JPS60188070A - シグナルペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質の細胞外への分泌に作用するシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ及びこれを含有するＤＮＡ
に関するものである。

シグナルはプチドとは、細胞内で生７准された蛋白質を
細胞外へ分泌する働きケなすはプチドをいう。蛋白質は
一般に細胞内で生産蓄積はれるが、シグナルペプチドを
伴なう蛋白質は生産と併行して細胞外へ分泌されると言
われている。そこでシグナルペプチドを利用すれば細胞
内で生産でれる蛋白質全細胞外へ分泌することが可能と
なる。

蛋白質が細胞外へ分泌すれば次のような棟々の利点が考
えられる。すなわら第１に、細胞内で生産された蛋白質
を細胞外へ移行させれば、不純物の分離が容易となり、
精製、単離作業の労力低減が図れるし、また蛋白質は細
胞膜内の有毒物質を包含せず純粋に単離できるので、使
用用途が限定されず、広範囲に利用可能となる。第２に
細胞内で過剰生産されると、それ自身により生産が抑制
されるような蛋白質の場合でも、生合成系から外へ蛋白
質を移行させることにより、フィードバック阻害から解
放して、過剰生産が可能となる。第３に、細胞の生育に
有害になる蛋白質も細胞外へ移行させることにより、細
胞を健全に維持させながら生産が可能となる。

シグナルペプチド及びそのＤＮＡ塩基配列としては数種
のものが知られている。例えばバチルス・リケニフオル
ミスのベニンリナーゼのシグナルはプチド（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｖａｌ９．Ｎｏ１１
　＋２５７７＋１９８１）及びバチルス・アミロリクイ
ファシェンスのα−アミラーゼのシグナルペプチド（Ｇ
ｅｎｅ、　１５゜４３．１９８１　）が知られている。

本発明者らは、α−アミラーゼ生産性の極めて高い枯草
菌のα−アミラーゼ遺伝子をクローニングし、その解析
し、アミラーゼの雌釦のシグナルはプチド分よびそのＤ
ＮＡ配列と異なる新規なシグナルペプチドを見出したも
のである。その結果、既知のシグナルはプチド及びその
ＤＮＡ塩基配列と異なる新規なシグナルペプチド及びそ
のＤＮＡ塩基配列を発明した。

本発明におけるＤＮＡ’ｉｉ用い、α−アミラーゼ高生
産性を有する枯草菌全宿主として用いたホストベクター
系にて蛋白質の土曜を行えば、異なる生物を用いる場合
や異なる生物のシグナルはプチドを用いる場合に比べて
、安定性や分泌生産性等が優れている。

すなわち本発明は新規なシグナルはブチドである Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
　Ｐｈｅ人１ａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　ＰｈｅＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ をコードする新規なりＮＡ塩基配列である。史に好まし
いＤＮＡ塩基配列は、次のものである。

ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＴＴＣＡＡ
ＡＡＣＣＴＣＴ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　’［’ｒＡ
　ＴＴＣＧＣＴ　（Ｋ）Ａ　’ｒ’ｌ”Ｌ’　ＴＴＡ　
ＴＴＧ　Ｃ’Ｌ’Ｇ　ＴＴＴＴＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　
ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＣＣＧＧＣＧ　ＧＣＴ　ＯＣ
Ｇ 本明細−運で用いる記号の意義は、Ｆ記に示すとおりで
ある。

Ｍｅｔ　メチオニン Ｐｈｅ　フェニールアラニン Ａｌａ　アラニン Ｌｙｓ　リジン Ａｒｇ　アルギニ／ Ｔｈｒ　スレオニン ８ｅｒ　ヒリン Ｌｅｕ　ロイシン Ｐｒｏ　プロリン Ｇｌｙ　グリシ／ Ｔｙｒ　チロシン Ｖａｌ　バリン Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ａｓｎ　アスパラギン Ａ　アブ二ノ Ｔ　チミ／ Ｇ　グγ二／ Ｃシトシン また本発明の各種アミノ酸をコードするＤＮＡ塩基配列
は下記に示すと分りである。

