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado 및 Remers, Eds. (제10판. - 1998), 및 미국특허번호 제5,708,025호 및 제5,994,106호에 기술되어 있다. 약학적으로 허용가능한 조성물을 제형화하는 원리는 예를 들어, Platt, Clin . Lab Med . 7:289-99 (1987), Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone (New York) (1988), EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS , CSHP (1998), 및 "Drug Dosage," J. Kans. Med. Soc. 70(1):30-32 (1969)에 기술되어 있다. 벡터의 투여에 특히 적합한 추가적인 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, 국제특허출원공개번호 제 WO 98/32859호에 기술되어 있다.
약학적 조성물을 포함하여, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 수성 담체 또는 부형제(예를 들어 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함) 및 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 염, 하나 이상의 세제 또는 유화제, 및/또는 하나 이상의 당과 같은 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 완충 시스템은 일반적으로 조성물에 존재하는 본 발명의 분자(예, 변이체 CTLA-4-Ig)의 안정성에 도움이 되는 범위 내에서 조성물의 pH를 유지하는데 적합한 것이다. 조성물에서의 사용을 위한 예시적인 완충제는 예를 들어, N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-아미노에탄 술폰산(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-aminoethane sulfonic acid, HEPES) 완충제, 시트르산염(citrate) 완충제(예, 시트르산이나트륨(disodium citrate)-시트르산삼나트륨(trisodium citrate) 혼합물, 시트르산나트륨-시트르산 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산일나트륨(monosodium citrate)-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물), 인산나트륨 완충제(예, 인산이나트륨(disodium phosphate)-인산삼나트륨(trisodium phosphate) 혼합물(Na2HPO4/Na3PO4), 제2인산나트륨(sodium dibasic phosphate)-제1인산나트륨(sodium monobasic phosphate) 혼합물), 아세트산염 완충제(예, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물), 히스티딘 완충제, 트리스(Tris) 완충제, 트리스-말레산염(maleate) 완충제, 숙신산염(succinate) 완충제(예, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산일나트륨(monosodium succinate) 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물, 숙신산일나트륨-숙신산이나트륨 혼합물), 말레산염 완충제, 이미다졸 완충제, 타르타르산염(tartrate) 완충제, 푸마르산염 완충제, 글루콘산염 완충제, 옥살산염(oxalate) 완충제, 락트산염(lactate) 완충제, 아세트산염 완충제 등, 또는 이의 임의의 조합(예, 시트르산염 완충제 및 아세트산염 완충제의 칵테일 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 조성물에서 완충제의 농도는, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 약 1mM 내지 약 100mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 50mM, 또는 약 5mM 내지 약 25mM의 범위, 예컨대 1mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 40mM, 50mM(예를 들어, 20mM HEPES 완충제, 20mM 시트르산이나트륨-시트르산삼나트륨 완충제, 20mM 숙신산염 완충제 등)을 포함하여, 조성물 용액에 포함된 본 발명의 분자(들)(예, 변이체 CTLA-4-Ig)에 적절한 임의의 농도일 수 있다.
조성물에서의 사용을 위한 예시적인 염은 예를 들어, 염화나트륨, 염화마그네슘, 중탄산나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 염화암모늄 등과 같은 유기염 또는 무기염을 포함한 수용성 염(예, 수용성 무기염), 또는 임의의 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 양립가능한 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 조성물 용액에서 염의 예시적인 농도는 예를 들어, 약 1mM 내지 약 150mM, 약 10mM 내지 약 125mM, 또는 약 75mM 내지 약 125mM을 포함하고, 예컨대 10mM, 50mM, 75mM, 100mM, 125mM, 150mM(예를 들어, 100mM NaCl)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
조성물에서의 사용을 위한 예시적인 당 또는 탄수화물은, 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 당을 조성물에 대하여 중량으로 약 0.1% 내지 약 10%, 당을 중량으로 약 1% 내지 약 5%, 또는 당을 중량으로 약 1% 내지 약 3%을 포함하며, 예컨대 당을 조성물에 대하여 중량으로 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%(예, 수크로오스를 중량으로 2%, 트레할로오스를 중량으로 2%, 만노오스를 중량으로 2%)를 포함하는 농도 범위에서, 예를 들어, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 덱스트로오스, 만노오스, 라피노오스, 락토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 사카로오스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 조성물에서의 사용을 위한 예시적인 당알코올은, 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 당알코올을 조성물에 대하여 중량으로 약 0.1% 내지 약 10%, 약 1-5%, 약 1-3%를 포함하며, 예컨대 당알코올을 조성물에 대하여 중량으로 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 포함하는 농도 범위에서, 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 글리콜, 글리세롤, 아라비톨, 에리스리톨, 자이리톨, 리비톨, 락티톨 등을 포함한다.
약학적 조성물을 포함하여, 본 발명의 조성물의 삼투질농도(osmolality)는 일반적으로 혈액의 혈청 삼투질농도와 유사하고, 이는 물의 킬로그램당 약 250 내지 약 350 밀리오스몰(mOSm/kg)의 범위이다. 조성물에서 염의 농도는 일반적으로 125mM 미만이다. 염 및 당 농도는 조정되고 바뀔 수 있어 조성물의 삼투질농도는 물에 대하여 약 250-350mOSm/kg이다.
조성물에서의 사용을 위한 예시적인 세제 또는 유화제는, 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 조성물에 대하여 세제 또는 유화제의 중량으로 약 0.001% 내지 약 0.2%를 포함하며, 예컨대 조성물에 대하여 세제 또는 유화제(예, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68)의 중량으로 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.075%, 및 0.1%를 포함하는 범위에서, 예를 들어, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68과 같은 폴리소르베이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
약학적 조성물을 포함하여, 본 발명의 조성물은, 예컨대 본 발명의 둘 이상의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머와 같은, 본 발명의 둘 이상의 분자 사이의 바람직하지 않은 회합을 감소시키거나 저해하는데 충분한 농도에서, PEG 분자와 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 조성물은 둘 이상의 상이한 폴리머(예, PEGs)를 포함할 수 있다. 폴리머(예, PEG 분자)는 일반적으로 약 200Da 내지 약 8000Da(예, 약 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500, 또는 8000Da, Dow Chemical로부터 입수가능함)의 분자량을 가진다. 조성물에 폴리머(예, PEG 분자)의 첨가는 바람직하지 않은 응집체, 특히 본 발명의 둘 이상의 융합 단백질 다이머의 바람직하지 않은 응집체의 형성을 감소시킨다고 여겨진다.
약학적 조성물을 포함하여, 본 발명의 조성물은 사이클로덱스트린(예, Captisol® (Cydex))과 같은 사이클릭 올리고당(cyclic oligosaccharide)을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 조성물은 둘 이상의 상이한 사이클릭 올리고당을 포함한다. 조성물에의 사이클릭 올리고당(들)의 첨가는 활성 약학적 요소(들)(예, 변이체 CTLA-4 분자)의 용해성, 안정성, 생물학적 이용가능성(bioavailability), 및/또는 투약을 개선시킨다.
약학적 조성물을 포함하여, 본 발명의 조성물의 pH는 약 pH 3 내지 약 pH 10, 약 pH 4 내지 약 pH 10, 약 pH 5 내지 약 pH 9, 약 pH 6 내지 약 pH 9, 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.2 내지 약 pH 8.7, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.3 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.8, 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0, 및 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.4의 범위일 수 있다. 하나의 양태에서, 예컨대 변이체 CTLA-4-IgG2와 같은 본 발명의 분자를 포함하는 조성물은 pH 5.0, pH 5.1, pH 5.2, pH 5.3, pH 5.4, pH 5.5, pH 5.6, pH 5.7, pH 5.8, pH 5.9, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0, pH 9.1, pH 9.2, pH 9.3, pH 9.4, pH 9.5, pH 9.6, pH 9.7, pH 9.8, pH, 9.9, 또는 pH 10.0의 pH를 가진다.
하나의 양태에서, 본 발명은 부형제 또는 담체(예컨대, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함) 및 유효한 양의 본 명세서에 걸쳐서 및 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 CTLA-4 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머를 포함하는 본 발명의 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 pH 3 내지 약 pH 10의 범위 이내에서 조성물의 pH를 유지시킬 수 있는 완충제, 물, 선택적으로 비이온성 세제, 선택적으로 염, 및 선택적으로 당알코올, 단당류, 이당류, 또는 다당류를 추가로 포함한다. 일부 그러한 조성물은 생리학적 pH에 있다. 일부 이러한 조성물은 약 4 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7.5, 또는 약 6.4 내지 약 6.6의 pH를 가지며, 예컨대 약 pH 6.5, 약 pH 7.4, 또는 pH 7.5를 포함한다. 일부 이러한 조성물은 약 1mM 내지 약 100mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 35mM, 약 10mM 내지 약 25mM의 농도로 완충제를 포함하며, 예컨대 약 20mM, 25mM, 또는 30mM을 포함한다. 일부 그러한 조성물은 HEPES 완충제, 시트르산염 완충제, 숙신산염 완충제, 아세트산염 완충제, 시트르산염 완충제, 말레산염 완충제, 인산염 완충제, 및 트리스 완충제로 구성되는 그룹에서 선택된 완충제를 포함한다. 일부 그러한 조성물은 HEPES 완충제, 시트르산나트륨 완충제, 및 숙신산나트륨 완충제로 구성되는 그룹에서 선택된다. 일부 그러한 조성물에 대하여, pH는 약 6.0 내지 약 6.7이고 완충제는 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨이다. 일부 그러한 조성물에 대하여, pH는 약 7.0 내지 약 7.7이고 완충제는 HEPES이다. 일부 이러한 조성물은 당알코올 또는 당류(saccharide)를 추가로 포함하며, 여기에서 당류는 단당류, 이당류(예, 수크로오스 또는 트레할로오스), 또는 다당류이다. 일부 그러한 조성물은, 약 1mM 내지 약 50mM, 예컨대 약 20mM, 25mM, 또는 30mM을 포함하는 농도에 존재하는 염을 포함한다. 일부 그러한 조성물은 예컨대 Tween®-80, Tween®-60, Tween®-40, Tween®-20, 또는 플루로닉 F-68로 구성되는 그룹에서 선택된 비이온성 세제와 같은 비이온성 세제를 포함한다.
위의 단락에서 기술된 일부 그러한 조성물(약학적 조성물을 포함)에서, 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머는 약 1mg/ml(중량/부피 또는 w/v) 내지 약 200mg/ml(w/v), 약 25mg/ml(w/v) 내지 약 100mg/ml(w/v), 약 50mg/ml 내지 약 300mg/ml의 범위에서, 선택적으로 약 50mg/ml(w/v) 내지 약 100mg/ml(w/v)의 범위에서의 농도에서 존재한다. 일부 그러한 조성물은 약 0.1mg/kg 내지 약 15mg/kg의 유효한 양의 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머를 포함하고, 상기 조성물은 포유류(예, 인간)에게 투여된다. 일부 그러한 조성물은 약 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg의 유효한 양의 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머를 포함하고, 상기 조성물은 비경구적으로 투여된다. 일부 그러한 조성물은 약 0.1mg/kg 내지 약 5mg/kg, 선택적으로 약 0.5mg/kg의 유효한 양의 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머를 포함하고, 상기 조성물은 피하로 투여된다. 일부 이러한 조성물은 약 5mg/kg 내지 약 15mg/kg(선택적으로 약 10mg/kg)의 유효한 양의 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머를 포함하고, 상기 조성물은 정맥 내로 투여된다. 일부 그러한 조성물에 대하여, 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머는 서열번호 36의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 그러한 조성물에 대하여, 폴리펩티드, 멀티머, 다이머, 접합체, 융합 단백질, 또는 융합 단백질 다이머는 서열번호 50의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 그러한 조성물은 멸균 상태이고 및/또는 혈액에 대하여 등장(isotonic)이다. 일부 그러한 조성물은 액체 조성물이다. 일부 그러한 조성물은 액체 또는 건조된 형태이며, 여기에서 건조된 형태는 동결건조된 형태, 공기-건조된 형태, 및 분무-건조된 형태로 구성되는 그룹에서 선택된다.
예시적인 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: (i) 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml(예컨대, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 또는 약 100mg/ml 등)의 농도를 가지는 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질(선택적으로 다이머성 융합 단백질); (ii) 약 5mM 내지 약 50mM의 농도에서 약 pH 5.0 과 약 pH 9.0 사이의 완충 능력을 가지는 완충제; (iii) 조성물을 지정된 부피로 만드는 약학적으로 허용가능한 희석제; (iv) 조성물에 대하여 당이 중량으로 약 0.5% 내지 약 10%인 농도에서의 당; (v) 약 1mM 내지 약 200mM의 농도에서의 염; (vi) 선택적으로, 약 0.01mg/ml 내지 약 0.5mg/ml의, 예컨대 약 0.01mg/ml 내지 약 0.1mg/ml의 농도에서의 비이온성 세제(예, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68); 및 (vii) 선택적으로 사이클릭 올리고당(예, 사이클로덱스트린(Captisol®)), 여기에서 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 범위이다. 본 발명의 예시적인 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222로 구성되는 그룹에서 선택된(선택적으로, 예컨대 서열번호 197, 199, 211, 및 213으로 구성되는 그룹에서 선택됨) 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 포함하며, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이의 세포외 도메인에 결합하고 및/또는 면역 반응을 억제한다. 그러한 융합 단백질은 모노머성 또는 다이머성 형태일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: (i) 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질(선택적으로 다이머성 융합 단백질) 및 상기 융합 단백질에 공유적으로 부착된 비폴리펩티드 성분(moiety)을 포함하는 접합체, 상기 접합체는 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml(예컨대, 약 1 mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 또는 약 100mg/ml 등)의 농도를 가짐; (ii) 약 5mM 내지 약 50mM의 농도에서 약 pH 5.0 과 약 pH 8.0 사이의 완충 능력을 가지는 완충제; (iii) 조성물을 지정된 부피로 만드는 약학적으로 허용가능한 희석제; (iv) 조성물에 대하여 당을 중량으로 약 0.5% 내지 약 10%인 농도에서의 당; (v) 약 1mM 내지 약 200mM의 농도에서의 염; 및 (vi) 선택적으로, 약 0.01mg/ml 내지 약 0.5mg/ml의, 예컨대 약 0.01mg/ml 내지 약 0.1mg/ml의 농도에서의 비이온성 세제(예, Tween®2-0, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68), 여기에서 조성물의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 범위이다. 상기 접합체는 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 이상의 비폴리펩티드 성분을 포함할 수 있다. 각 비폴리펩티드 성분은 폴리머(예, PEG 또는 PAO) 또는 당 성분을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 비폴리펩티드 성분은 PEG 분자와 같은 폴리머 분자이다. 폴리머 분자는 원하는 기능적 효과(예, 증가된 반감기, 융합 단백질 분자 간의 감소된 회합 등)에 따라서 임의의 원하는 분자량을 가질 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어, 폴리머는 약 1kDa 내지 약 100kDa(예, 1, 2, 2.5, 3, 5, 8, 10, 12, 20, 25, 30, 40, 60kDa 등)의 분자량을 가지는 PEG이다. 비폴리펩티드 성분(예, 당 성분 또는 폴리머 분자)은 상기한 바와 같은 표준 절차를 이용하여 융합 단백질의 아미노산 잔기의 부착기(attachment group)에 공유적으로 부착된다. 예시적인 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222 로 구성되는 그룹에서 선택된(선택적으로, 예컨대 서열번호 197, 199, 211, 및 213으로 구성되는 그룹에서 선택됨) 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 포함하며, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이의 세포외 도메인에 결합하고 및/또는 면역 반응을 억제한다. 상기 융합 단백질은 모노머성 또는 다이머성 형태일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: (a) 예컨대, 서열번호 36 및 50과 같은, 서열번호 1-73의 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 약 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 상기 폴리펩티드는 약 1 내지 약 200mg/ml(w/v)의 농도 범위에 존재함; (b) 약 5mM 내지 약 50mM의 농도 범위에서 약 pH 5.0 과 약 pH 8.0 사이의 완충 능력을 가지는 완충제; (c) 조성물을 지정된 부피로 만드는 약학적으로 허용가능한 희석제; (d) 중량으로 0.5% 내지 10%의 농도에서의 당; (e) 약 1mM 내지 약 200mM의 농도에서의 염; 및 (f) 선택적으로, 세제, 여기에서 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 범위이다. 일부 그러한 약학적 조성물에서, (a) 폴리펩티드는 약 50mg/ml 내지 약 100mg/ml의 농도 범위에서 존재하는 서열번호 36의 폴리펩티드 서열을 포함하고; (b) 완충제는 약 20mM의 농도에서 존재하는 HEPES 완충제이며; (c) 약학적으로 허용가능한 희석제는 물이고; (d) 당은 중량으로 2%의 농도에서 수크로오스 또는 트레할로오스이며; (e) 염은 약 100mM의 농도에서 염화나트륨이고; 및 (f) 선택적으로 세제는 약 0.1mg/ml 이하의 농도에서 Tween®-80, Tween®-60, Tween®-40, Tween®-20, 또는 플루로닉 F-68로 구성되는 그룹에서 선택되며, 여기에서 조성물의 pH는 약 pH 7.4이다. 다른 그러한 조성물에서, (a) 폴리펩티드는 약 50mg/ml 내지 약 100mg/ml의 농도 범위에서 존재하는 서열번호 50의 폴리펩티드 서열을 포함하고; (b) 완충제는 약 20mM의 농도에서 존재하는 시트르산나트륨 완충제이며; (c) 약학적으로 허용가능한 희석제는 물이고; (d) 당은 중량으로 2%의 농도에서 수크로오스 또는 트레할로오스이며; (e) 염은 약 100mM의 농도에서 염화나트륨이고; 및 (f) 선택적으로 세제는 약 0.1mg/ml 이하의 농도에서 Tween®-80, Tween®-60, Tween®-40, Tween®-20, 또는 플루로닉 F-68로 구성되는 군에서 선택되며, 여기에서 조성물의 pH는 약 pH 6.5이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: (a) 서열번호 36의 아미노산에 대하여 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) HEPES 또는 시트르산나트륨 완충제(예, 시트르산이나트륨-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산나트륨-시트르산 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 또는 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물).
또한 다음을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다: (a) 서열번호 36 의 아미노산에 대하여 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 여기에서 상기 조성물은 약 7 내지 약 8의 pH를 가진다. 일부 그러한 약학적 조성물은 약 7.4 또는 7.5의 pH를 가진다. 일부 그러한 약학적 조성물은 HEPES 또는 시트르산나트륨 완충제를 포함한다.
또한 다음을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다: (a) 서열번호 50의 아미노산 서열에 대하여 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 시트르산나트륨 완충제(예, 시트르산이나트륨-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산나트륨-시트르산 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 또는 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물).
또한 다음을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다: (a) 서열번호 50의 아미노산 서열에 대하여 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 여기에서 상기 조성물은 약 6 내지 약 7의 pH를 가진다. 일부 이러한 약학적 조성물은 약 6.5의 pH를 가진다. 일부 그러한 약학적 조성물은 시트르산나트륨 완충제를 포함한다.
하나의 예시적인 양태에서, 본 발명은 물 중 20mM HEPES 완충제, 100mM NaCl, 조성물에 대하여 중량으로 2%의 수크로오스, pH 7.4에서 일반적으로 다이머성 융합 단백질로서 발현되는 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, D3-54-IgG2)의 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml(예, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 예컨대 약 50mg/ml 또는 약 100mg/ml)를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 이는 선택적으로 약 0.01mg/ml 내지 약 0.5mg/ml, 예컨대 약 0.01mg/ml 내지 약 0.1mg/ml의 농도로 비이온성 세제(예, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68)를 포함하고, 선택적으로 약 200달톤(Da) 내지 약 8000Da의 분자량(예컨대, 약 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500, 또는 8000 Da, Dow Chemical로부터 입수가능함)을 가지는 PEG 분자와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 다른 예시적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예, D3-69-IgG2)의 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 이는 물 중 20mM 시트르산나트륨 완충제, 100mM NaCl, 조성물에 대하여 중량으로 2%의 수크로오스, pH 6.5에서 일반적으로 다이머성 융합 단백질로서 발현되고, 이는 선택적으로 약 0.01mg/ml 내지 약 0.5mg/ml, 예컨대 약 0.01mg/ml 내지 약 0.1mg/ml의 농도로 비이온성 세제(예, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68)를 포함하고, 선택적으로 약 200Da 내지 약 8000Da의 분자량(예컨대, 약 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500, 또는 8000Da, Dow Chemical로부터 입수가능함)을 가지는 PEG 분자와 같은 PEG 분자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 분자(예, 변이체 CTLA-4-Ig와 같은, 변이체 CTLA-4 분자) 및 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함하는 본 발명의 조성물을 포함하는 리셉터클(receptacle)을 포함한다. 상기 조성물은 본 발명의 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 리셉터클은, 예를 들어, 바이알(예, 유형 I 유리 바이알과 같은, 유리 바이알), 자기주사기(autoinjector), 펜주사기(pen injector)(고정 용량 또는 가변 용량), 및 프리필드 시린지(pre-filled syringe), 또는 다른 적합한 용기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 원한다면, 리셉터클은 본 명세서의 다른 부분에 기술된 바와 같이 면역 반응을 억제하거나 면역계 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 본 발명의 분자의 하나 이상의 소정의 용량을 포함할 수 있다. 일부 이러한 리셉터클은 면역 질환 또는 장애로 고통받는 대상체에게 여기에 포함된 조성물을 투여하는데 유용하다(예, 자기주사기, 펜주사기, 프리필드 시린지 등). 일부 그러한 리셉터클은 대상체에 의한 조성물의 자가투여를 가능하게 한다(예, 펜주사기, 자기주사기, 프리필드 시린지 등).
또한 본 발명의 분자(예, 변이체 CTLA-4 ECD 또는 변이체 CTLA-4-Ig)의 안정한 조성물 또는 제형이 제공되며, 이는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 분자의 약학적으로 허용가능한 조성물을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된(freeze-dried) 또는 동결건조된(lyophilized) 조성물 또는 제형을 포함한다. 용어 “동결-건조된(freeze-dried)” 또는 “동결건조된(lyophilized)”은 일반적으로 동결건조(freeze-drying 또는 lyophilization)와 같은 건조 절차로 처리한 물질의 상태를 지칭하며, 여기에서 적어도 50%의 수분이 제거된다. 전-동결건조(pre-lyophilization) 및 동결건조(lyophilization) 절차는 당해 분야에 잘 알려져 있고(예를 들어, LYOPHILIZATION OF BIOPHARMACEUTICALS, Vol. 2 of BIOTECHNOLOGY: PHARMACEUTICAL ASPECTS (Henry R. Costantino 등 eds., 2004), 미국특허 제6,436,897호, 국제출원공개 제WO 06/104852호 참조), 이는 숙련된 기술자에 의해 용이하게 이해될 것이다. 임의의 적합한 동결건조 절차가 본 발명의 동결건조된 조성물을 제조하는데 당해 분야에서 숙련된 자에 의해 적절한 대로 사용되거나 변형될 수 있다. 동결-건조(freeze-dried), 공기-건조, 분무-건조, 또는 동결건조(lyophilized)된 조성물은 보통 용액, 현탁액, 에멀션 등과 같은 액체로 제조된다. 동결-건조, 공기-건조, 분무-건조, 또는 동결건조된 액체는 일반적으로 최종적인 재구성된 액체 조성물로 되는 모든 성분(예컨대 물과 같은 액체를 제외함)을 포함한다. 이러한 방법으로, 동결-건조, 공기-건조, 분무-건조, 또는 동결건조된 조성물은 재구성될 때 원하는 액체 조성물(예, 약학적 조성물)을 가질 것이다. 본 출원을 통해 기술되어 있는 본 발명의 분자(예컨대, 서열번호 197, 199, 211, 또는 213과 같은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)를 포함하는, 약학적 조성물을 포함한 본 발명의 예시적인 조성물은 당해 분야에 알려진 표준 절차를 이용함으로써 동결-건조, 공기-건조, 분무-건조, 또는 동결건조되어 각각 안정한 동결-건조, 공기-건조, 분무-건조, 또는 동결건조된 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기한 LYOPHILIZATION OF BIOPHARMACEUTICALS에 기술된 예시적인 절차를 참고.
예를 들어, 동결건조된 본 발명의 분자(예, 서열번호 197, 199, 211, 또는 213과 같은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)를 포함하는 액체 조성물을 포함하는 용기(예, 유리 바이알과 같은 바이알)는 당해 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 표준 절차를 이용하여 동결건조될 수 있다. 예컨대, 상기한 LYOPHILIZATION OF BIOPHARMACEUTICALS를 참조. 본 발명의 동결건조된 분자(예, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig)는 후에 액체와 재구성되어 재구성된 액체 조성물을 생성할 수 있다. 동결건조된 제형은 일반적으로 동결건조된 제형을 용해하는 수성 용액의 첨가로 재구성된다. 임의의 적합한 수성 액체 또는 용액은 동결건조된 제형을 재구성하는데 사용할 수 있다. 동결건조된 제형은 종종 멸균수 또는 증류수를 사용하여 재구성되지만, 본 명세서에 기술된 것들을 포함하여, 담체, 부형제, 희석제, 완충제, 및/또는 다른 성분을 포함하는 용액을 재구성에 사용할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 동결건조된 형태의 약학적 조성물을 제공하며, 여기에서 조성물은 원하는 pH(예, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5)를 유지하는 농도에서 물 중 적절한 완충제(예, HEPES, 시트르산이나트륨-시트르산 삼나트륨 등), 염(예, 50mM NaCl), 당(예, 조성물에 대하여 중량으로 4-6%의 수크로오스)에서 일반적으로 다이머성 융합 단백질로서 발현되는 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml를 포함하고, 이는 선택적으로 약 0.01mg/ml 내지 약 0.5mg/ml, 예컨대 약 0.01mg/ml 내지 약 0.1mg/ml의(예, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68) 농도로 비이온성 세제(Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68)를 포함한다. 약학적 조성물의 동결건조된 형태는 일반적으로 비동결건조된 액체 조성물과 비교하여 더 낮은 염 농도 및 더 높은 당 농도를 포함한다.
하나의 특정 양태에서, 본 발명은 멸균수로 재구성시 치료적 투여에 대하여 안정한 동결건조된 조성물을 제공하며, 이는 본 발명의 치료적으로 유효한 양 및 선택적으로 다음의 약학적으로 허용가능한 성분 중 하나 이상을 포함한다: (a) 중량으로 약 1% 내지 중량으로 약 10%의 양으로, 예를 들어 수크로오스, 만노오스, 덱스트로오스, 또는 트레할로오스와 같은, 당 또는 당류, (b) Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, Tween®-80, 또는 플루로닉 F-68과 같은, 세제 또는 유화제; (c) 0mM 내지 약 50mM의 농도(예컨대 상기에 제시한 농도를 포함함)로 예컨대 무기 염(예, 염화나트륨)과 같은 등장화제 또는 염; (d) 분자의 안정성에 도움이 되는 범위 내에서 조성물의 pH를 유지하는 적합한 완충제; (e) 분산제(예컨대, 0.001w/v% 내지 약 1.0w/v%와 같이, 본 발명의 분자의 장기 분산에 충분한 양으로)(예, Tween®-20, Tween®-40, Tween®-60, 또는 Tween®-80과 같은 폴리소르베이트, 또는 플루로닉 F-68); 및 (f) 안정화제(예, 당류, 덱스트란, 약 200Da 내지 약 8000Da(예, 200, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500, 또는 8000Da)의 분자량(MW)을 가지는 PEG와 같은, 저 분자량(MW) PEG 그룹), 또는 보존제. 일부 그러한 안정한 동결건조된 조성물에서, 본 발명의 분자는 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222로 구성되는 그룹에서 선택된(선택적으로, 예컨대 서열번호 197, 199, 211, 및 213으로 구성되는 그룹에서 선택된) 적어도 하나의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질과 같은, 본 발명의 재조합형 또는 분리형 융합 단백질이며, 여기에서 융합 단백질은 CD80 및/또는 CD86 및/또는 이의 세포외 도메인에 결합하고, 및/또는 면역 반응을 억제한다. 이러한 융합 단백질은 모노머성 또는 다이머성 형태일 수 있다.
