CN1120853A

CN1120853A - 促进革兰氏阳性细菌中产生商业上重要的外蛋白的方法和系统

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Publication number: CN1120853A
Application number: CN94191732A
Authority: CN
Inventors: V·康丁伦; M·沙瓦斯
Original assignee: Finnish National Public Health Institute
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1996-04-17
Anticipated expiration: 2014-02-25
Also published as: CN1080307C; DE69434807T2; EP0686195A1; DE69434807D1; DK0686195T3; WO1994019471A1; JPH08507207A; US5780261A; EP0686195B1; ATE335083T1; AU6142694A; JP2004350691A; JP4202985B2

Abstract

本发明提供一种提高革兰氏阳性细菌如杆菌属中超产的同源和异源外蛋白的分泌的方法和表达系统。这种方法和表达系统包括在一种也能够超产至少一种有意义外蛋白的革兰氏阳性细菌宿主中超产PrsA蛋白。使用本发明的方法和系统极大地提高了合成的外蛋白向生长培养基中的分泌。一旦这些分泌的外蛋白存在于培养基中，就能直接将其收集和纯化。

Description

促进革兰氏阳性细菌中产生商业上重要的外蛋白的方法和系统

发明领域

本发明涉及一种促进革兰氏阳性细菌，特别是杆菌属的菌种，生产工业上和医学上重要的外蛋白的方法和表达系统。

技术背景

革兰氏阳性细菌是通过细胞膜和细胞壁排出分泌的蛋白质，然后接着释放在外部基质中。另一方面，革兰氏阴性细菌是由两层细胞(或表面)膜包裹着，它们没有细胞壁。在革兰氏阴性细菌中，并没有把排出的大多数蛋白从细胞里释放出去，而是将其停留在内膜胞质空间和外膜中。

在大肠杆菌中已鉴定出这种分泌机制中的两种类型组分：可溶性胞质蛋白和膜相连蛋白(见综述，Wickner等(1991)Annu.Rev.Biochem.，60：101-124)。可溶性胞质蛋白，包括SecB和热休克蛋白，都可以防止所分泌蛋白前体折叠成与分泌物不相溶的构象。膜相连蛋白组包括周围膜蛋白SecA，整合膜蛋白SecY，SecE，SecD，SecF和信号肽酶Lep和Lsp(参见Hayashi，S.和Wu，H.C.(1990)J.Bioenerg.Biomembr.，22：451-471；Dalbey，R.E.(1991)Mol.Microbiol.，5：2855-2860)。这些膜相连蛋白参与与前体的结合和通过胞质膜的转运，然后分离信号肽并释放该蛋白。

有关革兰氏阳性细菌的分泌机理的知识是很有限的。在枯草杆菌(它是遗传上和生理上特征明显的典型微生物菌属)上获得的数据显示出与大肠杆菌上获得的数据完全相似，但也表现出在个组分的结构和特异性上的不同，这可能也反应出由各个细胞外膜的非常不同的组份和结构所设定的要求。

象枯草杆菌，解淀粉芽孢杆菌，地衣型芽孢杆菌这样的革兰氏阳性细菌具有很高的分泌蛋白能力，的确，工业上使用了许多杆菌的细胞外酶。由于在革兰氏阳性细菌中所分泌的蛋白在商业上如此重要，并且由于革兰氏阳性细菌所分泌的蛋白是通过与大肠杆菌非常不同的结构的细胞外膜来转移的，所以在革兰氏阳性细菌中蛋白分泌的分子理论是有相当学术价值的，并且在工业上很重要。

在这方面，我们近来发现枯草杆菌分泌机制的一种新组份，PrsA蛋白(Kontinen，V.P.和Sarvas，M.，(1988)J.Gen.Microbiol.，134：2333-2344；Kontinen，V.P.，等(1991)Mol.Microbiol.，5：1273-1283)。开始是用减少几种外蛋白分泌的非致死性突变来定义编码这种PrsA蛋白的PrsA基因。(Kontinen，V.P.和Sarvas，M.，(1988)J.Gen.Microbiol.，134：2333-2344)。基于克隆PrsA基因的DNA序列和有关该基因和蛋白的后续研究，我们认定PrsA能够编码一种作为伴随物的蛋白(PrsA)，并且它是通过细胞质膜转移的(起初的研究，见Kontinen，V.P.等，(1991)Mol.Microbiol.5：1273-1283)。已经发现PrsA蛋白具有一定量的序列与乳酸球菌的PrtM蛋白同源(30％左右)，其中PrtM蛋白是一种促进排出的丝氨酸蛋白酶成熟的一种蛋白(Haandrikman，A.J.，等(1989)J.Bacteriol.，171：2789-2794；Vos，P.，et al(1989)J.Bacteriol.，171：2795-2802)。我们也已发现PrsA蛋白的类似功能与细菌分泌机制的其它已知蛋白无关，这表明PrsA蛋白是蛋白分泌通道中的一种新型组份，这种组份促进革兰氏阳性细菌中的分泌蛋白在穿过细胞质膜后的释放，并且有可能折叠所分泌的蛋白。

因为在多数情况下，细胞内生产会导致所生产蛋白的聚集，相对来说排出的蛋白常常保留着它们的天然构象，所以在细菌中生产分泌形式的有意义蛋白是有优点的。在细菌中以分泌形式生产工业上和医学上的重要蛋白的其它优点在于这种分泌促进了蛋白产物的纯化。另外，与大肠杆菌不同的是，象杆菌这样的革兰氏阳性细菌不含有类似脂多糖的毒性化合物，这使得它们特别适合宿主来生产医学和药学上的蛋白。

由于对工业化生产许多外酶如α－淀粉酶，蛋白酶和脂肪酶中所用的革兰氏阳性杆状菌株的改良，分泌蛋白的产率增长是非常显著的。到目前为止采用的对策一直是过度表达适当的基因。现在已有完成这一目的公知和容易实现的方法，例如，使用多拷贝质粒的方法来增加基因的表达或者修饰其调节成份如使用强启动子或多启动子来提高基因的活性。这种方法已经实现了外蛋白合成的显著增加，使合成的增长达到了由于分泌机制的限制而不能进一步增大的水平。在增加合成的同时平行增加分泌能力应当是最理想的。但是至今这些都还是不可能的。

本发明的一个目的就是克服革兰氏阳性细菌中分泌机制的这种限制，并提供一种方法和一种系统，通过该方法和系统提高从革兰氏阳性细菌如杆菌中正常分泌蛋白的含量，同时促进特定的同源或异源有意义蛋白的表达超过在未改良的或野生型微生物中正常生产的量。

本发明的另一个目的是描述能用来促进各种商业上重要蛋白的生产的细菌宿主和质粒。

概述

本发明提供了一种方法和表达系统，它们在增加同源或异源蛋白表达的同时，能够提高革兰氏阳性细菌(如杆菌属)正常分泌同源或异源蛋白的含量，使之超过未改良的或野生型微生物所生产的未改良的或野生型的量。

本发明的方法和系统包括在能够超产至少一种同源或异源外蛋白的革兰氏阳性细菌宿主中超产PrsA蛋白或其功能性同源物质。按照本发明的教导，超产是指高于野生型的产量，即高于野生型细菌正常生产蛋白(PrsA或其功能性同源物质，或者有意义的外蛋白)的量。按照本发明，超产也是用本领域公知的一般方法来实现的，例如，可以使用在宿主染色体中多拷贝质粒，多拷贝编码PrsA或其功能性同源物质和/或有意义外蛋白的基因，结合使用改变调节组份来增加表达，例如使用强启动子，使用多倍启动子，使用强化因子等。使用本发明的方法和系统可以极大地提高合成蛋白向生产培养基的分泌，例如比对照组多5-10倍。一旦这些分泌的外蛋白存在于生产培养基中，就可以直接将其收集和纯化。

