FI120155B - Menetelmä ja järjestelmä kaupallisesti tärkeiden eksoproteiinien tehostetuksi tuottamiseksi grampositiivisissa bakteereissa - Google Patents

Description

Menetelmä ja järjestelmä kaupallisesti tärkeiden eksqproteii- nien tehostetuksi tuottamiseksi grampositiivisissa baktee reissa 5 Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee menetelmää ja ekspressiojärjestelmää teollisesti ja lääketieteellisesti tärkeiden ek-soproteiinien tuottamiseksi tehostetusti grampositiivisissa bakteereissa, erityisesti suvun Bacillus lajeissa.

10 Tausta

Grampositiivisissa bakteereissa erittyvät proteiinit kuljetetaan solukalvon ja soluseinän läpi ja vapautetaan sitten ulkopuoliseen alustaan. Gramnegatiivisia bakteereja sen sijaan ympäröi kaksi solu (eli pinta) -kalvoa; 15 niillä ei ole soluseinää. Gramnegatiivisissa bakteereissa useimmat kuljetetut proteiinit eivät vapaudu solusta, vaan ne jäävät kalvojenväliseen periplasmatilaan ja ulompaan kalvoon.

E, colissa on identifioitu kaksi erityskoneiston 20 komponenttityyppiä: liukoiset sytoplasman proteiinit ja kalvoon liittyvät proteiinit [katsaus aiheeseen; Wickner et ai., Annu. Rev. Biochem. 60 (1991) 101 - 124]. Liukoiset sytoplasman proteiinit, mukaan luettuina SecB ja lämpösok-kiproteiinit, estävät kaikki erittyvien proteiinien esias-25 teiden laskostumisen erityksen kannalta sopimattomaan kon-formaatioon. Kalvoon liittyvien proteiinien ryhmään kuuluvat ulkokalvon proteiini SecA, yhtenäisen kalvon proteiinit SecY, SecE, SecD ja SecF ja signaalipeptidaasit Lep ja Lsp [katsauksia aiheeseen: Hayashi, S. ja Wu, H. C., J. Bio- 30 energ. Biomembr. 22 (1990) 451 - 471; Dalbey, R. E., Mol.

Microbiol. 5 (1991) 2855 - 2860]. Nämä kalvoon liittyvät proteiinit ovat mukana esiasteen sitomisessa ja sen siirtämisessä sytoplasmakalvon poikki, minkä jälkeen seuraa sig-naalipeptidin lohkeaminen ja proteiinin vapautuminen.

35 Tiedot grampositiivisten bakteerien erityskoneistos- ta ovat rajoittuneempia. Tiedot, joita on saatavissa B. Sub- 2 tilisista, geneettisesti ja fysiologisesti hyvin karakterisoidusta tämän suvun malliorganismista, viittaavat yleiseen samankaltaisuuteen E. colin vastaavan koneiston kanssa mutta myös eroihin yksittäisten komponenttien rakenteessa ja 5 spesifisyydessä, jotka mahdollisesti heijastavat vastaavien soluvaippojen hyvin erilaisen koostumuksen ja rakenteen asettamia vaatimuksia.

Grampositiivisilla bakteereilla, kuten B. suttuisilla, B. amyloliquefaciensisilla ja B, licheniformisilla 10 on hyvin suuri kapasiteetti proteiinien erityksen suhteen, ja monia solunulkoisia Bacilius-entsyymejä käytetään itse asiassa teollisesti. Koska grampositiivisten bakteerien erittämä t proteiinit ovat kaupallisesti niin tärkeitä ja koska grampositiivisten bakteerien erittämät proteiinit läpäise-15 vät soluvaipan, jolla on hyvin erilainen rakenne kuin E. colin soluvaipalla, on grampositiivisten bakteerien moleku-laarisilla proteiinineritysmekanismeilla huomattava akateeminen ja teollinen merkitys.

Tässä suhteessa olemme jokin aika sitten löytäneet 20 B. subtilisin erityskoneiston yhden uuden komponentin, PrsA-proteiinin [Kontinen, V. P. ja Sarvas, M., J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 2333 - 2344; Kontinen, V. P. et ai., Mol. Microbiol. 5 (1991) 1273 - 1283]. prsA-geeni, joka koodittaa PrsA-proteiinia, määriteltiin aluksi ei-letaalis-25 ten mutaatioiden kautta, jotka vähensivät muutamien ekso-proteiinien eritystä [Kontinen, V. P. ja Sarvas, M., J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 2333 - 2344]. Kloonatun prsA- geenin DNA-sekvenssin ja tämän geenin ja proteiinin parissa sen jälkeen tekemämme tutkimuksen perusteella väitämme, et-30 tä prsA koodittaa proteiinia (PrsA:ta), joka toimii "esiliinana" (chaperone) ja siirtyy sytoplasmakalvon poikki [alkuvaiheen tutkimuksen suhteen katso Kontinen, V. P. et ai., Mol. Microbiol. 5 (1991) 1273 - 1283]. PrsA-prote- iinilla on havaittu olevan rajoitettu määrä (noin 30 %) 35 sekvenssihomologiaa Lactococcus laatisin PrtM-proteiinin kanssa, jonka proteiinin on ehdotettu myötävaikuttavan kul- 3 jetetun seriiniproteaasin valmiin muodon syntymiseen [Haan-drikman, A. J. et ai., J. Bacteriol. 171 (1989) 2789 - 2794; Vos, P. et ai., J. Bacteriol. 171 (1989) 2795 - 2802]. Samanlaista toimintaa ei ole liitetty bakteerien eritys-5 koneiston muihin tunnettuihin proteiineihin, mikä viittaa siihen, että PrsA-proteiini on proteiinineritystiellä esiintyvä uudentyyppinen komponentti, joka helpottaa erittyvien proteiinien vapautumista ja todennäköisesti laskostumista niiden siirryttyä sytoplasmakalvon poikki grampositiivisis- 10 sa bakteereissa.

On edullista tuottaa kiinnostuksen kohteina olevia proteiineja bakteereissa erittyvässä muodossa, sillä kuljetetut proteiinit säilyttävät tavallisesti luontaisen konfor-maationsa toisin kuin solunsisäisessä tuotannossa, joka mo-15 nissa tapauksissa johtaa tuotetun proteiinin aggregoitumi- seen. Toinen etu, joka on teollisesti ja lääketieteellisesti tärkeiden proteiinien tuottamisella bakteereissa erittyvässä muodossa, on se, että erittyminen helpottaa proteiinituotteen puhdistusta. Lisäksi grampositiiviset baktee-20 rit, kuten Bacillus sp., eivät, toisin kuin E. coli, sisällä toksisia yhdisteitä, kuten lipopolysakkaridia, mikä tekee niistä erityisen sopivia isäntiä lääketieteellisten ja farmaseuttisten proteiinien tuottamiseksi.

Erittyneiden proteiinien kasvaneella saannolla oli-25 si suuri merkitys monien eksoentsyymien, kuten alfa-amy-laasien, proteaasien ja lipaasien, teollisessa tuotannossa käytettävien grampositiivisten Bacillus-kantojen parantamisen kannalta. Tähän asti on strategiana ollut asianomaisen geenin yli-ilmentäminen. On olemassa tunnettuja ja helposti 30 käytettävissä olevia menetelmiä tämän tekemiseksi, kuten geenin ilmentymisen lisääminen käyttämällä monikopioisia plasmideja tai geenin aktiivisuuden edistäminen muuntamalla sen säätelyelementteja, esimerkiksi käyttämällä voimakkaita promoottoreja tai useita promoottoreja. Tällä tavalla on 35 saavutettu eksoproteiinien synteesin dramaattisia kasvuja, aina sellaiselle tasolle asti, jolla synteesin lisäämisestä 4 ei ole lisäetua erityskoneistossa esiintyvien pullonkaulojen vuoksi. Olisi toivottavaa lisätä erityskapasiteettia lisääntyneen synteesin rinnalla. Tämä ei ole kuitenkaan ollut tähän mennessä mahdollista.

5 Tämän keksinnön yhtenä päämääränä on helpottaa eri- tysmekanismin muodostamaa pullonkaulaa grampositiivisissa bakteereissa ja tarjota käyttöön menetelmä ja järjestelmä, joilla voidaan suurentaa grampositiivisista bakteereista, kuten Bacillus-lajeista, normaalisti erittyvien proteiinien 10 määriä, kun kiinnostuksen kohteena olevan homologisen tai heterologisen proteiinin iImentymistaso on nostettu muunta-mattomissa tai villiä tyyppiä olevissa organismeissa normaalisti syntyvän määrän yläpuolelle.

Tämän keksinnön yhtenä lisäpäämääränä on kuvata bak-15 teeri-isäntiä ja plasmideja, joita voidaan käyttää erilaisten kaupallisesti tärkeiden eksoproteiinien tuotannon edistämiseen.

Yhteenveto 1. Keksintö koskee grampositiivista bakteeria, jol-20 le on tunnusomaista se mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

2. Lisäksi keksintö koskee menetelmää mielenkiinnon kohteena olevan eksoproteiinin tuottamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista se mitä patenttivaatimuksessa 7 25 esitetään.

3. Lisäksi keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän ja ekspressiojärjestelmän grampositiivisista bakteereista (kuten Bacillus sp.) normaalisti erittyvien yhden tai useamman homologisen tai heterologisen proteiinin määrien suurenta- 30 miseksi, kun yhden tai useamman homologisen tai heterologisen proteiinin ilmentymistaso on nostettu muuntamattornien tai villiä tyyppiä olevien organismien tuottamien muunta-mattomien tai villin tyypin määrien yläpuolelle.

Keksintömme mukainen menetelmä ja järjestelmä kä- 35 sittävät Prsä.-proteiinin tai sen toiminnallisen homologin ylituotannon grampositiivisessa bakteeri-isännässä, jolla 5 on kyky ylituottaa myös vähintään yhtä kiinnostuksen kohteena olevaa homologista tai heterologista eksoproteiinia. Tämän keksinnön mukaisesti ylituotanto tarkoittaa villin tyypin määrää suurempaa määrää, ts. määrää, joka on suurem-5 pi kuin villiä tyyppiä olevan bakteerin normaalisti tuottama määrä proteiinia (PrsA:ta tai sen toiminnallista homologia tai kiinnostuksen kohteena olevaa eksoproteiinia). Samoin keksinnön mukaisesti ylituotanto saadaan aikaan tavanomaisin alalla tunnetuin keinoin, esimerkiksi käyttämällä 10 monikopioisia plasmideja, PrsA:ta tai sen yhtä tai useampaa toiminnallista homologia ja/tai kiinnostuksen kohteena olevaa eksoproteiinia koodittavien geenien useita kopioita, isännän kromosomissa yhdistettynä säätelyelementtien muuntamiseen ilmentymisen lisäämiseksi, esimerkiksi yhden tai 15 useamman voimakkaan promoottorin, useiden promoottorien, tehostajien jne. käyttöön. Keksinnön mukaisen menetelmän ja järjestelmän käyttö johtaa syntetisoitujen eksoproteiinien voimakkaasti tehostuneeseen, esimerkiksi vertailunäytteisiin nähden jopa viisinkertaiseen - kymmenkertaiseen, erittymi-20 seen kasvualustaan. Kasvualustaan erlttymisensä jälkeen nämä eksoproteiinit voidaan ottaa talteen ja puhdistaa yksinkertaisesti .