동결건조된 조성물에서 각각의 상기 성분의 예시적인 양은 상기 및 본 명세서에 기술된 것들을 포함한다. 하나의 양태에서, 약 pH 3 내지 약 pH 8, 약 pH 4 내지 약 pH 7.5의 범위 내에서 조성물의 pH를 유지하도록 완충제를 선택한다. 본 발명의 재조합형 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 동결건조된 조성물은 일반적으로 -80℃ 내지 +40℃에서 안정하고, 및/또는 주위 온도(예, 약 22℃ 내지 약 30℃)에서 저장될 때 실질적으로 적어도 일주, 한달 이상(예, 여섯 달), 일년, 이년, 삼년, 사년, 또는 그 이상 동안 생물학적 활성을 유지한다. 액체(예, 주사용 멸균수(WFI)로 재구성시, 동결건조된 조성물은 대상체(예, 인간)에 투여(예, i.v., s.c., 비경구, i.m., i.d., i.p. 등)하는데 적합하다.
본 발명은 또한 제1 용기(예, 유리 바이알과 같은, 바이알)에 본 발명의 동결건조 또는 동결-건조된 분자(예, 서열번호 197, 199, 211, 또는 213과 같은, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)를 포함하는 동결건조 또는 동결-건조된 조성물을 포함하는 키트 및 액체(예, 멸균수, WFI 또는 완충제)를 사용하여 동결-건조 또는 동결건조된 조성물을 재구성하는 지시를 제공한다. 선택적으로, 키트는 동결건조 또는 동결-건조된 조성물을 액체 조성물로 재구성하는데 충분한 양의 액체(예, 멸균수, WFI 또는 완충제)를 포함하는 제2 용기(예, 유리 바이알과 같은, 바이알)를 추가로 포함한다. 이 예에서, 재구성은 제2 용기로부터 원하는 부피의 물을 빼내고 제1 용기 내로 물을 도입하는 주사기를 사용하여 이루어진다. 그 후에 제1 용기를 약하게 흔들어서 본 발명의 분자(예, 융합 단백질)를 용액으로 들어가게 한다. 키트는 동결건조 또는 동결-건조된 조성물을 재구성 및/또는 재구성된 액체 조성물을 투여하는 장치(들)를 포함한다. 예시적인 장치는 예를 들어, 2-성분 혼합 주사기, 이중-챔버 주사기, 및 이중-챔버 자기주사기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 제1성분 또는 챔버는 동결건조된 조성물을 포함하고 제2성분 또는 챔버는 재구성용 액체를 포함한다. 그러한 장치와 함께, 재구성은 일반적으로 투여 바로 전에 수행하고, 재구성된 조성물은 보통 비경구 (예, s.c., i.v., i.m., i.d. 주사)로 투여한다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 리포좀의 형태를 포함하거나 리포좀의 형태일 수 있다. 리포좀 제형에 적합한 액체는 제한없이, 모노글리세리드, 디글리세리드, 술퍼티드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 그러한 리포좀 제형의 제조는 예를 들어, 미국특허번호 제4,837,028 및 제4,737,323호에 기술되어 있다.
조성물 또는 약학적 조성물의 형태는 적어도 부분적으로, 관심의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 또는 세포의 투여 경로에 의해 지시될 수 있다. 수많은 투여 경로가 가능하므로, 약학적 조성물의 형태 및 그 성분은 다양할 수 있다. 예를 들어, 경점막 또는 경피 투여에서, 투과되는 장벽에 적절한 침투제를 조성물에 포함할 수 있다. 그러한 투과제는 당해 분야에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 경점막 투여, 세제, 담즙산염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 이와 반대로, 경점막 투여에서는 비강 스프레이 또는 좌약의 이용을 통해 용이하게 될 수 있다.
약학적 조성물을 포함하여 본 발명의 조성물에 대한 공통적인 투여 형태는 주사에 의한 것이다. 주사가능한 약학적으로 허용가능한 조성물은 일반적으로, 물, 석유(petroleum), 생리학적 식염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ), PBS, 또는 오일과 같은, 하나 이상의 적합한 액체 담체를 포함한다. 액체 약학적 조성물은 생리학적 식염 용액, 덱스트로오스(또는 다른 당류 용액), 알코올(예, 에탄올), 폴리올(만니톨, 소르비톨 등과 같은 폴리알코올), 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, PEG 분자와 같은 글리콜, 레시틴과 같은 적당한 유동성을 촉진하는 코팅제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 등장화제, 에티올레이트(ethyoleate)와 같은 유기 에스테르, 및 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴과 같은 흡수-지연제를 추가로 포함할 수 있다. 주사가능한 조성물은 발열원이 없고(pyrogen-free), 안정하며, 수성인 용액의 형태일 수 있다. 주사가능한 수성 용액은 염화나트륨, 링거 주사 용액, 덱스트로오스, 락트산화 링거 주사 용액, 또는 동등한 전달 비히클(예, 염화나트륨/덱스트로오스 주사 용액)을 포함할 수 있다. 관절내, 정맥내, 근육내, 피내, 피하(subdermal), 복강내, 및 피하(subcutaneous) 경로에 의한 주사에 적합한 제형은, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장으로 만드는(예, PBS 및/또는 0.1 M NaCl과 같은 식염 용액) 용매, 보조-용매(co-solvent), 항산화제, 환원제, 킬레이트제, 완충제, 정균제, 항박테리아 보존제, 및 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성, 등장 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 유화제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, 슈도바이러스, VLP 또는 세포(또는 상기 성분을 투여하는 조성물)의 투여는 임의의 적합한 물질로 형성된 전달 장치로 용이하게 할 수 있다. 생물분해성이 아닌 투여 장치를 생산하는 적합한 매트릭스 물질의 예는 하이드록아파타이트, 바이오글라스, 알루민산염, 또는 다른 세라믹을 포함한다. 일부 응용에서, 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 메틸셀룰로오스, 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropylmethylcellulose, HPMC)와 같은 금속이온 봉쇄제(sequestering agent)는 국소 전달용 장치에 특정 성분을 결합시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 벡터는 대상체의 일군의 세포 또는 조직 또는 피부로 핵산 또는 벡터의 전달을 위한 하나 이상의 폴록사머, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 또는 다른 계면활성제 또는 비누유사(soap-like) 친유성 물질과 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어 미국특허번호 제6,149,922호, 제6,086,899호, 및 제5,990,241호를 참조.
본 발명의 핵산 및 벡터는 하나 이상의 형질감염 향상제(transfection-enhancing agent)와 관련이 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 핵산 및/또는 핵산 벡터는 일반적으로 하나 이상의 안정성-증진 염, 담체(예, PEG), 및/또는 형질감염에 도움이 되는 제형(예, 인산나트륨염, 덱스트란 담체, 산화철 담체, 또는 골드 비드 또는 분말 담체와 같은 바이오리스틱 전달(“유전자 총”) 담체)과 관련되어 있다. 예를 들어, 미국특허번호 제4,945,050호를 참조. 추가적인 형질감염-향상제는 핵산 또는 핵산 벡터가 접합될 수 있는 바이러스 입자, 인산칼슘 침전제, 프로테아제, 리파아제, 비푸비카인(bipuvicaine) 용액, 사포닌, 지질(예, 하전된 지질), 리포솜(예, 양이온성 리포솜), 형질감염 용이화 펩티드 또는 단백질-복합체(예, 폴리(에틸렌이민), 폴리리신, 또는 바이러스 단백질-핵산 복합체), 비로좀(virosome), 또는 변형된 세포 또는 세포유사(cell-like) 구조(예, 융합 세포)일 수 있다.
본 발명의 핵산 및 벡터는 또한 생체 내 또는 생체 외 전기천공 방법으로 전달할 수 있으며, 이는 예를 들어 미국특허번호 제6,110,161호 및 제6,261,281호, 및 Widera 등, J. of Immunol. 164:4635-4640 (2000)에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명의 성분(예, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 및/또는 세포)의 경피 투여는 임의의 적합한 형태로 임의의 적합한 조성물에 그러한 성분을 포함하는 경피 패치로 용이화될 수 있다. 그러한 경피 패치 장치가 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, 그러한 성분은 약물 저장 패치 장치에서 액체 저장소에 포함될 수 있거나, 또는 대안적으로 상기 성분은 단순한 모놀리식(monolithic) 경피 패치 장치에서 혼합에 적합한 물질을 통해 분산될 수 있다. 일반적으로, 상기 패치는 적어도 하나의 그러한 성분의 면역억제 양- 패치를 접촉시킨 대상체에서 면역 반응을 억제하는 데 유효한 양과 같음 -을 포함한다. 그러한 패치 장치의 예는 당해 분야에 알려져 있다. 상기 패치 장치는 대상체의 피부 또는 조직에 대한 적어도 하나의 그러한 성분의 수동적 장치 또는 이온영동(iontophoretic) 장치일 수 있다.
조성물, 특히 약학적 조성물은 투여 후 대상체에서 원하는 면역억제 반응을 얻기에 충분한 본 발명의 적어도 하나의 상기 성분(예, 폴리펩티드, 접합체, 핵산, 벡터, 바이러스, VLP, 및/또는 세포)의 임의의 적합한 용량을 포함할 수 있다. 적당한 투여량은 임의의 적합한 기술로 결정할 수 있으며 적당한 용량을 결정하는데 있어서 고려사항은 당해 분야에 알려져 있다. 단일 투여량 테스팅 섭생에서, 조성물의 낮은 용량을 테스트 대상체 또는 시스템(예, 동물 모델, 무세포 시스템, 또는 전세포 분석 시스템)에 투여한다. 투여량은 공통적으로 투여되는 특정 성분의 효능, 대상체의 상태, 대상체의 체중, 및/또는 치료될 대상체의 표적 부위로 결정한다. 복용량의 크기는 또한 특정 대상체에서 임의의 상기 특정 성분의 투여를 수반하는 임의의 유해 부작용의 존재, 성질, 및 정도로 결정한다. 치료적 및 예방적 제제의 투여량과 관련된 원리는 예를 들어, Platt, Clin . Lab Med . 7:289-99 (1987), “Drug Dosage,” J. Kans. Med. Soc. 70(1):30-32 (1969), 및 본 명세서에 기술된 다른 참조문헌(예, 상기한 Remington의 것)에서 제공된다.
예로서, 자가면역 질환을 치료하는 초기 투여량에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 치료적으로 유효한 양은 대상체의 체중의 약 0.001mg/kg 내지 대상체의 체중의 약 100mg/kg, 예를 들어, 대상체의 체중의 kg당 약 0.001mg(mg/kg) 내지 대상체의 체중의 kg당 약 100mg(mg/kg), 또는 예를 들어 대상체의 체중에 대하여 약 0.001mg/kg 내지 대상체의 체중에 대하여 적어도 약 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 또는 100mg/kg을 포함할 수 있다. 그러한 투여량은, 예를 들어 매일, 매주, 또는 이주에 한번, 또는 이의 임의의 조합(예, 약 0일, 1일, 2일, 4일, 5일, 6일, 및 7일, 그 후 매주, 또는 약 0주, 1주, 2주, 4주, 및 6주), 그 후 1달 간격, 2달 간격, 3달 간격과 같은 임의의 적합한 프로토콜에 의해, 및 예를 들어, 전기천공 또는 피하(subcutaneous, s.c.), 근육내(intramuscular, i.m.), 정맥내(intravenous, i.v.), 또는 복강내(intraperitoneal, i.p.), 피하(subdermal), 경피, 비경구, 또는 피내(intradermal, i.d.) 주사와 같은 임의의 적합한 전달 방법으로 할 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 일반적으로 예를 들어, Ig Fc 폴리펩티드와 공유적으로 연결된 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질과 같은 가용성 폴리펩티드로서 투여한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제에서 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 자가면역 질환(예, 류마티스관절염) 또는 치료되는 상태(예, 수용자 대상체에 의한 공여자로부터의 조직, 세포, 이식편, 또는 고형 장기 이식의 거부를 저해하는 것)에 따라 유효한 양으로 임의의 적절한 경로(예, 피내, 정맥내, 또는 피하로)로 투여될 수 있다.
하나의 예시적인 양태에서, 본 발명은 면역 반응의 억제를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하며, 이는 예를 들어, 물 중 20mM HEPES 완충제, 100mM NaCl, 중량으로 2%의 수크로오스, pH 7.4에서 D3-54-IgG2 융합 단백질의 약 25mg/ml 내지 약 150mg/ml(예, 50 또는 100mg/ml)를 포함하여, 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 대상체는 자가면역 장애(예, 류마티스관절염)로 고통받는다. 다른 예시적인 양태에서, 본 발명은 수용자 대상체에서 공여자로부터의 조직, 세포, 이식편 또는 고형 장기 이식의 거부를 저해하는 방법을 제공하며, 이는 물 중 20mM 시트르산나트륨 완충제, 100mM NaCl, 중량으로 2%의 수크로오스, pH 6.5에서 D3-69-IgG2 융합 단백질의 약 25mg/ml 내지 약 100mg/ml(예, 50 또는 100mg/ml)를 포함하는 약학적 조성물을 수용자 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또한 바이러스 벡터 조성물이 제공되며, 이는 담체 또는 부형제 및 본 발명의 바이러스 벡터를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 바이러스 벡터 입자 또는 바이러스 벡터 입자-인코딩 핵산의 양 또는 투여량은 다음에 따라 다르다: (1) 벡터의 기원에 대한 바이러스 벡터 입자의 유형, 이는 예를 들어 벡터가 알파바이러스 벡터, 셈리키-삼림열 바이러스 벡터(Semliki-Forest viral vector), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련(adeno-associated, AAV) 바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 유두종바이러스 벡터, 및/또는 단순포진바이러스(herpes simplex viral, HSV) 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않음, (2) 벡터가 발현하는 이식유전자 또는 벡터를 나타내는 재조합형 펩티드, (3) 숙주, (4) 상기 검토된 다른 고려사항. 일반적으로 유전자 전달 벡터에 대하여 약학적으로 허용가능한 조성물은 약 1 ml의 부피에서 적어도 약 1 x 102 바이러스 벡터 입자(예, 약 1 ml에서 적어도 약 1 x 102 내지 1 x 108 입자)를 포함한다. 또한 더 높은 투여량이 적합할 수 있다(예, 적어도 약 1 x 106 입자/ml, 약 1 x 108 입자/ml, 약 1 x 109 입자/ml, 약 1 x 1010 입자/ml).
본 발명은 또한 본 발명의 둘 이상의 폴리펩티드 또는 접합체의 응집체를 포함하는 조성물(약학적 조성물을 포함함)을 제공한다. 또한, 본 발명은 일군의 본 발명의 하나 이상의 멀티머성 폴리펩티드 또는 멀티머성 접합체를 포함하는 조성물(약학적 조성물을 포함함)을 제공한다. 상기한 바와 같이, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 포함한다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 하나, 둘, 셋 이상의 폴리펩티드(예, 다이머성 융합 단백질을 포함하여, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질), 접합체, 핵산, 벡터, 세포, 및/또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 선택적으로 다음을 포함한다: (1) 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질), 접합체, 핵산, 벡터, VLP, 세포, 및/또는 조성물; (2) 선택적으로 적어도 하나의 제2 면역억제제(예, 비스테로이드성 항염증 제제, 메토트렉세이트, 스테로이트, TNFα 길항제 등); (3) (1) 또는 (2)에서 확인된 임의의 성분을 사용하기 위한 치료적 또는 예방적 방법 및 지시를 포함하여, 본 명세서에 기술된 임의의 방법을 실행하기 위한 지시; (4) (1) 또는 (2)에서 확인된 적어도 하나의 그러한 성분을 수용하는 용기; 및/또는 (5) 패키징 물질. 선택적으로 하나 이상의 제2 면역억제제와 함께, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질), 접합체, 핵산, 벡터, VLP, 세포, 및/또는 조성물은 팩(pack), 디스펜서 장치, 및 인간을 포함한 포유류와 같은 대상체로의 투여를 위한 키트에 패키징할 수 있다. 본 발명의 각각의 상기 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질), 접합체, 핵산, 벡터, VLP, 세포, 및/또는 조성물의 또는 나타낸 치료적 또는 예방적 방법을 위한 선택적인 제2 면역억제제의 유효한 양(예, 복용량)이 나타내어지고 하나 이상의 그러한 용량이 제공된다. 하나 이상의 폴리펩티드(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질), 접합체, 핵산, 벡터, 및/또는 세포 조성물, 및 원한다면, 선택적인 제2 면역억제제가 분말(예, 동결건조됨) 또는 액체 형태로 제공할 수 있고, 부형제 또는 담체(예컨대, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체)와 함께 제형화할 수 있으며, 이로써 조성물(예, 약학적 조성물)을 형성한다. 하나 이상의 단위 투여량 형태를 포함하는 팩 또는 디스펜서 장치가 제공된다. 일반적으로, 상기 성분의 투여용 지시는 화합물이 나타낸 이상의 치료에 적합한 라벨 상의 적합한 지시와 함께, 패키징을 제공한다.
실시예
다음 실시예들은 본 발명을 추가로 설명하는 것이지만, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 1
이 실시예는 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 만드는 방법의 기술을 제공하며, 이는 대조로서 및 BiacoreTM 결합 및 세포-기반 활성 분석에서 비교 목적으로 사용되었다.
LEA29Y
-
Ig
융합 단백질을 인코딩하는
DNA
플라스미드 벡터의 제조.
이 실시예는 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 플라스미드 벡터를 만드는 것을 기술한다. LEA29Y-Ig는 “LEA29Y”(또는 “LEA” 또는 “L104EA29Y” 또는 “A29YL104E”)라고 지칭하는, 특이적인 알려진 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하며, 이는 C-말단에서 특이적인 변이체 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 연결되어 있다. LEA29Y 폴리펩티드는 인간 CTLA-4 세포외 도메인의 폴리펩티드 서열과 두 개의 돌연변이- A29Y 치환 및 L104E 치환 -가 다른 폴리펩티드 서열을 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드이며, 상기 위치 29 및 104는, 인간 CTLA-4의 제1 아미노산 잔기가 아미노산 잔기 위치 1로서 지정되는 것에 따라서, 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열에 대한 참조로 번호가 매겨진다. 미국특허 제7,094,874호를 참조. LEA29Y-Ig를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 pCDNA3.1-LEA를 만들어서 이러한 융합 단백질을 제조하였다.
LEA29Y-Ig를 인코딩하는 DNA는 서열번호 167에 나타낸 LEA29Y-Ig를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과의 서열 동종성에 기초하여 고안된 오버랩핑 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 조립(assembly)으로 만든다. 올리고뉴클레오티드는 당해 분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 절차를 사용하여 고안되고, 만들어지며, 조립되고 필요에 따라 정지 코돈 및 시작 코돈 및 제한 부위를 포함할 수 있다. 또한 채용된 PCR 증폭 절차는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기한 Berger, Ausubel, 및 Sambrook를 참조.
올리뉴클레오티드는 100㎕ PCR 반응에서 1μM 올리고뉴클레오티드, 1x Taq 완충제(Qiagen; #201225) 및 200μM dNTPs를 이용하여 30회의 증폭 사이클(94℃, 30초; 60℃, 30초; 72℃, 60초)동안 조립한다. 증폭된 DNA는 QiaQuick PCR 스핀 컬럼(Qiagen, Cat. #28104)으로 정제하고 제한효소 NheI 및 SacII로 소화한다. 절편은 아가로스-겔 전기영동으로 분리하고, 제조자의 추천에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, #28704)를 사용하여 정제하며, 유사하게 소화된 플라스미드 pCDNA 3.1(+)(Invitrogen, Cat. #V790-20)로 결찰한다. 결찰은 제조자의 추천에 따라 TOP10 E. coli 세포(Qiagen, Cat. #C4040-10)로 형질전환한다. 그렇게 생긴 세포를 50㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 LB 배지에서 37℃에서 250rpm으로 흔들면서 밤새 배양하고 그 후 플라스미드 DNA(이후 플라스미드 벡터 pCDNA3.1-LEA로서 지칭됨)의 맥시프렙(maxiprep)(Qiagen; #12362) 군(stock)을 만드는데 사용한다.
플라스미드 벡터 pCDNA3.1-LEA는 변이체 CTLA-4-IgG2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 대체된 것을 제외하고는 도 1에 나타낸 플라스미드 벡터 pCDNA 변이체 CTLA-4-IgG2 벡터와 동일하다. 인간 CTLA-4 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산은 신호 펩티드-인코딩 뉴클레오티드 서열로서 포함하였다.
예측된 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 167에 나타나 있다. 서열번호 167은 신호 펩티드(예, 서열번호 165의 아미노산 잔기 1-37)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예측된 LEA29Y-Ig 및 성숙 LEA29Y-Ig 융합 단백질(신호 펩티드가 없음)의 폴리펩티드 서열은 각각 서열번호 165 및 166에 나타나 있다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, LEA29Y-Ig의 예측된 아미노산 서열은 다음 분절을 포함한다: 예측된 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-37), LEA29Y ECD 폴리펩티드(아미노산 잔기 38-161), 링커(아미노산 잔기 162), 및 인간 IgG1 폴리펩티드의 변이체(변형된) Fc 도메인(아미노산 잔기 163-394). 이들 다양한 분절 사이의 연결점에서 아미노산 잔기는 또한 도 2c에 나타나 있다. 특히, 신호 펩티드의 마지막 네 개의 아미노산 잔기, LEA29Y ECD의 처음 다섯 개 및 마지막 다섯 개의 아미노산 잔기, 신호 링커 아미노산 잔기(Q), 및 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드의 처음 다섯 개 및 마지막 다섯 개의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
신호 펩티드는 일반적으로 가공 동안 절단되고 따라서 LEA29Y-Ig의 분비 융합 단백질(즉, 성숙 융합 단백질)은 보통 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 총 357개의 아미노산을 가지는 LEA29Y-Ig의 성숙/분비 형태는 서열번호 165에 나타낸 예측된 서열의 아미노산 잔기 38-394(신호 펩티드가 없는 전장 서열)를 포함하고, 다음 아미노산 서열로 시작한다: 메티오닌-히스티딘-발린-알라닌. 서열번호 165는 N-말단에서 신호 펩티드(예, 잔기 1-37)를 포함하고; 신호 펩티드는 일반적으로 절단되어 서열번호 166에 나타낸 성숙 단백질을 형성한다. 원한다면, 성숙한 형태의 아미노산은 Met-His-Val-Ala 서열의 Met으로 시작하는 것으로 번호를 매길 수 있고, 서열번호 166에 나타낸 서열을 가지는 성숙 LEA29Y-Ig 융합 단백질에서와 같이, 제1 잔기로서 Met을 지정한다(예, ECD는 1-124로 번호가 매겨진 아미노산 잔기를 포함한다). 하나의 양태에서, 서열번호 165 또는 166의 서열은 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않고; 이 잔기는 가공 동안 또는 분비 전에 절단될 수 있다.
LEA29Y-Ig 융합 단백질의 단백질 서열은 미국특허 제7,094,874호에 기술되어 있다. 특히, 미국특허 제7,094,874호의 서열번호 4는 모노머성 LEA29Y-Ig의 비성숙 형태를 인코딩하는 단백질 서열을 나타낸다. 미국특허 제7,094,874호에서, LEA29Y-Ig 융합 단백질은 “L104EA29YIg”으로 지칭한다. 미국특허 제7,094,874호의 서열번호 4는 신호 펩티드(즉, 서열번호 4의 잔기 1-26)를 포함하므로 본 명세서에서 제시된 서열번호 166에 나타낸 서열을 포함하는 성숙 LEA29Y-Ig 융합 단백질은 미국특허 제7,094,874호에서의 서열번호 4에 나타낸 융합 단백질 서열과 다르다. 신호 펩티드는 일반적으로 가공 동안 절단되고 따라서 LEA29Y-Ig 융합 단백질의 성숙(분리) 형태는 보통 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다. 미국특허 제7,094,874호의 서열번호 3은 L104EA29YIg 융합 단백질(즉, LEA29Y-Ig)을 인코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
LEA29Y-Ig은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질로서 용액에 존재한다. 이 예에서, 각 모노머성 성숙 LEA29Y-Ig 융합 단백질은 C-말단에서 변이체 IgG1 Fc(서열번호 186)의 N-말단으로 융합된 LEA29Y ECD(서열번호 168) 폴리펩티드를 포함한다. 두개의 LEA29Y-Ig 모노머는 각 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화결합으로 공유적으로 함께 연결되어 있고, 이로써 LEA29Y-Ig 융합 단백질 다이머를 형성한다. LEA29Y-Ig 다이머는, 명백하게 달리 언급되지 않으면, 이들 실시예에 기술된 분석에서 사용되는 융합 단백질 분자의 형태이다.
LEA29Y
-
Ig
융합 단백질을 발현하는 안정한
CHO
-
K1
세포주의 제조.
안정한 세포주를 만들어서 상기 검토된 수-밀리그램 양의 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 생성하였다.
CHO
-
K1
세포의 형질감염.
40ml 성장 배지(10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone, #SV30014.03) 및 1x PS(페니실린 + 스트렙토마이신)(Invitrogen, #15140-122)로 보충한 DMEM/F12 배지(Invitrogen, #10565-018))를 포함하는 T-175 플라스크(BD Falcon, #353112) 내에 1 x 106의 밀도로 CHO-K1 세포를 접종하였다. 제조자가 추천한 조건에 따라 세포를 24시간 동안 37℃에서 배양하고 그 후 60㎕ Fugene 6(Roche, #11814443001)과 혼합된 10㎍ 맥시프렙 플라스미드 DNA(예, 상기 기술된 바와 같은 LEA29Y-Ig를 인코딩하는 플라스미드 벡터)로 형질감염시켰다. 세포를 성장 배지에서 2일 동안 37℃에서 배양하고 그 후 선택 배지(300㎍/ml 제네티신(Geneticin)(Invitrogen, #10131-027)을 포함하는 성장 배지)에서 10일 동안 배양하였으며, 2일마다 배지를 바꾸었다. 배지를 제거하고 3ml 0.05% 트립신(Invitrogen, Cat. #25300-054)을 첨가하여 세포를 분산시켰고 37℃에서 3분동안 배양하였다. 분산된 세포를 10ml 성장 배지로 희석하고 GH-3.8 로터(Beckman Coulter, #360581)에서 1000 rpm으로 5분 동안 실온(RT)에서 원심분리로 수확하였다. 상청액을 버린 후, 세포를 1ml 성장 배지에서 현탁하고, 40㎛ 막(BD Falcon, #352340)으로 여과하여, 밀도를 1 x 106 세포/ml로 조정하였다.
독특한 클론의 분리.
세포-분류기(Dako, MoFlo)를 사용하여, 살아있는 세포를 25% 순화 배지(Conditioned Medium)(형질감염되지 않은(또는 순수한(naive)) 세포 배양으로부터 미리 수확된 성장 배지)를 포함하는 200㎕/웰 성장 배지를 포함하는 96-웰 배양 플레이트(Sigma-Aldrich, #CLS-3596)로 개별적으로 분산하였다. 37℃에서 10-14일 동안 배양한 후, 세포를 트립신 가수분해로 분산하고 200㎕/웰 성장 배지를 포함하는 새로운 배양 플레이트로 옮겼다. 세포 밀도가 70% 컨플루언스(confluence)(7일마다 배지를 바꾸어주면서 대략 14일)에 도달할 때까지 세포를 성장 배지내 37℃에서 배양하였다.
원하는 클론의 확인.