本发明的表达系统包括一种革兰氏阳性细菌如杆菌菌种的宿主，它能够表达高于PrsA蛋白，或其功能性同源物质的野生型产量，和高于一种有意义外蛋白如α－淀粉酶，枯草杆菌蛋白酶，肺炎球菌溶血素，脂肪酶，或者其它有商业价值的外蛋白酶的野生型产量。本发明的方法包括使用这种表达系统来提高在革兰氏阳性细菌中生产商业上重要的外蛋白。按照该方法，能在超量表达(即，表达高于野生型细菌的产量)PrsA蛋白或其一种功能性同源物质的革兰氏阳性细菌宿主中超量表达至少一种有意义的外蛋白。按照本发明的教导，PrsA蛋白的功能性同源物质是指这样一种蛋白，当超量表达这种蛋白时它能够提高革兰氏阳性细菌分泌有意义外蛋白的分泌能力。按照本发明的教导，PrsA的功能性同源物质也能用好几种方法来识别，这些方法包括与prsA或PrsA的序列同源性，与高效价抗－PrsA抗体的免疫反应，和/或功能上，即，是一种当超量表达这种蛋白时能够提高一种革兰氏阳性细菌分泌有意义外蛋白的能力的蛋白质。

转化革兰氏阳性细菌如杆菌种类的宿主，使其能够生产高于PrsA蛋白的野生型产量的一种优选方法是用载有枯草杆菌的PrsA基因的质粒pKTH277转化宿主。也能构建载有编码PrsA蛋白的功能性同源物的基因的类似质粒。使用这些质粒转化宿主革兰氏阳性细菌，使其超产PrsA的功能性同源物。一旦设计出能超产PrsA同源物(也可以指类PrsA蛋白)的宿主革兰氏阳性细菌，按照本发明，就能够使用它们提高高产的有意义外蛋白的分泌。

本发明也公开并包括与我们的发现有关的方法和构件，这种发现即用增加能够表达高于有意义外蛋白的野生型产量的革兰氏阳性宿主中细胞PrsA蛋白或其功能性同源物的含量的方法能够促进革兰氏阳性细菌的分泌。

一方面本发明包括了一种促进革兰氏阳性细菌分泌外蛋白的表达系统，它包括一种革兰氏阳性细菌，这种细菌既能表达高于野生型产量的PrsA蛋白或其功能性同源物，又能表达高于野生型产量的至少一种有意义外蛋白。

另一方面本发明也包括了一种革兰氏阳性细菌，它能够表达高于野生型产量的至少一种有意义的外蛋白并又含有pKTH277。

再一方面本发明还包括一种革兰氏阳性细菌，它能够表达高于野生型产量的至少一种有意义外蛋白，并且还至少含有下列之一：至少两个拷贝的来源于枯草杆菌的prsA基因，或其一种功能同源物；来自枯草杆菌中的prsA基因，或其一种功能同源物，它们与导致超量表达所述prsA基因(或其功能同源物)的强调节序列人工相连。

本发明还包括一种DNA构件，它含有在能引起超量表达所述的prsA基因或其功能性同源物的表达信号控制下的来自枯草杆菌的prsA基因或其一种功能性同源物，以及一种载体，它也含有在能引起超量表达所述的prsA基因或其功能性同源物的表达信号控制下的来自枯草杆菌的prsA基因，或其一种功能性同源物。

再一方面，本发明还包括一种促进革兰氏阳性细菌中分泌有意义外蛋白的方法，它包括在该革兰氏阳性细菌中表达高于野生型产量的来源于枯草杆菌的PrsA蛋白或其功能同源物，其中该革兰氏阳性细菌也能够表达高于野生型产量的外蛋白。

本发明还包括刨造一种改良的非枯草杆菌革兰氏阳性宿主微生物的方法，该微生物适用于促进在宿主微生物中超量表达的有意义外蛋白的分泌，这种方法包括(a)从宿主微生物中识别一种能编码来源于枯草杆菌的PrsA蛋白的功能性同源物的基因，和(b)至少用下列之一的方法促进步骤(a)中所识别基因的表达：向该宿主微生物中导入至少一个额外拷贝的这种基因，向该宿主微生物中导入可以与导致超量表达该基因的表达序列相连的这种基因。

本发明还包括一种识别编码来源于枯草杆菌的PrsA功能性同源物的基因的方法，该方法包括用Southern印迹法识别能与枯草杆菌prsA基因的DNA探针杂交的DNA，并且证实该基因能编码这样一种蛋白，即，当超量表达这种蛋白时它能够提高一种革兰氏阳性细菌分泌有意义外蛋白的分泌能力。

本发明还包括一种识别编码枯草杆菌PrsA的功能性同源物的基因的方法，该方法包括识别能与高效价抗PrsA抗体反应的蛋白，并且证实当该蛋白在一种革兰氏阳性细菌中的含量高于野生型含量时，该蛋白能够提高该革兰氏阳性细菌分泌有意义外蛋白的分泌能力。

用下列详细说明，实施例，方法和物质以及所附的权利要求将会更好地理解本发明的这些和其它特征，目的和优点。

详细说明

当革兰氏阳性细菌如杆菌属中所排出的蛋白的表达量(合成)较高时，分泌器官的能力是蛋白分泌和以分泌形式生产这类蛋白的一个限制因素。本发明提供了一种克服这种限制或障碍的系统和方法。

本发明是以我们最初的惊奇发现为基础的，这种发现就是在能够表达高于野生型量的有意义外蛋白的革兰氏阳性细菌宿主中仅通过增加杆菌排出机制中的一种组份的含量，即细胞PrsA蛋白或其功能性同源物的含量，就能够促进革兰氏阳性细菌如杆菌属的菌种中的分泌。不管革兰氏阳性细菌宿主中的有意义蛋白是如何超产的，本发明的方法和系统均可适用。所以使用该方法和系统能够改良现在工业上使用的各种超产的商用菌株。

任何一种革兰氏阳性细菌都能够使用本发明的方法和系统。优选杆菌属细菌。特别优选嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌，短杆菌，环状芽孢杆菌，凝固芽孢杆菌，B.lautus，B.lentus，地衣型芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草杆菌和苏云金芽孢杆菌。

任何所需的有意义外蛋白也能够使用本发明的方法和系统。以下列出了本发明的方法和系统可生产的有意义外蛋白的例子，其中典型的外蛋白可以用种类来表示。

微生物和原生动物门的抗原蛋白：来自任何革兰氏阴性细菌的荚膜，外膜和菌毛蛋白，但特别是来自下列细菌的那些蛋白：脆弱拟杆菌，梭形杆菌属，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，Branhamellia catarrhalis，大肠杆菌，肺炎杆菌，霍乱弧菌，奇异变形杆菌，绿脓杆菌，灵杆菌，Legionellapneumophila，淋病双球菌，脑膜炎双球菌，鼠伤寒沙门氏菌，伤寒杆菌，乙型副伤寒杆菌，结核杆菌，沙眼衣原体和志贺氏杆菌属。

来自任何细菌的蛋白毒素或分泌的蛋白，特别是来自下列细菌的蛋白毒素或分泌的蛋白：金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，梭状芽孢杆菌属，大肠杆菌，鼠疫耶尔森氏菌，霍乱弧菌，百日咳杆菌，酿脓链球菌的M－蛋白，Stretococcus mutane分泌的酶。

任何微生物的表面蛋白，特别是下列(各个生长期的)微生物的表面蛋白：变形体属，弓形体属，利什曼属，血吸虫属，锥虫属，链球菌属的粘着蛋白，和金黄色葡萄球菌的粘着蛋白。

