KR100209921B1

KR100209921B1 - 신규한 칼시토닌의 제조방법

Info

Publication number: KR100209921B1
Application number: KR1019960066177A
Authority: KR
Inventors: 최차용; 최윤희
Original assignee: 허일섭; 주식회사녹십자
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 1999-07-15
Also published as: KR19980047664A

Abstract

본 발명은 유전자 재조합법을 이용한 칼시토닌의 효율적인 제조, 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각종 칼시토닌을 대량 생산하기 위하여 유전자 반복 배열 개념을 설계, 사용하였고 단백질 생산을 위하여 세포 내부 생산법을 사용하였다. 디자인된 칼시토닌의 생산효율을 높이기 위하여 유전자 재조합방법을 사용, 유전자를 반복 배열시켜 다수의 칼시토닌을 한 분자의 고분자 단백질로 발현 시키는 방법 및 세포 내부 생산방법에 의한 고농도 대량 생산 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명에서 새롭게 디자인된 칼시토닌의 반복 배열 대량 생산방법은 기존의 칼시토닌 생산방법을 크게 개선할 수 있다. 또한, 상기의 반복 단백질 고분자 생산법은 무세포 단백질 생산법과 함께 다른 단백질의 생산에도 적용될 수 있다.

Description

신규한 칼시토닌의 제조방법

제1도는 디자인된 인간-연어 혼성 칼시토닌의 아미노산 서열 중의 하나인 변형된 인간-연어 혼성 칼시토닌의 아미노산 서열도.

제2도는 디자인된 인간-연어 혼성 칼시토닌의 아미노산 서열에 따라 디자인된 유전자 서열도.

제3도는 본 발명에 사용된 벡터 플라스미드 pET-3b의 유전자 지도.

제4도는 본 발명에 사용된 벡터 플라스미드 pHK414의 유전자 지도.

제5도는 디자인된 칼시토닌 유전자를 벡터 플라스미드 pHK414에 삽입하고 반복 배열로 만드는 방법을 나타낸 개략도.

제6도는 일련의 벡터 플라스미드 pHK414/칼시토닌들로 부터 각 반복 배열 수의 칼시토닌 유전자를 절단해내어 벡터 플라스미드 pET-3b에 삽입하여 일련의 벡터 플라스미드 pET-3b/칼시토닌을 제작하는 방법을 나타낸 개략도.

제7도는 반복 배열된 칼시토닌 펩타이드를 단량체로 분리해내고 활성화시키기 위하여 아미노산 서열을 첨가하여 디자인된 단백질 서열도.

제8도는 pHK414/Cal로 형질전환된 JM109 및 pET-3b/Cal로 형질전환된 BL21(DE3)를 배양한 후 단백질 발현을 유도하고 세포 단백질을 SDS-PAGE 방법을 통해 분석한 겔 사진.

본 발명은 유전자 재조합법을 이용한 칼시토닌의 효율적인 제조, 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각종 칼시토닌을 대량 생산하기 위하여 유전자 반복 배열 개념을 설계, 사용하였고 단백질 생산을 위하여 세포 내부 생산법을 사용하였다. 그중에서도 인간 및 연어 칼시토닌 각각의 부작용을 제거하기 위하여 인간-연어 혼성 칼시토닌의 아미노산 서열을 적절히 조합하는 개념을 사용하였고 디자인된 칼시토닌의 생산효율을 높이기 위해 유전자 재조합 방법을 사용, 유전자를 반복 배열시켜 다수의 칼시토닌을 한 분자의 고분자 단백질로 발현시키는 방법, 그리고 세포 내부 생산방법에 의한 고농도 대량 생산 방법에 관한 것이다.

칼시토닌은 많은 척추동물의 내분비계에서 칼슘농도를 조절하는 펩타이드 호르몬으로서 뼈의 재구성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 생물학상의 종의 종류에 관계없이, 일반적인 칼시토닌의 공통구조로는 32개 아미노산으로 구성되어 있는 점, 아미노산 서열 1번과 7번의 시스테인이 서로 이황화물 결합에 의해 연결되어 있는 점, 그리고 32번의 프롤린이 아미드화되어 있다는 점을 들 수 있다.

칼시토닌은 생리학적 활성정도 및 아미노산 서열의 상동성이 종에 따라 차이를 나타내는데, 인간 및 쥐를 대상으로 한 칼슘농도 저하활성실험에서 연어 칼시토닌, 뱀장어 칼시토닌, 닭 칼시토닌이 높은 활성을 나타내고, 인간 칼시토닌은 칼슘농도 저하활성이 매우 낮으나 투여시 항원성이 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다.