도트-블랏(dot-blot) 및 웨스턴 분석(western analysis)으로 재조합형 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 높은 수준으로 발현하는 클론을 확인하였다. 도트-블랏 분석에 있어서, 제조제의 추천에 따라 100㎕의 배지를 96-웰 배양 플레이트의 각 웰로부터 수확하고 니트로셀룰로오스 막(Whatman, #10439388)으로 옮겼다. 막을 200ml PBST(PBST는 인산염-완충 식염수(PBS) + 0.05% Tween®-20이다)로 10분 동안 실온(RT)에서 두 번 세척하고 그 후 5% 탈지 분유(EMD, #1.15363.0500)를 포함한 PBST로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 상기 기술된 바와 같이 세척하고 1:4000으로 희석된 호스래디쉬 페록시다아제(HRP)-접합 염소 항-인간 Ig 항체(Vector Labs, #BA-3000)를 포함하는 20ml PBST에서 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 상기 기술된 바와 같이 세척하고 1: 2000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 시약(BD Biosciences, #554066)을 포함하는 PBST로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 상기 기술된 바와 같이 세척하고 제조자가 추천한 조건에 따라 ECL 웨스턴 블랏 검출 시약(Amersham, Cat. #RPN2132)을 사용하여 신호를 검출하였다. 높은 신호 강도로 확인된 양성 클론(즉, 융합 단백질을 높은 수준으로 발현함)을 트립신 가수분해로 분산시키고 2ml/웰 성장 배지를 포함하는 6-웰 배양 플레이트(BD Falcon, Cat. #353046)로 옮겼다. 37℃에서 3-4일 동안 배양한 후, 세포를 트립신 가수분해로 분산시키고 20ml 성장 배지를 포함하는 T-75 플라스크(BD Falcon, Cat. #353136)로 옮겼다. 37℃에서 2일 동안 배양한 후, 100㎕의 배지를 수확하고 웨스턴 분석으로 단백질 발현 수준에 대하여 분석하였다. 웨스턴 분석에 대하여, 제조자가 추천한 조건에 따라 각 세포 배양으로부터 동등한 양(15㎕)의 배지를 MES(MES는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산, pH 7.3이다) 실행 완충제 내에서4-12% Bis-Tris NuPAGE 겔(Invitrogen, #NP0322BOX)을 통해 실행하였다. 제조자가 추천한 조건에 따라 전자 전달(electro-transfer)로 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로오스 막(Invitrogen, Cat. #LC2001)으로 옮겼다. 막을 도트-블로팅에 대하여 상기 기술된 바와 같이 처리하였고 양성 클론(관심의 융합 단백질을 발현함)을 신호 강도 및 겉보기 분자량으로 확인하였다. 양성 클론을 상기 기술된 바와 같이 트립신 가수분해로 분산시키고 40ml 성장 배지를 포함하는 T-175플라스크에서 증식시켰다.
LEA29Y
-
Ig
융합 단백질의 제조 및 정제.
롤러 병 배양물(
Roller
Bottle
Cultures
)의 증식.
상기 기술된 바와 같이 관심의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시킨 안정한 CHO-K1 세포주를 40ml 성장 배지(10% FBS(Hyclone #SV30014.03) 및 1x PS(Invitrogen, #15140-122)으로 보충한 DMEM/F-12 배지(Invitrogen, #10565-018))를 포함하는 T-175 플라스크에서 컨플루언스까지 성장시켰다. 세포를 3ml 0.05% 트립신(Invitrogen, Cat. #25300-054)에서 3분 동안 37℃에서 배양하여 수확하고 12ml 성장 배지로 희석한 후 250ml 성장 배지를 포함하는 롤러 병(Corning, Cat. #431191)으로 옮겼다. 습한 롤링 배양기에서 2일 동안 37℃에서 롤러 병 배양물을 배양한 후, 배지를 제거하고 250ml 신선한 성장 배지로 대체하였다. 배양물을 2일 동안 37℃에서 배양하고 배지를 250ml UltraCHO 배지(1/1000 EX-CYTE(Serologicals Proteins, Cat. #81129N) 및 1x PS로 보충한 UltraCHO 배지(BioWhittaker, Cat. #12-724))로 대체하였다. 2일 동안 37℃에서 배양한 후, 배지를 250ml 신선한 UltraCHO 배지로 대체하였다. 배양물을 2일 동안 37℃에서 배양하였고 배지를 250ml 생산 배지(Production Medium)(1/100x ITSA (Life Technologies #51300-044), 1/1000x EX-CYTE 및 1x PS로 보충한 DMEM/F-12 배지)로 대체하였다. 생산 동안, 배지를 수확하고 2일에 한 번 신선한 생산 배지로 대체하였다.
단백질 정제.
롤러 병 배양물로부터 생산 배지를 2500 x g에서 30분 동안 실온에서 원심분리한 다음 0.2μM 막(VWR, Cat. #73520-986)으로 여과하여 정화하였다. 배지를 10kDa MWCO 막(Millipore, Cat. #P3C010C00)을 사용하여 접촉류 여과(tangential flow filtration)로 10배 농축한 다음 BioCad vision HPLC 시스템을 사용하여 단백질-A 친화성 크로마토그래피에 사용하였다. Ig-융합 단백질을 PBS 완충제 중 Poros 20 단백질-A 수지(Applied Biosystems, Cat. #1-5029-01)에 결합시키고, 동일한 완충제로 세척하였으며, 160mM 염화나트륨을 포함하는 80mM 시트르산 완충제(pH 4.0)로 용출한 다음 2M Tris 염기를 첨가하여 중화시켰다. 단백질 용액을 최종적으로 10kDa MWCO 막(Pierce, Cat. #PI66810)을 사용하여 6리터(l) PBS에 대하여 투석하였다.
실시예 2
이 실시예는 파지 디스플레이(phage display)로서 변경된 인간 CD80 및/또는 인간 CD86 결합 활성에 대한 CTLA-4 변이체의 라이브러리를 만들고 이를 스크리닝하는데 사용되는 예시적인 방법을 기술한다.
인간
CD80
-
Ig
융합 단백질.
인간 CD80-Ig(“hCD80-Ig”) 및 인간 CD86-Ig(“hCD86-Ig”) 융합 단백질을 파지 패닝 및 파지 ELISA 실험에서 리간드로서 사용하여 인간 CD80(“hCD80”) 및/또는 인간 CD86(“hCD86”) 및/또는 이 둘 중 하나 또는 둘 다의 세포외 도메인에 결합하는 변이체 CTLA-4 분자를 확인하였다. 인간 CD80-Ig(또한 “hB7.1-Ig” 또는 “hB7-1-Ig”이라고 지칭함) 및 인간 CD86-Ig(또한 “hB2.1-Ig” 또는 “hB2-1-Ig”이라고 지칭함) 융합 단백질은 R&D Systems(Minneapolis, MN)로부터 입수가능하다.
인간 CD80 신호 펩티드, 인간 CD80 ECD, 및 인간 IgG1 Fc를 포함하는 예측된 WT 인간 CD80-IgG1 융합 단백질을 인코딩하는 대표적인 핵산 서열은 서열번호 172에 나타나 있다. hCD80-IgG1 융합 단백질의 예측된 폴리펩티드 서열 및 성숙 폴리펩티드 서열은 각각 서열번호 170 및 서열번호 171에 나타나 있다. 서열번호 170에 나타낸 예측된 융합 단백질은 C-말단에서 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 융합된 WT 인간 CD80 ECD를 포함하고 N-말단에서 신호 펩티드를 포함한다. 신호 펩티드는 일반적으로 절단되어 서열번호 171에 나타낸 성숙한 CD80-Ig 융합 단백질을 형성한다.
인간 CD80-IgG1은 일반적으로 본 명세서에서 hCD80-Ig으로 축약된다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, hCD80-Ig 융합 단백질(또한 지정된 “CD80-IgG1”)의 예측된 아미노산 서열은 다음의 분절을 포함한다: 예측된 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-34), 인간 CD80 ECD(아미노산 잔기 35-242), 링커(아미노산 잔기 243-245), 및 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드(아미노산 잔기 246-476). 이들의 다양한 분절 사이의 연결점에서 아미노산 잔기는 도 2a에 나타나 있다. 특히, 신호 펩티드의 마지막 네 개의 아미노산 잔기, 인간 CD80 ECD의 처음 다섯 개 및 마지막 다섯 개의 아미노산 잔기, 링커의 아미노산 잔기(GVT), 및 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드의 처음 다섯 개 및 마지막 다섯 개의 아미노산 잔기가 나타나 있다. CD80-Ig 융합 단백질에서, CD80 ECD의 C-말단(이는 아미노산 잔기 FPDN으로 끝남)과 IgG1 Fc의 N-말단(이는 아미노산 잔기 PKSC로 시작함) 사이에서 클로닝 산물(cloning artifact)(또는 링커)로서 세 개의 잔기 GVT가 존재한다. 이 GVT 클로닝 산물 또는 링커는 각각 서열번호 170 및 171에 나타낸 예측된 CD80-Ig 폴리펩티드 서열 및 성숙한 CD80-Ig 폴리펩티드 서열에서 나타나 있다.
신호 펩티드는 일반적으로 가공 동안 절단되고 따라서 hCD80-Ig의 분비 융합 단백질(즉, 성숙 융합 단백질)은 보통 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 총 442개의 아미노산을 가지는 hCD80-Ig의 성숙/분비 형태는 서열번호 170의 아미노산 잔기 35-476(신호 펩티드가 없는 전장 서열)을 포함하고, 발린-이소류신-히스티딘-발린의 아미노산 잔기 서열로 시작한다. 원한다면, 성숙한 형태의 아미노산은 Val-Ile-His-Val 서열의 발린(Val)으로 시작하고, Val을 제1 잔기(예, ECD는 1-208로 번호가 매겨진 아미노산 잔기를 포함한다)로서 지정하며, hCD80-Ig의 성숙한 형태에서 서열번호 171에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함한다.
hCD80-Ig 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 성숙 hCD80-Ig 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질로서 용액에 존재한다. 이 예에서, 각 모노머성 성숙한 hCD80-Ig 융합 단백질(서열번호 171)은 C-말단에서 인간 IgG1 Fc(서열번호 185)의 N-말단으로 융합된 인간 CD80 ECD(서열번호 174)를 포함한다. 두 개의 hCD80-Ig 모노머는 각 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합으로 공유적으로 함께 연결되어 있고, 이렇게 하여 hCD80-Ig 융합 단백질 다이머를 형성한다. hCD80-Ig 융합 단백질 다이머는, 명백하게 달리 언급되지 않으면, 실시예들에 기술된 분석에서 사용되는 융합 단백질 분자의 형태이다.
예측된 전장 인간 CD80 폴리펩티드를 인코딩하는 대표적인 핵산이 서열번호 196에 나타나 있다. 서열번호 196에 나타낸 핵산 서열은 인간 CD80 신호 펩티드, ECD, 트랜스 막, 및 세포질 도메인을 인코딩하고, C-말단에 TAA 정지 코돈을 포함한다.
인간
CD86
-
Ig
융합 단백질.
인간 CD86-인간 IgG1(일반적으로 본 명세서에서 “hCD86-Ig”로서 축약됨) 융합 단백질의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 대표적인 핵산 서열은 서열번호 179에 나타나 있다. 이 핵산 서열은 성숙 인간 CD86-인간 IgG1 융합 단백질의 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. hCD86-Ig 융합 단백질의 예측된 아미노산 서열은 서열번호 177에 나타나 있고, 예측된 hCD86-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 179에 나타나 있다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, hCD86-Ig 융합 단백질의 예측된 아미노산 서열은 다음의 분절을 포함한다: 예측된 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-23), 인간 CD86 세포외 도메인(아미노산 잔기 24-243), 링커 서열(아미노산 잔기 244-246), 및 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드(아미노산 잔기 247-477). 이들 다양한 분절 사이 연결점에서의 아미노산 잔기는 또한 도 2b에 나타나 있다. 특히, 신호 펩티드의 마지막 네 개의 아미노산 잔기, 인간 CD86 ECD의 처음 다섯 개 및 마지막 일곱 개의 아미노산 잔기, 링커의 아미노산 잔기(GVT), 및 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드의 처음 다섯 개 및 마지막 다섯 개의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
CD86 신호 펩티드는 일반적으로 가공 동안 예측된 hCD86-Ig 폴리펩티드로부터 절단되고 이렇게 하여 분비된 인간 CD86-Ig 융합 단백질(즉, 성숙 융합 단백질)은 보통 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 총 454개의 아미노산을 가지는 hCD86-Ig의 성숙/분비 형태는 서열번호 177의 아미노산 잔기 24-477(신호 펩티드가 없는 전장 서열)을 포함하고, 알라닌-프롤린-류신의 아미노산 잔기 서열로 시작한다. 원한다면, 서열번호 178에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 hCD86-Ig의 성숙한 형태에서와 같이, 성숙 융합 단백질의 아미노산은 Ala-Pro-Leu 서열의 알라닌 잔기(Ala)로 시작하고, Ala을 제1 잔기(예, ECD는 1-218로 번호가 매겨진 아미노산 잔기를 포함한다)로서 지정하여 번호가 매겨질 수 있다. 성숙 융합 단백질(서열번호 178)은 C-말단에서 hIgG1 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 융합된 WT hCD86 ECD 단백질을 포함한다.
hCD86-Ig 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 성숙 hCD86-Ig 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질로서 용액에 존재한다. 이 예에서, 각 모노머성 성숙한 CD86-Ig 융합 단백질(서열번호 178)은 C-말단에서 인간 IgG1 Fc(서열번호 185)의 N-말단으로 융합된 인간 CD86 ECD(서열번호 180)을 포함한다. 두 개의 hCD86-Ig 모노머는 각 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합으로 함께 공유적으로 연결되고, 그렇게 함으로써 hCD86-Ig 융합 단백질 다이머를 형성한다. hCD86-Ig 융합 단백질 다이머는 명백히 달리 언급되지 않으면, 실시예들에 기술된 분석에 사용된 융합 단백질 분석의 형태이다.
CD86-Ig 융합 단백질(예, 예측된 및 성숙 형태)에서, CD86 ECD의 C-말단과 IgG1 Fc 폴리펩티드의 N-말단 사이에서 클로닝 산물(cloning artifact)(또는 링커)로서 세 개의 잔기 GVT가 존재한다. 다른 양태에서, WT 인간 CD86 ECD 단백질은 서열번호 180의 아미노산 잔기 1-218을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다(즉, (PP)에서 마지막 두 개의 C-말단 아미노산 잔기를 제외함).
Orencia
® 융합 단백질.
추가적인 대조로서 및 비교 목적으로, Orencia® 융합 단백질(Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ)로서 알려진 상업적으로 입수가능한 융합 단백질을 구입하였다. Orencia® 융합 단백질은 C-말단에서 특이적인 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 융합된 WT 인간 CTLA-4 세포외 도메인으로 이루어진다. Orencia® 단백질은 각각의 모노머성 융합 단백질에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합에 의해 공유적으로 함께 연결된 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질이다. 각각의 성숙 Orencia® 융합 단백질 모노머의 폴리펩티드 서열은 서열번호 164에 나타나 있으며 이는 다음 분절로 이루어진다: WT 인간 CTLA-4 세포외 도메인(아미노산 잔기 1-124), 링커 서열(아미노산 잔기 125), 및 변이체 IgG1 Fc 폴리펩티드(아미노산 잔기 126-357). LEA29Y ECD가 WT 인간 CTLA-4 ECD로 대체되고, 각각의 모노머는 분비 또는 성숙 융합 단백질이므로 어떠한 신호 펩티드도 Orencia® 융합 단백질 모노머에 존재하지 않는다는 점을 제외하고, 각각의 Orencia® 융합 단백질 모노머는 도 2c에 도식으로 나타낸 LEA29Y-Ig 융합 단백질 모노머의 구조와 유사한 구조를 가진다. Orencia® 모노머의 비성숙 형태의 폴리펩티드 서열(신호 펩티드를 포함함) 및 Orencia® 융합 단백질 모노머의 비성숙 형태를 인코딩하는 핵산 서열은 각각 미국특허 제7,094,874호의 서열번호 8 및 서열번호 7에 나타나 있다. Orencia® 융합 단백질을 만들고 사용하는 방법은 또한 미국특허 제7,094,874호에 개시된다.
변이체
CTLA
-4 폴리펩티드를 인코딩하는
DNA
서열의 제조.
방향성 진화 방법(directed evolution method)은 재조합형 변이체 CTLA-4 세포외 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합형 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하는데 사용하였다. 많은 자연-발생 포유류 CTLA-4 동종체(homologue)의 단백질 및 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 예를 들어, 미국 국립생물기술정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)를 참조. 방향성 진화 방법에서 다양한 자연-발생 포유류 CTLA-4 세포외 도메인 동종체에서 확인된 서열 다양성을 사용하여 변이체 CTLA-4 ECD 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합형 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하였다. 방향성 진화 절차는 예를 들어, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Chang 등, Nature Biotech 17:793-797 (1999); 국제특허출원번호 제WO 98/27230호; 및 미국특허번호 제6,117,679호 및 제6,537,776호에 대체로 기술된 바와 같은 시험관 내 재조합 및 돌연변이생성 절차를 포함한다.
변이체
CTLA
-4 폴리펩티드를 인코딩하는
DNA
서열의 라이브러리의 제조.
재조합형 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 변이체 DNA 서열을 서열 동종성에 기초하여 고안한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용한 PCR에 의한 조립 반응으로 증폭하였다. 프라이머들은 당해 분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 절차를 사용하여 고안되고, 만들어지며, 조립되었고 필요에 따라 정지 코돈 및 시작 코돈 및 제한 부위를 포함하였다. 채용된 PCR 증폭 절차 또한 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기한 Berger, Ausubel, 및 Sambrook을 참조. 예시적인 정방향 및 역방향 프라이머는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 정방향 프라이머(5'-CTATTGCTACGGCCGCTATGGCCMTKCACGTCGCTCAACCAGCCGTCGTACTCGCGTCC-3')(서열번호 191) 및 역방향 프라이머(5'-GTGATGGTGATGGTGTGCGGCCGCATCAGA-3')(서열번호 192). 15회의 증폭 사이클 동안(94℃ 30초; 50℃ 30초; 72℃ 40초) 1μM 정방향 및 역방향 프라이머, Taq 완충제(Qiagen; #201225) 및 200μM dNTPs를 사용한 100㎕ PCR 반응에서 5㎕의 조립 반응을 주형으로서 사용하였다. 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 증폭된 DNA를 제한효소(SfiI 및 NotI)로 소화시켰으며 단편을 아가로스-겔 전기영동으로 분리하고 제조자의 추천에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, #28704)를 사용하여 정제하였으며, 유사하게 소화된 파지-디스플레이 벡터 pSB0124로 결찰하였다(Chang 등, Nature Biotech 17:793-797 (1999)에 기술된 절차와 유사한 절차). 그 결과 생성된 라이브러리 결찰을 제조자가 추천한 조건에 따라서 전기천공법에 의해 TOP10 E. coli 세포(Invitrogen, Inc; #C4040-50)로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 250 rpm에서 밤새 37℃에서 50㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 LB(Luria broth 배지)에서 배양하고 그 다음 제조자가 추천한 조건에 따라 라이브러리 DNA의 맥시프렙(Qiagen; #12362) 군을 만드는데 사용하였다.
개선된 인간
CD80
및/또는 인간
CD86
결합 활성을 가지는
변이체
CTLA
-4 폴리펩티드를 나타내는 파지 라이브러리의 스크리닝
변이체
CTLA
-4 폴리펩티드의 라이브러리를 나타내는 파지의 생성.
라이브러리 DNA(예, CTLA-4 ECD 변이체를 인코딩하는 DNA 서열의 라이브러리)를 제조자가 추천한 조건에 따라 전기천공법에 의해 TG-1 E. coli 세포(Stratagene; #200123)로 형질전환하였다. 배양물을 파지미드-선택 조건(50㎍/ml으로 카르베니실린을 포함하는 LB 배지) 하에서 1-2 세대 동안 성장시키고, 헬퍼 파지 M13KO7로 감염시켰으며(5-10의 감염 수준의 다중도에서), 파지미드(카르베니실린 50㎍/ml) 및 헬퍼 파지(카나마이신 70㎍/ml)에 대한 이중 선택하에서 250rpm에서 밤새 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 배양물을 원심분리로 정화하였고(Sorvall 600TC 로터에서 6000rpm, 15분, 4℃) 파지 입자는 32ml 배양 상청액을 8ml PEG/NaCl 용액(20% PEG-8000; 2.5M NaCl)과 함께 30분 동안 얼음 위에서 배양한 다음 원심분리(Sorvall 600TC 로터에서 9500rpm, 40분, 4℃)함으로써 침전시켰다. 파지 펠렛을 1% BSA(소혈청 알부민, Sigma; #A7906)를 포함한 1ml PBS에서 현탁시키고, 마이크로퓨지 튜브로 옮겼으며, 원심분리(Eppendorf 테이블-탑 원심분리기(table-top centrifuge)에서 최대 속도, 5분, 실온)로 정화하였다.
CTLA
-4
변이체
파지 라이브러리의
패닝
.
표준 조건을 이용하여 hCD80-Ig 또는 hCD86-Ig 융합 단백질에 대하여 5라운드까지 파지 라이브러리를 패닝하였다. 예를 들어, Lowman, 등, Biochemistry 12;30(45):10832-10838 (1991); Smith, G.P. 등, Chem. Rev. 97:391-410 (1997)를 참조. 패닝의 각 라운드는 다음을 포함하였다: (a) hCD80-Ig 또는 hCD86-Ig 리간드로 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 나타내는 파지의 결합; (b) 결합하지 않은 파지의 제거; (c) 결합한 파지의 용출; 및 (d) 그 다음 라운드의 패닝을 위하여 용출된 파지의 증폭. 각각의 라운드로부터의 파지의 분액을 E. coli 세포로 형질도입하여 개별적인 형질도입체 콜로니를 획득하였다.
파지
ELISA
에 의한 인간
CD80
및/또는 인간
CD86
에 대하여 개선된 결합 활성을 가지는
CTLA
-4
변이체의
확인.
각각의 라운드의 패닝으로부터 얻어진 개별적인 콜로니를 50㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 150㎕/웰의 2 x YT(이스트-트립톤) 배지를 포함하는 96-웰 배양 플레이트(NUNC; #243656) 내로 접종하고 250rpm에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 밤새 배양물을 사용하여 600㎕/웰의 동일한 배지를 포함하는 딥웰 블록(deepwell block)(Scienceware; #378600001)을 접종하였다. 배양물을 250rpm에서 2시간 동안 37℃에서 배양하고 M13K07 헬퍼 파지(감염(moi) 5-10의 다중도)로 감염시켰으며, 파지미드 및 헬퍼 파지 마커(각각 50㎍/ml의 카르베니실린 및 70㎍/ml의 카나마이신)에 대한 이중 선택하에서 250rpm에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 배양물을 Beckman GH 3.8 로터에서 4000rpm으로 20분 동안 4℃에서 원심분리로 정화하였다. 10㎍/ml hCD80-Ig 또는 hCD86-Ig를 포함하는 50㎕/웰 PBS를 첨가하여 ELISA 플레이트(NUNC; #449824)를 코팅하였고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 200㎕/웰 PBST로 세 번 세척하고 3% 탈지분유를 포함한 200㎕/웰 PBS를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 하온처리하여 차단시켰다. 딥웰 블록에서 25㎕/웰의 파지 상청액을 25㎕/웰 6% 탈지 분유를 포함한 ELISA 플레이트로 옮겼고 플레이트를 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 200㎕/웰 PBST로 세 번 세척하고 3% 탈지분유를 포함한 PBST에서 1:5000으로 희석된 50㎕/웰 HRP-접합 항-M13 모노클론성 항체(GE Healthcare, #27-9421-01)로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 200㎕/웰 PBST로 세 번 세척하고 제조자가 추천한 조건에 따라서 TMB 기질 키트(TMB substrate kit)(Pierce; #34021)를 사용하여 신호를 검출하였다. 인간 CD80 및/또는 인간 CD86에 대한 인간 CTLA-4의 결합 활성(hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig에 대한 인간 CTLA-4 ECD의 결합 활성으로 측정된 바와 같음)과 비교하여, 인간 CD80 및/또는 인간 CD86에 대하여 증가된 결합 활성(hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig에 대한 증가된 결합활성으로 측정된 바와 같음)을 보이는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 추가 분석을 위하여 선택하였다.
실시예 3
IgG2
Fc
융합 단백질 벡터의 제조.
플라스미드 IgG2-Fc융합 단백질 발현 벡터를 만들어서 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 및 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 생산하였다. 정방향 프라이머(5'-AAGCTGTCACCGGTGGATCGATCCCGAACCCTGCCCTGATTCTGATGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGT-3')(서열번호 189) 및 역방향 프라이머(5'-CAGAATTCATTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG-3')(서열번호 190)를 사용하여 인간 백혈구 cDNA(BD Biosciences, Cat. #HL4050AH)의 PCR 증폭으로 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 생성하였다. 상기 프라이머들은 당해 분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 고안되고, 만들어지며, 조립되었고 필요에 따라 정지 코돈 및 시작 코돈 및 제한 부위를 포함하였다. 채용된 PCR 증폭 절차 또한 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기한 Berger, Ausubel, 및 Sambrook을 참조. 25회의 증폭 사이클 동안(94℃ 30초; 55℃ 30초; 72℃ 60초) 1μM 정방향 및 역방향 프라이머, Taq 완충제(Stratagene; #200435) 및 200μM dNTPs를 사용한 100㎕ PCR 반응에서 50-100ng의 cDNA를 주형으로서 사용하였다. PCR 생산물을 제조자가 추천한 조건에 따라 QiaQuick PCR 스핀 컬럼(Qiagen #28106)으로 정제하였고 제한 효소 AgeI 및 EcoRI으로 소화시켰다. PCR 소화 단편을 아가로스-겔 전기영동으로 분리하고 제조자가 추천한 조건에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, #28704)를 사용하여 정제하였다. CTLA-4 신호 서열에서 AgeI 제한 자리를 포함하는 pCDNA3.1-LEA 벡터(상기 기술함)의 변형된 버전은 AgeI 및 EcoRI으로 소화하고 상기 언급한 단편으로 결찰할 수 있다. 상기 결찰은 제조자가 추천한 조건에 따라 원샷(One-shot) TOP10 E. coli 세포(Invitrogen Cat. #C4040-03)로 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 250rpm에서 밤새 37℃에서 50/㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 LB(Luria broth 배지)에서 배양하고 그 다음 제조자가 추천한 조건에 따라 플라스미드 DNA의 맥시프렙(Qiagen; #12362) 군을 만드는데 사용하였다.
그 결과 생성된 플라스미드 발현 벡터는 pCDNA IgG2 Fc 융합 단백질 발현 벡터로서 지정된다. 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 제거된 것을 제외하고 이 벡터는 도 1에 나타낸 pCDNA 변이체 CTLA-4-IgG2 플라스미드 벡터와 동일하다. pCDNA IgG2 Fc 융합 벡터에서 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(이는 도 1에서 임의의 적합한 신호 펩티드-인코딩 뉴클레오티드 서열일 수 있다)은 인간 CTLA-4 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산이다(서열번호 181 또는 서열번호 215). 이 IgG2 Fc 융합 벡터는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 또는 다른 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 핵산을 포함하지 않는다.
IgG2
Fc
융합 벡터 내로
변이체
CTLA
-4 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의
클로닝
.
가용성 Fc 융합 단백질로서 변이체 CTLA-4 폴리펩티드를 생산하기 위하여, 파지 라이브러리 스크리닝으로부터 인간 CD80 및/또는 인간 CD86에 대하여 개선된 결합 활성을 가지는 것(인간 CD80 및/또는 인간 CD86에 대하여 인간 CTLA-4-ECD의 결합 활성과 비교한 대로)으로 확인된 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 예를 들어, 다음의 절차를 사용하여 상기 기술된 IgG2 Fc 융합 단백질 벡터 내로 각각 클로닝하였다.
