FI106726B

FI106726B - Korkea-alkalisia proteaaseja koodaavien geenien transformointi Bacillus-bakteereihin, ja menetelmässä käytettävät vektorit, DNA-sekvenssit ja koettimet

Info

Publication number: FI106726B
Application number: FI925413A
Authority: FI
Inventors: Eekelen Christiaan A G Van; Der Laan Johannes C Van; Leonardus J S M Mulleners
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1992-11-27
Publication date: 2001-03-30
Also published as: WO1988006624A2; AU1398088A; FI884904A; DK175738B1; WO1988006624A3; LT4000B; FI105483B; BR8805647A; DK593988A; HU213220B; DK593988D0; ATE181110T1; FI925413A0; US5217878A; DE3856339D1; DK200401262A; DK175852B1; RU2023723C1; FI119028B; AU620026B2

Description

106726

Korkea-alkalisia proteaaseja koodaavien geenien transfor-mointi Baci1lus-bakteereihin, ja menetelmässä käytettävät vektorit, DNA-sekvenssit ja koettimet (Jakamalla erotettu ph:sta 88 4904) Tämän keksinnön aiheena on seriiniproteaasin tehostunut tuotanto Bacillus-kannoissa rekombinaatiomenettelytapoja käyttäen.

Eacillus-lajeja on käytetty laajalti teollisesti tärkeiden entsyymien kuten alfa-amylaasin, neutraalin proteaasin ja alkalisten proteaasien tai seriiniproteaasien tuotannossa. Yleisesti ottaen bakteeriperäisiä seriiniproteaaseja voidaan saada monista prokaryoottisistä organismeista mukaanlukien gram-negatiiviset organismit kuten Serratia- tai Pseudomonas-laiit ja gram-positiiviset bakteerit kuten Micrococcus- ja Bacillus-lajit. Teollisesti tärkeiden seriiniproteaasien erityisen kiinnostava ryhmä ovat korkean aktiivisuuden emäksisessä ympäristössä omaavat proteaasit. Eri Bacillus-lajien, mukaanlukien Ek. subtilis, B. licheni-formis. B. amvlolicmefaciens. B. alcalophilus ja muut Bacillus-lajit, tuottaessa teollisia seriiniproteaaseja, korkea-alkalisia (high alkaline) proteaaseja tuottavat yleensä Bacillus-lajit, jotka kykenevät kasvamaan emäksisessä pH:ssa. Esimerkki tällaisesta Bacillus-lajista : : on Bacillus novo -laji PB92.

Proteolyyttisten entsyymien, erityisesti korkea-alkalisten proteaasien, tuottamiseen siten, että saanto on korkea, kykenevien Bacillus-kantojen kehittämistä kohtaan tunne-taan huomattavaa kiinnostusta.

Useita solunulkoisten Baeillus-entsvvmien geenejä on kloonattu menestyksekkäästi, kuten alfa-amylaasigeenit organismeista, B. amvloliquefaciens (Palva et ai., Gene 15 (1981) 43-51), B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23. (1983) 267), B. stearothermophilus (Mielenz et ai., Proc. Natl.

2 106726

Acad. Sei. USA 80 (1983) 5975-5979; EPA-0057976 ja B. sub-tilis Yang et al., Nucleic Acids Res. 11^ (198 3) 237); Te-vaanisukraasigeeni B. subtills (Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); neutraalia proteaasia koodaavat geenit B. stearothermophllus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983) 831), B. amyloliguefaciens (Honjo et al., J. Biotech. 1 (1984) 165) ja B. subtllis (Yang et al., J. Bacteriol. 160 (1984) 115; seriiniproteaasia tai emäksistä proteaasia koodaavat geenit B. subtills (Wong et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81_ (1984) 1184), B. lichenifor-mis (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13^ (1985) 8913) ja B. amyloliguefaciens (Wells et al., Nucleic Acids Res. 11^ (1983) 7911).

Teollisten seriiniproteaasien tuottamista eri Bacillus-la jeissa kuvataan esimeriksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,674,643; 3,723,250; ja 4,480,043. Emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevien Bacillus-kantojen korkea-alkalisen proteolyyttisen entsyymin tuotantoa kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,723,250; Re. 30,602 ja 4,480,037. Yleiskatsauksen osalta koskien Bacillus-lajien käyttöä teollisesti tärkeiden entsyymien tuottamiseksi katso esimerkiksi Debabov, 'The Industrial Use of Bacilli' kirjassa The Molecular Biology of Bacilli (Academic Press, ; New York, 1982).

Menetelmän B. subtiliksen protoplastitransformaation suorittamiseksi ovat kuvanneet Chang ja Cohen (Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115). Samankaltaisia menetelmiä on kuvattu transformoinnin suorittamiseksi menestyksekkäästi, « ♦. kun kyseessä ovat B. meqaterium-protoplastit (Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Letters 2 (1980) 261-263), B. amylo-liquefaciens-protoplastit (Smith et al., Appi. and Env. Microbiol. 21 (1986) 634), B. thuringiensls-protoplastit (Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), B. sphaericus-protoplastit (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 3 106726 (1984) 203), ja B. larvae-protoplastlt (Bakhiet et ai., Appi. and Env. Microbiol. 49 (1985) 577). Bakhiet et ai., supra, ilmoittivat kuitenkin epäonnistumisesta B. popil-laen kohdalla. Mann et ai., Current Microbiol. 13 (1986) 131-135, ilmoittivat lajien B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans ja B. laterosporus menestyksekkäästä transfor-moinnista. Menetelmä ei kuitenkaan ollut tuloksekas lajien B.coaqulans, B. cereus ja B. pumilus kohdalla, vaikka todettiin hyvää protoplastimuodostusta. Muihin menetelmiin DNA:n viemiseksi protoplasteihin kuuluu fuusioiminen DNA:ta sisältäviin liposomeihin, Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97.

Keksinnön kohteena ovat uudet alkalofiiliset Baclllus-kannat sekä menetelmät ja kokoonpanot tällaisten kantojen transformoimiseksi. Keksinnön kohteena on niinikään uusi DNA-sekvenssi, joka käsittää alkalofiilisestä Bacillus-kannasta peräisin olevan korkea-alkalista proteolyyttistä entsyymiä koodaavan geenin. Isäntäsolu, joka omaa edullisesti positiivisen taustan, transformoidaan käyttäen plasmid i rakennetta, joka käsittää sanottua korkea-alkalista proteolyyttistä entsyymiä koodaavan geenin. Voidaan käyttää protoplastitransformointia plasmidirakenteen avulla polyetyleeniglykolin läsnäollessa emäksisessä pH:ssa. DNA-; sekvenssiä voidaan ylläpitää kromosominulkoisesti tai se voidaan integroida isäntäsolugenomiin.

