JPS609487A - 組換ｄｎａ分子 - Google Patents
組換ｄｎａ分子Info
- Publication number
- JPS609487A JPS609487A JP58116144A JP11614483A JPS609487A JP S609487 A JPS609487 A JP S609487A JP 58116144 A JP58116144 A JP 58116144A JP 11614483 A JP11614483 A JP 11614483A JP S609487 A JPS609487 A JP S609487A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- solution
- secretion
- bacillus subtilis
- molecule
- Prior art date
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- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換ＤＮＡ分子に関するものである。
本発明は、％ ｌこバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
Ｉｎ５ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子の
発現とその調節および分泌に必要な領域をコードする遺
伝子をバチルス属細菌で複製可能なベクターに組み込ん
た組換ＤＮＡ分子に関するものである。
Ｉｎ５ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子の
発現とその調節および分泌に必要な領域をコードする遺
伝子をバチルス属細菌で複製可能なベクターに組み込ん
た組換ＤＮＡ分子に関するものである。
本発明でいう組換ＤＮＡ分子きはバチルス・ズブチリス
のα−アミラーゼ遺伝子の発現とその調節および分泌に
必要な領域をコードする遺伝子に組換ＤＮＡ技術により
分泌生産させたい蛋白質をコードする遺伝子を連結させ
たものを含むものである。これを適当な宿主微生物に尋
人すれば、該蛋白に１は高効率で発現分泌されｌ？Ｘ
”Ｉ’ｉ”Ｅ ｉ／”を夜から容易に回収精製すること
が可能となる。
のα−アミラーゼ遺伝子の発現とその調節および分泌に
必要な領域をコードする遺伝子に組換ＤＮＡ技術により
分泌生産させたい蛋白質をコードする遺伝子を連結させ
たものを含むものである。これを適当な宿主微生物に尋
人すれば、該蛋白に１は高効率で発現分泌されｌ？Ｘ
”Ｉ’ｉ”Ｅ ｉ／”を夜から容易に回収精製すること
が可能となる。
本発明でいう組換ＤＮＡ分子には数々の特徴がある。第
１に、この組換Ｄ ＮＡＡ分子利用すれば宿主菌が、本
来生産しない蛋白質でも容易に菌体外をこ分泌生産する
ことが出来る。これは微生物生産の従来技術では全〈実
施不可能なことであった。
１に、この組換Ｄ ＮＡＡ分子利用すれば宿主菌が、本
来生産しない蛋白質でも容易に菌体外をこ分泌生産する
ことが出来る。これは微生物生産の従来技術では全〈実
施不可能なことであった。
近年、バチルス・ズブチリス以外の遺伝子のバチルス−
細菌における発現が問題となっている。
細菌における発現が問題となっている。
スナワチグラム陽１＋菌であるバチルス・リケニホルミ
ス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）、バチルス
・プユミルス（Ｂ、 ｐｕｍｉｌｕｓ ）、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Ｓ、 ａｕｒｅｕｓ ）等の遺
伝子は、バチルス・ズブチリス中で発現するが（ＰＮＡ
Ｓ ７４ １６Ｆ３０゜（１９７７）、 ＰＮＡ、Ｓひ
１４２り、（１９７Ｂ））、グラム陰性菌である大腸
菌の薬剤耐性遺伝子等は、バチルス・ズブチリス中では
発現しないことが知られている（ Ｍ、 Ｇ、 Ｇ巌二
２６９ 、 （１９７８））。この点に関して、本発明
でいう組換ｎ Ｎ Ａ分子はバチルス・ズブチリスのα
−アミラーゼ遺伝子の発現に必要な領域（転写プロモー
ター、リボゾーム結合部（Ｘγ等）を有するものである
ので本発明の組換１） Ｎ Ａ分子を用いることにより
、通常バチルス・ズブチリスでは発現しないグラム陰性
菌由来の遺伝子をも発現せしめることが出来る。このこ
とは高等生物由来の遺伝子をバチルス属で発現させる場
合にも当てはまる。
ス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）、バチルス
・プユミルス（Ｂ、 ｐｕｍｉｌｕｓ ）、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Ｓ、 ａｕｒｅｕｓ ）等の遺
伝子は、バチルス・ズブチリス中で発現するが（ＰＮＡ
Ｓ ７４ １６Ｆ３０゜（１９７７）、 ＰＮＡ、Ｓひ
１４２り、（１９７Ｂ））、グラム陰性菌である大腸
菌の薬剤耐性遺伝子等は、バチルス・ズブチリス中では
発現しないことが知られている（ Ｍ、 Ｇ、 Ｇ巌二
２６９ 、 （１９７８））。この点に関して、本発明
でいう組換ｎ Ｎ Ａ分子はバチルス・ズブチリスのα
−アミラーゼ遺伝子の発現に必要な領域（転写プロモー
ター、リボゾーム結合部（Ｘγ等）を有するものである
ので本発明の組換１） Ｎ Ａ分子を用いることにより
、通常バチルス・ズブチリスでは発現しないグラム陰性
菌由来の遺伝子をも発現せしめることが出来る。このこ
とは高等生物由来の遺伝子をバチルス属で発現させる場
合にも当てはまる。
第２に本発明による組（％ Ｄ Ｎ Ａ分子はα−アミ
ラーゼの高効率の発現をもたらす調節遺伝子を有するも
のであり、このような調節遺伝子は〕くチルス・ズブチ
リスｌＡ４１２株からも得ることが可能である。従って
本発明の組換ＤＮＡ分子中に存在するα−アミラーゼの
生産性を約４〜５倍に高めるα−アミラーセ調節遺伝子
の影響のおよぶ範囲内に分泌させたい蛋白質をコードす
る遺伝子を遺伝子工学の手法で連結させ、バチルス属細
菌に導入することにより該蛋白質の分泌生産を行なわせ
しめれば該調節遺伝子を持たない分泌ベクター分子を利
用した場合よりも所望する蛋白質の分泌生産の効率を約
４倍も増加せしめることが可能となる。
ラーゼの高効率の発現をもたらす調節遺伝子を有するも
のであり、このような調節遺伝子は〕くチルス・ズブチ
リスｌＡ４１２株からも得ることが可能である。従って
本発明の組換ＤＮＡ分子中に存在するα−アミラーゼの
生産性を約４〜５倍に高めるα−アミラーセ調節遺伝子
の影響のおよぶ範囲内に分泌させたい蛋白質をコードす
る遺伝子を遺伝子工学の手法で連結させ、バチルス属細
菌に導入することにより該蛋白質の分泌生産を行なわせ
しめれば該調節遺伝子を持たない分泌ベクター分子を利
用した場合よりも所望する蛋白質の分泌生産の効率を約
４倍も増加せしめることが可能となる。
α−アミラーゼ遺伝子の発現および分泌に必要な領域を
コードする遺伝子およびα−アミラーゼの高効率の発現
をもたらす調節遺伝子は以下船こ示ず塩基配列に含まれ
ている。
コードする遺伝子およびα−アミラーゼの高効率の発現
をもたらす調節遺伝子は以下船こ示ず塩基配列に含まれ
ている。
ＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧ Ａ、ＡＧＡＧＣＧＧＴＡＡＡ
ＡＧＡＡＱＡＡＡ ＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡ ＡＴＣＡＴ
Ｃ’ｌ’ＴＧＡＡＡＡ、ＡＴＡ（）ＡＴＧ ＧＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴ ＴＴＧＴＴＴＯＯＡＡＡＧＣＧＡＧＧＧＡ
Ａ ＡＣ人ＧＴＣＴＣＧＧ ＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴ
ＡＧＧＡＣＣＡＴ ＴＧＡ、ＴＴＴＧＴＡＴ ＴＣＡＣ
ＴＣＴ（３ＣＣＡＡＧＴＴＧ’ｌ’ＴＴＴ ＧＡＴＡＧ
ＡＧＴＧＡ ＴＴＧＴＯＡ’ｒＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴ（
）ＴＡ ＡＧＣｆｌＴＡＡＡＣＡ ＡＡＡＴＴＣＴＣＣ
ＡＧＴＣＴＴＣＯＣＡ、Ｔ ＣＡＧＴＴＴＧＡＡ、Ａ、
ＧＯＡＧＧＡＡ、ＵＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＡＡ ＧＴＡ
Ａ、ＧＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＡＧＴ
ＡＡＧＴ ＣＴＴＣＡＡＡＡＡＡ ＴＣＡＡＡＴＡＡ（
）ＯＡＧＴＧＴＣＡＡ（）Ａ ＡＴＧＴＴＴＧＣＡ、Ａ
ＡＡＣ（）ＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＡ ＣＴ
ＧＣＣＧＴＴＡＴ ＴＣＧＣＴ（＋ＧＡＴＴＴＴＴＡＴ
ＴＧＣＴＧ ＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧ ＴＴＣＴＧＧＣＡ
（１ＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＴＧＣＴ（１
Ａ、ＡＡ、ＣＧ（１ＣＣＪ、Ａ、ＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡ
Ｔ ＧＡＯ なお、ここでＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシン
およびＧはグアニンを示す。
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Ｔ ＧＡＯ なお、ここでＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシン
およびＧはグアニンを示す。
また、α−アミラーゼ遺伝子の発現とそのべ１節および
分泌に必要な領域をコードする塩基配列が上記塩基配列
中の塩基の欠損、変換あるいは新らの働きをするもので
あれば、本発明の範囲である。
分泌に必要な領域をコードする塩基配列が上記塩基配列
中の塩基の欠損、変換あるいは新らの働きをするもので
あれば、本発明の範囲である。
かような誘導体ＤＮＡ断片は微生物から抽出あるいは合
成により得ることができる。
成により得ることができる。
本発明で用いるベクターＤＮＡＩこついては、バチルス
属細菌で複製可能なものならプラスミド。
属細菌で複製可能なものならプラスミド。
ファージオたはそれらに由来する複合ベクター等如何な
るものも使用可能である。例えばプラスミドとしてはス
タフィロコッカス・アウレウス由来のｐＵＢｌ １０
、 ｐｃｉ ９４ 、 ｐＵＢｌ １２ 、 ｐＢ１９
４ 。
るものも使用可能である。例えばプラスミドとしてはス
タフィロコッカス・アウレウス由来のｐＵＢｌ １０
、 ｐｃｉ ９４ 、 ｐＵＢｌ １２ 、 ｐＢ１９
４ 。
ｐＴＰ４．ｐＴＰ５等がありファージとしてはφ１０５
．ρ１１．φろＴ、５Ｐ０２等がある。
．ρ１１．φろＴ、５Ｐ０２等がある。
本発明の組換えＤＮＡを導入する宿主菌はバチルス属細
菌のいずれのものも使用可能である。バチルス属細菌の
例としては、バチルス・ズブチリス（Ｂ、 ５ｕｌ）ｔ
ｉｌｉｓ ）、バチルス・アミロリキファシエンス（Ｂ
、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ） 、バチ
ルス・アミロサツカリチカス（Ｂ、ａｍｙｌｏｓａｃｃ
ｈａｒｉｔｉｃｕｓ） 。
菌のいずれのものも使用可能である。バチルス属細菌の
例としては、バチルス・ズブチリス（Ｂ、 ５ｕｌ）ｔ
ｉｌｉｓ ）、バチルス・アミロリキファシエンス（Ｂ
、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ） 、バチ
ルス・アミロサツカリチカス（Ｂ、ａｍｙｌｏｓａｃｃ
ｈａｒｉｔｉｃｕｓ） 。
バチルス・セレウス（Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ ）％バチルス
°ステアロサーモフィルス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）等があげられるが本願で使用する宿
主菌は何らこれらに制限されるものではない。実用上の
観点からは、α−アミラーゼの分泌を高める遺伝子群を
Ｉするバチルス・ズブチリスのび一アミラーゼ高分泌株
の使用が本発明の効果を更に増大させ、好適な宿主とな
るものである。
°ステアロサーモフィルス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）等があげられるが本願で使用する宿
主菌は何らこれらに制限されるものではない。実用上の
観点からは、α−アミラーゼの分泌を高める遺伝子群を
Ｉするバチルス・ズブチリスのび一アミラーゼ高分泌株
の使用が本発明の効果を更に増大させ、好適な宿主とな
るものである。
本発明の組換ＤＮＡ分子を利用し、所望の蛋白質の生産
を行なう場合、次のような種々の利点がある。
を行なう場合、次のような種々の利点がある。
第１に細胞内で多量に生産された所望の蛋白質を細胞外
へ効率良く分泌出来るので、不純物の分離が容易となり
、該蛋白質の精製、単離工程の生産性を顕著に高めるこ
とが可能となる。また、所望の蛋白質は宿主微生物の細
胞膜内の有毒物質を包含せず、純粋に単離できるので使
用用途が限定されず、広範囲に利用可能である。
へ効率良く分泌出来るので、不純物の分離が容易となり
、該蛋白質の精製、単離工程の生産性を顕著に高めるこ
とが可能となる。また、所望の蛋白質は宿主微生物の細
胞膜内の有毒物質を包含せず、純粋に単離できるので使
用用途が限定されず、広範囲に利用可能である。
第２に細胞内で堝剰生産されるとそれ自身によら外へ該
蛋白質を移行させることができ、フィードバック阻害を
解除して所望蛋白質を過剰生産させ、培養液中に多媚：
に蓄積するこ吉が可能となる。
蛋白質を移行させることができ、フィードバック阻害を
解除して所望蛋白質を過剰生産させ、培養液中に多媚：
に蓄積するこ吉が可能となる。
第３に宿主微生物細胞の生育に有害な蛋白質であっても
、細胞外へ移行させることが出来るので宿主微生物細胞
の生育阻害を回避して、その蛋白質を多ｆＲ−，ｆこ生
産さぜるこ吉が可能となる。
、細胞外へ移行させることが出来るので宿主微生物細胞
の生育阻害を回避して、その蛋白質を多ｆＲ−，ｆこ生
産さぜるこ吉が可能となる。
才た、本発明による組換ＤＮＡ分子に所望する蛋白質の
遺伝子を連結［７、宿主株であるバチルス・ズブチリス
をこ導入したホストベクター系を用いて該蛋白質の分泌
生産を行えば、異なるホストベクター系（たとえば、従
来知られているバチルス・アミロリキファシエンスの、
遺伝子を用いた分泌用組換ＤＮＡ分子をバチルス・ズブ
チリスに導入したホストベクター系等）を用いた場合に
比べて、次のような大きな利点がある。即ち、宿主とし
て用いる株にバチルス・ズブチリスのα−アミラーゼの
分泌を高める遺伝子を有する株を選ぶことにより所望の
蛋白質の分泌をさらに増加せしめることが可能となる。
遺伝子を連結［７、宿主株であるバチルス・ズブチリス
をこ導入したホストベクター系を用いて該蛋白質の分泌
生産を行えば、異なるホストベクター系（たとえば、従
来知られているバチルス・アミロリキファシエンスの、
遺伝子を用いた分泌用組換ＤＮＡ分子をバチルス・ズブ
チリスに導入したホストベクター系等）を用いた場合に
比べて、次のような大きな利点がある。即ち、宿主とし
て用いる株にバチルス・ズブチリスのα−アミラーゼの
分泌を高める遺伝子を有する株を選ぶことにより所望の
蛋白質の分泌をさらに増加せしめることが可能となる。
そのような遺伝子を有するバチルス・ズブチリスの例と
しては、鍾々の報告がなされている（ Ａｇｒｉｃ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ４５ ２２ ｄ ３（１９７
９）等）。
しては、鍾々の報告がなされている（ Ａｇｒｉｃ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ４５ ２２ ｄ ３（１９７
９）等）。
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、当該説明
は、何ら発明を制限するものでない。
は、何ら発明を制限するものでない。
また、本発明実施例で用いた菌株は、いずれも既に広＜
Ｎ−ＩＦ及しているもので、たとえば、Ｔｌ１Ｅ Ｂ
ＡＣＩＬＬＵＳ ＧＥＮＥＴＩＣ５ＴＯＣＫ （ＪＮＴ
ＥＲ（ＴＩＩＥ ０１１１０ Ｓ’ｌ”ＡＴＥ ＵＮＩ
ＶＩＳＩＴＹ ） ｆコて入手可能である。
Ｎ−ＩＦ及しているもので、たとえば、Ｔｌ１Ｅ Ｂ
ＡＣＩＬＬＵＳ ＧＥＮＥＴＩＣ５ＴＯＣＫ （ＪＮＴ
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ＶＩＳＩＴＹ ） ｆコて入手可能である。
実施例１
ｆａｔ バチルス・ズブチリスからの遺伝子の調製細菌
種として、α−アミラーゼ遺伝子を含むバチルス・ズブ
チリスｌＡ４１２株を使用した。
種として、α−アミラーゼ遺伝子を含むバチルス・ズブ
チリスｌＡ４１２株を使用した。
この株をＬブロス（、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ
１％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒ；Ｉｃｔ ｌＪ、５％、
ＮａＣＪ Ｏ，５％、 Ｇｌａｃｏｓｅ０２％、（ｐＨ
７２）） ５０ 、ｒｔｌ中で１晩培養後、集菌した。
１％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒ；Ｉｃｔ ｌＪ、５％、
ＮａＣＪ Ｏ，５％、 Ｇｌａｃｏｓｅ０２％、（ｐＨ
７２）） ５０ 、ｒｔｌ中で１晩培養後、集菌した。
この年間したものをリリチウム（生化学工業ｆＪ−％
） ４ ｍ’ｉを溶かした０、 １５ Ｍ ＮａＣノー
０．Ｉ Ｍ ＥＤＴＡＵ液（＋）１１８．０ ） ２帽
こ懸濁し、６７℃で１５分間保持後、−７０℃のティー
フリリーブ−中で凍結した。この凍結物ｌこ１％８ Ｄ
Ｓ−０１Ｍ ＮａＣ！−〇、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣノ（ｐ
Ｈ９，０）１Ｂ−を加え、撹拌後、６０℃の温浴に入れ
完全に溶菌した。この溶菌した溶液に水飽和フェノール
２０＋＋／を加え、よく振盪したのち、低速遠心（３０
００ｒｐｍ）して上清と沈殿にわけた。この上清をコマ
ゴメピペットでとり新らしい試験管に移した。これに２
倍容の冷エタノール（−２０℃）を加え、ガラス棒でゆ
っくりと撹拌して核酸繊維をまきとった。このガラス棒
にまきついた核酸繊維を適当量のＴＥ緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉ ５−ＨＣ）、０．２ｍＭ ＢＤＴＡ （ｐＨ
７，６））に溶かし、−晩ＴＥ緩衝液に対して４℃で透
析した。この透析済の溶液に熱処理した１（ＮａｓｅＡ
を５μｆ ／ａｒｔになるようｌこ加え、３７℃で６０