칼시토닌은 의학적으로 파젯병(Paget's disease) 및 골다공증등, 뼈대사이상 질병의 치료재로써 널리 사용되고 있는데, 그 치료효과를 높이기 위하여 비교적 많은 양이 투여되며 치료기간도 평균 1년 이상이 걸린다. 또한, 암 진단용 표식 물질로써도 널리 사용되고 있으며, 칼시토닌 자체의 진통효과도 보고되고 있으므로 그 이용 및 사용범위는 매우 광범위하다. 그 중 가장 많이 사용되고 있는 분야갸 뼈 대사이상 질병치료분야인데 이러한 질병은 인간의 수명이 연장됨에 따라 뼈의 재구성에 있어 필연적으로 예견되었던 질병이고 현재 이 종류의 질병 발생율이 계속 증가일로에 있다.

다양한 종 유래의 칼시토닌 중에서 현재 치료제 및 의약용으로 가장 널리 사용되고 있는 것은 연어 칼시토닌이다. 현재까지 이 연어 칼시토닌은 주로 화학합성 방법에 의해 생산되어 왔다. 미생물발현체계를 이용한 일반적인 유전공학방법은 발현 후 수정단계의 결핍 때문에 프롤린의 아미드화가 불가능하여 활성을 지닌 칼시토닌을 생산할 수 없었고, 전구체조차도 작은 분자량 때문에 세포내 단백질 분해효소의 공격을 받아 분해되는 문제점이 있었다. 고등생물 발현체계의 경우 세포내 발현후 단백질의 수정(프롤린의 아미드화)은 가능하나 화학합성방법에비해 경제적인 가격의 대량생산이 불가능했다.

효소학적으로 C-말단을 아미드화하는 방법이 개발된 이후, 연어 칼시토닌 본래의 32개의 아미노산에 글리신이 하나 더 붙은 전구체를 유전공학적인 방법으로 거대 단백질과의 융합형태로 미생물(대장균)에서 발현 생산하는 방법도 보고된 바 있다(Bio/Technology 11: 64~70, 1993). 이처럼 미생물을 사용하여 거대 단백질과의 융합형태로 발현될 경우, 융합 단백질 자체의 생산성이 높고, 거대 단백질을 이용한 분리 정제가 용이하였다. 하지만 융합 단백질에서 작은 분자량이 목적 단백질(이 경우 칼시토닌)을 절단, 분해해 낼 경우, 그 생산성은 크게 떨어졌다. 또한, 세포내 전사발현 체계 이용상의 효율성 견지에서 볼 때도 결국 절단해내야 하는 거대 단백질이 다량 전사 발현되어야 하므로 매우 비경제적이었다.

연어 칼시토닌의 경우 칼슘농도 저하활성이 인간 칼시토닌에 비해 20-30배에 달하지만 항원성을 나타내어 투여시 항체를 발생시키고 그로 인한 중화 효과로 투여량이 계속 증가되어야 치료 효과를 나타내는 부작용을 가지고 있었다. 또한, 소화기관에 악영향을 끼쳐 구토, 메스꺼움 등의 현상을 일으켜 환자의 체중 감소 및 치료 기피를 유도하였다. 반면, 인간 칼시토닌은 항원성도 없고, 소화기관에 대한 악영향도 연어 칼시토닌에 비해 매우 적으나 낮은 활성 때문에 치료에 사용하기에 부적합하였다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여, 칼시토닌의 아미노산 서열 구조와 활성 및 부작용과의 관계에 대한 연구 보고가 있었고, 칼시토닌 32개 아미노산 중 C-말단과 N-말단을 16개 아미노산으로 나누어 C-말단의 16개 아미노산은 인간 칼시토닌 아미노산 서열로, N-말단의 16개 아미노산은 연어 칼시토닌 아미노산 서열로 단순 융합시킨 혼성 칼시토닌도 화학합성 방법에 의해 합성된 바 있다. 이 경우 항원성도 없고 칼슘농도 저하활성도 연어 칼시토닌과 유사하게 높았으며 진통효과도 유지하고 있었으나 화학 합성 방법 자체의 낮은 생산성은 극복하지 못했다(Endocrinology 131: 2885-2890, 1992).