Lyhyt kuvaus piirroksista:

Kuviossa 1 esitetään tulokset histidiini/MOPS-geeli-elektroforeesiajosta, joka suoritettiin pUB110:n tai vastaavasti pM58 sisältävien B. subtilis DB104 - viljelmien supernatanteilla, verrattuna useihin subtilisiineihin.

vyöhyke 1: Carlsberg-subtilisiini vyöhyke 2: Bacillus PB92 -proteaasi 106726 vyöhyke 3: Bacillus subtills -subtilisiini vyöhyke 4: Bacillus subtills DB104 (pM58) vyöhyke 5: Bacillus subtllls DB104 (pUBHO)

Kuviossa 2 esitetään plasmidin pM58 restriktiokartta. Kuvion yläosassa esitetään edelleen sekvenssoimisstrategia. Nuolilla varustetut kiinteät viivat edustavat faagi M13 -vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 kloonattuja fragmentteja. Kuvion alaosassa esitetään sekvenssoimisstrategia, jossa käytetään proteaasigeenissä tasaisin välein sijaitsevia 10 oligonukleotidiä.

Kuviossa 3 esitetään koodaavan juosteen nukleotidisekvens-si korreloituna Bacillus PB92 -seriiniproteaasin aminohapposekvenssiin. Promoottorit (P1# P2), ribosomisitoutumis-keskukset (rbs) ja lopetusalueet (term) on niinikään esitetty. Numeroidut kiinteät viivat edustavat sekvensoinnissa käytettyjen 10 oligonukleotidin sijaintikohtia.

Kuviossa 4A esitetään plasmidin pE194-neo rakentaminen.

Kuviossa 4B esitetään plasmidin pMAX-4 rakentaminen.

Tämän keksinnön mukaan tarjotaan uusia DNA-rakenteita ja . < Baclllus-kantoj a proteolyyttisten entsyymien tuottamiseksi siten, että saanto on korkea, sekä menetelmiä niiden valmistamiseksi. Isäntäsolut transformoidaan yhdistämällä Bacillus-lsäntäkannasta valmistetut protoplastit fuusioi-misolosuhteissa plasmidirakenteeseen, joka käsittää jotain proteolyyttistä entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin.

« «

Korkea-alkaliset proteaasit ovat seriiniproteaaseja tai subtilisiineja, jotka ovat erittäin aktiivisia emäksisessä ympäristössä. Tarkemmin ottaen korkea-alkalisten proteaa-sien optimiaktiivisuus ilmenee yli noin 9:n ylittävillä pH-arvoilla ja ne säilyttävät tästä optimiaktiivisuudesta 106726 ainakin 80 % pH:ssa noin 11 tai jopa yli. Korkea-alkalisia proteaaseja tuottavat yleensä emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevät Bacillus-kannat.

Proteaasigeenin eristyksessä käytetyt menetelmät ovat alalla tunnettuja ja niitä ovat synteesi, eristys genomi-DNArsta, valmistaminen cDNA:sta tai näiden yhdistelmät. Korkea-alkista proteaasia koodaavien geenien eristys ja ilmentäminen on julkistettu tämän patenttihakemuksen pohjana olevassa etuoikeusasiakirjassa, EP-hakemusjulkaisussa n:o EP-A-87200358.7, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä. Eri menetelmät geenien manipuloimiseksi ovat tunnettuja ja niihin lukeutuvat restriktio, pilkkominen, uudelleenpilkkominen (resection), ligatointi, in vltro-mutatointi, alukkeen avulla korjailu (primer repair), liittäjien ja siltasekvenssien käyttö ja muut samankaltaiset menetelmät. Katso Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

Yleisesti ottaen menetelmä käsittää genomikirjaston valmistamisen korkea-alkalista proteaasia ilmentävästä organismista. Luovuttejamikro-organismin genomi eristetään ja pilkotaan soveltuvalla restriktioentsyymillä. Saadut luo-: vuttajakannan DNA-fragmentit ligatoidaan sitten kloonaus- vektoriin, joka on pilkottu yhteensopivalla restriktioen-donukleaasilla.

Insertoidun DNA-fragmentin sisältävät kloonit voidaan tunnistaa resistenssimerkin avulla tai käyttämällä jotain suoraa tai positiivista valikoimismenettelyä kuten B. sub-tilikselle (Gryczan ja Dubnow, Gene 20 (1982) 459-469) kehitetty menettely. Lisäksi korkea-alkalista proteaasia ilmentävät kloonit voidaan tunnistaa käyttämällä ilmentymis-tuotteen vastaisia vasta-aineita tai toteamalla kyseisen proteolyyttisen entsyymin substraatin hävikki tai tuot- β 106726 teenmuodostus. Esimerkiksi merkkigeeniä, kuten antibioot-tiresistenssigeeniä, ilmentäviä pesäkkeitä voidaan seuloa proteaasituotannon suhteen, jolloin viimemainittu määritetään kaseiinikehäsaostuman kasvun perusteella kaseiinia sisältäville maljoille maljattujen pesäkkeiden ympärillä.

Kun täydellinen geeni on tunnistettu, joko cDNA:na tai kromosomi-DNA:na, sitä voidaan manipuloida lukuisilla tavoilla ilmaisun aikaansaamiseksi. Voidaan käyttää Bacil-lus-isäntlä, jotka ovat esimerkiksi alkalofiilisiä bakteereita, mukaanlukien ne alkalofiiliset Bacillus-lajit, jotka jo tuottavat korkea-alkalisia proteaaseja. Edullinen isäntäorganismi on Bacillus novo -laji PB92. Sen vuoksi on käytännöllistä ylläpitää villityyppisekvenssiä, joka omaa säätösignaaleja ja erittyviä johtosekvenssejä, jne., vaikka muistakin Bacillus-lajeista saatuja, kyseisessä Bacil-lus-isäntäkannassa funktionaalisia kontrollialueita voidaan niinikään käyttää. Jonkin Bacillus-solun transfor-mointiin soveltuva vektori sisältää täten korkea-alkalista proteaasia koodaavan rakennegeenin, joka voidaan saada jostain alkalofiilisesta Bacillus-lajista, esim. säätö-alueita, kuten esim. promoottorisekvenssin, ribosomisitou-tumiskeskuksen muodostavan sekvenssin ja emäksistä proteaasia koodaavan geenin transkription ja translaation lope- : . tusta sääteleviä sekvenssejä, jotka ovat alkalofiilisessä > «

Bacillus-isäntäsolussa funktionaalisia.

Vektori voi sisältää lisäksi merkkigeenin, esimerkiksi tuottamaan resistenssin jollekin antibiootille, jolle kyseinen isäntäkanta on herkkä, sekä jonkin toisiintumisal- .: kukohdan, joka kykenee toisiintumaan itsenäisesti isäntä- « solussa. Toisiintumisalkukohta voi käsittää mutaation, joka tekee sen toiminnasta isäntäsolussa lämpötilaherkän, jolloin mahdollistuu kromosomi-integraation esiinseulonta Ehrlichin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_5 (1978) 1433, kuvaaman mukaan.

