HUT53154A - Process for producing protease-defective gram-positive bacteria and utilizing them as host-organizmus for producing recombinant products - Google Patents
Process for producing protease-defective gram-positive bacteria and utilizing them as host-organizmus for producing recombinant products Download PDFInfo
- Publication number
- HUT53154A HUT53154A HU894054A HU405489A HUT53154A HU T53154 A HUT53154 A HU T53154A HU 894054 A HU894054 A HU 894054A HU 405489 A HU405489 A HU 405489A HU T53154 A HUT53154 A HU T53154A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protease
- residual
- culture
- bacillus
- activity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya proteáz-hianyós Gram-pozitiv baktériumtörzsek, mint például Bacillus subtilis, ilyen törzsek izolálása szempontjából hasznos eljárások és eszközök, és ezeknek, a törzseknek az alkalmazása hétéről óg proteinek el bál 1itására.
A legutóbbi évtized egyik, legjelentősebb technológiai előrelépése idegen gének baktériumokba történd sikeres bevitele, és gyógyászatilag és iparilag fontos proteinek termelése szempontjából történd kifejezésük rekombináns DNS technoiógiával.
Klónozott gének kifejezésére a legelterjedtebben alkalmazott gazdaszervezet az E. coli. Az E. coli által termelt hétérőlóg proteinek azonban a sejtplazmában halmozódnak fel. A hétéről óg termékek: gyakran oldhatatlan termékként zárványtestekben halmozódnak, fel. Ezért beterel óg proteineknek E. coli és más Gram-negativ gazdaszervezetekben történd termelése a kívánt terméknek a gazdaszervezet szennyezd proteinjeitől való alapos megtisztítását teszi szükségessé. A proteinek zárványtestekből történd extrakciója rendkívül kíméletlen, denaturál ássál járó körülményeket igényelhet, ami a protein jelentős inaktiválásához, és ezáltal csekély kitermeléshez vezet. További nehézségek adódhatnak, ha a rekombináns proteinek szülfhidri1-csoportokat tartalmaznak. Az extrakció során gyakran a proteinek véletlenszerű polimerizációja játszódik le nem jellegzetes diszülfid-keresztkütések utján.
• ···* · ····«·· • · · · · · · • ♦ · · · · .
• · · « · · · • · · · · ··«··· ··
Bacillus és más Gram-pozitiv szervezetek azonban a sejten kívüli tápközegbe választanak ki proteineket. Ez előnyős a hétérőlóg proteinek tisztítása szempontjából. Bacillus és hasonló baktériumok továbbá proteinek termelése tekintetében költségesebbek, mint más kompatitiv gazdaszervezetek, mint élesztőgombák és emlős sejttenyészetek, annak következtében, hogy utóbbiak növekedése gyorsabb, olcsóbb tápközeget és általában egyszerűbb tenyésztési eljárásokat i génvelnek.
Bacillus rutinszerűen, ipari méretekben tenyésztett •fermentációs szervet, és egy -faja, a B. subtilis a legrészletesebben tanulmányozott Gram-pozitiv szervezet. Nincs kórokozó hatása, és - az E. colival ellentétben - nem termel endoto;:int, ezek egyértelműen kívánatos tulajdonságok, ha a rekombináns termékek gyógyászati vagy állatgyógyászati rendeltetésüek. Előállítottak olyan plazmidklónozó vektorckat, amelyekkel lehetséges idegen genek Bacillus gazdaszervezetekbe történő bevitele, és azok által történő kifejezése. Ezek a klónozó vektorok általában szekréciós vektorok, amelyekben a szekréciós Bacillus protein jelszekvenciája a kívánt heterológ proteint kódoló szerkezeti génhez van kapcsolva. Ezt a képződményt azután olyan plazmidba klónozzák, amely a Bacillus baktériumban replikációra képes. Ezek a plazmidok különleges restrikciós helyekkel rendelkeznek, és az átalakított szervezetek izolálása szempontjából hasznos, kiválasztható antibiotikum ellenállást jelző markereket kódolnak.
A Gram-pozitiv baktériumok, igy a B. subtilis gazdaszervezetként betöltött nagy potenciális lehetőségei ellenére ezeknek a szervezeteknek az általános alkalmazása hétérőlóg proteinek előállítására számos ok, nem utolsósorban a protein lebomlása miatt korlátozott maradt. Ez a nehézség jelentős, mivel a Bacillus legalább három olyan ismertetett sejten kívüli proteázt termel, amelyek a E-íacillus által termelt heterológ proteineket megtámadhatják: és lebonthatják (Priest: 41 Bacteriol. Rév. 711 (1977), Roitsch és munkatársai: 155 J.Bacteriol. 145 (1923), Stahl és munkatársai! 153 J. Bacteriol. 411 (1934) , llehara és munkatársai: 139 J. Bacteriol. 533 (1979), Yang és munkatársai: 160
J. Bacteriol. 15 (1934)).
A Bacillus két tő sejten kívüli proteáza a semleges proteáz (NP) , egy eti1én-diamin-tetraecetsavra (EDTA) érzékeny metál 1oenzim, és az alkalikus proteáz (AP) , egy szerin-proteáz, amely aktivitásának optimuma a lúgos pH-tartományban van. E két -fő proteáz szerkezeti génjét klónozták, és arra használták, hogy in vitro olyan származtatott meghatározott kiiktatásokat hozzanak létre, amelyek a vonatkozó proteáz géneket inaktiválják (Stahl és munkatársai! 153 J. Bacteriol. 411 (1934), Yang és munkatársai: 160 j.
Bacteriol. 15 (1934), Kawamura és munkatársai: 160 J. Bactericl. 442 (1934)). Ezeket a két -fö proteáz szerkezeti génjeiben kiiktatásokat tartalmazó mutáns törzseket a követke• · · » ·· · • · · · · • · · · · · “ wJ zbkben aprE-/nprE“ kettős mutánsoknak nevezzük. A fenotipusosan alkálikus és semleges proteáz-hiányos mutáns törzseket, amelyekben a mutáció természete nem definiált, a következükben AP”/NP“ kettős mutánsoknak nevezzük.
