JP4202985B2

JP4202985B2 - グラム陽性菌中の商業的に重要な菌体外タンパク質の高められた生産のための方法及び系

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Publication number: JP4202985B2
Application number: JP2004256168A
Authority: JP
Inventors: ヴェサコンチネン; マティサーヴァス
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2023-12-24
Also published as: WO1994019471A1; CN1120853A; EP0686195A1; AU6142694A; DK0686195T3; JPH08507207A; DE69434807T2; ATE335083T1; DE69434807D1; US5780261A; EP0686195B1; JP2004350691A; CN1080307C

Description

グラム陽性菌中の商業的に重要な菌体外タンパク質の高められた生産のための方法及び系発明の分野本発明は、グラム陽性細菌、特にバチルス属細菌の産業上及び医学上重要な菌体外タンパク質（エキソプロテイン、exoprotein）の高められた生産のための方法及び発現系に関する。

グラム陽性細菌では、分泌されたタンパク質は細胞膜及び細胞壁を介して輸出され、引き続いて外部の培地に放出される。一方、グラム陰性細菌は２つの細胞（又は表面）膜に囲包されており、細胞壁を持たない。グラム陰性細菌では、輸出（export）されたタンパク質は細胞から放出されず、膜内のペリプラズム空間及び外膜の中に留まる。

分泌機構の２つの型の成分が大腸菌中で同定されている。すなわち、可溶性の細胞質タンパク質及び膜付随タンパク質である（Wickner et al.，（1991）Annu．Rev．Biochem．参照）。ＳｅｃＢ及び熱ショックタンパク質を包含する可溶性の細胞質タンパク質は全て、分泌タンパク質の前駆体が、分泌に適合しない構造に折りたたまれることを防止する。膜付随タンパクのセットは、周辺膜タンパク質ＳｅｃＡ、完全膜タンパク質ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＦ並びにシグナルペプチダーゼＬｅｐ及びＬｓｐを包含する（Hayashi，S．and Wu，H.C．（1990）J．Bioenerg．Biomembr.，22:451-471；Dalbey，R.E．（1991）Mol．Microbiol.，5:2855-2860）。

これらの膜付随タンパク質は、前駆体の結合及び細胞膜を介しての移動、それに続くシグナルペプチドの開裂及びタンパク質の放出に関与する。
グラム陽性細菌の分泌機構に関する知識はより少ない。バチルス属のモデル生物として遺伝学的及び生理学的によく特徴づけられている枯草菌についてのデータによると、全体的に大腸菌と似ていることが示唆される。しかしながら、おそらく非常に異なる個々の細胞エンベロープの組成及び構造に基づく要求を反映して、個々の成分の構造及び特異性は異なっている。

枯草菌、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・リケニホルミスのようなグラム陽性細菌は、タンパク質を分泌する能力が非常に高く、実際、多くのバチルス属の細胞外酵素が産業的に利用されている。グラム陽性細菌の分泌タンパク質は商業的に非常に重要であり、また、グラム陽性細菌の分泌タンパク質は、大腸菌とは非常に異なる構造の細胞エンベロープを通って移動するので、グラム陽性細菌におけるタンパク質分泌の分子機構は学問的及び産業的に重要である。

この点に関し、我々は最近、枯草菌の分泌機構に関与する新規な成分であるＰｒｓＡタンパク質を発見した（Kontinen，V.P．and Sarvas，M.，（1988）J．Gen．Microbiol.，134:2333-2344；Kontinen，V.P.，et al.，（1991）Mol．Microbiol．5:1273-1283）。ＰｒｓＡタンパク質をコードするｐｒｓＡ遺伝子は、最初、いくつかの菌体外タンパク質の分泌を減少させる非致命的突然変異を起こすものと規定された（Kontinen，V.P．and Sarvas，M.，（1988）J．Gen．Microbiol.，134:2333-2344）。クローニングされたｐｒｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列及びこの遺伝子とタンパク質についての我々のその後の研究により、我々は、シャペロンとして機能し、細胞膜を介して輸送されるタンパク質（ＰｒｓＡ）をｐｒｓＡはコードするものであると断定する（最初の仕事については、Kontinen，V.P.，et al.，（1991）Mol．Microbiol．5:1273-1283参照）。

輸出されたセリンプロテアーゼの成熟を助けるといわれているタンパク質である、ラクトコッカス・ラクチスのＰｒｔＭタンパク質（Haandikman，A.J．et al，（1989）J．Bacteriol.，171:2789-2794；Vos，P.，et al.，（1989）J．Bacteriol.，171:2795-2802）の配列と、ＰｒｓＡタンパク質との相同性は低い（約３０％）。細菌の分泌機構の公知のタンパク質には類似の機能がない。従って、ＰｒｓＡタンパク質は、グラム陽性細菌において、細胞膜を介してタンパク質が輸送された後の放出及びおそらく分泌タンパク質の折りたたみを容易にする、タンパク質分泌の経路における新規なタイプの成分であることが示唆される。

細菌中の目的のタンパク質を分泌された形態で生産することは有利である。なぜなら、輸出されたタンパク質は、通常、そのネイティブの構造を維持しているのに対し、細胞内に生産されるものは多くの場合、生産されたタンパク質が凝集しているからである。産業上及び医学上重要な細菌中のタンパク質を分泌された形態で生産することのもう１つの利点は、分泌によりタンパク質の精製が容易になることである。さらに、大腸菌とは異なり、バチルス属細菌のようなグラム陽性細菌は、リポ多糖のような有毒化合物を含まない。このことにより、グラム陽性細菌は医学及び薬学に用いられるタンパク質の生産の宿主としては非常に適している。

アルファ−アミラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼのような多くの細胞外酵素の産業的な生産に用いられるグラム陽性細菌菌株を改良して、分泌されるタンパク質の量を増やすことは、非常に有意義なことである。従来、これを行うための戦略としては、適当な遺伝子を過剰発現させることであった。これを行うための直ちに利用できる方法が知られている。すなわち、マルチコピープラスミドを用いることにより、又は例えば強力なプロモーターや複数のプロモーターを用いて調節要素を修飾することにより遺伝子の活性を高めることにより遺伝子の発現を増大させること等である。この方法により、分泌機構がネックとなってそれ以上多くタンパク質を合成しても意味がないレベルにまで細胞外タンパク質の合成は劇的に高められた。合成量の増大と並行して分泌能を増大させることが望ましい。しかしながら、現在までのところ、これは不可能である。

本発明の目的は、グラム陽性細菌の分泌機構のネックを軽減し、目的の同種又は異種タンパク質の発現量が、修飾されていない野生型の生物により通常生産される量よりも高められている場合に、バチルスのようなグラム陽性細菌から通常分泌されるタンパク質の量が増大される方法及び系を提供することである。
本発明の更なる目的は、種々の商業的に重要な細胞外タンパク質の生産を高めるために用いることができる細菌宿主及びプラスミドを記述することである。
概要本発明は、目的の同種又は異種タンパク質の発現量が、修飾されていない野生型の生物により通常生産される量よりも高められている場合に、バチルスのようなグラム陽性細菌から通常分泌されるタンパク質の量が増大される方法及び系を提供する。

本発明の方法及び系は、少なくとも１つの目的の同種又は異種細胞外タンパク質を過剰生産することができるグラム陽性細菌宿主中で、ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体を過剰生産することを含む。本発明の教示において、過剰生産とは、野生型の生産よりも多いこと、すなわち、野生型の細菌が通常生産するタンパク質（ＰｒｓＡ若しくはその機能的類似体又は目的の細胞外タンパク質）の量よりも多く生産されることを意味する。また、本発明においては、過剰生産はこの分野で知られた標準的な手段を伴う。

例えば、マルチコピープラスミド、ＰｒｓＡ若しくはその機能的類似体及び／又は目的の細胞外タンパク質をコードする遺伝子のマルチコピーの、宿主染色体中での使用、これらを発現を高めるための調節要素の改変、例えば、強力なプロモーターの使用、複数のプロモーターの使用、エンハンサーの使用等と組合せることである。本発明の方法及び系を用いることにより、合成された細胞外タンパク質の増殖培地中への分泌は、例えば対照の５〜１０倍と、大幅に高められる。これらの分泌された細胞外タンパク質は、一旦増殖培地中に分泌されると、その後は容易に回収、精製される。