본 발명에서는 종래의 칼시토닌 생산방법인 화학합성 혹은 미생물을 이용하더라도 거대 단백질과의 융합단백질 생산방법의 낮은 생산효율을 개선하고자 하는데 그 목적이 있다.

또한, 인간 및 연어 칼시토닌 각각의 부작용과 단점을 극복하고자 하였으며, 유전자 재조합 기술에 의해 미생물로부터 보다 값싸고 간편한 방법으로 많은 양을 생산하여 기존의 화학 합성 방법의 생산성을 능가하고자 하였다.

미생물에서 생산할 경우 분해 안정성 혹은 분리 정제를 위하여 사용하는 융합 단백질 생산방법의 비경제성을 극복하고자 반복배열의 고분자 단백질을 생산하였다. 이와 같이 디자인된 반복 고분자는 세포내 고농도 발현시 문제가 되는 봉입체(inclusion body)의 형성의 방지를 위하여 고안된 무세포 전사 발현 시스템에 응용, 일정 아미노산 조성의 기질액 공급 조절에 의해 세포내 생산 방법의 한계를 극복하여 고활성의 단백질을 높은 생산성으로 생산할 수도 있다.

화학 합성 방법으로 칼시토닌이 생산될 경우의 낮은 합성 효율을 극복하고자 미생물계를 이용하였다. 인간 및 연어 칼시토닌 각각의 부작용과 단점을 없애고자 인간-연어 혼성 칼시토닌 아미노산 서열을 새롭게 디자인하였다. 인간 칼시토닌과 연어 칼시토닌은 기본적인 칼시토닌 공통구조(32개 아미노산으로 구성된 점, 1번과 7번 시스테인이 이황화물결합(Disulfide bond) 하는 점, 32번 프롤린이 아미드화되어 있는 점)를 가졌지만, 아미노산 서열상 상동성이 매우 낮다. 본 발명에서는 N-말단은 인간 칼시토닌의 아미노산 서열, C-말단은 연어 칼시토닌의 아미노산 서열을 기본으로 하는 인간-연어 혼성 칼시토닌의 아미노산 서열을 디자인하였다.

이 단백질을 미생물계에서 효율적으로 생산하기 위하여 유전자 재조합 수준(upstream level)과 생산수준(downsteam level)의 기술 및 방법을 개발하였다.

유전자 재조합 수준의 인자로는 숙주세포 및 벡터 플라스미드의 특성, 코돈의 선호성, 발현의 효율성등이 있다. 이 중 코돈은 숙주세포의 종류(미생물, 동물세포)에 따라 그 선호도 차이가 보고되어 있다. 본 발명에서는 숙주세포로 사용된 대장균에 선호도가 큰 코돈으로 칼시토닌 유전자 및 인접 유전자 서열을 재구성하였다.

발현 생산용 벡터 플라스미드는 강력한 프로모터와 전사종결신호를 갖는 벡터 플라스미드를 사용하였다. 그 구체적인 한 예로서 pBR322벡터 플라스미드 유래의 pET-3b벡터(Novagene co., USA) 플라스미드는 인간-연어 혼성 칼시토닌의 유전자 운반체로서 항생물질 저항성표지로 암피실린 저항성을 지니고 있으며 제3도에 나타낸 바와 같은 구조를 가진다.

본 발명에 사용된 또 하나의 발현 벡터 플라스미드인 pHK414(Recombinant DNA research and virus, Martinus Nijhoff Publishing, Boston, USA 327-352, 1985)를 제4도에 나타내었다. pHK414 벡터 플라스미드는 유도성 lac프로모터와 이 프로모터에 의해 조절되는 lacI유전자 조작과 lacZ의 전체 서열을 포함하고 있다. pHK 414 벡터 플라스미드의 다중 클로닝 위치를 사용하여 칼시토닌 구조 유전자를 삽입하였으며, 제5도의 개략도에 따른 방법으로 반복 배열된 칼시토닌 유전자를 구성하였다. 이 pHK414 벡터 플라스미드에서 적절한 서열의 구조 유전자가 발현될 경우 lac 오페론의 중간에 외래 유전자가 삽입되므로 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)가 융합된 형태의 융합 단백질이 생산된다. pHK414 벡터 플라스미드에서 반복 배열로 카피수(copy number)가 증폭된 칼시토닌 유전자 조각은 제6도에 나타냈듯이 유전자 조작법에 의해 또 다른 벡터 플라스미드 pET-3b로 옮겨서, 칼시토닌만의 반복배열 고분자 단백질을 발현, 생산하였다. 본 발명에 사용된 숙주세포는 미생물인 대장균 JM109(Stratagene Cloning Systems co., USA) 및 BL21(DE3)(Novagene co., USA)이다.