변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에서 많은 뉴클레오티드 잔기(예, 30-60개의 뉴클레오티드)와의 서열 동종성에 기초하여 고안된 정방향 및 역방향 프라이머 및 당해 분야에 알려진 표준 절차를 사용하여 hCD80-Ig 및/또는 hCD86-Ig에 대하여 더 높은 결합 활성을 보이는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 PCR 증폭에 의해 파지 디스플레이 벡터로부터 처음으로 회수하였다. 예를 들어, 예컨대 상기한 Berger, Ausubel, 및 Sambrook에 기술된 절차를 참고. 예를 들어, 하나의 예시적인 양태에서, 정방향 프라이머(5'-GGAATACCGGTTTTTTGTAAAGCCATGCACGTCGCTCAACCAGCCGTCGTACTC-3')(서열번호 191) 및 역방향 프라이머(5'-GGCACTCAGATCTACGTCATCGATCCCGAA-3')(서열번호 192)를 사용하여 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 PCR 증폭에 의해 파지 디스플레이 벡터로부터 회수하였다. 10ng의 플라스미드 DNA(변이체 CTLA-4 ECD-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 파지 디스플레이 벡터)를 25회의 증폭 사이클 동안(94℃ 30초; 55℃ 30초; 72℃ 60초) 상기 기술된 1μM 정방향 및 역방향 프라이머, Taq 완충제(Stratagene; #200435) 및 200μM dNTPs를 사용한 100㎕ PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. PCR 생산물을 제조자가 추천한 조건에 따라 QiaQuick PCR 스핀 컬럼(Qiagen #28106)으로 정제하였고 제한 효소 AgeI 및 ClaI로 소화시켰다. 단편을 아가로스-겔 전기영동으로 분리하고 제조자가 추천한 조건에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, #28704)를 사용하여 정제하였으며, 유사하게 소화된 플라스미드 IgG2 Fc 융합 벡터 내로 결찰하였다. 상기 결찰은 제조자가 추천한 조건에 따라 원샷(One-shot) TOP10 E. coli 세포(Invitrogen Cat. #C4040-03)로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 250rpm에서 밤새 37℃에서 50㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 LB(Luria broth 배지)에서 배양하고 그 다음 제조자가 추천한 조건에 따라 플라스미드 DNA의 맥시프렙(Qiagen; #12362) 군을 만드는데 사용하였다.
본 발명의 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 그 결과 생성된 플라스미드 발현 벡터는 pCDNA 변이체 CTLA-4 ECD IgG2 Fc 플라스미드 발현 벡터로서 지정된다. 이 벡터의 도식적인 도표가 도 1에 나타나 있다. 이 벡터는 Bla 프로모터; 앰피실린 내성 유전자; pUC 기점(origin); SV40 폴리아데닐화(poly A) 신호 서열; f1 기점; SV40 프로모터; 네오마이신 내성 유전자; 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예컨대, 인간 CTLA-4 신호 펩티드, 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드, 및 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드를 포함함)의 발현을 용이하게 하는 CMV 프로모터; 인간 CTLA-4 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(서열번호 181 또는 서열번호 215); 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 80-152중 임의의 하나를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함하나 이에 한정되지 않음); 서열번호 183 또는 서열번호 217에 나타낸 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 예시적인 핵산 서열; 및 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, bGH) 폴리 A 종결 신호 서열을 포함한다. 서열번호 183의 핵산 서열은 C-말단 리신(K) 잔기를 가진 hIgG2 Fc 폴리펩티드(서열번호 184)를 인코딩하고; 서열번호 217의 핵산 서열은 C-말단 리신 잔기가 없는 hIgG2 Fc 폴리펩티드(서열번호 218)를 인코딩한다.
플라스미드 IgG2 Fc 융합 단백질 벡터는 또한 인간 CTLA-4-IgG2(“hCTLA-4-Ig”) 융합 단백질을 제조하는데 사용할 수 있다. 이 예에서, 인간 CTLA-4 ECD(예, 서열번호 193)를 인코딩하는 핵산 서열은 변이체 CTLA-4 ECD를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 대신에 상기 기술된 절차와 유사한 표준 클로닝 절차를 사용하여 플라스미드 IgG2 Fc 융합 단백질로 클로닝한다. hCTLA-4-Ig 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 성숙 hCTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질로서 용액에 존재한다. 이 예에서, 각각의 모노머성 성숙 hCTLA-4-Ig 융합 단백질은 C-말단에서 인간 IgG2 Fc(서열번호 218 또는 서열번호 184)의 N-말단으로 융합된 인간 CTLA-4 ECD(서열번호 159)를 포함한다. 두 개의 hCTLA-4-Ig 모노머는 각각의 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합으로 공유적으로 함께 연결되고, 그렇게 함으로써 hCTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머를 형성한다. 성숙 hCTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는, 명백하게 달리 언급되지 않으면, 실시예들에서 기술된 분석에 사용되는 융합 단백질의 형태이다.
우리는 hCTLA-4-Ig 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 및 서열번호 184에 나타낸 hIgG2 Fc폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 형질감염시킴으로써 CHO 세포에서 만들어진 인간 CTLA-4-Ig 융합 단백질 또는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은, LCMS 분석으로 결정된 바와 같이, 일반적으로 예측된 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며; 이렇게 하여 hCTLA-4-IgG2 또는 변이체 CTLA-4-IgG2의 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 218에 나타낸 것이며, 상기 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 184에 나타낸 폴리펩티드 서열과 비교된 바와 같이 일반적으로 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는다는 것을 실험으로 알아내었다.
COS
세포의 일시적인 형질감염.
COS-7 세포를 40ml 성장 배지(10% FBS(Hyclone Cat. #SV30014.03) 및 1x PSG(페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민)(Invitrogen, Cat. #10378-016)로 보충한 DMEM/F12 배지(Invitrogen, Cat. #10565-018))를 포함하는 T-175 플라스크에서 80-90% 컨플루언스까지 성장시켰다. 플라스미드 발현 벡터로 세포를 형질감염시키기 직전에, 배지를 제거하고 35ml 발현 배지(1x PSG를 포함하는 OptiMem 배지(Gibco #51985))로 대체하였다. 플라스미드 DNA(10㎍)(예, 본 발명의 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질을 인코딩하는 pCDNA 변이체 CTLA-4 ECD IgG2 Fc 발현 벡터)를 1:3 부피비에서 FuGENE6 형질감염 시약(Roche #11 815 075 001)으로 혼합하고 1ml의 성장 배지에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물을 T-175 플라스크로 천천히 첨가하고 부드럽게 빙빙 돌려서 혼합하였다. 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 배지를 수확하고, 신선한 발현 배지를 첨가하였으며, 배양물을 추가 3일 동안 배양하였다.
유사한 절차를 사용하여 인간 CTLA-4-IgG2를 인코딩하는 유사한 플라스미드 벡터 또는 LEA29Y-Ig를 인코딩하는 pCDNA3.1-LEA 플라스미드 벡터로 형질감염된 COS-7 세포를 만들 수 있다.
단백질의 정제.
형질감염 배양물의 상청액(예컨대 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 인코딩하는 pCDNA 변이체 CTLA-4 ECD IgG2 Fc 벡터로 형질감염된 세포를 포함함)을 1000x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리한 다음 0.2㎛ 막(Nalgene, VWR #73520-982)으로 여과하여 정화하였다. 단백질을 AKTA Explorer HPLC 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 단백질-A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 PBS 완충제에서 Hitrap 단백질 A FF 컬럼(GE Healthcare, #17-5079-01)에 결합시키고, 동일한 완충제로 세척하였으며, 100mM 시트르산 완충제(pH 4.0)로 용출시킨 다음, 2M Tris 염기의 1/10 부피를 첨가함으로써 중화시켰다. 단백질 용액에서 완충제를 10kDa MWCO 막(Pierce, Cat. #PI66810)을 사용하여 투석함으로써 최종적으로 PBS로 교환하였다.
유사한 절차를 사용하여 인간 CTLA-4-IgG2 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 정제할 수 있다.
단백질 질의 평가.
SDS
/
PAGE
분석.
본 발명의 정제된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 겉보기 분자량(MW)을 비환원 조건하에서 SDS/PAGE 분석으로 측정하였다. 비환원 조건하에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질로서 존재한다. 하나의 양태에서, 다이머는 두 개의 동일한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 모노머를 포함하는 호모다이머이다. 하나의 양태에서, 각각의 CTLA-4-Ig 융합 단백질 모노머는 C-말단에서 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합된 성숙/분비 변이체 CTLA-4 ECD를 포함한다. 두 개의 변이체 CTLA-4-Ig 모노머는 각각의 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합으로 공유적으로 함께 연결된다. 호모다이머는, 명백하게 달리 언급되지 않는다면, 실시예들에서 일반적으로 기술된 본 발명의 변이체 융합 단백질 분자의 형태이다. 실시예들에 나타낸 데이터는, 명백하게 달리 언급되지 않으면, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 호모다이머에 관련한 것이다.
SDS/PAGE 분석을 다음과 같이 실행하였다. 2㎍의 정제된 단백질을 20㎕ LDS 샘플 완충제(Invitrogen #NP0007)에 첨가하고 제조자가 추천한 조건에 따라서 1x MES 도데실 황산 나트륨(sodium docecyl sulfate, SDS)/PAGE 러닝 완충제(Invitrogen #NP0002) 내에서 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen #NP0321BOX)을 통해 흐르게 하였다. 겔을 실온에서 약하게 교반하면서 50ml SimplyBlue SafeStain(Invitrogen #LC6060)에서 1시간 동안 항온처리하여 염색하였다. 겔을 제조자가 추천한 조건에 따라서 실온에서 약하게 교반하면서 200ml 물로 1시간 동안 두 번 항온처리함으로써 탈염시키고 건조 완충제(drying buffer)(Bio RAD 161-0752)에서 처리하였다.
본 발명의 두 개의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 호모다이머(클론 D3 및 D4로 지정됨) 및 비교 대조군으로서 역할하는 Orencia® 융합 단백질의 대표적인 SDS/PAGE 겔이 도 3에 나타나 있다. D3-Ig 융합 단백질 다이머는 각 D3-Ig 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합으로 공유적으로 연결된 두 개의 동일한 D3-Ig 융합 단백질 모노머를 포함한다. 각각의 D3-Ig 모노머는 C-말단에서 서열번호 218에 나타낸 hIgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 직접적으로 융합된 서열번호 61에 나타낸 폴리펩티드 서열(즉, 어떠한 “링커” 아미노산 잔기(들)를 가지지 않음)을 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(“D3”으로 명명함)를 포함한다. D4-Ig 융합 단백질 다이머는 각각의 D3-Ig 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 이황화 결합으로 공유적으로 연결된 두 개의 동일한 D4-Ig 모노머를 유사하게 포함한다. 각각의 모노머성 D4-IgG2 융합 단백질은 C-말단에서 서열번호 218에 나타낸 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열의 N-말단으로 직접적으로 융합된 서열번호 62에 나타낸 폴리펩티드 서열(즉, 어떠한 “링커” 아미노산 잔기(들)를 가지지 않음)을 포함하는 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(“D4”로 명명함)를 포함한다.
상기에서 설명한 바와 같이, 우리는 서열번호 184에 나타낸 예측된 hIgG2 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 만들어진 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은, LCMS 분석으로 결정된 바와 같이, 일반적으로 예측된 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며; 이렇게 하여 본 명세서에 기술된 변이체 CTLA-4-IgG2의 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 218에 나타낸 것이고, 상기 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 184에 나타낸 폴리펩티드 서열과 비교된 바와 같이 일반적으로 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는다는 것을 실험으로 알아내었다.
SDS/PAGE 분석을 모든 단백질 제조물에 대하여 실행하여 겉보기 분자량, 단백질 농도, 및 순조의 관점에서 단백질 질을 확인하였다. SDS/PAGE 분석의 결과는 모든 단백질 제조물에 대하여 유사하였다. 도 3에 나타낸 예시적인 겔 결과로부터, 정제된 D3-IgG2 및 D4-IgG2 융합 단백질 다이머는 겉보기 MW가 대략 80kDa이고, 이는 도 10에 묘사된 예시적인 호모다이머성 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질 구조의 예측된 MW(예측된 MW = 78-79kDa)와 일치한다. (정제된 변이체 CTLA-4-IgG2 단백질 모노머는 일반적으로 겉보기 MW가 39-40kDa이다.) 도 3에 나타낸 겔에서의 단백질 밴드는 동등한 강도로 염색하였고, 이는 다른 샘플에 대한 단백질 농도의 측정의 정확도를 확인해 준다. 단백질 순도에 관하여는, 도 3에서 대략 44kDa의 겉보기 MW에서 더 낮은 MW 밴드를 관찰할 수 있으며, 이는 모노머성 IgG2 융합 단백질의 예측된MW와 일치한다. 이러한 더 낮은 MW 밴드의 상대적인 강도는 일관적으로 낮으며 총 단백질의 5% 미만인 것으로 추정된다.
유사 SDS/PAGE 분석을 사용하여 상기에 기술된 방법과 유사한 방법을 사용하여 생산된 인간 CTLA-4-IgG2 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질의 순도를 평가할 수 있다.
내독소 분석.
변이체 CTLA-4 융합 단백질의 내독소 수준을 제조자가 추천한 조건에 따라서 QCL-1000 투구게 변형세포 용해물 분석 키트(limulus amoebocyte lysate assay kit, Cambrex #50-648U)를 사용하여 측정하였다. 세포-기반 분석에서 사용된 단백질에 대한 최대 내독소 수준은 10 내독소 유닛(EU)/mg 단백질에서 맞추었다.
유사 분석을 사용하여 인간 CTLA-4-IgG2 또는 LEA29Y-Ig 단백질 제조물의 내독소 수준을 측정할 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피(
SEC
) 분석.
단백질 응집 수준(변이체 CTLA-4 폴리펩티드 및 대조군 폴리펩티드의 응집 수준을 포함함)을 Dionex BioLC 시스템(Dionex)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 측정하였다. 단백질(5㎍)을 20분 등용매 실행(isocratic run)을 사용하여 PBS 러닝 완충제 내에서 Tosoh G3000Wxl 컬럼(Tosoh Bioscience)을 통해 흐르게 하였고 214nm에서 흡광도(A)로 검출하였다. 추가 분석에 사용된 단백질에 대한 응집의 최대 수준은 10%에서 맞추었다.
SEC 분석을 모든 단백질 제조물에 대하여 실행하여 단백질 응집 수준의 관점에서 단백질 질을 확인하였다. 그 결과는 모든 단백질 제조물에 대하여 유사하였고 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머(D3-Ig)의 SEC 분석으로부터의 대표적인 용출 프로파일을 도 4에 나타내었다. y-축은 밀리흡광도 유닛(milliAbsorbance units, mAU)을 나타내고; x-축은 분에서의 용출 시간을 나타낸다. D3-Ig 다이머의 구조는 상기 “SDS/PAGE 분석” 섹션에 설명되어 있다. 이러한 정제된 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 크기에서 대체로 동종이고 높은 수준의 응집된 종(species)을 포함하지 않는다. 본 발명의 다른 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 유사하게 분석하였고 유사한 결과를 보였다(데이터는 나타내지 않음). 본 발명의 정제된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 크기에서 동종인 것으로 밝혀졌고 높은 수준(>10%)의 응집된 단백질을 포함하지 않았다. 높은 수준으로 응집된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 인간 CD80 및/또는 인간 CD86 분자에 더 높은 결합활성으로 결합할 수 있고 따라서 더 높은 생물학적 활성을 보일 수 있으므로 본 발명의 정제된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 응집 상태를 확인하는 것은 중요하다.
실시예 4
표면
플라즈몬
공명(
SPR
)(
Biacore
TM
Analysis
)을 이용한 인간
CD80
-쥐 Ig(hCD80-mIg) 및 인간
CD86
-쥐
Ig
(
hCD86
-
mIg
) 융합 단백질에 대한
변이체
CTLA
-4-Ig 융합 단백질의 결합 활성의 측정.
이 실시예는 Biacore 상호작용 분석을 이용하여 hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg 리간드에 대한 개선된 결합 활성에 대하여 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 스크리닝하는 절차를 기술한다. 이러한 타입의 분석을 기술하는데 사용되는 명명법에서, 고정된 결합 파트너는 “리간드”로서 지칭하고, 이동상에서 결합 파트너는 “분석물(analyte)”로서 지칭한다. Ig 도메인을 포함하는 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 Ig 도메인 사이에서 강한 결합 때문에 용액에서 다이머성 구조를 형성한다. 달리 지시되지 않으면, 그러한 다이머성 형태는 이 실시예에 기술된 융합 단백질(즉, 변이체 CTLA-4-Ig, Orencia® 융합 단백질, LEA29Y-Ig, hCD80-mIg, 및 hCD86-mIg)에 대하여 존재하는 것으로 예상된다. 용어 “결합활성(avidity)”은 일반적으로 다이머성 분석물(예, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)과 다이머성 리간드(예, hCD80-mIg 또는 hCD86-mIg 융합 단백질) 사이에서의 결합의 세기에 관한 것이다. 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대하여 기술된 결합 활성에서의 증가는 각각의 CTLA-4 ECD 도메인과 그것의 대응 리간드 사이에서의 결합 친화도를 증가시킨다. 결합 활성의 세기는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)의 관점에서 기술되며, 이는 이용가능한 리간드의 50%가 평형상태에서 결합된 분석물의 몰 농도를 기술한다.
이러한 스크리닝 방법에서, Biacore 센서 칩은 hCD80-mIg 또는 hCD86-mIg 리간드로 유도되고 완충제에서 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 리간드-코팅된 센서 칩 위로 흐르게 하였다. 특이적인 결합 파트너(즉, hCD80-mIg 또는 hCD86-mIg)에 결합하는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 분자의 능력을 평가하였다. 대조군 융합 단백질(즉, 인간 CTLA-4-IgG2 융합 단백질, Orencia® 융합 단백질, 및 변이체 LEA29Y-Ig 융합 단백질)을 또한 리간드-코팅된 센서 칩 위로 흐르게 하였고 hCD80-mIg 또는 hCD86-mIg에 결합하는 이들 분자의 능력을 비교를 위하여 유사하게 측정하였다. Biacore 시스템을 이용하여, hCD80-mIg 또는 hCD86-mIg 리간드에 결합하는 관심의 단백질의 결합(kon) 및 해리(koff) 속도 상수를 평가하고 평형 해리 상수, KD를 계산하는데 사용할 수 있다. 인간 IgG2 폴리펩티드에 융합된 WT 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함하는 인간 CTLA-4-IgG2 융합 단백질은 야생형 인간 CTLA-4-Ig “대조군”으로서 역할할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, Orencia® 융합 단백질은 변형된 IgG1 Fc 폴리펩티드로 융합된 WT 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 이루어지므로, 또한 비교 목적으로 야생형 인간 CTLA-4-Ig 대조군으로서 효과적으로 역할을 한다. 인간 CTLA-4-IgG2, Orencia® 융합 단백질, 및/또는 LEA29Y-Ig와 비교하여, hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg에 대하여 증가된 결합 활성을 가지는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 확인하였다. 하기에서 더 상세히 검토될 바와 같이, hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg에 대한 Orencia® 융합 단백질(즉, hCTLA-4-IgG1) 및/또는 LEA29Y-Ig의 결합 활성과 비교한 바와 같이, hCD80-mIg 및/또는 hCD86-mIg에 대한 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 증가된 결합 활성은 변이체 CTLA-4-Ig 분자에 존재하는 IgG2와 Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 분자에 존재하는 변이체 IgG1 사이의 상이함 인한 것이 아니었다.
모든 BiacoreTM 분석은 실온(RT, 25℃)에서 BiacoreTM 2000 시스템(GE Healthcare)에서 실행하였다. HBS-EP 완충제(10mM HEPES (pH 7.4), 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 모든 실험에서 유동 완충제(flow buffer)로서 사용하였다.
표준 동역학 분석.
표준 동역학(Kinetic) 분석은 센서 칩으로 코팅된 다이머성 리간드(예, hCD80-mIg 융합 단백질 또는 hCD86-mIg 융합 단백질) 및 이동상에서 다이머성 분석물(예, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질)의 결합 동역학을 측정한다. 토기 항-마우스 IgG 항체(GE Healthcare, #BR-1005-14)를 제조자의 프로토콜에 따라서 CM5 센서 칩(GE Healthcare, #BR-1000-14) 위에 고정하였다. 항체를 고정화 완충제(10mM 아세트산나트륨, pH 5.0 (BR-1003-51))에서 30㎍/ml으로 희석하였다. 5㎕/분의 유속에서, 센서 칩 CM5를 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)(11.5mg/ml EDC 및 75mg/ml NHS를 동일한 부피로 혼합하여 만듦)(GE Healthcare, #BR-1000-50)의 혼합물을 35㎕ 주사하고, 이어서 희석하지 않은 항체 35㎕를 주사하여 활성화하였다. 반응하지 않은 부위를 35㎕의 1M 에탄올아민-HCL, pH 8.5(GE Healthcare, #BR-1000-50)로 급랭시켰다. 이 절차는 일반적으로 연결된 항체의 15,000 반응 유닛(response units, RU)을 산출하였다. CTLA-4 리간드 인간 CD80-쥐 Ig(hCD80-mIg)(Ancell, #510-820) 또는 인간 CD86-쥐 Ig(hCD86-mIg)(Ancell, #509-820)를 항체-코팅된 센서 칩에 각각 10㎕ 또는 16㎕ 리간드 용액(HBS-EP 완충제[10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% (v/v) 계면활성제 P-20, GE Healthcare, #BR-1001-88] 내에 2㎍/ml 단백질)을 10㎕/분의 유속으로 주사하여 결합시켰다. 리간드 포획 수준은 일반적으로 135-170RU이었다. 변이체 CTLA-4-Ig 단백질(또는 )을 HBS-EP 완충제에서 희석시키고 2분 동안 30㎕/분으로 리간드-코팅된 센서 칩 위로 흐르게 하고, 이어서 동일한 유속으로 단백질을 포함하지 않은 HBS-EP 완충제로 5분 항온처리하였다. hCD86-mIg로부터 매우 느린 해리 속도를 가지는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대하여, 또한 더 긴 해리 시간(예, 20분)을 이용하여 동역학 분석을 수행하였다. 변이체 CTLA-4-Ig 단백질에 대하여 Rmax 신호 수준이 대략 70-100RU의 범위에 있었다. 10mM 글리신 완충제(pH 1.7)를 가지고 50㎕/분으로 3분 항온처리함으로써 사이클 사이의 재생을 실행하였다. 새로운 칩을 실제 실험에 사용하기 전에 포획/결합/재생을 4-5 사이클 실시하였다. 토끼 항-마우스 IgG 포획 항체를 단독으로 포함하는 참조 세포로부터의 데이터는 포획된 hCD80-mIg 또는 hCD86-mIg를 포함하는 유동 세포로부터 얻은 데이터에서 차감하였다. 일반적으로, 500nM 내지 0.2nM 범위의 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 8개의 희석물을 블랭크 참조(blank reference)(HBS-EP 완충제 단독)에 대하여 분석하였다.
일반적인 Biacore 분석의 센서그램(Sensorgram) 기록이 도 5에 나타나 있다. 이 도면은 hCD86-mIg 융합 단백질에 대한 다음 세 개의 융합 단백질의 결합에 의해 생성된 시간 동안(초(s))의 반응(RU)을 보여준다: (1) Orencia® 융합 단백질(대조군으로서 및 비교로서 역할을 함)(Bristol-Myers Squibb Co.; 예컨대, Larson C.P. 등, Am. J. Trans. 5:443-453 (2005) 참조); (2) LEA29Y-Ig 융합 단백질(비교를 위하여); 및 (3) “클론 D3”(또한 D3-IgG2으로도 지칭됨)으로 지정된 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질. D3-IgG2 융합 단백질은 각각의 모노머에서 시스테인 잔기 사이에 형성된 하나 이상의 이황화 결합으로 공유적으로 함께 연결된 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질을 포함한다. 상기한 “SDS/PAGE 분석” 섹션에서의 검토를 참조. 각각의 모노머성 융합 단백질은 C-말단에서 서열번호 184 또는 218에 나타낸 인간 IgG2 폴리펩티드의 N-말단으로 공유적으로 융합된 서열번호 159에 나타낸 성숙한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 다이머성 융합 단백질은, 각각의 모노머성 융합 단백질의 D3 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드가 상이한 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드로 대체된 것을 제외하고, 다이머성 D3-IgG2 융합 단백질의 구조와 유사한 구조를 포함할 수 있다.
결합상(association phase)은 관심의 분석물과 관심의 리간드 사이에서의 결합을 반영한다. 도 5에서, 각각의 분석물에 대한 결합상은 화살표로 표시된 시간 전에 시간에서 곡선으로 표시되며 hCD86-mIg 리간드에 대한 분석물(D3-IgG2, Orencia® 융합 단백질, 또는 LEA29Y-Ig)의 결합으로 특징지어진다. 분석물이 hCD86-mIg 리간드와 결합하는 속도는 곡선에서 반영된다 - 예를 들어, 약 510초에서 시작하는 반응 유닛에서 날카로운 증가율을 참고.
분석의 해리상(dissociation phase)은 도 5에서 화살표로 표시된 시간에서 시작한다. 해리상 동안, 분석물 및 리간드는 그것들의 결합된 형태에서 해리한다. 도 5에서, 분석물이 hCD86-mIg 리간드에서 해리하는 속도는 반응 유닛에서 감소(시간동안 반응 유닛의 감소 속도)로써 표시된다. 이들 데이터에 기초하여, 상대적인 해리 속도 상수(“off” 속도, koff 또는 kd) 및 상대적인 결합 속도 상수(“on” 속도, kon 또는 ka)를 결정할 수 있다. 상호작용의 총 결합활성은 KD, (koff)/ (kon)에 의해 기술할 수 있다. 증가된 결합 활성은 종종 더 낮은 해리 속도에서 명백하다. 동일한, 더 높은, 또는 미미하게 더 낮은 결합 속도가 더 낮은 해리 속도를 동반한다면, 계산된 평형 해리 상수 KD는 더 낮고, 결합활성을 더 커질 것이다. 이 경우에서, hCD86-mIg 리간드에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성보다 더 큰 hCD86-mIg 리간드에 대한 결합 활성을 가지는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 또한 Orencia® 단백질보다 상기 리간드로부터의 더 느린 해리 속도를 가질 것이다. hCD86-mIg 리간드에 대한 LEA29Y-Ig의 결합 활성보다 더 큰 hCD86-mIg 리간드에 대한 결합 활성을 가지는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 또한 LEA29Y-Ig보다 상기 리간드로부터 더 느린 해리 속도를 가질 것이다.
도 5는 hCD86-mIg 리간드로부터 LEA29Y-Ig의 해리 속도가 hCD86-mIg 리간드로부터 Orencia® 단백질의 해리 속도보다 유의하게 더 느리다는 것을 나타낸다. 또한 LEA29Y-Ig는 Orencia® 융합 단백질에 대하여 관찰된 결합 속도와 유사한 hCD86-mIg에의 결합에 대한 결합 속도를 가진다. 따라서, LEA29Y-Ig는 Orencia® 단백질이 가지는 것보다 더 높은 hCD86-mIg에 대한 결합활성을 가진다. 이 발견은 Orencia® 융합 단백질보다 hCD86-mIg리간드에 대하여 더 높은 결합 활성을 가지는 것으로 LEA29Y-Ig를 기술한 이전의 연구와 일치한다(Larson C.P. 등, Am. J. Trans. 5:443-453 (2005)). 도 5는 또한 본 발명의 변이체 D3-IgG2 융합 단백질은 Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질 보다 hCD86-mIg 리간드로부터의 더 느린 해리 속도를 가진다는 것을 나타낸다. D3-IgG2 융합 단백질은 또한 hCD86-mIg 리간드에 대한 Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질의 결합 속도와 비교하여 hCD86-mIg 리간드에 대한 결합의 유사한 (그러나 다소 더 빠른) 결합 속도를 가진다. 이렇게 하여, D3-IgG2 융합 단백질은 Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 hCD86-mIg 리간드에 대하여 더 높은 결합 활성을 보인다. 따라서, D3-IgG2 융합 단백질은 인간과 같은 포유 동물에서 APC상에 생체 내 발현되는, 예컨대, CD86을 포함하여 본래의 CD86에 더 높은 결합 활성으로 결합할 것으로 예상된다. 이 견해는 하기의 실시예에서 검토되는 기능적인 세포-기반 분석으로 추가적으로 뒷받침된다.