なおＦ記に示す塩基は、メチル化等された修飾塩基も含
むものとする。

Ｍｅｔ　ＡＴＧ Ｐｈ　ｅ　ＴｒＴ　、ＴＴＣ’ Ａｌ　ａ　ＧＣＴ、ＧＣＣ，ＧＣＡ、ＧＣＧＬｙｓ　ｈ
蹟、ＡＡＧ Ａｒｇ　ＡＧＡ、ＡＣ３Ｇ、ＣＧＴ、ＣＧＣ，ＣＧＡ、
Ｃ（）Ｃ）Ｔｈ　ｒ　ＡＣＴ　、ＡＣＣ、ＡＣＡ　、Ａ
ＣＧＳｅ　ｒ　ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧ
Ｔ　、ＡＧＣＬｅｕ　ＴＴＡ、實Ｇ、ＣＴＴ　、ＣＴＣ
、ＣＴＡ、ＣＴＧＰｒｏ　ＣＣＴ、ＣＣＣ，ＣＣＡ、Ｃ
ＣＧＧｌｙ　α）’ｒ　、ＧＧＣ、ＧＧＡ、α刀Ｔｙｒ
　Ｔにｒ　、ＴＡＣ Ｖａ　ｌ　ＧＴＴ　、ＧＴＣ、ＧＴＡ　、ＧＴＧＧｌｕ
　ＧＡＡ、ＧλＧ Ａｓｎ　ＡＡＴ、ＡＡＣ 本発明は、前述したアミノ酸をコードする穐々の塩基配
列を適宜選択できる。

本発明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
からなるＤＮＡ及びこれを含有するＤＮＡは化学合成的
にも削製できるし、また菌体の染色体ＤＮＡからも抽出
できる。

菌体の染色体ＤＮＡから抽出する方法に分ける使用菌と
しては、たとえばα−アミラーゼ高生産枯草菌バチルス
・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｔｓ）が
ある。ここでいうα−アミラーゼ高生・ψ枯草菌（バチ
ルス・サチルス）には、歴史的に改良され、バチルス・
サチルス１６８株に由来する６１６０株ＩＣバチルス・
ナツト−のα−アミラーゼ制Ｈ遺伝子をいれたＮＡ（５
４株（ＩＡ４１２）寺があシ、α−アミラーゼを菌体外
に多量に分泌する特性全弁している。このＮＡ６４株（
１人４１２）の入手は、代に広く普及して≧り容易であ
り、たとえば’［’ＨＦ３　ＢＡＣＩＬＬ（Ｊ８　（３
（８ＮＢＴＩＣ１３’ｌｆＫ　Ｃ１ＢＮ’ｒＢ［’Ｌ　
（ＴＨｇＯＨＩＯＳＴＡＴｇ　ＵＮＩＶｇＲ，９ＩＴＹ
　）にて容易に入手可能である。また、ＮＡ６４株はＦ
’ｇＲＭ　１３Ｐ−４２３として做工研に寄託されてい
る。

本発明のシグナルにブチドをコードするＤＮＡ断片を作
製する方法は固相ホスホトリエステル法の如く化学合成
で行うのが迅速であり最も好ましい。

本発明のＤＮＡ断片を用いて所望の蛋白質の遺伝子を連
結させて蛋白質を分泌生産させる場合は１、を伝子の組
換えを行う際に一般的に行なわれているようＫ・・イブ
リッドＤＮＡ’ｚ作製する工程の手間の省力化及び簡易
性を考慮しなければならない。