생산 수준의 기술 인자로는 배양 발효시의 문제점들이 있는데 적정 생육 속도 유지, 배양 중 재조합 유전자의 안정성 유지, 봉입체(inclusion body)형성 억제 등을 고려하였다. 이러한 인자들은 주로 세포내 발현 생산체계(in vivo system)에서 비롯된 문제점들 이므로 기존의 무세포 전사발현 체계(in vitro system)에서 비롯된 문제점들이므로 기존의 무세포 전사발현 체계(in vitro system)를 이용, 세포내 발현 생산 체계의 한계를 극복할 수도 있다. 디자인된 칼시토닌 반복 배열은 발현시 아미노산 사용 비율이 일정하므로 기질 공급시 일정 비율의 아미노산 혼합물을 공급하면 무세포 생산시 효율적인 기질 이용이 가능하다. 무세포 단백질 생산방법에서는 이들 문제점들을 해결할 수 있을 뿐만 아니라 생산성과 분리 정제상의 이점등 여러 가지 장점이 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

제1도에 도시한 바와 같은 인간-연어 혼성 칼시토닌의 아미노산 서열을 디자인하였다. 구체적으로 N-말단의 16개 아미노산은 인간 칼시토닌 서열, C-말단의 16개 아미노산은 연어 칼시토닌 서열을 사용하였으며 N-말단에서부터 24번째 아미노산은 연어 칼시토닌의 경우 아르지닌, 인간 칼시토닌의 경우 글루타민인 바, 본 발명에서 디자인된 인간-연어 혼성 칼시토닌은 라이신으로 대체하였다. 24번째 아미노산인 아르지닌을 라이신으로 대체한 이유는 다량체로부터 단량체를 분리하기 위해 클로스트리파인(Clostripain)효소 (Sigma Co., USA)를 사용하는데 이 효소가 아르지닌 아미노산의 C-말단 부위를 절단하기 때문이다. 따라서, 본원발명에서는 24번째 아미노산인 아르지닌을 유사한 성질을 나타내는 라이신으로 대체하였다.

제7도에는 반복 배열된 인간-연어 칼시토닌의 발현 후 과정까지 고려하여 디자인한 아미노산 서열을 제시하였다. 즉, 32번 프롤린을 효소학적인 방법으로 아미드화하기 위하여 33번 위치에 글리신을 덧붙였으며 이 인간-연어 혼성 칼시토닌 전구체를 반복 배열시켜 고분자 단백질로 생산한 후 다시 단량체로 분리해내기 위하여 효소 반응을 위한 아미노산 서열(아르지닌)을 첨가하였고, 유전자 서열 디자인시의 제한 효소 사용을 위하여 두 개의 아미노산 서열(글루타민-아스파라진산)을 첨가하였다.

제2도에는 결정된 아미노산 서열에 따라 디자인한 유전자 서열을 나타내었다. 이때 코돈은 대장균에서의 발현체계에 적합하도록 결정하였다.

아미노산 서열 디자인 및 유전자 서열 디자인에 따라 헥산 합성기로 필요한 개수의 올리고 핵산 조각으로 나누어 각각 합성하였다. 합성된 올리고 핵산은 10수산화 암모늄 존재하에 55항온조에서 하룻밤 반응시켜 4로 냉각시킨 후 진공 상태에서 완전히 건조시켰다. 건조된 올리고 헥산은 1의 증류수에 용해시킨후 원심분리하여 상등액만을 새 튜브에 옮겨 400의 부탄올로 2~3회 추출하였다. 추출된 상층의 유기 용액은 제거하고 증류수에 용해되어 있는 올리고 헥산을 다시 진공 건조시켰다. 건조된 올리고 헥산은 증류수 50에 용해시켜 도량의 포름아미드와 섞어 55에서 5분간 방치한 뒤, 변성 폴리아크릴아미드 15수직 겔(denatured polyacrylamide 15vertical gel)을 조성하여 TBE완충액(90mM 트리스-붕산염, 2mM EDTA)상에서 50일정온도, 1000볼트 일정전압으로 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔을 형광 얇은 판 크로마토그라피(fluorescent thin layer chromatography)판 위에서 장파장 자외선등으로 조사하여 이동속도가 가장 느린 밴드만을 잘라내고, 분쇄한 뒤 올리고 헥산 추출 완충액(0.1SDS, 0.5M 암모늄 아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트)을 1첨가하여 37-42교반기에서 12시간 이상 교반하였다. 추출반응이 끝난 튜브는 12,000g에서 5분간 원심분리하고 상층액만을 취하였다. Sep Pak C18 역상 컬럼을 10아세토니트릴(acetonitrile), 10의 증류수, 2의 10mM 초산 암모늄 용액으로 처리한 뒤 상기의 올리고 헥산 추출액을 적하하여 용매의 극성 차이를 이용하여 순수 분리하였다.