本発明の発現系は、ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体を野生型よりも多く発現することができ、かつ、例えばアルファアミラーゼ、ズブチリシン、ニューモリシン、リパーゼ又は他の商業的に重要な細胞外酵素を野生型よりも多く発現することができる、例えばバチルスのようなグラム陽性細菌宿主を包含する。本発明の方法は、この発現系を用いて、グラム陽性細菌中で商業的に重要な細胞外タンパク質の生産を高めることを包含する。この方法では、ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体を過剰発現（すなわち、野生型細菌により生産される量よりも多く発現）するグラム陽性細菌宿主中で少なくとも１つの目的の細胞外タンパク質が過剰発現される。

本発明の教示において、ＰｒｓＡの機能的類似体とは、それが過剰発現された場合に、目的の細胞外タンパク質の分泌に関し、グラム陽性細菌の分泌能を高めることができるタンパク質である。また、本発明の教示において、ｐｒｓＡ又はＰｒｓＡとの配列の相同性、高力価の抗ＰｒｓＡ抗体との免疫学的反応性及び／又は機能的に、すなわち、それが過剰発現された場合に、目的の細胞外タンパク質の分泌に関し、グラム陽性細菌の分泌能を高めることができるという機能、を包含するいくつかの手段によりｐｒｓＡの機能的類似体を同定することができる。

バチルス属細菌のようなグラム陽性細菌宿主を形質転換してＰｒｓＡの生産量を野生型におけるよりも増大させる好ましい方法は、枯草菌からのｐｒｓＡ遺伝子を有するプラスミドｐＫＴＨ２７７で宿主を形質転換することである。ＰｒｓＡタンパク質の機能的類似体をコードする遺伝子を担持する、同様なプラスミドを構築することができる。これらのプラスミドは、ＰｒｓＡの機能的類似体を過剰生産させるべくグラム陽性細菌宿主を形質転換するために用いることができる。ＰｒｓＡ類似体（これらはＰｒｓＡ様タンパク質と呼ぶこともできる）が過剰生産されるようにエンジニアリングしたならば、それらの宿主グラム陽性細菌菌株は、本発明の教示に従い、過剰生産された目的の細胞外タンパク質の分泌を高めるために用いることができる。

本発明はまた、目的の細胞外タンパク質を野生型よりも多く発現するグラム陽性細菌宿主中で、細胞性ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体の量を増やすことによって、グラム陽性細菌における分泌が高められるという我々の発見に関連する方法及び構築物を開示し、包含する。
一局面において、本発明は、ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体を野生型よりも多く発現することができ、かつ、少なくとも１つの目的の細胞外タンパク質を野生型よりも多く発現することができるグラム陽性細菌を含む、グラム陽性細菌中の細胞外タンパク質の分泌を高めるための発現系を包含する。

他の局面において、本発明は、少なくとも１つの目的の細胞外タンパク質を野生型よりも多く発現することができ、かつｐＫＴＨ２７７を含むグラム陽性細菌を包含する。
さらに他の局面において、本発明は、少なくとも１つの目的の細胞外タンパク質を野生型よりも多く発現することができ、かつ、枯草菌からの少なくとも２コピーのｐｒｓＡ遺伝子若しくはその類似体、又は枯草菌からのｐｒｓＡ遺伝子又はその類似体が強力な調節配列に機能的に連結され、その結果ｐｒｓＡ遺伝子又はその類似体が過剰発現されるグラム陽性細菌を包含する。

本発明はまた、ｐｒｓＡ遺伝子又はその機能的類似体の過剰発現を引き起こす発現シグナルの制御の下に枯草菌からのｐｒｓＡ遺伝子又はその機能的類似体を含むＤＮA構築物、並びにｐｒｓＡ遺伝子又はその機能的類似体の過剰発現を引き起こす発現シグナルの制御の下に枯草菌からのｐｒｓＡ遺伝子又はその機能的類似体を含むベクターを包含する。
さらに他の局面において、本発明は、細胞外タンパク質を野生型よりも多く発現することができるグラム陽性細菌中で、枯草菌からのＰｒｓＡタンパク質又はその類似体を野生型よりも多く発現させることを含む、グラム陽性細菌における目的の細胞外タンパク質の分泌を高める方法を包含する。

さらに、本発明は、宿主生物中で過剰発現される目的のタンパク質の分泌を高めるために有用な、改良された非枯草菌宿主生物を創製する方法を包含する。この方法は、（a）枯草菌からのＰｒｓＡタンパク質の機能的類似体をコードする遺伝子を宿主生物中で同定すること、及び（b）該遺伝子のコピーを少なくとも１つさらに宿主生物に導入する及び／又は該遺伝子の過剰発現をもたらす発現配列に機能的に連結された遺伝子を宿主生物に導入することにより、工程（a）で同定された遺伝子の発現を高めることを含む。
本発明はまた、サザンブロット法により、枯草菌のｐｒｓＡ遺伝子からのＤＮＡプローブとハイブリダイズするＤＮＡを同定し、過剰発現された場合に目的の細胞外タンパク質の分泌に関してグラム陽性細菌の分泌能を高めることができるタンパク質を該遺伝子がコードすることを示すことを含む、枯草菌からのＰｒｓＡの機能的類似体をコードする遺伝子を同定する方法を包含する。

さらに、本発明は、高力価の抗ＰｒｓＡ抗体と反応するタンパク質を同定し、このタンパク質がグラム陽性細菌中に野生型よりも多く存在すると、目的の細胞外タンパク質の分泌に関し、該タンパク質がグラム陽性細菌の分泌能力を高めることができることを示すことを含む、枯草菌からのＰｒｓＡの機能的類似体をコードする遺伝子を同定する方法を包含する。

本発明のこれら及び他の特徴、局面並びに利点は、以下の説明、実施例、方法及び材料並びに請求の範囲を参照することによりさらによく理解されるであろう。
説明バチルス属細菌のようなグラム陽性細菌において、輸出されるタンパク質の発現レベル（合成）が高い場合には、タンパク質の分泌及び分泌型のタンパク質の生産において律速となるのは分泌装置の能力である。本発明は、この限定すなわちネックを克服するための系及び方法を提供する。

本発明は、バチルス属細菌のようなグラム陽性細菌における分泌は、目的の細胞外タンパク質を野生型よりも多く発現するグラム陽性細菌宿主中で、バチルス輸出機構のたった１つの成分、すなわち、ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体の量を増大させることによって増大させることができるという、我々の最初の驚くべき発見に基づいている。本発明の方法及び系は、グラム陽性細菌宿主中でどのように目的のタンパク質が過剰生産されるかにかかわりなく有用である。
従って、本発明の方法及び系は、現在産業的に用いられている種々の過剰生産商業菌株を改良するために用いることができる。

本発明の方法及び系は、あらゆるグラム陽性細菌に用いることができる。バチルス属に属する細菌が好ましい。特に好ましいものは、バチルス・アルカリフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コーギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）である。

本発明の方法及び系はまた、あらゆる所望の目的の細胞外タンパク質に対しても用いることができる。本発明の方法及び系により生産することができる目的の細胞外タンパク質の例を以下に列挙する。ここでは、例示的な細胞外タンパク質は一般的なカテゴリー別に記載されている。

微生物及び原生動物の抗原性タンパク質：あらゆるグラム陰性細菌、もっとも、特に以下に列挙するもの、からの莢膜、外膜及び線毛。バクテロイデス・フラジリス（Bacteroies fragilis）、フソバクテリウム属菌（Fusobacterium spp.）、ボーデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヤーシニア・エンテロコリティカ（Yersinia entercolitica）、ヤーシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、ブランハメラ・カタルハリス（Branhamellla catarrhalis）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、セラティア・マーセセンス（Serratia marcescens）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionela pneumophila）、ネイセリア・ゴノローエアエ（Neisseria gonorrhoea）、ネイヤリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・パラリフィＢ（Salmonella pararyphi B）、マイコバクテリウム・ティバキュローシス（Mycobacterium tyberculosis）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）及びシゲラ属菌（Shigella spp.）。