A vad tipusu B. subtiiis, például BD170 (ATCC 33 60S) törzsek és AP~, NP“ és AP-/NP“ mutánsok aktivitását olymódon figyelték- meg, hogy a törzseket kazein-agar tápközegen tenyésztették, és megfigyelték a kazein degradálására képes proteázokat termelő kolóniák körül képződött tiszta udvarok méretét. A B. subtiiis BD170 vad tipusu és proteáz-hiányos mutánsait 1 7. szeparált tejet tartalmazó TBAB agaron tenyésztették 37 hőmérsékleten 16 óra időtartamig. A kolóniák a kazein proteolitikus degradációjának tulajdoníthatók. A törzsek a következők voltak: <1) vad tipusu, (2) alkalikus proteáz mínusz íAP->, (3) semleges proteáz mínusz <NP~) és (4) kettős proteáz. Ebben a vizsgálatban a proteáz-hiányos kettős mutánsok (AP~/NP~) nem mutattak a kazeinnel kapcsol atban aktivitást, vagy annak mértéke csekély volt. Minden esetre a B. subtiiis AP~/NP“ törzsek, még számos fontos rekombináns szekréciós proteint degradálnak. A B. subtiiis AP/NP“ törzsei degradálják például a lizcsztafin, prolizosztafin , mikrckokkusz nukleáz .heterológ proteineket és eukariótikus proteineket tartalmazó fúziós proteineket, közöttük az interleukin-l-et és a szövet-plazminogén aktivátort, amelyet a prolizősztafin szekréciós és proenzim szekvenciáihoz kapcsoltak annak: érdekében, hogy a baktériumból ···· ···· való kiválasztását lehetővé tegyék.
A találmány tárgya eljárás Gram-pozitiv organizmusok, különösen a maradék proteáz aktivitást jelentős mértékben csökkenteni képes Bacillus nemzetség kiválogatására és azonesi tására.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan Gram-pozitiv gazdaszervezetei::, különösen a Bacillus nemzetséghez tartozó gazdaszervezetek biztcsitására, amelyek a jelenleg hozzáférhető proteáz-negativ kettős mutánsokat a maradék proteáz aktivitás lényeges csökkenése következtében jelentősen fe1 üljulja.
A találmány tárgyköréhez tartozik továbbá olyan eljárás, amellyel Gram-pozitiv baktériumok, különösen Bacillus spp., nagymértékben proteáz-hiánycs törzsei állíthatók elő hétérőlóg proteinek termelésére alkalmas gazda— szervezetekként.
A találmány tárgyához tartozik hétérőlóg proteinek termelésére szolgáló olyan tökéletesített eljárás, amely gazdaszervezetként nagymérték ben proteáz-hiányos Gram-pozitiv baktériumokat alkalmaz.
Megállapítottuk, hegy a Bacillus AP“/NP“ törzseiben a maradék proteáz aktivitás két további proteáznak, a maradék szerin proteáznak <RSP) és a szulfhidri1 —függö maradék cisztein proteáznak (RCF) tulajdonítható, amelyek együtt okozzák a rekombináns hétérőlóg proteinek dsgradációját B. subtilis (AF—/NP“> kultúrákban. Megvizsgáltuk e két enzim akti···· ···· • · · · · · « • · · ··· · • · · · · · · • · · ·· ······ ·· vitását, és megállapítottuk, hogy a két proteáz aktivitása hétérőlóg proteinekkel, például 1izosztafinnal és prolizosztafinnal szemben eltérő. Meghatároztuk továbbá az RSP N-terminális aminosav szekvenciáját, és nukleinsav mintát terveztünk meg az RSP gén hel yspec i f i kus mutációjához. Ezen ismereteket alkalmazva olyan B. subtilis törzseket -Fejleszthetünk ki és azonosíthatunk, amelyekből nemcsak a semleges és az alkálikus proteáz hiányzik, hanem az egyik vagy mindkét maradék proteáz is. Az ilyen törzsek mód -Felett alkalmasak gazdaszervezetként olyan hétérőlóg proteinek termelésére, amelyek a maradék proteázok -Fehérjebontó aktivitására érzékenyek.
Az 1. ábra -Feltünteti a lizosztafin rekombináns protein -Felezési élettartamát a vad tipusu B. subtilis BD170, a B. subtilis BD170 AP“/NP~ és az izolált B. sphaericus OO kultúrákban végbemenő tenyésztés során.
A 2. ábra mutatja a maradék cisztein proteáz (PCP) és a maradék szerin proteáz <RSP) kromatográfiás elválasztását.
A 3. ábra bemutatja az RSP N-terminális aminosav szekvenci áját.
A 4. ábrán látható az RSP-hez előnyösen alkalmazható ol igonukleotid minta szekvenciája.
A Bacillus AP-/NP- törzsek maradék proteáz aktivitása okának meghatározására megvizsgáltuk a B. subtilis BD170 AP~/NP~ kultúra fel üluszóját. Megállapítottuk, hogy a maradék sejten kívüli proteáz aktivitás azonosíthatóan két ···· ···· ·· · ♦· · · • · · ··♦ · • · · · · · · • · · ·· ······ ··
- e proteinnek, a maradék szerin proteáznak (RSP) és a szulfhidril—Függő maradék cisztein proteáznak (RCP) tulajdonítható. Ezt a két proteázt az alább leirt módon izoláltuk a későbbi stacionárius szakaszban lévő kultúra felüluszójából. Az izolálást kővetően megállapítottuk, hogy RSP-t fenil-metil-szulfoni1-f1uorid (RI1SF) inaktiválja, és az antipain enzim inhibitor (Phe-CO-Arg-Val-Arg-al) inhibitál ja. A vizsgálatok szerint RCP-t p-hidroxi-merkuri-benzoát CpHMB) inaktiválja, és az antipain inhibitálja, ami arra mutat, hogy az RSP és RCP egymástól eltérő proteinek.
Az 1. ábra a növekedési -Fázisban a növekedés -Függvényébán mutatja a lizoszta-Fin inaktiválását, összehasonlítva a vad tipusu B. subtilis BD170 (W) törzset a B. subtilis
AP~/NP“ (D) és a proteáz-hiányos B. sphaericus 00 <S) törzsekkel. Felüluszó mintákat gyűjtöttünk össze a logaritmikus növekedési szakasz végen és a stacionárius szakasz különböző időpontjaiban. A felüluszót <20 μΐ-t) 1,0 mg/ml 1izosztatint tartalmazó oldat 20 yl—ével 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk 30 percig, ezt követően a mintákat a további inaktiválás meggátlására szárazjégen gyorsan befagyasztottuk. A maradék lizoszta-Fin aktivitást ezután turbidometrikusan mértük hőhatás utján elpusztított Staphy1ococcus aureus-szal szemben, és kontroll 1izosztafinnal hasonlítottuk össze.
•··· ···« ·· · · • · · · « • · · · »····· ·« • ···♦ ·· · • · ♦ · · ··· ··
A rekombináns lizosztafin (azaz az ΓΡΒ7. október 22-én
WO 37/06264 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, rekombináns DNS technológiával előállított 1 i zosz tar i n ) -felezési élettartama a vad tipusu B. subtilis és annak AF*/NP~ mutánsai esetében a stacionárius szakaszban lévő kultúrák felüluszóiban hasonló. Ez az alapvető megfigyelés jelzi, hogy a fenti kultúrákban lévő maradék proteázok, az RCP és az RSP aktivitása jelentős mértékben befolyásolja ezen szekréciós rekombinációs termék instabilitását. Ez az eredmény jelzi továbbá, hogy félrevezető az általánosan elfogadott feltevés, miszerint a vad tipusu B. subtilis kultúrák fel üluszói bán a domináló sejten kívüli proteáz aktivitás a semleges és alkalikus prcteázcknak tulajdonítható.