分間保温した後、フェノール抽出エタノール沈殿を行な
った。沈殿物を１１１ＩｌのＴＥ緩衝液に溶かし、バチ
ルス・ズブチリス染色体ＤＮＡ試料とした。
） ４ ｍ’ｉを溶かした０、 １５ Ｍ ＮａＣノー
０．Ｉ Ｍ ＥＤＴＡＵ液（＋）１１８．０ ） ２帽
こ懸濁し、６７℃で１５分間保持後、−７０℃のティー
フリリーブ−中で凍結した。この凍結物ｌこ１％８ Ｄ
Ｓ−０１Ｍ ＮａＣ！−〇、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣノ（ｐ
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完全に溶菌した。この溶菌した溶液に水飽和フェノール
２０＋＋／を加え、よく振盪したのち、低速遠心（３０
００ｒｐｍ）して上清と沈殿にわけた。この上清をコマ
ゴメピペットでとり新らしい試験管に移した。これに２
倍容の冷エタノール（−２０℃）を加え、ガラス棒でゆ
っくりと撹拌して核酸繊維をまきとった。このガラス棒
にまきついた核酸繊維を適当量のＴＥ緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉ ５−ＨＣ）、０．２ｍＭ ＢＤＴＡ （ｐＨ
７，６））に溶かし、−晩ＴＥ緩衝液に対して４℃で透
析した。この透析済の溶液に熱処理した１（ＮａｓｅＡ
を５μｆ ／ａｒｔになるようｌこ加え、３７℃で６０
分間保温した後、フェノール抽出エタノール沈殿を行な
った。沈殿物を１１１ＩｌのＴＥ緩衝液に溶かし、バチ
ルス・ズブチリス染色体ＤＮＡ試料とした。
（ｂｌ テンペレートファージρ１１ＤＮＡの調製テン
ペレートファージρ１１の溶原菌をＬ〕Ｔ）ス１ノ中で
３７℃で振盪培養し、ＯＤ、６゜＝０．２５１μ２／−
となるよう７ＪＤえ、さらに１５ｆ＋間振盪培養した。
ペレートファージρ１１の溶原菌をＬ〕Ｔ）ス１ノ中で
３７℃で振盪培養し、ＯＤ、６゜＝０．２５１μ２／−
となるよう７ＪＤえ、さらに１５ｆ＋間振盪培養した。
−兜この培養物を３１］００ｒｐｍの低速遠心を行ない
上清をすて、次いで新らしいＬブロス１ノｆこ分散した
のぢ、さらに３７℃で２時間４１ｄ’Ｒ培養を行ない、
溶原菌を溶菌した。この溶菌した培養物を低速遠心（３
０００ｒｐｍ）Ｉｙで上清を得た。
上清をすて、次いで新らしいＬブロス１ノｆこ分散した
のぢ、さらに３７℃で２時間４１ｄ’Ｒ培養を行ない、
溶原菌を溶菌した。この溶菌した培養物を低速遠心（３
０００ｒｐｍ）Ｉｙで上清を得た。
得られた上清にＮ ａ Ｃノ、１３（］６０００をそれ
ぞれの濃度が０．５Ｍおよび１０％となるように加え。
ぞれの濃度が０．５Ｍおよび１０％となるように加え。
−晩４ ’Ｃで放１臂した。次いでこの溶液を低速遠心
（３００Ｄｒｐｍ）して沈殿を集めた。この沈殿をファ
ージ希釈緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣ！、１０ｍ
ＭＭｇＣ４，１００ｍＭ ＮａＣ！ （ｐＨ７５） ）
２０ｗｇに懸濁した。これをＲＮａｓｅ で処理した
後）ｃ超遠心（ベック” ” ５０．２ ’ｒｉ ｏ−
ター使用、 ２５００Ｏｒｐｍ ７０分間）して、ρ１
１ファージ粒子を得た。
（３００Ｄｒｐｍ）して沈殿を集めた。この沈殿をファ
ージ希釈緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣ！、１０ｍ
ＭＭｇＣ４，１００ｍＭ ＮａＣ！ （ｐＨ７５） ）
２０ｗｇに懸濁した。これをＲＮａｓｅ で処理した
後）ｃ超遠心（ベック” ” ５０．２ ’ｒｉ ｏ−
ター使用、 ２５００Ｏｒｐｍ ７０分間）して、ρ１
１ファージ粒子を得た。
得られたρ１１ファージ粒子を更に塩化セシウム平衡密
度勾配遠心法（ベックマンＳＷ４’１日−ター使用、２
５０００ｒｐｍ ｉ６時間）で精製した。なお遠心前の
塩化セシウム溶液の密度は１．５１２／〜〆ｌこ調製し
てあった。
度勾配遠心法（ベックマンＳＷ４’１日−ター使用、２
５０００ｒｐｍ ｉ６時間）で精製した。なお遠心前の
塩化セシウム溶液の密度は１．５１２／〜〆ｌこ調製し
てあった。
精製したρ１１ファージ粒子は１％ＳＤＳ 存在下船こ
６０℃で１５分間加温されてつぶされ、フェノール抽出
エタノール沈殿が行なわれた。得られた沈殿をＴＥ緩衝
液１ｗｅに溶かし、ρ１１ ＤＮＡ試料とした。
６０℃で１５分間加温されてつぶされ、フェノール抽出
エタノール沈殿が行なわれた。得られた沈殿をＴＥ緩衝
液１ｗｅに溶かし、ρ１１ ＤＮＡ試料とした。
ｉｃｌ 組換ＤＮＡ分子の作製
ｉ１１記のバチルス・ズブチリス染色体ＤＮＡ ２０μ
？、ρ１１ＤＮＡ２０ｐｆ をそれぞれ制限酵素Ｂａｍ
［−ＩＴ用酵素反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −１１
Ｃ〕。
？、ρ１１ＤＮＡ２０ｐｆ をそれぞれ制限酵素Ｂａｍ
［−ＩＴ用酵素反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −１１
Ｃ〕。
７ ｍＭ ＭｇＣノｔ 、 １００ Ｔ１’Ｍ Ｎ ａ
Ｃノ、２ｍＭ２−メルカプトエタノール（ｐＨｓ、ｏ
） ） ５０μノ中に分散させ、それぞれを制限酵素
Ｂａｍ１ｌＩ溶液（全酒造製）２０μノで切断後、６５
℃で１０外間熱処理をして、制限酵素を失活させた。
Ｃノ、２ｍＭ２−メルカプトエタノール（ｐＨｓ、ｏ
） ） ５０μノ中に分散させ、それぞれを制限酵素
Ｂａｍ１ｌＩ溶液（全酒造製）２０μノで切断後、６５
℃で１０外間熱処理をして、制限酵素を失活させた。
これらの制限酵素ＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ溶液を混
合後、１００ｍＭジチオスレイトール溶液２０ ｐＪ２
、１ ｍＭ ＡＴＰ溶液２０μノ、ライゲーション用
緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＨＣノ、 ６６ｍＭ
ＮａＣｌ！（メ１７．６））２０μｌ、滅菌蒸留水２０
／ＪノおよびＴ４リガーゼ溶液（ＢＲ，Ｌ製）１０μ
ノを加え、１０℃で一晩放置し、それぞれのＴ）ＮＡ断
片の再結合を行なわせた。
合後、１００ｍＭジチオスレイトール溶液２０ ｐＪ２
、１ ｍＭ ＡＴＰ溶液２０μノ、ライゲーション用
緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＨＣノ、 ６６ｍＭ
ＮａＣｌ！（メ１７．６））２０μｌ、滅菌蒸留水２０
／ＪノおよびＴ４リガーゼ溶液（ＢＲ，Ｌ製）１０μ
ノを加え、１０℃で一晩放置し、それぞれのＴ）ＮＡ断
片の再結合を行なわせた。
＋ｄｌ ρ１１を用いたσ−アミラーゼ遺伝子のクロー
〉′化ρ１１をｌ−Ｔｌいたα−アミラーーＶ遺伝子の
りａ−ン化は、宿主細菌としてρ１１ファージを溶原化
したバチルス・ズブチリスｌＡ２Ｂ９株（ａｍｙ Ｅ
）を用い、同村、斎藤らの方法（Ｋ、ａｗａｔｎｏｒａ
ｒｔ ａｌ 。
〉′化ρ１１をｌ−Ｔｌいたα−アミラーーＶ遺伝子の
りａ−ン化は、宿主細菌としてρ１１ファージを溶原化
したバチルス・ズブチリスｌＡ２Ｂ９株（ａｍｙ Ｅ
）を用い、同村、斎藤らの方法（Ｋ、ａｗａｔｎｏｒａ
ｒｔ ａｌ 。
Ｇｅｎｃ５．８７ （１９７９））て行なった。
なお、α−アミラーゼ遺伝子欠損株を用いたのであるが
、可溶性デンプンを単一の炭素原にして培養した場合で
も、この欠損株は生育可能であるので、α−アミラーゼ
；ｙＬ伝子自体を選択マーカーとすることはできない。
、可溶性デンプンを単一の炭素原にして培養した場合で
も、この欠損株は生育可能であるので、α−アミラーゼ
；ｙＬ伝子自体を選択マーカーとすることはできない。
したがってα−アミラーゼ遺伝子の近傍にある栄養及求
変異ａｒｏＩ（アロマチックアミノ酸の生合成に関与し
た酵素遺伝子）ヲ・直接のマーカーとしてｆｉセ用し、
その中から八ｍｙ＋を選択する方法を採った。
変異ａｒｏＩ（アロマチックアミノ酸の生合成に関与し
た酵素遺伝子）ヲ・直接のマーカーとしてｆｉセ用し、
その中から八ｍｙ＋を選択する方法を採った。
才ず、上記バチルス・ズブチリスｌＡ２Ｂ９株をＡｎａ
ｇｎｏａｔｏｐｕ Ｉｎｓらの方法（Ｊ、１３ａｃｔｅ
ｒｉｎｌリ、７４１ （１９６１） ）のようにして、
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌ＋を調製し、前記の連結ＤＮ
Ａを加え、３７℃で９０分間振盪培養した。次にこの混
合物をアロマチックアミノ酸を欠き、５０μｔ／＊ｌＯ
）メチオニン、１％可溶性デンプンを含む最少培地プレ
ートで３７℃で２日間培養した。この間にａｒｏ Ｉ遺
伝子をもった宿主細菌が生育して小さなコロニーとなっ
た。このプレート上にＫＩ−Ｉ、溶液（０，１ＭＫＩ
、 ０．１Ｍ ＩＣ）溶液に０．０１Ｍの■、を溶かし
た溶液）を噴霧した。その結果、α−アミラーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ分子を受容した細菌はα−アミラーゼを生
産し、培地上のデンプンを分解しており、そのためヨウ
素−デンプン反応による着色はみられず、そのコロニー
の回りは透明なハローを形成していた。
ｇｎｏａｔｏｐｕ Ｉｎｓらの方法（Ｊ、１３ａｃｔｅ
ｒｉｎｌリ、７４１ （１９６１） ）のようにして、
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌ＋を調製し、前記の連結ＤＮ
Ａを加え、３７℃で９０分間振盪培養した。次にこの混
合物をアロマチックアミノ酸を欠き、５０μｔ／＊ｌＯ
）メチオニン、１％可溶性デンプンを含む最少培地プレ