Keksinnön mukainen ekspressiojärjestelmä käsittää grampositiivisen isäntäbakteerin, esimerkiksi Bacillus-la-25 jin, jolla on kyky ilmentää suurempia kuin villin tyypin määriä PrsA-proteiinia tai sen toiminnallista homologia ja suurempia kuin villin tyypin määriä kiinnostuksen kohteena olevaa eksoproteiinia, esimerkiksi alfa-amylaasia, subtili-siinia, pneumolysiiniä, lipaaseja tai muita kaupallisen kiin-30 nostuksen kohteina olevia eksoproteaaseja. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää tämän ekspressiojärjestelmän käytön kaupallisesti tärkeiden eksoproteiinien tuotannon edistämiseksi grampositiivisissa bakteereissa. Tämän menetelmän mukaisesti yli-ilmennetään ainakin yhtä kiinnostuksen kohtee-35 na olevaa eksoproteiinia grampositiivisessa isäntäbaktee-rissa, joka yli-ilmentää (ts. ilmentää suurempia kuin vil- 6

Iin tyypin bakteerin tuottamia määriä) myös PrsA-proteiinia tai sen toiminnallista homologia. Tämän keksinnön mukaisesti PrsA-proteiinin toiminnallinen homologi on proteiini, jolla yli-ilmennettynä on kyky parantaa grampositiivisen bak-5 teerin erityskykyä kiinnostuksen kohteena olevan eksoprote-iinin erityksen suhteen. Samoin tämän keksinnön mukaisesti PrsA:n toiminnallinen homologi voidaan identifioida muutamin keinoin, mm. sekvenssihomologialla prsA:n tai PrsA:n kanssa, immunologisella reaktiolla yhden tai useamman kor-10 keatitterisen anti-PrsA-vasta-aineen kanssa ja/tai toiminnallisesti, ts. proteiinina, jolla yli-ilmennettynä on kyky parantaa grampositiivisen bakteerin erityskykyä kiinnostuksen kohteena olevan eksoproteiinin erityksen suhteen.

Yksi edullinen keino grampositiivisten isäntäbak-15 teerien, kuten Bacillus-lajien, transformoimiseksi siten, että ne tuottavat suurempia kuin villin tyypin määriä PrsA-proteiinia, on transformoida isäntä plasmidilla pKTH277, joka sisältää Bacillus subtilis -peräisen psrA-geenin. Voidaan konstruoida vastaavia plasmideja, jotka sisältävät 20 PrsA-proteiinin toiminnallisia homologeja koodittavia geenejä. Näitä plasmideja voidaan käyttää grampositiivisten isäntäbakteerien transformointiin, niin että ne ylituotta-vat PrsA:n toiminnallisia homologeja. Kun nämä grampositii-viset isäntäkannat on käsitelty ylituottamaan PrsA-homolo-25 geja (joita voidaan kutsua myös PrsA:n kaltaisiksi proteiineiksi) , niitä voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti kiinnostuksen kohteena olevien ylituotettujen eksoproteii-nien tehostettuun erittämiseen.

Tämä keksintö tuo myös esiin ja sisältää menetelmiä 30 ja rakenteita, jotka liittyvät siihen havaintoomme, että erittymistä voidaan tehostaa grampositiivisissa bakteereissa suurentamalla solun PrsA-proteiinin tai sen yhden tai useamman toiminnallisen homologin määrää grampositiivisissa isännissä, jotka ilmentävät villin tyypin määriä suurempia 35 määriä kiinnostuksen kohteena olevia eksoproteiineja.

7

Yhtenä puolenaan keksintömme sisältää ekspressio-järjestelmän eksoproteiinien erityksen edistämiseksi gram-positiivisissa bakteereissa, joka käsittää grampositiivisen bakteerin, jolla on kyky ilmentää villin tyypin määriä suu-5 rempia määriä PrsA-proteiinia tai sen yhtä tai useampaa toiminnallista homologia ja kyky ilmentää villin tyypin määriä suurempia määriä vähintään yhtä kiinnostuksen kohteena olevaa eksoproteiinia.

Yhtenä lisäpuolenaan keksintömme sisältää gramposi-10 tiivisen bakteerin, jolla on kyky ilmentää villin tyypin määriä suurempia määriä vähintään yhtä kiinnostuksen kohteena olevaa eksoproteiinia ja joka käsittää lisäksi pKTH277:n.

Yhtenä lisäpuolenaan keksintömme sisältää vielä 15 grampositiivisen bakteerin, jolla on kyky ilmentää villin tyypin määriä suurempia määriä vähintään yhtä kiinnostuksen kohteena olevaa eksoproteiinia ja joka käsittää lisäksi vähintään yhden seuraavista: vähintään kaksi Bacillus subti-lis -peräisen psrA-geenin tai sen toiminnallisen homologin 20 kopiota; Bacillus subtilis -peräinen psrA-geeni tai sen toiminnallinen homologi kytkettynä operatiivisesti voimakkaisiin säätelysekvensseihin, jotka johtavat mainitun psrA-geenin tai sen toiminnallisen homologin yli-ilmentymiseen.

Tässä kuvataan myös DNA-rakenne, joka käsittää Ba-25 cillus subtilis -peräisen psrA-geenin tai sen toiminnallisen homologin sellaisten ekspressiosignaalien ohjauksessa, jotka aiheuttavat mainitun psrA-geenin tai sen toiminnallisen homologin yli-ilmentymisen, ynnä vektorin, joka käsittää lisäksi Bacillus subtilis -peräisen psrA-geenin tai sen 30 toiminnallisen homologin sellaisten ekspressiosignaalien ohjauksessa, jotka aiheuttavat mainitun psrA-geenin tai sen toiminnallisen homologin yli-ilmentymisen.

Yhtenä lisäpuolenaan keksintömme sisältää vielä menetelmän kiinnostuksen kohteena olevan eksoproteiinin eri-35 tyksen edistämiseksi grampositiivisessa bakteerissa, jossa menetelmässä ilmennetään villin tyypin määriä suurempia 8 määriä Bacillus subtilis -peräistä PrsA-proteiinia tai sen toiminnallista homologia grampositiivisessa bakteerissa, jolla on myös kyky ilmentää villin tyypin määriä suurempia määriä eksoproteiinia.

5 Tässä kuvataan lisäksi menetelmän sellaisen paran netun grampositiivisen isäntäorganismin luomiseksi, joka on muu kuin Bacillus subtilis ja käyttökelpoinen kiinnostuksen kohteena olevan, isäntäorganismissa yli-ilmentyvän eksopro-teiinin tehostettuun eritykseen, joka menetelmä käsittää 10 a) Bacillus subtilis -peräisen PrsA-proteiinin toiminnallista homologia koodittavan geenin identifioinnin isäntäor-ganismista ja b) vaiheessa a identifioidun geenin ilmentymisen edistämisen vähintään yhdellä seuraavista keinoista: tuodaan isäntäorganismiin tämän geenin vähintään yksi lisä-15 kopio; tuodaan isäntäorganismiin tämä geeni, joka on operatiivisesti kytketty ekspressiosekvensseihin, jotka johtavat tämän geenin yli-ilmentymiseen.

Tässä kuvataan myös menetelmä Bacillus subtilis -peräisen PrsA-proteiinin toiminnallista homologia koodit-20 tavan geenin identifioimiseksi, joka menetelmä käsittää sellaisen DNA:n identifioinnin Southern blotting -menetelmällä, joka hybridisoituu Bacillus subtilis -peräisestä prsA-geenistä saatavien yhden tai useamman DNA-koettimen kanssa, ja sen osoittamisen, että geeni koodittaa proteii-25 nia, jolla on yli-ilmennettynä kyky parantaa grampositiivisen bakteerin erityskykyä kiinnostuksen kohteena olevan ek-soproteiinin erityksen suhteen.

Hakemuksessa kuvataan vielä lisäksi menetelmän Bacillus subtilis -peräisen PrsA-proteiinin toiminnallista 30 homologia koodittavan geenin identifioimiseksi, joka menetelmä käsittää sellaisen proteiinin identifioinnin, joka reagoi yhden tai useamman korkeatitterisen anti-PrsA-vasta-aineen kanssa, ja sen osoittamisen, että kun tätä proteiinia on läsnä suurempia kuin villin tyypin määriä gramposi-35 tiivisessa bakteerissa, proteiinilla on kyky parantaa tämän 9 grampositiivisen bakteerin erityskykyä kiinnostuksen kohteena olevan eksoproteiinin erityksen suhteen.

Keksinnön nämä ja muut piirteet, puolet ja edut ovat paremmin ymmärrettävissä tutustuttaessa seuraaviin ku-5 vaukseen, esimerkkeihin, menetelmiin ja materiaaleihin sekä liitteenä oleviin patenttivaatimuksiin.

Kuvaus

Kun kuljetettavan proteiinin ekspressiotaso (synteesi) on korkea grampositiivisissa bakteereissa, kuten Ba-10 cillus sp.:ssa, on erityskoneiston kapasiteetti rajoittava tekijä proteiinin erityksessä ja näiden proteiinien tuotannossa erittyvässä muodossa. Keksintömme tarjoaa käyttöön järjestelmän ja menetelmän tämän rajoituksen eli pullonkaulan voittamiseksi.

15 Keksintömme perustuu siihen aluksi tekemäämme yl lättävään havaintoon, että eritystä voidaan tehostaa grampositiivisissa bakteereissa, kuten Bacillus-lajeissa, suurentamalla vain Bacillus-bakteerien kuljetuskoneiston yhden komponentin määrää, ts. solun PrsA-proteiinin tai sen toi-20 minnallisten homologien määrää, grampositiivisissa bakteeri-isännissä, jotka ilmentävät villin tyyppiä määriä suurempia määriä kiinnostuksen kohteena olevia eksoproteiine-ja. Keksinnön mukainen menetelmä ja järjestelmä ovat käyttökelpoisia riippumatta siitä, miten kiinnostuksen kohteena 25 olevia proteiineja ylituotetaan grampositiivisessa bakteeri-isännässä. Siten tätä menetelmää ja järjestelmää voidaan käyttää erilaisten teollisissa sovelluksissa nykyisin käytettävien kaupallisten ylituotantokantojen parantamiseen.

Keksinnön mukaista menetelmää ja järjestelmää voi-30 daan käyttää minkä tahansa grampositiivisen bakteerin yhteydessä. Suvun Bacillus bakteerit ovat edullisia. Erityisen edullisia ovat Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloli-quefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus 35 licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subti-lis ja Bacillus thuringiensis.

10

Keksinnön mukaista menetelmää ja järjestelmää voidaan käyttää myös minkä tahansa halutun, kiinnostuksen kohteena olevan eksoproteiinin yhteydessä. Esimerkkejä kiinnostavista eksoproteiineista, joita voidaan tuottaa tämän 5 keksinnön menetelmän ja järjestelmän mukaisesti, annetaan seuraavassa luettelossa, jossa esitetään yleisten ryhmien kautta esimerkkejä eksoproteiineista.