Az RSP és RCP heterclóg proteinnek, mint a lizosztafinnak degradálásában megnyilvánuló aktivitását tovább tanúimén y ox t u k azzal a céllal, hogy egy lehetséges vizsgálati módszer alapját teremtsük meg proteáz-hiányos Bacillus törzsek azonosítása számára. A B. subtilis BD170 AP~/NP“ törzs stacionárius szakaszban vett fel ül úszójának frakcionálásit követően, Mono □ tipusu oszlopon (Pharmacia) kromatcgráfiásan meghatároztuk az RCP és RSP aktivitásokat. Az (1,0 ml-es) őszlop-frakciókból vett (20 pl-es) mintákat inkubáltuk vagy (A) 20 j-· 1 prol i z ősz taf i nnal 1,0 mmól f eni 1-met i 1-szül feni 1-fluorid (PMSF) jelenlétében, vagy • ···· ···· • · · · • · · · · • · · · • ·· ··· ·· ·♦·· (Ε) 2ϋ p.l 1 i ζ α=: taf i nnal °C hőmérsékleten 30 perc időtartamig, majd a mintákat a további degradáció meggátlására szárazjégen gyorsan befagyasztottuk. A mintákat ezután EDE-PAGE vizsgálatnak vetettük alá, és megfestettük Coomassie Blue színezékkel. A krcmatrcfági ás viszonyok: Mono □ tipusu oszlopon végzett ani on cser és HF'LC (A) oldószer: viz (B) oldószer: 100 mmól/1 Na^HPCU, pH - 7,0, 1,0 mól/1 NaCl , gradiens: 5-100 7. B oldószer 15 percig 1,0 ml /perc térfogatsebességgel.
A csúcsokat on-line detektáltuk AS1O és Asao értékekként .
F;SP képes mindkét hétéről óg proteint, a prol i zosz taf i nt és a lizosztafint degradálni. Másrészt RCP nem befolyásolja a lizosztafint, azonban képes a prcl i zcsztaf i nt 1 i z esz taf i ríná alakítani. A prolizosztafin inaktív, és a pro!izosztafίn heterológ protein enzimátikusan aktiv 1izcsztafinná alakítása az R l. F* vizsgalat alapja. Az R’o P vizsgalat alapja a lizcsztafin heterológ protein degradálását kisérő i n a k 11 v á 1 á s.
A két maradék proteázra és heterológ proteinekkel való reakciójukra vonatkozó ismeretek lehetővé teszik, hogy válogató vizsgálatokat végezzünk azokra a törzsekre, amelyekben hiányoznak ezek a proteáz-aktivitások. Ezzel a módszerrel azonosítottuk a B. sphaeri cus-nak egy AP“/NF’“/RBP~/RCF’~ *·»· ♦··· • ···· · ·· · ·· · · • · · · · · · • · · · · · · ·· · ·· ······ ··
- 11 törzsét a B. sphaericus 00-t. Ennek a gazdatörzsnek a lizosztafin-gén hordozóplazmidjával transzf orrnál t tiszta kultúráját letétbe helyeztük az American Type Culture Collection intézetben, és a PCT/USS7/0ÖE73 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésnek megfelelő 034 4ó4 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentéssel összefüggésben megjelöltük a 67 0S0 deponálási számot. A módositat 1an gazdaszervszet megtalálható a New York állam-beli Public Health Research Institute (New York) törzsgyüjteményében. Ez a gazdaszervezet nemcsak azért jelentős, mert AP“/NP_/F;=P—/RCP” tipusu, hanem mert a pBCló-lL és pRDJ^ARR-lL plazmidokkal úgy transzformálható, hogy prolizosztafint termeljen, és azt 1izosztafinná alakítsa az AP, NP, R5P és RCP proteáz-aktivitások hiánya ellenére.
Továbbá annak ismeretében, hogy a B. subtilis AP“/NP“ törzsekben van két maradó proteáz, és hogy azoknak heterológ proteinekkel végbemenő reakcióján alapuló vizsgálati módszerekkel meg tudjuk különböztetni aktivitásukat, bármilyen ismert eljárással előállított mutáns populációkból ki tudjuk válogatni azokat a mutáns törzseket, amelyekből az egyik vagy mindkét maradék proteáz hiányzik. A mutáns törzsek olyan mikroorganizmus-törzsek, amelyek, egy vagy több mutációt, azaz a szervezet genetikai szekvenciájában lévő változást tartalmaznak. Ezeket a mutációkat a mutációt előidéző módszerek számos változata közül bármelyik (sugárzással vagy kémiai utón előidézett mutációk, transzpcziciós, rekombiná• · · · * · · ·
• · · · • · · · · • · · · ··· ·♦· ··
- 12 ciós és restrikciós enzimmel végzett kezelés) előidézheti. A keletkező mutáns törzs különbözhet a szülő-törzstől bázis-pár helyettesítés következtében, azaz a szervezet genetikai szekvenciájában egy bázis-párnak egy másikkal történő helyettesítése (bázis-pár helyettesítéses mutánsok), egy vagy több bázis-párnak a genetikai szekvenciába történő betoldása (betoldásos mutánsok), egy vagy több bázis-párnál··: a genetikai szekvenciából történő kiiktatása (kiiktatásáé mutációk) következtében. A gyakori atban a kiiktatásos mutánsokat részesítjük előnyben, mivel a bázis-pár helyettesítéses vagy betoldásos mutánsoknál fennáll a reverzió lehetősége. Ilyen kiiktatásos mutánsokat előnyösen a megfelelő génben specifikus in vitro kiiktatások elvégzésére ismert eljárásokkal állítunk elő.
A marcidék proteázokat azonosítva a nem-mutáns mikroorganizmusok által termelt maradék RSP és RSP hatását is megszüntethetjük azáltal, hogy vegyi anyagok, például pHMB, FMSF és peptid jellegű inhibitorok, mint az arrtipain és fém-kelát-képzök, mint az EDTA hozzáadásával kémiailag inhibitáljuk vagy inaktiváljuk a tápközegben éppen keletkező RCP és RSP hatását.
Hiányzó RSP és/vagy RCP aktivitású, hely-specifkus kiiktatásos mutánsok in vitro létrehozásában az első lépés azt igényli, hogy ezeket a proteázokat kódoló megfelelő gének a bakteriális genomban ki ónozottak legyenek.