あらゆる細菌、しかし特に以下に列挙する細菌からのタンパク質毒素及び分泌タンパク質：スタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、クロストリジウム属菌（Clostridium spp.）、大腸菌（Escherichia coli）、ヤーシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、ボーデテラ・パーチュシス（Bordetella pertussis）、ストレプトコッカス・パイオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＭ−タンパク質、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）の排泄酵素。

あらゆる微生物、しかし特に以下の微生物（増殖のあらゆる期）の表面タンパク質：プラスモジウム属菌（Plasmodium spp.）、トキソプラスマ属菌（Toxoplasma spp.）、レイシュマニア属菌（Leishmania spp.）、シストソマ属菌（Schistosoma spp.）、トリパノサマ属菌（Trypanosama spp.）、ストレプトコッカス属菌の接着タンパク質及びスタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）の接着タンパク質。

抗原タンパク質及びウイルス：ミキソウイルス（インフルエンザＡＨ１−Ｈ１２、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ）のＨＡ及びＮＡタンパク質；パラミキソウイルス（パラインフルエンザ１−４、ニューキャッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸シンシチアル（syncytial）ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ジステンパーウイルスのＨＡ及びＮＡタンパク質；狂犬病ウイルスのＧタンパク質；アルファウイルス（チクングンヤ、ウェスタン、イースタン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、オニョン−ニョン（O'nyong-nyong）ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビス（Sindbis）ウイルス；フラビンウイノレス（デンク（Denque 1-4）、日本脳炎ウイルス、ダニ脳炎ウイルス、ムレー渓熱脳炎ウイルス、キャサヌア（Kyasanur）森林病ウイルス、ルーピング病（looping ill）ウイルス、オムスク（Omsk）出血熱ウイルス）のＶ１及びＶ３タンパク質；

ジャーマン麻疹ウイルスの表面タンパク質；ブタコレラウイルスの表面タンパク質；ウマ関節炎ウイルスの表面タンパク質；ブンヤ（Bunya）ウイルス（リフト（Rift）渓熱ウイルス、クリミーン（Crimean）出血熱ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、砂蝿熱ウイルス）のＧ１及びＧ２タンパク質；アレナウイルス（レッサ熱ウイルス、リンパ性絨毛膜軟膜炎ウイルス）のＧ１及びＧ２タンパク質；ピコルナウイルス（ポリオ１−３、コクサッキーＡウイルス１−２４、コクサッキーＢウイルス１−６、エコーウイルス１−８、１１−３４、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトリノ（rhino）ウイルス１−１１３）のＶ１−Ｖ４タンパク質；ロータウイルスの表面タンパク質；

ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、２、サイトメガロウイルス、エプシュタイン−バ−ウイルス、ウマ堕胎ウイルス）の表面タンパク質；パポバウイルス（ＢＫウイルス、ヒトイボウイルス）のＶＰ１−ＶＰ３タンパク質；パルボウイルス（ミンク腸炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ネコパルボウイルス、ブタパルボウイルス）のｐタンパク質；ヒトＢ型肝炎ウイルスの構造タンパク質；エボラ及びマーバーグ（Marburg）ウイルスの表面タンパク質；アデノウイルス（ヒトアデノウイルス１−３３）のヘキソン、ペントン及び線維タンパク質。

産業的酵素：産業的に重要な酵素としては、デンプン分解酵素、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、オキシダーゼなどが挙げられる。
より詳細には、目的の酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、ガラクトシダーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、タンパクジスフィド（disuphide）イソメラーゼ、ＣＧＴ’ase（シクロデキストリングルコノトランスフェラーゼ）、フィターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ又はキシラナーゼであり得る。

例としては、アルファ−アミラーゼ、アミノ酸アシラーゼ、アミログルコシダーゼ、ブロメライン、フィシン、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘミヤルラーゼ、インベルターゼ、カタラーゼ、コラゲナーゼ、キシラナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、ナリンギナーゼ、パンクレアチン、パパイン、ペクチナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ペプシン、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、レニン、リボヌクレアーゼ、セルラーゼ、ストレプトキナーゼ及びトリプシンが挙げられるがこれらに限定されるものではない。

医学上有意義な細胞外タンパク質もまた生産することができる。これらのタンパク質は、診断のための抗原並びにワクチン及び医薬に用い得るタンパク質を包含する。
本発明の教示では、目的の細胞外タンパク質は必ずしもネイティブな細胞外タンパク質である必要はなく、遺伝子工学技術を用いて細胞外タンパク質に設計され、創製された新規なタンパク質でもよい。例えば、１つの種からの普通は非分泌性のタンパク質（又は操作された非ネイティブタンパク質）は、構造タンパク質をコードする配列にシグナル配列を付加することにより「細胞外」タンパク質に作り替えることができる。この操作された細胞外タンパク質は、ＰｒｓＡタンパク質又はその機能的類似体を過剰発現するバチルス属のようなグラム陽性細菌中で発現させることができる。このように、本発明の方法は、これらの目的の非ネイティブ及び遺伝子操作されたタンパク質の分泌を高めるために用いることができる。

本発明の局面に戻ると、本発明の１つの具体例を例示するために、我々は枯草菌からのｐｒｓＡ遺伝子の過剰発現が、バチルス属の２つの重要な産業的細胞外酵素、すなわちアルファ−アミラーゼ及びズブチリシンの分泌に与える効果を示す。これらの研究のために、枯草菌からの全ｐｒｓＡ遺伝子を含む、５．３ｋｂの挿入物を、少ないコピー数のシャトルベクター（ｐＫＴＨ２７７）にクローニングし、枯草菌にｐｒｓＡのさらなるコピーを導入するために用いた（枯草菌からのｐｒｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列は、EMBL/GenBank/DDBJヌクレオチド配列データライブラリーにＸ５７２７１の番号で登録されている。）

（ｐＫＴＨ２７７は、ｐＫＴＨ２６８からの５．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、各制限酵素で消化することにより直線化した少コピー数のシャトルプラスミドｐＨＰ１３に連結し、大腸菌ＴＧ１株に形質転換することにより得られた。ｐＫＴＨ２６８及びｐＫＴＨ２７７のサイズはそれぞれ８．５ｋｂ及び１０．２ｋｂである。Kontinen，et al.，（1991）Mol．Microbiol.，5:1273-1283も参照。この文献はこの明細書に組み入れられたものとする）。

枯草菌中にｐＫＴＨ２７７が存在することにより、対応するＰｒｓＡタンパク質の量は野生型の約１０倍に増大した。これらの増大した量のＰｒｓＡタンパク質を含むバチルス属細菌中で他の分泌タンパク質の遺伝子が発現される場合には、培地に分泌されるタンパク質の量は実質的に増加する。例えば、この系において、バチルス・アミロリクファシエンスのアルファ−アミラーゼの分泌量は対照の２．５倍に増大し、バチルス・リケニホルミスの耐熱性アルファ−アミラーゼの分泌量は対照の６倍に増大し、バチルス・リケニホルミスからのズブチリシン（アルカリプロテアーゼ）の分泌量は対照の２倍に増大した。

これらの研究において、細胞外酵素は、該酵素をコードする遺伝子をマルチコピープラスミド上に置き又は宿主の染色体中に挿入することによって、宿主菌株中で、分泌機構を飽和させるであろう程度の量に過剰発現された。（これらの研究において、細胞外酵素をコードする全てのマルチコピープラスミドはｐＵＢ１１０の誘導体であり、これはシャトルプラスミドｐＫＴＨ２７７とは異なる非適合性群に属するものであり、同一の宿主細胞中での複製が可能なものである。これらのプラスミドの安定性は、ほとんどの場合、相同配列間の効果的な組換えを防ぐrｅｃＥ４株（Dubnau et al.，1973；Keggins et al.，1978）を用いることによりさらに増大された。