ートで３７℃で２日間培養した。この間にａｒｏ Ｉ遺
伝子をもった宿主細菌が生育して小さなコロニーとなっ
た。このプレート上にＫＩ−Ｉ、溶液（０，１ＭＫＩ
、 ０．１Ｍ ＩＣ）溶液に０．０１Ｍの■、を溶かし
た溶液）を噴霧した。その結果、α−アミラーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ分子を受容した細菌はα−アミラーゼを生
産し、培地上のデンプンを分解しており、そのためヨウ
素−デンプン反応による着色はみられず、そのコロニー
の回りは透明なハローを形成していた。
このようなＡｒｎ Ａｍｙ 形質転換体を数百コロニー
得た。
得た。
次にＡｒｏ Ａｍｙ 形質転換体を２０株づつに分け、
Ｌブロス５ ｍｌに懸濁し、更に０Ｄａａｏ ” ０．
０５になるように希釈し、３７℃で振盪培養した。
Ｌブロス５ ｍｌに懸濁し、更に０Ｄａａｏ ” ０．
０５になるように希釈し、３７℃で振盪培養した。
ＯＤ６．ｌｏ ” ０．２５になったとき、この培養液
をマイトマイシンＣで処理してファージ粒子を誘発した
。
をマイトマイシンＣで処理してファージ粒子を誘発した
。
その後、ミリポアフィルタ−を通して生存菌を除き、フ
ァージ溶液を得た。
ァージ溶液を得た。
一方、Ａ１１を溶原化していない菌株（ＩＡ２８９）を
Ｌブロス５ ｗｔｌ中でＯＤａａ６ ” ０．８になる
まで培養し、低速遠心（？ｌ＋００Ｏｒｐｍ）で集菌し
た。この菌体をファージ希釈緩衝液２．５ ｍｌに懸濁
した。
Ｌブロス５ ｗｔｌ中でＯＤａａ６ ” ０．８になる
まで培養し、低速遠心（？ｌ＋００Ｏｒｐｍ）で集菌し
た。この菌体をファージ希釈緩衝液２．５ ｍｌに懸濁
した。
前記のファージ浴液０．０５ ｍｌを受容菌懸濁液０．
５ｄｆこ加え、１５′９＋間ろ７℃で吸着させたのち、
前記のアロマチックアミノ酸を欠き、メチオニン。
５ｄｆこ加え、１５′９＋間ろ７℃で吸着させたのち、
前記のアロマチックアミノ酸を欠き、メチオニン。
可溶性デンプンを含む最少培地で培養し、Ａｒｏ＋Ａｍ
ｙ＋形質導入体数株形質導入体数 置られたＡｒｏ Ａｍｙ 形質導入体を１株選び、前記
のようをこして、バチルス・ズブチリスのα−アミラー
ゼ遺伝子を含むＡ１１ ＤＮＡを調製した。
ｙ＋形質導入体数株形質導入体数 置られたＡｒｏ Ａｍｙ 形質導入体を１株選び、前記
のようをこして、バチルス・ズブチリスのα−アミラー
ゼ遺伝子を含むＡ１１ ＤＮＡを調製した。
ｌｅｔ ｐＵＢ１１０プラスミド分子を用いたアミラー
ゼ遺伝子のクローン化および分泌ベクターである組換Ｄ
ＮＡ分子の作製 宿主菌としてバチルス・ズブチリスｌＡ２８９株を用い
、プラスミドｐＵＢ １１０をベクタープラスミドとし
て使用した。
ゼ遺伝子のクローン化および分泌ベクターである組換Ｄ
ＮＡ分子の作製 宿主菌としてバチルス・ズブチリスｌＡ２８９株を用い
、プラスミドｐＵＢ １１０をベクタープラスミドとし
て使用した。
ｐＵＢ １１０プラスミドを有するバチルス・ズブチリ
スＩＥｂ株よりＧｒｙｃｚａｎらの方法（Ｊ。
スＩＥｂ株よりＧｒｙｃｚａｎらの方法（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３４３１Ｂ、 （１９７８）
）に従い、ｐＵＢ １１０プラスミドを分離精製した
。
）に従い、ｐＵＢ １１０プラスミドを分離精製した
。
得られたｐＵＢ １１０プラスミド５μｍをＢａｍＨＩ
用酵素反応浴液２５μノ中に分散し、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ溶液５μノを加え、分解した。 その後６５℃で１０
分間処理して、制限酵素を失活させた。
用酵素反応浴液２５μノ中に分散し、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ溶液５μノを加え、分解した。 その後６５℃で１０
分間処理して、制限酵素を失活させた。
一方、前記のバチルス・ズブチリスのα−アミラーゼ遺
伝子を含むＡ１１ ＤＮＡ Ｉ Ｄａｆｔを５ａｕ３Ａ
用酵素反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈ（１、７ｍ
ＭＭｇＣ４，１００ｍＭ ＮａＣ！ （ｐＨ７，５）
） ２５ ｔｔＪ中に分散させ、制限酵素５ａｕ５Ａ
溶液（全酒造製）１μノを加え％３０℃で１分間処理し
、その後、６５℃で１０分間処理して、制限酵素を失活
させた。
伝子を含むＡ１１ ＤＮＡ Ｉ Ｄａｆｔを５ａｕ３Ａ
用酵素反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈ（１、７ｍ
ＭＭｇＣ４，１００ｍＭ ＮａＣ！ （ｐＨ７，５）
） ２５ ｔｔＪ中に分散させ、制限酵素５ａｕ５Ａ
溶液（全酒造製）１μノを加え％３０℃で１分間処理し
、その後、６５℃で１０分間処理して、制限酵素を失活
させた。
この反応液１０μノと前記制限酵素ＢａｍＨＩで処理し
たｐＵＢｌｌｏ）ｌＪ液１０μノを混合し、１０（］ｍ
Ｍジチオスレイトール５μＡ 、 １ ｍＭＡＴＰ ５
ｐｉ 、ライゲーション緩％液５μ！、滅菌蒸留水１
０μノとＴ４リガーゼ溶液（Ｂ Ｒ，Ｌ製）５μノを加
え、１０℃で１晩放置し、組換ＤＮＡ分子を含む混合液
を得た。それぞれのＤＮＡが連結していることはアガロ
ースゲル電気泳動により確められた。
たｐＵＢｌｌｏ）ｌＪ液１０μノを混合し、１０（］ｍ
Ｍジチオスレイトール５μＡ 、 １ ｍＭＡＴＰ ５
ｐｉ 、ライゲーション緩％液５μ！、滅菌蒸留水１
０μノとＴ４リガーゼ溶液（Ｂ Ｒ，Ｌ製）５μノを加
え、１０℃で１晩放置し、組換ＤＮＡ分子を含む混合液
を得た。それぞれのＤＮＡが連結していることはアガロ
ースゲル電気泳動により確められた。
次に、バチルス・ズブチリスｌＡ２８９株をＳ、Ｃｈａ
ｎｇ 、 Ｓ、Ｎ、Ｃｏｂｅｎらのプロトプラスト形質
転換法（Ｍ、０．Ｇ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｇｅｍｅｔ ）１６８．１１１ （１９７９）
）４ごよりプロトプラス日こした。
ｎｇ 、 Ｓ、Ｎ、Ｃｏｂｅｎらのプロトプラスト形質
転換法（Ｍ、０．Ｇ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｇｅｍｅｔ ）１６８．１１１ （１９７９）
）４ごよりプロトプラス日こした。
前記の連結されたｐＵＴ’３１１ ［１を含む溶液５０
ｔｔ Ｊに２倍濃度のＳＭＭＰ溶液５０μ！とこのプ
ロトプラスト溶液０．５ ａｔを加え、更に、４０％Ｐ
ＥＧ６０００溶液１．５−を加えてよく混合し、２分間
室温に放置後、ＳＭ’ＭＰ溶液５ ｍｌを加え、低速遠
心（”＋０００ｒｐｍＸ２０分間）でプロトプラストを
・集めた。そして、集められたプロトプラストは再びＳ
ＭＭＰ溶液１厚ｅに１論濁した。
ｔｔ Ｊに２倍濃度のＳＭＭＰ溶液５０μ！とこのプ
ロトプラスト溶液０．５ ａｔを加え、更に、４０％Ｐ
ＥＧ６０００溶液１．５−を加えてよく混合し、２分間
室温に放置後、ＳＭ’ＭＰ溶液５ ｍｌを加え、低速遠
心（”＋０００ｒｐｍＸ２０分間）でプロトプラストを
・集めた。そして、集められたプロトプラストは再びＳ
ＭＭＰ溶液１厚ｅに１論濁した。
なお、ここで（標準濃度の）ＳＭＭＰ溶液とは２倍濃度
のＳＭ’Ｍ溶液と４倍濃度のＰＢ浴溶液等量混合したも
のであり、Ｘ倍濃度とはＸ倍に希釈するこさにより標準
濃度になることを示している。
のＳＭ’Ｍ溶液と４倍濃度のＰＢ浴溶液等量混合したも
のであり、Ｘ倍濃度とはＸ倍に希釈するこさにより標準
濃度になることを示している。
また、標準濃度のＳＭＵ＠液とは０．５Ｍショ糖。
０、０２ Ｍリンゴ酸、 ０．０２ Ｍ ＭｇＣノ、の
溶液でｐＨは６．５に調整されているものであり、標準
濃度のＰ］３溶液とはＤｉｆｃｎ Ａｎｔｉｈｉｏｔｉ
ｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ｎ（１３（Ｄｉｆｃｎ製）１Ｚ５り
を水１ノζこ溶かしたものである。更に４０％ＰＢＧ６
０００溶液とはＰＥＧ６０００１１０？と２倍濃度の８
ＭＭ溶液５ ｍｌを合せ蒸留水で希釈して１０１０ｌ３
としたものである。
溶液でｐＨは６．５に調整されているものであり、標準
濃度のＰ］３溶液とはＤｉｆｃｎ Ａｎｔｉｈｉｏｔｉ
ｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ｎ（１３（Ｄｉｆｃｎ製）１Ｚ５り
を水１ノζこ溶かしたものである。更に４０％ＰＢＧ６
０００溶液とはＰＥＧ６０００１１０？と２倍濃度の８
ＭＭ溶液５ ｍｌを合せ蒸留水で希釈して１０１０ｌ３
としたものである。
プロトプラストをＳＭＭＰ溶液１ ｍｌに懸濁した液を
３７℃で９０分間振盪培養した後、１００μｆ／ｒｎｌ
のカナマイシン（明治製菓製）、１％可溶性デンプン入
りのＩ） Ｍ ３培地（ＤＭ３培地はＭ、Ｇ、Ｇ。
３７℃で９０分間振盪培養した後、１００μｆ／ｒｎｌ
のカナマイシン（明治製菓製）、１％可溶性デンプン入
りのＩ） Ｍ ３培地（ＤＭ３培地はＭ、Ｇ、Ｇ。
１６．８１１１（１９７９）による）のプレート（０，
８％寒天、０．５Ｍコハク酸Ｎａ、０．５％カザミノ酸
。
８％寒天、０．５Ｍコハク酸Ｎａ、０．５％カザミノ酸
。
０．５％イーストエキストラクト、０．３５％に２ Ｈ
Ｐ ０４ｍ０．１５％ＫＨ，ＰＯ４，０，５％グルコー
ス 、ｏ、ｏ：ｚＭＭｇＣ！、、Ｏ，ｌＪ１％Ｂ８Ａ
（牛血清アルブミン））上に散き、３７℃で４８時間培
養した。ｐＵＢ １１０プラスミドに由来する部分ｌこ
はカナマイシン耐性を示す遺伝子（ＫＭ）があるので、
プラスミド分子をもった宿主細菌のみが生育してコロニ
ーを形成した。この中からＫＩ−Ｉ、法によりバチルス