Az RSP ezen végén meghatároztűk az N-terminális aminosav-szekvenciát, amelyet a
ábra mutat ·»·« • ♦ • · • ···· Mtv ··· · • · 9 9· •> · a • · · ····· be. A protein aminosav-szekvenciájának alapján a kodon degenerációjából előre jelezhető, a DNS szekvencia kevéssé bizonytalan szakaszait azonosítottuk. Ezen aminosav-szekvenciáknak meg-felelő oligonukleotid mintákat szintetizálhatunk hibridizációs vizsgálatokban való alkalmazáshoz abból a célból, hogy azonosítsuk a maradék proteáz géneket tartalmazó restrikciós -Fragmentumokat. Alkalmasan a kodon degenerációját vegyes bázisú cligonukleoti□ mintákkal állítjuk helyre. Példaként a 4. ábra olyan három vegyes oligonukleotid mintát mutat be, amelyek alkalmasak az RSF'-hez előállított N-terminális aminosav-szekvencia szakaszai számára.
A proteáz-aminosav-szekvencia más szakaszaira alapuló egyéb szekvenciája mintákat is használhatunk.
Miután a már alkalmasnak bizonyult minta-szekvenciákat azonosítottuk, az RSP-t és RCF'-t kódoló géneket lokalizálhatjuk olymódon, hogy 3=P—atomokkal jelzett oligonukleotid mintákat hibridizálunk Bacillus kromoszóma-DNS restrikciós enzimmel. Az anonositottan RSP vagy RCP géneket tartalmazó fragmentumokat ezután egy plazmidba klónozzuk, és kiiktatásom mutánsok előállítására előnyösen szekvenciává kapcsolhatjuk, vagy hely-specifikus mutagenézisnek vethetjük alá. A proteáz-hiányos, kiiktatásom mutánsok szelekciójának elősegítésére antibiotikum rezisztencia markereket építhetünk be a kiiktatásos génbe. A B. subtilis baktériumban a proteáz gének homológ rekombináció utján inaktiválva vannak,
- 14 • ···· · ···· ···· ·· · · · ν « • · · · 9 · y • · · · · · · ··· ·* ··· ··» «« és a mutánsokat antibiotikum jelenlétében végbemenő növekedés révén szelektáljuk, és megvizsgáljuk maradék proteáz aktivitás szempontjából.
A szakterületen jártas szakember világosan látja, hogy a maradék proteáz aktivitásának a hétérőlóg proteinen alapuló vizsgálata és az RSF' ami ncsav-s: ekvenc i á ja alapján a Bacillus tetszőleges száma maradék prcteáz-hiánycs mutánsát előállíthatjuk, vagy válogató vizsgálatot végezhetünk velük kapcsol a t □ s a n «
A következőkben részletesebben leírjuk, azokat az eljárásokat, amelyekkel az R5P és RCP meghatározását végezzük, amelyekkel az aminosav szekvenciáját meghatároztuk, és amelyekkel specifikus mutánsokat állíthatunk' elő.
RSP és RCP izolálása és jellemzése
A B. subtilis ED17Ü AP~/NP“ törzs maradék: proteáz aktivitása forrásának izolálására és jellemzésére a stacionárius növekedési fázisú kultúrák felüluszóit Mono Q (Pharmacia? oszlopon végzett ioncserés nagy teljesítményű folyadék kromatcgrafál ássál (HPLC) frakciónál tűk. A B. subtilis BD170 AF-/NP- törzs stacionárius növekedési fázisú kultúrái fel ülu = zóinak krcmatografálását (A), az RCP ismételt krcmatograf ál ását (B) és az RSF' ismételt kromatografálását (C) Mono Q tipusu (Pharmacia) oszlopon végeztük anioncserés HF'LC utján a következő viszonyok mellett:
A oldószer: viz
B oldószer: 100 mmól/1 NasHP0<, pH = 7,0, 1,0 mól/1 NaCl ·«·· ·«·· • · • · · ·«· ·· • ···· • · · ··· ·· « ·· ··· gradiens: 5-100 7. E oldószer 15 percig 1,0 ml/perc térfogatsebességgel .
A csúcsokat on-line detektáltuk A=Xo és A=eo értékekként. A maradék proteáz aktivitás egészében két proteinnek tulajdonítható, amelyeket egy szülfhidri1-függö proteázként (maradék cisztein proteáz - RCP) és egy szerin proteázként (maradék szerin prcteáz - RSP) azonosítottuk. Ezt a két proteint izoláltuk a stacionárius szakaszban lévő kultúra felüluszójából ammónium-szulfáttal (50 %-os telítettségig) végzett ki csapással és azt követően Mono 0 oszlopon végzett ioncserés HF'LC utján 0,05-1,0 mól/1 NaCl lineáris sógradienst használva 0,05 mól/1 nátrium-foszfát pufferben, pH = 7,0 értéknél. Mono 0 tipusu oszlopon, azonos körülmények között végzett ismételt kromatografál ás során az RSP szimmetrikus csúcsként eluál. Az így tisztított RSF nátrium-dodeci1 szülfát-pcliakri1-amid gél elektroforézise (SDS-PAGE) 18 000 Dalton körüli látszólagos mólekulatömegü egyedi csúcsot ad. Az RCP a Mono Q tipusu oszlopról a sógradiensben heterogén csúcsként eluál. Az oszlopról lejövő folyadékot szimultán on-line elemeztük A=Xo és A^eo értékekként.
RSF és RCP meghatározás a lizcsztafin hétérőlóg protein alk a1 mázasava1
A lizosztafin szobahőmérsékleten 30 perc alatt lejátszódó inaktiválódása - ha 20 μΐ 1,0 mg/ml 1izősztafin-tartalmu oldatot a kultúra fel üluszójának (vagy az RSF enzimet ·<·· ···· «·«· tartalmazó egyéb mintának) azonos térfogatú oldatával inkubáljuk - alkotja a mennyiségi meghatározás alapját, bár más alkalmas hétérőlóg proteint is alkalmazhatunk. Hosszabb vagy rövidebb időtartamot alkalmazhatunk, -feltéve, hogy elegendő idő áll rendelkezésre ahhoz, hogy a 1izosztafinnak vagy más heterológ proteinnek: legalább egy része degradálódjon, ha RSP jelen van. Ebben a meghatárezásban a proteáz. aktivitásának az egysége az a proteáz mennyiség, amely a leírtak szerint inkubált 1izcsztatiπ 50 í-át inaktiválja. A
1izcsztafin maradék aktivitását turbidometrikusar. mérjük hőhatással elölt Staphy1ccoccus aureus sejt-szuszpenziójával EzembEn és kezeletlen 1 izosztaf in ellenőrző oldathoz hasonlítjuk.
Hasonlóképpen határozhatjuk meg az RCP mennyiségét hasonló körülmények: között, egy egységként az RCP azon menynyi ségét definiálva, amely a prcl ízosztafin 50 ‘í-át aktiválja 11 zosztat inna. Mivel azonban az RSP degracalja az RCP által a pro!izcsztafinból termelt 1izosztafint, az RSP-t is tartalmazó bal·térium-l·ultura f el üluszó jában végzett RCP meghatározások =zükségcssá teszik, hogy először az RSF-t inaktív-áljuk PMSF vagy más RSP-inhibitorral végzett inkubálás segítségével. PMSF jelenlétében a B. subtilis AP—.MF~ kulturak RCF-aktivitása a prolizosztafint 1izosztafinná konvertálja és lehetővé teszi az enzim felszaporodásét.
