CN88101681A - 编码蛋白水解酶之基因的分子克隆及表达 - Google Patents
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Abstract
提供了用于提高丝氨酸蛋白酶生产的新方法及新的工业芽孢杆菌菌株。将含有丝氨酸蛋白酶编码基因的克隆载体引入相容性宿主内。通过使载体整合到宿主细胞染色体中,致使已转化的宿主细胞以稳定的方式包含所引入的载体,并对已转化的宿主细胞进行选择。优选的宿主细胞是芽孢杆菌新种PB92的细胞,并且优选的蛋白酶编码基因也是来源于芽孢杆菌PB92的。
Description
本发明涉及增加丝氨酸蛋白酶生产的新的杆菌菌株及其生产方法。更具体地说,本发明涉及在杆菌属菌株中引入和稳定维持来源于某嗜碱杆菌菌株的、编码高碱性蛋白水解酶的DNA序列,借以放大所说的DNA序列,并从而显著提高所说酶之生产水平的方法。
芽孢杆菌被广泛用于生产工业上重要的酶类,例如α淀粉酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶或丝氨酸蛋白酶(参见Debabov,“The Industrial Use of Bacilli”,in:The Molecular Biology of Bacilli,Acad Press,New York,1982)。
枯草杆菌蛋白酶为细菌丝氨酸蛋白酶,它们通常用于裂解蛋白质或肽类的内部肽键。这些酶可以从许多原核生物体中得到,例如由革兰氏阴性菌(如沙雷氏菌或假单孢菌)及革兰氏阳性菌(如细球菌和芽孢杆菌)中得到。
有价值的工业枯草杆菌蛋白酶是用各种芽孢杆菌如枯草杆菌(B.subtilis)、地衣形芽孢杆菌(B.licheniformis)、淀粉液化杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜碱杆菌(B.alcalophilus)及其他杆菌生产的(参见美国专利3674643、3723250和4480043号)。一种重要的枯草杆菌蛋白酶叫作“高碱性蛋白水解酶”,它是用工业杆菌新种PB92菌株生产的,该菌株已特别记载于美国再版专利30602号中。
高碱性蛋白水解酶类,是在碱性介质中具有高度活性的丝氨酸蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。更具体地说,高碱性蛋白酶在PH大于大约9时具有最佳活性,而且在PH约11或更高时至少可保留80%的最佳活性。高碱性蛋白酶通常是由能够在碱性PH条件下生长的某些芽孢杆菌菌株生产的(如美国专利3723250、4480037号及美国再版专利30602号中所述)。这些生产高碱性蛋白酶的芽孢杆菌在分类学上尚未明确,本说明书中将其称为嗜碱芽孢杆菌菌株。
利用经典遗传学技术,例如突变及继后的选择以及近代分子生物学技术可以改进芽孢杆菌酶的生产。本发明即属于后一可能性的具体实例。
采用分子生物学序列以改善酶的生产的方法,大都涉及克隆编码所说酶的基因。已经成功地克隆出芽孢杆菌胞外酶的几种基因,为淀粉液化芽孢杆菌(B,amyloliquefaciens)的α淀粉酶基因(Palva et al.,Gene 15,43-51,1981)、地衣形芽孢杆菌的α淀粉酶基因(Ortlepp,Gene23,267,1983)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的α淀粉酶基因(Mielenz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,5975-5979,1983;欧洲专利申请(EPA)-0057976)和枯草杆菌的α淀粉酶基因(Yang et al,Nucleic Acids Res.11,237,1983)、枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶基因(Gay et al.,J.Bacteriol.153,1424,1983)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Fuji et al.,J.Bacteriol.156,831,1983)、淀粉液化芽孢杆菌(Honjo et al.,J.Biotech.1,165,1984)和枯草杆菌(Yang et al.,J.Bacteriol.160,115,1984)的中性蛋白酶编码基因、枯草杆菌的丝氨酸蛋白酶或碱性蛋白酶编码基因(Wong et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1184,1984)、地衣形芽孢杆菌(Jacobs et al.,Nucleic Acids Res.13,8913,1985)和淀粉液化芽孢杆菌(Wells et al.,Nucleic Acids Res.11,7911,1983)的丝氨酸蛋白酶或碱性蛋白酶编码基因。
这些胞外蛋白质的基因编码位于加工后成熟酶之氨基末端氨基酸前面的信号肽,而这些信号肽则与分泌机制有关。据报导,来源于地衣形芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和枯草杆菌的蛋白酶在成熟蛋白酶之氨基末端的前面具有特别长的氨基酸序列。这意味着存在有真核蛋白酶所常见的早前期结构。从而表明,使用上述已克隆的基因可以在实验室规模上、在枯菌杆菌中产生由几个不同杆菌菌种之基因编码的这些酶。因为对枯草杆菌的性质已十分明瞭、可以获得一些突变种、而且能通过反应潜能细胞的转化作用使之成为遗传学上可利用的,所以它常被用作这一规模上的宿主微生物。
进行工业发酵时,通常使用一些强壮而且稳定的菌株。然而,由于这些工业菌株的抗遗传饰变性质及其原养型特点,所以它们很难于饥饿,并常常显示出抗转化性。
