JPH03500606A - プロテアーゼ欠損グラム陽性菌類及び組換え体産生用宿主有機体としての用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼ欠損グラム陽性菌類及び 組換え体産生用宿主有機体としての用途本発明は、プロテアーゼを欠損している バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のようなグラム 陽性菌株１本株単離に有用な方法及び手段及び非相同タンパク質産生のためのこ れらの株の使用に関する。

発明の背景 外来遺伝子の細菌内への導入成功及び組換えＤＮＡ技術による医学上及び工業的 に重要なタンパク質の製造のためのそれらの発現は、過去１０年間における最も 重要な技術的進歩の一つである。

クローン化遺伝子の発現に最も広く用いられる宿主有機体は、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）である。しかし、イー。

コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）内で産生される非相同タンパク質は、細胞細胞質内に蓄積 する。この非相同産物は頻繁に封入体内に不溶性産物として蓄積する。従って、 イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）及び他のグラム陰性宿主内で非相同産物を生産する には夾雑宿主タンパク質から所望の産物を広範囲にわたり精製することが必要に なる。その上、封入体から前記タンパク質を抽出するには極めて過酷な変性条件 が必要となり、その結果前記タンパク質が著明に不活化され従って回収が不良と なる。前記組換えタンパク質がスルフヒドリル基を含有する時、別の問題が生じ る可能性がある。タンパク質のランダムな重合反応が、非特異的ジスルフィド架 橋を介して抽出時に頻繁に起こる。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びその他の り゛ラム陽性有機体は、これに対して細胞外培養培地内（こタンパク質を分泌す る。これは、非相同タンノくり質の精製の観点からして有用である。その上、） くシラス増殖借地の使用及び一般的に容易な培養操作のゆえ（こタンパク質の生 産においてコスト的により効率的である。

バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は工業的規模で日常的に増殖されている発酵有機 体であり、１種Ｂ、サブチ１ノスと異なりエンドトキシンを産生せず、組換え産 物力（医療または獣医上の用途を意図している時には明ら力１（こ所望の特徴で ある。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主（こ外来遺伝子を導入し発現できるプ ラスミドクローニンク゛ベクターが構築されてきた。一般に、これらのクローニ ングベクターは分泌ベクターであり、この中で分泌性づする。この構築物を次い で、）くシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内で複製できるプラスミド内にクローン化 する。これらのプラスミドは独自の制限部位を有しており、形質転換有機体の単 離に有用で選択可能な抗生物質耐性指標をコードする。

宿主としてＢ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｌｉｌｉｓ）のようなダラム陽性菌が 高い能力を有しているにもかかわらず、非相同タンパク質の産生にこれらの有機 体を一般に用いることは数々の理由から限定されており、タンパク質分解の発生 は最もささいな理由と言うわけではない。

バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）産生非相同タ ンパク質類を攻撃し分解できる少なくとも３種の細胞外プロテアーゼを産生ずる ことが報告されているので、本問題が重要になってくる。プリースト（Ｐｒｉｅ ｓｔ）、４１　バクテリオロジカル・レビュー（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ 、　）　７１１　（１９７７）　；　０イトシユら（Ｒｏｂｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ 、）、１５５ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｆｅｒｉｏｌ 、　）　１４５　（１９８３）　ニスタールら（Ｓｔａｈｌ　ｅｔ　ａｔ、）　 、１５８ジヤーナルーオブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ、　 ）　４１１　（１９８４）　；ウニハラら（ｔｌｅｈａｒａ　ｅｌａｌ、）、１ ３９ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｆｅｒｉｏｌ、　）　５ ８３　（１９７９）　；ヤングら（Ｙａｖｇ　ｅｔａｌ）　、　４６０ジヤーナ ル・オブ・バクテリオロゼは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に感受性の 金属酵素の１種中性プロテアーゼ（ＮＰ）及びアルカリ性ｐＨで至適活性を有す るセリンプロテアーゼの１種アルカリ性プロテアーゼ（ＡＰ）である。これらの ２つの主要プロテアーゼの構造遺伝子をクローン化し、それぞれのプロテアーゼ 遺伝子を不活化する歪２スタールら（Ｓｔａｈｌ　ｅｌ　ａｌ、）、１５８ジヤ ーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　４１１　 （１９８４）　：ヤングら（Ｙａｎｇ　ｅｌ　ａｌ、）　１６０ジヤーナル・オ ブ・バクテリオロジー（１，Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ、）　１５　（１９８４）　； カワムラら（Ｋａｖａｍｕｒａ　ｅｌａｌ、）　、１６０ジヤーナル・オブ・バ クテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、）　４４２　（１９８４）。前記 ２主要プロテアーゼの構造遺伝子に欠失を有する２つの（突然）変異株を本文で ａｐｒＥ−／　ｎｐｒＥ−二重（突然）変異体と言う。アルカリ性及び中性プロ テアーゼを表現型で欠失しているが変性の性質が特定されていない変異株を本文 でＡＰ−／ＮＰ−二重変異体と言う。