すなわらシグナルペプチド全コードするＤＮＡ（（作製
し、別途他の必要なりＮＡ断片を改めて連結するよりも
、遺伝子発現に必要なプロモーター領域及び連結処ｉ２
［！を容易にするためのす／カー等が連結されたシグナ
ルはプチド會コードするＤＮＡを含むＤＮＡ４１片を直
接作製するのが最も効率が良い。例えば次のような本発
明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ
断片が使用できる・・ ＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧ　ＡＡＧＡＧＣＧＧ’Ｌ”ＡＡ
ＧＣＧＡＧＧＧＡＡ　ＡＣＡＧＴＣＴＣＧＧ　（）ＣＡ
ＧＴＴ’［’ＴＴＴにｒＡＧＧＡＣＣＡＴ　ＴＧＡＴＴ
ＴＧＴＡＴ　ＴＣＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＴＴ’
ｔ″Ｔ　ＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡ　ＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴ
ＴＴＡＡＡＡＴＧＴＡ　ＡＧＣ（）ＴＡＡＡＣＡ　ＡＡ
ＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＣＡ’［’　ＣＡＧＴ
ＴＴＧＡＡＡ　ＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＧＴＧＴＣＡＡ
ＧＡ　ＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡ　ＡＡＣＧＡＴＴＣＡＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＴＴＡ　ＣＴＧＣＣＧＴＴＡＴ　ＴＣＧＣ
ＴＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧ　ＴＴＴＴＡ’ｒＴ
ＴＧＧ　ＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴ　
ＧＣＧ 本発明のシグナルペプチドをコードする塩基配列の後に
分泌全所望する蛋白質全コードするＤＮＡ塩基配列を連
結し、適当な発現プロモーター及びベクターを用いて菌
体内へ組込んだ場合、菌体外へ分泌される蛋白質は本来
の正しいＮ末端を有するものとなる。これは菌体外への
分泌の際、所望の蛋白質のＮ末端アミノ酸と本発明のシ
グナルペプチドのＣ末端のアミノ酸の間で切断が起きる
ものと考えられる。

ところで本発明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
の下流（６′末端側）に、他のＤＮＡ配り１ｊが付加さ
れているシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むＤ
ＮＡ断片を用いた場合には、苗木外へ分泌される蛋白質
のＮ末端側に、付加され／ｃＤＮＡ配列に相当するペプ
チドが結合したまま、す泌式れる場合があることがわか
った。このような所望の蛋白質に、更に他のペプチドが
結合した蛋白質は、余分のはブチド全切祈し稍製しなけ
れば、所望の蛋白質の活性が発現しない場合がある。

またこのペプチドを切断しないで生体内へ接種した場合
には、本来の蛋白質と異なることから、免疫上支障をき
たすことがあり、生理上からも好ましいものではない。

本発明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列金含
むＤＮＡ断片を蛋白質の分泌システムに利用した場合に
は、このような欠点が生じない。

これも本発明の大きな％敵の一つである。

以下に本発明のシグナルベプテド？コードするＤＮＡ塩
基配列會含むＤＮＡ断片の創製例を具体的に説明するが
、当該説明例は何ら発明を制限するものでない。

創製例 α−アミラーゼ遺伝子の調製は次のようにした。

菌体外酵素α−アミラーゼ全生産するバチルス・サチル
スＮＡ６４株（Ｉ　Ａ　４１２　）　（ＦｇＲＭ　ＢＰ
−４２３）から、８ａｉｔｏ、　Ｍｉｕｒａ法（Ｈ，８
ａｉｔｏ　ｅｔａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ａｃｔａ、　７２　６１９　（１９６５））によ
シ染色体ＤＮＡを調製した。

まだ、テ／ベレートファージｌ）　１１　（Ｄｅａｎ。

Ｄ、Ｈ，ｅｔａｌＪ、Ｙｉｒｏｌ、２０　５０９　（１
９７６））の調製は次のようにした。テンペレートファ
ージρ１１の溶原ｍをマイトマイシンＣ（協和）処理で
誘発しρ１１粒子を得た。

ρ１１は、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法Ａ心前の塩
化七シウム溶液の密度は、１．５１ｉ／ｃｒｌにする。

）により精製した。私製ρ１１粒子より５ＤＳ−７二ノ
ールーエタノール沈殿／Ｉｎｃ　、１：　！ｌ　ＤＮＡ
を調製した。

前述のようにして得られたバチルス・サテルスＮＡ６４
株から得た染色体ＤＮＡとρ１１ＤＮＡと全制限ｆ孝Ｊ
ｆ：埠ワーＨＩ（蟹酒造）で切断後、Ｔ４−リガー七（
￥Ｌ７Ａ造）で連結させ、河村らによる方法（Ｋａｗａ
ｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｇｅｎｅ、　５．８７　（
＋９７９））　または、封材らの方法（Ｎｏｍｕｒａ　
ｅｔ　ａｌ　：　Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　４３．２６３７．　（１９７９
）により、α−アミラーゼ帆伝子全保何する特殊導入フ
ァージ粒子金を得た。得られたα−アミラーゼ位伝子を
保何する特殊導入７ア一ジ粒子より、５ＤＳ−フェノー
ル・エタノール沈殿法により、α−アミラーゼ遺伝子全
保有するρ１１ＤＮＡ’ｅ調製した。