有人提出不利用涉及反应潜能细胞的传统转化操作方法而将DNA引入杆菌内。还曾报导了几种革兰氏阳性微生物的原生质体转化作用。Chang和Cohen(Mol Gen,Genet.168,111-115,1979)描述了枯草杆菌的原生质体转化方案,该方案已被广泛使用。还已描述了有关巨大芽孢杆菌(B.megaterium)原生质体(Vorobjeva et al.,FEMS Microbiol.Letters,7,261-263,1980)、淀粉液化芽孢杆菌原生质体(Smithet al.,APPl.and Env.Microbiol.51,634,1986)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)原生质体(Fisher et al.,Arch.Microbiol.139,213-217,1981)园形芽孢杆菌(B.sphaericus)原生质体(McDonald,J.Gen.Microbiol.,130,203,1984)和幼虫芽孢杆菌(B.larvae)原生质体(Bakhiet et al.,Appl.and Env.Microbiol.49,577,1985)进行成功转化的类似操作方法;但在同一出版物中也提到使用日本甲虫芽孢杆菌(B.popilae)没有获得成功的结果。该方法对于多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、地衣形芽孢杆菌、软化芽孢杆菌(B.macerans)和侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)来说是成功的,但对于凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)却不是这样,尽管也已观察到形成了良好的原生质体(Mann et al.,Current Microbiol.13,131-135,1986)。
除了聚乙二醇诱发的原生质体转化作用之外,还发展了将DNA引入原生质体中的一些其他方法,例如与包含DNA的脂质体融合(Holubova,Folia Microbiol.30,97,1985),或使用易于转化的微生物作中间宿主细胞进行原生质体融合(EPA-0134048)。
进行微生物原生质体转化时,无论使用裸核DNA、或借助于用来通过融合作用将DNA转移到最终宿主菌株内的易于转化之宿主菌株的原生质体,或是使用包装有DNA的脂质体,其关键性要素均在于(1)原生质体的形成;(2)确定维持原生质体稳定的条件,以及(3)使所得已转化的原生质体能够再生形成活细胞的发育条件。
如果某宿主微生物携带的载体分子中含有可在所说的生物体中过表达(overexpress)的基因,则一般将存在适于选择那些丧失过表达所说基因能力之细胞的选择压力。对于被转化的宿主细胞来说,过表达是一种不利的性质,因为这对于与非过表达的细胞之间竞争(生长速率)来说会有不利的影响,而且大量代谢能量将消耗在过多的合成单一基因产物上。
通过放大编码这种酶的基因,改进用现有工业芽孢杆菌生产高碱性蛋白酶的方法,最好包括采用作为这一基因之来源的杆菌菌株作为重组体宿主菌株,其理由如下:
-所说的菌株具有有效合成和分泌该蛋白酶的天然能力,
-该蛋白酶基因的原始调节序列将在这一宿主菌株中有效地发挥功能,
-存在于原始菌株和重组菌株所产生的胞外酶中的非蛋白酶付组分是完全相同的,因为不存在新的、具有潜在变应原的蛋白质成分,故可允许将这些酶应用于洗涤剂中得到简单的认可。
迄今尚未报导过嗜碱杆菌的转化作用。根据我们自己的经验,传统的操作方法是无效的。因此没有关于在这些芽孢杆菌中进行质粒载体的自发复制、维持这些载体的稳定性或其染色体整合作用的现成资料。而且也不知道是否能使用已通过基因放大而过量产生所说蛋白酶(5g/L)的某种嗜碱杆菌来改善高碱性蛋白酶的生产水平。
本发明提供了一个新颖的DNA序列,该序列包含来源于嗜碱杆菌菌株的丝氨酸蛋白酶编码基因。
在转化已经生产丝氨酸蛋白酶的杆菌菌株时,使用的优选DNA序列是来源于芽孢杆菌新种PB92的DNA序列。
特别优选的DNA序列为编码基本上具有下列一级结构的丝氨酸蛋白酶:
H2N-AlaGlnSerValProTrpGlyIleSerArgValGlnAlaProAlaAlaHisAsnArgGlyLeuThrGlySerGlyValLysValAlaValLeuAspThrGlyIleSerThrHisProAspLeuAsnIleArgGlyGlyAlaThrPheValProGlyGluProSerThrGlnAspGly
25 AsnGlyHisGlyThrHisValAlaGlyThrIleAlaAlaLeuAsnAsnSerIleGlyValLeuGlyValAlaProAsnAlaGluLeuTyrAlaValLysValLeuGlyAlaSerGlySerGlySerValSerSerIleAlaGlnGlyLeuGluTrpAlaGlyAsnAsnGlyMetHisValAlSernLeuSerLeuGlySerProSerProSerAlaThrLeuGluGlnAlaValAsnSerAlaThrSerArgGlyValLeuValValAlaAlaSerGlyAsnSerGlyAlaGlySerIle
30 SerTyrProAlaArgTyrAlaAsnAlaMetAlaValGlyAlaThrAspGlnAsnAsnAsnArgAlaSerPheSerGlnTyrGlyAlaGlyLeuAspIleValAlaProGlyValAsnValGlnSerAsnTyrProGlySerThrTyrAlaSerLeuAsnGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGlyAlaAlaAlaLeuValLysGlnLysAsnProSerTrpSerAsnValGluIleArgAsnHisLeuLysAsnThrAlaThrSerLeuGlySerThrAsnLeuTyrGlySer