순수 분리된 올리고 헥산들 중 필요한 조각의 올리고 헥산을 100pmole씩 취하여 인산화 완충액(kination buffer: 0.05M Tris·Cl(pH7.5), 0.01M MgCl₂, 5mM DTT, 0.05/BSA, 1mM ATP)에서 약 10 단위의 T4 DNA 카이나제(kinase: New England Biolabs, USA)를 첨가하여 인산화 반응을 진행하였다. 상보되는 올리고 헥산을 100 pmole씩 혼합하여 100mM NaCl 존재하에서 85에서 15분 방치하고 실온까지 서서히 냉각시킨 후 모두 혼합하여 리게이션 반응을 실시하였다. 이때 T4 DNA 리게이션 완충액(0.05M Tris·Cl(pH 7.5), 5mM MgCl₂, 5mM DTT, 0.05/BSA, 1mM ATP)에 용해시켜서 400단위 이상 충분한 양의 T4 DNA 리가제(ligase: New England Biolabs, USA)를 첨가하여 14에서 하룻밤 반응시켰다. 반응액의 일부는 TBE 완충액 상의 3%메타포 아가로스 겔(metaphor agarose gel)에 적하, 전기영동하여 칼시토닌 유전자의 혼성화(hybridization) 및 리게이션 반응이 적절히 이루어졌음을 확인하였다.

남은 반응액을 65에서 10분간 가열, T4 DNA 리가제를 실활(inactivation)시킨 후 에탄올 침전법으로 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자를 분리하여 다시 상기의 인산화 반응을 재실시하였다.

[실시예 2]

벡터 플라스미드 pHK414를 제한효소 BamHI 완충액(10mM Tris·Cl(pH 7.9), 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 1mM DTT)에 용해시켜서 제한효소 BamHI과 HindⅢ(New England Biolabs, USA)를 DNA당 1 단위가 되도록 첨가한 후 37에서 1시간 이상 반응시키고 75에서 15분간 가열하여 실활시켰다. 이 반응액에 10배 농도의 포스파타제 완충액(200mM Tris·Cl(pH8.0), 10 mM MgCl₂, 10mM ZnCl₂, 50/BSA)를 적절히 첨가, 포스파타제 반응 조성을 맞춘 후 충분한 양의 CIAP(송아지 장 알칼라인 포스파타제: New England Biolabs, USA)로 반응시켰다. 여기에 0.5SDS, 5mM EDTA 50/프로테아제 K가 되도록 맞춰 준 뒤 56에서 1시간 반응시키고 페놀, 클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 행하여 순수 분리하였다.

실시예 1에서 얻은 칼시토닌 유전자 5pmole을 상기의 벡터 플라스미드 pH k 4 14(제4도 참조, lacP: lac프로모터, O:오퍼레이터, RBS: 리보좀 결합 부위, cro: cro단백질 유도 참조, lacI, lacZ: lac오페론) 0.5pmole 미만의 양과 혼합하여 실시예 1의 리게이션 방법과 동일한 방법으로 리게이션시켰다. 얻어진 리게이션 반응액을 대장균 숙주세포JM109에 형질 전환시킨 후 암피실린이 함유된 LB 배지(1(w/v) 트립톤, 0.5(w/v)효모추출물, 1(w/v) NaCl)의 한천 고체배지상에서 생육시켜 콜로니를 얻었다.