・ズブチリスのアミラーゼ遺伝子を結合したプラスミド
をもった宿主細菌、ずなわち、 Ａｍｙ Ｋｍ の株を
選び出した。
Ｐ ０４ｍ０．１５％ＫＨ，ＰＯ４，０，５％グルコー
ス 、ｏ、ｏ：ｚＭＭｇＣ！、、Ｏ，ｌＪ１％Ｂ８Ａ
（牛血清アルブミン））上に散き、３７℃で４８時間培
養した。ｐＵＢ １１０プラスミドに由来する部分ｌこ
はカナマイシン耐性を示す遺伝子（ＫＭ）があるので、
プラスミド分子をもった宿主細菌のみが生育してコロニ
ーを形成した。この中からＫＩ−Ｉ、法によりバチルス
・ズブチリスのアミラーゼ遺伝子を結合したプラスミド
をもった宿主細菌、ずなわち、 Ａｍｙ Ｋｍ の株を
選び出した。
こノＡｍｙ Ｋｍ の株を１０μｆ／ｍｌのカナマイシ
ンを添加したＴＢＡＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、 Ｂｌ
ｏｏｄ。
ンを添加したＴＢＡＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、 Ｂｌ
ｏｏｄ。
Ａｇａｒ 、 Ｂａ５ｅ （Ｄｉｆｃｏ ） ）にて培
養し、前記のｐＵＢ１１０プラスミド分子の分離精製と
同様にして、この宿主細菌からバチルス・ズブチリスの
アミラーゼ遺伝子を含むｐＵＢ １１０プラスミド分子
を分離精製した。
養し、前記のｐＵＢ１１０プラスミド分子の分離精製と
同様にして、この宿主細菌からバチルス・ズブチリスの
アミラーゼ遺伝子を含むｐＵＢ １１０プラスミド分子
を分離精製した。
このプラスミド分子を用いてバチルス・ズブチリスｌＡ
２Ｂ９株を再びプロトプラスト形質転換法にて形質転換
させた結果、カナマイシン耐性になったバチルス・ズブ
チリスｌＡ２８９株がすべて同時にアミラーゼを生産し
ていることが判明した。すなわち、α−ｙ ミラーゼ遺
伝子がｐｌＪＢ１１０プラスミド分子に組み込まれてい
ることが確認された。
２Ｂ９株を再びプロトプラスト形質転換法にて形質転換
させた結果、カナマイシン耐性になったバチルス・ズブ
チリスｌＡ２８９株がすべて同時にアミラーゼを生産し
ていることが判明した。すなわち、α−ｙ ミラーゼ遺
伝子がｐｌＪＢ１１０プラスミド分子に組み込まれてい
ることが確認された。
一方、このプラスミド分子を種々の制限酵素（Ｅｃｏ
ＩＩＩ 、 ｎａｌ ＩＩ 、 Ｂａｌ ＩＩと８ａｌ
ｌ ｒ Ｂａｌ ＩｔとＰｓｔ Ｉ 、 Ｂａｌ Ｉ
ＩとＣ１ａ１等）で分解した。生じた各断片を用いｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｃｅ形質転１＄ ｉ’ノｋ（前述）にて、
アミラーゼを生産しないバチルス・ズブチリスｌＡ２８
９株を形質転換さぜることによりα−アミラーゼの遺伝
子の位置及びフィジカルマツプを作成し、α−アミラー
ゼの遺伝子の塩基配列をＭａｘａｍ−Ｏｉ １ｂｅｒｔ
の方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＩＩＩ 、 ｎａｌ ＩＩ 、 Ｂａｌ ＩＩと８ａｌ
ｌ ｒ Ｂａｌ ＩｔとＰｓｔ Ｉ 、 Ｂａｌ Ｉ
ＩとＣ１ａ１等）で分解した。生じた各断片を用いｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｃｅ形質転１＄ ｉ’ノｋ（前述）にて、
アミラーゼを生産しないバチルス・ズブチリスｌＡ２８
９株を形質転換さぜることによりα−アミラーゼの遺伝
子の位置及びフィジカルマツプを作成し、α−アミラー
ゼの遺伝子の塩基配列をＭａｘａｍ−Ｏｉ １ｂｅｒｔ
の方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ぴ ５６０（１９７７）Ｈこより決定した。
その結果α−アミラーゼぜＬ伝子の発！１７． （！：
その調節および０泌ζこ必要な領域をコードする塩基配
列は、α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＢ１
１０分子を制限酵素Ｅｃｏ旧とＸｂａｉで切断して得ら
れる１、４５ＫｂｐのＤＮＡ断片にあり、更に。
その調節および０泌ζこ必要な領域をコードする塩基配
列は、α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＢ１
１０分子を制限酵素Ｅｃｏ旧とＸｂａｉで切断して得ら
れる１、４５ＫｂｐのＤＮＡ断片にあり、更に。
この１．、！１５ＫｈｐのＤＮＡ断片を制御Ｊ：ｉ酵素
Ａｌｕｌでで切断して生ずる約り、４Ｔ（＋）Ｉ）のＤ
ＮＡ断片にあることが確認された。なおこのり、ＮＡ断
片の塩基配列はすでに示しであるう 得られたα−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドを用い
、異種遺伝子を発現させ、かつ、発現された蛋白質を細
胞外へ分泌させる分泌ベクター分子を作成した。この作
成は１例であり、本発明はこれに限られるものではない
。要はプラスミド自身の複製等に関係する部分と１分泌
をもたらすアミラーゼ遺伝子由来の遺伝子部分とか結合
していることである。結合の様式はリンカ−を介しても
、又、介していなくても良い。特に分泌ベクター作成時
に発現を期待する異種遺伝子を一緒に組み込めればリン
カ−を介する必要はない。
Ａｌｕｌでで切断して生ずる約り、４Ｔ（＋）Ｉ）のＤ
ＮＡ断片にあることが確認された。なおこのり、ＮＡ断
片の塩基配列はすでに示しであるう 得られたα−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドを用い
、異種遺伝子を発現させ、かつ、発現された蛋白質を細
胞外へ分泌させる分泌ベクター分子を作成した。この作
成は１例であり、本発明はこれに限られるものではない
。要はプラスミド自身の複製等に関係する部分と１分泌
をもたらすアミラーゼ遺伝子由来の遺伝子部分とか結合
していることである。結合の様式はリンカ−を介しても
、又、介していなくても良い。特に分泌ベクター作成時
に発現を期待する異種遺伝子を一緒に組み込めればリン
カ−を介する必要はない。
（分泌ベクターの作成）
先に得られたアミラーゼ遺伝子を含ムｐｌＪｒ３１１０
プラスミド分子４００μ２をＥｃｏＲＩ用酵素反応液（
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ −１１Ｃｌ！ （ｐＴ１７．５
） 、 ７ｍＭ ＭｇＣ４。
プラスミド分子４００μ２をＥｃｏＲＩ用酵素反応液（
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ −１１Ｃｌ！ （ｐＴ１７．５
） 、 ７ｍＭ ＭｇＣ４。
５０ ｍＭ ＮａＣノ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルフミン））に分散
し、制限酵素ＥｃｏＲＩ溶液３５０μノ及び制限酵素Ｘ
ｂａＩ溶液（全酒造製）４００μ を加え、６７℃で１
晩反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけた。
ール、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルフミン））に分散
し、制限酵素ＥｃｏＲＩ溶液３５０μノ及び制限酵素Ｘ
ｂａＩ溶液（全酒造製）４００μ を加え、６７℃で１
晩反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけた。
約４．９Ｋｂｐと約１．４５ＫｈｐのＤＮ人バンドを目
標としてヒドロキシアパタイト法（Ｔ＝Ｉ。
標としてヒドロキシアパタイト法（Ｔ＝Ｉ。
Ｆ、Ｆａｂｌａｋ ａｎｄ Ｒ，Ａ、ＦＩ＊ｖｅｌ＋
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ、ｃｉｄＳＲｅｓ、、 ５ 、
２３２１ （１９７Ｂ））にてゲル中より］）ＮＡ断片
を抽出し１．ぞれぞれをＴＥＰｊ衝液２００μノに溶解
した。
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ、ｃｉｄＳＲｅｓ、、 ５ 、
２３２１ （１９７Ｂ））にてゲル中より］）ＮＡ断片
を抽出し１．ぞれぞれをＴＥＰｊ衝液２００μノに溶解
した。
（１１μ断片の作成
約４．９ＫｂｐのＤＮＡ１ｐｆ当りｎ１ｃｋ転換緩衝液
（０，０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０．Ｉ Ｍ Ｍ
Ｃ！ Ｓ ０４ 。
（０，０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０．Ｉ Ｍ Ｍ
Ｃ！ Ｓ ０４ 。
０．１ ｍＭ ＤＴＴ 、 ５１３ｔｒＹ／ｍｌ ＢＳ
Ａ （ｐｌ−Ｉ７．２ ） ）２５μノに分散さぜ、次
いで２ｍＭＪＮＴＰ各５μ）及びＫｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｑｍｅｎｔ ｏｆ Ｉ）ＮＡ ｐｎｌｙｍｅｒａｓｙ
Ｉ（Ｂ ＲＬＮ ） １ ｕｎｉ ｔを加え、室温で３
０分間反応して末端部分を二重鎖にした。
Ａ （ｐｌ−Ｉ７．２ ） ）２５μノに分散さぜ、次
いで２ｍＭＪＮＴＰ各５μ）及びＫｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｑｍｅｎｔ ｏｆ Ｉ）ＮＡ ｐｎｌｙｍｅｒａｓｙ
Ｉ（Ｂ ＲＬＮ ） １ ｕｎｉ ｔを加え、室温で３
０分間反応して末端部分を二重鎖にした。
この末端部分を二重鎖にしたＤＮＡをフェノール抽出エ
タノール沈殿により甲離し、適当量のＴｇ緩衝液に溶解
した。
タノール沈殿により甲離し、適当量のＴｇ緩衝液に溶解