106726

Aminohapposekvenssiä voidaan käyttää sellaisen koettimen suunnittelemiseksi ja rakentamiseksi, jolla seulotaan korkea-alkalista proteaasia koodaavan geenin luovuttajaso-luina kiinnostavista soluista peräisin olevasta mRNArsta tai DNA:sta valmistettua genomikirjastoa. Käyttämällä korkea-alkalista proteaasia koodaavaa cDNA:ta tai sen fragmenttia hybridisaatiokoettimena voidaan helposti kloonata muista organismeista tavattuja rakenteellisia suku-laisgeenejä. Erityisen kiinnostavaa on geenien eristys korkea-alkalisia seriiniproteaaseja ilmentävistä organismeista käyttämällä oligonukleotidikoettimia, jotka perustuvat alkalofiilisista Baclllus-kannoista, mukaanlukien Bacillus novo -lajista PB92, saatavissa olevien korkea-alkalisia seriiniproteaaseja koodaavien nukleotidisekvens-seihin. Tällaiset koettimet voivat olla huomattavasti lyhyempiä kuin sekvenssi kokonaisuudessaan, mutta niiden pituuden tulisi olla vähintään 10, edullisesti vähintään 15 ja edullisemmin 20 nukleotidia. Pidemmätkin oligonuk-leotidit ovat hyödyllisiä aina geenin täyteen mittaan asti, jolloin pituus ei edullisesti ylitä 1200 nukleotidia. Voidaan käyttää sekä RNA- että DNA-koettimia.

Käytännössä koettimet leimataan tyypillisesti jollain todettavalla tavalla (esim. 32P:llä, 3H:lla, biotiinilla tai . avidiinilla), minkä jälkeen niitä inkuboidaan organismis-

Λ I

ta, josta geeniä etsitään, peräisin olevan yksisäikeisen DNA:n tai RNA:n kanssa. Hybridisoituminen todetaan leiman avulla, sen jälkeen kun yksisäikeinen ja kaksisäikeinen (hybridisoitunut) DNA (tai DNA/RNA) on erotettu toisistaan (tyypillisesti nitroselluloosapaperia käyttäen). Alan am- ’1' mattilaiset ovat hyvin perillä oligonukleotidien yhteydes sä käytettäviksi soveltuvista hybridisoimismenettelyistä.

Vaikka koettimia käytetään normaalisti helpon tunnistuksen mahdollistavan todettavan leiman kanssa, myös leimaamatto-mat oligonukleotidit ovat hyödyllisiä sekä leimattujen ko- 8 106726 ettimien prekursoreina että käytettäviksi menetelmissä, jotka mahdollistavat kaksisäikeisen DNA:n (tai DNA/RNA:n) suoran toteamisen. Tämän mukaisesti ilmaisu oligonukleoti-dikoetin viittaa sekä leimattuihin että vailla leimaa oleviin muotoihin. Ligatointiseoksella transformoidaan sitten transformoitumiskelpoisia B. subtilis-soluj a♦ Merkkigeeniä valikointikeinona käyttäen voidaan sitten eristää rekombi-nanttiplasmideja, joita voidaan karakterisoida restriktio-analyysin ja sekvenssoinnin avulla.

Korkea-alkalisen proteaasin tuottamiseksi edullinen, jo jotain seriiniproteaasia tuottavien Bacillus-kantoien transformointiin käytettävä DNA-sekvenssi on eräs Bacillus novo -lajista PB92 peräisin oleva sekvenssi. Kyseisen DNA-sekvenssin koodaaman seriiniproteaasin aminohapposekvenssi on seuraava: H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-n-a-e-l-y-a-v- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-’* 1 T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

Vaikka proteaasigeenin saamiseksi edullinen kanta on Bacillus novo -laji PB92, oleellisesti sama seriiniproteaa-si voidaan saada muistakin alkalofiilisistä Bacillus-la-/ jeista. Tällaiset proteaasigeenit, jotka omaavat vähintään 70 %:n ja edullisesti yli 80 %:n homologian Bacillus PB92:n aminohapposekvenssin nähden, tulee ymmärtää kyseisen keksinnön piiriin kuuluviksi.

Toivottavaa on, että ilmentymistuote erittyy. Koska emäksinen proteaasi erittyy, voidaan käyttää villityypin 9 106726 johto- ja prosessoimissignaaleja. Lisäksi voidaan valmistaa fuusioitu geeni varustamalla rakennegeeni 5'-sekvenssillä, joka koodaa erittyvää johto- ja prosessoimissignaa-lia. Edustavia heterologisia erittyviä johtosekvenssejä ovat Bacillus-amylaasi- ja Bacillus-proteaasigeenien erittyvät johtosekvenssit. Fuusioimalla tarkoituksenmukaisella lukualueella erittyvä johtosekvenssi kiinnostavaan raken-negeeniin kasvualustaan saadaan erittymään kypsä alkalo-fiilinen proteaasi.

Ilmentämiskasetti voi olla täysin tai osittain peräisin luontaisista lähteistä ja olla täysin tai osittain peräisin isäntäsoluun nähden homologisista lähteistä, tai isän-täsoluun nähden heterologisista lähteistä. Keksinnön mukaiset eri DNA-rakenteet (DNA-sekvenssit, vektorit, plas-midit, ilmentämiskasetit) eristetään ja/tai puhdistetaan, tai syntetisoidaan, jolloin ne eivät ole "luontaisesti esiintyviä".

Riippuen siitä, halutaanko rakennegeenin integroituvan isäntäkannan kromosomiin vai kromosominulkoisen yksikön tulevan ylläpidetyksi, voidaan mukaan sisällyttää toi-siintumisjärjestelmä Bacillus-lajia varten tai olla sitä sisällyttämättä. Integrointia silmälläpitäen plasmidira-. kenteen homologisia jaksoja Bacillus-genomiin nähden voi daan käyttää rekombinoitumistodennäköisyyden kasvattamiseksi. Lisäksi lämpötilaherkän toisiintumisalkukohdan sisällyttäminen plasmidirakenteeseen mahdollistaa valikoinnin kromosomi-integraation suhteen. Katso esimerkiksi Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1433.

Isäntäsoluun voidaan insertoida rakennegeenistä useampi kuin yksi kopio rakennegeenin ilmentymisen vahvistamiseksi. Rakennegeenin stabiili vahvistuminen voidaan saada integroimalla isäntäsolugenomiin rakennegeenistä vähintään yksi ylimääräinen kopio ja valikoimalla transformanttien 10 106726 suhteen, joissa rakennegeenin kopioita erottavat endogee-niset kromosomaaliset sekvenssit. DNA-rakenteita ja menetelmiä prokaryoottisille järjestelmille kuvataan EP-hake-musjulkaisussa n:o EP-A-87200356.1, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

Toisiintumisjärjestelmän ohella plasmidirakenteeseen sisältyy tavallisesti vähintään yksi merkkigeeni. Merkkigee-nillä tarkoitetaan jossain isännässä ilmentymään kykenevää rakennegeeniä, joka tuottaa biosidi- tai virusresistens-sin, tai resistenssin raskasmetalleille, immuniteetin tai muuta vastaavaa. Biosidiresistenssin kyseessä ollessa tämä saattaa käsittää resistenssin antibiooteille, esimerkiksi neomysiinille, kanamysiinille, tetrasykliinille jne. Merkkigeeni valitaan mahdollistamaan valikointi alhaisten kopiolukujen ja sellaisen antibioottipitoisuuden kyseessä ollessa, joka ei vakavasti häiritse rekombinanttisolujen kasvua. Erityisen kiinnostava on neomysiiniresistenssi.