病毒的抗原蛋白：粘液病毒(流感病毒A H1-H12，流感病毒B，流感病毒C)的HA和NA蛋白；副粘液病毒(副流感病毒1-4，新城疫病毒，麻疹病毒，呼吸合胞体病毒，腮腺炎病毒，瘟热病毒)的HN和F蛋白；狂犬病病毒的G蛋白；病毒(Chikunguhya，Western，Easter，委内瑞拉马脑炎病毒，O′nyong-nyong病毒，Semlikl Forest病毒，Sindbls病毒)的E1和E2蛋白；黄素病毒(Denque 1-4，日本脑炎病毒，螨脑炎病毒，Murray Valley脑炎病毒，Kyasanur Forest疾病病毒，Looping病病毒，Omsk出血热病毒)的V1和V3蛋白；德国麻疹病毒的表面蛋白；HogCholera病毒的表面蛋白；马关节炎病毒的表面蛋白；Bunya病毒(Rift Valley发热病毒，Crimean出血热病毒，加利弗尼亚脑炎病毒；Phlebotomus发热病毒)的G1和G2蛋白；沙粒病毒(拉萨发热病毒，淋巴细胞性绒膜脑膜炎病毒)的G1和G2蛋白Picorna病毒(脊髓灰质炎1-3，柯萨奇A病毒1-24，柯萨奇B病毒1-6，ECHO病毒1-8，11-34，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人鼻病毒1-113)的蛋白V1-V4；轮纹孔板病毒的表面蛋白；疱疹病毒(HSV1，2，细胞肥大病毒，Epstein-Barr病毒，马顿挫病毒)的表面蛋白；papova病毒(BK病毒，人瘤病毒)的VP1-VP3蛋白；细小病毒(水貂肠炎病毒，牛细小病毒，猫细小病毒，猪细小病毒)的p蛋白；人乙型肝炎病毒的结构蛋白；Ebola和Marburg病毒的表面蛋白；和腺病毒(人腺病毒1-33)的纤维蛋白，异己酮，缬烯炔。

工业用酶：就工业用重要酶而言，这种酶可以是淀粉分解酶，脂肪分解酶和蛋白分解酶，糖酶，转换酶，异构酶，过氧化物酶，氧化还原酶，氧化酶等。更具体地说，这种有意义的酶可以是一种蛋白酶，脂肪酶，角质酶，淀粉酶，半乳糖酶，支链淀粉酶，纤维素酶，葡糖异构酶，蛋白质二硫化物异构酶，CGT酶(环糊精葡糖酸转移酶)，植酸酶，葡糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，胆红素氧化酶，或者木聚糖酶。不作为限定用的例子有：α-淀粉酶，氨基酸酰基转移酶，淀粉转葡糖苷酶，菠萝蛋白酶，phisine，β-半乳糖酶，β-葡聚糖酶，葡糖异构酶，葡糖氧化酶，半纤维素酶，转化酶，触酶，胶原酶，木聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，柚皮苷酶，胰酶，木瓜蛋白酶，果胶酶，青霉素酰胺酶，胃蛋白酶，蛋白酶，支链淀粉酶，异构淀粉酶，凝乳酶，核糖核酸酶，纤维素酶，链激酶和胰蛋白酶。

也能够生产医学上有意义的蛋白。这类蛋白包括诊断抗原，能用作疫苗和药物的蛋白。

按照本发明的教导，有意义的外蛋白不必是天然外蛋白，但可以是用基因工程技术设计和创造的用作外蛋白的新蛋白。例如，在编码构件蛋白的序列中加入一段信号序列的方法能够将一种菌种的正常非分泌蛋白(或者是所设计出的非天然蛋白)设计成外蛋白。在一种革兰氏阳性细菌如杆菌菌种中能够表达这些所设计的外蛋白，其中的革兰氏阳性细菌能够超量表达PrsA蛋白或其一种功能性同源物。使用这种方式的本发明方法能够提高这些非天然的或者所设计的有意义蛋白的分泌。

我们现在讨论本发明的目的，为了说明本发明的一个实施方案，我们展示了超量表达枯草杆菌的prsA基因对两种工业上重要的外酶，α-淀粉酶和枯草杆菌蛋白酶，的分泌所产生的影响。在这些研究中，把含有枯草杆菌的完整prsA基因的一个5.3KB插头克隆到一种低复制数的往反性质粒(pKTH277)中，然后使用这种质粒把prsA的额外的拷贝导入到枯草杆菌。(枯草杆菌的prsA基因的DNA和所推断出的氨基酸序列以入藏号X57271存在于EMBL/GenBank/DDBJ核苷酸序列数据库中)。(把来源于pKTH268的5.3KB EcoRI-BamHI片断与用相关限制性内切酶消化的使其线性化的低复制数目的往返性质粒pHP13连接在一起，并将它们转化到大肠杆菌TG1而获得pKTH277。pKTH268和pKTH277的大小分别为8.5KB和10.2KB。也可以参见在这里用作参考文献的Kontinen等(1991)Mol.Microbiol.，5：1273-1283)。枯草杆菌中pKTH277的存在能增加与PrsA蛋白对应的蛋白产量大约10倍于野生型产量。当在含有这些增加了PrsA蛋白含量的杆菌菌株中表达所分泌的不同蛋白的基因时，随之也大量增加了分泌到培养基中的蛋白含量。例如，在这种系统中已发现解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的分泌增加了2.5倍，地衣形芽孢杆菌的耐热性α-淀粉酶的分泌含量提高了6倍，以及地衣形芽孢杆菌中分泌的枯草杆菌蛋白酶(碱性蛋白酶)也比对照组含量高两倍。

在这些研究中，通过把编码外蛋白的基因置于一个多拷贝的质粒中，或者将其插入宿主的染色体中的方法，在宿主菌株中以有可能使分泌机制达到饱和的量来超量表达这种外酶。(在这些研究中，编码这种外酶的全部多拷贝质粒都是pUB110的衍生物，能使其在相同宿主细胞中进行复制，其中pUB110属于与往返式质粒pKTH277不同的不相容的类型)。在多数情况下，用recE4宿主菌株来进一步增强这些质粒的稳定性，防止相同序列间的有效重组(Dubnau等，1973；Keggins等，1978)。

为详细说明本发明内容所研究的第一种外酶是用pKTH10编码的解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)(Palva，I.(1982a)Gene，19：81-87；Palva，I.，等，(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：5582-5566)。我们发现在高产这种α-淀粉酶的野生型菌株中，pKTH277的存在确实提高了整个静止生长期中α-淀粉酶的分泌，大约2.5-3倍于没有超量表达PrsA的对照菌株的含量。在生长24小时后发现培养基上清液中α-淀粉酶的浓度最高(大约3400毫克/毫升)。在不含pKTH277时，该菌株仅分泌1200毫克/毫升。当从一个拷贝的amyE基因表达α-淀粉酶时也获得了性质上相似的结果，其中这种amyE基因被插入到染色体中，并且由于修饰调节而进行了大量转录。

我们所试验的第二种外蛋白是地衣形芽孢杆菌的耐热性α-淀粉酶(AmyL)，即工业上重要的主要液化α-淀粉酶(Ortlepp等，1983；Diderichsen，B.，等，(1991)Res.Microbiol.，142，793-796)。由以解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子和信号序列为基础的分泌载体表达适宜的基因，实现了在枯草杆菌中以类似于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的量分泌AmyL酶(Palva，I.(1982)Gene，19：81-87；Palva，I.，等，(1982)Proc.Nati.Acad.Sci.USA，79：5582-5586)；Sibakow，M.(1986)Eur.J.Biochem.，1sS，577-581)。把pKTH277导入一个这类菌株中(形成IH6760)增加了该培养基中α-淀粉酶的含量大约6倍，从指数生长晚期到45小时培养可见到有相似的区别。

碱性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，是一种不同类型的外蛋白，它的前体除了信号序列外还含有一个进一步延伸的前序列(Wells，等，(1983)Nucleic.Acids Res.11：7911-7925；Wong，S.L.，等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1884-11188)。通过比较两种菌株，一种是含增长量的PrsA的菌株(IH6789)，另一种是野生型含量的菌株，来研究PrsA的增长量对其分泌的作用。二者均分泌地衣形芽孢杆菌的异源枯草杆菌蛋白酶(SubC可用作洗衣粉，是一种重要的工业产品)，它们是用多拷贝质粒pMJ57来编码的(Hastrup，S.和Jacobs，M.F.(1990)In Zukowski，M.M.，等，(eds.)，Lethal phenotype conferred by xylose-inducedoverproduction of apr-lacz fusion protein，Vol.3.AcademicPress，Inc.，San Diego，California，PP.33-41)。在这个质粒中subC基因是在一种木糖可诱导启动子控制下。当完全诱导时，比较这两种菌株分泌的枯草杆菌蛋白酶表明，在全部时间测定点IH6789(增长量的PrsA)的培养基上清液中它的含量大约高于对照IH6788的两倍。