本発明のこの局面を例示するために研究された最初の細胞外酵素は、ｐＫＴＨ１０（Palva，I．（1982a）Gene，19:81-87；Palva，I.，et al.，（1982b）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:5582-5586）によりコードされるバチルス・アミロリクエファシエンス（ＡｍｙＥ）のアルファ−アミラーゼである。我々は、このアルファアミラーゼを過剰生産する野生型菌株において、ｐＫＴＨ２７７の存在は本当に、増殖の定常期を通じてアルファ−アミラーゼの分泌を、ＰｒｓＡを過剰発現していない対照菌株と比較して、２．５〜３倍に高めることを見出した。培養上清中のアルファ−アミラーゼの最大濃度（約３４００μｇ／ｍｌ）は、増殖２４時間後に観察された。ｐＫＴＨ２７７がない場合には、この菌株は僅か１２００μｇ／ｍｌを分泌したに過ぎない。染色体中に挿入され、修飾された調節の故に高レベルに転写される、１コピーのＡｍｙＥ遺伝子によりアルファ−アミラーゼが発現された場合にも定性的に同様な結果が得られた。

我々が試験した第２の細胞外タンパク質は、産業的に重要な、主たる液化アルファ−アミラーゼである、バチルス・リケニホルミスの耐熱性アルファ−アミラーゼ（ＡｍｙＬ）である（Ortlepp et al.，1983；Diderichsen，B.，et al.，（1991）Res．Microbiol.，142，793-796）。バチルス・アミロリクエファシエンスのアルファ−アミラーゼ遺伝子のプロモーター及びシグナル配列に基づく分泌ベクター（Palva，I．（1982）Gene，19:81-87；Palva，I.，et al.，（1982）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:5582-5586）；Sibakov，M．（1986）Eur．J．Biochem.，1sS，577-581）からの適切な遺伝子を発現させることにより、この酵素を枯草菌中で、バチルス・アミロリクエファシエンスにおけると同程度に分泌させることができた。このような菌株の１つにｐＫＴＨ２７７を導入することにより（この結果得られた菌株がＩＨ６７６０）、培地中のアルファ−アミラーゼの量は約６倍に増大した。これは指数期の後期から培養４５時間にかけて見られた。

アルカリプロテアーゼであるズブチリシンは、その前駆体がシグナル配列に加えてさらにプロ配列を有する、異なるタイプの細胞外タンパク質である（Wells，et al.，（1983）Nucleic Acids Res.，11:7911-7925；Wong，S.-L.，et al.，（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:1884-11188）。この酵素の分泌に対する、ＰｒｓＡの増大された量の影響を、ＰｒｓＡの量が増大している菌株（ＩＨ６７８９）と野生型の量を有する菌株とを用いることにより調べた。

両者とも、マルチコピープラスミドｐＭＪ５７（Hastgrup，S．and Jacobs，M.F．（1990）In Zukowski，M.M．et al.，（eds.），Lethal phenotype conferred byxylose-induced overproduction of apr-lacZ fusion protein，vol.3，Academic Press，Inc.，San Diego，California，pp.33-41）によりコードされる、バチルス・リケニフホルミスの異種ズブチリシン（洗剤粉として用いられ、工業製品として重要なＳｕｂＣ）を分泌した。このプラスミドでは、ｓｕｂＣ遺伝子は、キシロースにより誘導されるプロモーターの制御下にある。これら２つの菌株からのズブチリシンの分泌量を比較すると、完全に誘導がかかっている場合に、ＩＨ６７８９（ＰｒｓＡ量が増大）中の量は、分析した全ての時点で対照のＩＨ６７８８により分泌される量の約２倍であった。

我々はまた、過剰生産を引き起こすプラスミドを全く含まない菌株中における内発性細胞外酵素の自然な少量の分泌に対するｐＫＴＨ２７７の効果を試験した。増殖の指数期の後期すなわち一夜培養物中でのアルファ−アミラーゼの分泌量及び総タンパク質量は、ｐＫＴＨ２７７又はクローニングベクターｐＨＰ１３を有する菌株でも同じであった。これらの結果から、ＰｒｓＡタンパク質の量を増大させることにより、過剰生産されている細胞外酵素の分泌のみが高められるものと思われる。

上記のプラスミドにおいて、５．３ｋｂの断片によって引き起こされる分泌量の増大におけるＰｒｓＡの役割を確認するために、我々は、ｐＫＴＨ２７７のｐｒｓＡ遺伝子中のＥｃｏＲＶ部位（第３８２番目のヌクレオチド）に挿入することによりプラスミドｐＫＴＨ２７７中のｐｒｓＡ遺伝子を不活化した。ｐＫＴＨ３２６１では、該挿入物は、翻訳停止コドンが結合されたバチルス・リケニホルミスのｂｌａＰ遺伝子の５６０ｂｐ断片であり、ｐＫＴＨ３２６２では、ラムフダファージの４．６ｋｂＥｃｏＲＶ断片であった。

これらのプラスミドを担持する大腸菌の全細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析することにより、これらのプラスミドにより発現されるフルサイズのＰｒｓＡタンパク質は存在せず、ｐＫＴＨ３２６１により発現される、予想されるサイズ（１４ｋＤａ）の、ＰｒｓＡ推定的な切断物が見られた（データ示さず）。対照として、５．３ｋｂ断片がｐｒｓＡ遺伝子の１．９ｋｂ下流で切断され、該遺伝子が無傷で保たれているｐＫＴＨ３２５３を構築した。枯草菌（ｐＫＴＨ１０を担持するＩＨ６６２４）中で、ｐｒｓＡ遺伝子中に挿入物を有する２つのプラスミドはアルファアミラーゼの分泌を促進しなかったが、ｐＫＴＨ３２５３は促進した。

ｐｒｓＡの過剰発現により得られる高められた分泌は、細胞外酵素の大規模な工業生産にとって明らかに有利である。このような用途においては、潜在的に不安定なマルチコピープラスミドを用いることを避けることが望まれる場合がときどきある。１つの戦略は、細胞外酵素の構造遺伝子を１コピー又は数コピー染色体中に挿入し、かつ調節要素を修飾して発現を高めることである。従って、我々は、このような系でアルファアミラーゼの分泌に対するＰｒｓＡの過剰生産の効果を試験した。

すなわち、１コピーのａｍｙＥ遺伝子が染色体中に挿入され、該染色体に、調節タンパク質ＤｅｇＱを過剰発現する菌株（A．Palva，個人的通信）中のＤｅｇＱの標的配列が結合した系を用いた。この系においてもまた、ＰｒｓＡタンパク質の量を増大させることにより、アルファ−アミラーゼの分泌量は約３倍に増大した（表１及び表２、菌株ＢＲＢ７６４及びＩＨ６７７０−３）。このことは、細胞外タンパク質の最初の発現レベルが高い場合には、標的遺伝子の増大された発現がどのようにして得られたかにかかわらず分泌の促進が達成されることを示している。

枯草菌以外のグラム陽性細菌中におけるＰｒｓＡの存在に関し、我々は、例えばバチルス・アミロリクエファシエンス及びバチルス・リケニホルミスのような他の種の中にもＰｒｓＡ又はＰｒｓＡ類似体が存在することを確認した。バチルス・アミロリクエファシエンス中のＰｒｓＡタンパク質の量は枯草菌細胞中における量と同程度であるが、バチルス・リケニホルミス細胞中のＰｒｓＡタンパク質の量はより少ないように思われる。さらに、これらのグラム陽性細菌菌株中の分泌機構の成分は、枯草菌のそれと類似している。バチルス・アミロリクエファシエンス及びバチルス・リケニホルミスは、分泌されたプロテアーゼ及びアミラーゼを生産するための大規模な工業的生産において最も広く用いられている２つの種である。ＰｒｓＡタンパク質の過剰生産を用いて目的の同種及び異種の細胞外タンパク質の分泌を増大させる本発明の方法は、これらの菌株中において特に有用である。