얻어진 콜로니들 중 10여개를 상기의 LB 액체 배지상에서 각각 튜브 배양하여 벡터 플라스미드를 알칼리 세포 용해 방법으로 추출하였다. 우선 세포 배양액을 원심분리하여 세포 침전물을 얻은 후, 이 세포 침전물을 다시 GTE용액(50mM 포도당, 25mM Tris·Cl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0))에 현탁시키고 알칼리 용액(0.2N NaOH, 1SDS) 두배 부피를 첨가하여 얼음속에 5분간 방치한다. 여기에 다시 1.5배 부피의 중화용액(3M 칼륨, 5M 아세테이트)을 첨가하여 얼음 속에 5분간 방치한 후 12,000g, 4에서 5분간 원심분리하고 상등액만 취하여 페놀, 클로로포름 처리와 에탄올 침전법을 실시하여 벡터 플라스미드를 순수 분리해냈다. 얻어진 벡터 플라스미드는 제한 효소 BamHI의 완충액에 용해시켜 제한 효소Bgl Ⅱ와 BamHI을 유전자당 1단위의 효소양이 되도록 첨가한 뒤 37에서 1시간이상 반응시킨 후 TBE완충액상의 3메타포 아가로스 겔 전기영동에 의해 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자가 적절히 삽입된 균주를 확인, 선택하였다. 여기에서 얻어진, 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자 단량체를 포함한 pHK414벡터 플라스미드를 본 발명자들은 pHK414/Cal-1로 명명하였다.

[실시예 3]

칼시토닌 유전자를 반복 배열시키기 위하여 제5도에 따라 반응을 진행시켰다. 칼시토닌 유전자 단량체가 삽입되어 있는 벡터 플라스미드 pHK414/Cal-1을 숙주세포로부터 상기의 알칼리 세포용해방법으로 추출 및 순수 분리한 뒤 제한효소 Sac I의 완충액(6mM Tris·Cl(pH7.5), 6mM NaCl, 1mM DTT)에 용해시켜 제한효소 Sac I을 유전자당 1단위가 되도록 첨가하여 37에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완결된 후 65에서 15분간 가열하여 효소를 실활시킨 후 제한효소 완충액을 전환시키기 위해 Nal 실리카 입자 방법을 다음과 같이 사용하였다. 3배 부피의 Nal 용액(6M NaI)과 5의 실리카겔 입자를 첨가하여 4에서 5분간 반응시킨 후 에탄올 용액(5에탄올, 100mM NaCl)으로 3번 세척 후 증류수 5로 2번 추출하였다.

얻어진 유전자 용액은 5씩 나누어 각각 제한효소 Bgl Ⅱ 완충액(6mM Tris·Cl(pH7.9), 6mM MgCl₂, 150mM NaCl, 1mM DTT)과 제한효소 BamHI 완충액으로 전환시킨 후 각각 Bgl Ⅱ와 BamHI을 유전자당 1단위를 첨가하여 37에서 1시간 이상 반응시키고 TAE완충액(40mM 트리스-아세테이트, 1mM EDTA)상태의 0.8아가로스겔 전기영동법에 의해 유전자 절단 밴드를 분리했다.

제한효소 BamHI으로 절단한 경우는 큰 분자량의 유전자 조각을, 제한효소 Bgl Ⅱ로 절단한 경우는 작은 분자량의 유전자 조각을 각각 아가로스 겔로부터 잘라내어 55로 가열하여 녹인 후 상기의 NaI-실리카 입자 방법으로 추출, 분리하였다.

얻어진 유전자 조각 중 제한효소 BamHI 절단조각을 실시예 2의 포스파타제로 처리한 후, 제한효소 Bgl Ⅱ 절단조각과 같은 몰 비로 혼합하여 리게이션시켰다. 이때 리게이션 반응은 실시예 1에 나타낸바와 같으며 리게이션 반응액은 실시예 2에서와 같이하여 숙주세포에 형질전환시킨후 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자가 2개 반복 배열된 벡터 플라스미드를 확인, 선택하여 pHK414/Cal-2라 명명하였다.

상기의 방법을 반복하여 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자의 반복 배열 수 즉 카피 수를 증폭하고, 증폭된 다량체의 벡터 플라스미드를 각각 인간-연어 혼성 칼시토닌의 카피수에 따라 pHK414/Cal-4, pHK414/Cal-8, pHK414/Cal-12등으로 명명하였고, 각 벡터 플라스미드로 형질 전환된 숙주세포 대장균 JM109를 30글리셀롤존재 하에서 -70냉동고에 보관하였다.