我们也研究了pKTH277对不含有可引起高分泌的质粒的菌株中内源性外酶的天然低水平分泌作用。在指数生长晚期或整夜培养中所分泌的α-淀粉酶和总蛋白酶的量与载有pKTH277的菌株或克隆载体pHP13中的量是相同的。基于这些结果表明增长量的PrsA蛋白只能促进高产的外酶分泌。

为确认PrsA在由上述质粒中5.3kb片断所引起的提高中的作用，我们通过在prsA基因(在382位核苷酸)的EcoRV位点处插入来激活质粒pKTH277中prsA的基因。在pKTH3261中，所插入的是在侧面带有翻译终止密码子的地衣形芽孢杆菌的blaP基因的560bp片断，而在pKTH3262中所插入的是入噬菌体的4.6kb EcoRV片断。SDS-PAGE分析载有这些质粒的大肠杆菌的全部细胞蛋白发现没有这二者质粒之一表达的完整大小的PrsA蛋白，和一种推断的由pKTH3261表达的所预料大小(14 KDa)的平头PrsA(数据没有显示)。作为对照，我们构建了pKTH3253，其中从prsA下游1.9kbp处平载5.3kbp片断，并保留该基因完整。在枯草杆菌(载有pKTH 10的IH6624)中，prsA中含有一种插入物的两种质粒都不能提高α-淀粉酶的分泌，而pKTH3253却能。

由超产prsA所得到的提高了的分泌对大规模工业生产外酶是明显有益的。在这方面使用中，有时最好避免使用潜在不稳定的多拷贝质粒。一种方法是把一个或几个外酶结构基因拷贝插入染色体中，同时改变它的调节组份来增加表达。所以我们测试了PrsA的超产对这类系统中α-淀粉酶的分泌的作用，其中在与超量表达DegQ的菌株中(A.Palva，个体传染)的调节蛋白DegQ的靶序列融合的染色体中插入一个拷贝的amyE。在该菌株中增加PrsA蛋白的含量使α-淀粉酶的分泌提高了3倍(表1，菌株BRB764和IH67703)。这表明不论使用什么方法获得靶基因的表达增加，当外蛋白的表达的起始含量较高时就能实现分泌的提高。

现在讨论革兰氏阳性细菌而不是枯草杆菌中含有PrsA，我们已证实在其它菌种如解淀粉芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌中也含有PrsA或其同源物。在解淀粉芽孢杆菌中PrsA蛋白的含量与枯草杆菌细胞中的含量相似，而地衣形芽孢杆菌中的PrsA蛋白的含量似乎较低。此外在这些革兰氏阳性杆菌菌株中分泌机制的组份与枯草杆菌的相似。在生产分泌出的蛋白酶和淀粉酶的大规模工业生产工艺中解淀粉芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌是杆菌中使用最普遍的两种。用超产PrsA蛋白来增加同源和异源有意义外蛋白的分泌的本发明方法尤其可用于这类菌株中。

作为本发明的一部分，我们也教导在其它革兰氏阳性细菌中如何识别PrsA蛋白和/或prsA基因，和枯草杆菌的prsA蛋白功能性同源物的存在以及它们在本发明的方法和系统是如何使用的。用高效价的抗-PrsA抗体能够在其它革兰氏阳性细菌中识别枯草杆菌的PrsA蛋白的功能性同源物。另一方面，用prsA基因的探针或prsA基因的片段通过Southern印迹方法能够识别编码枯草杆菌的PrsA蛋白的功能性同源物的prsA基因或类-prsA基因的同源物。如果发现有类PrsA蛋白存在，但是没有足够的与prsA基因或PrsA蛋白同源的物质可供用PrsA蛋白的特异性抗体或者含有prsA基因同源序列的DNA探针明确测出，那么能够将同源的基因定位并克隆，这样就能进行明确的测定。

尽管如此，在大多数情况下，还是能够用PrsA蛋白的特异性抗体或含有prsA基因同源序列的DNA探针发现同源的蛋白和基因。对免疫识别来说，能够使用免疫印迹法(Western印迹法)来测定具有高效价抗PrsA抗体的PrsA蛋白。用枯草杆菌的PrsA蛋白，或优选用比枯草杆菌更接近于有意义种类的其它种类的PrsA蛋白同源物通过给一种合适的动物(如兔子)免疫接种的方法生产抗血清。为了识别PrsA，可在各种生长培养基上培养有意义细菌，但最好是在有最小量的蛋白酶诱导的培养基上培养该细菌。最好在含有最小量蛋白酶的生长期时收集细菌细胞，并用一种适合于该菌种的方法(一般是将酶处理，声波物理破碎法，French细胞加压法或玻璃珠剪切的方法结合使用)破碎细胞。用常规方法在SDS-PAGE中电泳用超速离心制备的各种大小的破碎细胞和完整细胞破碎后的微粒部分的样本，把蛋白转移到膜过滤器，用抗PrsA抗血清和标记的第二种抗体进行测定。(如果制备了微粒部分的话，那么能够测得的PrsA蛋白量更少)。在这些所有的步骤中能够使用常规方法和商品试剂。

使用Southern印迹法能够识别在有意义菌种中编码prsA功能性同源物的prsA基因或类-prsA基因。在这种方法中，按照Southern杂交的标准方法使prsA基因的适当DNA探针与适当断裂过的和电泳过的有意义菌种的染色体DNA进行杂交。杂交的探针可以是含枯草杆菌prsA基因的任意DNA片断，或者该基因的片断，或者是含有其它菌种prsA基因同源物的DNA片断或者是该基因的片断。一旦识别，就能对prsA基因的同源物进行测序以进一步确定它的特性。

本发明的教导不仅包括超量表达枯草杆菌的PrsA蛋白，而且也包括在革兰氏阳性有意义菌种中超量生产枯草杆菌的PrsA蛋白的一种功能性同源物。按照本发明的教导，把枯草杆菌的prsA基因或者其它菌种包括该宿主菌种的prsA基因同源物导入该宿主菌种中。为高水平(但非致死性)表达prsA基因，使prsA基因或其同源物处于有意义菌种中的活性表达信号控制下。用各种方法都能完成这一目的，这些方法包括：

(1)质粒pKTH277向有意义菌种的转移。用任意适合于该菌种的转化方法象转化，转导，原生质体的转化，电击穿或结合都能实现这种转移。在除杆菌外的许多其它革兰氏阳性菌种中把pKTH277留作多拷贝质粒，并且该质粒中prsA基因的表达信号在许多革兰氏阳性菌种中是有活性的。

(2)把pKTH277的5.3kb Sacl片断插入任何有意义菌种相容的其它质粒中，并且以适当的拷贝数保留下来，这种拷贝数目是与在该菌种中枯草杆菌的prsA基因的活性相比能较高但非致死量的表达prsA。然后用任何适合于那个菌种的转化方法把这种质粒转移到那个菌种中。或者插入该质粒的DNA片段能够含有一种具有其表达信号的其它菌种的prsA基因同源物。

(3)在那种质粒的表达信号控制下，把编码信号序列和prsA蛋白的成熟部分的pKTH277的DNA片断插入适合于有意义菌种的表达载体中，使其能够完成高产量地表达prsA。如上所述，适当的片段可来自另一种菌种的prsA基因同源物。

(4)可以将上述(2)和(3)段中DNA的构件插入有意义菌种的染色体中，而不是质粒中。在这种情况下，虽然每个基因组中仅有一个基因拷贝，但必须选择足以确保高产量表达prsA的表达信号。