ＢＤ１７０　（ＡＴＣＣ３３６０８）のようなり、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｊ ｉｉｉｓ）野生型株類及びＡＰ−、ＮＰ−及びＡＰ／ＮＰ−突然変異体のタンパ ク分解活性は、カゼイン（−）寒天上で前記菌株を増殖させカゼイン変性能を有 するプロテアーゼ産生性コロニー、の周囲に形成された明確なハロ類（輪状体） の大きさを観察することによって評価した。Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｊｉ −１ｉｓ）ＢＤ１７０の野生型プロテアーゼ欠失変異体類を１％脱脂ミルク含有 ＴＢＡＢ寒天上で３７℃で１６時間増殖させた。コロニーはカゼインのタンパク 分解による。株類は（１）野生型、（２）アルカリ性プロテアーゼマイナス（Ａ 　Ｐ−）　、　（３）中性プロテアーゼマイナス（ＮＰ−）及び（４）二重プロ テアーゼであった。プロテアーゼ欠損二重変異体（ＡＰ−／ＮＰ−）は、本アッ セイにおいてカゼインに対しほとんどまたは全く活性を示さなかった。にもかか わらず、Ｂ、サブチリス（Ｂ−ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＡＰ−／ＮＰ−菌株類はそ れでもなお問題の約換え分泌タンパク質の多くを分解させる。例えば、Ｂ、サブ チリス（Ｂ、　５ｕｂｊｉｌｉｓ）のＡＰ−／ＮＰ−菌株は、リソスタフィン、 プロリソスタフィン、マイクロコツカスヌクレアーゼ及びインタロイキン１及び 組織プラスミノーゲン活性化因子を含む真核生物タンパク質類がプロリソスタフ ィンの分泌性及びプロ酵素配列に融合した融合タンパク質類で菌からそれらを分 泌できるタンパク質類のような非相同タンパク質類を分解する。

本発明の目的は、残余プロテアーゼ活性を実質に低下させるグラム陽性有機体、 特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の有機体をスクリーニングし且つ同定する 方法を提供することである。

本発明の目的は、残余プロテアーゼ活性の実質的低下のために現在入手可能なプ ロテアーゼ陰性二重変異体よりも優れているグラム陽性宿主有機体、特にぺ２ラ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の有機体を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、非相同タンパク質生産における宿主有機体としての 用途のために、プロテアーゼ高欠損性のグラム陽性菌株、特にバシラス（Ｂａｃ ｉ−ｌ　１ｕｓ）　ｓｐｐ、　を産生ずる方法を提供することである。

本発明の別の目的は、宿主としてプロテアーゼ高欠損性のダラム陽性菌を利用す る非相同タンパク質類を産生ずる改善方法を提供することである。

バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ａ　Ｐ　−／　Ｎ　Ｐ−菌株中の残余プロテア ーゼ活性は残余セリンプロテアーゼ（Ｒ３Ｐ）１種及びスルフヒドリル基依存性 残余システィンプロテアーゼ（ＲＣＰ）１種の２つの追加プロテアーゼに起因し 、Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　（Ａ　Ｐ　−／ＮＰ−）の培養 物中における組換え非相同タンパク質の分解をともに説明するものであることが 現在見出されている。これらの２酵素の活性を調べ、例えばリソスタフィン及び プロリソスタフィンのような非相同タンパク質類に対して上記２プロテアーゼ類 が異なる活性を有していることが見出された。さらに、Ｒ３ＰのＮ末端アミノ酸 配列を決定し核酸プローブをＲ３Ｐ遺伝子の部位特異的突然変異に使用するため に設計した。

これらの手段を用いて、中性及びアルカリ性プロテアーゼ類ばかりでなく上記残 余プロテアーゼの一方または双方を欠失しているＢ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）の菌株を開発できしかも同定できる。このような菌株は、前記残余 プロテアーゼ類のタンパク分解活性に耐性であるような非相同タンパク質の生産 に宿主有機体として用いる上で、極めて適している。

図面の簡単な説明 第１図はＢ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｌｉｌｉｓ）　Ｂ　Ｄ　１７０野生型、 Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｌｉｌｉｓ）　Ｂ　Ｄ　１７０　Ａ　Ｐ−／ＮＰ −及びプロテアーゼ欠損単離体Ｂ、スファエリクス（Ｂ、５ｐｂａｅｒｉｃｕｓ ）　ＯＯの培養物中における増殖を通して、組換えタンパク質の１種リソスタフ ィンの半減期を示したものである。

第２図は、残余システィンプロテアーゼ（ＲＣＰ）及び残余セリンプロテアーゼ （ＲＳ　Ｐ）のクロマトグラフィ分離を示したものである。

第３図は、Ｒ３ＰのＮ末端アミノ酸配列を示したも一ブ配列を示したものである 。

物を検討した。残余セリンプロテアーゼ（ＲＳ　Ｐ）及びセルフヒドリル依存性 残余システィンプロテアーゼ（ＲＣＰ）の２タンパク質類は、前記残余細胞外プ ロテアーゼ活性の全てを説明するものであることが同定された。これらの２タン パク質は、下記に述べたように定常期後期の培養上漬物から単離された。Ｒ３Ｐ は単離後、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によって不活化さ れ且つアンチパイン（Ｐｈｅ−Ｃｏ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ａｒｇ−ａ　１）酵素 阻害剤によって阻害されることが見出された。ＲＣＰはｐ−ヒドロキシ水銀ペン シアー　ト（ｐＨＭＢ）によって不活化され且つアンチパインによって（阻害さ れ）不活化されることが見出され、このことはＲ３Ｐ及びＲＣＰが明らかにタン パク質であることを示唆している。