次に得られたρ１１ＤＮＡを、制限酵素生咀６Ａ（全酒
造）で部分分解した。このものとプラスミドｐＵＢ　１
１０のｉ＆ｌＪ限酵素抛二憂］■切断部分にＴ４リガー
ゼを用いて結合しハイブリッドプラスミド混合物を得た
。

この混合物を用いて枯草菌をプロトプラスト形質転ｐｐ
法（８，Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ
、　Ｍ、　Ｇ、　Ｇ。

１６８、１１１．　’７９　）ｉ：用いて形質転換した
。形質転換株の中からカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍ
１）１」４′つα−アミラーゼ活性のある株を選択した
。これらの株葡カナマイシン添加培地（１０μｇ／ｌｎ
りにて紳枠培養し、常法のクリアートライゼート法にＬ
リプラスミドを調製した。得られたプラスミド全制限酵
素盗ｏＲＩ（全酒造）及びＸｂａＩ（全酒造）にて切断
し、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．４
　ｋｂｐのバンドを目標として、ヒドロキシアノξタイ
ト法（Ｈ，Ｆ、　ＴａｂａＫ　ａｎｄ　Ｒ，Ａ。

Ｆｌａｖｅｌｌ　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｌｌ　
ｓ、　２３２１．　’７８　）にてゲル中よりＤＮＡ断
片を抽出した。この０１片を更に制御Ｉ１１酵素悼ＩＩ
Ｉ（全酒造）で切断し、５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、約０．４６ｋｂｐのバンドを切りとシ、
抽出緩岨丁液（０，１、ｊ１４Ｔｒｉｓ　Ｔ−ＩＣｌ（
ｐｉ１８．０　）　、　０．５Ｍ酢＃ｒンモニウム。

１０ｍＭＥＤ’［’Ａ）で約０．４３　ｋｂｐ　ＤＮＡ
　ｆ：抽出しブζ。

更にこの約０．４３ｋｂｐＤＮＡｌｔ７ｒ片を制限酵素
勇ソ■（宝繍造製）にて切断し、５％ポリアクリルアミ
ド′亀気気泳動かけ、約０．３８ｋｂｐＤＮＡ４；ｆｒ
片を抽出精製した。抽出ＤＮＡをｇ−、ｃｏｌｉ　Ｄ　
Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ　）　（全酒造）及びｄＮＴＰ（ヤマサ醤油）を用
いて末端部分全ダブルストランドとしたのら６５℃１０
分加熱処理を行った。このように処理１，７／こＤＮＡ
藺片とＨｉｎｄｌ［リンカ−（宝？西造）と全Ｔ４　り
万一ゼで常法通り結合したのら、制限酵素惠剪Ｔ［（全
酒造製）で切断したのら５％ポリアクリルアミドゲルで
泳動後、ｔ（ｉｎｄ　Ｎ　’Ｊンカーが結合した約０３
９ｋｂｐの当該−片召：ゲル中Ｊニジ抽出した。このよ
うにして本発明で目的とするシグナルペプチドをコード
するＤＮＡを含むＤＮＡＩ所片を得た。

このＤＮＡ断片が本発明で目的とするγミノｒ浚配列金
コードしていることは、このＤＮＡ断片をＭａｘａｍ　
−Ｇ１１ｂｅｒｔ法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｇｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙｖｏｌ　６５．４９９　）で分析することに
よって確認することができた。

この断片の一方の端には以下に示される本発明のシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡが含まれていることが確
認できた。