본 발명의 다른 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 사용하여 Biacore 분석을 실행하였다. 추가적으로, hCD80-mIg-코팅된 센서 칩 및 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 사용하여 Biacore 분석을 실행하였다. 이들 변이체 분자의 해리 속도 및 결합 활성을 결정하고 해리 속도 및 Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질의 결합 활성과 비교하였다. 대표적인 결과를 표 3 및 4에 나타내었고 하기에 더 상세히 검토한다.
표준
Biacore
데이터 분석.
센서그램의 재생 및 포획 부분의 삭제 후, 샘플을 주사하기 대략 10초 전에 모든 곡선의 5초 평균으로 곡선을 0으로 맞추었다. 블랭크 곡선을 각각의 테스트 곡선에서 차감하였다. 데이터를 “Fit kinetics, Simultaneous ka/kd” 기능을 사용하여 BIAevaluation 소프트웨어(v4.1, GE Healthcare에서 입수가능함)로 분석하였다. 주사 시작 시간을 결합상 전 시간으로서 정의하고 모든 곡선을 0에 가깝게 하였다. 결합상에 대한 데이터 선택은 주사 시작 시간 후 대략 10초 후에 시작하였고 주사 정지 시간 전 대략 10초 전에 끝냈다. 주사 정지 시간은 해리상과 관련된 신호 스파이크의 외관 전의 시간으로서 정의하였다. 해리상은 주사 종료 시간 후 10초 후에 시작하는 것으로 선택하였고 5분 해리상의 280-295초를 포함하였다. 1:1 랭무어(Langmuir) 모델은 반응 A + B <=> AB을 기술한다. 이 모델은 관심의 단일의 단백질(예, 수용체)에 결합하는 단일의 리간드를 나타낸다. BIAevaluation 소프트웨어로부터 1:1 랭무어 모델을 사용하여 결합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)를 결정하였고 평형 해리 상수, KD를 계산하였다. KD = kd /ka. KD = ([A].[B])/[AB]. 평형 해리 상수 KD는 평형 결합 상수 KA의 역과 동등하다. KD = 1/ KA. 반응에 대한 속도 방정식(분석물 A 더하기 리간드 B는 복합체 AB를 산출함)은 d[B]/dt = - (ka [A][B] - kd [AB]) 및 d[AB]/dt = ka[A][B] - kd[AB]이고, A = 주사된 분석물, B = 자유 리간드, 및 t = 시간이다. [AB] 대신 R, 주어진 시간에서 Biacore 반응 유닛(RU) R, [B] 대신 Rmax-R, [A] 대신 C(분석물 농도)를 대용하여, Biacore 유닛에서 순 속도 표현은 dR/dt = kaC(Rmax-R) - kdR이고, 총 반응 = [AB] + RI에 대하여 t0에서 R = 0, B[0] = Rmax, 및 AB[0] = 0 RU이다. 벌크 이동(RI)을 0으로 조정하고, Rmax, ka 및 kd를 모든 곡선에 대하여 전체적으로 맞추었다.
상기 기술된 표준 동역학 분석 및 데이터 분석을 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 단백질 제조물 뿐만 아니라 LEA29Y-Ig 및 Orencia® 융합 단백질에서 실행하였다. 표 3 및 4는 본 발명의 대표적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대한 결합 데이터를 요약한 것이다.
표 3은 상기 기술된 표준 Biacore 분석으로 측정된, hCD86-mIg에 대한 대표적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 결합 활성을 나타낸다. 특히, 표 3은 각 변이체 CTLA-4Ig 융합 단백질의 이름; 모노머성 변이체 CTLA-4 ECD 융합 단백질의 폴리펩티드 서열에 대응하는 서열번호(sequence identification number, SEQ ID NO); hCD86-mIg에 대한 변이체 단백질의 결합 활성에 기초하여 결정한 평형 해리 상수(KD(몰(M)); 및 hCD86-mIg에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성에 대하여 hCD86-mIg에 대한 각각의 변이체 CTLA-4-Ig의 결합 활성을 나타낸다. 이 상대적인 결합 활성(제일 오른쪽 컬럼에 나타냄)은 hCD86-mIg에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성과 비교하여 hCD86-mIg에 대한 변이체 융합 단백질의 결합 활성에서 개선도 배수(fold improvement)로서 나타내었다. 표 3에서 본 발명의 각각의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 일반적으로 두 개의 동일한 모노머성 융합 단백질을 포함하는 다이머성 융합 단백질로서 용액에 존재하며, 여기에서 각각의 모노머성 단백질은 C-말단에서 서열번호 184 또는 218의 서열을 포함하는 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 직접적으로 융합된 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(예, D1, D1T, D2, D3, D4 등으로 명명됨)를 포함한다. 각각의 그러한 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig는 당해 분야에 알려진 표준 기술을 사용하여 만들 수 있다. 대안적으로, 각각의 그러한 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머는 상기한 실시예 3에서 제시한 방법들을 사용하여 만들 수 있다. 간단하게, 표 3에서 확인된 특정 변이체 CTLA-4 ECD를 인코딩하는 핵산 서열(예, 표 3에서 확인된 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열)은 IgG2 Fc 융합 벡터로 클로닝할 수 있고, 포유류 세포는 상기 벡터로 형질감염시킬 수 있으며, 그 결과로 생기는 융합 단백질은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현시키고, 정제하며 평가할 수 있다. 각각의 변이체 CTLA-4 ECD에 대한 예시적인 핵산 서열은 본 명세서와 함께 포함된 서열 목록에 나타내었다. 각각의 모노머성 융합 단백질은 변형된 IgG1 Fc 에 융합된 야생형 인간 CTLA-4 ECD를 포함하는 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 Orencia® 융합 단백질은, 참조로서, 즉 hCD86-mIg에의 결합 활성을 1로 맞추는 역할을 한다. LEA29Y-Ig 융합 단백질 및 인간 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대한 KD 값을 또한 나타내었다. 추가로, Orencia® 단백질의 hCD86-mIg 결합 활성과 비교하여 LEA29Y-Ig의 hCD86-mIg 결합 활성에서 개선도 배수를 또한 나타내었다. hCD86-mIg에 대한 CTLA-4-IgG2 및 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성은 대략 동일하며, 이는 인간 CTLA-4-IgG2에 존재하는 인간 IgG2 폴리펩티드와 Orencia® 단백질에 존재하는 변형된 IgG1 사이의 차이는 이들 분자의 각각의 hCD86-mIg 결합 친화도에 대하여, 기여하더라도, 거의 기여하지 않음을 확인해준다. 하기 실시예 5에서 더 상세히 검토되는 것과 같이, 우리는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 폴리펩티드와 Orencia® 단백질(또는 LEA29Y-Ig) 사이에서 면역억제 기능 활성도에서의 차이는 상이한 IgG 아이소타입(isotype)을 포함하는 각각의 Ig Fc 영역에 기인할 수 없다는 것을 확인하였다.
표 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 대표적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 다음의 hCD86-mIg 결합 활성을 가진다: (1) 인간 CTLA-4-IgG2(“hCTLA-4-IgG2”)(두 개의 공유적으로 연결된 모노머성 융합 단백질을 포함하며, 각각의 그러한 모노머성 단백질은 IgG2 Fc 폴리펩티드에 융합된 인간 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함함)의 결합 활성보다 적어도 대략 동일하거나 더 큰 결합 활성; (2) hCD86-mIg 리간드에 대한 Orencia® 단백질의 결합 활성보다 적어도 대략 동일하거나 더 큰 결합 활성; 및/또는 (3) hCD86-mIg 리간드에 대한 LEA29Y-Ig의 결합 활성보다 적어도 대략 동일하거나 더 큰 결합 활성. hCD86-mIg리간드에 대한 Orencia® 단백질의 결합 활성에 대하여 hCD86-mIg 리간드에 대한 결합 활성에서 개선도 배수를 각각의 CTLA-4-Ig 변이체에 대하여 나타내었다(표 3의 4번째 컬럼).
대부분의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 hCD86-mIg로부터의 Orencia® 융합 단백질의 해리 속도보다 더 느린 hCD86-mIg 융합 단백질의 해리 속도를 가지는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음). 많은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 hCD86-mIg 리간드에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 속도보다 더 큰 hCD86-mIg에 대한 더 큰 결합 속도를 가지는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음).
표 3에 나타낸 모든 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 인간 CTLA-4-IgG2 또는 Orencia® 융합 단백질의 hCD86-mIg 평형 해리 상수(KD)보다 더 낮은 hCD86-mIg 평형 해리 상수를 가졌다. 또한, 표 3에 나타낸 대부분의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 LEA29Y-Ig의 hCD86-mIg 평형 상수보다 더 낮은 hCD86-mIg 평형 해리 상수를 가졌다.
표 3에 나타낸 모든 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 hCD86-mIg에 대한 인간 CTLA-4-IgG2 또는 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성보다 더 큰 hCD86-mIg에 대한 결합 활성을 가졌다(Orencia® 융합 단백질에 대한 hCD86-mIg 결합 활성에서 계산된 개선도 배수는 표 3의 4번째 컬럼에 나타내었다). 또한 표 3에 나타낸 많은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 hCD86-mIg에 대한 LEA29Y-Ig의 결합 활성보다 더 큰 hCD86-mIg에 대한 결합 활성을 가졌다(표 3의 4번째 컬럼).
예컨대, 대상체에서 면역 반응을 억제하는 치료적 및/또는 예방적 방법(예를 들어, 면역저해 또는 면역억제가 바람직한 인간과 같은 포유류의 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료에서), 수용체(예, 인간과 같은 포유류)에 의한 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법, 및 본 명세서의 다른 부분에 기술된 다른 방법에서와 같이, Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질이 가지는 것보다 더 높은 hCD86-mIg 리간드에 대한 결합 활성을 가지는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig는 각각 hCTLA-4-IgG2, Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질과 비교하여 증가된 생체 내 면역억제 효능을 가질 것이다.
| 융합 단백질 (다이머) |
서열번호* (예컨대, 변이체 CTLA-4 ECD의 서열번호) |
hCD86-mIg KD (M) |
hCD86-mIg에 대한 결합 활성 (Orencia® 융합 단백질 다이머에 대함) |
| 인간 CTLA-4-IgG2 | 162 | 3.95 x 10-9 | 1.32x |
| Orencia® 융합 단백질 다이머 | 164 | 5.23 x 10-9 | 1 |
| LEA29Y-Ig | 166 | 1.05 x 10-9 - 5.23 x 10-10 | 5x - 10x |
| D1-IgG2 | 58 | 2.65 x 10-9 - 5.23 x 10-10 | 2x - 10x |
| D1T-IgG2 | 59 | 5.23 x 10-10 - 2.62 x 10-10 | 10x - 20x |
| D2-IgG2 | 60 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-IgG2 | 61 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D4-IgG2 | 62 | 2.65 x 10-9 - 5.23 x 10-10 | 2x - 10x |
| D5-IgG2 | 63 | 2.65 x 10-9 - 5.23 x 10-10 | 2x - 10x |
| D6-IgG2 | 64 | 2.65 x 10-9 - 5.23 x 10-10 | 2x - 10x |
| D20-IgG2 | 65 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D21-IgG2 | 66 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D23-IgG2 | 67 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D24-IgG2 | 68 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D26-IgG2 | 69 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D27-IgG2 | 70 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D28-IgG2 | 71 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D29-IgG2 | 72 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D31-IgG2 | 73 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-1-IgG2 | 1 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-2-IgG2 | 2 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-3-IgG2 | 3 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-4-IgG2 | 4 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-5-IgG2 | 5 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-6-IgG2 | 6 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-7-IgG2 | 7 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-8-IgG2 | 8 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-9-IgG2 | 9 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-11-IgG2 | 10 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-12-IgG2 | 11 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-14-IgG2 | 12 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-15-IgG2 | 13 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-16-IgG2 | 14 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-17-IgG2 | 15 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-19-IgG2 | 16 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-20-IgG2 | 17 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-21-IgG2 | 18 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-22-IgG2 | 19 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-23-IgG2 | 20 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-24-IgG2 | 21 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-25-IgG2 | 22 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-26-IgG2 | 23 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-27-IgG2 | 24 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-28-IgG2 | 25 | 5.23 x 10-10 - 2.62 x 10-10 | 10x - 20x |
| D3-29-IgG2 | 26 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-30-IgG2 | 27 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-31-IgG2 | 28 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-32-IgG2 | 29 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-33-IgG2 | 30 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-34-IgG2 | 31 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-39-IgG2 | 32 | 5.23 x 10-10 - 2.62 x 10-10 | 10x - 20x |
| D3-50-IgG2 | 33 | 2.62 x 10-10 - 1.31 x 10-10 | 20x - 40x |
| D3-52-IgG2 | 34 | 5.23 x 10-10 - 2.62 x 10-10 | 10x - 20x |
| D3-53-IgG2 | 35 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-54-IgG2 | 36 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-56-IgG2 | 38 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-62-IgG2 | 44 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-65-IgG2 | 47 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-66-IgG2 | 48 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-69-IgG2 | 50 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-70-IgG2 | 51 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-71-IgG2 | 52 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-72-IgG2 | 53 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-73-IgG2 | 54 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-74-IgG2 | 55 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-75-IgG2 | 56 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
| D3-76-IgG2 | 57 | < 1.31 x 10-10 | > 40x |
*주: 인간 CTLA-4-IgG2, Orencia®, 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질에 대하여 표 3에 나타낸 서열번호는 이들 Ig 융합 단백질 각각의 폴리펩티드 서열의 서열번호이다. 각각의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대하여 표 3에 나타낸 서열번호는 확인된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 변이체 CTLA-4 ECD의 폴리펩티드 서열을 확인한다. 이 데이터는 N-말단에서 서열번호 184 또는 218에 나타낸 IgG2 Fc 폴리펩티드의 C-말단으로 융합된 변이체 CTLA-4 ECD를 포함하는 변이체 CTLA-4-Ig(예, 서열번호 1-48 및 58-73의 임의의 것)에 관한 것이다. 상기 융합 단백질을 만드는 방법은 당해 분야에 알려져 있고 본 명세서에 기술되어 있다. 그러나, 상기에서 언급한 바와 같이, 우리는 서열번호 184에 나타낸 예측된 hIgG2 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 만들어진 변이체 CTLA-4-Ig는, 일반적으로 예측된 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며; 이렇게 하여 변이체 CTLA-4-IgG2의 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 218에 나타낸 것이며, 상기 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 184에 나타낸 서열과 비교하여 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는다는 것을 실험으로 알아내었다. C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는 예시적인 융합 단백질 서열은 서열번호 205-214, 219, 및 221에 나타나 있다.
표 4는 표준 Biacore 분석으로 측정된, hCD80-mIg에 대한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 결합 활성을 나타낸다. 특히, 표 4는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 클론 이름; 모노머성 변이체 CTLA-4 ECD 융합 단백질의 폴리펩티드 서열에 대응하는 서열번호(sequence identification number, SEQ ID NO); hCD80-mIg 리간드 결합 활성 분석에 대한 평형 해리 상수(KD(몰(M)); 및 hCD80-mIg 리간드에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성에 대하여 hCD80-mIg 리간드에 대한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 결합 활성을 나타낸다. 각각의 변이체 단백질에 대하여, hCD80-mIg 리간드에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성과 비교하여 hCD80-mIg 리간드에 대한 결합 활성에서 개선도 배수를 나타내었다(표 4의 4번째 컬럼). Orencia® 융합 단백질은, 참조로서, 즉 hCD80-mIg에의 결합 활성을 1로 맞추는 역할을 한다. 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 일반적으로 다이머성 융합 단백질로서 용액에 존재한다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 다음의 hCD80-mIg 리간드에 대한 결합 활성을 가진다: (1) 인간 CTLA-4-IgG2의 결합 활성보다 적어도 대략 동일하거나 더 큰 결합 활성; (2) hCD80-mIg 리간드에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성보다 적어도 대략 동일하거나 더 큰 결합 활성; 및/또는 (3) hCD80-mIg 리간드에 대한 LEA29Y-Ig의 결합 활성보다 적어도 대략 동일하거나 더 큰 결합 활성. 상기 검토된 바와 같이, 각각의 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 다이머는 상기 실시예 3에 제시한 방법들을 사용함으로써 만들 수 있다.
많은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 hCD80-mIg 리간드로부터의 Orencia® 융합 단백질의 해리 속도보다 대략 동일하거나 더 큰 hCD80-mIg 융합 단백질로부터의 해리 속도를 가지는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음). 일부 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 hCD80-mIg 리간드에 대한 Orencia® 융합 단백질의 결합 속도보다 대략 동일하거나 더 큰 hCD80-mIg에 대한 결합 속도를 가지는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음).
표 4에 나타낸 많은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 인간 CTLA-4-IgG2 또는 Orencia® 융합 단백질의 hCD80-mIg 평형 해리 상수(KD)보다 더 낮은 hCD80-mIg 평형 해리 상수를 가졌다. 또한, 표 4에 나타낸 수 개의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 LEA29Y-Ig의 hCD80-mIg 평형 상수와 적어도 대략 동일한 hCD80-mIg 평형 해리 상수를 가졌다.
표 4에 나타낸 많은 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 hCD80-mIg에 대한 인간 CTLA-4-IgG2 또는 Orencia® 융합 단백질의 결합 활성보다 더 큰 hCD80-mIg에 대한 결합 활성을 가졌다(Orencia® 융합 단백질에 대한 hCD80-mIg 결합 활성에서의 개선도 배수는 4번째 컬럼에 나타내었다). 추가적으로, 표 4에 나타낸 수 개의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 hCD80-mIg에 대한 LEA29Y-Ig의 결합 활성과 적어도 대략 동일한 hCD80-mIg에 대한 결합 활성을 가졌다.
예컨대, 대상체에서 면역 반응을 억제하는 치료적 및/또는 예방적 방법(예를 들어, 면역저해 또는 면역억제가 바람직한, 인간과 같은 포유류의 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료에서), 수용체(예, 인간과 같은 포유류)에 의한 공여자의 조직 또는 장기 이식의 거부를 저해하는 방법, 및 본 명세서의 다른 곳에 기술된 다른 방법에서와 같이, hCTLA-4-IgG1, Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질이 가지는 것보다 더 높은 hCD80-mIg에 대한 결합 활성을 가지는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig는 각각 hCTLA-4-IgG2, Orencia®, 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질과 비교하여 증가된 생체 내 면역억제 효능을 가질 것이다.
| 융합 단백질 (다이머) |
서열번호* (예컨대, 변이체 CTLA-4 ECD의 서열번호) |
hCD80-mIg KD (M) |
hCD80-mIg에 대한 결합 활성 (Orencia® 융합 단백질 다이머에 대함) |
| hCTLA-4-IgG2 | 162 | 6.55 x 10-10 | 1.34x |
| Orencia® 융합 단백질 다이머 | 164 | 8.77 x 10-10 | 1 |
| LEA29Y-Ig | 166 | 4.39 x 10-10 - 2.19 x 10-10 | 2x - 4x |
| D1-IgG2 | 58 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D1T-IgG2 | 59 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D2-IgG2 | 60 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-IgG2 | 61 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D4-IgG2 | 62 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D5-IgG2 | 63 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D6-IgG2 | 64 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D20-IgG2 | 65 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D21-IgG2 | 66 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D23-IgG2 | 67 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D24-IgG2 | 68 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D26-IgG2 | 69 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D27-IgG2 | 70 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D28-IgG2 | 71 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D29-IgG2 | 72 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D31-IgG2 | 73 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-1-IgG2 | 1 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-2-IgG2 | 2 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-3-IgG2 | 3 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-4-IgG2 | 4 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-5-IgG2 | 5 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-6-IgG2 | 6 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-7-IgG2 | 7 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-8-IgG2 | 8 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-9-IgG2 | 9 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-11-IgG2 | 10 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-12-IgG2 | 11 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-14-IgG2 | 12 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-15-IgG2 | 13 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-16-IgG2 | 14 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-17-IgG2 | 15 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-19-IgG2 | 16 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-20-IgG2 | 17 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-21-IgG2 | 18 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-22-IgG2 | 19 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-23-IgG2 | 20 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-24-IgG2 | 21 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-25-IgG2 | 22 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-26-IgG2 | 23 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-27-IgG2 | 24 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-28-IgG2 | 25 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-29-IgG2 | 26 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-30-IgG2 | 27 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-31-IgG2 | 28 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-32-IgG2 | 29 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-33-IgG2 | 30 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-34-IgG2 | 31 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-39-IgG2 | 32 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-50-IgG2 | 33 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-52-IgG2 | 34 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-53-IgG2 | 35 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-54-IgG2 | 36 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-56-IgG2 | 38 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
| D3-62-IgG2 | 44 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-65-IgG2 | 47 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-66-IgG2 | 48 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-69-IgG2 | 50 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-70-IgG2 | 51 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-71-IgG2 | 52 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-72-IgG2 | 53 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-73-IgG2 | 54 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-74-IgG2 | 55 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-75-IgG2 | 56 | < 4.39 x 10-10 | > 2x |
| D3-76-IgG2 | 57 | 1.75 x 10-9 - 4.39 x 10-10 | 0.5x - 2x |
*주: 인간 CTLA-4-IgG2, Orencia®, 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질에 대하여 표 4에 나타낸 서열번호는 이들 Ig 융합 단백질 각각의 폴리펩티드 서열의 서열번호이다. 각각의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대하여 표 4에 나타낸 서열번호는 확인된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 변이체 CTLA-4 ECD의 폴리펩티드 서열을 확인한다. 이 데이터는 N-말단에서 서열번호 184 또는 218에 나타낸 IgG2 Fc 폴리펩티드의 C-말단으로 융합된 변이체 CTLA-4 ECD를 포함하는 변이체 CTLA-4-Ig(예, 서열번호 1-48 및 58-73의 임의의 것)에 관한 것이다. 그러나, 우리는 서열번호 184에 나타낸 예측된 hIgG2 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 만들어진 변이체 CTLA-4-Ig는, 일반적으로 예측된 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며; 이렇게 하여 변이체 CTLA-4-IgG2의 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 218에 나타낸 것이며, 상기 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 일반적으로 서열번호 184에 나타낸 서열과 비교하여 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는다는 것을 LCMS 분석에 의해 실험으로 알아내었다. C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는 예시적인 융합 단백질 서열은 서열번호 205-214, 219, 및 221에 나타내었다.
모노머성
동역학 분석.
변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 결합 특성의 추가 확인을 1가(monovalent) 동역학 결합 분석으로 구하였다. 이들 분석은 이동상에서 센서 칩에 코팅된 2가 테스트 단백질(예, 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질) 및 1가 리간드(파파인-소화된 hCD86-mIg)의 결합 동역학을 측정한다. 염소 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch, #109-005-098)를 제조자의 프로토콜에 따라서 CM5 센서 칩과 연결하였고, 일반적으로 15,000 반응 유닛(RU)을 산출하였다. 리간드를 HBS-EP 완충제에서 10㎕/분의 유속으로 2㎍/ml 용액의 다이머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 10㎕로 항체-코팅된 센서 칩을 항온처리함으로써 포획하였다. 리간드 포획 수준은 일반적으로 25-80RU이었다. 모노머성 hCD86-mIg 리간드(Hermanson, G.T. BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, 1996에 기술된 바와 같이, hCD86-mIg의 파파인 소화 및 단백질-A 세파로오스 흡착에 의해 만들어짐)를 HBS-EP 완충제에서 희석하고 2분 동안 30㎕/분에서 테스트 단백질-코팅된 센서 칩을 통해 흐르게 하였고, 이어서 단백질을 포함하지 않은 HBS-EP 완충제로 같은 유속으로 2분 항온처리하였다. 사이클 사이의 재생을 10mM 글리신 완충제(pH 1.7)로 30㎕/분에서 3분 항온처리함으로써 실행하였다. 일반적으로, 3000nM 내지 0.2nM 범위의 모노머성 분석물 단백질의 8개의 희석물을 이중으로 블랭크 참조(HBS-EP 완충제 단독)에 대하여 분석하였다. 변이체 CTLA-4-Ig 단백질에의 결합에 대한 Rmax 신호 수준은 10-60RU의 범위이었다.
동역학 분석에 대하여, 모노머성 결합 분석으로부터의 데이터는 주사 시작 및 정지 시간으로부터 5초에 결합 데이터 선택이 시작되고 끝나며, 주사 종결 시간 후 5초 후에 해리 데이터 선택이 시작되었고, 일반적으로 해리 기간의 1-60초를 포함한다는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 선택하였다. 그러한 데이터는 또한 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 정류 상태(steady state) 평형 친화도에 대하여 분석하였다. BIAevaluation “General fit: average” 기능을 사용하여 샘플 주사의 종결 근처에서 5-20 범위에서 각각의 농도에 대한 정류 상태 결합 수준(Responseeq (“Req” 값)을 평균하였다. 식 Req=KA x C x Rmax/(KA x C x n+1)에 따라서 BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 Req 대 농도 플롯으로부터 정류 상태 친화도를 결정하였고, C는 분석물 농도이고 입체 방해 요인(steric interference factor)인 n은 1이며, KD= 1/ KA이다. 일부 경우에서, 해리 후의 잔여 플랫 R-값 자취(residual flat R-value trace)로 나타낸 실질적인 비특이적 결합을 관찰하였다. Req 값에서 잔여 R-값을 차감하여 상기 데이터를 정정하였다. 그 다음 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software, Inc.)에서 “한 부위-특이적 결합” 모델을 사용하여 KD를 계산하였다.
이 모노머성 결합 분석은 대표적인 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 부분집합(subset)에서 실행하였고, 그 결과는 표 5에 요약하였다. 대체로, 표준 동역학 분석에서 모노머성 결합 분석에서 관찰된 LEA29Y-Ig에 대하여 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에의 hCD86 ECD 결합에서 개선도는 LEA29Y-Ig에 대하여 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에의 hCD86-mIg 결합에 대하여 관찰된 개선도와 유사하였다. 그러한 결과는 변이체 단백질에 대한 결합 동역학에서 관찰된 개선은 변이체 단백질의 결합 친화도에서의 실제 개선으로 인한 것이고 응집된 단백질 제조물의 더 높은 결합가(valency)에 의한 잠재적인 산물에 의한 것이 아니라는 결론을 뒷받침한다.
| 융합 단백질 (다이머) |
서열번호* (예컨대, 변이체 CTLA-4 ECD의 서열번호) |
모노머성 hCD86 ECD KD (M) |
모노머성 hCD86 ECD에 대한 결합 활성 (LEA29Y-Ig에 대함) |
| LEA29Y-Ig | 166 | 1.68 x 10-6 | 1 |
| D3-IgG2 | 61 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-4-IgG2 | 4 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-11-IgG2 | 10 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-12-IgG2 | 11 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-14-IgG2 | 12 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-17-IgG2 | 15 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-20-IgG2 | 17 | 8.4 x 10-7- 3.36 x 10-7 | 2x-5x |
| D3-27-IgG2 | 24 | 8.4 x 10-7- 3.36 x 10-7 | 2x-5x |
| D3-29-IgG2 | 26 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-31-IgG2 | 28 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
| D3-53-IgG2 | 35 | < 3.36 x 10-7 | >5x |
*주: LEA29Y-Ig에 대하여 표 5에 나타낸 서열번호는 LEA29Y-Ig 융합 단백질의 폴리펩티드 서열의 서열번호이다. 각각의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대하여 표 5에 나타낸 서열번호는 확인된 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 존재하는 변이체 CTLA-4 ECD의 폴리펩티드 서열을 확인한다. 이 데이터는 N-말단에서 서열번호 184 또는 218에 나타낸 IgG2 Fc 폴리펩티드의 C-말단으로 융합된 변이체 CTLA-4 ECD를 포함하는 변이체 CTLA-4-Ig(예, 서열번호 4, 10-12, 15, 17, 24, 26, 28, 35, 및 61의 임의의 것)에 관한 것이다. 그러나, 우리는 서열번호 184에 나타낸 예측된 hIgG2 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 만들어진 변이체 CTLA-4-Ig는, 일반적으로 예측된 C-말단 리신(K) 잔기를 포함하지 않으며; 이렇게 하여 변이체 CTLA-4-IgG2의 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 서열번호 208에 나타낸 것이며, 상기 hIgG2 Fc 폴리펩티드 서열은 일반적으로 서열번호 184에 나타낸 서열과 비교하여 C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는다는 것을 LCMS 분석에 의해 실험으로 알아내었다. C-말단 리신 잔기를 포함하지 않는 예시적인 융합 단백질 서열은 서열번호 205-214, 219, 및 221에 나타내었다. C-말단 리신 잔기를 포함하는 예시적인 융합 단백질 서열은 서열번호 74-79, 197-200, 220, 및 222에 나타나 있다.