した。
次いでこのＤ Ｎ Ａ ０．４μｍ当りカイネース処理
した１ｌｉｎｄｌ’Ｊンカー（全酒造製）１μ２を加え
、更にライゲーション釉Ｆｊ％液２０μノ於びＴ４リガ
ーゼ１ｇ液（宝酒造１４ ） １ ｕｎｉｔを加え、１
０℃で１晩保温して反応させた。このＨｉｎｄｆを反応
させたＤＮＡをフェノール抽出エタノール沈殿により単
離し、これをＨｉｎ＋Ｊｊ用反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ） （ｐｌ＋７．５）、 ７ ＋ｎＭ Ｍ
ｇＣｊ！２ ．６０ｍＭ Ｍａｉｌり５０μノに溶解し
、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ溶液（全酒造製）２０ｕｎｉｔ
を加え、 ６７℃で充分反応させて結合したＢｉ ｎｄ
［リンカ一部分を切断した。
した１ｌｉｎｄｌ’Ｊンカー（全酒造製）１μ２を加え
、更にライゲーション釉Ｆｊ％液２０μノ於びＴ４リガ
ーゼ１ｇ液（宝酒造１４ ） １ ｕｎｉｔを加え、１
０℃で１晩保温して反応させた。このＨｉｎｄｆを反応
させたＤＮＡをフェノール抽出エタノール沈殿により単
離し、これをＨｉｎ＋Ｊｊ用反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ） （ｐｌ＋７．５）、 ７ ＋ｎＭ Ｍ
ｇＣｊ！２ ．６０ｍＭ Ｍａｉｌり５０μノに溶解し
、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ溶液（全酒造製）２０ｕｎｉｔ
を加え、 ６７℃で充分反応させて結合したＢｉ ｎｄ
［リンカ一部分を切断した。
この川ｎｄｌ ’Ｊンカ一部分を制限酵素用ｎｄｊで切
断したＤＮＡを１．［３％アガロース平板ゲル電気泳動
を行ない１次いでヒドロキシアパタイト法でゲル中より
約４．７Ｋｂｐ部分のＤＮＡを抽出した。フェノール抽
出エタノール沈殿により精製したのち。
断したＤＮＡを１．［３％アガロース平板ゲル電気泳動
を行ない１次いでヒドロキシアパタイト法でゲル中より
約４．７Ｋｂｐ部分のＤＮＡを抽出した。フェノール抽
出エタノール沈殿により精製したのち。
適当量のＴＢ緩衝液に溶解した。
このようにして得られたＤＮＡはプラスミドベクタ一部
分を構成する断片であり、Ａ断片とした。
分を構成する断片であり、Ａ断片とした。
ｆｉｌ Ｂ断片の作成
上記の約１．４５ＫｂｐのＤＮＡ溶液５０μ）と５倍濃
度のＨ４ｎｄｌｌ用反応緩衝液１２．５μノを混合し、
制現酵素Ａｊ！ｕｌ溶液（全酒造製）４０μノを加え。
度のＨ４ｎｄｌｌ用反応緩衝液１２．５μノを混合し、
制現酵素Ａｊ！ｕｌ溶液（全酒造製）４０μノを加え。
６７℃で２時間反応した。その後エタノール沈殿を行な
い、得られた沈殿を少量の滅萌蒸留水に溶解した。
い、得られた沈殿を少量の滅萌蒸留水に溶解した。
次いでＡ断片作成の場合と同様にしてＨｉｎｄｕ ’Ｊ
ンカーを結合し、このＨｉｎｄｌ ’Ｊンカ一部分を制
限酵素ｌ−１ｉｎｄｌで切断した。得られた反応液を５
％アクリルアミドゲル電気泳動を行なった。約４３０ｂ
ｐのバンド部分を切り出し、ガラス俸で粉砕後、これを
ゲル体積の６倍量の溶出緩衝液（０，１ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ）、１ｍＭＥＤＴＡ 、０．５Ｍ酢酸アンモニｒ
’７ム（ｐＨ８，０） ） トトモにエツペンドルフチ
ューブｌこ入れ、３７℃で一晩抽出した。上澄の抽出液
を取り、フェノール抽出エタノール沈殿により沈殿を得
、この沈殿を適当量のＴＢ緩衝液に溶解した。
ンカーを結合し、このＨｉｎｄｌ ’Ｊンカ一部分を制
限酵素ｌ−１ｉｎｄｌで切断した。得られた反応液を５
％アクリルアミドゲル電気泳動を行なった。約４３０ｂ
ｐのバンド部分を切り出し、ガラス俸で粉砕後、これを
ゲル体積の６倍量の溶出緩衝液（０，１ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ）、１ｍＭＥＤＴＡ 、０．５Ｍ酢酸アンモニｒ
’７ム（ｐＨ８，０） ） トトモにエツペンドルフチ
ューブｌこ入れ、３７℃で一晩抽出した。上澄の抽出液
を取り、フェノール抽出エタノール沈殿により沈殿を得
、この沈殿を適当量のＴＢ緩衝液に溶解した。
このようにして得られたＤＮＡはα−アミラーゼ遺伝子
の発現とその調節および分泌に必要な遺伝子を含む断片
であり、以下Ｂ断片とする。
の発現とその調節および分泌に必要な遺伝子を含む断片
であり、以下Ｂ断片とする。
Ｏｊ＋１ 分泌ベクターとしての組換ＤＮＡＢ子の作成
上記のようにして得られたＡ、Ｂ２つの断片をそれぞれ
４μｍおよび０．５μＶをライゲーション用緩衝液５０
μノに溶かし、Ｔ４１Ｊガーゼ尋液（宝酒造（（１））
Ｉ Ｑ Ｈｎｉｔｓを加え、１０℃で１晩反応させた
。この反応液を用い、前記のプロトプラスト形質転換を
行ない、形質転換体を１００μ？／／Ｉｔのカナマイシ
ン入りのＤＭ３プレート（前出）で生育するコロニー中
より任意の５００個のコロニーを選出し、常法によりプ
ラスミ下の大きさを調べた。
上記のようにして得られたＡ、Ｂ２つの断片をそれぞれ
４μｍおよび０．５μＶをライゲーション用緩衝液５０
μノに溶かし、Ｔ４１Ｊガーゼ尋液（宝酒造（（１））
Ｉ Ｑ Ｈｎｉｔｓを加え、１０℃で１晩反応させた
。この反応液を用い、前記のプロトプラスト形質転換を
行ない、形質転換体を１００μ？／／Ｉｔのカナマイシ
ン入りのＤＭ３プレート（前出）で生育するコロニー中
より任意の５００個のコロニーを選出し、常法によりプ
ラスミ下の大きさを調べた。
保有されているプラスミドの大きさが約５．５ Ｋ ｈ
ｐのものにつき、制限酵素などによる切断パターンの
比較、塩基配列の分析等を行なった結果、このプラスミ
ドは明らかに上記Ａ断片及びＢ断片を含んでいることが
確認された。即ち、このプラスミドは目的とするハイブ
リ゛ンドブラスミドとなっていた。
ｐのものにつき、制限酵素などによる切断パターンの
比較、塩基配列の分析等を行なった結果、このプラスミ
ドは明らかに上記Ａ断片及びＢ断片を含んでいることが
確認された。即ち、このプラスミドは目的とするハイブ
リ゛ンドブラスミドとなっていた。
このプラスミドは、Ｂ断片の一方の端（３′末端）にあ
る分泌に必要な領域に接続したＨｉｎｄｌ１部分に他の
遺伝子を結合することにより、結合した遺伝子は当然に
発現され％分泌に必要な領域を有することから１発現さ
れて生産された蛋白質（酵素）は細胞外に分泌させる能
力を有しており１分泌ベクターを含む組換ＤＮＡ分子と
して利用できる。
る分泌に必要な領域に接続したＨｉｎｄｌ１部分に他の
遺伝子を結合することにより、結合した遺伝子は当然に
発現され％分泌に必要な領域を有することから１発現さ
れて生産された蛋白質（酵素）は細胞外に分泌させる能
力を有しており１分泌ベクターを含む組換ＤＮＡ分子と
して利用できる。
実施例２
バチルス・ズブチリス による大腸菌由来β−ラクタマ
ーゼの菌体外生産。
ーゼの菌体外生産。
前記の分泌ベクターである組換ＤＮＡ外子を制限酵素Ｂ
ｉｎｄｌで完全に分解し、その断片に発現と分泌に必要
な領域を欠く大腸菌プラスミドｐＢｒ（３２２由米のβ
−ラクタマーゼをコードする遺伝子を結合した。
ｉｎｄｌで完全に分解し、その断片に発現と分泌に必要
な領域を欠く大腸菌プラスミドｐＢｒ（３２２由米のβ
−ラクタマーゼをコードする遺伝子を結合した。
＋１１ ｅ泌ベクターである組換ＤＮＡ＋子の制限酵素
Ｂｉｎｄｕによる完全消化 前記の分泌ベクターを保有した形質転換体をカナマイシ
ン入りのＬグロス１０〇−中で３７℃で５時間培養し、
遠心して菌体を集め、アルカリ法にて粗プラスミド５０
ｔ１ｆを得た。
Ｂｉｎｄｕによる完全消化 前記の分泌ベクターを保有した形質転換体をカナマイシ
ン入りのＬグロス１０〇−中で３７℃で５時間培養し、
遠心して菌体を集め、アルカリ法にて粗プラスミド５０
ｔ１ｆを得た。
これを’Ｉ” Ｅ緩衝液１５０μ）に溶解し、ＴＥ緩衝
液に対し透析したのち、０．８％アガロース電気泳動に
かけ、ヒドロキシアパタイト法で抽出精製を行ないプラ
スミドを単離した。このプラスミドを再びＴＥ緩衝液１
００μノｌこ溶解した。
液に対し透析したのち、０．８％アガロース電気泳動に
かけ、ヒドロキシアパタイト法で抽出精製を行ないプラ
スミドを単離した。このプラスミドを再びＴＥ緩衝液１
００μノｌこ溶解した。
この精製したプラスミド溶液に）ｌｉｎｄｌｌ用反応緩
衝液２５μノおよび制限酵素用りｄ曹溶液３０μノを加
え、６７℃で４Ｂｆ間反応を行なった。反応終了後、こ
れを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ａ断
片およびＢ断片を前記と同様にして抽出し、それぞれを
適当量のＴＷ緩衝液に溶解した。
衝液２５μノおよび制限酵素用りｄ曹溶液３０μノを加
え、６７℃で４Ｂｆ間反応を行なった。反応終了後、こ
れを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ａ断
片およびＢ断片を前記と同様にして抽出し、それぞれを
適当量のＴＷ緩衝液に溶解した。
Ａ断片は更にアルカリフォスファターゼ溶液（全酒造製
）１０μノを加え、６５℃で３０分間反応し、フェノー
ル抽出、エーテル処理、エタノール沈殿を行ない沈殿を
得た。この沈殿を適当昂二のＴＦ緩楕液に溶解した。
）１０μノを加え、６５℃で３０分間反応し、フェノー
ル抽出、エーテル処理、エタノール沈殿を行ない沈殿を
得た。この沈殿を適当昂二のＴＦ緩楕液に溶解した。
（１１）発現と分泌に必要な領域を欠くβ−ラクタマー
ゼ遺伝子の調製 ｐＢ１１３２２プラスミドをＥｃｏｌ用反応緩衝液５０
０μノに溶解し、 ＥｃｏＲＩ溶液５０μノを加え、３
７℃で適当時間反応して、環状ＤＮＡ鎖を切断してリニ
アー分子とした。
ゼ遺伝子の調製 ｐＢ１１３２２プラスミドをＥｃｏｌ用反応緩衝液５０
０μノに溶解し、 ＥｃｏＲＩ溶液５０μノを加え、３
７℃で適当時間反応して、環状ＤＮＡ鎖を切断してリニ
アー分子とした。
次ｆここのリニアーＤＮＡ分子溶液２５μノに対し滅菌
蒸留水２５μノ、２倍濃度のＨａ１３１用反応緩＠液（
２４ｍＭＣａＣ）２ 、 ２４ｍＭ ＭｇＣＪ！２ 、
０．４ＭＮａＣノ 、ＡＯｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣノ、
２ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐｌ（８，０） ） ５０μノ、
エキソヌクレアーゼＢａｌ！＋１溶液１０μノを加え、
２０℃で４５秒間反応させたのち、フェノール抽出エタ
ノール沈殿を行い、乾燥した。このものを滅菌蒸留水９
０μノに溶解し、５倍濃度のＢｓｔＮｉ用反応緩衝Ｉ（
１００ｍＭＫＣ！。
蒸留水２５μノ、２倍濃度のＨａ１３１用反応緩＠液（
２４ｍＭＣａＣ）２ 、 ２４ｍＭ ＭｇＣＪ！２ 、
０．４ＭＮａＣノ 、ＡＯｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣノ、
２ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐｌ（８，０） ） ５０μノ、
エキソヌクレアーゼＢａｌ！＋１溶液１０μノを加え、
２０℃で４５秒間反応させたのち、フェノール抽出エタ
ノール沈殿を行い、乾燥した。このものを滅菌蒸留水９
０μノに溶解し、５倍濃度のＢｓｔＮｉ用反応緩衝Ｉ（
１００ｍＭＫＣ！。
１００＋ｎＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ） 、３０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２．３０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５００μ
ｔ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ８，０） ） ８μノと制限酵
素ＢｓｔＮ１溶液（全酒造！り６μ）を加え、６０℃で
１．５時間反応させた。ここ韮での反応を数回性ない、
まとめて１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．４
５Ｋｂｌ）の位置にあるバンドをヒドロキシアノ（タイ
ト法で抽出した。得られた約１．ｄ５ＫｈｐのＤＮＡ断
片をフェノール抽出、エタノール沈殿により精製し、滅
菌蒸留水４０μ）に溶解した。この溶液に１００倍濃の
ｎ ｉ ｃ＃Ｌ転換緩衝液４μノ及び１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐａ液（ヤマサ正油製）各２μノ、 Ｋｌｅｎｏｗｆｒ
Ｂｇｍｅｎｔ ｏｆＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａａｅｌ
１ｉｉ３μノを加え、室温で６０分間反応した。
Ｃｌ２．３０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５００μ
ｔ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ８，０） ） ８μノと制限酵
素ＢｓｔＮ１溶液（全酒造！り６μ）を加え、６０℃で
１．５時間反応させた。ここ韮での反応を数回性ない、
まとめて１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．４
５Ｋｂｌ）の位置にあるバンドをヒドロキシアノ（タイ
ト法で抽出した。得られた約１．ｄ５ＫｈｐのＤＮＡ断
片をフェノール抽出、エタノール沈殿により精製し、滅
菌蒸留水４０μ）に溶解した。この溶液に１００倍濃の
ｎ ｉ ｃ＃Ｌ転換緩衝液４μノ及び１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐａ液（ヤマサ正油製）各２μノ、 Ｋｌｅｎｏｗｆｒ
Ｂｇｍｅｎｔ ｏｆＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａａｅｌ
１ｉｉ３μノを加え、室温で６０分間反応した。
以下フェノール抽出、エタノール沈殿を行ない。
得られた沈殿を滅菌蒸留水２０μノに溶解した。
得られたＤＮＡ断片溶液を前記のＢｉｎｄ＠ ’Ｊンカ
ー付加、制限酵素）１ｉｎｄｌにより分解を行ない、１
％アガロースゲル電気泳動を行ない、ヒドロキシアパタ
イト法で抽出して再び約１．．１５ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。このものをフェノール抽出、エタノール沈殿で
′ｆｆＩ製したのち適当量のＴＥ緩衝液に溶解した。
ー付加、制限酵素）１ｉｎｄｌにより分解を行ない、１
％アガロースゲル電気泳動を行ない、ヒドロキシアパタ
イト法で抽出して再び約１．．１５ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。このものをフェノール抽出、エタノール沈殿で
′ｆｆＩ製したのち適当量のＴＥ緩衝液に溶解した。
（ｔｉｉｌ β−ラクタマーゼ遺伝子を含む複合プラス
ミド分子の調製 上記（ｉｔ 、 （ｔｉｌで得たＡ断片溶液１０μ〕、
Ｂ断片溶液１０μノおよび大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝
子溶液１０μノに１０ｍＭＡＴＰ溶液１０μノ、５０ｍ
Ｍジチオスレイトール溶液２０μノ、滅菌蒸留水２０μ
ノおよびライゲーション用緩衝液１０μノおよびＴ４リ
ガーゼ溶液５μノを加え、１０℃で１６時間反応した。
ミド分子の調製 上記（ｉｔ 、 （ｔｉｌで得たＡ断片溶液１０μ〕、
Ｂ断片溶液１０μノおよび大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝
子溶液１０μノに１０ｍＭＡＴＰ溶液１０μノ、５０ｍ
Ｍジチオスレイトール溶液２０μノ、滅菌蒸留水２０μ
ノおよびライゲーション用緩衝液１０μノおよびＴ４リ
ガーゼ溶液５μノを加え、１０℃で１６時間反応した。
Ｇｖｌ β−ラクタマーゼ遺伝子を含む複合プラスミド
分子による形質転換 β−ラクタマーゼ遺伝子を含む複合プラスミド分子を前
記のプロトプラスト形質転換法によりバチルス・ズブチ
リスｌＡ２Ｂ９株に取り込ませた。
分子による形質転換 β−ラクタマーゼ遺伝子を含む複合プラスミド分子を前
記のプロトプラスト形質転換法によりバチルス・ズブチ
リスｌＡ２Ｂ９株に取り込ませた。
形質転換体を１５０μｆ／［ｌのカナマイシンを含むＤ
Ｍ６プレート（前出）にて再生を行なわせた後。
Ｍ６プレート（前出）にて再生を行なわせた後。
カナマイシン１０μｔ／ｍｅを含む１％の可溶性デンプ
ン入りのＬプレートにて培養し、当該培地上にニトロセ
フイン溶液をスプレーして、β−ラクタマーゼを分泌し
ている形質転換株を選択した。
ン入りのＬプレートにて培養し、当該培地上にニトロセ
フイン溶液をスプレーして、β−ラクタマーゼを分泌し
ている形質転換株を選択した。
ｆＶｌ β−ラクタマーゼを分泌している形質転換株の
β−ラクタマーゼ活性の測定 β−ラクタマーゼを分泌している形質転換株を１０μｍ
／−のカナマイシン入りのＬグロスで６７℃、５時間の
培養を行なったのち、遠心により培養液および菌体に分
離した。
β−ラクタマーゼ活性の測定 β−ラクタマーゼを分泌している形質転換株を１０μｍ
／−のカナマイシン入りのＬグロスで６７℃、５時間の
培養を行なったのち、遠心により培養液および菌体に分
離した。
菌体は等量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｅノ緩衝液（ｐ
Ｈ７０）に分散させ、超音波菌体破壊装置にて菌体を破
壊した。
Ｈ７０）に分散させ、超音波菌体破壊装置にて菌体を破
壊した。
この両者のβ−ラクタマーゼ活性をニトロセフイン比色
法により測定したところ、培養液分には５００ｕｎｉｔ
のβ−ラクタマーゼ活性があり、菌体外には４ｕｎｉｔ
のβ−ラクタマーゼ活性があることが認められた。
法により測定したところ、培養液分には５００ｕｎｉｔ
のβ−ラクタマーゼ活性があり、菌体外には４ｕｎｉｔ
のβ−ラクタマーゼ活性があることが認められた。
即ち、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来のβ−ラクタ
マーゼはほとんどがバチルス・ズブチリス菌体外に分泌
されていることが明らかである。なお、宿主菌として用
いたバチルス・ズブチリス１人２８９株には全くβ−ラ
クタマーゼ活性が認められなかった。
マーゼはほとんどがバチルス・ズブチリス菌体外に分泌
されていることが明らかである。なお、宿主菌として用
いたバチルス・ズブチリス１人２８９株には全くβ−ラ
クタマーゼ活性が認められなかった。
上記のニトロセフインにょるβ−ラクタマーゼの検出及
び測定は下記のように行なった。
び測定は下記のように行なった。
（１） スプレー法
ニトロセフイン５りをジメチルシン二ルポキシド０．５
ｄに溶かし、０．１ｍＭリン酸緩衝液９．５ ｄ ’Ｔ
：希釈した溶液を、β−ラクタマーゼを分泌してぃりβ
−ラクタマーゼ活性を有していることを検出する。
ｄに溶かし、０．１ｍＭリン酸緩衝液９．５ ｄ ’Ｔ
：希釈した溶液を、β−ラクタマーゼを分泌してぃりβ