Egy másik vál tz~ st i. ón t az RCF és RSF alkalmas meghatározását = 1 végezhet j CJ a hű torol i-g proteir.sk, igy a prolizo • « · • · scta-ir és lizosztafin degradáció es a degradációt termékek elcs:ésével SDB-PAGE utján, Az RCP, illetve RSP akti vitásat meghatározhatjuk továbbá radioaktív módszerekkel 1='s*I-atcmokk.31 , vagy f 1 ucresccein-izocianáttal jelzett heterológ proteinekkel, igy pr ol i z ősz taf i n és lizcsztafin szubsztrátokkal szembeni aktivitásuk révén. A jelzett hétérőlóg proteinek degradációját vagy a degradációs termékek -Fel szaporodását alkalmasan meghatározhatjuk a Jelzett termékeknek a jelzett szubsztráttól történő elválasztására végzett savas ki csapatás után a savoldható vagy a nem savoldható jelzett anyag mérésével.
A leirt, a maradék proteáz aktivitás meghatározására szolgáló eljárást használva megái 1 api tettük , hogy F'MSF inaktiválja az RSP-t. RSP-t az antipain proteáz inhibitor (F'he-Arg-Val-Arg-Al ) is inhibitálja. RCP-t nem befolyásolja F’MSF, a szülfhidri1-reaktív reagens pHMB azonban inaktiválja. RCP-t az antipain inhibitor is inhibitálja.
Ezen ismeretek alapján RSP és RCP maradék proteáz aktivitását specifikusan inaktiválhatjuk vagy inhibitál hatjuk annak, érdekében, hogy lehetővé tegyük Bacillus AF'~/NP törzsek kultúrái által termelt hétérőlóg proteinek felhalmozódását. A B. subtilis BD170 AP~/NP“ kettős proteáz-hiányos törzs kultúrái például inter1eukin-1-mikrococcusos nukleáz fúziós proteineket termeltek. A sejteket (5 p.g/ml ) klóramfenikolt tartalmazó bor j uhus/él eszlögomba-tart al mu (VY) tápközegben tenyésztettük 37 °L hőmérsékleten intenzív levegöz• · · · • · · * · ··· ··· ··
- IS • · • · • · · • · · · tetős közben. Amikor a kultúrák elérték a 220 Klett egységet, továbbá az összegyűjtés idején proteáz inhibitorokat adagoltunk. A sejteket centrifugái ássál gyűjtöttük össze, 30 mmól/1 NaCl és 10 mmól/1 Trisz 8,8 pH-ju oldatával mos-tuk, ultrahanggal 0 °C hőmérsékleten 2 percig besugároztuk. Mintát 300 (1,4), 370 (2,5) és 420 (3,£) Klett egységnél vettünk. A kultúrákat (a) 1,0 mmól/1 PMSF, (b)
1,0 mmól/1 PMSF, antipain (1,0 mg/ml) és leupeptin (1,0 mg/ml) jelenlétében tenyésztettük. A mintákon SDS-PAGE és Western elemzést végeztünk. A foltokat nyúl-antitestekkel mikrccoccuscs nukleázzá vagy inter1eukin-l-gyé inkubáltuk, és kecske anti-nyúl IgG-alkaiikus foszfatáz konjugáttal detektáltuk. Az inter1eukin-1 standard-ot futtattuk.
A maradék proteáz gének azonosítása
A fent leírtak szerint izolált, tisztított RSP N-terminális amincsav-szekvéneiáját automatikus, gáz-fázisú protein szekvencia-meghatározóval (Applied Biosystems) végzett Edman degradációval állapítottuk meg. Az ioncserés HPLC módszerével tisztított proteint C3 oszlopon végzett ellentétes fázisú kromatograf ál ássál sómeritesi tett ük el uálószerként 0-75 % (v/v) lineáris gradienssel 0,1 triflucr-ecetsavban (TFA) acetonitrilt használva. Az RSP és RCP autokatalitikus degradációját az enzimek PMSF, illetve pHMB reagensekkel való inaktiválása utján gátoljuk meg. A tisztított RSP protein savas hidrolizis-termékeinek elvégeztük az aminosav-elemzését. Az N-terminális aminosav szekvencia19 ját az Érintetlen RSF' protein vizsgálatával állapítottuk meg.
Az RSP N-terminális aminosav-szekvenciája meghatározásának eredményét a 3. ábra mutatja. Az aminosav-szekvenciára vonatkozó ezen adatok alapján a kodon degenerációjából előre jelezhető, a DNS szekvencia kevéssé bizonytalan szakaszait azonosítottuk, és ezen aminosav-szekvenciáknak megfelelő oligonukleotid mintákat szintetizáltunk hibridizációs vizsgálatokban való alkalmazáshoz abból a célból, hogy lokalizáljuk a maradék szerint prcteáz gént. Szükség esetén keverék bázisú minták szintézisével kód-degererálást végezt n k .
Alkalmas ol i gonukl eot i d mintákéit a 4. ábra mutat be. Természetesen hatékonyan használhatók a proteáz aminosav-szekvencia más szakaszaira alapuló egyéb minta-szekvenciák IS»
F'éldául a vonatkozó proteinek peptid fragmentumait elválasztottuk CX8 oszlopon végzett ellentétes fázisú kromatcgrafál ássál eluálószerként hasonló oldószereket (azaz 0,1 7. TFA-ban acetonitrilt vagy i z opr opanol t) használva. A proteinek alkalmas fragmentumokra, peptid-komponensekre bontását CNBr-hasitással végeztük. A fragmentumokra bontást legkönnyebben enzimatikusan végezhetjük, Lys és Arg maradó szakaszokat követően tripszinnel, vagy Arg maradó szakaszokat követően clostripain segítségével végzett kezeléssel. A clostripain segítségével végzett kezelés különösen előnyös •··· · · · ·
RSP számára, mivel az molekulánként csak négy Arg maradó szakaszt tartalmaz. Más ismert specifikus hasítási módszerek is hasznosak lehetnek RSP és RCP specifikus peptid-fragmentumainak képzésére.