Mikrobien ja alkueläinten antigeeniset proteiinit: Kapseli-, ulkokalvo- ja fimbriaproteiinit, jotka ovat pe-10 räisin mistä tahansa gramnegatiivisesta bakteerista, mutta erityisesti seuraavista: Bacteroides fragilis, Fusobacteri-um spp., Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae, Yersinia entercolitica, Yersinia pestis, Branhamella catarrha-lis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Vibrio chole-15 rae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B., Mybobacterium tyberculosis, Chlamydia trachomatis ja Shigella spp.

20 Proteiinitoksiinit tai erittyvät proteiinit, jotka ovat peräisin mistä tahansa bakteerista, mutta erityisesti seuraavista: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium spp., Escherichia coli, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Bordetella pertussis, Streptococcus pyogenes 25 -bakteerin M-proteiini, Streptococcus mutansin erittyvät entsyymit.

Minkä tahansa mikro-organismin pintaproteiinit, mutta erityisesti seuraavista mikro-organismeista (kaikissa kehitysvaiheissa) peräisin olevat: Plasmodium spp., Toxoplasma 30 spp., Leishmania spp., Schistosoma spp., Trypanosama spp., Streptococcus sp.:n adheesioproteiini ja Staphylococcus au-reusin adheesioproteiini.

Antigeeniproteiinit tai virukset: myksovirusten (influenssa A Hl - H12, influenssa B, influenssa C) HA- ja ΝΆ-35 proteiinit: paramyksovirusten (parainfluenssa 1 - 4, new- castlentautivirus, tuhkarokkovirus, hengitysteiden synkyti- aalivirus, sikotautivirus, penikkatautivirus) BN- ja F-pro-teiinit: rabiesviruksen G-proteiini; alfavirusten (Chikun- gunya, Western, Easter, Venetsuelan hevosenkefaliittivirus, 0'nyong-nyong-virus, Semliki Forest -virus, Sindbis-virus); 5· flaviinivirusten (Denque 1-4, Japanin enkefaliittivirus, puutiaisaivokuumevirukset, Murray Valley -enkefaliittivirus, Kyasanur Forest -tautivirus, lampaan keskushermosto-tautivirus, Omskin verenvuotokuumevirus) VI- ja V3-prote-iinit; vihurirokkoviruksen pintaproteiinit; sikaruttoviruk-10 sen pintaproteiinit; hevosen artriittiviruksen pintaproteiinit; Bunya-virusten (Rift Valley -kuumevirus, Krimin verenvuotokuumevirus, Kalifornian enkefaliittivirus, Phlebo-tomus-kuumevirus) Gl- ja G2-proteiinit; arenavirusten (Las-sa-kuumevirus, lymfosyyttinen koriomeningiitti -virus) Gl-15 ja G2-proteiinit; pikornavirusten (polio 1-3, koksakkia A -virukset 1 - 24; koksakkia B -virukset 1 - 6; ECHO-virukset 1 ~ 8 ja 11 - 34, hepatiitti A -virus, hepatiitti B -virus, hepatiitti C -virus, ihmisen nuhavirukset 1 - 113) proteiinit VI - V4; rotavirusten pintaproteiinit, herpesvi-20 rusten (HSV 1 ja 2, sytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, hevosen luomatautivirus) pintaproteiinit; papovavirusten {BK-virus, ihmisen syylävirus) VP3-proteiinit; parvovirus-ten (minkin enteriittivirus, naudan parvovirus, kissan parvovirus, sian parvovirus) p-proteiinit; ihmisen hepatiitti 25 B -viruksen rakenneproteiinit; Ebola- ja Marburg-virusten pintaproteiinit; adenovirusten (ihmisen adenovirukset 1 - 33) heksoni-, pentoni- ja kuituproteiinit.

Teolliset entsyymit: Teollisesti tärkeät entsyymit voivat olla amylolyyttisiä, lipolyyttisiä ja proteolyytti-30 siä entsyymejä, karbohydraaseja, transferaaseja, isome- raaseja, peroksidaaseja, oksidoreduktaaseja, oksidaaseja jne. Tarkemmin määriteltynä kiinnostuksen kohteena oleva entsyymi voi olla proteaasi, lipaasi, kutinaasi, amylaasi, galak-tosidaasi, pullulanaasi, sellulaasi, glukoosi-isomeraasi, 35 proteiinidisulfidi-isomeraasi, CGT-aasi (syklodekstriini- glukonotransferääsi), fytaasi, glukoosioksidaasi, glukosyyli- 12 transferaasi, laksaasi, bilirubiinioksidaasi tai ksylanaasi. Esimerkkeihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta alfa-amylaasi, aminohappoasylaasi, amyloglukosidaasi, bromelaiini, fisiini, beeta-galaktosidaasi, beeta-glukanaasi, 5 glukoosi-isomeraasi, glukoosioksidaasi, hemisellulaasi, in- vertaasi, katalaasi, kollagenaasi, ksylanaasi, laktaasi, li-paasi, naringinaasi, pankreatiini, papaiini, pektinaasi, pe-nisilliiniamidaasi, pepsiini, proteaasi, pullulanaasi, isoamy-laasi, renniini, ribonukleaasi, sellulaasi, streptokinaasi 10 ja trypsiini.

Myös lääketieteellisesti kiintoisia eksoproteiineja voidaan tuottaa. Mainitunlaisiin proteiineihin kuuluvat diagnostiset antigeenit, proteiinit, joita voidaan käyttää rokotteina, ja lääkeaineet.

15 Kiinnostuksen kohteena olevien eksoproteiinien ei keksinnön mukaisesti tarvitse olla luontaisia eksoproteiineja, vaan ne voivat olla uudenlaisia proteiineja, jotka on suunniteltu ja tehty eksoproteiineiksi käyttämällä geeniteknisiä menetelmiä. Jonkin lajin normaalisti erittymätön 20 proteiini (tai konstruoitu ei-luontainen proteiini) voidaan käsitellä "eksoproteiiniksi" lisäämällä rakenneproteiinia koodittavaan sekvenssiin signaalisekvenssi. Tätä käsiteltyä eksoproteiinia voidaan ilmentää grampositiivisessa bakteerissa, kuten Bacillus-lajissa, joka yli-ilmentää PrsA-pro-25 teiinia tai sen toiminnallista homologia. Tällä tavalla keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää edistämään näiden kiinnostavien ei-luontaisten tai konstruoitujen proteiinien eritystä.

Siirrymme nyt keksintömme eri puolten pariin ja 30 keksintömme yhden suoritusmuodon valaisemiseksi esitämme, millainen vaikutus Bacillus subtilis -peräisen prsA-geenin yli-ilmentymisellä on kahden tärkeän teollisen Bacillus-eksoentsyymin, alfa-amylaasin ja subtilisiinin, eritykseen. Näiden tutkimusten yhteydessä kloonattiin 5,3 ke:n (ki~ 35 loemäksen} kokoinen insertti, joka sisälsi Bacillus subtiilein koko prsA-geenin, kopioluvultaan alhaiseen sukkula- 13 plasmidiin (pKTH277), jota käytettiin sitten prsA-lisäko-pioiden viemiseen Bacillus suhtilisiin, (Bacillus subtiilein pzsA-geenin DNA- ja päätellyt aminohapposekvenssit löytyvät EMBL/GenBank/DDBJ Nucleotide Sequence Data Librarie-5 sistä tulonumerolla X57271.) [pKTH277 saatiin ligatoimalla pKTH2 68:sta peräisin oleva 5,3 ke: n EcoRI-BamHI-fragmentti kopioluvultaan alhaiseen sukkulaplasmidiin pHP13, joka oli avattu pilkkomalla vastaavilla restriktioentsyymeillä, ja transformoimalla E. coli -kanta TG1. pKTH268:n ja pKTH277:n 10 koot ovat 8,5 ke ja vastaavasti 10,2 ke. Katso myös Kontinen, V. P. et ai., Mol. Microbiol. 5 (1991) 1273 - 1283, joka mainitaan tässä viitteenä.] pKTH277:n läsnäolo B. subtiileissa suurensi PrsA-proteiinia vastaavan proteiinin määrän noin 10-kertaiseksi villiin tyyppiin nähden. Kun eri-15 laisia erittyviä proteiineja vastaavat geenit ilmentyvät Bacillus-kannoissa, jotka sisältävät näitä kohotettuja PrsA-proteiinipitoisuuksia, kohoaa kasvualustaan erittyvän proteiinin määrä olennaisesti. Bacillus amyloliquefaciensin alfa-amylaasierityksen havaittiin esimerkiksi kasvavan 20 2,5-kertaiseksi tässä järjestelmässä, Bacillus lichenifor- misin lämmönkestävän alfa-amylaasin erittymistaso kasvoi kuusinkertaiseksi, ja Bacillus licheniformisista erittyi sub-tilisiinia (alkalinen proteaasi) kaksinkertainen määrä ver-tailutasoon nähden.

25 Näissä tutkimuksissa eksoentsyymejä yli-ilmennet- tiin isäntäkannoissa määriä, jotka kyllästävät todennäköisesti erityskoneiston, joko sijoittamalla eksoproteiinia koodattava geeni monikopioiseen plasmidiin tai insertoimalla se isännän kromosomiin. [Näissä tutkimuksissa kaikki ekso-30 entsyymejä koodittavat monikopioiset plasmidit oli johdettu pUB 110:stä, joka kuuluu eri inkompabiliteettiryhmään kuin sukkulaplasmidi pKTH277, mikä mahdollistaa niiden replikaa-tion samassa isäntäsolussa. Näiden plasmidien stabiiliutta parannettiin useimmissa tapauksissa edelleen käyttämällä 35 rec£4-isäntäkantaa, mikä estää tehokkaan rekombinaation ho- 14 mologisten sekvenssien välillä (Dubnau et ai., 1973; Keg-gins et ai., 1978)].

Ensimmäinen eksoentsyymi, jota tutkittiin keksintömme tämän puolen valaisemiseksi, oli Bacillus amyl oii-5 quefaciensin alfa-amylaasi (AmyE), jota koodittaa pKTHlO [Palva, I., Gene 19 (1982a) 81 - 87; Palva, I. et al.f Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982b) 5582 - 5586]. Havaitsimme, että tätä alfa-amylaasia ylituottavassa villin tyypin kannassa pKTH277:n läsnäolo todella lisäsi alfa-amy-10 laasin eritystä koko stationaarisen kasvuvaiheen ajan, noin 2,5 - 3 -kertaiseksi verrattuna PrsA:ta yli-ilmentämät- tömään vertailukantaan. Suurin alfa-amylaasipitoisuus viljelmän supernatantissa (noin 3400 pg/ml) havaittiin 24 tuntia kestäneen kasvun jälkeen. pKTH277;n poissa ollessa tämä 15 kanta eritti vain 1200 pg/ml. Kvalitatiivisesti samankaltaisia tuloksia saatiin ilmennettäessä alfa-amylaasia yhdestä amy£-geenikopiosta käsin, joka insertoitiin kromosomiin ja tuli voimakkaasti transkriboiduksi muunnetun säätelyn ansiosta.