本発明の一部として、我々は、他のグラム陽性細菌中でＰｒｓＡタンパク質及び／又はｐｒｓＡ遺伝子をどのようにして同定するのか、そして、枯草菌からのＰｒｓＡタンパク質の機能的類似体が存在し本発明の方法及び系において用いることができることをどのようにして確認するのかを教示する。枯草菌からのＰｒｓＡタンパク質の機能的類似体は、高力価の抗ＰｒｓＡ抗体を用いることによって他のグラム陽性細菌中において同定することができる。

あるいは、ｐｒｓＡ遺伝子又は枯草菌からのＰｒｓＡタンパク質の機能的類似体をコードする同種のｐｒｓＡ様遺伝子は、ｐｒｓＡ遺伝子又はｐｒｓＡ遺伝子断片からのプローブを用いたサザンブロッティングにより同定することができる。ＰｒｓＡ様タンパク質が存在することがわかったが、ＰｒｓＡタンパク質に特異的な抗体又はｐｒｓＡ遺伝子に相同な配列を含むＤＮＡプローブによって断定的に検出するには相同性が不十分である場合には、その相同遺伝子の位置を決定し、クローニングすることができ、疑義のない同定が可能である。

もっとも、ほとんどの場合、相同なタンパク質及び遺伝子は、ＰｒｓＡタンパク質に特異的な抗体又はｐｒｓＡ遺伝子に相同な配列を含むＤＮＡプローブを用いて見つけることができる。免疫学的な同定のために、免疫ブロット（ウェスタンブロット）を利用し、高力価の抗ＰｒｓＡ抗体を用いてＰｒｓＡタンパク質を検出することができる。抗血清は、適当な動物（例えばウサギ）を枯草菌のＰｒｓＡタンパク質で免疫することにより、あるいは好ましくは、枯草菌よりも目的の種により近い種のＰｒｓＡタンパク質類似体で免疫することにより生産される。ＰｒｓＡを同定するために、目的の細菌を多数の増殖培地上で増殖させることができるが、好ましくは、細菌はプロテアーゼの誘導が最小となる培地上で増殖される。

細菌細胞を、好ましくは存在するプロテアーゼの量が最小である増殖の期に集め、その種にとって適当な方法により破壊される（通常、酵素処理と、超音波処理、フレンチプレス処理又はガラスビーズとの剪断処理のような機械的処理との組合せ）。超遠心により調製された、破壊細胞の種々の大きさのサンプル及び破壊された全細胞の粒子分画を常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質をメンブレンフィルターに転写し、抗ＰｒｓＡ抗血清及び標識第２抗体を用いて検出する（粒子分画を調製すると、より少量のＰｒｓＡタンパク質が検出できる）。これらの全ての工程では、常法及び市販の試薬を用いることができる。

ｐｒｓＡ遺伝子又は目的の種においてＰｒｓＡの機能的類似体をコードするＰｒｓＡ様遺伝子を同定するために、サザンブロットを用いることができる。この方法では、サザンハイブリダイゼーシヨンの常法に従い、ｐｒｓＡ遺伝子からの適当なＤＮＡプローブが、断片化され電気泳動にかけられた、目的の種の染色体ＤＮＡとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションプローブは、枯草菌のｐｒｓＡ遺伝子を含むあらゆる断片若しくはこの遺伝子の断片又は他の種のｐｒｓＡ遺伝子の類似体を含むＤＮＡ断片若しくはこの遺伝子の断片であってよい。
ｐｒｓＡ遺伝子類似体が一旦同定されると、それの配列を決定してさらに同一性を確認することができる。

本発明の教示は、枯草菌のＰｒｓＡタンパク質の過剰発現だけではなく、目的のグラム陽性細菌種中における枯草菌からのＰｒｓＡタンパク質の機能的類似体の過剰発現をも包含する。本発明の教示によると、枯草菌のｐｒｓＡ遺伝子又は宿主の種を包含する他の種からのｐｒｓＡ遺伝子類似体が宿主の種に導入される。ｐｒｓＡ遺伝子を高レベル（しかし致命的ではない）に発現させるために、ｐｒｓＡ遺伝子又はその類似体は、目的の種において活性である発現シグナルの制御下に置かれる。これは種々の方法で行うことができ、例えば次のような方法により行うことができる。

（1）目的の種にプラスミドｐＫＴＨ２７７を伝達する。この伝達は、形質転換、形質導入、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション及び接合のような、その種に適用可能なあらゆる形質転換方法により行うことができる。ｐＫＴＨ２７７はバチルス以外の多くのグラム陽性細菌種においてマルチコピープラスミドとして維持され、そのプラスミドにおけるｐｒｓＡ遺伝子の発現シグナルは多くのグラム陽性細菌種中で活性である。

（2）ｐＫＴＨ２７７の５．３ｋｂのＳａｃＩ遺伝子を、目的の種と適合性のある他のプラスミドに挿入し、その種における枯草菌のｐｒｓＡ遺伝子の活性に比較してより高い、しかし致命的でないレベルにｐｒｓＡを発現させるために適当なコピー数で維持する。次いで、その種に適用可能なあらゆる形質転換方法のいずれかを用いてプラスミドをその種に伝達する。あるいは、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片は、他の種のｐｒｓＡ遺伝子類似体及びその発現シグナルを含んでいてもよい。

（3）シグナル配列及びＰｒｓＡタンパク質の成熟部分をコードするｐＫＴＨ２７７のＤＮＡ断片を目的の種にふさわしい発現ベクターに、該プラスミド中の発現シグナルの制御下に挿入してＰｒｓＡの高レベル発現を達成する。上述のように、適当な断片は、他の種のｐｒｓＡ遺伝子類似体から誘導されたものであってもよい。

（4）上記段落（2）及び（3）のＤＮＡ構築物を、プラスミドに代えて目的の種の染色体中に挿入する。この場合、遺伝子のコピー数がゲノム当たり僅か１個であってもＰｒｓＡの高レベル発現を確保するのに十分な活性のある発現シグナルを選択する必要がある。
本願発明者らは基礎研究者でもあり、設計及び必要のために我々の仕事の多くは実験室内、すなわち工業的な条件を模倣した環境下で行った。しかしながら、産業分野での協働研究者の助けを借りて、本発明の方法及び系は、商業的に有用な細菌菌株を用いた工業的な発酵条件下でも非常によく働くことが示された。
当業者が本発明の方法及び系を実施することを助けるために、我々の研究で用いた方法及び材料並びに本発明の実施例を以下に記載する。

材料及び方法
細菌菌株及びプラスミド枯草菌Marburg 168のｐｒｓ突然変異体及びその親株を表１に示す。また、ＰｒｓＡタンパク質を過剰発現している枯草菌及び大腸菌菌株並びにＰｒｓＡタンパク質の細胞内の量が多いために細胞外酵素の分泌が高められている枯草菌菌株並びにそれらの適当な対照菌株もリストされている。プラスミドベクターを有するクローニング宿主として用いられた大腸菌菌株はＨＢ１０１、ＴＧ１及びＤＨＳｃｃ（Sambrook J.，et al，（1989）Molecular cloning．A laboratorymanual．Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork）並びにラムダファージを有するＫｗ２５１（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）であった。

ｐｒｓＡ遺伝子及びその断片のためのクローニングベクターとして、ｐＨＰ１３（Haima，P.，et al.，（1987）Mol．Gen．Genet.，209:335-342，pJH101（Ferrari，F.A.，et all，（1983）J．Bacteriol.，154:1513-1515），pGEM3zf（+）（プロメガ社）及びpDR540（スウェーデン国アプサラのファルマシア社）を用いた。これらのプラスミドベクター及び５．３ｋｂ（ｐＫＴＨ２７７及びｐＫＴＨ２６８）又は３．４ｋｂ（ｐＫＴＨ３２５３）挿入物を有する、ｐｒｓＡ遺伝子を担持する構築された誘導体プラスミドが表３に示されている。ｐＫＴＨ３２５３中のｐｒｓＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム中の唯一のＥｃｏＲＶ部位に、バチルス・リケニホルミスｂｌａＰ遺伝子（０．５ｋｂ）又はバクテリオファージラムダゲノム（４．６ｋｂ）を挿入することにより、ｐＫＴＨ３２５３中のpr sＡ遺伝子を破壊した（得られたプラスミドはｐＫＴＨ３２６１及びｐＫＴＨ３２６２である）。