A B. subtilis IS75 vagy BD170 kromoszóma DNS restrikciós kezelését elvégezhetjük HindlII és Sau3Al restrikciós nukleázok alkalmazásával. Számos különböző kezelésből származó, megfelelő méretű (megközelítőleg 3kb), specifikus RCP és RSP fragmentumokat izolálhatunk preparativ agaróz gélekből vagy szacchar ózból (5-20 *;) sürüség-gradienssel, semleges ρΗ-nál végzett nem egyensúlyi centrifugái ás után. Olyan plazmid-tárakat hozhatunk létre HindlII vagy Bam Hl helyeknél elvágott és E. coli baktériumokba klónozott pUC vagy pBR322 plazmid vektorokat használva, amelyek tartalmazzák az izolált RSP és RCP specifikus fragmentumokat. Ezeken a plazmid-tárakcn az RSP vagy RCP specifikus beépítés szempontjából válogató vizsgálatokat végzünk 3=;P-atomokkal jelzett oligonukleotid mintákkal kivitelezett kolónia-hibri di záci óval . A pozitív kiónokból plazmid DNS-t készítettünk, és azt restrikciós analízissel jellemeztük. Ezeket a restrikciós termékeket megvizsgálhatjuk például a Southern analízis utján, RSP és RCP specifikus szekvenciák szempontjából 3=P-atomokkal jelzett oligonuklectid mintákat használva. A 3=P-atomckkal jelzett mintákkal hibridizált fragmentumok helyét auto-radiográfiás vizsgálattal állapítjuk meg. Proteáz-spécifikus restrikciós fragmentumok birtokában • ···· • · ··♦ · • · · • · · · · ·
- 21 az ajoknak megfelelő proteáz gének inaktiválását homológ rekombinációval végezhetjük el.
Hely-specifikus mutánsok előállítás
Proteáz-hiányos kiiktatásos mutánsok kiválasztásának elösegitésére előnyösen antibiotikum rezisztencia markert építhetünk be a plazmidba a kiiktatott génbe. Például a kanamicin-, eritromiciη-, fuzidinsav- és kióramfenikel-rezisztenciát kódoló géneket beépíthetjük a kiiktatott AP~, NP-, REP-, illetve RCF- génekbe. A mutáns proteáz szekvenciát kódoló vektort és a vonatkozó antibiotikum rezisztencia markért ezután a B. subtilis transzforrnálására használjuk
Mivel a Bacillus baktériumokban a pUC éspBR322 bázi su plazmidok nem replikálódnak, az olyan AP-,
NP-, RSP- és
RCPmutánsokat, amelyekben a kiiktatás homológ rekombi náció utján a baktérium kremoszómájába épült, kiválaszthatjuk
Bacillus transzformációját követő, megfelelő antibiotikum-tartalmú tápközegben való tenyésztés céljára. A befogadó gazdaszervezet fenctipusától függően a mutáns törzsek preteáz -hi ányos, azaz AF'-/NF-/RSP- és AF'-/NP-/RCF'- fenotipusos
Fenotipusos négyszeres mutáns törzseket sokszoroznak, amelyeket elválaszthatunk. Például EcoRI-kezelt B. subtilis
IS75 vagy BD170 kromoszóma-DNS klónozása E.
coli baktériumba az EcoRI révén elvágott pUC9 vektorhoz való kapcsolása és utján a trans • · ·
formációs termékek kiválasztása után lehetővé teszi az alkalikus proteáz és semleges proteáz, pAF‘41 , illetve pNF'llö.2 génjeit kódoló kiónok izolálását. A klónozott DNS szubklónozása M13-má és Sanger didezoxi-módszerével végzett szekvencia-analízis megerősítette, hogy ezek a kiónok kódolják a vonatkozó proteázokat (Stahl M.L. és Ferrari E.:J.
Eacteriol. 158, 411-418 (1984), Yang és munkatársai: J. Bacteriol. 160, 15-21 (1984)). Mindkét génben belső kiiktatást végeztünk, a szerin-proteáz gén esetében egy különleges restrikciós fragmentum eltávolítása utján, és a semleges proteáz génben egy különleges restrikciós helyről E<al31 kiiktatása utján. Ezeket az eritromicin rezisztenciát és ksnamicin rezisztenciát kódoló géneket az alkalikus proteázban, illetve semleges proteázban létesített belső kiiktatásckba klónoztuk. E termékek B. subtilis baktériumokba történő transzformációja eredményesen generál homológ rekombináció utján olyan mutánsokat, amelyek hiányosak az alkalikus proteáz, a semleges proteáz vagy az alkalikus és semleges proteáz tekintetében.
Az antibiotikum rezisztencia markerek eltávolítása
A proteáz gének szisztematikus inaktiválását szolgáló ezen megoldást az korlátozza, hogy az antibiotikum rezisztencia markerek a gazdaszervezet genomjában maradnak. Az AP“/NP”/RCP-/RSP“ mutánsok esetében ez négy különféle antibiotikum rezisztencia marker alkai mazásával jár. Viszont a gazdaszervezet antibiotikum rezisztenciájának ezen korlá• ···· ···· ·· · · • · ·· · • · · * ······ ·· tozása miatt a használható klónozó vektorok választéka azokra szlikül, amelyek további antibiotikum réz i sz tenci át kódolnak. Ezért a genomban lévő rezisztencia markereknek ideális esetben inaktiváltnak kellene lennie. Ezt a célt különböző módon érhetjük el.
A proteáz gének inaktiválását elérhetjük összekapcsolásuk utján, és igy elkerüljük az antibiotikum rezisztencia marker beépülését. A lizosztafin aktivitást detektálhatjuk élő vagy hőhatással elölt S. aureus szuszpenzióját tartalmazó, fel ülrétegzett agarban megjelenő tiszta udvarok révén. így lizosztafin inaktiválását és a prolizosztafinnak 1izosztafinná történő aktiválását vizuálisan észlelhetjük a kolóniák válogató vizsgálatához abból a célból, hogy a lizosztafin-függő udvarok megjelenése, illetve hiánya által specifikusan detektáljuk RSP és RCP jelenlétét vagy inaktiválásukat. Azonban specifikus proteáz inaktiválásához ez széleskörű válogató vizsgálatokkal járna.
Egy további megoldás a proteáz gének fent leirt szétbontására a transzpozonok, például az eritromicin rezisztenciát kódoló Tn917 transzpozon alkalmazása. Tn917 hozzákapcsolható a pUCS-ban szétbontott proteáz génhez, és homológ rekombináció utján a gazdaszervezet proteáz génjének inaktiválására használható. A rekombináns termékeket eritromicin jelenlétében végzett tenyésztés utján kiválaszthatjuk. Ennek a megoldásnak előnye, hogy a transzponál ható elemet elveszíthetjük a genomból, ha azt követően eritromicin szelekció ···· ···· ····
- 24 nélkül végzik a tenyésztést. Ezt az er itromicinnel szembeni érzékenység igazolja.
Egy további megoldás egy érintetlen fuzidinsav rezisztencia marker összekapcsolása egy olyan fragmentummal, amelyen egy lehasitott kióramfenikol rezisztencia marker van (amely a kióramfenikol aceti1-transzferáz (cat) gén első 2/3-át kódolja). A fuzidinsav rezisztenciát kódoló hibrid terméket beépíthetjük a kiiktatott proteáz génbe a p(JC vektorba. Ezt a terméket a fent leírtak szerint használhatjuk homológ rekcmbináci ót kővetően RSP és PCP proteázokkal kapcsolatos gének beépitéses inaktiválására a fuzidinsav rezisztencia alapján végzett szelekció által.