作为发明人同时也是基础科学家，在实验室或模拟工业条件下进行了设计和必要量的工作。尽管如此，在工业上共同研究者的帮助下，已经表明在工业发酵条件下，本发明的方法和系统对于商业上使用的菌株运行的非常好。

下面所包括的我们研究中使用的方法和材料以及本发明的实施例将进一步帮助本领域熟练技术人员实施本发明的方法和系统。

材料和方法

细菌菌株和质粒

表1中显示了枯草杆菌的prs突变体Marburg 168和其亲本菌株。也列出了超量表达PrsA蛋白的枯草杆菌和大肠杆菌的菌株，以及由于增加了细胞内PrsA蛋白的含量而提高了外酶分泌的枯草杆菌菌株及其适当的对照菌株。用作带有质粒载体的克隆宿主的大肠杆菌菌株是HB101，TG1和DHScc(Sambrook J.等，(1989)Molecularcloning.A laboratory manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)和lambda，KW251(Promega，Madison，Wisconsin)。

用pHP13(Haima，P.，等，(1987)Mol.Gen.Genet.，209：335-342，pJH101(Ferrarl，F.A.，等，(1983)J.Bactoriol.，154：1513-1515)，pGEM 3 zf(+)(Promega)和pDR540(Pharmacia，Upsaia，Sweden)作为prsA基因或其片段的克隆载体。表2中列出了这些质粒载体和所构建的载有含5.3kb(pTKH277和pKTH268)或3.4kb(pKTH3253)插入物的prsA基因的衍生质粒的特性。在prsA的ORF的单一EcoRV位点处插入一个来源于地衣形芽孢杆菌blaP基因的片段(0.5kb)或者入噬菌体基因组的片断(4.6kb)来断裂pKTH3253的prsA基因(所得到的质粒是pKTH3261和pKTH3262)。pKTH10(Palva，1，(1982a)Gene，19：81-87；Palva，I.，等，(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：5582-5586)和pMJ57(Hastrup，S.和Jacobs，M.F.(1990)in Zukowski，M.M.，等.，(eds.)，Lethal phenotype conferred by xylose-inducedoverproduction of apr-lacZ fusion protein，vol.3 AcademicPress，Inc.，San Diego，California，pp.33-41)分别是能够大量生产分泌到外培养基的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)和地衣形芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(SubC)的多拷贝质粒。已经构建了能在枯草杆菌的分泌载体系统中克隆地衣形芽孢杆菌的amyL基因的pKTH1582(BRB360 in Sibakov，M.(1986)Eur.J.Biochem.，1sS，577-581；Palva，I.(1982a)Gene，19：81-87；Palva，I.，等，(1982b)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 79：5582-5586)。

培养基和培养条件

在37℃下振荡的改良型L-液体培养基(1％胰胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中，或者在37℃下含15％琼脂(Difco，Detroit，Michigan)和适宜的抗菌素的L-平板培养基上(Kontinen，V.P.，等，(1991)Mol.Microbiol.5：1273-1283)培养细菌；对α-淀粉酶来说改良平板培养基为含5％淀粉和2.5％琼脂，而对枯草杆菌蛋白酶超量表达菌株来说改良平板培养基为含0.2％木糖和1％奶粉。用2％溶解淀粉(Merck，Darmstadt，Germany)补给L-培养基或者将其用作生产外酶的2倍浓缩培养基。在含1％奶粉的L-平板培养基上培养生产枯草杆菌蛋白酶的菌株。在有力振荡的两倍浓缩L-液体培养基中研究外酶的生产。用66号滤头的Klettsummerson比色计(Klett Manufacturing Co.，Inc.N.Y.)测量培养液的浊度来表示生长。

酶的测定

如Kontinen，V.P.和Sarvas，M.，(1988)J.Gen.Microbiol.，134：2333-2344所述的用Phadebas药片(Pharmacia)测定α-淀粉酶。对平皿测定法来说，把细菌在含5％淀粉的L-平皿上划线接种，在4℃培育平皿后测定菌落周围的晕圈。生产内生α-淀粉酶的野生型菌落周围没有晕圈，而对于载有pKTH10的菌株来说根据平皿的培养时间长短其晕圈直径大于2mm。在1ml的0.1M Tris-0.01MCaCl₂(pH8.0)中用-种产色性肽底物琥珀酰-AlaAla-Pro-Phe-对硝基苯胺测定地衣形芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶和染色体编码的蛋白酶(Del Mar，E.G.，等，(1979)Anal.Biochem.，99：316-320)。在一台Hewlett Packard二极管排列的分光光度计上410nm处测定水解率。或者用((Kontinen，V.P.和Sarvas，M.，(1988)J.Gen.Microbiol.，134：2333-2344)所述的方法或者用考马斯兰染色的SDS-PAGE方法评估培养基上清液的试样中α-淀粉酶和枯草杆菌蛋白酶的含量来测定它们的特殊活性。酶的含量用微克/毫升表示。表1.细菌菌株菌株编号相关基因型和特性亲本菌株或来源枯草杆菌IH6064 metB5 sacA321 (Sibakov et al.，1983)IH6090 his metBS sac321 IH6064IH6157 IH6090(pKTH10) IH6090IH6160 IH6064(pKTH10) IH6064IH6480 prs-3 metB5 sacA321(pKTH10) IH6157IH8482 prs-29 metB5 sacA321(pKTH10) IH6157IH6483 prs-33 metB5 sacA321(pKTH10) IH6157IH6484 prs-40 metB5 sacA321(pKTH10) IH6157IH6485 prs-3 metB5 sacA321 IH6480IH6487 prs40 metB5 sacA321 IH6484IH6489 prs-11 metB5 sacA321(pKTH10) IH6160IH6491 prs-13 metBS sacA321(pKTH10) IH6160IH6494 prs-33 metB5 sacA321 IH6483IH6497 prs-26 metB5 sacA321(pKTH10) IH6157IH6498 prs-13 metB5 sacA321 IH6491IH6501 prs-26 metB5 sacA321 IH6497IH6504 prs-11 metB5 sacA321 IH6489IH6513 QB917(pKTH10) QB917IH6521 prs-13hisAl trpC2(pKTH10) IH6513IH6523 prs-11 metB5 sacA321(pKTH10) IH8513IH6622 IH6624(pKTH277) IH6624IH6623 IH8824(pHP13) IH6624IH6624 PSLI(pKTH10) PSLIIH6654 prs-29 metB5 sacA321 IH6482IH6752 PSLI(pMJ57) PSLIIH6755 PSLI(pHP13) PSLIIH6757 PSLI(pKTH1582) PSLIIH6759 IH6755(pHP13) IH6755IH6760 IH6757(pKTH277) IH6757IH6770 BRB764(pKTH277) BRB764IH6774 IH6180(pKTH277) IH8160IH6788 IH8752(pKTH3229) IH6752IH6789 IH6752(pKTH3230) IH6752PSLI arg(GH)15，leuA8，rm-，recE4， IA510 in BGSC

stp，thrAQB917 hisAl thr-5 trpC2 IA10 in BGSCBRB764 ∷Φ(′P_mos′-amyE)(pKTH1743) A.Palva，Unlverslty

of Helsinkl枯草杆菌IH6559 prsA29，recE4，trpC2(∷pKTH1601) Kontinen et al，1991IH6799 IH6064(∷pKTH3200) IH6064IH6811 IH6624(pKTH3253) IH6624IH8812 IH6624(pKTH3261) IH6824IH6813 IH6624(pKTH3262) IH6624大肠杆菌EH1568 HBIOI(pKTH268) HBIOI

EH1581 DH5α(pKTH3101) DH5α

EH1631 TGI(pKTH3180) TGI

EH1639 TGI(pGEM3zf(+)) TGI

EH1640 TGl(pDR540) TGI

EH1674 TGI(pKTH277) TGI

EH1675 TGI(pKTH3253) TGI

EH1678 TGI(pKTH3261) TG1

EH1679 TGI(pKTH3282) TGI

1)pKTH1743是载有插入到枯草杆菌decQ基因ORF的一个0.3kbp插入物的pUB110的衍生物。

2)细菌基因保藏中心，俄亥俄州立大学，俄亥俄。表2.质粒质粒号所克隆的基因衍生物的

和抗性标识 (来源和/或参考文献)pKTH10 amyE neo pUB110(Palva，1982；

Gryczan et al.，1978)pKTH268 prsA bla pGEM3zf(+)(Promega；

Sambrook et al.，1989)pKTH277 prsA cat ermC pHP13(Halma et al.，1987)pKTH1582 amyL neo pUB110(I.Palva；

Slbakov，1986)pKTH1743 degQ neo pUB110(A.Palva)pKTH1786 bla cat neo pAMβI(M.Simonen；

Leblanc and Lee，1984)pKTH3101 ′prsA bla pKTH268pKTH3180 O/P_tae-′prsA bla pDR540(Pharmacla)pKTH3229 ermC pHP13pKTH3230 prsA ermC pKTH3229pKTH3253 prsA cat ermC pHP13pKTH3261 0.5kb insert in prsA pKTH3253

cat ermCpKTH3262 4.5kb insert in prsA pKTH3253

cat ermCpJH101 bla cat tet (Ferrarl et al.，1983)pMJ57 O/P_xyn-′subC cat pUB110(Hastrup and

Jacobs，1990

实施例

实施例1

当PrsA蛋白含量增加时枯草杆菌

中α-淀粉酶的分泌提高

下列表(表3)详细说明了当革兰氏阳性细菌宿主也超量表达PrsA蛋白时在不同条件下枯草杆菌中的α-淀粉酶的分泌提高。

表3.通过超量表达PrsA蛋白来提高枯草杆菌中α-

淀粉酶的分泌

菌株号	表达α-淀粉酶的基因所在处	质粒PrsA的表达来源	所分泌的α-淀粉酶μg/ml^a)
		质粒PrsA的表达来源		质粒号质粒中prsA基因
		IH6160IH6774		质粒号质粒中prsA基因	多拷贝质粒^a)	—pKTH277 完整的	10003100
BRB764IH6770	染色体b)	IH6160IH6774	—pKTH277 完整的	6302000	多拷贝质粒^a)	—pKTH277 完整的	10003100
BRB764IH6770	染色体b)	IH6811IH6812IH6813	—pKTH277 完整的	6302000	多拷贝质粒^a)	pKTH3253 完整的pKTH3261 断裂的pKTH3282 断裂的	370013001400

a)含解淀粉芽孢杆菌的amyE的pKTH10

b)在增强活性的启动子下的amyE的一个拷贝

c)在静止生长晚期测定培养基上清液中α-淀粉酶的活性

实施例2

当较高表达PrsA蛋白时解淀粉酶芽孢杆菌

中α-淀粉酶分泌的提高

本实施例证实了当革兰氏阳性细菌宿主也较高表达PrsA蛋白时在解淀粉酶芽孢杆菌中超产枯草杆菌的PrsA蛋白的作用。

ALK02732是ALK02100的一个衍生物，它含有编码解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的多拷贝质粒pKTH10，所以该菌株含有10个拷贝的α-淀粉酶基因，并能比野生型菌株ALK02100多分泌约20倍的α-淀粉酶(Vehmaanpera等，J.Biotechnd，1991，19，221-240)。用抗PrsA抗血清对ALK02732的细胞进行免疫印迹表明ALK02732中PrsA蛋白的含量与ALK02100中的含量一样少，参见下文。所以PrsA限制了ALK02732中蛋白分泌的速率。

用电击穿法把质粒pKTH277转移到解淀粉芽孢杆菌菌株ALK02732制得ALK02732(pKTH277)。如免疫印迹法所测得的，ALK02732(pKTH277)中PrsA的含量比ALK02732中的含量高出许多倍。这与用pKTH277转化的枯草杆菌菌株中PrsA蛋白的相似增长非常一致。

在对数生长期和早期静止生长期(摇瓶培养)期间测定由ALK02732和ALK02732(pKTH277)向生长培养基(含2％可溶性淀粉的双倍浓度的Luria液体培养基)分泌的α-淀粉酶的含量。在表4-1(实施例1)和4-2(实施例2)中显示了结果。可以看出在这两种分离实验中ALK02732(pKTH277)的培养基中α-淀粉酶的含量是ALK02732培养基中的1.5倍到2.5倍。表4-1和4-2.pKTH277对解淀粉芽孢杆菌(ALK02732)

分泌α-淀粉酶的作用表4-1，实验1.

时间(h)3	ALK02732		ALK02732(pKTH277)
	ALK02732		ALK02732(pKTH277)		生长′106	α-淀粉酶(mg/l)1，1	生长′100	α-淀粉酶(mg/l)1，1
	4	241	8，8	240	生长′106	α-淀粉酶(mg/l)1，1	生长′100	α-淀粉酶(mg/l)1，1	8，8
5	4	241	8，8	240	426	47	430	72	8，8
5	6	520	160	525	426	47	430	72	224
7	6	520	160	525	576	480	580	650	224
7	8	625	800	630	576	480	580	650	1050

表4-2，实验2.

时间(h)344，5	ALK02732		ALK02732(pKTH277)
	ALK02732		ALK02732(pKTH277)		生长′100250350	α-淀粉酶(mg/l)0，9624	生长′112272363	α-淀粉酶(mg/l)1，5938
	5	425	50	437	生长′100250350	α-淀粉酶(mg/l)0，9624	生长′112272363	α-淀粉酶(mg/l)1，5938	80
6，58	5	425	50	437	545585	190320	577637	4501300	80
6，58	12			702	545585	190320	577637	4501300	1600
12，5	12			702	700	900			1600

′用Klett-Summerson分光计66号过滤器所测得的培养物的浓度，用Klett单位表示。

在这个实施例中所用的材料和方法

细菌菌株和质粒：在转化和生长试验中使用了解淀粉芽孢杆菌菌株ALK02732(由Vehmaanpera等在1991年进行了描述)。把质粒pKTH277转化到ALK02732(本研究)制得ALK02732(pKTH277)，并用于培养试验。Kontinen等(1991)描述了载有prsA基因的质粒pKTH277。

用电击穿法把pKTH277转化到ALK02732：按照生产商说明用碱性溶菌法分离质粒pKTH277并用BamHI甲基酶(New England Biolabs)将其甲基化。电击穿法使用了约0.5μg的甲基化质粒DNA。按Vehmaanper(1989)所述进行电击穿。用设置在1.5KV，25μF和400Ω条件的Gene Pulser^TM装置(Bio-Rad Laboratories)的0.2cm的试样比色杯中(Bio-Rad Laboratories)对细胞进行脉冲处理。在Luria-卡那霉素(10μg/ml)-氯霉素(5μg/ml)平板培养基上筛选对氯霉素有抗性的转化体。(平板培养基上有卡那霉素存在而没有损失pKTH10，鉴于ALK02732含有pKTH10，证实了其卡那霉素抗性)。

培养实验和样品的收集：首先在Luria平板培养基上过夜培养ALK02732和ALK02732(pKTH277)。把来自平皿的细菌加入10mlLuria中并使其进入生长对数期(Klett 100)。然后加入1ml甘油(体积的1/10)并冷冻细胞悬浮液，存放于-70℃。在2×Luria＋2％淀粉中以1∶100或1∶200稀释Klett 100细胞开始培养实验。在培养试验中所用的Luria不含盐。培养体积是20ml，在37℃剧烈摇动的瓶中培育生长。对于两种菌株来说把卡那霉素(10μg/ml)补给给培养基，而对ALK02732(pKTH277)来说把氯霉素(5μg/ml)补给给培养基。用66号过滤器的Klett-Summerson分光光度计(Klett Manufactaring Co.，Inc.N.Y.)测试法指示其生长。在生长过程中取0.5ml试样，将其离心分离，并把培养上清液贮存于-20℃下用于α-淀粉酶的测定。

α-淀粉酶的测定：用Phadebas药片(Pharmacia)测定培养基上清液中的α-淀粉酶。37℃下在1ml含1/4扩散的Phadebas药片缓冲液(50mM MES pH6.8，50mM NaCl，100μM CaCl₂)中把试样保温1小时，之后加入50μl 5M NaOH中止反应。用Whatman 1号滤纸过滤后，用616-624nm作分析波长范围和800-804nm作参考波长范围测量滤液的吸光度。用商业上可获得的解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(Sigma)作标准样品，并用每升酶的毫克数表示结果。

参考文献：Kontinen V.，Saris P.和Sarvas M.(1991)：Agenes(prsA)of Bacillus subtilis involved in a novel，latestage of protein export.Mol.Microbiol.5：1273-1283。Vehmaanper，J.(1989)：Transformation of BacillusAmyloliquefaciens by electropration.FEMS Miorobiol.Lett.61：165-170。Vehmaanper J.，Steinborn G.and HofemeisterJ.(1991)：Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens.J.Biotechnol.19：221-240。

实施例3

高表达PrsA蛋白时由B.Lentus分泌

枯草杆菌蛋白酶的提高

本实施例证实了本发明方法和系统在宿主革兰氏阳性细菌也高表达PrsA蛋白时能提高B.lentus中超量表达的外蛋白分泌。

我们已测试了高表达prsA对由B.lentus分泌枯草杆菌蛋白酶的作用，这种枯草杆菌蛋白酶可以在商业上以Experase^TM名称购得，并且在WO 89/06279(名称为Novo Nordisk A/S)中进行了描述。用一种原始的pUB110和来源于地衣形芽孢杆菌的α-淀粉酶(amyL)的启动子和信号肽由基于表达载体pPL 1759(Hansen，C.，Thesis，1992，The Technical University of Denmark)的质粒pPL 1800转录枯草杆菌蛋白酶。WO 89/06279中描述了质粒pSX94。用于生产的枯草杆菌菌株SHa 273是DN 1885的一种蛋白酶弱衍生物(Jorgensen，P.L.等，(1991)FEMS Microbiol.Lett.，77：271-276)，其中已经对两种其他的蛋白酶cpr和npr进行了灭活。从含有(MOL253)或不含(MOL 252)prsA质粒pKTH277的，并在30℃用卡那霉素和氯霉素补给的大豆液体培养基BPX中进行培养生长的菌株中测定B.lentus枯草杆菌蛋白酶的分泌。

五天后测定两种菌株中枯草杆菌蛋白酶的含量表明含有prsA质粒的菌株分泌的B.lemtus枯草杆菌蛋白酶(160微克/毫升)比不含这种质粒的菌株的分泌量(40微克/毫升)高四倍。

所用的BPX培养基有下列组份：BPX：马铃薯淀粉 100g/l

大麦面粉 50g/l

BAN 5000 SKB 0.1g/l

酪蛋白酸钠 10g/l

大豆粗粉 20g/l

Na₂HPO₄·12H₂O 9g/l

Pluronic 0.1g/l 菌株表：

枯草杆菌基因型和特性亲本菌株

DN1885 amyE，amyR2 RUB200

PL1801 amyE，amyR2，apr-，npr- DN1885

MOL252 PL1801(pPL1800) PL1801

MOL253 PL1801(pPL1800，pKTH277) PL1801

RUB 200菌株由Yoneda等，1979，Biochem Biophys.Res.Common.Vol.91，1556-64进行了描述。

实施例4

解淀粉芽孢杆菌和枯草杆菌中PrsA蛋白的存在

我们已经证实在解淀粉芽孢杆菌的两个菌株ALK089和ALK02100中有PrsA蛋白存在。菌株ALK089是用于生产α-淀粉酶的一个工业菌株。菌株ALK089是一个超产菌株，在(Bailey，M，J.和MarkkanenP.H.J.Appl.Chem.Biotechnol.1975，25，73-79)中进行了描述。菌株ALK02100是ATCC23843的一个衍生物(J.Vehmaanper，FEMS Microbiolohy Letters 49(1988)101-105)。

我们也证实了在地衣形芽孢杆菌的两个菌株749/C(Pollock，M.R.(1965)Biochem，J.94，666-615)和ATCC14580中有PrsA蛋白的存在。

用免疫印迹技术识别这些非枯草杆菌的革兰氏阳性细菌中PrsA蛋白。更具体地说，把指数生长晚期收集的细胞(使蛋白酶含量尽可能低—PrsA蛋白对蛋白酶敏感)进行免疫印迹，用溶菌酶进行短暂处理(使细胞壁破漏，但又避免长时间处理以尽可能减少蛋白水解)，并在100℃用含2％SDS的试样的缓冲液溶解。用抗大肠杆菌生产的枯草杆菌PrsA蛋白的兔抗血清(KH1283)测定PrsA蛋白(因此，尽可能减少了除PrsA外与任何细菌蛋白的抗原交叉反应)。该抗血清能测出免疫印迹中毫微克量的类枯草杆菌的PrsA。

此外，我们发现这四种菌株中都含有枯草杆菌PrsA大小的蛋白，并能用上述抗血清特异性识别。谱带上的染色强度大约与两种解淀粉芽孢杆菌菌株相似并和野生型枯草杆菌的PrsA蛋白染色强度相似。对解淀粉芽孢杆菌细胞蛋白的平行SDS-PAGE进行考马斯兰染色，在类似于枯草杆菌的PrsA蛋白位置处仅显示了一条非常弱的谱带，并与解淀粉芽孢杆菌的PrsA蛋白一致，是一种类似于枯草杆菌中的小细胞蛋白。两种地衣形芽孢杆菌菌株的PrsA蛋白的染色强度比枯草杆菌的染色强度弱，表明PrsA蛋白的含量较少。尽管如此，不能排除较弱的染色是因为地衣形芽孢杆菌的PrsA蛋白比枯草杆菌的PrsA蛋白与抗血清的结合效率更低造成的。表5是不同菌株中PrsA粗估量的总结。

表5.在早期静止生长期(在Klett400细胞密度时)中杆菌菌

株细胞中测得的PrsA蛋白的大约含量。评估是以Western

印迹为基础的，并且是初步。

菌株细胞中的PrsA(任意单位))

解淀粉芽孢杆菌

RH2078 4

RH2079 4¹⁾

地衣形芽孢杆菌

RH2080 1

RH305 1

枯草杆菌

IH6064 5

IH6774²⁾ 100¹⁾

1)在指数生长中期(Klett 100的密度时)收集细胞，并且估计的PrsA值与Klett 400的密度相对应。

2)因含有pKTH277，这是一个PrsA的超产菌株。

在本实施例中所用的材料和方法

菌株：解淀粉芽孢杆菌RH2078＝ALKOB 9＝VTT197＝E18。这是一种α-淀粉酶的超产菌株。由J.Vehmaanper，ALKO赠送的地衣形芽孢杆菌RH2080＝BRA 5＝ATCC14580。这是一种耐热性α-淀粉酶的生产菌株。由P.Saris，Bl，H：Ki赠送的地衣形芽孢杆菌RH305＝749/C。这是一种青霉素酶组成菌株，最初来自J.O.Lampen。枯草杆菌IH6074。这是metB 5 sacA321，参见M.Sibakov等1983，枯草杆菌IH6774。它来自IH6064，含有质粒pKTH10(载有α-淀粉酶基因)和pKTH277(载有编码PrsA的基因)。

生长培养基：Luria-琼脂平板培养基(L-平板)；浓缩两倍

的Luria-肉汤培养基(2×L)

纯化的PrsA蛋白：由M.Laureaus从含pKTH277的枯草杆菌中纯化的PrsA。

免疫血清：由大肠杆菌生产的枯草杆菌的PrsA，这是从SDS-凝胶中跑带并切下的。

化学试剂：苯甲基磺酰氟化物，Sigma P-7628，在-20℃以100mM溶于乙醇中。EDTA，Titriple^xRIII p.a.Menk 8418，作一种0.5M溶液，pH8。溶菌酶，Sigma L-6876，在下列溶液中以1mg/ml使用：20mM磷酸钾，pH7，15mM MgCl₂，20％蔗糖。由Pierce提供的TCA 100％BCA⁺蛋白检测试剂，按照BioRad的SDS-PAGE和Western印迹设备及化学试剂。印迹是用4-氯-1-萘酚染色。