ＮＰ−（Ｄ）及びプロテアーゼ欠損Ｂ、スファエリクとしてリソスタフィン不活 化を示したものである。上清試料は、対数増殖末期と定常期全期を通して採取し た。上清（２０μｌ）は１．０ｍｇ／ｍｌのりソスタフィン溶液２０μｌと３７ ℃で３０分間インキュベートし、その後試料を迅速にドライアイス上で凍結しさ する残余のりソスタフィン活性を次いで比濁分析で測定し、対照りソスタフィン と比較した。

組換えリソスタフィンの半減期（例。１９８７年１０月２２日付ＷＯ３７１０６ ２６４として発行された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７１００８７３に記載 の組換えＤＮＡ技術によって産生されたりソスタフィン）は、野生型Ｂ、サブチ リス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）及びそのＡＰ−／ＮＰ−変異体の双方の定常期培 養上漬物に類似している。この重要観察から、この分泌性組換え産物の不安定性 がこれら培養物中の残余システィンプロテアーゼ（ＲＣＰ）及び残余セリンプロ テアーゼ（Ｒ３Ｐ）という残余プロテアーゼ類の活性に大きく影響されることが 示された。さらに、この結果からまた、野生型Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｌ ｉｌｉｓ）培養上清中の主要細胞外プロテアーゼ活性が中性及びアルカリ性プロ テアーゼによるものであるという一般に考えられている概念が実際は誤ったもの であることが示唆された。

リソスタフィンのような非相同タンパク質を変性させるＲ８Ｐ及びＲＣＰの活性 を、プロテアーゼ欠損ごシラス（ＢａｃｉｌｌｕＳ）菌株の同定アッセイ技術と しての根拠可能性の点で調べた。ＲＣＰ及びＲ８Ｐ活性は、且ユ常期培養上清を モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑクロマトグラフィで分画後分析した。カラム分画（１，０ｍ 　ｌ）の試料（２０μｌ）を、（Ａ）１．０ｍＭフェニルメチルスルホニルフル オリド（ＰＭＳＦ）存在下プロリソスタフィンまたは（Ｂ）リソスタフィンのい ずれかの２０μｍと２５℃で３０分間インキュベートし、それ以上の変性を防ぐ ためにドライアイス上で迅速に凍結した。試料を次に５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し クーマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）で染色した。クロマトグ ラフィ条件は、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑのカラム（ファルマシア（Ｐｔａｒｍａ−ｃ ｉａ））上における陰イオン交換ＨＰＬＣで、下記の条件を用いた。溶媒Ａ：水 水溶溶媒　：　１００ｍＭＮａ２ＨＰ○４．ｐＨ７，ｏ、１．０ＭＮａＣ１中。

グラジェント：１分当り１．０ｍｌで１５分内に溶媒Ｂ５−１００％。ピークは 、Ａ　２１０及びＡ２８ｏでオンラインで検出した。

Ｒ３Ｐは、非相同タンパク質の双方、プロリソスタフィン及びリソスタフィンの 双方を分解できる。一方、ＲＣＰはりソスタフィンに何の作用も示さないが、し かし、プロリソスタフィンをリソスタフィンに転換できる。プロリソスタフィン は不活性で、非相同タンパク質プロリソスタフィンの酵素的に活性なりソスタフ ィンへの転換は、ＲＣＰアッセイの基礎となっている。

非相同タンパク質リソスタフィンの分解に伴う不活化は、Ｒ８Ｐアッセイの基礎 となっている。

上記２残余プロテアーゼ類及び非相同タンパク質とのそれらの反応によって、こ れらのプロテアーゼ活性を欠損している菌株を同定するために天然に産生ずるリ ソスタフィン遺伝子を有するプラスミドで形質転換したこの宿主菌株の実質的に 純粋な培養物は、アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕＨｕｒｅＣｏｌｌｅｃｉｏｎ）　に寄託し、ｐｃＴ／ＵＳ ８７１０　Ｏ８７３対応米国特許出願番号第０３４，４６４号に関連するアクセ ス番号第６７０８０を指定された。

非改変宿主は、パブリック・ヘルス・リサーチ・インスティテユート（Ｐｕｂｌ ｉｃ　Ｈｅａｔｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ｎｓｌｉｔｌｅ）。

ニューヨーク、ニューヨークの培養コレクション中で継代されている。この宿主 はＡＰ−／ＮＰ−／Ｒ３Ｐ−／ＲＣＰ−であるからばかりでなくプラスミドｐＢ Ｃ１６−ＩＬ及びＰＲＯＪ６４９９−ＩＬによって形質転換しＡＰ、ＮＰ、Ｒ３ Ｐ及びＲＣＰプロテアーゼ活性がないにもかかわらずプロリソスタフィンを産生 じリソスタフィンに変えることから、この宿主は重要菌株には２つの残余プロテ アーゼ類があるという知識及びそれらの活性を識別できる非相同タンパク質とそ れらの反応に基づ（アッセイ系を用いて、前記残余プロテアーゼ類のいずれかま たは双方を欠損する変異菌株は、いずれかの公知の方法で作製された変異体群か ら選択できる。変異菌株は、この有機体の遺伝配列中に１力所以上の突然変異す なわち変化を有する微生物の菌株である。これらの突然変異は、放射線及び化学 変異原性物質に対する暴露、転移、組換え及び制限酵素消化を含めた種々の変異 方法のいずれかによって誘発することができる。結果として生成する変異菌株は 、塩基対置換すなわち有機体の遺伝子配列中で１組の塩基対が別のものと置換す ること（塩基対置換変異体）、１個以上の塩基対を遺伝子配列中に挿入すること （挿入変異体）または遺伝子配列からの１個以上の塩基対の欠失（欠失変異体） により親菌株と異なることができる。実際には、塩基対置換の復帰または挿入変 異体の可能性のために、欠失変異体が好適である。このよる。

残余プロテアーゼが同定されれば、例えばＰＨＭＢ。

ＰＭＳＦ及びアンチパインのようなペプチドアナログ阻害剤及びＥＤＴＡのよう な金属キレート化剤のような化学物質を添加することによって培地中に産生され るＲＣＰ及びＲ３Ｐの効果を化学的に阻害するかまたは不活化することによって 非変異微生物体によって産生される残余ＲＣＰ及びＲ３Ｐの効果を消失させるこ とも可能である。

Ｒ３Ｐ及び／またはＲＣＰ活性欠失部位特異的欠失変異体をインビトロで産生ず る第一段階では、細菌ゲノム内でこれらのプロテアーゼ類をコードするそれぞれ の遺伝子をクローン化することが必要になる。

この目的のために、第３図に示した如＜Ｒ３ＰのＮ末端アミノ酸配列を決定した 。このタンパク質アミノ酸配列に基づき、コドン縮重から予想される不確かさが 最も低いＤＮＡ配列領域を識別した。これらのアミノ酸配列に対応するオリゴヌ クレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション研究用途のために合成し、残余 プロテアーゼ遺伝子含有制限フラグメントを識別できる。コドン縮重は混合塩基 オリゴヌクレオチドプローブを用いて解決するのが適切である。例えば、Ｒ３Ｐ のために作製したＮ末端アミノ酸配列領域に適するオリゴヌクレオチド混合プロ ーブを３種第４図に示した。このプロテアーゼアミノ酸配列の他の部位に基づく 他のプローブ配列も同様に用いることができる。

いったん適切なプローブ配列が識別されれば、Ｒ３Ｐ及びＲＣＰコード遺伝子は バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体ＤＮＡの制限消化物と３２ｐ標識オリゴヌ クレオチドプローブをハイブリダイズすることによって局在化できる。Ｒ８Ｐま たはＲＣＰ遺伝子を含有するとして同定された特定フラグメントを次にプラスミ ドにクローン化し配列決定することができるか、または、好適には部位特異的変 異を誘発し欠失変異体を作製する。プロテアーゼ欠損性欠失変異体の選択を促進 するために、抗生物質耐性指標を欠失遺伝子に挿入できる。Ｂ、サブチリス（Ｂ 、　５ｕｂｆｉｌｉｓ）のプロテアーゼ遺伝子は次に相同組換えによって不活化 され、変異体を抗生物質存在下における増殖によって選択し残余プロテアーゼ活 性について検討した。

同業者は、残余プロテアーゼ活性に関する非相同タンパク質を基準とするアッセ イ法及びＲ８Ｐのアミノ酸配列が付与されれば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） の残余プロテアーゼ欠損性突然変異体がいくらでも得られまたスクリーニングで きることを理解するであろう。Ｒ３Ｐ及びＲＣＰのアッセイ実施手順、アミノ酸 配列決定手順及び特定変異体調整手順を下記でさらに詳しく述／ＮＰ−の残余プ ロテアーゼ活性源を単離し特性解析するために、定常期培養上漬物をモノ（ｉ、 １ｏｎｏ）Ｑ　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））上イオン交換高速液体 クロマトグラフィ　（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）で分画した。Ｂ、サブチリス（Ｂ、５ｕｂ ｌｉｌｉｓ）ＢＤ１７０ＡＰ−／ＮＰ一定常期培養上清のクロマトグラフィ、（ Ｂ）ＲＣＰ再クロマトグラフィ及び（Ｃ）Ｒ３Ｐ再クロマトグラフィは、モノ（ Ｍｏｎｏ）Ｑ　（ファルマシア　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））　カラム上の陰イオ ン交換ＨＰ　Ｌ　Ｃで行い、下記の条件を用いた。溶媒Ａ：水水溶溶媒　：　１ ００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７，０，１，０ＭＮａＣ１中。グラジェント＝１ ．０ｍｌ／分で１５分内に溶媒Ｂの５−１００％。ピークは、Ａ　２．０及びＡ 　２　Ｂ　Ｏでオンラインで検出した。２つのタンパク質がともに残余プロテア ーゼ活性の全てを説明し、これらはスルフヒドリル依存性プロテアーゼ（残余シ スティンプロテアーゼ−ＲＣＰ）及びセリンプロテアーゼ（残余セリンプロテア ーゼ−Ｒ３Ｐ）として同定された。これら２タンパク質類は、定常期培養上清か ら硫酸アンモニウム沈殿（５０％飽和）によって単離した後ｐＨ７，００の０． ０５Ｍリン酸ナトリウムバッファ中０．０５−１．０ＭＮａＣ１の直線的塩グラ ジェントを、用いるモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ上イオン交換ＨＰＬＣを行う。同一条件 下でモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ上で再クロマトグラフィを行うと、Ｒ８Ｐは対称的ピー クとして溶出する。このようにして精製したＲ３Ｐは５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一 バンドを呈し、見かけ上の分子量は１８，０００ダルトンに近い。ＲＣＰは、不 均一ピークとして前記塩グラジェントの初期にモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑから溶出する 。カラム溶出物は、Ａ２□。及びＡ２８０のオンラインで同時にモニターする。

リソスタフィン１．０ｍｇ／ｍｌ溶液２０μｍを等量の培養上清（または前記Ｒ ３Ｐ酵素含有その他の試料）とインキュベートする時室温下で３０分後に起こる リソスタフィンの不活化は、その他の適切な非相同タンパク質も同様に用いるこ とができることが定量的アッセイの根拠となっている。Ｒ３Ｐが存在する場合少 なくともりソスタフィンまたはその他の非相同タンバク質の一部を分解できる充 分な時間反応を進行させることができる限り、より短いかまたはより長い時間期 間も用いることができる。本アッセイにおける１里位のプロテアーゼ活性とは、 記載の如くインキュベートしたりソスタフィンの５０％不活化をもたらすプロテ アーゼの量である。リソスタフィンの残余活性は、濁分析で測定し、未処理リソ スタフィン対照群と比較した。

同様に、ＲＣＰも類似条件下で定量的に推定でき、１単位はプロリソスタフィン のりソスタフィンへの５０％活性化をもたらすようなＲＣＰの量と定義した。

しかし、Ｒ８ＰはＲＣＰによってプロリソスタフィンから産生されたりソスタフ ィンを分解するので、Ｒ３Ｐも含有する培養上清中のＲＣＰアッセイでは、フェ ニルメチスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）またはその他のＲ３Ｐｌｆｆｌ害剤 とインキュベーションし最初にＲ３Ｐを不活化することが必要になる。ＰＭＳＦ の存在下においては、Ｂ、サブチラス（Ｂ、　５ｕｂｌｉｌｉｓ）　Ａ　Ｐ　− ／　Ｎ　Ｐ　−培養物のＲＣＰ活性はプロリソスタフィンをリソスタフィンに転 換し本酵素を蓄積させる。

これとは別に、ＲＣＰ及びＲ８Ｐの便利な方法は、プロリソスタフィン及びリソ スタフィン分解物及び分解生成物の蓄積物などの非相同タンパク質をドデシル硫 酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって 分析することによって行うことができる。更に、ＲＣＰ及びＲ３Ｐの活性はそれ ぞれ、１′■による放射性標識またはフルオレセインイソシアナートで標識した プロリソスタフィン及びリソスタフィン基質のような非相同タンパク質に対する 活性によって定量化できる。前記標識非相同タンパク質類の分解または分解産物 の蓄積は、酸沈殿後標識産物を標識基質から分離しそれぞれ酸可溶性標識または 酸不溶性標識のいずれかを測定し、簡便に測定することができる。残余プロテア ーゼ活性に特異的な上記アッセイを用いることによって、Ｒ８ＰはＦＭＳ　Ｆに よって不活化されることがわかった。また、Ｒ３Ｐは、プロテアーゼ阻害剤アン チパイン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ａｒｇ−ＡＩ）によって阻害される。

ＲＣＰはＰＭＳＦによって影響を受けないが、スルフヒドリル反応試薬ｐ−ヒド ロキシ水銀ベンゾアート（ＰＨＭＢ）によって不活化される。ＲＣＰはまた、ア ンチパインによって阻害される。

コノ知識を用いて、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＡＰ−／ＮＰ−菌株培養によ る非相同タンパク質を蓄積できるように、Ｒ３Ｐ及びＲＣＰの残余プロテアーゼ 活性を特異的に不活化するかまたは阻害できる。例えば、インタロイキン１とマ イクロコツカスヌクレアーゼ融合タンパク質類は、二重プロテアーゼマイナス菌 株Ｂ。

サブチリス（Ｂ、５ｕｂｌｉｌｉｓ）ＢＤＩ　７０ＡＰ−／ＮＰ−の培養によっ て産生された。細胞は、クロラムフェニコール含有（５μｇ／ｍｌ）ビール／イ ースト（Ｖｅａｌ／Ｙｅａｓｔ；ＶＹ）媒地で強く通気しながら３７℃で増殖さ せた。プロテアーゼ阻害剤は、培養物が２２０クレツト（Ｋｌｅｔｌ）単位に到 達した時と集菌時に添加した。細胞は遠心分離によって集菌後、１０ｍＭ）’Ｊ ス（Ｔｒｉｓ）。

ｐＨ８，８，３０ｍＭＮａｃｌ中で洗浄、さらにＯｏＣで２分間音波処理した。

試料は、３００（１，４）、３７０（２，５）、及び４２０　（３，６）クレッ ト（ＫｌｅＮ）単位で採取した。培養物は、（ａ　）　１　、Ｏｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ 　Ｓ　Ｆ　、（ｂ　）１　、　０　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　、アンチパイン（ １，０ｍｇ／ｍｌ）及びロイペプチン（１，０ｍｇ／ｍｌ）の存在下で増殖させ た。試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析に供した。

プロットは、マイクロコツカスヌクレアーゼに対するウサギ抗体またはインヤギ 抗ウサギＩｇＧ、アルカリホスファターゼ結合物で検出した。インタロイキン１ 標準についても検査した。