−ラクタマーゼ活性を有していることを検出する。
【１１）比色法
ｘ−ｆシー法で作成したニトロセフイン溶液５０μノに
滅菌蒸留水２０μノを加え、これｔこ酵素液１０μノを
添加し、良く混合したのち、４９８ｎｍの吸光度の増加
を測定する。
滅菌蒸留水２０μノを加え、これｔこ酵素液１０μノを
添加し、良く混合したのち、４９８ｎｍの吸光度の増加
を測定する。
なお、β−ラクタマーゼの１ｕｎｉｔとは１分間ｌこ１
μｍｏｌｅのニトロセフインを加水分解する機能量であ
る。
μｍｏｌｅのニトロセフインを加水分解する機能量であ
る。
才だ、上記のｌ−ラクタマーゼ活性のある培養液分に大
腸菌プラスミドｐ１３Ｒ３２２由米β−ラクタマーゼに
対する抗体を加えると、β−ラクタマーゼ活性がほぼ完
全−ζ消失することから、当該形質転換株から分泌され
たβ−ラクタマーゼは大腸菌由来のβ−ラクタマーゼと
同一蛋白質であることが明らかである。
腸菌プラスミドｐ１３Ｒ３２２由米β−ラクタマーゼに
対する抗体を加えると、β−ラクタマーゼ活性がほぼ完
全−ζ消失することから、当該形質転換株から分泌され
たβ−ラクタマーゼは大腸菌由来のβ−ラクタマーゼと
同一蛋白質であることが明らかである。
更（ここの形質転換株より複合プラスミド分子を分離し
、 Ｍ；Ｉｘａｍ −Ｇ１１ｂｅｒｔの方法により塩基
配列を決定したところ、β−ラクタマーゼの発現分泌に
必要な領域を欠くβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子
は本発明ｌこかかる分泌ベクター遺伝子部分に川ｎｒｌ
Ｎ ’）ンカーを介して連結していることが判明した。
、 Ｍ；Ｉｘａｍ −Ｇ１１ｂｅｒｔの方法により塩基
配列を決定したところ、β−ラクタマーゼの発現分泌に
必要な領域を欠くβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子
は本発明ｌこかかる分泌ベクター遺伝子部分に川ｎｒｌ
Ｎ ’）ンカーを介して連結していることが判明した。
なお、これら実施例に用いた酵素反応、電気泳動、ＤＮ
Ａ抽出等に使用した緩衝液、方法Ｖはいずれも説明書、
各種文献、手引書等ｆこ記載されている一般的な組成、
方法を用いたものである。
Ａ抽出等に使用した緩衝液、方法Ｖはいずれも説明書、
各種文献、手引書等ｆこ記載されている一般的な組成、
方法を用いたものである。
代理人 弁理士 戸 １）親 男
第１頁の続き
＠出 願 人 カルビス食品工業株式会社東京都渋谷区
恵比寿西２丁目２０ 番３号 ■出 願 人 王子コーンスターチ株式会社東京都中央
区銀座１丁目７番１゜ ＝４３６−
恵比寿西２丁目２０ 番３号 ■出 願 人 王子コーンスターチ株式会社東京都中央
区銀座１丁目７番１゜ ＝４３６−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）バチルス・ズブチルスのα−アミラーゼ遺伝子の
発現とその調節および分泌に必要な領域をコードする遺
伝子またはその一部が、バチルス属細菌内で複製可能な
ベクターＤＮＡに結合していることを特徴とする組換Ｄ
ＮＡ分子。 （２） α−アミラーゼ遺伝子の発現とその調節および
分泌に必要な領域をコードする遺伝子断片がバチルス属
細菌内で複製可能なベクターに結合しており、その下流
に蛋白質の遺伝情報を有する塩基配列が連結しているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組換ＤＮＡ
分子。 （ろ） α−アミラーゼ遺伝子の発現とその調節および
分泌に必要な領域をコードする遺伝子断片が下記の塩基
配列、あるいは、その一部であることを特徴とする特許
請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ分子。 ＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧ ＡＡＧＡＧＣＧＧｉ’ＡＡＡ
ＡＧＡＡＧＡＡＡ ＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡ ＡＴＣＡＴ
ＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧ ＧＴＴＴＴＴＴＴＴ
Ｔ ＴＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＧＧＡＡ ＡＣ
ＡＧＴＣＴＣＧＧ ＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡ
ＣＣＡ’ｒ ＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴ ＴＣＡＣＴＣＴＧ
ＣＣＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴ ＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡ Ｔ
ＴＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＡ ＡＧＣＧＴ
ＡＡＡＣＡ ＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＣＡ
Ｔ ＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡ ＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡ
ＡＧＡＡＴＯＡＡ ＧＴＡＡＧＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＴ
ＧＡＣＴＣＣＧＡＡＧＴＡＡＧＴ ＣＴＴＣＡＡＡＡＡ
Ａ ＴＣＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡ、ＡＧＡ Ａ
ＴＧＴＴＴＧＣＡＡ ＡＡＣＧＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴ
ＣＴＴＴＡ ＣＴＧＣＣＧＴＴＡＴ ＴＣＧＣＴＧＧＡ
ＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧ ＴＴＴＴＡＴ１’ＴＧＧ
ＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡ
ＧＴＧＣＴＧ ＡＡＡＣＧＧＣＧＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡ
ＡＴ ＧＡＧ （４）α−アミラーゼ遺伝子の発現とその調節および分
泌ζこ必要な領域をコードする遺伝子断片が特許請求の
範囲第６項に記載される塩基配列の誘導体であることを
ｔＦ１徴とする特許請求の範囲第２項に記載の組換ＤＮ
Ａ分子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58116144A JPS609487A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 組換ｄｎａ分子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58116144A JPS609487A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 組換ｄｎａ分子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS609487A true JPS609487A (ja) | 1985-01-18 |
Family
ID=14679834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58116144A Pending JPS609487A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 組換ｄｎａ分子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS609487A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0154284A2 (en) * | 1984-03-09 | 1985-09-11 | Kunio Yamane | DNA coding for a signal peptide and DNA containing the same |
| WO1997000677A1 (fr) * | 1995-06-21 | 1997-01-09 | Sichuan Industrial Institute Of Antibiotics, The State Pharmaceutical Administration Of China | Utilisation de l'ubenimex et de la composition pharmaceutique le renfermant pour le traitement de l'hepatite virale |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
-
1983
- 1983-06-29 JP JP58116144A patent/JPS609487A/ja active Pending
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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