실시예 5
인간
PBMC
증식 분석을 이용한
CTLA
-4
변이체의
생물학적 활성의 측정(항-CD3 항체 자극).
CTLA-4-Ig 및 이의 특정 변형체는 시험관 내에서 T 세포 증식의 강력한 저해제인 것으로 나타났다(예, Larson 등, Am. J. Transplant. 5, 443 참조). 상기 분석에서 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 개선된 활성을 측정하기 위하여 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 증식 측정을 개발하였다.
인간 혈액(공여자 프로그램으로부터 새로이 수집함)을 같은 부피의 PBS로 희석하고 분별하여 제조자가 추천한 조건에 따라 히스토페이크(Histopaque, Sigma, #10771) 피콜(Ficoll) 경사를 이용하여 PBMC를 분리하였다. PBMC를 성장 배지(10% FBS(Hyclone #SV30014.03) 및 1x PSG(Invitrogen, #10378-016)로 보충한 DMEM/F12 배지)에서 희석하고 1 x 105세포/웰의 밀도로 96-웰 배양 플레이트(BD Biosciences, #353077)에 추가하였다. 테스트 화합물을 연속적으로 성장 배지에서 희석하고 세 개의 웰씩으로 하여 웰에 첨가하였다. 최종 농도 5㎍/ml로 마우스 항-인간 CD3 항체(BD Pharmingen: 555329)를 첨가하여 세포 증식을 시작하였다. 37℃에서 2일 동안 항온처리한 후 3H 티미딘(GE Healthcare, #TRK758-5MCI)을 1μCi/웰로 첨가하여 플레이트를 37℃에서 추가 16시간 동안 항온처리하였다. 제조자가 추천한 조건을 사용하여 세포 수확기(FilterMate Omnifilter-96 Harvester)로 세포를 수확하였고 신틸레이션 계수기(Wallac Trilux, #1450-421)를 사용하여 3H 티미딘 혼입에 대하여 측정하였다. 3H 티미딘 혼입(3H 티미딘 흡수)의 정도는 T 세포 증식의 정도를 나타낸다. 3H-티미딘 혼입을 표준 기술로 측정한다. T 세포의 증식은 세 개의 웰의 분당 계수(counts per minute, cpm)의 평균으로 표시한다.
세포 증식 데이터를 비선형 회귀 곡선 피트 모델(non-linear regression curve fit model)(S자 모양 용량-반응, 가변성 경사) 및 최소제곱 피트 모델(least squares fit method)을 사용하여 GraphPad Prism 5 소프트웨어로 분석하였다. IC50(또한 IC50으로 나타냄) 파라미터 및 결과로부터 그것의 관련된 결과로부터의 95% 신뢰구간을 기록하였다(표 6). 도 6은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 세트-즉, D3-04-IgG2, D3-11-IgG2, D3-12-IgG2, 및 D3-14-IgG2 융합 단백질-를 수반하여 대표적인 PBMC 증식 분석(항-CD3 항체 자극을 사용함)으로부터의 세포 증식 곡선을 나타낸다. 그래프는 3H 티미딘 혼입(분당 계수(cpm)) 대 단백질 농도(나노몰(nM))의 플롯이다. 세포 증식의 정도를 나타내는 3H 티미딘 혼입(3H 티미딘 흡수)을 표준 기술로 측정한다.
Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함하였다. 이들 결과는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig Ig 융합 단백질은 시험관 내에서 폴리클론성 T 세포 활성 또는 T 세포 증식을 저해하거나 또는 억제하는데 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질(들) 보다 유의하게 더 높은 효능 또는 더 큰 능력을 가진다는 것을 설명한다.
본 발명의 다른 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 사용하여 PBMC 증식 분석을 실행하였다. 표 6은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 대표적인 세트에 대한 데이터의 요약을 제공한다. 표 6은 PBMC 증식 분석(항-CD3 항체 자극을 이용)에서 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 대 대조군(Orencia®, hCTLA-4-IgG2, 및 LEA29Y-I 융합 단백질)에 대한 평균 IC50 값(나노몰(nM))의 비교를 나타낸다. IC50 값은 시험관 내에서 T 세포 증식의 50% 저해를 위해 요구되는 화합물(예, 변이체 CTLA-4-Ig, hCTLA-4-IgG2, Orencia®, 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질)의 농도를 나타낸다. 개별적인 실험으로부터의 IC50 값을 평균하여 평균 IC50 값을 제공하였고, 이는 통계 분석에 사용하였다. 사후 던넷(Dunnett) 또는 본페로니(Bonferroni) 검정으로 일원분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 변이체 CLTA-4-Ig 융합 단백질 및 hCTLA-4-IgG2를 각각 Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질과 비교하였다(C.W. Dunnett, New Tables for Multiple Comparisons with a Control, Biometrics 20(3):482-491 (Sept. 1964); Abdi, Herve, “The Bonferroni and Sidak corrections for multiple comparisons”, in ENCYCLOPEDIA OF MEASUREMENT AND STATISTICS (N.J. Salkind ed., Thousand Oaks, CA 2007); 또한 월드와이드웹 상 웹 주소 utdallas.edu/~herve/Abdi-Bonferroni2007-pretty.pdf.에서 이용가능함). 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드(클론 D24, D3-07, D3-15 및 D3-16) 중의 하나로 이루어진 Ig 융합 단백질의 통계 분석은 n = 1이므로 실행하지 않았다. 용어 “SD (평균 log IC50)”는 평균 log IC50 값에서 표준 편차를 나타낸다.
| 융합 단백질 (다이머) |
평균 IC50 (nM) |
평균 Log IC50 (nM) | SD (평균 Log IC50) (nM) |
| Orencia® 융합 단백질 다이머 | 5.16 | 0.71 | 0.51 |
| hCTLA-4-IgG2 | 8.46 | 0.93 | 0.43 |
| LEA29Y-Ig | 0.481 | -0.32 | 0.54 |
| D3-4-IgG2 | 0.051,2 | -1.27 | 0.45 |
| D3-7-IgG2 | 0.12 | -0.93 | NA |
| D3-11-IgG2 | 0.081,2 | -1.07 | 0.40 |
| D3-12-IgG2 | 0.061,2 | -1.27 | 0.17 |
| D3-14-IgG2 | 0.071,2 | -1.17 | 0.15 |
| D3-15-IgG2 | 0.21 | -0.69 | NA |
| D3-17-IgG2 | 0.041,2 | -1.36 | 0.37 |
| D3-20-IgG2 | 0.071,2 | -1.19 | 0.37 |
| D3-26-IgG2 | 0.151 | -0.83 | 0.49 |
| D3-27-IgG2 | 0.101,2 | -1.00 | 0.41 |
| D3-29-IgG2 | 0.071,2 | -1.13 | 0.53 |
| D3-30-IgG2 | 0.181 | -0.74 | 0.35 |
| D3-31-IgG2 | 0.041,2 | -1.42 | 0.25 |
| D3-32-IgG2 | 0.101 | -1.00 | 0.47 |
| D3-33-IgG2 | 0.121 | -0.94 | 0.69 |
| D3-34-IgG2 | 0.411 | -0.39 | 0.18 |
| D3-39-IgG2 | 0.471 | -0.33 | 0.21 |
| D3-50-IgG2 | 0.351 | -0.46 | 0.23 |
| D3-52-IgG2 | 0.491 | -0.31 | 0.20 |
| D3-53-IgG2 | 0.021,2 | -1.69 | 0.24 |
| D3-54-IgG2 | 0.171 | -0.77 | 0.22 |
| D3-56-IgG2 | 0.081 | -1.08 | 0.20 |
| D3-62-IgG2 | 0.051,2 | -1.29 | 0.23 |
| D3-69-IgG2 | 0.051,2 | -1.34 | 0.19 |
| D3-70-IgG2 | 0.081 | -1.10 | 0.10 |
| D3-71-IgG2 | 0.05 | -1.32 | NA |
| D3-72-IgG2 | 0.031,2 | -1.54 | 0.19 |
| D3-73-IgG2 | 0.231 | -0.64 | 0.25 |
| D3-75-IgG2 | 0.081 | -1.11 | 0.33 |
| D3-76-IgG2 | 0.131 | -0.88 | 0.36 |
| D3-IgG2 | 0.141 | -0.85 | 0.13 |
| D24-IgG2 | 0.12 | -0.93 | NA |
표 6에 나타낸 위첨자는 다음과 같다: 1사후 던넷(Dunnett) 검정을 이용하여 일원분산분석(1 way ANOVA)으로 결정된 바와 같이, Orencia와 p<0.05으로 통계적으로 상이함. 2사후 본페로니(Bonferroni) 검정을 이용하여 일원분산분석으로 결정된 바와 같이, LEA와 p<0.05으로 통계적으로 상이함. D3-7, D3-15, D3-71 및 D24 변이체 CTLA-4 ECD를 포함한 융합 단백질을 한번 테스트하였으므로, 따라서 어떠한 통계 비교를 실행할 수 없었다. 주: 표 6에서 용어 “NA”는 “이용 불가능함”을 의미한다.
통계 분석은 적어도 두 가지의 별개의 분석에서 테스트하고 위첨자 (1)(표 6을 참조)로 지정한 모든 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia® 및 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질보다 효능면에서 통계적으로 우수함을 밝혔다(p < 0.05)(즉, Orencia® 및 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질보다 시험관 내 PBMC 분석에서 T 세포 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼). 상기에서 검토된 사후 던넷(Dunnett) 및 본페로니(Bonferroni) 검정을 사용하여 일원분산분석(one-way ANOVA)으로 결정된 바와 같이, 위첨자 (2)(표 6을 참조)로 지정한 것은 또한 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 효능면에서 통계적으로 우수하였다(p < 0.05)(즉, LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 시험관 내 PBMC 분석에서 T 세포 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼). 변형된 IgG1 Fc(Orencia®에서와 같음) 또는 야생형 IgG2 Fc(hCTLA4-IgG2에서와 같음)를 포함하는 인간 CTLA-4 융합 단백질 사이에 통계적인 상이함은 없었다. 이 결과는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(각각 인간 IgG2 Fc를 포함함)과 Orencia® 또는 hCTLA4-IgG2 사이에서 표 6에 나타낸 기능적인 활성에서의 상이함은 CTLA-4 ECD 영역에서 만들어진 아미노산 변화(즉, 아미노산 치환)의 직접적인 결과 때문이었음을 의미한다. 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질과, 예를 들어 Orencia® 변형된 IgG1 Fc를 포함함) 사이에서 기능적인 활성에서의 상이함은 각각의 Ig Fc 폴리펩티드 서열에서의 상이함 때문이 아니었다.
Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질과 비교하여, 시험관 내 분석에서 T 세포 증식을 억제하거나 저해하는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합단백질의 활성이 증가된다면, 상기 변이체 단백질은 또한 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질과 비교하여 생체 내에서 치료적 및/또는 예방적 방법에서 증가된 면역억제 효능을 보일 것으로 여겨진다. 본 발명의 각각의 그러한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대하여 생체 내 방법 또는 응용, 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 억제하거나 저해하는 치료적 및/또는 예방적 방법(예컨대, 인간과 같은 포유류에서 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료), 수용자에 의한(예컨대 인간과 같은 포유류에 의한) 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 억제하거나 저해하는 방법, 및/또는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 다른 치료 또는 진단 방법에서 T 세포 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰 것으로 여겨진다.
같은 통계적 분석을 적용하여, 우리는 Orencia® 융합 단백질(인간 CTLA-4 ECD-변이체 IgG1을 포함함)과 인간 CTLA-4-IgG2 사이에 어떠한 통계적인 상이함이 없음을 알아내었다. 따라서, 이들 분자(즉, Orencia® 융합 단백질의 변이체 IgG1 및 hCTLA-4-IgG2의 인간 IgG2)의 Ig 도메인에서 상이함은 이들 분자의 기능성에 영향을 미치지 않는 것으로 여겨진다. 도 11을 참조. Orencia® 융합 단백질의 증가한 용량으로 관찰된 증식의 저해는 CTLA-4-IgG2로 관찰된 것과 유의하게 상이하지 않았고, 이는 각각의 면역억제 활성은 상이한 IgG 아이소타입에 따라 편향되지 않지만, 오히려 hCTLA-4 ECD 폴리펩티드에 의한 것임을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 폴리펩티드와 Orencia® 융합 단백질(또는 LEA29Y-Ig, 이는 Orencia® 단백질에서와 같은 Ig를 포함하기 때문임) 사이에서 상이한 면역억제 활성은 상이한 IgG 아이소타입을 포함하는 각각의 Fc 영역 때문일 수 없다.
본 발명은 일부 경우에서, 모노머성 인간 CTLA-4 단백질 또는 이의 세포외 도메인보다 T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰, T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력을 가지는 모노머성 변이체 CTLA-4 ECD 단백질을 포함한다. 또한 일부 경우에서, 모노머성 hCTLA-4 Ig 융합 단백질 또는 이의 세포외 도메인보다 T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰, T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력을 가지는 모노머성 변이체 CTLA-4 ECD 융합 단백질을 제공한다. 또한 일부 경우에서, 두 개의 인간 CTLA-4 세포외 도메인을 포함하는 다이머보다 T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰, T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력을 가지는 변이체 CTLA-4 ECD 단백질 다이머를 포함한다. 본 발명의 일부 변이체 CTLA-4 ECD 융합 단백질 다이머(예, 변이체 CTLA-4-ECD-Ig 융합 단백질 다이머)는 일부 경우에서, hCTLA-4-IgG2 융합 단백질 다이머, Orencia® 융합 단백질 다이머, 및/또는 LEA29YIg 융합 단백질 다이머보다 T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰, T 세포 활성화 또는 증식을 억제하거나 저해하는 능력을 가진다.
실시예 6
인간
CD4
+
T 세포 증식 분석을 이용한
변이체
CTLA
-4-
Ig
분자의 생물학적 활성의 측정.
인간 CTLA-4-Ig 및 이의 특정 변형체는 CD28을 통해 CD80 및 CD86의 시그널링을 차단함으로써 T 세포 증식을 저해하는 것으로 보여졌다(Linsley P.S., Immunity 1:793-801 (1994); Larson C. P. 등, Am. J. Transplant. 5:443-453 (2005)). 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 단백질이 CD86-Ig 리간드에 대한 결합 활성에서 개선되었으므로, CD4+ T 세포 증식 분석을 전개하여 CD86을 통한 시그널링을 차단하는 것에서 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 활성을 측정하였다.
전장 인간
CD86
단백질을 인코딩하는
DNA
서열의 제조.
형질감염된 세포의 표면에서의 발현을 위하여 전장 인간 CD86 단백질을 인코딩하는 플라스미드 pCDNA3.1 hB7.2 FL을 제조하였다. 인간 CD86을 인코딩하는 DNA는 서열번호 176에 제시한 CD86-인코딩 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동종성에 기초하여 고안한 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 인간 백혈구에서 유래한 cDNA(BD Biosciences, Cat# HL4050AH)의 PCR 증폭으로 생성하였다. 상기 프라이머는 당해 분야에서 통사의 기술자에게 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 고안되고, 만들어지며, 조립되었고, 필요에 따라 정지 코돈 및 시작 코돈 및 제한 부위를 포함하였다. 채용한 PCR 증폭 절차 또한 당해 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 기술은 예를 들어, 상기한 Berger, Ausubel, 및 Sambrook에 기술되어 있다. 30회의 증폭 사이클 동안(94℃ 30초; 50℃ 30초; 72℃ 60초) 1μM 정방향 및 역방향 프라이머, Herculase 폴리머라아제 완충제(Stratagene; #600260) 및 200μM dNTPs를 사용한 100㎕ PCR 반응에서 50ng cDNA를 주형으로서 사용하였다. PCR 생산물을 QiaQuick PCR 스핀 컬럼(Qiagen #28106)으로 정제하고 제한효소 KpnI 및 NotI로 소화시켰다. 단편을 아가로스-겔 전기영동으로 분리하였고, 제조자의 추천에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, #28704)를 사용하여 정제하였으며, 유사하게 소화된 플라스미드 pCDNA 3.1(+)(Invitrogen, Cat. #V790-20)로 결찰하였다. 결찰을 제조자의 추천에 따라 TOP10 E. coli 세포(Qiagen, Cat. #C4040-10)로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 250rpm에서 밤새 37℃에서 50㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 LB(Luria broth 배지)에서 배양하고 그 다음 제조자가 추천한 조건에 따라 플라스미드 DNA의 맥시프렙(Qiagen; #12362) 군을 만드는데 사용하였다.
전장 인간 CD86 단백질의 예측된 아미노산 서열은 서열번호 175에 나타나 있다. 이 서열에서, 아미노산 잔기 1-23은 예측된 신호 서열을 포함하고, 아미노산 잔기 24-241은 인간 CD86 세포외 도메인을 포함하며, 아미노산 잔기 242-270은 트랜스막 도메인을 포함하고, 아미노산 잔기 271-329는 세포질 도메인을 포함한다.
세포
표면 상에서
인간
CD86
을 발현하는 안정한 세포주의 제조.
20ml 성장 배지(10% FBS(Hyclone Cat.#SV30014.03) 및 1x PSG (Invitrogen, Cat. #10378-016)로 보충한 DMEM/F12 배지(Invitrogen, Cat. #10565-018))를 포함하는 T-75 플라스크 내에서 80-90% 컨플루언스까지 HEK293 세포를 성장시켰다. 제조자가 추천한 조건에 따라 세포를 60㎕ Fugene 6(ROCHE, #11814443001)과 혼합된 10㎍ 플라스미드 DNA(pCDNA3.1 hB7.2 FL)로 형질감염시켰다. 세포를 성장 배지에서 2일 동안 37℃에서 배양하고 선택 배지(300㎍/ml 제네티신(Geneticin)(Invitrogen, #10131-027)을 포함하는 성장 배지)에서 10일 동안 37℃에서 추가적으로 배양하였으며, 2일마다 배지를 바꾸었다. FACS 분류를 할 수 있도록, 제조자가 추천한 조건에 따라 형질감염된 세포를 FITC-표지된 항-CD86 항체(BD Biosciences, #555)로 염색하였다. FITC 신호에 대하여 제어되는 세포-분류기(Dako, MoFlo)를 사용하여, 25% 순화 배지(Conditioned Medium)(형질감염되지 않은(또는 순수한(naive)) 세포 배양물로부터 미리 수확된 성장 배지)를 포함하는 200㎕/웰 성장 배지를 포함하는 96-웰 배양 플레이트(Sigma-Aldrich, #CLS-3596)로 CD86-양성 세포를 개별적으로 분류하였다. 37℃에서 13-19일 동안 배양한 후, 세포를 트립신 가수분해로 분산시키고 0.5ml/웰 성장 배지를 포함하는 24-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 37℃에서 7일 동안 배양한 후, 세포를 트립신 가수분해로 분산시키고 20ml 성장 배지를 포함하는 T-75 플라스크로 옮겼다. 제조자가 추천한 조건에 따라, FACS Caliber(BD Biosciences)를 사용하여 FITC-표지된 항-CD86 항체로 염색된 세포의 FACS분석으로 측정된 바에 따라 세포-표면 CD86 발현의 높은 수준에 기초하여 최종적인 세포주를 선택하였다.
CD4
+
T 세포 증식 분석.
제조자의 추천에 따라서 자기 세포 분리기(RoboSep, StemCell Technologies, #20000)와 함께 EasySep 인간 CD4 양성 Selection Kit(Stemcell Technologies, #18052R)를 사용하여 인간 완충층 프렙(Buffy coat prep)(Stanford University Blood Center, Stanford, CA)으로부터의 CD4+ T 세포를 96% 초과까지로 양을 늘렸다. 양을 늘린 CD4+ T 세포를 10% FBS(Hyclone SV30014.03)로 보충한 Yssel 배지(Yssel's media)(Gemini Bio-Products, #400-102)에서 1 x 106세포/ml의 밀도까지 조정하고 50㎕/웰로 96 웰 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 막-결합 인간 CD86을 발현하는 HEK293 세포를 6000rad(Stanford Research Institute, Menlo Park, CA)에서 방사능 처리를 하였고, 같은 배지에서 1 x 106세포/ml로 조정하였으며, 50㎕/웰로 배양 플레이트에 첨가하였다. 테스트 화합물을 같은 배지에서 연속적으로 희석하였고 세 개의 웰씩으로 하여 웰에 첨가하였다. 마우스 항-인간 CD3 항체(BD Pharmingen: 555329)를 최종 농도 5㎍/ml까지 첨가하여 세포 증식을 시작하였다. 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 3H 티미딘(GE Healthcare, #TRK758-5MCI)을 1μCi/웰로 첨가하였고 플레이트를 37℃에서 추가 18시간 동안 배양하였다. 제조자가 추천한 조건에 따라 세포 수확기(Perkin Elmer Filter Harvester D961962)를 사용하여 세포를 수확하였고 3H 티미딘을 액체 신틸레이션 계수기(Wallac Trilux 1450)를 사용하여 측정하였다. 세포 증식 데이터를 GraphPad Prism 5 소프트웨어로 가변 기울기 방정식(variable slope equation)(Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)(HillSlope)))을 사용하여 분석하여 각각의 테스트 화합물에 대한 IC50을 산출하였다. 용어 “(LogIC50-X)(HillSlope)”는 방정식에서 지수이다.
도 7은 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 예시적인 세트(즉, D3-04-IgG2, D3-11-IgG2, D3-12-IgG2, 및 D3-14-IgG2)를 수반하는 대표적인 CD4+ T 세포 증식 분석으로부터의 세포 증식 곡선을 나타낸다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질은 비교를 위하여 대조군으로서 포함하였다. 그래프는 3H 티미딘 혼입(cpm) 대 단백질의 농도(nM)의 플롯이다. 3H 티미딘 혼입은 세포 증식의 정도를 나타내며 표준 기술로 측정한다. 이 결과는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질이 시험관 내에서 CD86 보조-자극을 저해하거나 억제하는데 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 유의하게 더 높은 효능 또는 더 큰 능력을 가짐을 입증한다.
이 CD4+ T 세포 증식 분석을 본 발명의 많은 다른 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에서 실행하였다. 표 7은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 세트에 대한 데이터의 요약을 제공한다. 표 7은 CD4+ T 세포 증식 분석을 사용하여 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 대 참고 대조군(Orencia®, LEA29Y-Ig, 및 인간 CTLA-4-IgG2 융합 단백질)에 대한 평균 IC50 값(나노몰(nM)의 비교를 나타낸다. 개별적인 실험에서의 IC50은 평균하여 평균 IC50 값을 제공하였고, 이는 통계적인 분석에 사용하였다. 용어 “SD(평균 log IC50)”은 평균 log IC50 값에서 표준편차를 나타낸다.
| 융합 단백질 (다이머) |
평균 IC50 (nM) | 평균 Log IC50 (nM) | SD (평균 Log IC50) (nM) |
| Orencia® 융합 단백질 다이머 | 1.56 | 0.19 | 0.22 |
| hCTLA-4-IgG2 | 2.24 | 0.35 | 0.28 |
| LEA29Y-Ig | 0.211 | -0.67 | 0.25 |
| D3-02-IgG2 | 0.03 | -1.56 | NA |
| D3-03-IgG2 | 0.041,2 | -1.40 | 0.11 |
| D3-04-IgG2 | 0.031,2 | -1.47 | 0.02 |
| D3-06-IgG2 | 0.051 | -1.32 | 0.03 |
| D3-11-IgG2 | 0.031,2 | -1.52 | 0.07 |
| D3-12-IgG2 | 0.041,2 | -1.45 | 0.09 |
| D3-14-IgG2 | 0.041,2 | -1.37 | 0.11 |
| D3-15-IgG2 | 0.021,2 | -1.62 | 0.08 |
| D3-17-IgG2 | 0.031,2 | -1.47 | 0.11 |
| D3-20-IgG2 | 0.041,2 | -1.40 | 0.11 |
| D3-27-IgG2 | 0.041,2 | -1.37 | 0.10 |
| D3-29-IgG2 | 0.041,2 | -1.36 | 0.13 |
| D3-31-IgG2 | 0.031,2 | -1.58 | 0.21 |
| D3-34-IgG2 | 0.051,2 | -1.28 | 0.13 |
| D3-39-IgG2 | 0.051,2 | -1.35 | 0.10 |
| D3-50-IgG2 | 0.061,2 | -1.23 | 0.24 |
| D3-52-IgG2 | 0.071,2 | -1.14 | 0.24 |
| D3-53-IgG2 | 0.021,2 | -1.70 | 0.25 |
| D3-54-IgG2 | 0.041,2 | -1.40 | 0.12 |
| D3-56-IgG2 | 0.041,2 | -1.41 | 0.07 |
| D3-62-IgG2 | 0.041,2 | -1.44 | 0.09 |
| D3-65-IgG2 | 0.061,2 | -1.26 | 0.14 |
| D3-69-IgG2 | 0.031,2 | -1.59 | 0.14 |
| D3-70-IgG2 | 0.051,2 | -1.30 | 0.06 |
| D3-71-IgG2 | 0.041,2 | -1.43 | 0.09 |
| D3-72-IgG2 | 0.031,2 | -1.48 | 0.05 |
| D3-73-IgG2 | 0.061,2 | -1.26 | 0.18 |
| D3-75-IgG2 | 0.031,2 | -1.51 | 0.12 |
| D2-IgG2 | 0.031,2 | -1.52 | 0.18 |
| D3-IgG2 | 0.041,2 | -1.45 | 0.17 |
표 7에 나타낸 위첨자는 다음과 같다: 1사후 던넷(Dunnett) 검정을 이용하여 일원분산분석(1 way ANOVA)으로 결정된 바와 같이, Orencia와 p<0.05으로 통계적으로 상이함. 2사후 본페로니(Bonferroni) 검정을 이용하여 일원분산분석으로 결정된 바와 같이, LEA와 p<0.05으로 통계적으로 상이함. D3-02 변이체 CTLA-4 ECD를 포함한 융합 단백질은 한번 테스트하였으므로, 따라서 어떠한 통계 비교를 실행할 수 없었다.