A fuzidinsav markért hasonlóképpen inaktiválhatjuk homológ rekombináció utján. A pRNSIOl hömérséklet-érzékeny replikont kódol, amely alkalmas erre a célra (a gén első 1/3-át tartalmazó elvágott fuzidinsav markért összekapcsoljuk a cat gén vége felé eső 2/3-ával, és ezt a terméket beépítjük a pRNSIOl plazmidba. A fuzidinsav rezisztens törzs transzforrnáltjait szelektáljuk először eritromicin jelenlétében végzett tenyésztéssel. A kióramfenikol markert a plazmidba vivő rekombinánsok a fuzidinsav marker (inaktiválva ezáltal ezt a gént) és cat gén-szekvenciák között végbemenő homológ rekombinációkból származnak. A cat gén-szekvenciákon belüli rekombináció aktív kióramfenikol markert eredményez, amely a gazdaszerveret genomjában jelen van, ez nem inaktiválja a fuzidinsav markert. Mindkettőt • · ·· ·*·.
ki óram-f eni kol jelenlétében végzett tenyésztéssel szelektáljuk. A rekombinánsoknak a megengedetten kívüli hőmérsékleten, ki óram-Feni kol-mentesen végzett tenyésztése a plazmid törzset helyreállítja, azaz a baktérium törzsből eliminálja a plazmidot. A helyreállított törzseken az alkalmas rekombináció ki vál asztására a -Fűz i di nsavval szembeni érzékenység szempontjából válogató vizsgálatot végzünk.
Claims (2)
- Szabadalmi igénypontok1. Lényegében tiszta, proteáz-hiányos, Gram-pozitiv baktériumkul túra, azzal jellemezve, hogy semleges proteáztól, alkalikus proteáztól és legalább egy további maradék proteáztól, igy maradék szerin proteáztól és maradék cisztein proteáztól lényegében mentes.
- 2. Az 1. igénypont szerinti kultúra, azzal j e 1 -
Isme I? v* e , hogy a baktérium DNS szekvenciája mutáció i nak eredménye. 3. A 2. igénypont szerinti kultúra, azzal jel 1 e - mez v e , hogy a mutációk közül legalább egy kiiktatásos mutáci ó.4. Az 1. igénypont szerinti kultúra, azzal j e 1 1 e mez v G? 5 hogy a baktérium a Bacillus nemzetséghez tartóz i k. 5. A 4. igénypont szerinti kultúra, azzal j e 1 1 e - mez v e 5 hogy a baktériumok a Bacillus subtili s egyedei. .u. A 4. igénypont szerinti kultúra, azzal j e 1 1 e - mez v e 3 hogy a baktériumok a Bacillus sphaeri CUE egyedei 7. A 6. igénypont szerinti kultúra, azzal j e 1 1 e - mez v e 9 hogy a baktériumok a Bacillus sphaericus 00 egyedei *□ A 3. igénypont szerinti kultúra, azzal j e 1 1 e - m e v e , hogy a maradék szerin proteázt kódoló génben kiiktatásos mutáció van jelen.S. 01igonukleotid minta, azzal jellemezve, hogy lényegében a maradék szerin proteáz 40 N-terminális aminosavát kódoló nukleinsav szekvenciája egy részének kompiementere.10. A 9. igénypont szerinti oligonuk1eotid minta, azzal jel 1 e m e z v e , hogy azATX GGN AAY GAY GT, GAY GCN AAY GCN TTZ AA GGN GAY TTZ ATX GAZ GT csoport egyike, aholN jelentése G, T, A vagy C,X jelentése T, A vagy C,Y jelentése G vagy A ésZ jelentése T vagy C.11. Eljárás maradék szerin proteáz vagy maradék cisztein proteáz aktivitás vizsgálatára, azzal jellemezve , hogy a mintát alkalmas heterológ protein oldatával elegyítjük, az elegyet inkubáljuk, ennek során a maradék szerin prcteáz vagy a maradék cisztein proteáz inaktiválja vagy degradálja a heterológ protein legalább egy részét, majd meghatározzuk a heterológ protein degradációjának vagy a degradáci ós termék -Felszaporodásának mértékét.12. Eljárás maradék szerin proteáz aktivitás vizsgála- tára, azzal jel 1 emezve hogy a mintát lizosztatin ^---· -· - ···* -*··· • · · · « • · ·» · • · · · 9JjgggHíirfir • · · ·«- 28 oldatával elegyítjük, az elegyet inkubáljuk, ennek során a maradék szerin proteáz inaktiválja vagy degradálja a lizosztafin legalább egy részét, az inkubált el egyhez Staphylococcus aureus sejt-szuszpenzióját adjuk, és a Staphylococcus-tartal mu elegy Staphylococcus aureus egész-sejtjeinek számát összehasonlítjuk egy olyan ellenőrző elegy sejtjeinek számával, amelyet mintamentesen készítünk.13. Eljárás maradék cisztein proteáz aktivitás vizsgálatára, azzal jel lemezve, hogy a mintát prolizoszta-fin oldatával elegyítjük, az elegyet inkubáljuk, ennek során a maradék cisztein proteáz a prolizosztafinnak legalább egy részét 1izosztatinná alakítja, az inkubált elegyhez Staphylococcus aureus sejt-szuszpenzióját adjuk, és a Staphylococcus-tartalmu elegy Staphylococcus aureus egész-sejtjeinek számát összehasonlítjuk egy olyan ellenőrző elegy sejtjeinek számával, amelyet mintamentesen készítünk.14. Lényegében tisztított, szerin—függő proteáz készítmény, azzal jel lemezve, hogy N-terminális aminosav-szekvenciája a 3. ábrán -feltüntetett.15. A 14. igénypont szerinti proteáz, azzal jellemezve, hogy Bacillus subtilis baktériumokból izolált.16. Lényegében tisztított, Bacillus subtilis baktériumokból izolált, cisztein—függő proteáz készítmény, azzal jellemezve, hogy p-hidroxi-merkűri-benzoáttal inaktiváljuk, és az a prolizosztafint 1 i zoszta-f i nná ala«... .'·«« » » • · · ··· · ·-·-*'··- r»v>«>♦ · · · • « » 9· •· · · ·♦· 999··-29k i t j a.17. Eljárás baktériumkultúra által termelt maradék szerin proteáz és maradék cisztein proteáz hatásainak gátlására vagy inakti válására, azzal jellemezve, hogy a baktériumkulturához olyan vegyűletet adagolunk, amely a maradék szerin proteáz és maradék cisztein proteáz hatását gátolja vagy inaktiválja.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19048388A | 1988-05-05 | 1988-05-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU894054D0 HU894054D0 (en) | 1990-07-28 |
| HUT53154A true HUT53154A (en) | 1990-09-28 |
Family
ID=22701537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU894054A HUT53154A (en) | 1988-05-05 | 1989-03-14 | Process for producing protease-defective gram-positive bacteria and utilizing them as host-organizmus for producing recombinant products |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0370103A4 (hu) |
| JP (1) | JPH03500606A (hu) |
| AU (1) | AU622916B2 (hu) |
| DK (1) | DK1590A (hu) |
| FI (1) | FI900045A (hu) |