Eri DNA-sekvenssit voivat olla peräisin vaihtelevista lähteistä ja ne voidaan liittää toisiinsa vektorin saamiseksi, joka sisältää yhden tai useamman kätevän, edullisesti yksittäisen restriktiokeskuksen, jolloin on mahdollista insertoida tai korvata rakennegeenit näihin keskuk-, .< siin plasmidirakenteen saamiseksi.

Kun plasmidirakenne on valmistettu, sillä voidaan transformoida soveliaita isäntäsoluja. Bacillus-isäntä voi olla mikä tahansa Bacillus-kanta, joskin soveliasta kantaa va-littaesa otetaan huomioon tekijät, jotka mahdollisesti te-: hostavat korkea-alkalisten proteaasien tuotantoa. Tuotan toa voidaan tehostaa lukuisilla tavoilla, mukaanlukien isännän käyttäminen, jossa halutun tuotteen hajoaminen on alentunut, säätösignaalit tulevat tunnistetuiksi, eritys sujuu vaikeuksitta, jne. Täten vaikka edullinen Bacillus-isäntä tuottaa jotain korkea-alkalista proteaasia, ja on 11 106726 joko villityypin Bacillus tai mutanttl-Baclllus, Baclllus-isäntä voi niinikään olla jonkin korkea-alkalisen proteaa-sin tuottavan Bacilluksen mutantti, joka ei tuota korkea-alkalista proteaasia.

Korkea-alkalisia proteaaseja tuottavat Bacillus-lajit eivät ole taksonomisesti hyvin luokiteltuja ja niihin viitataan yleensä alkalofiilisinä Bacillus-kantoina. Esimerkkejä emäksisessä pH:ssa kasvamaan kykenevistä Bacillus-kannoista kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,723,250; Re. 30,602 ja 4,480,037. Eräs esimerkki edullisesta alkalofiilisesta Bacillus-isäntäkannasta on kanta Bacillus novo -laji PB92, joka on julkaistu mm. US-patenttijulkaisussa n:o Re. 30,602.

Isäntäsoluina voidaan käyttää myös teollisia alkalofiili-siä Bacillus-kantoj a. Teolliset Bacillus-kannat ovat peräisin organismeista, jotka ovat eristettävissä maaperästä tai ovat saatavissa talletuslaitoksista tai muista lähteistä, ja ne saadaan tällaisia Bacillus-kantoja geneettisesti modifioimalla. Teollisille Bacillus-kannoille on tunnusomaista vastuskyky geenivaihtoa kohtaan, kuten faa-gitartutusta tai transformointia kohtaan. Kyseiset kannat ovat stabiileja ja ne saattavat valinnaisesti kyetä itiö-muodostukseen. Ne ovat yleensä prototrofisia ja niitä on yleensä modifioitu tuottamaan endogeenisten proteiinituotteiden, kuten entsyymien alfa-amylaasi ja eri proteaasit, suuria saantoja. Teollisessa tuotantoprosessissa saadun endogeenisen proteiinituotteen saanto saattaa olla ainakin 5 g/1 (0,5 % w/v). Teolliset kannat erittävät myös DNA-: aaseja, mistä seurauksena DNA hajoaa kasvualustassa, mikä puolestaan tuottaa suojan geenivaihtoa vastaan.

Alkalofiilisten Bacillus-kantoj en transformointiin liittyy edullisesti sanotuista kannoista peräisin olevien proto-plastien käyttö. Kuitenkaan Cohenin et ai., supra, kuvaa- 12 106726 man mukainen tavanomainen protoplastitransformoimisjärjestely ei toimi alkalofiilisten Bacillus-kantoj en kyseessä ollessa. Tämän vuoksi on kehitetty lisäjärjestelyjä.

Alkalofiilisten Bacillus-1ajien kyseessä ollessa proto-plastien muodostuminen ja regeneraatio voivat tapahtua korkeassa pH:ssa, edullisesti pH:ssa noin 8. Protoplasteja voidaan valmistaa uudelleensuspendoimalla solut emäksiseen ylläpitoalustaan (Alkaline Holding Medium, AHM), pH 7,8 - 8,5, minkä jälkeen soluja inkuboidaan 30-80 minuutin ajan 37°C:ssa. Esimerkin yhdestä AHMrstä osalta katso esimerkki 5. Saadut protoplastit pestään sitten lysotsyymin poistamiseksi, minkä jälkeen ne uudelleensuspendoidaan AHM:ään. Sitten plasmidirakenne ja alkalofiilinen Bacillus-isäntä-protoplasti yhdistetään sopivan fusogeenin läsnäollessa. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa halutun tehokkuuden tuottavaa fusogeenia, useimmissa tapauksissa polyetylee-niglykolin (mp. 1000 - 8000) on todettu tuottavan erittäin tehokas fuusio, johon yhdistyy hyvin kätevä käyttö, vastaanottavasta Bacillus-kannasta valmistettuja protoplasteja ja plasmidirakennetta sekoitetaan keskenään ei 5 minuuttia ylittävän ajan, edullisesti ei pitempää kuin 2 minuuttia, polyetyleenigykolin läsnäollessa. Sitten fusogee-niseos korvataan tavanomaisella ravinnekasvualiistalla, jossa soluja inkuboidaan korkeintaan 5 tunnin ajan, edullisesti 2-3 tuntia, ennen kuin ne siirretään regeneroimis-maljoihin. Regeneroimismaljat sisältävät jotain antibioottia kuten neomysiiniä transformanttien valikoimiseksi.

Kloonit, joissa DNA-rakenteen ylläpito on episomaalinen, • voidaan tunnistaa toteamalla korkea-alkalisen seriinipro- teaasin ilmentyminen. Niiden kloonien tunnistamiseksi, jotka sisältävät ilmentämisrakenteen kromosominsa inte-graalisena osana, kehittyvät kloonit seulotaan eristämällä kokonaissolu-DNA ja valikoimalla ne kloonit, joissa ei ole todettavissa vapaata plasmidi-DNA:ta, mutta joissa plasmi- 13 106726 din merkkigeeni ilmentyy. Kloonit voidaan sitten seuloa sopivilla tavoilla erittäin emäksisen proteaasin ilmentymisen toteamiseksi.

Eri toteamismenettelyltä ovat spesifisten vasta-aineiden käyttö, DNA- tai RNA-hybridisaatio, entsyymituotteen muodostuminen tai entsyymin substraatin häviäminen, ja niitä voidaan käyttää kloonien seulomiseksi ilmentämisrakenteen ja kiinnostavan rakennegeenin ilmentymisen, eli proteaasi-tuotannon, läsnäolon toteamiseksi. Syntynyttä proteaasia voidaan karakterisoida blokemiallisesti esimerkiksi määrittämällä proteaasin molekyylipaino SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesiajon, histidiini/MOPS-geelielektro-foreesin avulla ja määrittämällä kineettiset parametrit Km ja Vmax, jolloin määritys suoritetaan synteettisen substraatin sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-prolyyli-L-fe-nyylialanyyli-p-nitroanilidin avulla.