35 GlyLeuValAsnAlaGluAlaAlaThrArg-COOH.
本发明还提供了含有所说DNA序列的克隆和表达载体,该载体整合到所说杆菌属微生物宿主菌株的染色体中,或在其中自身复制,所说的载体包括:
(a)一个细菌质粒的复制原点,
(b)一个细菌启动子,并且处于所说启动子的控制之下,
(c)编码丝氨酸蛋白酶的DNA序列,以及
(d)一个选择标志基因。
本发明的另一方面,提供了一种将含有所需基因或其部分的DNA序列引入嗜碱芽孢杆菌菌株内并选择含有所说DNA序列之转化体的方法。
本发明的再一个方面,提供了一种在嗜碱芽孢杆菌菌株中引入和稳定保留一得自嗜碱芽孢杆菌菌株的、编码高碱性蛋白水解酶的DNA序列,从而放大所说的DNA序列,并进而提高所说酶的生产水平的方法。
在一优选的实施方案中,所说的寄主菌株是芽孢杆菌新种PB92。
在进一步优选的实施方案中,所说DNA序列来源于芽孢杆菌新种PB92,并借助一适当的载体将其重新引入到芽孢杆菌新种PB92(作为宿主菌株)中。
图1显示对分别含有PUB110和PM58之枯草杆菌DB104培养物的上清液所作组氨酸/MOPS凝胶电泳的结果,并与使用几种枯草杆菌蛋白酶所作同一电泳进行比较。
泳道1:Carlsberg枯草杆菌蛋白酶
泳道2:芽孢杆菌PB92蛋白酶
泳道3:枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶
泳道4:枯草杆菌DB104(PM58)
泳道5:枯草杆菌DB104(PUB110)
图2显示质粒PM58的限制图谱,并且本图的上面部分显示出了测定序列的战略。带箭头的实线代表在噬菌体M13载体mp10、mp11和mp18中克隆的一些片段。图的下部分则显示使用位于所说蛋白酶基因上规则距离处出现的10个寡核苷酸进行序列测定的战略。
图3显示与杆菌PB92丝氨酸蛋白酶之氨基酸序列相关联的编码链的核苷酸序列。图中还显示了该DNA序列的启动子(P1、P2)、核糖体结合位点(rbs)及终止区(term)。编号的实线代表用于测定序列的10个寡核苷酸的位置。
图4A显示质粒pE194-neo的构建。
图4B显示质粒pMAX-4的构建。
本发明的重组宿主细胞是嗜碱型的芽孢杆菌菌株,可借助包含高碱性蛋白酶基因的适当载体使之转化并过量产生蛋白酶。一种适用和优选的宿主菌株是芽孢杆菌新种PB92。
本说明书中使用的术语“适当的载体”是指这样一种DNA构建物,即包含:
-使宿主菌株对某种抗生素(宿主菌株对其有敏感性)产生抗性的基因。当用于载体的染色体整合时,该标志基因必须满足这样的要求:即如果宿主菌株中只存在一个或很少几个标志基因的拷贝也可进行存活性选择;
-一个能自发复制的复制原点;
-一个来源于嗜碱芽孢杆菌、编码高碱性蛋白酶的结构基因,并且具有在嗜碱芽孢杆菌内有功能活性的所说基因的调节区,如启动子序列、形成核糖体结合位点的序列及控制所说基因之转录和翻译终止的序列。
在使用芽孢杆菌新种PB92的情况下,发现来源于质粒pUB110之赋予宿主以抗新霉素抗性的基因是适用的。
根据本发明的一个方面,令人惊疑的是,使用有突变之复制原点的质粒时,这一突变能使质粒在枯草杆菌中的功能表现为温度敏感性的,并可借以提高对染色体整合的选择(见Ehrlich对有关质粒pE194的描述,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1433,1978),亦可在嗜碱芽孢杆菌菌株内完成对在其染色体中具有载体整合之分离物菌株的选择。
本技术领域内的普通技术人员将会认识到,作为适当载体之一部分的高碱性蛋白酶的表达可受到其原始调节序列的控制,它们作为内源性序列将会在嗜碱芽孢杆菌宿主菌株内很好地发挥作用。当然,亦可使用其他一些源自嗜碱芽孢杆菌或其他微生物的控制区,条件是这些控制区能在选择的芽孢杆菌宿主菌株内发挥功能作用。
可用本技术领域内已知的方法制得形成适当载体之一部分的蛋白酶基因。一般说来,该方法包括由表达高碱性蛋白酶的生物体制备基因组文库。提供蛋白酶基因的优选菌株为芽孢杆菌新种PB92(参见上文)。基因组文库是以常规方法制备的,例如将所说菌株的DNA片段连接到包含能在枯草杆菌中发挥功能活性之复制原点及赋予枯草杆菌以抗新霉素抗性之基因的载体pUB110中,并用该连接混合物转化枯草杆菌的反应潜能细胞。