培养条件和用于凝胶电击穿的样本制备：在37℃ L-平板上培养细菌过夜。用一长玻璃棒把菌落收集到一个预称重的Eppendorf试管中，并称重。加入试样缓冲液得到10或100mg细胞(ww)/ml，在100℃把试样加热10分钟。

37℃搅拌下在2×L肉汤培养基中培养细菌。为把蛋白酶的作用降到最小，首先把细菌(从-20℃)培养成Klett 100(相对应约1-2mg ww/ml，或约10⁹细胞数/ml)。在10^-2稀释下把它作为菌种。在Klett烧瓶中培养20ml细菌，并在Klett 100，Klett 100＋2h(Klett约400)和Klett 100＋4h(Klett约550)取4ml试样。

把试样迅速转入冰浴中。将PMSF加至1mM，EDTA加至10mM。以12000×g离心10分钟从培养基上清液分离细胞，并在37℃用1/20体积的溶菌酶处理15分钟。加入等体积试样缓冲液。4℃用10％TCA沉淀培养基上清液，并用试样缓冲液浓缩20倍。

把试样在12％SDS-PA凝胶上跑带，用考马斯亮蓝R染色，或按BioRad印迹在PVDF滤纸上。

用特异性抗PrsA兔抗血清KH1283测定PrsA。

实施例5

在超产PrsA蛋白的枯草杆菌中

提高Pseudomonas mendocina的脂酶分泌

在Genencor international，South San Francisco，CA，USA的科学家使用pKTH277中的prsA基因已经证明当枯草杆菌超量表达PrsA蛋白和脂酶(来自Pseudomonas mendocina，一种革兰氏阳性细菌)时，分泌到培养基中的脂酶含量比不能超量表达PrsA基因的对照组大3.5倍。Genencor International科学家使用了工业杆菌菌株和工业发酵条件(数据没有列出)。

结论

总之，可以看到本发明公开了一种提高革兰氏阳性细菌中生产工业上和医学上重要外蛋白的方法和系统。在没有超出本发明的构思和范围情况下普通技术人员为使本发明适合各种用途和条件可以对本发明做出各种变化和改良。就此而论，这些变化和改良均适当地，等同地和应当处于下列权利要求相当的整个范围内，本发明的各种特征也表现在下列权利要求中。

Claims

1.一种能够提高革兰氏阳性细菌中外蛋白分泌的表达系统，它含有一种能表达高于野生型含量的PrsA蛋白或其功能性同源物，并能表达高于野生型含量的至少一种有意义外蛋白的革兰氏阳性细菌。

2.按照权利要求1的表达系统，其中所述的PrsA蛋白是与所述的革兰氏阳性细菌同源。

3.按照权利要求1的表达系统，其中所述的PrsA蛋白是与所述的革兰氏阳性细菌异源。

4.按照权利要求1的表达系统，其中所述的PrsA蛋白是杆菌属菌种的PrsA蛋白。

5.按照权利要求4的表达系统，其中所述的PrsA蛋白是来源于枯草杆菌，解淀粉芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌的PrsA蛋白。

6.按照权利要求1的表达系统，其中所述的PrsA蛋白的功能性同源物能够与抗来源于枯草杆菌，解淀粉芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌的PrsA蛋白的抗体发生免疫反应，并且当超量表达它时，能够提高所述的革兰氏阳性细菌分泌所述的有意义外蛋白。

7.按照权利要求1的表达系统，其中所述的PrsA蛋白或其功能性同源物以比野生型含量高2倍到10倍的量存在于所述的革兰氏阳性细胞中。

8.按照权利要求1的表达系统，其中所述的有意义外蛋白是蛋白酶，脂酶，角质酶，淀粉酶，半乳糖酶，支链淀粉酶，纤维素酶，葡糖异构酶，蛋白质二硫化物异构酶，CGT酶(环糊精葡糖酸转移酶)，植酸酶，葡糖氧化酶，葡糖基转移酶，漆酶，胆红素氧化酶，木聚糖酶，抗原性微生物或原生质蛋白，细菌蛋白毒素，微生物表面蛋白，病毒蛋白，一种药物。

9.按照权利要求8的表达系统，其中所述的有意义外蛋白是一种向编码该蛋白的构建体基因中加入信号序列而创制的非天然外蛋白。

10.按照权利要求1-9中任一表达系统，其中所述的革兰氏阳性细菌是杆菌属的一个菌种。

11.按照权利要求10的表达系统，其中所述的杆菌是枯草杆菌，地衣形芽孢杆菌，B.lentus，短杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝固芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，B.lautus和苏云金芽孢杆菌。

12.一种能够表达高于野生型含量的至少一种有意义外蛋白的革兰氏阳性细菌，还含有pKTH277。

13.一种能够表达高于野生型含量的至少一种有意义外蛋白的革兰氏阳性细菌，还含有至少下列之一：至少两个拷贝的来源枯草杆菌的prsA基因或其一种功能性同源物；来源于枯草杆菌的prsA基因或其一种功能性同源物，可以与能超量表达所述的prsA基因或其功能性同源物的强调节序列人工连接。

14.按照权利要求12或13中任意一种革兰氏阳性细菌，其中所述的革兰氏阳性细菌是杆菌属的一种细菌。

15.按照权利要求14的革兰氏阳性细菌，其中所述的杆菌是枯草杆菌，地衣形芽孢杆菌，B.lentus，短杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝固芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，B.lautus和苏云金芽孢杆菌。

16.一种DNA构件，含有在表达信号控制下的枯草杆菌的prsA基因或其一种功能性同源物，且这种表达信号能超量表达所述的prsA基因或其功能性同源物。

17.一种载体，还含有在能超量表达所述prsA基因或其功能性同源物的表达信号控制下的枯草杆菌的prsA基因或其一种功能性同源物。

18.一种提高革兰氏阳性细菌中分泌有意义外蛋白的方法，它包括在所述的革兰氏阳性细菌中能够表达高于野生型含量的枯草杆菌的PrsA蛋白，或是一种功能性同源物，其中所述的革兰氏阳性细菌也能表达高于野生型含量的所述外蛋白。

19.按照权利要求18的方法，其中所述的革兰氏阳性细菌是杆菌属的一种细菌。

20.按照权利要求19的方法，其中所述的杆菌属细菌是枯草杆菌，地衣形芽孢杆菌，B.lentus，短杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝固芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，B.lautus或苏云金芽孢杆菌

21.一种创制用于提高在所述宿主微生物中超量表达的有意义外蛋白分泌的改良型非枯草杆菌革兰氏阳性宿主微生物的方法，它包括(a)识别该宿主微生物中编码枯草杆菌PrsA蛋白的功能性同源物的基因，(b)选用至少下列之一的方法提高步骤(a)中所识别基因的表达：向该宿主微生物中至少导入一个额外拷贝的这种基因；向该宿主微生物中导入与能够超量表达该基因的表达序列人工相连的这种基因。

22.一种识别编码枯草杆菌PrsA的功能性同源物的基因的方法，它包括用Southern印迹法识别与枯草杆菌prsA基因的DNA探针杂交的DNA，并且证实该基因能编码这样一种蛋白，即当超量表达这种蛋白时，它能够提高一种革兰氏阳性细菌分泌有意义外蛋白的分泌能力。

23.一种识别编码枯草杆菌PrsA的功能性同源物的基因的方法，它包括识别能与高效价的抗-PrsA抗体反应的蛋白，并且证实当革兰氏阳性细菌中含有高于野生型含量的这种蛋白时，该蛋白能提高该革兰氏阳性细菌分泌一种有意义外蛋白的分泌能力。