20 Toinen testaamamme eksoproteiini oli B. lichenifor- misin lämmönkestävä alfa-amylaasi (AmyL), teollisesti tärkein nesteyttävä alfa-amylaasi [Ortlepp et ai., 1983; Dide-richsen, B. et al.f Res. Microbiol. 142 (1991) 793 - 796]. Tämän entsyymin erittyminen B. subtilisissa määrinä, jotka 25 ovat vertailukelpoisia B. amyloliquefaciensin erittämiin alfa-amylaasimääriin, saavutettiin saattamalla asianomainen geeni ilmentymään viimeksi mainitun entsyymin geenin promoottori- ja signaalisekvenssiin perustuvasta ekspressio-vektorista käsin [Palva, I., Gene 19 (1982) 81 - 87; Palva, 30 I. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982) 5582 - 5586; Sibakov. M., Eur. J. Biochem. IsS (1986) 577 - 581].

pKTH277:n tuominen yhteen mainitunlaiseen kantaan (jolloin tuloksena oli IH6760) suurensi alfa-amylaasin määrän kasvualustassa noin kuusinkertaiseksi, ja sama ero havaittiin 35 myöhäisestä eksponentiaalisesta vaiheesta 45 tunnin ikäisiin viljelmiin asti.

15

Alkalinen proteaasi subtilisiini on erityyppinen eksoproteiini, jonka esiaste sisältää signaalisekvenssin lisäksi toisen jatkeen, prosekvenssin [Wells et ai., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911 - 7925; Wong, S.-L. et ai., 5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1884 - 11188]. Suurennetun PrsA-määrän vaikutusta tähän eritykseen tutkittiin vertaamalla kahta kantaa, joista toisessa (IH6789) PrsA-taso oli kohotettu ja toisessa vallitsi villin tyypin taso. Molemmat erittivät B. licheniformisin heterologista subti-10 lisiinia (SubC:tä, jota käytetään pesujauheena ja tärkeä teollinen tuote), jota koodittaa monikopioinen plasmidi pMJ57 (Hastrup, S. ja Jacobs, M. F. teoksessa Lethal phenotype conferred by xylose-induced overproduction of apr-lacZ fusion protein, vol. 3, toim. Zukowski, M. M. et al., Aca-15 demic Press, Inc., San Diego, Kalifornia 1990, s. 33 - 41).

Tässä plasmidissa subC-geeni on ksyloosilla indusoitavissa olevan promoottorin ohjauksessa. Verrattaessa näiden kahden kannan subtilisiinin eritystä täysin indusoituina havaittiin, että sen määrä IH6789:n (suurennettu määrä PrsA:ta) 20 viljelmäsupernatantissa oli noin kaksi kertaa korkeampi kuin IH6788-vertailunäytteessä kaikkina tutkittuina ajankohtina .

Olemme myös tutkineet pKTH277:n vaikutusta endo-geenisten eksoentsyymien luonnostaan alhaiseen eritystasoon 25 kannassa, jossa ei ole mitään ylieritystä aiheuttavaa plas-midia. Erittyvän alfa-amylaasin määrä ja proteaasien kokonaismäärä myöhäisessä eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa tai yön yli kasvatetuissa viljelmissä oli sama pKTH277:n ja kloonausvektorin pHP13 sisältävissä kannoissa. Näiden tu- 30 losten perusteella näyttää siltä, että suurennettu PrsA-proteiinimäärä edistää ainoastaan ylituotettujen eksoent syymien eritystä.

Jotta saataisiin varmistetuksi PrsA:n rooli 5,3 ke:n fragmentin edellä mainituissa plasmideissa aiheuttamassa 35 tehostumisessa, inaktivoimme psrA-geenin plasmidissa pKTH277 tekemällä insertioita sen prsA-geenin BcoRV-kohtaan (nukle- 16 otidin 382 kohdalla). pKTH3261:ssä insertti oli B. licheniformisin blaP-geenin 560 ep:n (emäsparin) fragmentti, jota reunustivat translaation lopetuskodonit, ja pKTH3262:ssa lambdafaagin 4,6 ke:n EcoRI-fragmentti. Näitä 5 plasmideja sisältävän E. colin solujen kokonaisproteiinien SDS-PAGE-analyysi ei osoittanut kummankaan plasmidin ilmen-tämää täysikokoista PrsA-proteiinia, ja siinä näkyi kooltaan odotettu (14 kDa), pKTH3261:n ilmentämä oletettavasti lyhentynyt PrsA (tuloksia ei esitetä). Vertailua varten 10 konstruoimme pKTH3253:n, jossa 5,3 ke:n fragmenttia lyhennettiin 1,9 ke:n verran prsA:n jäljestä, jolloin tämä geeni jäi koskemattomaksi. B. subtilisissa (IH6624, joka sisältää pKTH10:n) nämä kaksi plasmidia, joissa oli insertti prsA:ssa, eivät edistäneet alfa-amylaasin eritystä, kun taas pKTH3253 15 edisti.

prsA:n ylituotannolla aikaansaadusta tehostuneesta erityksestä on ilmeistä etua eksoentsyymien laajamittaisen teollisen tuotannon kannalta. Mainitunlaisissa sovelluksissa on joskus toivottavaa välttää mahdollisesti epästabiili-20 en monikopioisten plasmidien käyttöä. Yksi strategia on yhden tai muutaman eksoentsyymirakennegeenikopion sijoittaminen kromosomiin yhdistettynä sen säätelyelementtien muuntamiseen ilmentymisen lisäämiseksi. Siksi testasimme PrsA:n ylituotannon vaikutusta alfa-amylaasin eritykseen mainitun-25 laisessa järjestelmässä, jossa oli yksi amyE-kopio inser- toituna kromosomiin, joka oli fuusioitu kohteena olevaan säätelyproteiinin DegQ sekvenssiin DegQ:ta yli-ilmentävässä kannassa (A. Palva, henkilökohtainen tiedonanto). Myös tässä kannassa PrsA-proteiinin määrän lisääminen kohotti alfa-30 amylaasin korkean eritystason noin kolminkertaiseksi (tau lukko 1, kannat BrB764 ja IH67703). Tämä osoittaa, että erityksen tehostuminen saavutetaan eksoproteiinin ilmentymisen lähtötason ollessa korkea riippumatta tavasta, jolla kohteena olevan geenin lisääntynyt ilmentyminen on saatu 35 aikaan.

17

Siirtyäksemme nyt PrsA:n läsnäoloon muissa grampo-sitiivisissa bakteereissa kuin Bacillus suttuisissa, olemme vahvistaneet PrsA:n tai PrsA-homologien läsnäolon muissa lajeissa, esimerkiksi Bacillus amyloliquefaciensissa ja Ba-5 cillus licheniformisissa. PrsA-proteiinin määrä Bacillus amyloliquefaciensissa on samanlainen ja määrä Bacillus sub-tilis -soluissa, kun taas PrsA-proteiinin määrä Bacillus licheniformisissa näyttää olevan pienempi. Lisäksi eritys-koneiston komponentit ovat näissä grampositiivisissa Bacil-10 lus-kannoissa samanlaiset kuin Bacillus suttuisissa, Bacillus amyloliquefaciens ja Bacillus licheniformis ovat kaksi laajamittaisissa teollisissa prosesseissa erittyvien proteaasien ja amylaasien valmistamiseksi eniten käytettyä Bacillus-lajia. Keksinnön mukainen menetelmä, jossa käyte-15 tään PrsA-proteiinin ylituotantoa lisäämään kiinnostuksen kohteena olevien homologisten ja heterologisten eksoprote-iinien eritystä, on erityisen käyttökelpoinen näiden kantojen yhteydessä.

Kuvaamme myös, miten PrsA-proteiini ja/tai prsA-20 geeni voidaan identifioida muista grampositiivisista bakteereista ja että Bacillus suttilis -peräisen PrsA-proteiinin toiminnallisia homologeja on olemassa ja niitä voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä ja järjestelmässä. Bacillus suttilis -peräisen PrsA-proteiinin 25 toiminnallisia homologeja voidaan identifioida muista grampositiivisista lajeista käyttämällä korkeatitteristä anti-PrsA-vasta-ainetta. Vaihtoehtoisesti prsA-geeni tai homologisia prsA:n kaltaisia geenejä, jotka koodattavat Bacillus suttilis -peräisen PrsA-proteiinin toiminnallisia homologe-30 ja, voidaan identifioida Southern blotting -menetelmällä käyttämällä prsA-geenistä tai prsA-geenifragmentista saatuja yhtä tai useampaa koetinta. Jos PrsA:n kaltaisen proteiinin havaitaan olevan olemassa, mutta homologia on riittämätön prsA-geenille tai PrsA-proteiinille, joka on määrä 35 detektoida yksiselitteisesti PrsA-proteiinille spesifisillä vasta-aineilla tai prsA-geenille homologisia sekvenssejä 18 sisältävillä DNA-koettimilla, voidaan homologinen geeni paikallistaa ja kloonata, niin että voidaan tehdä yksiselitteinen identifiointi.

Useimmiten voidaan kuitenkin löytää homologisia pro-5 teiineja ja geenejä käyttämällä PrsA-proteiinille spesifisiä vasta-aineita tai prsA-geenille homologisia sekvenssejä sisältäviä DNA-koettimia. Immunologisen identifioinnin tekemiseksi voidaan käyttää immuunitäplämenetelmää (Western blotting) PrsA-proteiinin detektoimiseksi korkeatitterisen 10 anti-PrsA-vasta-aineen avulla. Antiseerumia tuotetaan immunisoimalla sopiva eläin (esimerkiksi kaniini} B. subtiilein PrsA-proteiinilla tai edullisesti jonkin sellaisen lajin PrsÄ-proteiinihomologilla, joka on lähempää sukua kiinnostuksen kohteena olevalle lajille kuin B. subtilis. 15 PrsA:n identifiomiseksi kiinnostuksen kohteena olevaa bakteeria voidaan kasvattaa joukolla kasvualustoja, mutta edullisesti bakteeria kasvatetaan alustalla, jolla proteaasien induktio on hyvin vähäistä. Bakteerisolut otetaan talteen, jälleen edullisesti kasvuvaiheessa, jossa on läsnä hyvin 20 vähän proteaasejs, ja rikotaan lajille sopivalla menetelmällä (tavallisesti yhdistämällä entsymaattinen käsittely ja mekaaninen rikkominen ääni käsittelyn, French-painekennon tai lasihelmihierron avulla). Erikokoisia rikottuja soluja ja rikottujen kokosolujen hiukkasfraktiota sisältäviä näyt-25 teitä, joka on valmistettu ultrasentrifugoimalla, käsitellään elektroforeettisesti SDS-PAGE:ssa tavanomaisin menetelmin, siirretään proteiinit kalvosuodattimille ja detek-toidaan ne anti-PrsA-antiseerumin ja leimatun toisen vasta-aineen avulla. (Pienempiä PrsA-proteiinimääriä voidaan de-30 tektoida, jos valmistetaan hiukkasfraktio.) Kaikissa näissä vaiheissa voidaan käyttää tavanomaisia menetelmiä ja kaupallisia reagensseja.

prsA-qeenin tai PrsA:n toiminnallista homologia kiinnostuksen kohteena olevassa lajissa koodittavan prsA:n 35 kaltaisen geenin identifiointiin voidaan käyttää Southern blotting -menetelmää. Tässä menetelmässä hybridisoidaan 19 prsA-geenistä saatuja sopivia DNA-koettimia kiinnostuksen kohteena olevan lajin sopivasti fragmentoidun ja elektrofo-reettisesti käsitellyn kromosomi-DNA:n kanssa noudattamalla tavanomaista Southern-hybridisaatiomenetelmää. Bybridisaa-5 tiokoetin voi olla mikä tahansa DNA-fragmentti, joka sisältää B. subtilisin prsA-geenin tai tämän geenin fragmentin, tai DNA-fragmentti, joka sisältää jonkin toisen lajin prsA-geenihomologin tai kyseisen geenin fragmentin. Kun prsA-geenihomologi on identifioitu, se voidaan sekvensoida in-10 dentiteetin lisävarmistuksen saamiseksi.