使用质粒pUB110时,可在含有酪蛋白的基本琼脂平皿上分析,因其产生一个酪蛋白沉淀环(晕圈),从而分离出过量产生蛋白酶的抗新霉素菌落。分离由所说的菌落中得到的重组质粒(称为pM58)经限制性酶切分析对其定性并进行序列测定(见实施例3)。与已公开发表的枯草杆菌、淀粉液化芽孢杆菌及地衣形芽孢杆菌之枯草杆菌蛋白酶的DNA序列相一致,发现在芽孢杆菌新种PB92之成熟高碱性蛋白酶(269个氨基酸)N末端氨基酸的前面有一信号肽和肽原。信号肽长度为27个氨基酸,肽原为84个氨基酸。与已公布的枯草杆菌蛋白酶蛋白质序列有低的同源性(60%)、总正电荷(+10)较之已公布的枯草杆菌蛋白酶所带总正电荷(+5)高,并且缺失了成熟蛋白蛋的6个氨基酸,这些均表明本发明的枯草杆菌蛋白酶是新的。
本领域内的普通技术人员可以理解到,由其他嗜碱芽孢杆菌亦可制得基本上同样的丝氨酸蛋白酶。这些可表达与芽孢芽菌PB92的氨基酸序列至少有70%、最好有大约80%同源性之蛋白质的蛋白酶基因亦应视为属于本发明范围内的。
起始密码子前面的启动子区域由一个含有核糖体结合位点的独特DNA序列和一个在芽孢杆菌新种PB92中被有效地识别的启动子区所组成。通过在有利于酶合成的条件下,通常是在保留质粒的选择压力(如由抗生素新霉素所提供的选择压力)下,培养包含质粒pM58的枯草杆菌以确定高碱性蛋白酶的表达。由于在这些条件下进行培养,从而导致培养基中蛋白酶水平的显著增加,并且足以定性这种蛋白酶。除了在应用条件下有同样性能(洗衣清洁作用)外,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶、组氨酸-MOPS凝胶电泳测定分子量(参见实施例2),并基于合成底物琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-对位硝基苯胺分析以检测动力学参数Km和Vmax,对所产生的蛋白酶进行生物化学定性,表明克隆的蛋白酶与芽孢杆菌PB92的高碱性蛋白酶是完全相同的。
确定了质粒pM58包含编码芽孢杆菌菌株PB92之丝氨酸蛋白酶的完整基因后,即可以将形成该基因的DNA序列转移到其他适当载体内。载体pE194-neo是由其中插入了来自质粒pUB110的抗新霉素抗性基因的质粒pE194的完整序列组成的(见实施例4)。已有报导指出质粒pE194含有一个在枯草杆菌内表现有温度敏感性功能活性的复制原点(J.Hofemeister et al.,Mol.Gen.Genet.189,58-68,1985)。
在本发明的一优选实施方案中,是将芽孢杆菌PB92的丝氨酸蛋白酶基因插入到质粒pE194-neo中,并将所得质粒(称为pMax-4)转化到不同的芽孢杆菌菌株内。
在本发明的一个特定实施方案中,用于引入编码嗜碱芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶基因的宿主菌株是一种工业菌株。发酵罐中所用的菌株是很强壮而且稳定的。所说的菌株对噬菌体感染有抗性,另外还对用常规转化方法引入DNA所造成的基因交换具有抗性。常用的工业菌株是原养型的,从而避免了在培养基中加入昂贵的氨基酸。工业菌株的其他特性是,它们在发酵终止以前(可长达一周)保有高度的生产能力,消耗培养液时保有稳定的细胞浓度以及高度的生产能力(通常特定的分泌蛋白浓度至少为0.5%W/V)。本发明的分泌蛋白主要是一种丝氨酸蛋白酶,特别是高碱性蛋白水解酶。
嗜碱芽孢杆菌菌株如芽孢杆菌工业菌株PB92的转化作用,最好包括使用得自所说菌株的原生质体。显然,如Cohen等人所述的常规原生质体转化方法并不能用于芽孢杆菌菌株PB92。
根据本发明的一个方面,令人惊奇地发现,原生质体的形成和再生有利于发生于高pH、最好在约8.0范围内发生。这一点是很令人惊奇的,因为芽孢杆菌新种PB92在中性pH条件下也具有很高的生长速率。因此,本发明需要使用其他适于原生质体形成的新方法及再生平皿。为了选择目的,发现适于在再生平皿中使用相对高浓度的抗生素。例如,当用pMAX-4转化芽孢杆菌PB92时,可使用浓度高达1000μg/ml的新霉素来反选择未转化的细胞,而来自所说再生平皿之复制培养的转化体在正常富琼脂平皿(如心脏浸液琼脂平皿)上则产生了低的新霉素(1μg/ml)抗性。
根据本发明的另一个方面,发现启动子、Shine-Dalgarno和终止序列等基因表达信号用于嗜碱芽孢杆菌宿主菌株比用于其他芽孢杆菌宿主(如枯草杆菌)时更为有效。
如实施例中所示,包含自发复制质粒pMAX-4的枯草杆菌生长于含抗生素的培养基上,其表达水平高达芽孢杆菌新种PB92菌株之生产水平的10%,而用包含质粒pMAX-4的芽孢杆菌新种PB92(称为PB92(pMAX-4))在同样条件下则可使蛋白酶生产能力提高到大约120%。已发现在普通实验室条件下,质粒pMAX-4可稳定地保留于芽孢杆菌菌株PB92中。
在由我们于本申请同日递交的欧洲专利申请EPA-0000000号中提出,为了避免较大工业规模生产时存在的载体不稳定问题,以及相伴随的为形成必须生物量而出现的较高再生数问题,而使所说“适当载体”的多个拷贝中的一个整合到所说菌株的染色体中。当使用pMAX-4的温度敏感性复制原点时,会使人惊奇地发现,在嗜碱菌株中选择染色体整合作用是可能的。来自所说菌株的DNA分离物的杂交实验和向枯草杆菌内的再转化结果表明,已发生了蛋白酶基因的串联复制而且不存在pMAX-4质粒。与PB92相比,该菌株(称为PBT109)增加了蛋白酶产量(120%)。
已经发现,由于稳定地存在一个额外的染色体基因拷贝,使得其生产能力与PB92中40-50个质粒拷贝的生产能力差不多,而且比含有40-50个质粒pMAX-4拷贝的枯草杆菌菌株的总产量也有明显的产量增加。
下列实施例旨在进一步阐明本发明,而不是对本发明之范围的限定。
实施例1
制备嗜碱芽孢杆菌新种PB92的基因组DNA库并分离其丝氨酸蛋白酶基因
依照Saito-Miuva所述的方法(Biochim.Biophys.Acta72,619-632,1963)自芽孢杆菌新种PB92(寄在于Laboratorium voor Microbiologie,Technical University of Delft,the Netherlands,寄存号OR-60,见美国再版专利30602)中分离染色体DNA,用限制性内切酶Sau3A部分消化并连接到质粒pUB110(Gryczan et al.,J.Bacteriol.134,318-329,1978)的BamHI位点上。按Birnboim和Doly所述方法(Nucl.Acids Res.7,1513-1523,1979)制备pUB110质粒DNA。
按照Spizizen等人的方法(J.Bacteriol.81,741-746,1961),用每毫升反应潜能细胞600-1000ngDNA,将连接混合物转化到枯草杆菌1A40(Bacillus Genetic Stock Centre)中。将得自转化混合物的细胞铺敷在含有2.8%K2HPO4、1.2%KH2PO4、0.4%(NH4)2SO4、0.2%二水合柠檬酸三钠、0.04%MgSO4·7H2O、5.10-5%MnSO4·4H2O、0.4%L-谷氨酸、0.5%葡萄糖、0.02%酪蛋白氨基酸、50μg/ml色氨酸、20μg/ml蛋氨酸、20μg/ml赖氨酸、20μg/ml新霉素、0.4%酪蛋白和1.5%琼脂的基本培养皿上。于37℃保温过夜后,50000个新霉素抗性菌落中有一个表现增加了蛋白酶产量,这可以由琼脂平皿上菌落周围增加了酪蛋白的沉淀(晕圈)判断出来。按照Birnboim和Doly所述的方法(Nucleic Acids Res.7,513,1979)由该菌落中分离质粒DNA并定名为pM58。
实施例2
PB92丝氨酸蛋白酶基因的表达
使含有pM58的枯草杆菌1A40生长于添加了0.02%酪蛋白氨基酸、50μg/ml色氨酸、20μg/ml蛋氨酸、20μg/ml赖氨酸和20μg/ml新霉素的基本培养基中(Spizizen et al.,Proc.Natl.Acad.Sei.USA,44,1072-1078,1958)。24小时后,离心分离培养物,用二甲基酪蛋白作为底物分析上清液的蛋白酶活性(Lin et al.,J.Biol.Chem.244,789-793,1969)。用含有质粒pUB110的枯草杆菌1A40的培养物作对照,结果表明蛋白酶活性低于由PM58转化之培养物所示活性的1/60。用1mM苯磺酰氟(PMSF)处理可使蛋白酶活性完全抑制,但用20mMEDTA处理则不会呈现这一抑制效果。
按Laemmli的方法(Nature227,680,1970)在蛋白质凝胶上分析上述上清液的等分样品。经用5%三氯醋酸(TCA)处理这些上清液,在这些凝胶上制得用于分析的样品。离心后,用丙酮将沉淀的蛋白质洗两次并经煮沸10分钟使之溶解于40μl样品缓冲液(0.5MTris/HCl PH7.5,10%V/V2-巯基乙醇、50%V/V甘油和5.10-2%溴酚兰)中。电泳后用考马斯亮兰对凝胶染色。所得电泳图形(其中被分析的培养物上清液来自3个分别含有pUB110、pM58和不含质粒的不同枯草杆菌1A40菌株,并以芽孢杆菌PB92蛋白酶作为对照)表明,来自含pM58之枯草杆菌菌株1A40的样品含有31KD蛋白质,并且它与枯草杆菌PB92蛋白酶共迁移。在含pUB110之枯草杆菌1A40菌株的对照泳道上则没有检测到这种蛋白质。
因为所有丝氨酸蛋白酶均具有相似的分子量,所以可通过将pM58和pUB110转化到蛋白酶阴性枯草杆菌菌株DB104(R.Doi,J.Bacteriol160,442-444,1984)中并分析所产生的胞外蛋白酶,而将克隆的芽孢杆菌PB92丝氨酸蛋白酶与已知丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌的枯草杆菌蛋白酶、Carlsberg枯草杆菌蛋白酶)明确地鉴别开来。使所得转化体生长于含有0.02%酪蛋白氨基酸、50μg/ml组氨酸和20μg/ml新霉素的基本培养基(Spizizen et al.)上。24小时后取样,离心并在没有预理处的情况下在含有75mMKOH、40mM组氨酸、100mM MOPS(3-(N-吗啉代)-丙磺酸)(PH7.5)和5%聚丙烯酰胺的组氨酸/MOPS凝胶上进行电泳分析。电泳缓冲液含有40mM组氨酸、100mM MOPS(PH6.6)。样品沿阴极方向迁移。用Agfa Pan 100Professionnel胶片检测蛋白酶泳带(Zuidweg et al.,Biotechnol and Bioengin Vol Xlv,685-714,1972)(见图1)。该图表明pM58中包含编码芽孢杆菌PB92蛋白酶的基因。
实施例3
芽孢杆菌PB92丝氨酸蛋白酶基因的序列测定
用F.Sanger的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,6463,1977)测定PM58之BalI/HpoI片段的完整序列。在噬菌体M13载体mp10、mp11和mp18(Me-ssing et al.,Nucleic Acids Res.9,309-321,1981)中克隆PM58的限制性片段。通过噬菌斑杂交法筛选PM58的插入。测定序列后,在基因的规则距离上定位10个寡核苷酸并重复测定序列,从而进一步肯定了图3中所示的序列。
实施例4
质粒pMAX-4的构建
为了构建质粒pUCN710(图4A),首先用TaqⅠ和PvuⅡ消化pUB110。在低熔点琼脂糖凝胶上纯化含抗新霉素抗性基因的片段并用Klenow聚合酶及MTP′s(Maniatis,Mole-cular Cloning,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor,1982)将其末端填成平头。用SalⅠ将质粒pUC7(Vieira et al.,Gene19,259-268,1982)切成线形并按上述方法填成平头。用T4连接酶连接上述两个片段(Maniatis)并转化到JM103中。在含有50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml新霉素的2×TY平皿(1.6%W/V Bacto-trypton,1%W/V酵母提取物、0.5%Nacl)上进行选择。用BamHI消化所得质粒(定名为pUCN710)。用BclI消化质粒pE194(Jordanescu,Plasmid1,468-479,1978)。用T4连接酶连接两次消化所得片段并转化到枯草杆菌1A40中。在含有20μg/ml新霉素的基本平皿上进行选择(见实施例1)。所得质粒pE194-Neo(图4A)包含新霉素抗性基因及温度敏感性复制原点。
按如下方法在整合载体pE194-Neo中进行蛋白酶基因的再克隆:用HPaⅠ、BalⅠ和BglⅡ消化PM58(见实施例1)。用HpaⅠ消化质粒pE194-Neo。用T4连接酶连接这些片段并转化到枯草杆菌1A40中。基于新霉素抗性选择转化体并根据酪蛋白沉淀(晕圈形成,见实施例1)来判断蛋白酶产量的增加。以这种方法得到质粒PMAX-4,经限制性酶切分析进一步证实其结构(见图4B)。
实施例5
用PMAX-4对芽孢杆菌菌株PB92进行原生质体转化
使芽孢杆菌菌株PB92在100ml NBSG-X培养基(Thorne et al.,J.Bacteriol.91,1012-1020,1966)中生长过夜。在Sorrall GSA型转子中以4500rpm将培养物离心10分钟。细胞重新悬浮在含有0.5M蔗糖、0.02M Mgcl2和0.02M Tris/马来酸盐,PH8.0(在无菌水中配制)的10ml Alkalic Holding培养基(AHM)中后,在0.4mg/ml溶菌酶存在下于37℃保温1小时,使细胞原生质体化。离心(4500rpm,10分钟)得到原生质体并再悬浮于5ml AHM+(PH8.0)缓冲液(加有3.5%W/V Bacto Penassay培养液和0.04%W/VAlbumine Merieux的AHM缓冲液)中,混合并再制得沉淀饼。再悬浮后,将0.5ml原生质体与1μg质粒DNA混合,并在30%W/V聚乙二醇8000(PH8.0)存在下保温2分钟。用AHM+(PH8.0)培养基作1∶3稀释并离心后,将沉淀饼再悬浮于小体积(1ml)AHM+中并保温2-3小时。然后在含有0.5M琥珀酸钠/Hcl(PH8.0)、1.5%W/V琼脂、0.5%W/V酪蛋白氨基酸、0.5%W/V酵母提取物、0.031M磷酸盐缓冲液(PH8.0)、0.5%W/V葡萄糖、0.02M Mgcl2和0.02%Albumine Merieux的新的再生平皿上铺敷100μl等分样品。此外,在使用PMAX-4的情况下,这些平皿还含有相关抗生素-1000μg/ml新霉素。于37℃至少保温72小时后,在含有20μg/ml新霉素的心脏浸液琼脂平皿上复制培养这些菌落。