Ilmentämisrakenteen episomaalisesti tai kromosomin integroituneena sisältävänä Bacillus-isäntää viljellään sitten ravinnekasvualustassa entsyymin syntetisoitumista suosivissa olosuhteissa. Ravinnekasvualusta sisältää tavallisesti jonkin keinon plasmidin ylläpitämiseksi, jollainen on esimerkki jonkin antibiootin läsnäolo, jolle ei-trans-formoitu isäntä on herkkä. Käyttämistä voidaan jatkaa, kunnes kasvatusliemi on tullut loppuunkäytetyksi. Jos tuote on erittynyt, tuote voidaan eristää kasvatusliemestä tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi uuttamalla, kro-matografisesti, elektroforeettisesti tai muulla vastaavalla tavalla. Jos tuote on jäänyt sytoplasmaan, solut ote-: taan talteen sentrifugoimalla, suodattamalla jne., tuote- * taan niihin lyysi mekaanisesti rikkomalla, detergentin tai lysotsyymin avulla, tai muilla menetelmillä, ja eristetään tuote kuten aiemmin on kuvattu. Ei-transformoidun isäntä-solun ollessa korkea-alkalisen proteaasin tuottaja kyseistä menetelmää käyttämällä voidaan päästä korkea-alkalisen 106726 proteaasin runsaasti kasvaneisiin saantoihin, jotka ovat tavallisesti vähintään noin 120 % ei-transformoidun isän-täsolun saannosta, vain yhden kromosominulkoisen geeniko-pion avulla.

Seuraavat esimerkit tarjotaan havainnollistamistarkoituk-sessa eikä rajaavassa mielessä.

ESIMERKKI 1

Genomi-DNA-kirjaston valmistus alkalofilllsestä Bacillus novo -lajista PB92 ja seriinlproteaasigeenin eristys

Kromosomi-DNA:ta eristettiin Bacillus novo -lajista PB92 (talletettu numerolla OR-06 talletuslaitokseen Laborato-rium voor Microbiologie, Technical University of Delft, Hollanti; katso US-patenttijulkaisu n:o Re. 30,602) Saito-Miuvan, Biochim. Biophys. Acta. 72 (1963) 619-632, kuvaaman menetelmän mukaan, minkä jälkeen se pilkottiin osittain restriktioentsyymillä Sau3A ja pilkkomistuotteet li-gatoitiin plasmidin pUBHO (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329) BamHI-keskukseen. Plasmidin pUBHO plasmidi-DNA valmistettiin kuten Birnboim ja Doly (Nucl. Acids. Res. 2 (1979) 1513-1523) ovat kuvanneet.

Ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-lA40:ää (Bacillus Genetic Stock Centre) Spizizenin et ai., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746, menetelmän mukaan käyttäen 0,6 - 1 /ug DNA;ta millilitraa transformoitumiskelpoisia soluja kohden. Transformoimisseoksen soluja maljättiin mini-maalimaljoille, joissa kasvualusta sisälsi: 2,8 % K2HP04;ää, 1,2 % KH2P04;ää, 0,4 % (NH4)2S04;ää, 0,2 % tri-Na-sitraatti.2H20;ta, 0,04 % MgS04.7H20:ta, 0,00005 % MnS04.4H20:ta, 0,4 % L-glutamiinihappoa, 0,5 % glukoosia, 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metioniinia, 20 /ug/ml lysiiniä, 20 /ug/ml neomysiiniä, 106726 is 0/4 % kaseiinia ja 1,5 % agaria. Maljojen yön yli kestäneen inkuboinnin 37eC:ssa jälkeen yksi 50 000:stä neomy-siiniresistentistä pesäkkeestä osoitti kasvanutta proteaa-situotantoa, mikä määritettiin kaseiinipilkkoutumistuot-teiden muodostaman saostumakehän kasvusta pesäkkeen ympärillä agar-maljassa. Tästä pesäkkeestä eristettiin plas-midi-DNA Birnboimin ja Dolyn, Nucleic Acids Res. T_ (1979) 1513-1523, kuvaaman menetelmän mukaan ja se nimettiin pM58:ksi.

ESIMERKKI 2 » PB92-seriiniproteaasigeenin ilmentyminen pM58:n sisältävää Bacillus subtilis lA40:ää viljeltiin mi-nimaalikasvualustassa (Spizizen et ai., Proc. Natl. Äcad.

Sei. USA 44 (1958) 1072-1078), johon oli lisätty 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metio-niinia, 20 /ug/ml lysiiniä ja 20 /ug/ml neomysiiniä. Kun oli kulunut 24 tuntia, viljelmä sentrifugoitiin ja super-natantista määritettiin proteaasiaktiivisuus käyttäen di-metyylikaseiinia substraattina (Lin et ai., J. Biol. Chem.

244 (1969) 789-793). Plasmidin pUBHO sisältävää B. sub-tills-viljelmä, jota käytettiin kontrollina, osoitti alle l/60-osan pM58:lla transformoidun viljelmän osoittamasta proteaasiaktiivisuudesta. Proteaasiaktiivisuus inhiboitu! täysin käsiteltäessä 1 mM fenyylisulfonyylifluoridiliuok-sella (PMSF), mutta ei käsiteltäessä 20 mM EDTA-liuoksel-la.

: Näytteitä edelläkuvatuista supernatanteista analysoitiin proteiinigeelissä Laemmlin, Nature 227 (1970) 680, menetelmän mukaan. Näissä geeleissä analysoitaviksi aiotut näytteet valmistettiin käsittelemällä supernatantteja 5-%:isella trikloorietikkahapolla (TCA). Näytteen sentri-fugoinnin jälkeen saostuneen proteiinin muodostama pellet- 16 106726 ti pestiin kahdesti asetonilla, minkä jälkeen se liuotettiin 40 /Ulraan näytepuskuria (0,5M Tris/HCl, pH 7,5, 10 % v/v 2-merkaptoetanolia, 50 % v/v glyserolia ja 0,05 % bro-mifenolisinistä) keittämällä 10 minuutin ajan. Elektrofo-reesiajon jälkeen geelit värjättiin valmisteella Coomassie Brilliant Blue. Sitten viljelmäsupernatanttinäytteet analysoitiin elektroforeettisesti. Käytettiin kolmea eri B. subtllis lA40-kantaa: kantaa, joka sisälsi pUB110:n; tai pM58:n; tai joka ei sisältänyt plasmidia; sekä Bacillus PB92-proteaasia kontrollina. Elektroforeesiajon jälkeen geelit värjättiin käyttäen valmistetta Coomassie Brilliant Blue ja poistettiin väri. Plasmidin pM58 sisältävästä B. subtllis-kannasta 1A40 peräisin oleva näyte sisälsi 31 kD:tä proteiinia, joka migroitui kuten Bacillus PB92-pro-teaasi. Tätä proteiinia ei ollut todettavissa pUB110:n sisältävästä B. subtills-kannasta 1A40 saadussa kontrolli-vyöhykkeessä.

Kaikilla seriiniproteaaseilla on samankaltainen molekyyli-paino. Tämän vuoksi Bacillus PB92:n kloonattu seriinipro-teaasi erotettiin tunnetuista seriiniproteaaseista (B. subtills-subtilisiini, Carlsberg-subtilislinl) transformoimalla pM58 ja pUBHO proteaasinegatiiviseen B. sub-tllls-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) ja analysoimalla syntyneet solunulkoiset proteaa- > sit. Saatuja transformantteja kasvatettiin minimaalikasvu-alustassa (Spizizen et ai., supra), joka sisälsi 0,02 % kasaminohappoja, 50 /ug/ml histidiiniä ja 20 /ug/ml neomy-siiniä. Kun oli kulunut 24 tuntia, otettiin näytteitä, jotka sentrifugoitiin ja analysoitiin ilman esikäsittelyä histidiini/MOPS-geeleissä, jotka sisälsivät 75 mM kalium-hydroksidia, 40 mM histidiiniä, 100 mM MOPS:ää (3-(N-mor-folino)propaanisulfonihappo), pH 7,5, ja 5 % polyakryyli-amidia. Elektroforeesipuskuri sisälsi 40 mM histidiiniä, 100 mM MOPS:ää, pH 6,6. Näytteet ajettiin katodiin päin. Proteaasinauhat todettiin Agfa Pan 100 Professional- 17 106726 filmien avulla (Zuidweg et ai., Biotechnol. and Bioengin. 14 (1972) 685-714). Nämä tulokset on esitetty kuviossa 1. Kuten esitetty pM58 käsittää Bacillus PB92-proteaasia koo-daavan geenin.

ESIMERKKI 3

Bacillus PB92-serilniproteaasiqeenin sekvenssointi pM58:n erään Ball-Hpal-fragmentin sekvenssi kokonaisuudessaan määritettiin Sangerin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463, menetelmän mukaan. pM58-restriktiofragment-teja (katso kuvio 2) kloonattiin faagi M13-vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 (Messing et ai.. Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321). pM58-fragmentti-insertioiden suhteen seulottiin plakki-hybridisaation avulla. Sekvenssoinnin jälkeen valmistettiin kymmenen geenissä tasaisin välein sijaitsevaa oligonukleotidiä ja toistettiin sekvenssointi, jolloin varmistui kuviossa 3 esitetty sekvenssi.

ESIMERKKI 4

Seriinlproteaasin sisältävän plasmidin pMAX-4 rakentaminen . Plasmidin pUCN710 (kuvio 4A) rakentamiseksi pUB110:aa pil kottiin Taql:llä ja PvuII:lla. Neomysiiniresistenssin tuottavan geenin sisältävää fragmenttia puhdistettiin alhaisen sulamispisteen omaavassa agaroosissa ja fragmentista tehtiin tylppäpäinen Klenow-polymeraasin ja NTP-mole-kyylien avulla (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory : Manual", Cold Spring Harbor, 1982). Plasmidi pUC7 (Vieira et al., Gene lii (1982) 259-268) linearisoitiin Sällillä ja siitä tehtiin tylppäpäinen kuten edellä on kuvattu. Fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasin avulla (Maniatis) ja ligatointituotteella transformoitiin E. coli JM103. Valikointi suoritettiin 2xTY-maljoissa (1,6 % w/v Bacto- 18 106726 tryptonia, 1 % w/v hiivauutetta, 0,5 % natriumkloridia), jossa kasvualusta sisälsi (lisäksi) 50 /ug/ml ampisillii-niä ja 10 /ug/ml neomysiiniä. Saatua, pUCN710:ksi nimettyä plasmidia pilkottiin BamHI:llä. Plasmidia pE194 (Jordan-escu, Plasmid 1 (1978) 468-479) pilkottiin Bell:llä. Pilkkomisista saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-li-gaasin avulla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtllis-kanta 1A40. Valikointi suoritettiin minimaalimal-joissa, joissa kasvualusta sisälsi 20 /ug/ml neomysiiniä (katso esimerkki 1). Saatu plasmidi, pE194-neo (kuvio 4A), sisältää neomysiinigeenin.

Proteaasigeenin alakloonaus integroimisvektoriin pE194-neo suoritettiin seuraavasti: pM58:aa (katso esimerkki 1) pilkottiin Hpalrllä ja Ball:llä ja Bqlllilla. Plasmidia pEl94-neo pilkottiin Hpal:llä♦ Saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasilla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-kantaa 1A40. Transformantit valikoitiin neomysiiniresistenssin sekä kasvaneen proteaasi-tuotannon suhteen, jolloin viimemainittu pääteltiin kaseiinin pilkkoutumistuotesaostumasta (kehämuodostus, katso esimerkki 1). Saatiin plasmidi pMAX-4, jonka rakenteesta varmistuttiin restriktioentsyymianalyysin avulla (katso kuvio 4B).

ESIMERKKI 5

Bacillus-kannan PB92 protoplastltransformointi pMAX-4:llä

Baclllus-kantaa PB92 kasvatettiin yön yli 100 ml:ssa NBSG-: X-kasvualustaa (Thorne et ai., J. Bacteriol. 91L (1966) 1012-1020). Viljelmää sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 4500 kierr./min kierrosnopeudella Sorvall-GSA-roottorilla varustetussa sentrifugissa. Protoplastit valmistettiin in-kuboimalla Bacillus-mikrobeja tunnin ajan 37°C:ssa 10 ml:ssa valmistetta Alkaline Holding Medium (AHM), joka si 106726 19 sälsi 0,5M sakkaroosia, 0,02M magnesiumkloridia jaj 0,02M Tris/maleaattia, pH 8,0, steriilissä vedessä ja johon oli lisätty 0,4 mg/ml lysotsyymiä. Protoplastit pelletoitiin (10 minuuttia, 4500 kierr./min), uudelleensuspendoitiin 5 ml:aan AHM+-puskuria, pH 8,0 (AHM-puskuri, johon oli lisätty 3,5 % w/v valmistetta Bacto Penassay Broth ja 0,04 % w/v valmistetta Albumine Merieux), sekoitettin j a uudel-leenpelletoitiin kuten edellä. Pelletti uudelleensuspendoitiin 5,0 ml:aan AHM:ää, minkä jälkeen 0,5 ml tätä pro-toplastisuspensiota sekoitettiin 5 /ug:aan demineralisoi-tua vettä, joka sisälsi 1 ^ug:n plasmidi-DNA:ta, ja inku-boitiin 2 minuutin ajan 30-%:isen w/v polyetyleeniglykoli 8000 -liuokseen, pH 8,0, läsnäollessa. Laimennettiin suhteessa 1:3 AHM+-kasvualustaan, pH 8,0, ja sentrifugoitiin, minkä jälkeen pelletti uudelleensuspendoitiin pieneen tilavuuteen (1 ml) AHM+-kasvualustaa ja inkuboitiin 2-3 tunnin ajan. Sadan mikrolitran näyte-eriä maljattiin vasta-valmistettuihin regeneroimismaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 0,5M Na-sukkinaatti/HCl:ää, pH 8,0, 1,5 % w/v aga-ria, 0,5 % w/v kasaminohappoja, 0,5 % w/v hiivauutetta, 0,031M fosfaattipuskuria, pH 8,0, 0,5 % w/v glukoosia, 0,02M magnesiumkloridia ja 0,02 % w/v Albumine Merieux -valmistetta. Nämä maljat sisälsivät niinikään 1000 /ug/ml neomysiiniä valikointia silmälläpitäen. Maljoja inkuboitiin 37eC:ssa vähintään 72 tunnin ajan, minkä jälkeen pe-säkkeet kopiomaljattiin Heart Infusion -valmiste-agar-maljoille, jotka sisälsivät 20 /ug/ml neomysiiniä.