ｐＫＴＨ１０（Palva，I．（1982a）Gene，19:81-87；Palva，I.，et al.，（1982b）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:5582-5586）及びpMJ57（Hastrup，S．and Jacobs，M.F．（1990）in Zukowski，M.M．et al.，（eds.），Lethal phenotype conferred by xylose-induced overproduction of apr-lacZ fusion protein，vol．3．Academic Press，Inc.，San Diego，California，pp.33-41）は、それぞれ、外部の培地に分泌されるバチルス・アミロリクエファシエンスのアルファ−アミラーゼ（ＡｍｙＥ）及びバチルス・リケニホルミスのズブチリシン（ＳｕｂＣ）を大量に生産するマルチコピープラスミドである。ｐＫＴＨ１５８２は、バチルス・リケニホルミスからのａｍｙＬ遺伝子を枯草菌の分泌ベクター系にクローニングして構築された（BRB360 in Sibakov，M．（1986）Eur．J．Biochem.，1sS，577-581；Palva，I．（1982a）Gene，19:81-87；Palva，I.，et al，（1982b）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:5582-5586）。

増殖培地及び培養条件
細菌は、修飾Ｌ−肉汁（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ）中で３７℃で振盪培養するか又は１．５％寒天（ミシガン州デトロイトのディフコ社製）及び適当な抗生物質を含むＬ−プレート上で３７℃で培養した（Kontinen，V.P.，et al.，（1991）Mol．Microbiol．5:1273-1283）。プレートはアルファアミラーゼ過剰発現菌株（５％デンプン及び２．５％寒天）及びズブチリシン過剰発現菌株（０．２％キシロース及び１％ミルク粉）のために修飾した。Ｌ−肉汁には、細胞外酵素の生産のために、２％可溶性デンプン（ドイツ国ダーマシュタッドのメルク社製）を加えるか又は２倍濃度の培地を用いた。ズブチシリンを産生する菌株は１％ミルク粉を含むＬ−プレート上で増殖させた。細胞外酵素の産生は、２倍濃度のＬ−肉汁を激しく撹拌しながら調べた。増殖は、クレットスマーソン色度計（ニューヨーク州クレットマニュファクチャリング社製）を用いて測定される濁度により示された。

酵素分析
アルファアミラーゼは、フェイドバス（Phadebas）タブレット（ファルマシア社製）を用い、Kontinen，V.p．and Sarvas，M.，（1988）J．Gen．Microbiol.，134:2333-2344）に記載された方法により分析した。プレートアッセイのために、５％のデンプンを含むＬ−プレート上に細菌を画線培養し、４℃でプレートを培養後、コロニーのまわりのハローを測定した。典型的には、内発性アルファアミラーゼを産生する野生型コロニーのまわりには領域はなかったが、ｐＫＴＨ１０を担持する菌株では、プレートの培養時間に依存して２ｍｍを超えるハローが観察された。

バチルス・リケニホルミスのズブチシリン及び染色体によりコードされるプロテアーゼは、１ｍｌの０．１ＭＴｒｉｓ−０．０１ＭＣａＣｌ₂（ｐＨ８．０）中で、発色性ペプチド基質であるスクシニル−Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド（Del Mar，E.G.，et al.，（1979）Anal．Biochem．99:316-320）を用いて分析した。加水分解の速さはヒューレット・パッカード社製ダイオードアレイ分光光度計を用いて４１０ｎｍで測定した。アルファ−アミラーゼ及びズブチシリンの特異的活性を測定するために、培養上清のサンプル中のそれらの量をKontinen，V.P．and Sarvas，J.,（1988）J．Gen．Microbiol.，134:233-2344）に記載された方法により、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いクマシーブルーで染色することにより測定した。酵素の量はμｇ／ｍｌで示した。

実施例
実施例１．ＰｒｓＡタンパク質の量が増大している場合における枯草菌によるアルファアミラーゼ分泌の促進
宿主グラム陽性細菌がまたＰｒｓＡタンパク質を過剰発現している場合の種々の条件下における枯草菌によるα−アミラーゼの分泌の促進を次の表（表４）に示す。

実施例２．ＰｒｓＡタンパク質の量が増大している場合におけるバチルス・アミロリクエファシエンスによるアルファアミラーゼ分泌の促進
この実施例は、宿主のグラム陽性細菌がまたＰｒｓＡタンパク質を過剰発現している場合における、バチルス・アミロリクエファシエンス中での枯草菌のＰｒｓＡの過剰生産の効果を示すものである。

ＡＬＫ０２７３２はＡＬＫ０２１００の誘導体であり、バチルス・アミロリクエファシエンスのα−アミラーゼをコードするマルチコピープラスミドｐＫＴＨ１０を含む。この菌株はα−アミラーゼ遺伝子のコピーを数十個含み、野生型菌株であるＡＬＫ０２１００（Vehmaanpera et al.，J．Biotechnol．1991，19，221-240）の約２０倍のアルファアミラーゼを分泌する。抗ＰｒｓＡ抗血清を用いたＡＬＫ０２７３２の細胞の免疫ブロットにより、ＡＬＫ０２７３２中のＰｒｓＡタンパク質の量は、以下に示すように、ＡＬＫ０２１００中と同様に少量であることが示された。従って、ＡＬＫ０２７３２によるタンパク質分泌においてＰｒｓＡが律速要素である。

ｐＫＴＨ２７７をエレクトロポレーションによりバチルス・アミロリクエファシエンス菌株ＡＬＫ０２７３２に導入してＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）を作った。免疫ブロットで測定したところ、ＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）中のＰｒｓＡの量は、ＡＬＫ０２７３２中のＰｒｓＡの量の何倍もあった。このことは、ｐＫＴＨ２７７で形質転換された枯草菌菌株においてＰｒｓＡタンパク質の量が増大するのとよく符合している。

ＡＬＫ０２７３２及びＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）により増殖培地（２％の可溶性デンプンを含む、２倍強度のルリア肉汁）に分泌されるα−アミラーゼの量を、増殖の対数期及び初期定常期（振盪フラスコ培養）において測定した。結果を表５（実験１）及び表６（実験２）に示す。２つの異なる実験において、ＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）の培地中のα−アミラーゼの量は、ＡＬＫ０２７３２の増殖培地中の量の１．５〜２．５倍であることがわかる。

この実施例で用いた材料及び方法細菌菌株及びプラスミド：バチルス・アミロリクエファシエンス菌株ＡＬＫ０２７３２（Vehmaanpera et al.，1991により記載）を形質転換及び増殖実験に用いた。ＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）はプラスミドｐＫＴＨ２７７をＡＬＫ０２７３２（本実験）に形質転換することにより作製し、増殖実験に用いた。
ｐｒｓＡ遺伝子を担持するプラスミドｐＫＴＨ２７７はKontinen et al．（1991）に記載されている。

エレクトロポレーションを用いたＡＬＫ０２７３２のｐＫＴＨ２７７による形質転換プラスミドｐＫＴＨ２７７をアルカリ溶解法を用いて単離し、製造社の指示書に従ってＢａｍＨＩメチラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）でメチル化した。約０．５μｇのメチル化プラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションに用いた。エレクトロポレーションは、Vehmaanpera（1989）に記載された方法により行った。０．２ｃｍの試料キュベット（バイオ−ラドラボラトリーズ社製）中で、１．５ｋＶ、２５μＦ及び４００Ωにセットしたジーンパルサー（登録商標）装置（バイオ−ラドラボラトリーズ社製）により細胞にパルスを与えた。

形質転換体は、ルリア−カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）−クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）プレート上でクロラムフェニコール耐性に基づきスクリーニングした（カナマイシンは、ｐＫＴＨ１０の消失を避けるためにプレートに加えた。なぜならＡＬＫ０２７３２は、カナマイシン耐性を与えるｐＫＴＨ１０を含むからである。）