实施例6
PMAX-4在芽孢杆菌菌株PH92染色体中的整合
将已经确定含有质粒PMAX-4之芽孢杆菌菌株PB92的转化体接种在含有1μg/ml新霉素的胰酶解胨-大豆培养液(Tryp-tone Soya Broth,TSB)中,并于37℃保温24小时。然后在100ml含1μg/ml新霉素的同样培养基中稀释2ml细胞悬液并于50℃保温24小时。24小时后,再按上述方法稀释5ml细胞悬液,并在1μg/ml新霉素存在下再于50℃保温24小时。再次重复后一操作过程。将细胞悬液稀释100倍并铺敷于含有1μg/ml新霉素的心脏浸液(HI)平皿上。将平皿于37℃保温16小时。分离新霉素抗性菌落并在10ml含有1μg/ml新霉素的TSB培养基中37℃培养16小时。由这些培养物中分离总DNA(Holmes et al.,Anal.Biochem.114,193-197,1981)并经在琼脂糖凝胶上对DNA作电泳分析,检知没有质粒存在。将总DNA转化到枯草杆菌1A40中,再次检查没有可见质粒的样品。将缺乏转化枯草杆菌1A40之能力的样品看作是质粒阴性的。依照上述方法分离出由有新霉素抗性、无质粒的芽孢杆菌PB92衍生的菌株,并定名为PBT109。该菌株含有作为其染色体之整合部分的质粒pMAX-4的拷贝。
整合作用是通过一个所谓的Campbell型机制发生的,经同源重组导致染色体上存在由质粒序列分离的两个串联定位的蛋白酶基因(菌株PBT109)。在我们于本申请同日递交的欧洲专利EP-0000000号中,进一步证实了菌株PBT109的这种基因组织。
实施例7
转化菌株的蛋白酶生产
在含有100ml如美国再版专利30602号中所述的生产培养基的500ml振荡瓶中进行转化菌株的蛋白酶生产试验,条件是当被试菌株为枯草杆菌时,PH调到7.0。如用菌株DB104(pUB110)、DB104(pMax-4)、PB92(pMax-4),所加新霉素浓度为20μg/ml;如用PBT109,则新霉素浓度为1μg/ml。结果列于表1中。
表1
*这里仅检测了PMAX-4之蛋白酶基因的蛋白酶生产;如实施例2中所述,该质粒也被转化(Spizizen et al.,1961)到蛋白外切酶阴性枯草杆菌菌株DB104中(R.Doi.J.Bacteriol.160,442-444,1984)。
**按照Lin等所述方法(J.Biol.Chem.244,789-793,1969),用二甲基酪蛋白作底物分析蛋白酶活性。
在进行更大规模(10升)的发酵时,与pBT109菌株比较,如果不加新霉素,则芽孢杆菌PB92(PMAX-4)显示出不稳定性及蛋白酶产量降低。
Claims (31)
1、一个表达暗盒,其在转录方向上包含一个在芽孢杆菌宿主细胞内起作用的转录调节区和翻译起始区、一个编码高碱性蛋白水解酶的DNA序列、以及一个在所说宿主细胞内起作用的翻译和转录终止区,其中所说DNA序列的表达是处于所说起始和终止区之调节控制下的;另外至少包括一个细菌质粒的标志基因及温度敏感性复制原点。
2、根据权利要求1的表达暗盒,其中所说的蛋白水解酶是可由某嗜碱芽孢杆菌菌株PB92得到的。
3、根据权利要求1的表达暗盒,其中所说的DNA序列在核苷酸序列上与芽孢杆菌新种PB92的蛋白水解酶编码基因至少有70%同源性。
4、根据权利要求1的表达暗盒,其中所说的DNA序列编码一基本上包含下列氨基酸序列的多肽:
H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-35 K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-P-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
5、包含一表达暗盒的转化的芽孢杆菌宿主细胞,所说的表达暗在转录方向上包括一个在所说宿主细胞内有功能活性的转录调节区和翻译起始区、一个编码高碱性丝氨酸蛋白酶的DNA序列以及一个在所说宿主细胞内有功能活性的翻译和转录终止调节区,其中所说DNA序列的表达是处于所说转录和翻译区之调节控制下的;另外至少包括一个细菌质粒的标志基因及温度敏感性复制原点。