Tämä keksintö ei sisällä pelkästään Bacillus subtilisin PrsA-proteiinin yli-ilmentämistä vaan myös Bacillus subtilisin PrsA-proteiinin toiminnallisen homologin yli-il-mentämisen kiinnostuksen kohteena olevassa grampositiivi-15 sessa lajissa. Tämän keksinnön mukaisesti joko B. subtilisin prsA-geeni tai jostakin toisesta lajista, isäntälaji mukaan luettuna, peräisin oleva prsA-geenihomologi tuodaan isäntälajiin. prsA-geeni tai sen homologi saatetaan sellaisten ekspressiosignaalien ohjaukseen, jotka ovat aktii-20 visia kiinnostuksen kohteena olevassa lajissa, jotta tuloksena on prsA-geenin korkea (mutta ei letaalinen) ekspres-siotaso. Tämä voidaan tehdä eri tavoin, mukaan luettuina seuraavat: (1) Plasmidin pKTH277 siirtäminen kiinnostuksen 25 kohteena olevaan lajiin. Siirto voi tapahtua millä tahansa kyseiselle lajille käyttökelpoisella transformointimenetel-mällä, kuten transformaation, transduktion, protoplasti-transformaation, elektroporaation tai konjugaation kautta. pKTH277 säilyy monikopioisena plasmidina monissa muissa 30 grampositiivisissa lajeissa kuin Bacillus-lajeissa, ja tässä plasmidissa olevat prsA-geenin ekspressiosignaalit ovat aktiivisia monissa grampositiivisissa lajeissa.

(2) pKTH277:n 5,3 ke: n Sacl-fragmentin insertointi mihin tahansa muuhun plasmidiin, joka on yhteensopiva kiin- 35 nostuksen kohteena olevan lajin kanssa, ja pidetään sitä yllä kopioluvultaan sopivana prsAm korkean muttei letaali- 20 sen ekspressiotason aikaansaamiseksi suhteessa B. suttuisin prsA-geenin aktiivisuuteen kyseisessä lajissa. Plasmidi siirretään sitten kyseiseen lajiin käyttämällä mitä tahansa kyseiselle lajille käyttökelpoista transformointimenetel-5 mää. Plasmidiin insertoitu DNA-fragmentti voi vaihtoehtoisesti sisältää jonkin toisen lajin prsA-geenihomologin eks-pressiosignaaleineen.

(3) PrsA-proteiinin signaalisekvenssiä ja valmista osaa koodittavan pKTH277-DNA-fragmentin insertointi kiin-10 nostuksen kohteena olevalle lajille soveltuvaan ekspres-siovektoriin kyseisen plasmidin ekspressiosignaalien ohjauksen alaiseksi prsA:n korkean ekspressiotason saavuttamiseksi. Kuten edellä, sopiva fragmentti voi olla peräisin jonkin toisen lajin prsA-geenihomologista.

15 (4) Edellä olevien kohtien 2 ja 3 mukaiset DNA- rakenteet voidaan insertoida kiinnostuksen kohteena olevan lajin kromosomiin plasmidin sijasta. Tässä tapauksessa on valittava ekspressiosignaaleja, jotka ovat kyllin aktiivisia PrsA:n korkean ekspressiotason takaamiseksi, vaikka 20 geenikopioita on vain yksi genomia kohden.

Tutkijoina, jotka ovat myös perustutkijoina, olemme tehneet suuren osan työstämme tarkoituksella ja välttämättömyyden pakosta laboratorio- tai simuloiduissa teollisuus-olosuhteissa. Teollisuudessa toimivien työtovereiden avulla 25 on kuitenkin osoitettu, että keksintömme mukainen menetelmä ja järjestelmä toimivat erittäin hyvin kaupallisesti käyttökelpoisten bakteerikantojen yhteydessä teollisissa fer-mentointiolosuhteissa.

Seuraavassa esitetään tutkirnuksissamme käytettyjä 30 menetelmiä ja materiaaleja ja esimerkkejä keksinnöstämme lisäavuksi ammattimiehille keksintömme mukaisen menetelmän ja järjestelmän toteuttamisessa.

Materiaalit ja menetelmät

Bakteerikannat ja plasmidit 35 Bacillus subtilis Marburg 168:n prs-mutantteja ja niiden lähtökantoja esitetään taulukossa 1. B. subtilis ja 21 E. coli -kantoja, jotka yli-ilmentävät PrsA-Bia, ja B, sub-tills -kantoja, joilla eksoentsyymien eritys on tehostunutta solun suurentuneen PrsA-proteiinimäärän ansiosta, sekä niiden asianmukainen vertailukanta luetellaan myös. E. coli 5 -kannat, joita käytettiin kloonausisäntinä plasmidivektori-en yhteydessä, olivat HB101, TG1 ja DHScc (Sambrook, J. et ai., Molecular cloning. A laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), ja lambdan yhteydessä käytettiin Kw25 l:tä (Promega, 10 Madison, Wisconsin).

pHP!3:a [Haima, P. et al., Mol. Gen. Genet. 209 (1987) 335 - 342], pJHlOlrtä [Ferrari, F. A. et al., J.

Bacterid. 154 (1983) 1513 - 1515]m pGEM3zzf(+):aa {Prome ga) ja pDR540:ä (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) käytettiin 15 kloonausvektoreina prsA-geenille ja sen fragmenteille. Näi den plasmidivektoreiden ja konstruoitujen johdannaisplasmi-dien ominaisuudet, joissa plasmideissa on 5,3 ke:n (pKTH277 ja pKTH2 68) tai 3,4 ke:n (pKTH3253) insertin sisältävä prsÄ-geeni, esitetään taulukossa 2. pKTH3253:ssa oleva 20 prsA-geeni katkaistiin insertoimalla fragmentti joko B.

licheniformisin blaP-geenistä (0,5 ke) tai bakteriofagi lambdan genomista (4,6 ke) prsA:n ORF:ssä olevaan ainutkertaiseen PcoRV-kohtaan (saadut plasmidit olivat pKTH3261 ja ΡΚΤΗ3262). pKTHlO [Palva, I., Gene 19 (1982a) 81 - 87; Pal-25 va, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982b) 5582 - 5586] ja pMJ57 (Hastrup, S. ja Jacobs, M. F. teoksessa Lethal phenotype conferred by xylose-induced overpro duction of apr-lacZ fusion protein, vol. 3, toim. Zukowski, M. M. et al., Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornia 30 1990, s. 33 - 41) ovat monikopioisia plasmideja, jotka tuottavat suuria määriä B. amyloliquefaciensin alfa-amylaasia (AmyE) ja vastaavasti B. licheniformisin subtili-siinia (SubC), jotka erittyvät ulkopuoliseen alustaan. pKTH1582 on konstruoitu kloonaamalla B. lieheniformisista 35 peräisin oleva AmyL-geeni B. subtilisin eritysvektorijär-jestelmään [BRB360 julkaisussa Sibakov. M., Eur. J.

22

Biochem. IsS {1986) 577 - 581; Palva, I., Gene 19 (1982a) 81 - 87; Palva, I. et al.f Proc, Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982b) 5582 - 5586].

Kasvualusta ja viljelyolosuhteet 5 Bakteereja kasvatettiin muunnetussa L-liemessä (1 % tryptonia, 0,5 % hiivauutetta, 0,5 % NaCl:a) ravistellen lämpötilassa 37 °C tai L-maljoilla, jotka sisälsivät 1,5 % agaria (Difco, Detroit, Michigan) ja asianmukaisia antibiootteja, lämpötilassa 37 °C [Kontinen, V. P. et ai., Mol. 10 Microbiol. 5 (1991) 1273 - 1283]; maljoja muunnettiin sel laisten kantojen ollessa kyseessä, jotka yli-ilmensivät al-fa-amylaasia (5 % tärkkelystä ja 2,5 % agaria) ja subtili-siinia (0,2 % ksyloosia ja 1 % maitojauhetta). L-lientä täydennettiin 2 %:lla liukoista tärkkelystä (Merck, Darmstadt, 15 Saksa) tai käytettiin kaksinkertaiseen väkevyyteen konsentroituna alustana eksoentsyymien tuotannon yhteydessä. Sub-tilisiinia tuottavia kantoja kasvatettiin L-maljoilla, jotka sisälsivät 1 % maitojauhetta. Eksoentsyymien tuotantoa tutkittiin kaksinkertaiseen väkevyyteen konsentroidussa L-lie-20 messä voimakkaasti ravistellen. Osoituksena kasvusta oli viljelmän sameus mitattuna Klett-Summerson-kolorimetrillä (Klett Manufacturing Co., Inc., N.Y.) käyttämällä suodatinta nro 66.

Entsyymimääritykset 25 Alfa-amylaasi määritettiin käyttämällä Phadebas-tab- letteja (Pharmacia) tavalla, jota kuvataan julkaisussa Kontinen, V. P. ja Sarvas, M., J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 2333 - 2344. Maljamäärityksen yhteydessä bakteereista tehtiin sivelyviljelmä L-maljalle, joka sisälsi 5 % tärkkelys-30 tä, ja mitattiin pesäkkeiden ympärillä oleva kehä, kun maljoja oli inkuboitu lämpötilassa 4 °C. Endogeenista alfa-amylaasia tuottavien villin tyypin pesäkkeiden ympärillä ei tyypillisesti ollut vyöhykettä, kun taas pKTH10:ä sisältävien kantojen ympärillä oleva vyöhyke oli yli 2 mm maljojen 35 iästä riippuen. B. licheniformisin subtilisiini ja kromo-somaalisesti kooditetut proteaasit määritettiin 1 ml:ssa 23 liuosta, joka sisälsi 0,1 mol/1 Trisiä ja 0,01 mol/1 CaCl2’.a (pH 8,0), käyttämällä kromogeenista peptidisubst-raattia, sukkinyyli-Ala-0000000000Ala-Pro-Phe-p-nitroanili-dia (Del Mar, E. G. et ai., Anal. Biochem. 99 (1979) 5 316 ~ 320]. Hydrolyysinopeus mitattiin Hewlett Packard -di- odiryhmäspektrofotometrillä aallonpituudella 410 nm. Alfa-amylaasin ja subtilisiinin ominaisaktiivisuuksien määrittämiseksi arvioitiin niiden määrä viljelmäsupernatanttinäyt-teessä joko tavalla, jota kuvataan julkaisussa Kontinen, V. 10 P. ja Sarvas, M., J. Gen. Microbiol. 134 (1988) 2333 - 2344, tai käyttämällä Coomassie Bluella värjättyä SDS-PAGE:a. Entsyymimäärät ilmoitettiin mikrogrammoina millilitraa kohden (pg/ml).

15 Taulukko 1

Bakteerikannat

Kanta Merkitsevä genotyyppi ja Lähtökanta, lähde ominaisuudet tai viite 20 B. subtilis IH6064 metB5 sacA321 Sibakov et ai.

1983 IH6090 his metBS sac321 IH6064 IH6157 IH6090 (pKTHIO) IH6090 25 IH6160 IH6064 (pKTHIO) IH6064 IH6480 prs-3 metBS sacA321 (pKTHIO) IH6157 IH8482 prs-29 metBS sacA321 (pKTHIO) IH6157 IH6483 prs-33 metBS sacA321 (pKTHIO) IH6157 IH6484 prs-40 metBS sacA321 (pKTHIO) IH6157 30 IH6485 prs-3 metBS sacA321 IH6480 IH6487 prs-40 metBS sacA321 IH6484 IH6489 prs-11 metB5 sacA321 (pKTHIO) IH6160 IH6491 prs-13 metBS sacA321 (pKTHIO) IH6160 IH6494 prs-33 metBS sacA321 IH6483 35 IH6497 prs-26 metBS sacA321 (pKTHIO) IH6157 IH6498 prs-13 metBS sacA321 IH6491 IH6501 prs-26 metBS sacA321 IH6497 24 IH6504 prs-11 metB5 sacA321 IH6489 IH6513 QB917 (pKTHIO) QB917 IH6521 prs-13 hisAl trpC2 (pKTHIO) IH6513 IH6523 prs~ll metBS SacA321 (pKTHIO) IH6513 5 IH6622 IH6624 (pKTH277) XH6624 IH6623 ΪΗ6624 (pHP13) IH6624

IH6624 PSLI (pKTHIO) PSLI

IH6654 prs~29 metBS sacA321 IH6482

IH6752 PSLI (pMJ57) PSLI

10 IH6755 PSLI (pHPl3) PSLI

IH6757 PSLI (pKTH1582) PSLI

IH6759 IH6755 (pHP13) IH6755 IH6760 IH6757 (pKTH277) IH6757 IH6770 BRB764 (pKTH277) BRB764 15 IH6774 IH6160 (pKTH277) IH6160 IH6788 IH6752 (pKTH3229) IH6752 IH6789 IH6752 (pKTH3230) IH6752

PSLI arg (611)15, leuA8, rm-, recE4, IA510 BGSC:ssS

stpf thrA

20 QB917 hisAl thr-5 trpC2 IA10 BGSC:ssa BRB7 64 : : φ {' PsubE'-amyE) (pKTH1743) A. Palva,

Helsingin yliopisto IH6559 prsA29, recE4, trpC2 Kontinen et ai., 25 (: :ρΚΤΗ1601) 1991 IH6799 IH6064 (::pKTH3200) IH6064 IH6811 IH6624 (pKTH3253) IH6624 IH6812 IH6624 (pKTH3261) IH6624 IH6813 IH6624 (pKTH3262) IH6624 30 E. coli

EH1568 HBIOI (pKTH268) HBIOI

EH1581 DH5aI (pKTH3101) DH5a

EH1631 TGI (pKTH3180) TGI

35 EH1639 TGI (pGEM3zf(+}) TGI

EH1640 TGI (pDR540) TGI

25

EH1674 TGI (pKTH277) TGI

EH1675 TGI (pKTH3253) TGI

EH1678 TGI (pKTH3261) TGI

EH1679 TGI (pKTH3262) TGI

5 1) pKTH1743 on pUBHO-johdannainen, joka sisältää 0,3 ke:n insertin, jossa on ORF B. subtilisin decp-geeniä varten.

2) The Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Ohio 10

Taulukko 2 Plasmidit

Johdannaisen kanta-

Plasmidin Kloonatut geenit ja plasmid! 15 numero resistenssimarkkerit (lähde ja/tai viite) pKTHlO amyE neo pUBHO (Palva 1982;

Gryczan et ai. 1978) pKTH268 prsÄ bla pGEM3zf(+) (Promega; 20 Sambrook et ai. 1989) pKTH277 prsA cat ermC pHP13 (Haima et ai.

1987} pKTHl582 amyL neo pUBHO (I. Palva;

Sibakov 1986) 25 pKTH1743 degQ neo pUBHO (A. Palva) pKTH1876 bla cat neo pAMBI (M. Simonen;

Leblanc ja Lee 1984) pKTH3101 rprsA bla pKTH268 pKTH3180 Ο/Ptac-'prsA bla pDR540 (Pharmacia) 30 pKTH3229 ermC pHP13 pKTH3230 prsA ermC pKTH3229 pKTH3253 prsA cat ermC pHP13 pKTH3261 0,5 ke:n insertti pKTH3253

prsA:ssa cat ermC

35 pKTH3262 4,5 ke:n insertti pKTH3253

prsA: ssa cat ermC

pJHlOl bla cat tet (Ferrari et ai. 1983) 26 pMJ57 0/Pxyn-'suJbC cat pUBHO (Hastrup ja

Jacobs 1990)

Esimerkit 5 Esimerkki 1

Al£a-amylaasin erityksen edistäminen B. subtiileissa. PrsA-proteiinin määrän ollessa suurennettu

Seuraava taulukko (taulukko 3) valaisee a-amylaa-sin erityksen tehostumista Bacillus subtiileissa erilai-10 sissa olosuhteissa, kun grampositiivinen isäntäbakteeri yli-ilmentää myös PrsA-proteiinia,

Taulukko 3 ot-amylaasin erityksen edistäminen B. suttuisissa PrsA-pro- 15 teiinin yli-ilmentymisen kautta

Kannan a-amylaasia il- Plasmidi-PrsA:n a-amy- nro mentävän geenin iImentyrnislähde laasin sijainti Plasmi- PrsA-geeni eritys din nro plasmidissa (pg/ml)c) 20 - IH6169 Monikopioinen --- 1 000 IH6774 plasmidi31 pKTH277 Intakti 3 100 BRB764 Kromosomib) --- 630 25 IH6779 pKTH277 Intakti 2 000 IH6811 Monikopioinen pKTH3253 Intakti 3 700 IH6812 plasmidia) pKTH3261 Katkaistu 1 300 IH6813 pKTH3262 Katkaistu 1 400 30

a) pKTHlO, jossa on B. amyloliquefaciensin amyE

b) Yksi amyE aktiivisuudeltaan kohotetun promoottorin ohjauksessa c) Viljelmäsupernatantin a-amylaasiaktiivisuus määritettiin 35 myöhäisessä stationaarisessa kasvuvaiheessa.

27

Esimerkki 2

Alfa-amylaasin erityksen edistäminen B. aioyloll- quefaciensissa PrsA-proteiinin yli-ilmentyessä Tämä esimerkki osoittaa B. subtilisin PrsA-proteii-5 nin vaikutuksen B. amyloliquefaciensissa, kun grampositii-vinen isäntäbakteeri myös yli-ilmentää PrsÄ-proteiinia.

ALK02732 on ALK02100:n johdannainen ja sisältää mo-nikopioisen plasmidin pKTHIO, joka koodittaa B. amyloli-quefaciensin a-amylaasia. Tämä kanta sisältää siten kymme-10 niä a-amylaasigeenikopioita ja erittää noin 20 kertaa enemmän a-amylaasia kuin villin tyypin kanta ALK02100 [Vehmaan-perä et ai., J. Biotechnol. 19 (1991) 221 - 240].

ALK02732:n Western blotting -määritys, jossa käytettiin an-ti-PrsA-antiseerumia, osoitti, että PrsA-proteiinin määrä 15 oli ÄLK02732:ssa yhtä pieni kuin ALK02100:ssa, mihin viitataan jäljempänä. Siten PrsA on proteiinin eritystä rajoittava tekijä ALK02732:ssa.

Plasmidi pKTH277 siirrettiin elektroporaatiolla B. amyloliquefaciens -kantaan ALK02732 kannan ALK02732(pKTH277) 20 valmistamiseksi. PrsA:n määrä ALK02732(pKTH277):ssä oli monta kertaa suurempi kuin ALK02732:ssa Western blotting -menetelmällä määritettynä. Tämä sopii hyvin yhteen pKTH277:llä transformoiduissa B. subtilis -kannoissa tapahtuneen PrsA-proteiinien samanlaisen lisääntymisen kanssa.

25 α-amylaasimäärä, jonka ALK02732 ja ALK02732(pKTH277) erittivät kasvualustaan (väkevyydeltään kaksinkertainen Lu-ria-liemi, joka sisältää 2 % liukoista tärkkelystä), määritettiin logaritmisen ja varhaisen stationaarisen kasvuvaiheen aikana (ravistuspulloviljelmät) . Tulokset esitetään tau-30 lukoissa 4-1 (koe 1) ja 4-2 (koe 2). On nähtävissä, että näissä kahdessa erillisessä kokeessa α-amylaasin määrä ALK02732(pKTH277):n kasvualustassa oli 1,5 - 2,5 -kertainen ALK02732:n kasvualustassa esiintyvään määrään nähden.

28

Taulukot 4-1 ja 4-2 pKTH277:n vaikutus B. amyloliquefaczensin (ALK02732) ct-amy-laasieritykseen 5 Taulukko 4-1, koe 1 ALK02732 ALK02732 (pKTH277)

Aika (h) Kasvu* α-amylaasi Kasvu* a-amylaasi (mg/1) (mg/l) 10 3 106 1,1 100 1,1 4 241 8, 8 240 8,8 5 426 47 430 72 6 520 160 525 224 7 576 480 580 650 15 8 625 800 630 1050

Taulukko 4-2, koe 2 ALK02732 ALK02732 (pKTH277)

Aika (h) Kasvu* α-amylaasi Kasvu* a-amylaasi 20 (mg/1) (mg/1) 3 100 0, 9 112 1,5 4 250 6 272 9 4.5 350 24 363 38 25 5 425 50 437 80 6.5 545 190 577 450 8 585 320 637 1300 12 702 1600 12.5 700 900 30 *Viljelmän tiheys määritettynä Klett-Summerson-kolorimetril-lä käyttämällä suodatinta nro 66 ja ilmoitettuna Klett-yk-sikköinä.

35 Tässä esimerkissä käytetyt materiaalit ja menetel mät

Bakteerikannat ja plasmidit: Transformointi- ja kasvatuskokeisiin käytettiin B. amyloliquefaciens -kantaa AL- 29 K02732 {jota kuvaavat Vehmaanperä et ai. 1991). AL-K02732(pKTH277) valmistettiin transformoimalla ALK02732 (tämä tutkimus) plasmidilla pKTH277 ja käytettiin sitä kasvatuskokeisiin. Plasmidia pKTH277, joka sisältää PrsA-geenin, 5 kuvaavat Kontinen et ai. (1991).