残余プロテアーゼ遺伝子類の同定 上記で単離された精製Ｒ８ＰのＮ末端アミノ酸配列は、自動気相プロテインシー クエンサ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ））　によるエドマン（Ｅ＋Ｉｍａｎ）分解によって決定した。イオン交換Ｈ ＰＬＣで精製したタンパク質を、０．１％三フッ化酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）中０−７ ５％（ｖ／■）アセトニトリル直線勾配で溶出する０３カラム）逆相クロマトグ ラフィで脱塩した。Ｒ３Ｐ及びＲＣＰの自動触媒分解は、それぞれＰＭＳＦ及び ＰＨＭＰとの反応による酵素の不活化によって防止した。アミノ酸分析は、精製 Ｒ３Ｐタンパク質の酸加水分解物について行った。Ｎ末端アミノ酸配列決定は、 未処理タンパク質Ｒ３Ｐについて行った。

その結果、Ｒ３ＰのＮ末端アミノ酸配列は第３図に示したように決定された。こ のアミノ酸配列データに基づき、コード縮重から予測し最もあいまいでないＤＮ Ａ配列領域を固定し、これらの配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを合 成し、残余セリンプロテアーゼ遺伝子の局在化のためのハイブリダイゼレーショ ン研究に用いた。必要な場合には、コード縮重を混合塩基プローブ合成で解決し た。

適切なオリゴヌクレオチドプローブを第４図に示した。前記プロテアーゼアミノ 酸配列の他の部位に基づく他のプローブ配列も同様に効果的に用いることができ る。

例えば、それぞれのタンパク質のペプチドフラグメント類は、特にＣ１８カラム 逆相クロマトグラフィで類似溶媒（すなわち、０．１％ＴＦＡ中アセトニアセト ニトリルソプロパツール）で溶出し分離される。前記タンパク質類の成分ペプチ ドへの適切な断片化は、ＣＮＢｒ切断によって行われる。断片化は、Ｌｙｓ及び Ａｒｇ残基後のトリプシン消化またはＡｒｇ残基後のクロストリパイン消化によ って酵素的に最も容易に達成される。Ｒ８Ｐは１分子当たりＡｒｇ残基を４個し か有していないので、クロストリパイン消化は特にＲ３Ｐに好適である。他の公 知の特異的切断方法もＲ３Ｐ及びＲＣＰの特定ペプチドフラグメントの産生に同 様に用いることができる。

Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｉ　Ｓ　７５またはＢＤ１７０染 色体ＤＮＡの制限消化物は、ＨｉｎｄＩＩＩ及び５ａｕ３Ａｌ制限ヌクレアーゼ を用いて調整できる。

数種の異なる消化により生成した適当な大きさく約３ｋｂ）のＲＣＰおよびＲ８ Ｐ特異的断片は、調整用アガロースゲルまたはショ糖密度勾配（５−２０％）か ら中性ｐＨにおける非平衡遠心分離後に単離できる。

ＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨｒ部位で切断しイー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で クローニングしたＰＵＣまたはｐＢＲ３２２プラスミドベクターを用いて単離Ｒ ３Ｐ及びＲＣＰ特異的フラグメントを含有するプラスミドライブラリを構築した 。３２ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブとのコロニーハイブリダイゼーション によって、これらのライブラリのＲ８ＰまたはＲＣＰ特異的挿入物をスクリーニ ングする。プラスミドＤＮＡは陽性クローンから調製し、制限解析によって特性 解析する。例えば、これらの制限消化物は、Ｒ３Ｐ及びＲＣＰの特異的配列に対 する３２ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブを用いるリジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）分析によって調べることができる。３２ｐ標識プローブとハイブリダイズして いるフラグメントは、オートラジオグラフィで局在化する。手元のプロテアーゼ 特異的制限フラグメント類を用いて、それらのそれぞれのプロテアーゼ遺伝子の 不活化を相同組換えによって達成する。

部位特異的変異体の作製 プロテアーゼ欠損性欠失変異体の選択を促進するために抗生物質耐性指標をプラ スミド中の欠失遺伝子に好適に挿入できる。例えば、カナマイシン、エリスロマ イシン、フシジン酸及びクロラムフェニコール耐性をコードする遺伝子は、それ ぞれＡＰ、ＮＰ、Ｒ８Ｐ及びＲＣＰの欠失遺伝子に挿入できる。前記の変異プロ テアーゼ配列及びそれぞれの耐性指標をコード化するベクターを次に用いてＢ、 サブチリス（Ｂ、　ＳυＮｉ１ｉｓ）を形質転換する。

ｐＵＣ及びｐＢＲ３２２に基づくプラスミド類はペシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 中で複製できないので、相同組換えによって細菌染色体中に欠失を取り込んだＡ Ｐ−。

おける増殖によって選択できる。受容体宿主の表現型に応じて、変異株はプロテ アーゼ欠損性で増殖し、例えば表現型ＡＰ−／ＮＰ−／Ｒ８Ｐ−及びＡＰ−／Ｎ Ｐ−／ＲＣＰ−のトリプル（三重）変異菌株及び表現型ＡＰ−／ＮＰ−／Ｒ３Ｐ −／ＲＣＰ−を有するクオドラプル（四重）変異菌株が選択できる。例えば、Ｅ ｃｏＲＩ消化Ｂ、消化子リス（Ｂ、　５ｕｂｆｉｌｉｓ）　ｒ　Ｓ　７５または ＢＤ１７０染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ９ベクターに連結後アンピシリ ン存在下の増殖で形質転換体を選択しイー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）にクローン化 すると、アルカリ性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼの遺伝子をコードするク ローン、それぞれｐＡＰ４１及びｐＮＰｌｌｏ、２を単離することができる。