ESIMERKKI 6 ; pMAX-4:n integrointi Bacillus-kannan PB92 kromosomiin pMAX-4:n sisältävä Bacillus-kantaa PB92 viljeltiin 20 /ug/ml neomysiiniä sisältävässä Heart Infusion -valmiste-maljassa ja eräs pesäke siitä siirrostettiin 100 ml:aan valmistetta Tryptone Soya Broth (TSB), joka sisälsi 1 20 106726 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37°C:ssa. Kahden millilitran erä viljelmää (noin 109 so-lua/ml) laimennettiin 100 ml:aan samaa kasvualustaa, joka sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50°C:ssa. 24 tunnin kuluttua 5 ml:n erä viljelmää (noin 109 solua/ml) laimennettiin toistamiseen kuten edellä on kuvattu, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50QC:ssa 1 /ug/ml neomysiiniä läsnäollessa. Viimemainittu menettely toistettiin edelleen kerran. Sitten solususpensio laimennettiin satakertaisesti, minkä jälkeen se maljattiin Heart Infusion - (HI) - valmiste-agar- (Difco) maljoille, joissa kasvualusta sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä. Maljoja inkuboitiin 16 tunnin ajan 50eC:ssa. Neomysiiniresistentit pesäkkeet eristettiin ja niitä viljeltiin 10 ml:ssa TSB-kasvu-alustaa, joka sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä, 16 tunnin ajan 37eC:ssa. Näistä viljelmistä eristettiin kokonais-DNA (Holmes et ai., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197) ja plasmidin puuttumisesta varmistuttiin ajamalla DNA:n elektroforeesi agaroosigeelissä. Plasmidin puuttuminen näytteistä, joista plasmidi-DNA ei ollut todettavissa, varmistettiin transformoimalla kokonais-DNA:11a B. subti-lis-kantaa 1A40. Näytteet, jotka eivät kyenneet transformoimaan B. subtilis-kantaa 1A40, katsottiin plasmidia sisältämättömiksi. Saatiin neomysiiniresistentti, plasmidia : ' vailla oleva Bacillus-kanta, joka nimettiin PBT109:ksi.

Tämä kanta sisälsi kopion plasmidista pMAX-4 kromosomiinsa integroituneena.

Integroituminen kantaan PBT109 tapahtui niinkutsutun Campbell-tyyppisen mekanismin välityksellä homologisena rekombinaationa, jonka tuloksena kaksi peräkkäin järjestäytynyttä proteaasigeeniä sijaitsi kromosomissa plasmidi-sekvenssien erottamina. Tämä kannan PBT109 geneettinen järjestely vahvistettiin kuten on esitetty vireillä olevassa, tämän kanssa samanaikaisesti jätetyssä EPA-hakemus-julkaisussa (EPA-0 000 000), joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

21 106726 ESIMERKKI 7

Transformoitujen kantojen proteaasltuotanto

Transformoitujen kantojen proteaasituotantoa testattiin lisäämällä 0,2 ml noin 109 ,solua/ml sisältävää TSB-vil-jelmää 500 ml:n ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 100 ml US-patenttijulkaisussa n:o Re. 30,602 kuvattua tuotan-toviljelmää. Testattaessa B. subtllis-kantoj a pH säädettiin kuitenkin 7,0:aan. Kun kyseessä olivat kannat DB104 (pUBHO), DB104 (pMAX-4), PB92 (pMAX-4), neomysiiniä lisättiin 20 /ug/ml ja PBTl09:n kysessä ollessa 1 /ug/ml. Näiden solulinjojen suhteellinen proteaasituotanto on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Proteaasituotanto transformoidussa Baclllus-lajeissa kanta suhteellinen pro- neomysiini- _teaasituotanto** lisäys_

Bacillus PB92 100,0 %

Bacillus PB92 (pMAX-4) 120,0 % + : Bacillus PBT109 120,0 % + B. subtilis DB104 (pUBHO)1 1,5 % + B. subtills DB104 (pMAX-4) 10,0 % +

Proteaasituotannon mittaamiseksi vain pMAX-4:n proteaa-sigeenistä tämä plasmidi transformoitiin (Spizizen et ai., (1961) supra) myös eksoproteaasinegatiiviseen B. suJbtilis-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) kuvattu esimerkissä 2.

22 106726 ** Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen dimetyylika-seiinia substraattina kuten kuvanneet Lin et ai., J.

Biol. Chem. 244 (1969) 789-793.

Suuremman mittakaavan (10 litraa) fermentaatioissa Bacillus PB92 (pMAX-4) osoitti PBT109:ään verrattuna epästabiilisuutta ja alentunutta tuotantoa, ellei käymisalustaan lisätty neomysiiniä.

Edellä saatujen tuloksien nojalla on selvää, että keksintö koskee yksinkertaista ja tehokasta menettelytapaa serii-niproteaasin tuottamiseksi, jossa homologinen tai hetero-loginen seriiniproteaasia koodaava geeni viedään stabii-listi teollisten Bacillus-kantojen kromosomiin. Keksintö koskee myös seriiniproteaasin tehostunutta tuotantoa ja jotain seriiniproteaasia tuottavassa Bacillus-isännässä.

Kun plasmidirakenteet integroituvat isäntäsolukromosomei-hin, päästään stabiilimpaan tilanteeseen tuotantofermen-taatioita ja suuresti tehostunutta proteaasituotantoa silmälläpitäen, kuin jos läsnä on kromosominulkoisia plasmi-dirakenteita.

Kaikki tässä patenttijulkaisussa mainitut julkaisut ja pa-tenttihakemusjulkaisut osoittavat viitteellisesti tämän : keksinnön koskeman alan ammattilaisten teknisen taidon ta- son. Kaikki julkaisut ja patenttihakemusjulkaisut sisällytetään tähän viitteinä samassa määrin, kuin jos kukin yksittäinen julkaisu tai patenttihakemusjulkaisu olisi nimenomaisesti ja itsenäisesti osoitettu sisällytettäväksi viitteeksi.

Kuvattuamme keksinnön nyt kokonaisuudessaan alan keskimääräiselle taitajalle lienee ilmeistä, että siihen voidaan tehdä useita muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta oheisten patenttivaatimuksien hengestä tai piiristä.