통계적인 분석은 적어도 두 가지 별개의 분석에서 테스트되고 위첨자 (1)(표 7 참조)로 지정된 모든 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 통계적으로 Orencia® 및 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질보다 효능이 우수하였음(p < 0.05)(즉, 시험관 내 CD4+ T 세포분석에서 Orencia® 및 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질보다 T 세포 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼)을 나타내었다. 상기 검토된 사후 던넷(Dunnett) 검정 및 사후 본페로니(Bonferroni) 검정을 이용한 일원분산분석(1 way ANOVA)으로 결정된 바와 같이, 위첨자 (2)(표 7을 참조)로 지정된 것들은 또한 통계적으로 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 효능이 우수하였다(p < 0.05)(즉, 시험관 내 CD4+ T 세포분석에서 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 T 세포 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼). 변형된 IgG1 Fc(Orencia®에서와 같음) 또는 야생형 IgG2 Fc(hCTLA4-IgG2에서와 같음)를 포함하는 인간 CTLA-4 융합 단백질들 사이에서 통계적인 상이함은 없었다. 이 결과는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(각각 인간 IgG2 Fc를 포함함)과 Orencia® 또는 hCTLA4-IgG2 사이에서 표 7에 나타낸 기능적인 활성에서의 상이함은 CTLA-4 ECD 영역에서 만들어진 아미노산 변화(즉, 아미노산 치환)의 직접적인 결과 때문이었음을 의미한다. 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질과, 예를 들어 Orencia® 변형된 IgG1 Fc를 포함함) 사이에서 기능적인 활성에서의 상이함은 각각의 Ig Fc 폴리펩티드 서열에서의 상이함 때문이 아니었다.
Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 hCTLA-4-IgG2 융합 단백질과 비교하여, 시험관 내 분석에서 T 세포의 CD86-매개된 보조-자극을 억제하거나 저해하는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 활성이 증가된다면, 그러한 변이체 단백질은 또한 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig 융합 단백질(예컨대, 인간 CTLA-4-IgG2 (“hCTLA-4-IgG2”)) 각각과 비교하여 생체 내에서 치료적 및/또는 예방적 방법 또는 응용에서 증가된 면역억제 효능을 보일 것으로 여겨진다. 하나의 양태에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig(예, hCTLA-4-IgG2) 융합 단백질 각각과 비교하여 생체 내 방법 또는 응용, 예를 들어 대상체에서 면역 반응을 억제하거나 저해하는 치료적 및/또는 예방적 방법(예컨대, 인간과 같은 포유류에서 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료), 수용자에 의한(예컨대, 인간과 같은 포유류에 의한) 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 억제하거나 저해하는 방법, 및/또는 본 명세서의 다른 부분에 기술된 다른 치료 또는 진단 방법에서 T 세포의 CD86-매개된 보조-자극을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰 것으로 여겨진다.
실시예 7
인간
PBMC
증식 분석을 이용한
변이체
CTLA
-4-
Ig
분자의 생물학적 활성의 측정(리콜 항원 자극).
기억 T 세포의 활성화는 자가면역에서 중요한 양태이다(Rogers N.J., 등 Eur. J. Immunol 35:2909-2919 (2005)). 이러한 점에서 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 면역억제 활성을 측정하기 위하여, PPD 항원 자극을 이용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 증식 분석을 전개하였다.
인간 혈액(공여자 프로그램으로부터 새로이 수집함)을 같은 부피의 PBS로 희석하고 분별하여 제조자가 추천한 조건에 따라 히스토페이크(Histopaque, Sigma, #10771) 피콜(Ficoll) 경사를 이용하여 PBMC를 분리하였다. PBMC를 10% FBS(Hyclone # SV30014.03) 및 1x PSG(페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민)(Invitrogen, #10378-016)로 보충한 RPMI 배지(Sigma, #R8758)에서 희석하고 1 x 105세포/웰의 밀도로 96-웰 배양 플레이트(BD Biosciences, #353077)에 추가하였다. 테스트 화합물을 연속적으로 같은 배지에서 희석하고 네 개의 웰씩으로 하여 웰에 첨가하였다. 최종 농도 5㎍/ml로 PPD 항원(Mycobacterium tuberculosis에서 유래한 정제된 단백질, Mycos, #P-1000-001)을 첨가하여 세포 증식을 시작하였다. 37℃에서 5일 동안 배양한 후, 3H 티미딘(GE Healthcare, #TRK758-5MCI)을 1μCi/웰로 첨가하여 플레이트를 37℃에서 추가 18시간 동안 배양하였다. 제조자가 추천한 조건을 사용하여 세포 수확기(FilterMate Omnifilter-96 Harvester, Perkin Elmer)로 세포를 수확하였고 신틸레이션 계수기(Wallac Trilux, #1450-421)를 사용하여 3H 티미딘 혼입에 대하여 측정하였다. 비선형 회귀 곡선 피트 모델 (S자 모양 복용량-반응, 가변성 경사) 및 최소제곱 피트 방법을 사용하여 GraphPad Prism 5 소프트웨어로 세포 증식 데이터를 분석하였다. IC50(또는 “IC50”) 파라미터 및 그것의 관련된 95% 신뢰구간을 기록하였다.
도 8은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 세트(즉, D3-IgG2, D3-12-IgG2, D3-17-IgG2, 및 D3-29-IgG2 융합 단백질)를 수반하여 대표적인 PBMC 증식 분석에서의 세포 증식 곡선을 나타낸다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함하였다. 그래프는 3H 티미딘 혼입(cpm) 대 단백질 농도(nM)의 플롯이다. 세포 증식의 정도를 나타내는 3H 티미딘 혼입을 표준 기술로 측정하였다. 이들 결과는, 하나의 양태에서 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 시험관 내 기억 T 세포 증식을 저해하거나 또는 억제하는데 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 단백질보다 유의하게 더 높은 효능 또는 더 큰 능력을 가진다는 것을 설명한다(예, 인간 PBMC 증식 분석(리콜 항원 자극)에서 변이체 CTLA-4-Ig 단백질은 시험관 내 기억 T 세포 증식을 저해하거나 또는 억제하는데 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 단백질보다 더 큰 능력을 가짐).
본 발명의 많은 다른 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에서 PPD 항원 자극을 이용한 이러한 PBMC 증식 분석을 실행하였다. 표 8은 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 세트에 대한 데이터의 요약을 제공한다. 표 8은 리콜 항원 자극을 이용한 PBMC 증식 분석을 사용하여 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 대 참고 대조군(Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질)에 대한 평균 IC50 값(나노몰(nM))의 비교를 나타낸다. 개별적인 실험에서의 IC50 값은 평균하여 평균 IC50 값을 제공하였고, 이는 통계적인 분석에 사용하였다. 용어 “SD(평균 log IC50)”d은 평균 log IC50 값에서 표준편차를 나타낸다.
| 융합 단백질 (다이머) |
평균 IC50 (nM) |
평균 Log IC50 (nM) | SD (평균 Log IC50) (nM) |
| Orencia® 융합 단백질 다이머 | 5.92 | 0.67 | 0.37 |
| LEA29Y-Ig | 0.31 | -0.71 | 0.53 |
| D3-IgG2 | 0.03 | -1.49 | NA |
| D3-12-IgG2 | 0.06 | -1.27 | 0.17 |
| D3-14-IgG2 | 0.07 | -1.17 | 0.15 |
| D3-17-IgG2 | 0.07 | -1.24 | 0.25 |
| D3-20-IgG2 | 0.13 | -0.91 | 0.18 |
| D3-27-IgG2 | 0.17 | -0.84 | 0.30 |
| D3-29-IgG2 | 0.07 | -1.16 | 0.18 |
| D3-34-IgG2 | 0.51 | -0.29 | NA |
| D3-50-IgG2 | 0.28 | -0.55 | NA |
| D3-53-IgG2 | 0.05 | -1.29 | NA |
| D3-54-IgG2 | 0.01 | -2.00 | NA |
| D3-56-IgG2 | 0.01 | -1.92 | NA |
| D3-69-IgG2 | 0.01 | -2.00 | NA |
| D3-71-IgG2 | 0.01 | -1.87 | NA |
| D3-75-IgG2 | 0.01 | -2.02 | NA |
| D3-76-IgG2 | 0.01 | -1.89 | NA |
주: 표 8에서 용어 “NA”는 “이용 불가능함”을 의미한다.
통계적인 분석은, 각각 상기에서 검토된 사후 던넷(Dunnett) 및 본페로니(Bonferroni) 검정을 사용하여 일원분산분석으로 결정된 바와 같이, 테스트된 모든 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질 둘 다 보다 효능면에서 p < 0.05로 통계적으로 우수함을 밝혔다(예컨대, 인간 PBMC 증식 분석(리콜 항원 자극)에서 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 시험관 내 기억 T 세포 증식을 저해하거나 또는 억제하는데 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 더 큰 능력을 가짐).
Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질과 비교하여, 시험관 내 분석에서 기억 T 세포(예, 인간 기억 T 세포)의 증식을 억제하거나 저해하는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 활성이 증가된다면, 그러한 변이체 단백질은 또한 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig(예, 인간 CTLA-4-IgG2) 융합 단백질과 비교하여 생체 내에서 치료적 및/또는 예방적 방법 또는 응용에서 증가된 면역억제 효능을 보여야 하는 것으로 여겨진다. 하나의 양태에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 단백질은 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig(예, 인간 CTLA-4-IgG2) 융합 단백질과 비교하여 생체 내 방법 또는 응용, 예를 들어 대상체에서 면역 반응을 억제하거나 저해하는 치료적 및/또는 예방적 방법(예컨대, 인간과 같은 포유류에서 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료), 수용자에 의한(예컨대, 인간과 같은 포유류에 의한) 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 억제하거나 저해하는 방법, 및/또는 본 명세서의 다른 부분에 기술된 다른 치료 또는 진단 방법에서 기억 T 세포의 증식을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰 것으로 여겨진다.
실시예 8
인간
MLR
(
Mixed
Lymphocyte
Reaction
) 분석을 이용한
변이체
CTLA
-4-
Ig
분자의 생물학적
할성
측정.
CTLA-4-Ig 및 이의 변형체는 시험관 내에서 주된 알로반응(alloresponse)의 강력한 저해자이다(Vaughan, A. N. 등, J. Immunol. 165:3175-3181 (2000); Wallace P. M., 등, Transplantation 58:602-610 (1994)). 상기 분석에서 변이체 CTLA-4-Ig 단백질의 개선된 활성을 측정하기 위하여, 인간 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 세포 증식 분석을 전개하였다.
인간 혈액(인간 공여자 프로그램으로부터 새로이 수집함)을 같은 부피의 PBS로 희석하고 분별하여 제조자가 추천한 조건에 따라 히스토페이크(Sigma, #10771) 피콜(Ficoll) 경사를 이용하여 PBMC를 분리하였다. 한 명의 공여자로부터의 PBMC를 10% FBS(Hyclone # SV30014.03) 및 1x PSG (Invitrogen, #10378-016)로 보충한 RPMI 배지(Sigma, #R8758)에서 희석하고 1 x 105세포/웰의 밀도로 96-웰 배양 플레이트(BD Biosciences, #353077)에 추가하였다. 다른 공여자로부터의 PBMC를 2500rad에서 방사능 처리를 하였고, 같은 배지에서 희석하였으며 1 x 105세포/웰의 밀도로 같은 플레이트에 첨가하였다. 테스트 화합물을 같은 배지에서 연속적으로 희석하였고 네 개의 웰씩으로 하여 웰에 첨가하였다. 37℃에서 5일 동안 배양한 후, 3H 티미딘(GE Healthcare, #TRK758-5MCI)을 1μCi/웰로 첨가하였고 플레이트를 37℃에서 추가 18시간 동안 배양하였다. 제조자가 추천한 조건을 사용하여 세포 수확기(FilterMate Omnifilter-96 Harvester, Perkin Elmer)로 세포를 수확하였고 신틸레이션 계수기(Wallac Trilux, #1450-421)를 사용하여 3H 티미딘 혼입에 대하여 측정하였다. 비선형 회귀 곡선 피트 모델(S자 모양 용량-반응, 가변성 경사) 및 최소제곱 피트 방법을 사용하여 GraphPad Prism 5 소프트웨어로 세포 증식 데이터를 분석하였다. IC50 파라미터 및 그것의 관련된 95% 신뢰구간을 기록하였다.
도 9는 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-IgG2)을 수반하여 대표적인 MLR 증식 분석에서의 세포 증식 곡선을 나타낸다. Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질을 비교를 위한 대조군으로서 포함하였다. 그래프는 3H 티미딘 혼입(cpm) 대 단백질 농도(nM)의 플롯이다. 세포 증식의 정도를 나타내는 3H 티미딘 혼입은 표준 기술로 측정한다. 이들 결과는, D3-IgG2는 시험관 내 T 세포의 주된 알로자극(allostimulation)을 저해하거나 또는 억제하는데 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 유의하게 더 높은 효능을 가진다는 것을 설명한다(예컨대, D3-IgG2는 Orencia® 또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 시험관 내 MLR 분석에서 T 세포 증식의 주된 알로자극을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼).
본 발명의 많은 다른 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에서 이러한 MLR 분석을 실행하였다. 표 9는 본 발명의 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 세트에 대한 데이터의 요약을 제공한다. 표 9는 MLR 분석에서 예시적인 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 대 참고 대조군(Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질)에 대한 평균 IC50 값(나노몰(nM))의 비교를 나타낸다. 두 가지 별개의 실험에서의 IC50 값은 평균하여 평균 IC50 값을 제공하였다. 용어 “SD(평균 log IC50)”은 평균 log IC50 값에서 표준편차를 나타낸다. 표 9에 나타낸 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질에 대한 평균 IC50 값은 Orencia® 및 LEA29Y-Ig 융합 단백질의 각각의 평균 IC50 값보다 낮았다.
하나의 양태에서, 본 발명은 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 효능이 더 우수한 것으로 여겨지는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 제공한다(예컨대, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질보다 시험관 내 MLR 분석에서 T 세포 증식의 주된 알로자극을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼).
Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질과 비교하여 시험관 내 분석에서 T 세포(예, 인간 T 세포)의 주된 알로자극을 억제하거나 저해하는 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 예상되는 증진된 능력에 기초하여, 상기 변이체 단백질은 또한 Orencia® 및/또는 LEA29Y-Ig 융합 단백질과 비교하여 생체 내 치료적 및/또는 예방적 방법 또는 응용에서 증가된 면역억제 효능을 나타낼 것으로 여겨진다.
하나의 양태에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 시험관 내 T 세포의 주된 알로자극을 저해하거나 억제하는데 있어서 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig(예, 인간 CTLA-4-IgG2) 융합 단백질보다 유의하게 더 높은 효능을 가진다(예컨대, 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig 융합 단백질보다 시험관 내 MLR 분석에서 T 세포 증식의 주된 알로자극을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큼). 하나의 양태에서, 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig는 Orencia®, LEA29Y-Ig, 및/또는 인간 CTLA-4-Ig 융합 단백질과 비교하여 생체 내 방법 또는 응용, 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 억제하거나 저해하는 치료적 및/또는 예방적 방법(예컨대, 인간과 같은 포유류에서 면역계 질환 또는 장애의 생체 내 치료), 수용자에 의한(예컨대 인간과 같은 포유류에 의한) 공여자로부터의 조직 또는 장기 이식의 거부를 억제하거나 저해하는 방법, 및/또는 본 명세서의 다른 부분에 기술된 다른 치료 또는 진단 방법에서 T 세포의 주된 알로자극을 억제하거나 저해하는 능력이 더 큰 것으로 여겨진다.
| 융합 단백질 (다이머) |
평균 IC50 (nM) |
평균 Log IC50 (nM) | SD (평균 Log IC50) (nM) |
| Orencia® 융합 단백질 다이머 | 12.53 | 1.05 | 0.23 |
| LEA29Y-Ig | 0.92 | -0.19 | 0.48 |
| D3-IgG2 | 0.06 | -1.26 | NA |
| D3-12-IgG2 | 0.09 | -1.11 | 0.34 |
| D3-14-IgG2 | 0.08 | -1.20 | 0.43 |
| D3-17-IgG2 | 0.09 | -1.15 | 0.43 |
| D3-20-IgG2 | 0.14 | -1.11 | 0.64 |
| D3-27-IgG2 | 0.13 | -1.29 | 0.86 |
| D3-29-IgG2 | 0.11 | -1.14 | 0.54 |
| D3-34-IgG2 | 0.10 | -1.09 | 0.39 |
| D3-53-IgG2 | 0.02 | -1.64 | 0.11 |
| D3-54-IgG2 | 0.07 | -1.13 | NA |
| D3-56-IgG2 | 0.06 | -1.23 | NA |
| D3-69-IgG2 | 0.04 | -1.41 | NA |
| D3-71-IgG2 | 0.05 | -1.32 | NA |
| D3-75-IgG2 | 0.08 | -1.11 | NA |
| D3-76-IgG2 | 0.08 | -1.11 | NA |
주: 표 9에서 용어 “NA”는 “이용 불가능함”을 의미한다.
실시예 9
류마티스관절염으로 고통받는 성인을 다음과 같이 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질로 치료할 수 있다. 본 발명의 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체(예, PBS)를 포함하는 약학적 조성물을 제조한다. 예시적인 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 하나 이상의 이황화 결합으로 함께 연결된 두 개의 동일한 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하며, 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 C-말단에서 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합된 서열번호 1-73 중 임의의 것에서 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222 중 임의의 것에서 제시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 포함한다. 그러한 융합 단백질은 일반적으로 다이머성 형태로 발현된다. 약학적 조성물에서 융합 단백질의 농도는 약 0.05mg/ml 내지 약200mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약120mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 75mg/ml, 약 100mg/ml 내지 약 150mg/ml 등의 범위에 있을 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물에서 융합 단백질의 농도는 약 1mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml, 40mg/ml, 50mg/ml, 60mg/ml, 70mg/ml, 80mg/ml, 90mg/ml, 100mg/ml, 150mg/ml, 또는 200mg/ml일 수 있다. 그러한 약학적 조성물의 pH는 약 pH 4 내지 약 pH 10이며, 이는 약 pH 5 내지 약 pH 9, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5를 포함하고, 바람직하게는 약 pH 6.0 내지 pH 8.0, 약 6.5 내지 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0을 포함한다.
환자의 류마티스관절염의 치료는 정맥내 또는 피하 주사로 환자에게 변이체 CTLA-4-Ig의 치료적으로 유효한 양(예, 유효한 용량)을 투여함으로써 수행된다. 주입 부위는 예를 들어, 환자의 팔, 몸통, 또는 다리일 수 있다. 투여되는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 유효한 용량은 일반적으로, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 성인 환자의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 100mg/kg, 예컨대, 약 0.01-5.0mg/kg, 약 0.01-3.0mg/kg, 약 0.05-2.5mg/kg, 약 0.1-2.0mg/kg, 약 0.1-1.0mg/kg, 약 0.01-0.05mg/kg, 약 0.5-1.5mg/kg, 약 1.0-4.0mg/kg, 약 1.0-3.0mg/kg, 약 1.0-2.0mg/kg이며, 이는 이에 한정되지 않지만, 환자의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg, 0.05mg/kg, 0.075mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1mg/kg, 1.25mg/ml, 1.5mg/kg, 2mg/kg, 2.5mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg, 20 mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 75mg/kg, 또는 100mg/kg을 포함한 용량이 환자에게 투여된다. 대안적으로 상기 “본 발명의 방법” 섹션에 기술된 유효한 양 또는 용량 또는 용량 범위를 사용할 수 있다. 투여되는 융합 단백질의 용량은 융합 단백질의 효능 및/또는 환자의 류마티스관절염의 증상 또는 징후의 심각도에 기초하여 결정한다. 환자에게 투여되는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 총 양은 예컨대 약 0.01mg 내지 약 100mg, 일반적으로 약 1mg 내지 100mg, 약 10mg 내지 100mg, 약 10mg 내지 약 75mg, 또는 약 10 내지 약 50mg일 수 있다. 환자에게 투여되는 약학적 조성물의 부피는 조성물 내 융합 단백질의 농도 및 투여되는 융합 단백질의 용량에 기초하여 결정한다. 피하 주사에 있어서, 일반적으로 각 주사당 융합 단백질을 포함하는 1 내지 2ml의 약학적 조성물을 투여한다. 정맥 주사에 있어서, 융합 단백질을 포함하는 적절한 부피의 약학적 조성물을 투여할 수 있다.
초기 용량의 주사에 이어서, 융합 단백질의 두번째 동일한 용량을 환자에게 피하로(예, s.c. 주사) 또는 정맥내로(예, i.v. 주사) 예컨대, 초기 투약 후 1, 2, 3, 또는 4주 후에 투여할 수 있다. 투약 스케줄은 예컨대 환자의 상태에 따라서 이 주일에 한 번 투약, 한 달에 한 번 투약, 두 달에 한 번 투약 등일 수 있다. 그 이후의 투약은 필요에 따라, 4주마다 또는 그보다 자주 또는 덜 자주 투여할 수 있다. 투약 빈도는 환자의 상태에 따라서 변화할 수 있으며 환자의 류마티스관절염의 증상 또는 징후의 심각도에 따라 다를 수 있다.
예시적인 양태에서, 체중에 대하여 약 0.5mg/kg의 융합 단백질 다이머의 용량을 제공하기에 충분한 본 발명의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머(예컨대, D3-29-IgG2, D3-54-IgG2, D3-56-IgG2, D3-69-IgG2 등) 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물의 양을 필요에 따라, 일주일에 한 번, 한 달에 한 번 류마티스관절염으로 고통받는 사람에게 피하 주사로 투여하며, 이는 환자의 상태 및 약물에 대한 반응에 따라 다르다.
다른 예시적인 양태에서, 약 10mg/kg의 융합 단백질 다이머의 용량을 제공하기에 충분한 본 발명의 CTLA-4-Ig 융합 단백질 다이머(예컨대, D3-29-IgG2, D3-54-IgG2, D3-56-IgG2, D3-69-IgG2 등) 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물의 양이 필요에 따라, 일주일에 한 번 또는 한 달에 한 번 류마티스관절염으로 고통받는 사람에게 정맥내로 투여하며, 이는 환자의 상태 및 약물에 대한 반응에 따라 다르다. 표준 i.v. 절차를 그러한 투여에 사용할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 표준 정맥 접근 장치를 통한 표준 지속적인 정맥내 점적을 이용하여, 멸균 식염수 용액, 덱스트로오스 용액, 또는 다른 등장 용액과 같은 다른 액체와 함께 사람에게 주입할 수 있다.
s.c. 또는 i.v. 주사에 의한 각각의 상기 기술된 치료 방법은 환자에서, 예컨대 염증, 관절 압통, 관절 부종, 통증, 조직 위축, 및 경직과 같은 류마티스관절염과 관련된 하나 이상의 징후, 증상, 또는 생물학적 반응을 감소시키거나 완화시키는 것으로 예상된다. 상기 치료는 환자에서 특히, 결합 조직, 근육 조직, 및 골격 조직에서, 질환의 더 이상의 진행을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 그러한 치료는 환자에서 결합 조직, 위축 근육 조직, 뼈, 관절, 연골, 및/또는 척추 등에 대한 손상의 진행 또는 상기의 악화를 감소시킬 수 있다. 피부, 중추신경계 또는 장기에 생긴 손상을 포함하여, 질환의 추가적인 임상 증상을 또한 줄이거나 완화시킬 수 있다. 그러한 치료는 또한 환자의 신체적 기능을 개선시킬 수 있다.
실시예 10
장기 이식 거부의 방지를 위한 유지 치료를 겪는 성인 환자를 다음과 같이 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질로 치료할 수 있다. 본 발명의 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체(예, PBS 등)를 포함하는 약학적 조성물을 제조한다. 예시적인 가용성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질은 하나 이상의 이황화 결합으로 함께 연결된 두 개의 동일한 모노머성 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 포함하며, 각각의 그러한 모노머성 융합 단백질은 C-말단에서 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드의 N-말단으로 융합된 서열번호 1-73 중 임의의 것에서 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 변이체 CTLA-4 ECD 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 서열번호 74-79, 197-200, 205-214, 및 219-222 중 임의의 것에서 제시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 포함한다. 약학적 조성물에서 융합 단백질의 농도는 약 0.05mg/ml 내지 약200 mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약120 mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 75mg/ml, 약 100mg/ml 내지 약 150mg/ml 등의 범위에 있을 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물에서 융합 단백질의 농도는 약 1mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml, 40mg/ml, 50mg/ml, 60mg/ml, 70mg/ml, 80mg/ml, 90mg/ml, 100mg/ml, 150mg/ml, 또는 200mg/ml일 수 있다. 그러한 약학적 조성물의 pH는 약 pH 4 내지 약 pH 10이며, 이는 약 pH 5 내지 약 pH 9, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 6.0 내지 pH 8.0, 약 6.5 내지 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0을 포함한다.
장기 이식 거부의 방지 또는 억제를 위한 유지 치료는 정맥 주사 또는 피하 주사로 장기 이식(예, 신장 이식)을 받은 환자에게 변이체 CTLA-4-Ig의 치료적으로 유효한 양(예, 유효한 용량)을 투여함으로써 수행된다. 주사 부위는 예를 들어, 환자의 팔, 몸통, 또는 다리일 수 있다. 투여되는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 유효한 용량은 일반적으로, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 성인 환자의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg 내지 약 100mg/kg, 예컨대, 약 0.01-5.0mg/kg, 약 0.01-3.0mg/kg, 약 0.05-2.5mg/kg, 약 0.1-2.0mg/kg, 약 0.1-1.0mg/kg, 약 0.01-0.05mg/kg, 약 0.5-1.5mg/kg, 약 1.0-4.0mg/kg, 약 1.0-3.0mg/kg, 약 1.0-2.0mg/kg이며, 이는 이에 한정되지 않지만, 환자의 체중에 대하여 약 0.01mg/kg, 0.05mg/kg, 0.075mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1mg/kg, 1.25mg/ml, 1.5mg/kg, 2mg/kg, 2.5mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg, 20 mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 75mg/kg, 또는 100mg/kg을 포함한 용량이 환자에게 투여된다. 대안적으로, 상기 “본 발명의 방법” 섹션에 기술된 유효한 양 또는 용량 또는 용량 범위를 사용할 수 있다. 투여되는 융합 단백질의 용량은 융합 단백질의 효능 및/또는 환자의 장기 이식 거부의 증상 또는 징후의 심각도에 기초하여 결정한다. 환자에게 투여되는 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질의 총 양은 예컨대 약 0.01mg 내지 약 100mg, 일반적으로 약 1mg 내지 100mg, 약 10mg 내지 100mg, 약 10mg 내지 약 75mg, 또는 약 10 내지 약 50mg일 수 있다. 환자에게 투여되는 약학적 조성물의 부피는 조성물 내의 융합 단백질의 농도 및 투여되는 융합 단백질의 용량에 기초하여 결정한다. 융합 단백질은 이식 후 임의의 날, 예컨대, 이식 후 1일, 4일, 7일, 14일, 28일, 56일, 84일 등에 투여할 수 있다. 피하 주사에 있어서, 일반적으로 1 내지 2ml의 약학적 조성물을 투여한다. 정맥 주사에 있어서, 융합 단백질을 포함하는 적절한 부피의 약학적 조성물을 투여할 수 있다.
초기 용량의 주사에 이어서, 융합 단백질의 두번째 동일한 용량을 환자에게 피하로 또는 정맥내로 초기 투약 후 1주, 2주, 3주, 또는 4주 후에 투여할 수 있다. 투약 스케줄은 예컨대 환자의 상태에 따라서 이 주일에 한 번 투약, 한 달에 한 번 투약, 두 달에 한 번 투약 등일 수 있다. 그 이후의 투약은 필요에 따라, 4주마다 또는 그보다 자주 또는 덜 자주 투여할 수 있고, 원한다면 한 달에 한 번씩 계속할 수 있다. 투약 빈도는 환자의 상태에 따라서 변화할 수 있으며 환자의 장기 이식 거부의 증상 또는 징후의 심각도에 따라 다를 수 있다.
그러한 치료는 환자에서 예컨대 이식된 장기의 급성 거부, 이식된 장기의 만성 거부, 이식된 장기의 기능 감소, 혈청 크레아티닌 수준의 증가 및/또는 이식된 장기 내로의 T 세포의 증가된 침윤과 같은 장기 이식 거부와 관련된 하나 이상의 징후, 증상, 또는 생물학적 반응을 감소시키거나 완화시키는 것으로 예상된다. 그러한 치료는 환자의 면역계에 의한 이식된 장기의 거부 가능성을 감소시킬 수 있다.