[실시예 4]

발현용 벡터 플라스미드 pET-3b(제3도 참조, T7P: T7프로모터, T: 전사종결신호, Amp r.:-락타마제 유전자)를 제한효소 BamHI 완충액으로 용해시켜 제한효소 BamHI를 첨가하여 실시예 2에서와 같이 절단하고 포스파타제를 처리한 후 순수분리하였다. 또한, 벡터 플라스미드 pHK414/Cal-1, pHK414/Ca-2, pHK414/Cal-4, pHK414/Cal-8, pHK414/Cal-12 등을 각각 제한효소 BamHI 완충액으로 용해시킨 후 제한효소 BamHI과 Bal Ⅱ를 실시예 3과 같은 방법으로 함께 첨가, 반응시켜 칼시토닌 유전자 반복 배열 절편을 잘라내고 TAE 완충액 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 아가로스 겔로부터 반복 수가 다른 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자 반복 배열 절편을 각각 55로 가열하여 녹인 후 상기의 NaI-실리카 입자 방법으로 추출, 분리하였다.

얻어진 여러 반복 배열 수의 인간-연어 혼성 칼시토닌 유전자 반복 배열 절편을 상기의 벡터 플라스미드와 혼합하여 실시예 1에서와 같이 리게이션시켰다. 리게이션 반응액을 사용, 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시키고 한천 고체 배지상에 배양하여 실시예 2에 명시된 방법대로 각 반복 수의 인간-연어 칼시토닌 유전자 반복 배열이 적절히 삽입된 벡터 플라스미드를 선택하였다. 얻어진 각 반복 수의 벡터 플라스미드를 그 반복 수에 따라 각각 pET-3b/Cal-1, pET-3b/Cal-2, pET-3b/Cal-4, pET-3b/Cal-8, pET-3b/Cal-12로 명명하였고, 각각의 벡터 플라스미드로 형질전환된 숙주세포를 30글리세롤 존재하에 -70에 보관하였다. 이중 pET-3b/Cal-12로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 1996년 11월 8일 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC-10926호로 기탁되었다.

[실시예 5]

얻어진 일련의 벡터 플라스미드 pHK414/Cal 등이 형질전환된 숙주세포 각각을 -870보관튜브에서 암피실린이 포함된 LB 한천 고체배지에 백금이로 접종하여 하룻밤 배양하고 각 반복수 별로 콜로니를 얻었다. 각 반복 수 별로 콜로니를 따서 100/의 암피실린을 포함한 1LB배지에 접종하고 37에서 하룻밤 배양한 후 다시 새 LB 배지에 20배 희석 접종하였다. 37에서 2시간 교반 배양후 발현 유도체 IPTG(Sigma co., USA) 1mM을 첨가하여 lac오페론상의 단백질(cro-lacI-lacZ 유전자 유래 단백질)과 융합된 인간-연어 혼성 칼시토닌 반복 배열의 고분자 단백질이 발현, 생산을 유도하였다. 37에서 계속 배양하며 30분 간격으로 3시간까지 배양액을 1씩 취하여 12,000g에서 2분간 원심분리하고, 얻어진 세포 침전물에 100의 SDS 겔 적하 완충액(50mM Tris·Cl(pH6.8), 100mM DTT, 2% SDS, 0.1브로모페놀 블루, 10글리세롤)을 첨가한 후 100에서 3분간 가열하고 0에 보관 하였다.

트리스-글리신 전기영동 완충액(25mM 트리스, 250mM 글리신(pH8.3), 0.1SDS)상에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 조성하고 상기의 세포 단백질 시료를 적하하여 전기 영동하였다. 전기영동이 끝난 겔은 쿠우마시(coomassie)염색하여 다른 단백질과 융합 형태의 인간-연어 혼성 칼시토닌 반복 배열 고분자 단백질이 발현되었음을 확인하였다(제8(a)도 1-5: pHK414/Cal-1, Cal-2, Cal-4, Cal-8, Cal-12로 형질전환된 JM109의 경우 단백질 발현 유도전의 세포 단백질 전기영동 결과, 6-10: 같은 경우 단백질 발현 유도후의 세포 단백질 전기영동 결과, 표시된 부분에서 인간-연어 혼성 칼시토닌의 융합 단백질 발현을 확인할 수 있음).