Claims

23 106726
1. Ilmentämiskasetti, tunnettu siitä, että se käsittää toiminnallisesti yhdistettyinä komponentteina (a) transkription säätelyalueen ja translaation aloitus- alueen, jotka ovat funktionaalisia Bacillus-isäntäsolus- sa, (b) korkea-alkalista seriiniproteaasia koodaavan DNA-sekvenssin, jolla on vähintään 70 %:n homologia aminohapposekvenssiä h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-a- V-L-D-T-G-I-S-T—H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V—L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A—V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-H-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A—R-Y-A-N-A-M-A-V-G—A-T-D-Q-N-N-N—R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A—P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. koodaavaan DNA-sekvenssiin nähden, (c) translaation ja transkription lopetuksen säätelyalueet, jotka ovat funktionaalisia mainitussa isäntäsolussa, jolloin sanotun DNA-sekvenssin ilmentäminen on mainittujen aloitus- ja • ; lopetusalueiden säätelevän kontrollin alaista; ja (d) vähintään yhden merkkigeenin ja lämpötilaherkän repli-kaation aloituskohdan jostain bakteeriplasmidista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämiskasetti, tunnettu siitä, että sanottu proteaasi on saatavissa ** eräästä alkalofiilisestä Bacillus-kannasta, Bacillus novo -lajista PB92. 1 2 3 Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämiskasetti, tun 2 nettu siitä, että sanottu DNA-sekvenssi koodaa polypepti- 3 diä, joka käsittää olennaisesti seuraavan aminohapposek- 24 106726 venssin: H2N-A-Q-S-V-P—W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S—T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-H-A-E-A-A-T-R-COOH.
4. Transformoitu Bacillus-isäntäsolu, joka kykenee tuottamaan korkea-alkalista seriiniproteaasia, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaisen ilmentämiskasetin.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Bacillus PBT109, joka on saatavissa integroimalla plasmidi pMAX-4 Bacillus novo -lajiin PB92, minkä jälkeen selektoidaan 1 /ig/ml neomysiinillä, ja että se sisältää kaksi korkea-alkalista seriiniproteaasia koodaavaa geeniä, jotka sijaitsevat peräkkäin kromosomissa ja erillään plasmidisekvensseistä. •
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää sanotusta DNA-sekvenssistä vähintään kaksi kopiota mainitun solun kromosomiin integroituneina. 1 2 3 Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu Bacillus- 2 isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainitun isäntäsolun 3 transformoimaton kantasolu on villityypin Bacillus, joka 25 106726 tuottaa seriiniproteaasia.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainitun isäntäsolun transformoimaton kantasolu on seriiniproteaasia tuottavan Bacilluksen mutantti.
9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainitun isäntäsolun transformoimaton kantasolu on Bacillus-mutantti, joka ei tuota seriiniproteaasia.
10. Jonkin patenttivaatimuksista 4-9 mukainen transformoitu Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että sanottu korkea-aikaiinen seriiniproteaasi on saatavissa Bacillus novo-lajista PB92.
11. Jonkin patenttivaatimuksista 4-10 mukainen transformoitu Bacillus-isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi koodaa olennaisesti seuraavaa aminohapposekvenssiä h2n-a-q-s-v~p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-a-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V—P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-n-a-e-l-y-a-v- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A—R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A—G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P—G-S-T-Y—A-S-L-N-G-T-S-M-A-T—P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. 1 2 Menetelmä Bacillus-isäntäsolujen transformoimiseksi, 2 tunnettu siitä, että 26 106726 valmistetaan jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen ilmentämiskasetti, joka sisältää korkea-alkalista seriiniproteaasia koodaavan geenin, yhdistetään Bacillus-isäntäsolusta valmistettu protoplast! mainitun kasetin kanssa fusogeenin läsnäollessa alkalisessa pH:ssa, jolloin mainittu kasetti viedään kyseiseen isäntäsoluun, ja sen sisältämä mainittua proteaa-sia koodaava geeni integroituu isäntäsolun kromosomiin, ja valikoidaan mainitun proteaasigeenin stabiilisti sisältävät isäntäsolut, jotka kykenevät tuottamaan korkea-alkalista seriiniproteaasia.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu fusogeeni on polyetyleeniglykoli, ja sen konsentraatio on noin 30 % w/v.
14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu korkea-aikaiinen seriini- proteaasi käsittää olennaisesti seuraavan aminohappo-sekvenssin h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-a- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-n-a-e-l-y-a-v- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A—R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- q-y-g-a-g-l-d-i-v-a-p-g-v-n-v-q-s-t-y-p-g-s-t-y-a-s-l-n-g-t-s- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. 1 Jonkin patenttivaatimuksista 4-11 mukaisen tai jonkin patenttivaatimuksista 12-14 mukaisella menetelmällä saadun transformoidun Bacillus-isännän käyttö korkea-alkali- 27 1 0 6 7 2 6 sen seriiniproteaasin tuottamiseksi.
16. Menetelmä korkea-alkalisen seriiniproteaasin tuottamiseksi Bacilluksessa, tunnettu siitä, että kasvatetaan Bacillus-viljelmää, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista 4-11 mukaisia Bacillus-soluja.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ilmentämiskasetti lisäksi sisältää toisen DNA-sekvenssin, joka koodaa erittymisen joh-tosekvenssiä ja prosessointisignaalia, jotka ovat toiminnallisesti liittyneinä korkea-alkalista seriiniproteaasia koodaavan DNA-sekvenssin 5'-päähän, jolloin kyseinen eks-pressiotuote erittyy.
18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ekspressiotuote lisäksi eristetään.
19. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa Bacillus novo -lajista PB92 peräisin olevaa korkea- alkalista seriiniproteaasia, jolla On olennaisesti seu-raava aminohapposekvenssi: h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-a- V-L-D-T—G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G—T-H—V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V—L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G—S-I-S-Y—P-A—R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A—G-L-D-I-V-A—P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M—A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V—K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. 28 106726
20. Plasmidi pMAX-4, tunnettu siitä, että sen koko on 7,6 kb ja sen fysikaalinen kartta on esitetty kuviossa 4B, se sisältää geenin, joka koodaa Bacillus novo -lajin PB92 sisältämää Bacillus PB92 -proteaasia, jolla on olennaisesti patenttivaatimuksessa 19 esitetty aminohapposekvenssi, plasmidista PE194 peräisin olevan lämpötilaherkän replikaation aloituskohdan, ja neomysiiniresistenssigee-nin.
21. Eristetty DNA- tai RNA-oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään 15 perättäistä nukleotidia, jotka ovat nukleotideja, jotka kykenevät hybridisoitumaan sekvenssiin, joka koodaa Bacillus novo -lajista PB92 saatavissa olevaa korkea-alkalisen seriini-proteaasia, jolla on olennaisesti patenttivaatimuksessa 19 esitetty aminohapposekvenssi.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se käsittää radioaktiivisen leiman.
23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään 20 perättäistä nukleotidia. • · 29 106726