실시예 11
래트에서
변이체
CTLA
-4-
IgG2
융합 단백질의 약물동역학 평가.
살아있는 유기체에 대하여 외부 투여 후 치료적 혈청 농도는 치료 효험에 영향을 미치고 약물동역학(PK) 평가로 결정한다. 다음의 절차에서, PK 프로파일을 대표적인 변이체 CTLA-4-IgG2 테스트 물질 D3-29-IgG2, D3-54-IgG2, D3-56-IgG2, D3-69-IgG2, 및 D3-75-IgG2에 대하여 hCTLA-4-IgG2 및 Orencia® 융합 단백질 테스트 물질 둘 다와 비교하여 래트에서 평가하였다. 연구 고안, 및 데이터 생성 및 해석은 앞으로 기술한다.
살아있는 생물체에서의 실험 고안.
적어도 5일의 기간동안 순화(acclimatization)시킨 후 중량을 일치시킨, 수컷 Hans Wistar 래트를 사용하였다. 테스트 물질 투약 부피를 모두 1mg/kg의 테스트 물질을 받도록 동물의 중량에 기초하여 개별적인 동물에 대하여 계산하였다. 모든 테스트 물질은 PBS에서 1mg/ml으로 제조하였으므로 따라서 일반적인 150g 래트는 150㎕ 투약 부피를 받았다. 상기 기술된 변이체 CTLA-4-IgG2 테스트 물질, hCTLA-4IgG2, 또는 Orencia® 융합 단백질의 단일 투여를 정맥(i.v. 또는 IV) 볼루스로서, 또는 피하(“s.c.” 또는 “SC”로 약칭함) 경로로서 가하였다. 연구 규모는 임의의 주어진 래트에서 10% 이하 총 혈액 부피까지 제거된 혈액 부피를 제한하면서, 시점당 300㎕의 최소한의 네 개의 혈액 샘플에 대하여 충분하였다. 혈액 샘플링 시간 과정은 i.v 및 s.c. 투여 각각에 대하여 복용 전, 복용 후 5분, 30분, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 및 14일 또는 복용 후 5분, 30분, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 및 15일이었다. 혈청을 개별적인 혈액 샘플로부터 준비하고, ELISA로 테스트하여 투여된 테스트 물질의 존재를 정량화하였다.
PK
ELISA
방법.
혈청 샘플 내에 존재하는 변이체 CTLA-4-IgG2, hCTLA-4IgG2, 또는 Orencia® 융합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 상으로 미리 코팅한 인간 CD80-쥐 IgG(상기 기술함)에 결합시켰다. 검출은 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP) 접합된 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch #109-035-098)로 이루었다. 발색 HRP 기질, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)에 과산화수소(Kem-En-Tec #4390A)를 더하여 사용하여 정량화하였고 그에 따라 반응을 0.2N 황산(H2SO4)을 첨가하여 정지시켰으며, 광학 흡수도를 분광광도계로 450nm에서 측정하였다. 혈청 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가하기 전에 1/20으로 미리 희석하여 매트릭스를 5% 래트 혈청으로 표준화하였고, 5% 래트 혈청에서 총 8개의 희석물에 대하여 더 희석하였다. 각각의 희석된 혈청 샘플의 농도를 5% 래트 혈청내로 섞인 동일한 테스트 물질의 적정을 사용하여 준비된 표준 곡선에 대하여 정량화하였다. 표준 곡선은 10 내지 0.078ng/ml의 범위이었고, 정확도 범위는 5% 래트 혈청에서 배경의 두 배 내지 5ng/ml인 것으로 결정하였다. 표준 곡선의 질은 표준 곡선 정확도 범위의 고, 중 및 저 농도에서 5% 래트 혈청에서 준비된 동일한 테스트 물질의 품질 관리(quality control, QC)로 평가하였다. QC 합격 기준은 관찰된 QC 농도가 예상된 QC 농도의 20% 이내인 것이었다. 표준 곡선의 정확도 범위 내에서 광학 밀도(OD)를 가지고 희석물에 대하여 할당된 농도를 평균함으로써 개별적인 미지의 혈청 샘플의 농도를 산출하였다. 적어도 4개의 개별적인 혈청 샘플을 사용하여 각각의 계획한 시점에서 평균 혈청 농도를 계산하였다.
PK
파라미터.
도 15a 및 15b는 래트에서 단일의 (A) 정맥(IV) 볼루스 또는 (B) 피하(SC) 주사로서 1mg/kg으로 투여된 Orencia® 융합 단백질, hCTLA-4-IgG2, 및 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대한 PK 프로파일을 나타낸다. 에러 바(error bar)는 평균의 표준편차(SD)를 나타낸다. 점섬은 ELISA에 대하여 정량화의 더 낮은 한계를 나타낸다(100% 혈청에서 테스트 물질에 대하여 ~3ng/ml). 도 15에서 시간 0h에서 테스트 물질을 투여한 후 각각의 계획한 시점에서 평균 혈청 농도는 세미-로그 농도-시간 프로파일의 데이터포인트를 포함한다.
평균 혈청 농도를 사용하였고 i.v.(IV) 또는 s.c.(SC) 투약 경로 각각에 대하여 WinNonLin 모델 201(i.v.-볼루스 주입), 또는 모델 200(혈관 밖 주입)을 이용하여 PK 파라미터를 산출하였다. 표 10은 s.c. 및 i.v. 투여 경로 각각에 대한 핵심적인 PK 파라미터를 요약한다.
Cmax는 테스트 물질의 최대 혈청 농도를 지칭한다. 최종 반감기 값(T1/2)은 농도-시간 프로파일의 종료 단계 동안에 혈청에서 테스트 물질의 농도가 반으로 감소하는데 걸린 시간이다. 혈청 농도-시간 곡선(AUC) 아래의 부분은 사다리꼴 법칙(trapezoidal rule)을 사용하여 시간 0에서 무한대까지 정량화된다. 클리어런스(Cl)는 식 용량/AUC를 사용하여 계산하였고, 종료 단계의 분배 부피(Vz)는 식 Cl/k를 사용하여 계산하였다.
각각의 화합물에 대한 생물학적 이용가능성 요인(F)는 표 11에 제시되며, 이는 피하 경로에 의한 AUC/정맥 경로에 의한 AUC를 계산함으로써 결정하였다.
| 화합물 | 생물학적 이용가능성 |
| Orencia | 0.54 |
| CTLA-4IgG2 | 0.34 |
| D3-29 | 0.71 |
| D3-54 | 0.51 |
| D3-56 | 0.58 |
| D3-69 | 0.45 |
| D3-75 | 0.52 |
인간 CTLA-4IgG2 및 Orencia® 융합 단백질은 IgG 구조형성에서의 상이함에도 불구하고 유사한 PK 프로파일을 보였으며, 이는 기능성 도메인이 변함이 없을 때 이들 각각의 테스트 물질의 인간 IgG2 및 돌연변이된 인간 IgG1 Fc 부분이 비슷한 PK 활성을 가진다는 것을 의미한다. 그러므로 추론에 의하여, Orencia® 융합 단백질과 비교된 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대한 PK 프로파일에서 보여진 임의의 변화는 기능성 도메인에서의 상이함으로 인한 것이고, Fc 부분에서의 상이함으로 인한 것이 아닐 것이다.
각각의 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대하여, 곡선 아래의 긴 반감기 값 및 넓은 부분으로 제안된 바와 같이 제거는 느렸다. Orencia® 융합 단백질의 반감기가 SC 또는 IV 경로로 투여될 때 각각 70.0 또는 42.3시간인 것과 비교하여, 반감기는 SC 복용에 대하여 11.2 내지 56.4시간의 범위이었고, IV 복용에 대하여 15.3 내지 83.0시간의 범위이었다. 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대한 AUC 값은 평균하여 Orencia® 융합 단백질보다 우수하였다. Orencia® 융합 단백질의 SC 투약에 대하여 391h*kg*ng/L/mg인 것과 비교하여 SC 투약 후 평균은 879.5 +/- 281.6h*kg*ng/L/mg이었으나, Orencia® 융합 단백질의 IV 투여에 대하여 728h*kg*ng/L/mg인 것과 비교하여 IV 투여는 평균 AUC 값이 1645.5 +/- 641.1h*kg*ng/L/mg이었다.
평균 값이 44.8ml/kg으로 제안된 바와 같이, 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질이 혈관밖의 유체 내부를 제외하고 혈청 밖에서 분배되었다는 점에서 두 가지 투여 경로 모두에 대하여 분배의 부피는 유사하였으며, 이는 표준 래트에 대하여 혈장 참고 부피 30ml/kg보다 위이고, 세포외 유체 참고 한도 300ml/kg 이내이다(Davies, B. 등, Pharm. Res. 10(7):1093-95 (1993)).
또한 Orencia® 융합 단백질의 생물학적 이용가능성이 유리하게 0.53인 것과 비교하여 생물학적 이용가능성은 평균이 0.6+/- 0.1으로서 대부분의 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대하여 유사하였다.
마지막으로, Cmax는 일반적으로 Orencia® 융합 단백질과 비교하여 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질에 대하여 더 높았다. Orencia® 융합 단백질을 SC 또는 IV로 투여할 때 각각에 대하여 Cmax가 3.3 또는 22.3ug/L인 것과 비교하여, Cmax 값은 SC 투약에 대하여 4.5 내지 9.3ug/L의 범위이었고, IV 투약에 대하여 20.6 내지 81.9ug/L의 범위이었다.
전체적으로, PK 데이터는 SC 또는 IV 경로를 통해 1mg/kg으로 래트에게 투여될 때 모든 평가한 변이체 CTLA-4-IgG2 융합 단백질이 일반적으로 Orencia® 융합 단백질보다 낮지 않은 PK 프로파일을 가지며, 기능성 도메인이 변함이 없을 때 IgG1 또는 IgG2 Fc 부분은 비슷하였음을 나타내었다.
실시예 12
이 실시예는 본 발명의 변이체 CTLA4-Ig 융합 단백질을 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포주를 제조하고, 변이체 CTLA4-Ig 융합 단백질의 통상적인 실험실 규모의 생산을 위하여 상기 세포주를 사용하며, 세포 발현 배지로부터 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 정제하는 방법을 기술한다. 이 실시예가 특히 D3-54-IgG2 융합 단백질을 발현하는 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포주를 제조하고, 실험실 규모 생산을 위하여 상기 세포를 사용하며, 배지로부터 상기 단백질을 정제하는 방법을 기술하더라도, 본 명세서에 기술된 방법은 본 발명의 임의의 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질 및/또는 상기에 검토된 임의의 적절한 세포주를 사용할 수 있다.
안정적으로 형질감염된 세포주의 제조.
재료.
CHO - K1 순수한(형질감염되지 않은) 세포: 화학적 규명 배지(chemically-defined medium)에서 무혈청 현탁 성장으로 조정한 CHO-K1 세포(세포 ID: M4-PeM-0436-112-01)를 액체 질소 증기상에 저장하였다(Dewar MVE1536P). M4-PeM-0436-112-01의 하나의 바이알을 해동하여 진탕플라스크에서 CD OptiCHOTM 배지(Invitrogen, #12681)로 배양하였다. 배양물은 형질감염용 세포와 성장 및 클로닝용 순화 배지를 제공하였다. 모든 배양물은 37℃, 5% CO2에서 성장하였다.
플라스미드: 인간 IgG2a Fc 영역으로 융합된 D3-54 변이체 CTLA-4 ECD를 인코딩하는 DNA를 CET1019AS UCOE 벡터(Millipore)로 삽입하였고 그 결과 생성된 플라스미드 CET1019AS-D3-54-IgG2를 모든 형질감염에 사용하였다.
세포 배양 배지: 2% v/v 200mM L-글루타민(Invitrogen #25031)으로 보충한, CD Opti-CHO(Invitrogen #12681) 화학적으로 규명된 동물성분이 없는 배지를 모든 배양에 사용하였다.
순화 배지: CD Opti-CHO 배지에서 부모 CHO-K1 세포주를 배양함으로써 순화 배지를 얻었다. 5 x 105세포/ml 이상의 세포수에서, 세포 배양물을 원심분리하고 순화 배지 상청액을 멸균-여과하였다. 순화 배지를 사용을 위하여 매일 새로이 만들었고 2-8℃에서 최대 7일 동안 저장하였다.
50% 순화 배지: (상기) 순화 배지를 동일 부피의 신선한 세포 배양 배지와 조합하였고; 매일 새로 만들어서 사용하였다.
분석 방법.
세포수 및 생존 능력 결정을 Cedex 또는 Cedex HiRes 세포 계수기(Innovatis)로 실행하였다.
생산을 위한 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-54-IgG2)을 발현하는 클론의 초기 스크리닝을 ELISA로 실행하였다. ELISA 플레이트를 hCD80-쥐 Ig 융합 단백질로 밤새 코팅하였다. 다음 날, 분석할 샘플을 50- 및 200-배로 희석하여 두 개의 웰씩으로 하여 ELISA 플레이트로 옮겼다. 두 시간 항온처리한 후, 항-인간 IgG-HRP 항체를 첨가하여 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 TMB로 전개하고 450nm에서 판독하였다. 원래의 광학 밀도(OD)를 기록하였다.
D3-54-IgG2 융합 단백질 농도의 정량적인 결정을 Poros A/20 컬럼(ABI # 1-5024-12)을 이용하여 단백질 A HPLC 방법으로 실행하였다. 두 가지 완충제를 사용하였다: 완충제 A: 50mM 인산, 150mM 염화칼륨, pH 7.6 ± 0.1 및 완충제 B: 50mM 인산, 150mM 염화칼륨, pH 2.5 ± 0.1. 두 가지 완충제 모두 추가적으로 5% 이소프로판올이 첨가되었다. 샘플 주입 후 42% 완충제 A 및 58% 완충제 B(pH 6.5)로 평형 및 세척을 하였다. 12% 완충제 A 및 88% 완충제 B까지 선형 경사로 1분 동안 용출하였다.
절차.
D3-54-IgG2 융합 단백질의 GMP 생산에 사용된 안정한 세포주의 제조를 위하여 사용된 순수한 점착성 CHO-K1 세포를 화학적 규명 CD OptiCHOTM 배지에서 현탁 성장으로 적응시켰다. 이들 순수한 CHO-KI 세포의 하나의 바이알을 해동하여 5 x 105 생존가능한 세포/ml의 밀도까지 CD OptiCHOTM 배지를 포함하는 125ml 진탕플라스크에서 성장시켰다. 2 x 106 생존가능한 세포를 400㎕의 50% 순화 배지에서 재현탁시키고 큐벳(cuvette)에서 20㎍ 플라스미드 DNA(CET1019AS UCEO 벡터 내에 D3-54-IgG2)와 결합시켰다. 전기천공을 320볼트(V)에서 15ms의 구형파 펄스(square wave pulse) 길이로 Gene X cell Pulser(BioRad)를 이용하여 실행하였다. 중복(duplicate) 형질감염을 실행하였고 그 후 세포를 모았다. 모은 세포를 5ml의 50% 순화 배지를 포함하는 T-25 플라스크로 옮기고 2일 동안 배양하였다.
형질감염된 세포를 클로닝을 위하여 96-웰 플레이트내로 직접적으로 분배하거나 안정한 풀(pool)을 얻을 때까지 항생제 선택으로 배양한 다음 96-웰 플레이트내로 분배하였다. 전기천공 후 2일 후에, 선택 압력을 위한 8㎍/ml의 퓨로마이신을 포함하는 순화 배지에서 1250 세포/ml까지 배양물을 희석하였다. 세포를 웰 당 200㎕(250세포/웰)로 96-웰 플레이트 내로 분배하였다. 플레이트를 대략 10일 동안 배양하여 형질감염되지 않은 세포 및 일시적으로 형질감염된 세포를 죽였다. 10-12일 후, 모든 플레이트에서의 모든 웰을 시각적으로 검사하여 단일 콜로니를 가지는 웰을 확인하였다. 이들 웰을 후에 다시 검사하여 이들이 24-웰 플레이트 내로 확장하기에 적합한 단일의 건강한 콜로니를 포함하는 것을 확인하였다.
전기천공 후 2일 후에, 배양물을 원심분리하였고 선택 압력을 위한 7㎍/ml의 퓨로마이신을 포함하는 50% 순화 배지에서 재현탁하였다. 또한 대조 플라스크를 동일한 배지에서 형질감염되지 않은 세포로 접종하였다. 진행 중인 최적화 연구에 기초하여, 퓨로마이신 농도를 3일 후에 8㎍/ml까지 증가시켰다. 대조 플라스크 내의 모든 세포가 죽었을 때, 선택 후 10-12일 후에 안정한 풀을 생성하였다. 안정한 풀에서 생성물 발현을 단백질 A HPLC로 확인하였고 배양물 생존 능력이 95% 초과임을 확인하였다. 최종 밀도 3.8세포/ml까지 순화 배지 내에서 퓨로마이신 없이 세포를 연속적으로 희석하였다. 세포를 웰 당 200㎕(75세포/플레이트 또는 0.8세포/웰)로 96-웰 플레이트 상에 접종하였다.
1일 후 모든 플레이트에서의 모든 웰을 시각적으로 검사하여 단일 세포 또는 콜로니를 가지는 웰을 확인하였다. 다음 날, 2-4세포의 단일 콜로니를 가지는 웰을 선택하였다. 두 개 이상의 콜로니를 가지는 임의의 웰은 제거하였다. 제2의 작동자자 상기 선택을 확인하였다. 웰을 후에 다시 검사하여 이들이 24-웰 플레이트 내로 확장하기에 적합한 단일의 건강한 콜로니를 포함하는 것을 확인하였다.
96-웰 플레이트로부터의 클론을 8㎍/ml의 퓨로마이신과 함께 웰 당 1ml의 순화 배지를 포함하는 24-웰 플레이트 내로 확장시켰다. 단일 콜로니를 가지는 96-웰 플레이트로부터 선택된 웰의 전체 내용물을 24-웰 플레이트 내의 개별적인 웰로 옮겼다. 24-웰 플레이트 내에서 각각의 새로운 웰로부터 200㎕를 취하여 96-웰 플레이트에서 대응하는 웰을 세척하고 다시 옮겼다. 백업을 위하여, 8㎍/ml의 퓨로마이신을 포함하는 200㎕의 순화 배지를 96-웰 플레이트에서 각각의 웰로 다시 첨가하였다.
1-3일 후, 24-웰 내의 각각의 웰을 샘플링하고 D3-54-IgG2 발현에 대하여 ELISA로 테스트하였다. 원래 ELISA OD 값 뿐만 아니라 충분한 성장의 입증에 기초하여 추가 확장에 대한 클론을 선택하였다.
ELISA 및 관찰가능한 성장 결과에 기초한 상위 35-40 클론을 8㎍/ml의 퓨로마이신을 가진 5ml의 순화 배지를 포함한 T-25 플라스크내로 확장시켰다. 24-웰 플레이트에서 선택된 웰의 각각의 전체 내용물을 개별적인 T-25 플라스크로 옮겼다. 웰 내의 잔여 세포를 동일한 배지로 세척하였고 대응하는 T-25 플라스크에 첨가하였다. 백업을 위하여, 8㎍/ml의 퓨로마이신을 포함한 1ml의 순화 배지를 24-웰 플레이트 내의 각각의 웰에 다시 첨가하였다.
가장 높은 생산성을 가진 클론을 선택하여 클론의 수를 더 감소시켰다. 1-2 x 105 생존가능한 세포/ml로 신선한 배지에서 세포를 재현탁시키고 T25 플라스크(5ml 배양) 또는 125ml 진탕플라스크(12ml 배양)내로 시딩하였다. 배양물을 22-24시간 동안 배양한 다음 최종 세포 밀도 및 생존력 결정을 하였으며 단백질 A HPLC에 의한 생산물 농도 결정을 위하여 샘플을 취하였다. 생산성은 플라스크에서 생산된 단백질의 총 양을 생존가능한 세포의 총 수로 나누고 배양 기간으로 나누어서 계산하였다. 단위를 세포당 일(day)당 피코그램(picogram) 또는 “pcd”로 변환하였다. pcd 값에 따라서 클론의 순위를 평가하였으나, 유의한 성장을 나타내지 않은 클론은 누락시켰다. 상위 클론들을 냉동보존(cryopreservation) 및 성장 및 생산성의 추가 평가를 위하여 125ml 진탕플라스크로 확장시켰다.
추가로 평가될 클론을 50ml 신선한 배지 내에 1 x 105 생존가능한 세포/ml로 250ml 진탕플라스크 내로 접종하였다. 세포 밀도가 1 x 106 생존가능한 세포/ml에 도달할 때, 다시 50ml 신선한 배지 내에 1 x 105 생존가능한 세포/ml로 배양물을 새로운 진탕플라스크 내로 계대배양(passage)시켰다. 계대배양을 한 번 더 반복하였다. 이러한 세 번째 계대배양 동안에, 세포 계수, 생존력, 및 단백질 A HPLC에 의한 생산물 농도 결정을 위하여 배양물을 매일 샘플링하였다.
성장 및 특이적 생산율에 기초하여 D3-54-IgG2 융합 단백질을 발현하는 상위 클론들을 서브클로닝을 위하여 선택하였다. 퓨로마이신을 언제나 사용하지 않은 것을 제외하고 안정한 풀에 대하여 상기 섹션에서 기술된 바와 같이 희석을 제한함으로써 서브클로닝을 실행하였다. 또한 서크클론의 확장, 스크리닝, 및 평가를 상기 기술된 바와 같이 실행하였다.
선택한 서브클로론을 진탕플라스크에서 대략 90일 동안 반복하여 계대배양하여 생산 안정성을 평가하였다. 각각의 계대배양에서, 25ml 신선한 배지 내에 1 x 105 생존가능한 세포/ml로 세포를 125ml 진탕플라시크 내에 시딩하였다. 배양물을 3-4일마다 계대배양하였다. 각각의 계대배양 전에, 세포 밀도 및 생존력을 측정하였고 단백질 A HPLC에 의한 생산물 농도 결정을 위하여 샘플을 취하였다.
선택된 클론 및 서브클론을 안정성 평가에서 pcd 값으로 순위를 평가한 시각부터 다양한 시점까지 냉동보존하였다. 얼린 배지를 90% 성장 배지 및 10% DMSO(Sigma)로 새롭게 만들었다. 진탕플라스크 배양물로부터의 세포를 원심분리하고 2 - 10 x 106세포/ml 범위의 밀도로 동결배지(freezing medium) 내에서 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 1ml 분액으로 극저온용 바이알 내로 분배하였다. 극저온용 바이알을 이소프로판올 냉동 용기에 넣고 -80℃에서 밤새 저장하였다. 동결된 바이알을 그 다음 날 액체 질소 증기상 저장으로 옮겼다.
변이체
CTLA4
-
IgG2
융합 단백질의 제조.
D3-54-IgG2 융합 단백질을 발현하는 1ml 부피의 CHO-K1 세포를 포함하는 냉동용기(cryovial)를 해동시키고 37℃ 및 5% CO2에서 CD OptiCHOTM 배지를 포함하는 125ml 진탕플라스크에서 5 x 105 생존가능한 세포/ml의 밀도까지 성장시킨다. 수개의 플라스크를 결합하여 4mM 글루타민을 가진 5 또는 10L 부피의 CD OptiCHOTM 배지에서 1-2 x 105 세포/ml로 웨이브백(wave bag)을 접종하였다. Sartorius Stedim Biotech에서 구입한 장비에 대하여 18-22rpm 및 8도의 각도로 세팅한 락킹 플랫폼(rocking platform)에서 5% CO2를 보충한 37℃ 인큐베이터내에 웨이브백 배양물을 유지한다. 배양물을 단백질 A HPLC 분석을 이용하여 세포수, 생존력, 영양 수준, 대사 프로파일 및 변이체 CTLA-4-IgG2(즉, D3-54-IgG2)의 발현 수준을 위하여 매일 샘플링한다. 접종 후 일반적으로 9-11일 후 생존력이 ~50%으로 감소할 때 배양물을 수확한다. 심층 여과 및 멸균 여과의 조합을 이용한 여과로 세포 배양 물질을 정화하고 추가적인 처리에 즉시 사용하거나 또는 2-8℃에서 저장한다.
변이체
CTLA
-4-
IgG2
융합 단백질의 정제.
AKTA Explorer HPLC 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 단백질-A 친화성 크로마토그래피로 변이체 CTLA4-IgG2 융합 단백질(D3-54-IgG2)을 정제하였다. 변이체 CTLA-4-Ig 융합 단백질(D3-54-IgG2)을 PBS 완충제(Invitrogen) 내에서 MabSelect 단백질 A FF 컬럼(GE Healthcare, #17-5079-01)에 결합시켰으며, 크로마토그래피 매질의 ~10mg/ml로 로딩하고, 동일한 완충제로 세척하고, 100mM 시트르산 완충제(pH 4.0)로 용출한 다음, 1/10 부피의 2M 트리스 염기를 첨가하여 중화시켰다. 20mM Tris-Cl, pH 7.5 내로 완충제 교환을 하는 접촉류 여과(tangential flow filtration, TFF) 시스템을 이용한 정용여과(diafiltration)로 단백질 A 정제된 샘플을 추가 처리한다.
~10mg/ml 로딩 밀도로 로딩된 Q-세파로오스 컬럼 상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 완충제 교환 단백질 샘플을 추가 정제한다. 20mM Tris-Cl, pH 7.5내의 0-500mM NaCl에서 20 컬럼 부피(CV) 선형 NaCl 경사를 이용하여 결합된 단백질을 용출시킨다. 대다수의 피크 부분을 모으고 280nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정한다.
SDS-PAGE 분석으로 단백질 순도를 확인하고 크기 배제-HPLC 방법을 이용하여 모노머 함량을 결정한다. 사용 전에 연장된 기간 동안 2-8℃ 또는 -20℃에서 샘플을 분액으로 저장한다.
상기 본 발명을 명확화 및 이해의 목적으로 약간 상세히 기술하였으나, 본 발명의 참 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부 사항에서 다양한 변형을 할 수 있음은 본 공지의 기록으로부터 당해 분야의 숙련된 자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 기술된 물질, 실시예, 및 구체예는 단지 설명의 목적을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않으며 본 발명의 관점에서 다양한 변형 또는 변경이 당해 분야의 숙련된 자에게 제안될 것이고 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 또는 다른 문서들은 각각의 상기 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문서가 개별적으로 특히 그 전체가 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로서 통합된다고 나타내어져 있고 본 명세서에 그 전체가 제시되어 있음과 같이 동일한 범위로 모든 목적을 위하여 그 전체가 참조로서 병합된다. 대립하는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서는 이를 제어할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (365)
- 각각의 모노머성 변이체 융합 단백질에 존재하는 두 개의 시스테인 잔기 사이에 형성된 하나 이상의 이황화 결합을 통해 연결된 두 개의 모노머성 융합 단백질을 포함하는 분리된 또는 재조합 융합 단백질 다이머로서, 각각의 모노머성 융합 단백질은 서열번호 197 또는 211에 나타낸 폴리펩티드 서열 또는 서열번호 199 또는 213에 나타낸 폴리펩티드 서열로 구성되는 융합 단백질 다이머.
- 제1항의 융합 단백질 다이머의 모노머성 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 분리된 또는 재조합 핵산.
- 제2항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제2항의 핵산 또는 제3항의 벡터를 포함하는 분리된 또는 재조합 숙주 세포.
- 포유동물에서 면역 반응을 저해 또는 억제하기 위한 의약으로서,
제1항의 융합 단백질 다이머를 포함하는 의약. - 면역계 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약으로서,
제1항의 융합 단백질 다이머를 포함하는 의약. - 포유동물에서 조직 또는 장기 이식 거부반응을 치료하기 위한 의약으로서,
제1항의 융합 단백질 다이머를 포함하는 의약. - 배양 배지에서 제4항의 숙주 세포를 배양하고 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
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