[실시예 6]

인간-연어 혼성 칼시토닌 반복배열 고분자 단백질만을 발현시키기 위하여 조성한 일련의 벡터 플라스미드 pET-3b/Cal 등이 형질전환된 숙주세포 BL21 (DE3 ) / pET-3b/Cal 각각을 -70보관튜브에서 암피실린이 포함된 LB 한천 고체 배지에 백금이로 접종하고 실시예 5에서와 같은 방법으로 배양 및 발현 유도시키고 전기 영동에 의해 단백질 발현을 확인하였다(제8(b)도 1과 12: 분자량 표준 단백질들, 2-6: pET-3b/Cal-1, Cal-2, Cal-4, Cal-8, Cal-12로 형질전환된 BL21(DE3)의 경우 단백질 발현 유도전의 세포 단백질 전기영동 결과, 7-11: 같은 경우 단백질 발현 유도후의 세포 단백질 전기영동 결과, 표시된 부분에서 인간-연어 혼성 칼시토닌의 단백질 발현을 확인할 수 있음. (c) 1: 분자량 표준 단백질들, 2와 4: pET-3b/Cal-12로 형질전환된 BL21(DE3)의 경우 단백질 발현 유도전의 세포 단백질 전기영동 결과, 3과 5: 같은 경우 단백질 발현 유도후의 세포 단백질 전기영동 결과, 표시된 부분에서 인간-연어 혼성 칼시토닌의 단백질 발현을 확인할 수 있음).

[실시예 7]

대장균 숙주 세포에서 발현된 인간-연어 혼성 칼시토닌 반복 배열 고분자 단백질을 얻기 위하여 대장균을 배양하고 배양물로부터 균체를 수확한 후, 세포를 파괴하고 원심 분리하여 봉입체 형태의 단백질을 수거하였다. 이 단백질은 8M 요소 완충액(25mM Tris·Cl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0), 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 8M 요소)에 용해시킨 후 8M 요소 완충액으로 평형화시킨 CM-셀룰로오스 양이온 교환 크로마토그래피용 칼럼에 적하하고 칼럼을 다시 충분한 양의 8M 요소 완충액으로 세척한 다음, 0.3M의 NaCl이 첨가된 8M 요소 완충액과의 그래디언트 용출방법으로 칼시토닌 다량체를 용출시켰다.

분리정제된 칼시토닌 다량체는 같은 부피의 증류수를 가해 요소 농도를 반으로 줄인후 2.5%(무게 대비) 클로스트리파인 효소(Sigma co., USA)를 첨가하여 37에서 24시간에 걸쳐 반응시켰다. TCA용액을 5가 되도록 첨가하여 반응을 끝낸 후 4에 20분간 방치한 다음 원심분리했다. 얻어진 상층액은 C18칼럼을 사용한 역상HPLC(Thermo Separation Products, Co., USA)로 분석 및 정제하였다. HPLC에 사용된 완충액은 완충액 A(95물, 5아세토니트릴, 0.1TFA)와 완충액 B(20물, 80아세토니트릴, 0.1TFA)로 샘플 투입전에 칼럼은 완충액 A로 평형화시켰고 칼시토닌 단량체의 용출은 완충액 B와의 그래디언트 상태로 이루어졌다. 이때 얻어진 칼시토닌 단량체는 40mM MES(pH6.0)에 용해시킨 후 CPB(카복시펩티다제B: Boeh ringer Mannheim GmbH, Germany)를 질량비 1/30로 첨가하여 22에서 30분간 반응시켰다. 여기에-AE(아미드화 효소: Wako Chemicals co., Japan)를 첨가하여 반응시키고 최종 반응 생성물은 C18 역상HPLC로 분리 정제하였다. 정제된 인간-연어 혼성 칼시토닌의 생물학적 활성을 확인한 결과, 암컷 Sprague-Dawley 랫트에서 혈중 칼슘 농도 저하 활성을 나타냄을 확인하였다.

Claims

(ⅰ) C-말단부터 16개까지의 아미노산은 연어 칼시토닌 유전자유래이고, N-말단부터 16개 까지의 아미노산은 인간 칼시토닌 유전자유래인 칼시토신 유전자를 다량체로 제조하여 발현벡터에 클로닝하는 과정, (ⅱ) 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 과정, (ⅲ) 상기 칼시토닌 유전자를 발현시켜 칼시토닌 다량체를 생산하는 과정, (ⅳ) 생산된 칼시토닌 다량체를 단백질 분해효소로 처리하여 단량체를 제조하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 칼시토닌의 제조방법.
제1항에 있어서, 단백질 분해효소는 클로스트리파인 및/또는 카복시펩티다제 B인 것을 특징으로 하는 칼시토닌의 제조방법.
C-말단부터 16개까지의 아미노산은 연어 칼시토닌 유전자유래이고, N-말단부터 16개 까지의 아미노산은 인간 칼시토닌 유전자유래인 칼시토신 유전자 다량체를 플라스미드 벡터에 클로닝하여 제조된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제3항 기재의 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.