ALK02732:n transformointi pKTII277:llä elektropo-raatiolla: Plasmidi pKTH277 eristettiin käyttämällä emäsha-jotusmenetelmää ja metyloitiin BamHl-metylaasilla (New England Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Elektropo-10 raatioon käytettiin noin 0,5 pg metyloitua plasmidi-DNA:ta. Elektroporaatio tehtiin Vehmaanperän (1989) kuvaamalla tavalla. Soluja pulssikäsiteltiin 0,2 cm:n näytekyveteissä (Bio-Rad Laboratories) Gene Pulser™ -laitteella (Bio-Rad Laboratories), jonka asetukset olivat 1,5 kV, 25 pF ja 400 Ω. 15 Transformanttien kloramfenikoliresistenssi tutkittiin Lu-ria - kanamysiini (10 pg/ml) - kloramfenikoii (5 pg/ml) -maljoilla. (Maljoilla oli myös kanamysiiniä pKTHlO-häviön välttämiseksi, sillä ALK02732 sisältää pKTH10:ä, joka antaa kanamysiiniresistenssin.) 20 Kasvatuskokeet ja näytteenotto: Kasvatettiin ensin ALK02732:a ja ALK02732(pKTH277):ää yön yli Luria-maljoilla. Maljoilta siirrettiin bakteereja 10 ml:aan Luria-alustaa ja kasvatettiin ne logaritmiseen vaiheeseen (tiheys 100 Klett-yksikköä). Sitten lisättiin 1 ml glyserolia (1/10 viljelmän 25 tilavuudesta) ja solususpensio pakastettiin ja säilytettiin lämpötilassa -70 °C. Kasvatuskokeet aloitettiin laimentamalla solut (tiheys 100 Klett-yksikköä) suhteessa 1:100 tai 1:200 väkevyydeltään kaksinkertaisella (2x) Luria-alus-talla, johon oli lisätty 2 % tärkkelystä. Kasvatuskokeissa 30 käytetty Luria-alusta ei sisältänyt suolaa. Viljelytilavuus oli 20 ml, ja kasvatus tehtiin pulloissa voimakkaasti ravistellen lämpötilassa 37 °C. Kummankin kannan yhteydessä kasvualustaa täydennettiin kanamysiinillä (10 pg/ml) ja ALK02732(pKTH277):n kohdalla myös kloramfenikolilla (5 pg/ml) . 35 Kasvu osoitettiin mittauksin, jotka tehtiin Klett-Summerson-kolorimetrilla (Klett Manufacturing Co., Inc., N.Y.) käyttä- 30 maila suodatinta nro 66. Kasvatuksen aikana otettiin 0,5 ml:n näytteitä, sentrifugoitiin ne ja varastoitiin viljelmäsuper-natantit lämpötilassa -20 °C α-amylaasimäärityksiä varten.

α-amylaasimääritykset: Viljelmäsupernatanteissa ole-5 va a-amylaasi määritettiin käyttämällä Phadebas-tabletteja (Pharmacia). Näytteitä inkuboitiin 1 tunti lämpötilassa 37 °C 1 ml:ssa puskuria (50 mmol/1 MES:ää, pH 6,8, 50 mmol/1 NaCl:a, 100 pmol/l CaCl2:a), joka sisälsi disper-goituna 1/4 Phadebas-tablettia, minkä jälkeen lisättiin 10 50 μΐ NaOH-liuosta (5 mol/1) reaktion keskeyttämiseksi. Kun seos oli suodatettu suodatinpaperin Whatman nro 1 läpi, mitattiin suodoksen absorbanssi käyttämällä 616 - 624 nm:ä analyysiaallonpituusalueeena ja 800 - 804 nm:ä referenssi-aallonpituusalueena. Standardina käytettiin kaupallisesti 15 saatavissa olevaa B. amyloliquefaciensin a-amylaasia (Sigma), ja tulokset ilmoitetaan milligrammoina entsyymiä litraa kohden (mg/1).

Viitteet: Kontinen, V., Saris, P. ja Sarvas, M., A Gene (prsÄ) of Bacillus subtilis involved in a novel, la-20 te stage of protein export, Mol. Microbiol 5 (1991) 1273 - 1283; Vehmaanperä, J., Transformation of Bacillus amyloliquefaciens by electroporation, FEMS Microbiol. Lett. 61 (1989) 165 - 170; Vehmaanperä, J., Steinborn, G. ja Ho-femeister, J., Genetic Manipulation of Bacillus amyloli-25 quefaciens, J. Biotechnol. 19 (1991) 221 - 240.

Esimerkki 3

Subtilisiinin erityksen edistäminen B. lentusissa

PrsA-proteiinin yli-ilmentyessa Tämä esimerkki valaisee keksinnön mukaista menetel-30 mää ja järjestelmää yli-ilmentyneiden eksoproteiinien erityksen edistämisessä B. lentusissa grampositiivisen isäntä-bakteerin yli-ilmentäessä PrsA-proteiinia.

On testattu PrsA:n yli-ilmentymisen vaikutusta subtilisiinin erittymiseen B. lentusista, jota entsyymiä on saa-35 tavissa kaupallisesti nimellä Experase™ ja kuvataan julkaisussa WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S:n nimissä). Subtilisii- 31 nin transkriptiolähteenä on plasmidi pPL1800, joka perustuu ekspressiovektoriin pPL1759 (Hansen, C., väitöskirja 1992, The Technical University of Denmark) , jossa on pUBHO-aloi-tuskohta ja B. lichneniformisista peräisin olevat promoot-5 tori ja signaalipeptidi. Plasmidia pSX94 kuvataan julkaisussa WO 89/06279. Tuotantoon käytettävä B, subtilis -kanta SHa273 on proteaasien suhteen heikko DN1885-johdannainen [Jorgensen, P. L. et ai., FEMS Microbiol. Lett. 77 (1991} 271 - 276], jossa kaksi muuta proteaasia, apr ja npr, ovat 10 inaktivoituja. B. lentus -subtilisiinin eritys mitattiin kannoista, jotka sisälsivät prsA-plasmidin pKTH277 (MOL253) tai eivät sisältäneet sitä (MOL252), ja kasvatus tehtiin lämpötilassa 30 °C soijaliemessä BPX, jota oli täydennetty kanamysiinillä ja kloramfenokolilla.

15 Subtilisiinitasojen mittaaminen näistä kahdesta kan nasta viiden vuorokauden kuluttua osoittaa, että prsA-plas-midin sisältävä kanta erittää neljä kertaa enemmän B. lentus -subtilisiinia (160 pg/ml) kuin tätä plasmidia sisältämätön kanta (40 pg/ml).

20 Käytetyn BPX-alustan koostumus on seuraava: BPX: Perunatärkkelys 100 g/1

Ohrajauho 50 g/1 BAN 5000 SKB 0,1 g/1

Natriumkaseinaatti 10 g/1 25 Soijapapujauho 20 g/1

Na2HP(V12H20 9 g/1

Pluronic 0,1 g/1

Kantaluettelo: B. svibtills Genotyyppi ja ominaisuudet Läh tokan ta 30 - DN 1885 amyE, amyR2 RUB200 PL1801 amyE, amyR2, apr-, npr- DN1885 MOL252 PL1801 (pPL1800) PL1801 MOL253 PL1801 (pPL1800, pKTH277) PL1801 32

Kantaa RUB 200 kuvaavat Yoneda et ai. julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Commun. 91 (1979) 1556 - 64.

Esimerkki 4

PrsA-proteiinin läsnäolo Bacillus amyloliqruefacien-5 sissa ja Bacillus subtilisissa

PrsA-proteiinin läsnäolo on osoitettu kahdessa Bacillus amyloliquefaciens -kannassa, kannassa ALK089 ja kannassa ALK02100. Kanta ALK089 on α-amylaasin tuotantoon käytettävä kaupallinen kanta. Kanta ALK089 on ylituottaja, jo-10 ta kuvataan julkaisussa Bailey, M. J. ja Markkanen, P. H.

J., Appi. Chem. Biotechnol. 25 (1975) 73 - 79. Kanta ALK02100 on ATCC23843:n johdannainen [J. Vehmaanperä, FEMS Microbiology Letters 49 (1988) 101 - 105].

PrsA-proteiinin läsnäolo on osoitettu myös kahdessa 15 Bacillus licheniformis -kannassa, kannoissa 749/C [Pollock, M. R., Biochem. J. 94 (1965) 666 - 675] ja ATCC 14580.

PrsA-proteiini identifioitiin näistä muista grampo-sitiivisista bakteereista kuin Bacillus subtilisista käyttämällä Western blotting -menetelmää. Tarkemmin määritelty-20 nä soluille, jotka kerättiin myöhäisessä logaritmisessa kasvuvaiheessa (proteaasien määrän minimoimiseksi - PrsA-proteiini on herkkä proteaaseille), tehtiin Western blotting -käsittely ja lyhyt lysotsyymikäsittely (soluseinän tekemiseksi läpäiseväksi välttäen tälläkin kertaa kuitenkin pit-25 kää käsittelyä proteolyysin minimoimiseksi) ja ne saatettiin liukoiseen muotoon lämpötilassa 100 °C käyttämällä näy-tepuskuria, joka sisälsi 2 % SDS:a. PrsA-proteiini detek-toitiin kaniinin antiseerumilla (PK 1283), jota oli muodostettu Eschericia colissa tuotettua B. subtilisin PrsA-30 proteiinia vastaan (siten tapahtui hyvin vähän antigeenistä ristireagointia mahdollisten muiden Bacillus-proteiinien kuin PrsA:n kanssa) . Tämä antiseerumi detektoi nanogrammaluokkaa olevia määriä B. subtilis -tyypin PrsA:ta Western blotting -vyöhykkeistä.

35 Kaikkien neljän kannan havaittiin lisäksi sisältä vän proteiinia, joka vastaa kooltaan JS. subtilisin PrsArta 33 ja jonka edellä mainittu antiseerumi tunnistaa spesifisesti. Vyöhykkeen värjäytymisintensiteetti oli suunnilleen samanlainen kummassakin B. amyloliquefaciens -kannassa ja samanlainen kuin villin tyypin B. subtilisissa esiintyvän 5 PrsA-proteiinin. B. amyloliquefaciensin soluproteiinien rin-nakkais-SDS-PAGE:n Coomassien blue -värjäys antoi tulokseksi vain hyvin heikon vyöhykkeen PrsA-proteiinin kohdalla samoin kuin B. subtilisin ollessa kyseessä, ja tämä sopii yhteen sen kanssa, että B. amyloliquefaciensin PrsA-proteiini 10 on vähäisinä pitoisuuksina esiintyvä soluproteiini samoin kuin B. subtilisissa. Kyseisten kahden B. licheniformis -kannan PrsA-proteiinin värjäytymisintensiteetti oli pienempi kuin B. subtilisissa, mikä viittaa jonkin verran pienempään PrsA-proteiinimäärään. Ei voida kuitenkaan sulkea 15 pois mahdollisuutta, että heikompi värjäytyminen johtuu antiseerumin heikommasta sitoutumisesta B. licheniformisin PrsA-proteiiniin kuin B. suttuisin PrsA-proteiiniin. Taulukko 5 on yhteenveto karkeasti arvioiduista PrsA-määristä eri kannoissa.