このクローン化ＤＮＡをＭ１３にサブクローニングし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）のジデオキシ法で配列解析し、これらのクローン類がそれぞれのプロテアーゼ をコードすることを確認した。スタール（Ｓｔａｈｌ）、　Ｍ、Ｌ、及びフング ら　（Ｙａｎｇ　ｅｔａｌ、）、　（１９８４）　ジャーナルオブバクテリオロ ジ−（Ｊ、　Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ）、　１６０．　１５−２１゜内部欠失は、セ リンプロテアーゼ遺伝子の場合は唯一の制限フラグメントの除去によって及び中 性プロテアーゼ遺伝子では唯一の制限部位からＢａ１３１欠失によって、両遺伝 子中に作製した。エリスロマイシン耐性及びカナマイシン耐性をコードする遺伝 子は、アルカリ性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼ遺伝子中にそれぞれ作製し た内部欠失中にクローン化した。この構築物のＢ、サブチリス（Ｂ、　Ｓｕｂ！ ｉ　ｌ　ｉｓ）中への形質転換によって、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテ アーゼ。

またはアルカリ性及び中性プロテアーゼの双方を欠損している変異体を相同組換 えによっていずれの所望Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｌｉｌｉ＋）宿主中でも 作製することに成功した。

抗生物質耐性の指標の除去 前記プロテアーゼ遺伝子類を総体的に不活化するための本法の限界は、抗生物質 耐性視標が宿主ゲノム中に残存することである。ＡＰ−／ＮＰ−／ＲＣＰ−／Ｒ ３Ｐ−変異体の場合、このために４つの別個の構成物質耐性指標を用いることに なる。次いで宿主の抗生物質耐性がこのように限定されているので、有用なりロ ーユングベクター類の範囲が別の抗生物質耐性をコードするものに制限される。

したがって、ゲノム中の耐性指標か不活化されることが理想的である。この目標 達成のために２乃至３の方法を用いることができる。

前記プロテアーゼ遺伝子の不活化はコングレション（Ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏｎ） によって達成でき、これによって抗生物質耐性指標の挿入を防止できる。リンス タフイン活性は、生存または熱殺菌Ｓ、オウレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）懸濁 液含有寒天重層中の明確な環状体の出現によって検出できる。リソスタフィンの 不活化及びプロリソスタフィンのりリスタフィンへの活性化は、特異的にＲ３Ｐ とＲＣＰを検出するコロニーをスクリーニングするために目視でき、またはそれ らの不活化はそれぞれ、リススタフィン依存性環状体の出現または欠損によって 検出できる。しかし、これには特異的プロテアーゼ不活化を広範囲にわたりスク リーニングすることが必要になるであろう。

別法ではトランスポゾンを使用する。例えば、上述のプロテアーゼ遺伝子の破壊 にエリスロマイシン耐性をコードするＴｎ９１７が挙げられる。Ｔｎ９１７はｐ ＵＣ８中の破壊プロテアーゼ遺伝子に連結し相同組換えによって宿主プロテアー ゼ遺伝子を不活化するのに用いることができる。組換え体は、エリスロマイシン 存在下における増殖によって選択できる。

エリスロマイシン選択の非存在下においてこの転置因子をその後増殖させると転 置因子とゲノム中から消失させることができるという利点を本法は有している。

このことは、エリスロマイシンに対する感受性によって確認できる。

別法として、端を切り取ったクロラムフェニコール耐性指標（クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子の最初の２／３をコードする ）を有するフラグメントに未処理のフシジン酸耐性指標を連結することが挙げら れる。フシジン酸耐性をコードするこのハイブリッド構築物は、ｐＵＣベクター 内の欠失プロテアーゼ遺伝子に挿入する。上述の如くこの構築物を用いて、相同 組換え後Ｒ８Ｐ及びＲＣＰに対するそれぞれのプロテアーゼ遺伝子をフシジン酸 耐性選択によって挿入的に不活化する。

このフシジン酸指標は相同組換えによって同様に不活化できる。

エリスロマイシン耐性プラスミドｐＲＮ５１０１は、本目的に適する温度感受性 レプリコン（複製子）をコードする。端を切り取ったフシジン酸指標（本遺伝子 の最初の１／３から成る）を前記ｃａｔ遺伝子の後端２／３に連結し、この構築 物をｐＲＮ５１０１に挿入する。フシジン酸耐性株の形質転換体をエリスロマイ シン存在下における増殖によって最初に選択する。クロラムフェニコール指標を プラスミドにレスキューする組換え体は、フシジン酸指標（これによって本遺伝 結果として宿主ゲノム中に常在する活性クロラムフェニコール指標を生じること になる。このことは、フシジン酸指標を不活化しない。両者は、クロラムフェニ コールの存在下における増殖によって選択できる。クロラムフェニコール非存在 下における非許容温度下での組換え体の増殖は、プラスミド株を修復し、すなわ ちプラスミドが菌株を形成するのを低下させる。この修復株について次にフシジ ン酸感受性をスクリーニングし、適当な組換えを選択する。

この組換え体は、フシジン酸指標（これによって本えは、結果として宿主ゲノム 中に常在する活性クロラムフェニコール指標を生じることになる。このことは、 フシジン酸指標を不活化しない。両者は、クロラムフェニコールの存在下におけ る増殖によって選択できる。

クロラムフェニコール非存在下における非許容温度下での組換え体の増殖は、プ ラスミド株を修復し、すなわちプラスミドが菌株を形成するのを低下させる。こ の修復株について次にフシジン酸感受性をスクリーニングし、適当な組換え体を 選択する。