５’　−ＡＴＧ　Ｔ’ｒＴ　ＯＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　
ＴＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡ　（ＹＪＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴ
　ＡＡＧ　ＴＴＴＡＣＣＴＣＴ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　Ｃ（
Ｘ）　ＴＴＡ　’Ｉ’ｌ’Ｃ直ＡＧＡ　、静、Ｔ弘Ｃα
℃ん口ＡＡＧＯＣＴ　（ＸＩＡ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　’Ｉ
’ｒＧ　ＣＴＧ　ＴＴＴＣＧＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡ
Ｔ　ＡＡＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＣＴ
ＣＧＣＡ　（Ｋ）Ａ　ＣＣＸ）ＡＴＡ　ＡＡＣＣＡＡ　
ＧＡＣＣＧＴ　ＣＣＴ　ＧＧＣＧ（Ｘ）　ＧＣＴ　ＯＣ
Ｇ　ＣＡ　−３’ＣＧＣＣＧＡ　ＣＧＣＧＴＴ　（Ｘ）
Ａこの配列の５′末端の上流にはα−アミラーゼ由来の
発現に必要なプロモーター領域が含まれており、シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の一方
の末端は上記配列の３′末端が該当していた。

以下この断片をＢ−６１と略す。

実盤例 １．８−４１の作製 創製例と同様にしてＡＩｕＩで切断された約０．４３ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を調整した。

この断片とＨｉｎｄｌ［リンカ−（宝グ１造）とをＴ４
リガーセ（全酒造）で常法通シ結合し、１ｉｉｌＪ限酵
素Ｈｉｎｄ工■（全酒造）で切断したのち５％ポリアク
リルアミドゲルで泳動後、Ｈｉｎｄｕリンカ−が結合し
た約０．４３ｋｂｐの当該断片をゲル中より抽出した。

この断片の塩基配列はＭａｘａｍ　−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ
法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｇｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏ
ｌ　６５　＋　４９９　）で分析することによって確認
することができた。

この断片の一方の端には以下に示されるように本発明の
シグナルはプチドをコードするＤＮＡがその一部に含ま
れていることが確認できた。

５’　−ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　Ｔ
ｒＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡ　ＣＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　Ａ
ＡＧ　實ＴＡＣＣ’ｌ’ｃＴ　貫Ａ　ＣＴＧαＥＧ　Ｔ
ＴＡ　ＴＴＣ’１ｍ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＧＡＣＧＧＣＡ
ＡＴ　ＡＡＧＧＣＴ　ＧＧＡ　’Ｉｖｒ′ｒＴＴＡ　’
ＩｖＩ’Ｇ　Ｃ’ｌＸ］　實ＴＣ（Ｍ　ＣＣＴ　ＡＡＡ
　ＡＡＴ　ＡＡＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴ　？ｒＧＧＴＴ　
ＣＴＧ　（ＫＥＡ　（Ｋ）Ａα℃ＡＴＡ　ＡＡＣＣＡＡ
　ＧＡＣａ）Ｔ　ＣＣＴ　（）ＧＣ（）ＣＧ　ＧＣＴα
ＥＧ　ＡＧＴ　ＧＣ’ｒ　ＧＡＡ　ＡＣＧα℃■Ａ　Ｃ
（３ＣＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　’ＩＹＪＣ（）ＣＧ　
ＡＡＣＡＡＡ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡ　−５’
（ＸＩＣ’Ｉ’ｌＵ　’Ｉ’ｌ’Ｔ　ＡＧＣ貫Ａ　ＣＴ
ＣＧＴＴ　ＣＧＡこの配列の５′末端の上流にはα−ア
ミラーゼ由来の発現に必要なプロモーター領域が含まれ
ており、シグナルはプチドをコードするＤＮＡを含むＤ
ＮＡ断片（約ｏ、４３　ｋｂｐ　）の一方の末端は上記
配列の３′末端が該当していた。上記配列は５′末端よ
シ、３１個のアミノ酸をコードする部分のＤＮＡ塩基配
列はＢ−６１のものと同一である。即ち、Ｂ−６１の５
′末端に更に一連の別のＤＮＡ配列が連結された状態に
なっているものである。以下この断片をＢ−４１と略す
。

２、ベクター及び異種蛋白質をコードする遺伝子断片の
調整 ベクターとしてシラスミドｐＵＢ　１１０を、そして分
泌主入をさせる２Ａ抽蛋白質としてＦｒ、　ｃｏｌｉを
宿主とするプラスミドルＢ几３２２由来のアンピシリン
分解酵素を用いた。

ｐＵＢ　１１０を制限酵索垣ＨＩで切断し、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋ！ｅｎｏｗ　ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ　）で処理し、ＨｉｎｄＮリンカ−を結
合し、Ｈｉｎｄｕで切断したのち０．８％アガロースゲ
ル泳動よシ前述と同イ求にＤＮＡを抽出し、ベクターと
して用いた。

またｐＢ几５２２を制限酵素、μ：ｏＦｔＩにより充分
に切断したのちエキソヌクレアーゼＢａｌ’３１（Ｂ几
Ｌ）により約６０秒間切断したのち、エタノール沈殿を
行いＤＮＡを濃縮精製したのち再び制限酵素１１ｓｔ　
Ｎ１　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ　
）により充分切１ｆｆｒＬだ。次いで１．２％アガロー
スゲルで泳動したのち、約１．４乃至１．５　ｋｂｐ付
近のＤＮＡを切り出しＩ）　Ｎ　Ａをゲル中よりヒドロ
キシアパタイト法を用いて抽出した。抽出物をＥ、　ｃ
ｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ　
ｆｒａｇｍｅｎｔ　）　（宝酒造）及びｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ
　（ヤマナ醤油）を用いて末端部分をダブルストランド
としたのち前述と同様にＨｉｎｄｌ［リンカ−を結合し
、旦すｄＮ切断を行い、１．２％アガロースゲル泳！助
によシ同ルｒ片を切出し、アンピシリン分解酵素をコー
ドするＤＮＡ断片とした。

３、　アンピシリン分解酵素の分泌生産１ｉｉ７述の如
く得られた（フタ−とアンピシリン分解酵素をコードす
るＤＮＡ断片とＢ−６１あるいはＢ−４１の三断片を略
等敏づつ混合し、Ｔ４１Ｊガーゼで結合したのち常法に
よシ枯草菌プロトプラスト中に取り込ませ、再生を行っ
たのち、カナマイシン１０μ：ｉ／ｍｌ含有培地にて培
養し、当該培地上にて生育可能な形質転換株をそれぞれ
得た。

これらの株のうちニトロセフイン溶液をスプレーシテ赤
い発色をマーカーとしてアンピシリン分解酵素生産株を
選択した。（Ｋ、　Ｏｈｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９５　、８７−９３．’８
４　）Ｂ−３１あるいはＢ−４１由来のそれぞれの単離
された株をカナマイシン１０μｌ／ｍｌ含有Ｌブロスで
培養を行うとそれぞれの培養液中にはアンピシリン分解
酵素が分泌されていた。酵素の活性はニトロセフインを
基質とした反応系により測定した。

（０’　Ｃａｌｌａｇｈａｎ　Ａ、　Ｈ，、Ｍｏｒｒｉ
ｓ　Ａ、、　Ｋｉｒｂｙ　Ｓ、　Ｍ。

＆　８ｈｉｎｇＩｅｒ　Ａ、Ｈ，、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ、ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ−１＋　２８６−
２８８．’７２）培養液中に分泌された酵素を常法によ
りＴＣＡ溶液にて沈殿濃縮したのち、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルにより分子量測定を行った。その結果、Ｂ
−４１からは分子量約２８．２００の蛋白質、Ｂ−６１
からは分子量約２７，２００の蛋白質、が検出された。

Ｂ−６１から得られた蛋白質の分子量約２７．２００は
、アンピシリン分解酵素自体の分子ｈｔと山ｎｃｌＪＩ
［リンカ−によシコードされる数個のアミノ酸の分子量
との和にｔ′５：ぼ一致した。

一方Ｂ−４１から得られた蛋白質は分子量約２８．２０
０より、Ｂ〜ろ１により得られた蛋白質の分子量約２７
．２［１０に比べ、約１０００多かった。しだがってＢ
　−４１から得られた蛋白質にはアンピシリン分解酵素
と？−１ｉｎｄｌ［リンカ−によりコードきれる数個の
アミノ酸のｅｔかに、他のペプチドが付加されていた。

壕だＢ−６１を使用した糸の方がＢ−４１の系よりも、
アンピアリン分解酵素の生産量はより多かった。

以上のことから、本発明のシグナルはプチドをコードす
るＤＮＡに、更にＤＮＡが付加されたシグナルＲプチド
奢用いて蛋白質を分泌する場合、本発明のシグナルペプ
チドを１吏用した場合に比べ蛋白質のＮ末端上流にシグ
ナルペプチドの一部が切断されずに、結合したまま分泌
されるばかシでなく、分泌蛋白質の生産量も劣ることが
わかった。

なお前述した創製例及び史、険例における枯草菌の培養
は、ρ１１の調製の際にはＬ　−ｂｒｏｔｈ改良型（１
００＋１１７１！当り、　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｏｔｏｎ
ｅ　（Ｄｉｆｃｏ　）１９’、　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒ
ａｃｔ　（Ｄｉｒｃｏ　）　０．５　ｇ＋　ＮａＣ６１
、０、！ｌ’　、　ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｏ，２！９．ｐＨ
１Ｏ）を用い、他の場合はＬ　−ｂｒｏｔｈ　（Ｌ　−
ｂｒｏｔｈ改良型においてＮａＣ１１を０６５Ｉにしだ
もの）を用いいづれの場合も振盪培養を行った。また酵
素反応、電気激動、ＤＮＡ抽出等に使用した緩衝液等１
よいづれも、説明書、多くの各捕文献、あるいは手引書
等に記載されている一般的な組成を用いたものである。

ちなみに、創製例、実験例で実施した制限酵素や他の酵
素の反応は酵素購入時に添付されている説明書に記載さ
れた緩イ藺液及び反応条件に従った。

代理人　弁理士　戸　１）イ１１　男 手続補正書 昭和５９年６月２９日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４３８２６号 ２、発明の名称 シグナルペプチドをコードするＤＮＡ及びこれを含有す
るＤＮＡ ３袖正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　茨城県新治郡桜村竹園三丁目６ｊ４−２０１４
、代理人 住　所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目１９番１４号
邦楽ビル５０６ ５、補正により増加する発明の数　なし６、補正の対象 明細書 Ｚ補正の内容 （１）明細書１４頁４行目〜９行目「抽出ＤＮＡヲＥ、
　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・）Ｔｉｎｄｌリンカ−（全酒造）とｒ
」とあるを、 「別途、固相ホスホトリエステル法を用いて、した。次
に常法に従い、Ｔ４トリヌクレオチドキナーゼ（全酒造
製）を用いて５′末端にリン酸基を結合したのち、それ
ぞれのＤＮＡ断片を約等モルずつ混合し、常法に従いア
ニーリングし、タプルストランドのＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片と先に抽出精製した約０．３８　ｋｂｐ
　ＤＮＡ断片とを約２０：１の割合で混合し、」と補正
する。

（２）明細書１４頁１２行目ｒＨｉｎｄｌ　リンカ−が
結合した」とあるを削除する。

（３）明細書１４頁１２行目「約０．３９　Ｊとあるを
、「約０．４０　Ｊと補正する。

（４）明細病１４頁１６行目「・・・・・・抽出したＪ
の後に以下の文を挿入する。

「この処理によりＨｐａｌルミｌサイトりＮＡが付加さ
れ、新たにＨ１ｎｄｌｌｌサイトになっているＤＮＡ断
片が得られた。」 （５）明細書２０頁１５行目「・・・・・・沈殿濃縮し
たのち、」の後に以下の文を挿入する。

「　１０チ」

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シグナル啄プチド Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌ
   ｙｓＴｈｒ　８ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
   　ＰｈｅＡｊａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
   ｅｕ　ＰｈｅＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
   　Ｇｌｙ　Ｐｒ。 Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ をコードするＤＮＡ塩基配列からなるＤＮＡ及びこれを
   含有するＤＮＡ０
2. （２）　シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
   が Ａ’ｒＧ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　’Ｉ’［
   ’ＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴ　’ＩＴＡ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　
   ’Ｉ’ｒＡ　ＴＴＣＧＣＴ　ＧＧＡ　’Ｉ’ｒＴ　ＴＴ
   Ａ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　Ｔ’ｒＴＴＡＴ　ＴＴＧσ百ＣＴ
   Ｇ　ＧＣＡ艶Ａ　ＣＣＧＧＣＧ　ＯＣＴ　ＧＣＧ である特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ及びこれを含
   有するＤＮＡ０
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ塩基配列から
   なるＤＮＡ１含有するベクター。