増殖実験及び試料採取：
先ず、ＡＬＫ０２７３２及びＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）をルリアプレート上で一夜増殖させた。プレートから細菌を取り、１０ｍｌのルリア培地に加え、対数期（クレット１００）まで増殖させた。次いで１ｍｌのグリセロール（培養体積の１／１０）を加え、細胞懸濁液を冷凍し、−７０℃で貯蔵した。クレット１００まで増殖した細胞を２ｘルリア＋２％デンプンで１００倍又は２００倍に希釈して増殖実験を開始した。増殖実験に用いたルリア培地は塩を含んでいなかった。培地の体積は２０ｍｌであり、増殖は３７℃で、ビン中で激しく振盪しながら行った。

２つの菌株ともカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を増殖培地に加え、ＡＬＫ０２７３２（ｐＫＴＨ２７７）ではさらにクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）も加えた。増殖は、Ｎｏ．６６フィルターを用いてクレット−スマーソン色度計（ニューヨーク州クレットマニュファクチャリング社製）により行った。増殖中に０．５ｍｌの試料を取り、試料を遠心分離し、α−アミラーゼ分析のために培養上清を−２０℃で保存した。

α−アミラーゼ分析：
培養上清中のα−アミラーゼはフェイドバスタブレット（ファルマシア社製）を用いて測定した。１／４の分散フェイドバスタブレットを含む１ｍｌの緩衝液（５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、１００μＭＣａＣｌ₂）中で試料をインキュベートし、次いで５０μｌの５ＭＮａＯＨを加えて反応を停止させた。ワットマンＮｏ．１ろ紙を通してろ過した後、６１６〜６２４ｎｍを分析波長域とし、８００〜８０４ｎｍを標準波長域として用いてろ液の吸光度を測定した。バチルス・アミロリクエファシエンスの市販のα−アミラーゼ（シグマ社製）を標準として用い、結果は１リットル当りの酵素のｍｇ数で示した。

文献：Kontinen V.，Saris P．and Sarvas M．（1991）:A gene（prsA）of Bacillus subtilis involved in a novel，late stage of protein export．Mol．
Microbiol．5:1273-2383．Vermaanpera，J．（1989）：Transformation of Bacillus Amyloliquefaciens by electroporation．FEMS Microbiol．Lett．61:165-170．Vehmaanpera J.，Steinborn G．and Hofemeister J．（1991）：Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens．J．Biotechnol．19:221-240．

実施例３．ＰｒｓＡタンパク質の量が増大している場合におけるバチルス・レンタス（B．lentus）によるズブチシリン分泌の促進
この実施例は、宿主のグラム陽性細菌がまたＰｒｓＡタンパク質を過剰発現している場合における、バチルス・レンタス中で過剰発現された細胞外タンパク質の分泌促進における本発明の方法及び系を例示するものである。
Ｅｘｐｅｒａｓｅ（登録商標）として市販され、ＷＯ８９／０６２７９（出願人：ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ）に記載されている、バチルス・レンタスのズブチシリンの分泌に対するＰｒｓＡの過剰発現の効果を試験した。

ズブチシリンはプラスミドｐＰＬ１８００から転写され、ｐＰＬ１８００は、ｐＵＢ１１０の複製開始点並びにバチルス・リケニホルミスのα−アミラーゼ（ａｍｙＬ）からのプロモーター及びシグナルペプチドを有する発現ベクターｐＰＬ１７５９（Hansen，C.，Thesis，1992，The Technical University of Denmark）に基づくものである。プラスミドｐＳＸ９４はＷＯ８９／０６２７９に記載されている。生産に用いた枯草菌菌株ＳＨａ２７３は、ＤＮ１８８５（Jorgensen，P.L．et al.，（1991）FEMS Microbiol．Lett.，77:271-276）のプロテアーゼを弱くした誘導体であり、２つのプロテアーゼａｐｒ及びｎｐｒを不活化したものである。バチルス・レンタスのズブチシリンの分泌は、ＰｒｓＡプラスミドｐＫＴＨ２７７を有する菌株（ＭＯＬ２５３）及び有さない菌株（ＭＯＬ２５２）の両方について測定し、増殖はカナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したダイズ肉汁ＢＰＸ中で３０℃で行った。

２つの菌株からのズブチシリン濃度を５日後に測定したところ、ＰｒｓＡプラスミドを有する菌株によるバチルス・レンタスのズブチシリンの分泌量（１６０μｇ／ｍｌ）が、このプラスミドを有さない菌株からの分泌量（４０μｇ／ｍｌ）の４倍であった。
用いたＢＰＸ培地は以下の組成を有していた。
ＢＰＸ：ポテトデンプン１００ｇ／ｌ
大麦粉５０ｇ／ｌＢＡＮ５０００ＳＫＢ０．１ｇ／ｌ
カゼイン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ
大豆ミール２０ｇ／ｌ Na₂HPO₄・12H₂O ９ｇ／ｌ
プルロニック０．１ｇ／ｌ

実施例４．バチルス・アミロリクエファシエンス及び枯草菌中でのＰｒｓＡタンパク質の存在
バチルス・アミロリクエファシエンスの２つの菌株ＡＬＫ０８９及びＡＬＫ０２１００中におけるＰｒｓＡタンパク質の存在が示された。ＡＬＫ０８９菌株はα−アミラーゼの生産に用いられている工業的菌株である。ＡＬＫ０８９菌株は、Bailey，M.J．and Markkanen P.H．J．Appl．Chem．Biotechnol．1975，25，73-79）に記載されている過剰発現菌株である。ＡＬＫ０２１００菌株はＡＴＣＣ２３８４３（J．Vehmaanpera，FEMS Microbiology Letters 49（1988）101-105）の誘導体である。

ＰｒｓＡタンパク質の存在はまた、バチルス・リケニホルミスの２つの菌株、すなわち７４９／Ｃ菌株（Pollock，M.R．（1965）Biochem．J．94，666-6/5）及びＡＴＣＣ１４５８０で確認された。

これらの非枯草菌グラム陽性細菌中でのＰｒｓＡタンパク質は、免疫ブロット法により同定された。より詳細にいうと、増殖の指数期後期（プロテアーゼの量を最少化するため−ＰｒｓＡタンパク質はプロテアーゼ感受性である）に回収した細胞を免疫ブロットにかけ、短時間リゾチーム処理を行い（細胞壁を漏出的にするため。しかしここでもタンパク質分解を最少化するために長時間の処理は避ける）、２％ＳＤＳを含む試料緩衝液で１００℃で可溶化した。ＰｒｓＡタンパク質は、大腸菌中で生産された枯草菌のＰｒｓＡタンパク質に対するウサギ抗血清（ＫＨ１２８３）により検出した（従って、ＰｒｓＡ以外のあらゆるバチルスタンパク質との抗原性交差反応が最少化されている）。抗血清により、免疫ブロット中にナノグラム単位の枯草菌様ＰｒｓＡが検出された。

さらに、４つの菌株は全て、枯草菌のＰｒｓＡと同じサイズで、上記抗血清により特異的に同定されるタンパク質を含んでいることがわかった。バンドの染色強度は、バチルス・アミロリクエファシエンス菌株及び野生型枯草菌のＰｒｓＡタンパク質と同程度であった。バチルス・アミロリクエファシエンスの細胞性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、並行的にクマシーブルーで染色したところ、枯草菌の場合と同様、ＰｒｓＡタンパク質の位置には極めて弱いバンドが観察されただけであった。

このことは、バチルス・アミロリクエファシエンスにおけるＰｒｓＡタンパク質は、枯草菌におけると同様、マイナーな細胞性タンパク質であるという事実と符合する。２つのバチルス・リケニホルミス菌株のＰｒｓＡタンパク質の染色強度は枯草菌におけるよりも弱く、ＰｒｓＡタンパク質の量がより少ないことが示唆される。しかしながら、染色強度がより弱いことは、バチルス・リケニホルミスのＰｒｓＡタンパク質の抗血清の結合性が枯草菌のそれに対するよりも弱いことに起因する可能性を排除することはできない。表８に異なる菌株中のＰｒｓＡの大ざっぱに見積もった量を示す。