34

Taulukko 5

Bacillus-kantojen soluissa varhaisen stationaarisen kasvuvaiheen aikana (solutiheyden ollessa 400 Klett-yksikköä) havaitut likimääräiset PrsA-proteiinimäärät.

5 Arviot perustuvat Western blotting -vyöhykkeisiin ja ovat alustavia.

Kanta PrsA:ta soluissa (mielivaltaisina yksiköinä) 10 B. amyloliquefaciens RH2078 4 RH2079 41} B. licheniformis RH2080 1 15 RH305 1 B. subtilis IH6064 5 ΙΗ67742ί 100υ 20 1) Solut kerättiin logaritmisen kasvuvaiheen puolivälissä {ti heyden ollessa 100 Klett-yksikköä) ja arvioitiin tiheyttä 400 Klett-yksikköä vastaavat PrsA-arvot.

2) Tämä on PrsA:n ylituottaja pKTH277 sisällön ansiosta.

25 Tässä esimerkissä käytetyt materiaalit ja menetel mät

Kannat: Bacillus amyloliquefaciens RH2078 = AL- K0B9 = VTT197 = E18. Tämä kanta on α-arrtylaasin ylituottaja. Kanta on saatu lahjoituksena J. Vehmaanperältä, ALKO. Ba-30 cillus amyloliquefaciens RH2079 = ALKO2100, johdettu kan nasta ALKO2099(pE194/pC194). Kanta on saatu lahjoituksena J. Vehmaanperältä, ALKO. Bacillus licheniformis RH2080 = BRÄ5 = ATCC14580. Tämä kanta on lämmönkestävän a-amylaasin ylituottaja. Kanta on saatu lahjoituksena P. Sarisilta, BI, 35 Helsinki. Bacillus licheniformis RH302 = 749/c. Tämä on konstitutiivinen penisillinaasikanta, joka on alunperin johdettu kannasta J. O. Lampen. Bacillus subtilis IH6074.

35 Tämä kanta on metB5 sacA321. Katso M. Sibakov et ai. 1983. Bacillus subtilis IH6774. Tämä kanta on johdettu kannasta IH6074 ja sisältää plasmidit pKTHlO (jossa on a-amylaasi-geeni) ja pKTH277 (jossa on PrsArta koodittava geeni).

5 Kasvualustat: Luria-agarmaljät (L-maljat); väkevyy deltään kaksinkertainen Luria-liemi (2xL).

Puhdistettu PrsA-proteiini: M. Lauraeus puhdisti

PrsA:n pKTH277-pitoisesta B. subtilisista.

Immuuniseerumi: E. colissa tuotettu B. subtilisin 10 PrsA, joka ajettiin SDS-geelissä ja leikattiin irti siitä.

Kemikaalit: Fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, Sigma P-7626, 100 mmol/1 etanolissa lämpötilassa -20 °C. EDTAr

TitriplexRIII p.a., Merck 8418, 0,5 mol/1 -liuoksena, pH 8. Lysotsyymi, Sigma L-6876. Tätä käytettiin pitoisuutena 15 1 mg/ml seuraavassa liuoksessa: 20 mmol/1 kalsiumfosfaat- tia, pH 7, 15 mmol/1 MgCl2:a, 20 % sakkaroosia. TCA, 100 %, BCA+ Protein Assay Reagent, valmistaja Pierce. SDS-PAGE ja Western Blot -välineet ja -kemikaalit BioRadrn mukaiset. Vyöhykkeet värjättiin 4-kloori-l-naftolilla.

20 Viljelyolosuhteet ja näytteen preparointi geelielek- troforeesia varten: Bakteereja kasvatettiin L-maljoilla yön yli lämpötilassa 37 °C. Pesäkkeitä poimittiin lasisauvalla ennalta punnittuun Eppendorf-putkeen ja punnittiin. Näyte-puskuria lisättiin siten, että saatiin pitoisuudeksi joko 25 10 tai 100 mg soluja (märkäpaino) millilitraa kohden. Näyt teitä kuumennettiin 10 min lämpötilassa 100 °C.

Bakteereja kasvatettiin 2xL-liemessä sekoittaen lämpötilassa 37 °C. Proteaasivaikutuksen minimoimiseksi bakteerit (lämpötilasta -20 °C) kasvatettiin ensin tiheyteen 100 30 Klett-yksikköä [vastaa suunnilleen tiheyttä 1 - 2 mg soluja (märkäpaino)/ml tai 109 solua/ml]. Tätä viljelmää käytettiin inokulaattina laimennussuhteen ollessa 10-2. 20 ml bakteereja kasvatettiin Klett-pulloissa ja otettiin 4 ml:n näytteitä tiheyden ollessa 100 Klett-yksikköä, 2 tunnin ku-35 luttua tiheyden 100 Klett-yksikköä saavuttamisesta (tiheys noin 400 Klett-yksikköä) ja 4 tunnin kuluttua tiheyden 100

Klett-yksikköä saavuttamisesta (tiheys noin 550 Klett-yk- sikköä) .

36 Näytteet siirrettiin välittömästi jäähauteeseen, lisättiin PMSF:a pitoisuudeksi 1 mmol/1 ja EDTAa pitoisuudek-5 si 10 mmol/1. Solut erotettiin viljelmäsupernatantista sent-rifugoimalla 10 min kiihtyvyydellä 12 000-G ja käsiteltiin lysotsyymillä 15 min lämpötilassa 37 °C tilavuuden ollessa 1/20. Lisättiin yhtä suuri tilavuus näytepuskuria. Vilje-mäsupernatantille tehtiin saostus 10-%:isessa TCAissa läm-10 pötilassa 4 °C ja se konsentroitiin väkevyydeltään 20-ker-taiseksi näytepuskurissa.

Näytteet ajettiin 12-%:isessa SDS-PAGE-geelissä, värjättiin Coomassie Brilliant Blue R:llä tai siirrettiin PVDC-suodattimille (BioRad).

15 PrsÄ detektoitiin kaniinin spesifisellä anti-PrsA- antiseerumilla KH 1283.

Esimerkki 5

Pseudomonas mendocina -peräisen lipaasin tehostettu eritys PrsA-proteiinia ylituottavassa Bacillus sub-20 tilisissa Käyttämällä pKTH277:ssä olevaa prsA-geeniä Genencor Internationalissa, South San Francisco, CÄ, USA toimivat tutkijat ovat osoittaneet, että kun Bacillus subtilis yli-ilmentää sekä PrsA-proteiinia että lipaasia (peräisin Pseu-25 domonas mendocinasta, gramnegatiivisesta bakteerista) , alus taan erittynyt lipaasimäärä on noin 3,5 kertaa suurempi kuin vertailunäytteissä, jotka eivät yli-ilmennä prsA-gee-niä. Genencor Internationalin tutkijat käyttivät teollisia Bacillus-kantoja ja teollisia fermentointiolosuhteita. (Tu-30 loksia ei esitetä.) 37

Johtopäätökset Täten on nähtävissä, että tämä keksintö tuo julki menetelmän ja järjestelmän teollisesti ja lääketieteellisesti tärkeiden eksoproteiinien tuotannon edistämiseksi gram-5 positiivisissa bakteereissa. Ammattimies voi tämän keksinnön hengestä ja suoja-alasta poikkeamatta tehdä keksintöön erilaisia muutoksia ja muunnoksia sen sopeuttamiseksi erilaisiin käyttötarkoituksiin ja olosuhteisiin. Siten nämä muutokset ja muunnokset kuuluvat asian- ja yhdenmukaisesti 10 ja on tarkoitettu kuuluviksi seuraavien patenttivaatimusten koko vsstaavuusalueen piiriin. Keksinnön eri puolet käyvät myös ilmi seuraavista patenttivaatimuksista.

Claims (13)

1. Transformoitu grampositiivinen bakteeri, tunnettu siitä, että se erittää mielenkiinnon kohteena ole- 5 vaa eksoproteiinia ja käsittää (a) useita geenejä, jotka koodaavat PrsA-proteii-nia, kromosomissa; {b} villityypin geenin, joka koodaa PrsA-proteii-nia, kromosomissa, ja geenin, joka koodaa PrsA-proteiinia, 10 monikopioplasmidissa; ja/tai (c) muunnettuja säätelyelementtejä PrsA-proteiinin ilmentymisen lisäämiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että se on Bacillus-suvun laji.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen bakteeri, tun nettu siitä, että se on laji, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu seuraavista: Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Ba-20 cillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacil lus subtilis ja Bacillus thuringiensis.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että mainittu eksoproteiini on proteaasi, lipaasi, kutinaasi, amylaasi, galaktosidaasi, 25 pullulanaasi, sellulaasi, glukoosi-isomeraasi, proteiini- disulfidi-isomeraasi, syklodekstriiniglukonotransferääsi, fytaasi, glukoosioksidaasi, glukosyylitransferääsi, lak-taasi, bilirubiinioksidaasi, ksylanaasi, antigeeninen mikrobi- tai alkueläinproteiini, bakteeriproteiinitoksiini, 30 mikrobipintaproteiini tai virusproteiini.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että mainittu eksoproteiini on amylaasi.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että mainittu eksoproteiini on 35 heterologinen tai homologinen.

7. Menetelmä mielenkiinnon kohteena olevan ekso-proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä ilmennetään mainittua eksoproteiinia jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisessa grampositiivisessa baktee- 5 rissa.

8. Menetelmä eksoproteiinin erittymisen grampositiivisessa bakteerissa parantamiseksi, tunnettu siitä, että transformoidaan grampositiivinen bakteeri, joka erittää mielenkiinnon kohteena olevaa eksoproteiinia, sopival- 10 la polynukleotidikonstruktilla, mikä johtaa transformoi tuun bakteeriin, joka käsittää (a) useita geenejä, jotka koodaavaat PrsA-proteii-nia, kromosomissa; {b) villityypin geenin, joka koodaa PrsA-proteii-15 nia, kromosomissa, ja geenin, joka koodaa PrsA-proteiinia, monikopioplasmidissa; ja/tai (c) muunnettuja säätelyelementtejä PrsA-proteiinin ilmentymisen lisäämiseksi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tun-20 nettu siitä, että bakteeri on Bacillus-suvun laji.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että bakteeri on laji, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu seuraavista: Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus cir- 25 culans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentue, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ja Bacillus thuringiensis.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mielenkiinnon 30 kohteena oleva eksoproteiini on proteaasi, lipaasi, kutinaasi, amylaasi, galaktosidaasi, pullulanaasi, sellulaasi, glukoosi-isomeraasi, proteiini-disulfidi-isomeraasi, syk-lodekstriiniglukonotransferääsi, fytaasi, glukoosioksidaa-si, glukosyylitransferääsi, laktaasi, bilirubiinioksidaa-35 si, ksylanaasi, antigeeninen mikrobi- tai alkueläinprote- iini, bakteeriproteiinitoksiini, mikrobipintaproteiini tai virusproteiini.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mielenkiinnon kohteena 5 oleva eksoproteiini on amylaasi.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 8-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu eksoproteiini on heterologinen tai homologinen.