6、根据权利要求5的细胞,其至少包含两个整合到所说细胞染色体中之所说DNA序列的拷贝。
7、根据权利要求5的细胞,其中所说的宿主细胞是已转化的野生型丝氨酸蛋白酶生产菌。
8、根据权利要求5的细胞,其中所说的宿主细胞是野生型丝氨酸蛋白酶生产细胞的转化的突变菌株。
9、根据权利要求8的细胞,其中所说的突变菌是丝氨酸蛋白酶生产菌。
10、根据权利要求5的细胞,其中所说的高碱性丝氨酸蛋白酶是可从芽孢杆菌新种PB92中得到的。
11、在嗜碱芽孢杆菌宿主细胞中生产丝氨酸蛋白酶的方法,所说的方法包括:
向所说的宿主细胞内引入一表达暗盒,该暗盒在转录方向上包括一个转录和翻译起始调节区、一个编码丝氨酸蛋白酶的DNA序列、一个转录和翻译终止调节区,其中所说的调节区是在所说宿主细胞内有功能活性的、以及一个用于选择已转化宿主细胞的选择标志基因;
在选择性条件下培养含有所说表达暗盒的所说转化的宿主细胞,从而得到基本上没有未转化之亲代细胞的已转化的培养物;以及
在培养基中温育所说的已转化的培养物,借以过量产生所说的丝氨酸蛋白酶。
12、根据权利要求11的方法,其中所说的宿主细胞是野生型丝氨酸蛋白酶生产菌。
13、根据权利要求11的方法,其中所说的宿主细胞是野生型丝氨酸蛋白酶生产菌的突变体。
14、根据权利要求13的方法,其中所说的突变体是丝氨酸蛋白酶非生产菌。
15、根据权利要求12的方法,其中所说的嗜碱菌株是芽孢杆菌新种PB92。
16、转化嗜碱芽孢杆菌细胞的方法,其包括:
在碱性培养基中,于大约20℃至37℃,用溶菌酶预处理所说的芽孢杆菌细胞,以形成原生质体;
将所说的原生质体与所说的溶菌酶分离开;
在促融合剂存在下,于大约20℃至37℃,使所说的原生质体与一DNA构建物结合;
稀释所说的促融合剂并使所说的芽孢杆菌细胞再生;并且
在选择条件下,使所说再生的芽孢杆菌细胞生长。
17、根据权利要求16的方法,其中所说的DNA构建物在转录方向上包括一个转录和翻译起始调节区;一个编码有用多肽的DNA序列、及一个转录和翻译终止调节区,其中所说的调节区是在所说宿主细胞内有功能活性的。
18、提高嗜碱芽孢杆菌菌株中有用多肽之生产能力的方法,所说的方法包括:
在促融合剂存在时及碱性pH条件下,使所说宿主细胞的原生质体与含有一个编码所说宿主细胞之内源性酶的DNA序列、一个在所说宿主细胞内具有功能活性的复制系统及一个选择标志基因的质粒构建物结合,进而使所说的DNA掺入到所说的宿主细胞内;
选择含有所说DNA的所说的宿主细胞;以及
在有利于合成所说的有用多肽的条件下培养所说的宿主细胞。
19、根据权利要求18的方法,其中所说的宿主细胞是芽孢杆菌新种PB92。
20、根据权利要求18或19的方法,其中所说的内源性酶是丝氨酸蛋白酶,最好是高碱性蛋白酶。
21、根据权利要求18至20中任一项的方法,其中所说DNA的至少一个拷贝被掺入到所说宿主细胞内。
22、编码基本上具有下列氨基酸序列之多肽的DNA序列:
H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-35 G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-F-A-A-T-R-COOH.
23、编码来源于芽孢杆菌新种PB92之丝氨酸蛋白酶的DNA序列。
24、依下述方法得到的转化的芽孢杆菌宿主细胞,该方法包括:
分离包含一个编码能在所说宿主细胞内表达之丝氨酸蛋白酶基因的DNA片段;
将所说的DNA片段连接到线性载体DNA上,以产生一个含所说基因及选择标志的载体;
在促融合剂存在时及碱性pH条件下,使由宿主细胞制得的原生质体与所说的载体结合,从而将所说的基因引入到所说的宿主细胞内并整合到所说宿主细胞的染色体中;以及
选择稳定地保留所说基因的宿主细胞。
25、根据权利要求24的转化的芽孢杆菌宿主细胞,其中所说的芽孢杆菌是芽孢杆菌新种PB92。
26、根据权利要求24的转化的芽孢杆菌宿主细胞,其中所说的载体是pMAX-4。
27、质粒pMAX-4。
28、芽孢杆菌PBT109
29、一分离的DNA或RNA寡核苷酸,其至少包含选自一能够与编码可得自芽孢杆菌新种PB92的高碱性丝氨酸蛋白酶之氨酸序列相杂交的核苷酸的15个连续核苷酸。
30、根据权利要求29的寡核苷酸,其包含有放射活性标记。
31、根据权利要求29或30的寡核苷酸,其至少包含20个连续的核苷酸。
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