この実施例で用いた材料及び方法
菌株：バチルス・アミロリクエファシエンスＲＨ２０７８＝ＡＬＫ０Ｂ９＝ＢＴＴ１９７＝Ｅ１８。これはα−アミラーゼの過剰生産菌株である。J．Vehmaanpera，ALKOからのギフト。バチルス・アミロリクエファシエンスＲＨ２０７９＝ＡＬＫ０２１００、ＡＬＫ０２０９９（pE194/pC194）から誘導。J．Vehmaanpera，ALKOからのギフト。バチルス・リケニホルミスＲＨ２０８０＝ＢＲＡ５＝ＡＴＣＣ１４５８０。これは耐熱性α−アミラーゼの生産株である。P．Saris，BI,H:kiからのギフト。バチルス・リケニホルミスＲＨ３０５＝７４９／ｃ。これはもともとJ.O.Lampenから誘導され、ペニシリナーゼを構成する菌株である。枯草菌ＩＨ６０７４。これはmetB5 sacA321.Ref．M．Sibakov et al.，1983。枯草菌ＩＨ６７４４。これはＩＨ６０６４から誘導され、プラスミドｐＫＴＨ１０（α−アミラーゼ遺伝子を担持）及びプラスミドｐＫＴＨ２７７（ＰｒｓＡをコードする遺伝子を担持）を含む。

増殖培地：ルリアー寒天プレート（Ｌ−プレート）；２倍濃縮ルリア肉汁（２ｘＬ）
精製ＰｒｓＡタンパク質：ＰｒｓＡはM．Lauraeusにより、ｐＫＴＨ２７７含む枯草菌から精製された。
免疫血清：ＳＤＳ−ゲルにかけ、ここから切り出された、大腸菌により生産された枯草菌のＰｒｓＡ。

化学物質：フェニルメチルスルホニルフロリド、シグマＰ−７６２６。エタノール中１００ｍＭ、−２０℃。ＥＤＴＡ、Titriplex（登録商標）III p.a.Merck 8418。０．５Ｍ溶液、ｐＨ８として。リゾチーム、シグマＬ−６８７６。これは次の溶液中で１ｍｇ／ｍｌで用いた。２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、２０％ショ糖。ピアス社のＴＣＡ１００％ＢＣＡ⁺タンパク分析試薬。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットの装置及び試薬はバイオラド社製。ブロットは４−クロロ−１−ナフトールで染色した。

培養条件及びゲル電気泳動のための試料調製：
細菌はＬ−プレート上で３７℃で一夜増殖させた。コロニーはガラス棒でピックアップし、予め重量を測定してあるエッペンドルフチューブに入れ、重量を測定した。試料緩衝液は細胞濃度が１０又は１００ｍｇ細胞（ｗｗ）／ｍｌになるように加えた。試料は１００℃で１０分間加熱した。
細菌は２ｘＬ肉汁中で３７℃で撹拌しながら増殖させた。プロテアーゼの効果を最小化するために、細菌は先ず−２０℃からクレット１００（１〜２ｍｇ細胞ｗｗ／ｍｌ又は約１０⁹細胞／ｍｌに対応）まで増殖させた。これを１００倍に希釈したものを接種物として用いた。２０ｍｌの細菌をクレットフラスコ中で増殖させ、４ｍｌずつの試料をクレット１００、クレット１００＋２時間（クレット約４００）、及びクレット１００＋４時間（クレット約５５０）で採取した。

試料は直ちに氷槽に入れ、ＰＭＳＦを１ｍＭに加え、ＥＤＴＡを１０ｍＭに加えた。１２０００ｘｇで１０分間の遠心により細胞を培養上清から分離し、１／２０容量をリゾチームで３７℃で１５分間処理した。同容積の試料緩衝液を加えた。培養上清を１０％ＴＣＡ中で４℃で沈殿させ、試料緩衝液中で２０倍に濃縮した。
試料は１２％のＳＤＳ−ＰＡゲル中で泳動し、クマシーブリリアントブルーＲで染色するか又はバイオラドに従いＰＶＤＦフィルター上にブロットした。
ＰｒｓＡは特異的抗ＰｒｓＡウサギ抗血清ＫＨ１２８３で検出した。

実施例５．ＰｒｓＡタンパク質を過剰生産する枯草菌による、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）のリパーゼの高められた分泌
ｐＫＴＨ２７７中のＰｒｓＡ遺伝子を用い、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコのジェネンコールインターナショナルの科学者たちは、枯草菌がＰｒｓＡタンパク質及びリパーゼ（グラム陰性細菌であるシュードモナス・メンドシナのリパーゼ）の両者を過剰発現する場合には、培地に分泌されるリパーゼの量はＰｒｓＡ遺伝子を過剰発現しない対照に比べて約３．５倍になったことを示した。ジェネンコールインターナショナルの科学者たちはバチルスの工業的な菌株を用い、工業的な発酵条件を用いた（データ示さず）。

結論
このように、本発明は、グラム陽性細菌の工業的及び医学的に重要な細胞外タンパク質の生産を高めるための方法及び系を開示するものであることがわかる。
本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者は本発明に種々の変更及び修飾を加えて種々の用途及び条件に適合するようにできる。このような変更及び修飾は、以下の請求の範囲の均等の全範囲内に、適正に、公正に、そして意図的に含められる。本発明の種々の特徴はまた以下の請求の範囲から明らかである。

Claims

目的の細胞外タンパク質を分泌する形質転換されたグラム陽性細菌であって、
（ａ）PrsAタンパク質をコードする染色体中の多数遺伝子；
（ｂ）PrsAタンパク質をコードする染色体中の野生型遺伝子、及びPrsAタンパク質をコードするプラスミド上の遺伝子；並びに／或いは
（ｃ）PreAタンパク質の発現を増強する改変された調節要素；
を含むことを特徴とする細菌。
バチルス（Bacillus）属の種である、請求項１に記載の細菌。
バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ステアロサームフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）から成る群から選択される種である、請求項２に記載の細菌。
前記細胞外タンパク質が、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、ガラクトシダーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、タンパクジスフィドイソメラーゼ、シクロデキストリングルコノトランスフェラーゼ、フィターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ラクターゼ、ビリルビンオキシダーゼ、キシラナーゼ、抗原性微生物又は原生動物タンパク質、細菌性タンパク質毒素、微生物表面タンパク質、又はウイルスタンパク質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌。
前記細胞外タンパク質がアミラーゼである、請求項４に記載の細菌。
前記細胞外タンパク質が異種又は同種タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細菌。
目的の細胞外タンパク質の製造方法において、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌において前記細胞外タンパク質を発現せしめる、ことを含んで成る方法。
グラム陽性細菌における細胞外タンパク質の分泌を改善する方法において、目的の細胞外タンパク質を分泌するグラム陽性細胞を、適当なポリヌクレオチド構成物により形質転換して、形質転換された細菌を得ることを含んで成り、この形質転換された細菌が、
（ａ）PrsAタンパク質をコードする染色体中の多数遺伝子；
（ｂ）PrsAタンパク質をコードする染色体中の野生型遺伝子、及びPrsAタンパク質をコードするプラスミド上の遺伝子；並びに／或いは
（ｃ）PreAタンパク質の発現を増強する改変された調節要素；
を含むことを特徴とする方法。
前記細菌が、バチルス（Bacillus）属の種である、請求項８に記載の方法。
前記バチルス属細菌が、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ステアロサームフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）から成る群から選択される種である、請求項９に記載の方法。
前記細胞外タンパク質が、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、ガラクトシダーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、タンパクジスフィドイソメラーゼ、シクロデキストリングルコノトランスフェラーゼ、フィターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ラクターゼ、ビリルビンオキシダーゼ、キシラナーゼ、抗原性微生物又は原生動物タンパク質、細菌性タンパク質毒素、微生物表面タンパク質、又はウイルスタンパク質である、請求項８〜10のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外タンパク質がアミラーゼである、請求項11に記載の方法。
前記細胞外タンパク質が異種又は同種タンパク質である、請求項８〜12のいずれか１項に記載の方法。