タイム、時間から定常期へ ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ＰＳＰの末端アミノ酸配列 Ｓｅｒ　Ｖａ！　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｒ）ｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｌ。

ＦＩＧ、４ ＰＳＰクローニングの混合ＤＮＡプローブ２、ＧＡＧ　ＧＣＮ　ＡＡＧ　ＧＣＮ 　”ｒｒＴ　ＡＡＡ　Ａ　Ｃ 特表千３−５００６０６　（９） ２δ− 国際調査報告 トン ０発　明　者　チャン　ニドワード　エル、　アメヤー リカ合衆国　１１２３８　ニューヨーク州　プルツクリン　クリンアヴエニュ− ３５５５階 リカ合衆国　１１７４０　ニューヨーク州　グリーン　ローン　シコート　１８ リカ合衆国　１１２０１　ニューヨーク州　プルツクリン　モンタユ　ストリー ト　５ジー　５７

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．中性プロテアーゼ，アルカリ性プロテアーゼ、及び残余セリンプロテアーゼ 及び残余システインプロテアーゼから成る群から選択した少なくとも一つのさら なる残余プロテアーゼを実質的に含まないプロテアーゼ欠損性グラム陽性菌の実 質的に純粋は培養物。
2. ２．前記細菌がこの細菌のＤＮＡ配列の突然変異の結果である請求の範囲第１項 に記載の培養物。
3. ３．前記突然変異の少なくとも一つが欠失変異である請求の範囲第２項に記載の 培養物。
4. ４．前記細菌がバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属である請求の範囲第１項に記載 の培養物。
5. ５．前記細菌がバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｓｕｂｔｉｌｉｓ） 種である請求の範囲第４項に記載の培養物。
6. ６．前記細菌がバシラス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕ ｓ）種である請求の範囲第４項に記載の培養物。
7. ７．前記細菌がバシラス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｓｐｈａｅｒｉ ｃｕｓ）００である請求の範囲第６項に記載の培養物。
8. ８．残余セリンプロテアーゼをコードする遺伝子において欠失突然変異がある請 求の範囲第３項に記載の培養物。
9. ９．残余セリンプロテアーゼのＮ末端アミノ酸４０個をコードする核酸配列の一 部に実質的に相補性のオリゴヌクレオチドプローブ。
10. １０．【配列があります】 ［式中，ＮはＧ，Ｔ，ＡまたはＣ，ＸはＴ，Ａ，またはＣ，ＹはＧまたはＡ及び ＺはＴまたはＣ］から成る群から選択される請求の範囲第９項に記載のプローブ 。
11. １１．（ａ）適当な非相同タンパク質１種の溶液と試料を混合すること、 （ｂ）いずれの残余セリンプロテアーゼまたは残余システインプロテアーゼが前 記非相同タンパク質の少なくとも一部を不活化または分解することができる充分 な時間、この混合物をインキュベートすること、及び （ｃ）前記非相同タンパク質の分解または分解産物の蓄積を測定すること、 から成る試料中残余セリンプロテアーゼまたは残余システインプロテアーゼ活性 をアッセイする方法。
12. １２．（ａ）試料をリンスタフィン溶液と混合すること、 （ｂ）いずれかの残余セリンプロテアーゼが前記リンスタフィンの少なくとも一 部を不活化または分解することができる充分な時間、この混合物をインキュベー トすること、 （ｃ）スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ ｒｅｕｓ）の細胞懸濁液を前記インキユベートした混合物に添加すること、 （ｄ）前記スタフィロコッカス含有混合物中のスタフィロコッカス・オウレウス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の全細胞数を全く試料を添 加していない対照中の細胞数と比較すること、 から成る試料中残余セリンプロテアーゼ活性をアッセイする方法。
13. １３．（ａ）試料をプロリソスタフィン溶液と混合すること、 （ｂ）いずれの残余システインプロテアーゼが前記プロリソスタフィンの少なく とも一部を不活化または分解することができる充分な時間，この混合物をインキ ュベートすること、 （ｃ）スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａ−ｐｈｌｏｃｏｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ）の細胞懸濁液を前記インキュベートした混合物に添加すること、 （ｄ）前記スタフィロコッカス含有混合物中のスタフィロコッカス・オウレウス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の全細胞数を全く試料を添 加していない対照中の細胞数と比較すること、から成る試料中残余システインプ ロテアーゼ活性をアッセイする方法。
14. １４．第６図に図示したＮ未端アミノ酸配列を有するセリン依存性プロテアーゼ の実質的に精製された調製物。
15. １５．バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ　ｓｕｂｓｉｌｉｓ）から単 離した請求の範囲第１３項に記載のプロテアーゼ。
16. １６．バノラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）から単 離したシステイン依存性プロテアーゼの実質的に精製された調製物で、このプロ テアーゼがＰ−ヒドロキシ水銀ベンゾアートで不活化されかつプロリソスタフィ ンをリンスタフィンに変換できる調製物。
17. １７．細菌培養物中に産生された残余セリンプロテアーゼ（ＲＳＰ）及び残余シ ステインプロテアーゼ（ＲＣＰ）の効果を阻害または不活化する方法で、前記培 養物中にＲＳＰ及びＲＣＰの効果を阻害乃至活性化するために充分な量のある化 合物のある量を添加することから成る方法。