| HU (1) | HUT53154A (hu) |
| IL (1) | IL89767A0 (hu) |
| NZ (1) | NZ228424A (hu) |
| PT (1) | PT90463A (hu) |
| WO (1) | WO1989010976A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA892325B (hu) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5143846A (en) * | 1988-03-17 | 1992-09-01 | The General Hospital Corporation | Protease deficient bacterial hosts |
| US5294542A (en) * | 1991-03-19 | 1994-03-15 | Omnigene, Inc. | Residual protease-III |
| IL102259A0 (en) * | 1991-07-01 | 1993-01-14 | Amgen Inc | Isolation and characterization of a protease from streptomyces lividans |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| DK0725653T3 (da) | 1993-10-05 | 2004-10-11 | Celltech Pharmaceuticals Ltd | Vaccinepræparater |
| GB9324529D0 (en) * | 1993-11-30 | 1994-01-19 | Univ Singapore | Biological control agents |
| DE4425645A1 (de) * | 1994-07-20 | 1996-02-22 | Mueller Karl & Co Kg | Deletiertes Lysostaphingen von Staphylococcus simulans |
| JP2001510050A (ja) * | 1997-07-15 | 2001-07-31 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | グラム陽性微生物からのプロテアーゼ |
| US6762039B2 (en) * | 1997-07-15 | 2004-07-13 | Genencor International, Inc. | Bacillus subtillis with an inactivated cysteine protease-1 |
| GB9727470D0 (en) | 1997-12-30 | 1998-02-25 | Genencor Int Bv | Proteases from gram positive organisms |
| US6599731B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-07-29 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6465186B1 (en) | 1997-12-30 | 2002-10-15 | Genecor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6528255B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-03-04 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4931390A (en) * | 1986-04-16 | 1990-06-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Expression of the cloned lysostaphin gene |
| JP3026567B2 (ja) * | 1987-02-27 | 2000-03-27 | ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド | 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現 |
-
1989
- 1989-03-14 AU AU37651/89A patent/AU622916B2/en not_active Ceased
- 1989-03-14 EP EP19890906977 patent/EP0370103A4/en not_active Withdrawn
- 1989-03-14 JP JP1506242A patent/JPH03500606A/ja active Pending
- 1989-03-14 WO PCT/US1989/001056 patent/WO1989010976A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-03-14 HU HU894054A patent/HUT53154A/hu unknown
- 1989-03-21 NZ NZ228424A patent/NZ228424A/en unknown
- 1989-03-28 IL IL89767A patent/IL89767A0/xx unknown
- 1989-03-29 ZA ZA892325A patent/ZA892325B/xx unknown
- 1989-05-04 PT PT90463A patent/PT90463A/pt not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-01-04 FI FI900045A patent/FI900045A/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-01-04 DK DK001590A patent/DK1590A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03500606A (ja) | 1991-02-14 |
| DK1590A (da) | 1990-02-05 |
| AU622916B2 (en) | 1992-04-30 |
| WO1989010976A1 (en) | 1989-11-16 |
| EP0370103A1 (en) | 1990-05-30 |
| FI900045A0 (fi) | 1990-01-04 |
| DK1590D0 (da) | 1990-01-04 |
| ZA892325B (en) | 1990-03-28 |
| FI900045A (fi) | 1990-01-04 |
| HU894054D0 (en) | 1990-07-28 |
| NZ228424A (en) | 1992-06-25 |
| PT90463A (pt) | 1989-11-30 |
| IL89767A0 (en) | 1989-09-28 |
| EP0370103A4 (en) | 1991-11-27 |
| AU3765189A (en) | 1989-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2889095B2 (ja) | サブチリシン突然変異体の製造に有用な桿菌 | |
| Stahl et al. | Replacement of the Bacillus subtilis subtilisin structural gene with an in vitro-derived deletion mutation | |
| Nakano et al. | Isolation and characterization of sfp: a gene that functions in the production of the lipopeptide biosurfactant, surfactin, in Bacillus subtilis | |
| US5763257A (en) | Modified subtilisins having amino acid alterations | |
| EP0369817B1 (en) | Bacillus strains | |
| US4980288A (en) | Subtilisin with increased thermal stability | |
| KR100258460B1 (ko) | 안정화 효소 및 세제 조성물 | |
| US5972682A (en) | Enzymatically active modified subtilisins | |
| US6506589B1 (en) | Useful mutations of bacterial alkaline protease | |
| Yamaguchi et al. | Characterization of a new Bacillus subtilis peptidoglycan hydrolase gene, yvcE (named cwlO), and the enzymatic properties of its encoded protein | |
| US5118623A (en) | Bleach stable enzymes | |
| WO1987005050A1 (en) | Mutagenesis and screening method and product | |
| HUT53154A (en) | Process for producing protease-defective gram-positive bacteria and utilizing them as host-organizmus for producing recombinant products | |
| Rodríguez et al. | Isolation of a gene from Burkholderia cepacia IS-16 encoding a protein that facilitates phosphatase activity | |
| Conlin et al. | Cloning and nucleotide sequence of opdA, the gene encoding oligopeptidase A in Salmonella typhimurium | |
| EP0576606B1 (en) | Residual protease-iii | |
| JP2001510037A (ja) | グラム陽性微生物からのプロテアーゼ | |
| Kawaguchi et al. | Purification and some properties of a Haim-sensitive α-amylase from newly isolated Bacillus sp. No. 195 | |
| EP0179025B1 (en) | Method for the production of neutral protease | |
| Hulett et al. | Two alkaline phosphatase genes positioned in tandem in Bacillus licheniformis MC14 require different RNA polymerase holoenzymes for transcription. | |
| KR0135392B1 (ko) | 신규한 호염기성 단백질 분해효소 및 호염기성 지방질 분해효소 생산균주 | |
| WO1997026361A9 (en) | Bacterial donor cell useful in conjugation | |
| Velishaeva et al. | Effect of the modification of the processing site of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase on the production of active enzyme by Bacillus subtilis cells | |
| Jacobs | Cloning of, and studies on, genes coding for subtilisins Carlsberg and BPN' | |
| JPH07184649A (ja) | 新規なプロテアーゼ、該酵素の製造方法、該酵素をコードする遺伝子、該酵素の変異体酵素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: APPLIED MICROBIOLOGY INC., US |
|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |