KR0135392B1

KR0135392B1 - 신규한 호염기성 단백질 분해효소 및 호염기성 지방질 분해효소 생산균주

Info

Publication number: KR0135392B1
Application number: KR1019940009140A
Authority: KR
Inventors: 유욱준; 이황희; 장원희; 김은경; 강주현
Original assignee: 심상철; 한국과학기술원
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1998-04-23

Abstract

본 발명은 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소를 생산하는 신규한 슈도모나스 에스피.(Pseudomonas sp.) 균주, 이로부터 생산되는 호염기성 단백질 분해 효소 및 상기 균주를 이용하여 호염기성 단백질 분해효소를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

신규한 호염기성 단백질 분해효소 및 호염기성 지방질 분해효소 생산균주

제1a도는 슈도모나스(Pseudomonas)로부터 분리된 균주의 호염기성 단백질 분해 효소의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

제1b도는 슈도모나스(Pseudomonas)로부터 분리된 균주의 호염기성 지방질 분해 효소의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

제2도는 슈도모나스로부터 호염기성 단백질 분해 효소의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이며.

제3도는 본 발명에 의해 생성된 호염기성 단백질 분해효소의 pH에 따른 활성변화를 나타낸 것이며.

제4도는 본 발명에 의해 생성된 호염기성 단백질 분해효소의 pH에 따른 활성변화를 나타낸 것이다.

본 발명은 신규한 호염기성 단백질 분해 효소 및 지방질 분해효소를 생산하는 슈도모나스(Pseudomonas)종에 속하는 균주, 이로부터 생산되는 단백질 분해효소 및 상기 균주를 이용하여 단백질 분해 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, pH 12에서 최소 활성을 갖는 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소를 생산하는 내알칼리성 균주인 슈도모나스 에스피.(Pseudomonas sp.), 이로부터 생산되는 호염기성 단백질 분해효소 및 이를 이용한 호염기성 단백질 분해효소의 제조방법에 관한 것이다.

미생물들로부터 분리되는 단백질 분해효소 및 지방질 분해 효소는 식품산업, 세척제, 의학품, 피혁공업등에 광범위하게 사용되는 매우 중요한 효소이다. 유전공학의 눈부신 발전에 힘입어 1980년대에 들어와 이들 효소에 대한 유전자의 클로닝, 유전자 구조의 분석, 분비기작의 해명, 분비성 벡터의 개발, 부위특이성 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의한 효소 성질의 개량 등의 분야에서 연구가 진행되고 있으며, 최근에는 보다 우수한 성질을 갖고 있는 효소들을 자연게의 미생물로부터 탐색하는 연구가 시도되고 있다.

단백질 분해 효소가 산업적으로 이용되기 위해서는 여러 가지 필요조건들이 있지만 그준에서 보다 중요한 것은 극한적인 환경, 즉 염기, 산, 혹은 고온 등에서 매우 잘 견디며 오히려 이러한 환경을 선호하는 단백질 분해효소들이다. 특히 호염기성 단백질 분해효소는 세척제 드으이 성분으로 첨가되는 등 산업적 응용면에서 더 큰 사용 가능성을 내포하고 있다.

미생물에서 발견되는 단백질 분해효소들은 대체적으로 세포외로 분비되고 있는 것들이 많으며 이들 분비성 단백질 분해효소의 구조를 살펴보면, 대부분의 경우 분비에 관여하는 부위인 시그날 펩티드 부위가 있다(G. Von Heijne, J. Mol. Biol. 184, 99(1985)). 또한, 분비성 단백질에는 시그날 펩티드 이외에 프로-영역(pro-region)이 있는 경우가 많으므로 (F. N. Yanagida et al., J. Bacteriol., 166, 937(1986). 균주나 효소에 따라서 그 분비기작이 매우 다양하다고 보고되었다. 예를 들면 그람양성균인 바실러스 아밀로리퀴훼신(Bacillus amyloliquefacien)이나 바실러스 리체니포미스(B. licheni-formis)로부터 분비되는 서브틸리신에 의하여 자연적으로 프로세싱되면서 분비되고 있다(S. D. Power et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 3097(1986)).

이와 같이 분비성 효소의 분비기작이 하나씩 밝혀지면서 시그날 펩티드를 이용한 분비성 벡터의 개발도 활발히 진행되고 있다. 분비성 베터는 주로 그람 양성균의 시그날 서열을 이용하며 숙주로는 주로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용하고 있다. 그 일례로서, 바실러스 아밀로리퀴훼신의 시그날 서열을 이용하여 대장균(E. coli)의 β-락타마제, 및 인간 인터페론-2를 성공적으로 분비시킨 바 있으며(Palva, I., Gene 19, 85(1982); Palva, I. et al., Gene 22, 225(1983)), 동 균주의 알칼리성 및 중성 단백질 분해효소의 시그날 서열을 이용하여 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A를 발현시킨 바 있으며 (Vasantha, N., et al., J. Bacteriol. 165, 837(1986)), 국내에서도 바실러스 서브틸리스 α-아밀라제를 이용하여 성숙형 인간 췌장 분비 트립신 억제제(hPSTI)를 바실러스 서브틸리스에서 분비시킨 바 있다(이 세영, 한국생화학회 초록 p. 38, 1990).

국내에서의 단백질 분해효소에 대한 연구로서는 그람 양성균인 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 새로운 단백질 분해효소가 클로닝된 바 있으며, 주로 단백질 분해 효소의 작용기작에 대한 연구가 진행되었다.(Jang J. S., et al. Biochem. Biophy. Res. Comm. 184, 277(1992)).

지방질 분해효소를 산업에 이용하기 위해서는 극한적 환경에 내성을 갖는 효소가 요구된다. 최근에 효소세제의 시장규모 확대로 주로 단백질 분해효소만 첨가하던 효소세제에 호염기성 지방질 분해효소를 첨가하려는 시도가 행해지고 있어 그 사용량이 점차 증가될 것으로 예상된다. 이러한 목적으로 다양한 미생물에서 지방질 분해효소가 발견되었으며, 예를들면, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)(Akio S., et al., Agri. Biol. Chem. 52, 1591(1988)), 칸디다 파라 폴리티나(Candida parapolytica)(Kimiyasu l., et al., Agri. Biol. Chem., 55. 2359(1991)). 알칼리겐스(Alcaligenes sp.)(Yoshitaka K., et al., Agri. Biol. Chem. 46, 1743(1982))등과 같은 원핵 미생물에서 pH 90부근에서 최적활성을 나타내는 호염기성 지방질 분해효소가 발견되었다.

이에 본 발명자들은 산업적으로 가치가 있는 극한성 단백질 분해효소 및 극한성 지방질 분해효소를 자연계의 미생물들로부터 탐색 하고자 연구노력한 결과 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소를 대량 분비하는 슈도모나스종에 속하는 균주를 발견하게 되었으며 이를 배양한 후 호염기성 단백질 분해효소를 분리·정제할 수 있게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소를 생산하는 슈도모나스종에 속하는 박테리아 균주 Pseudomonas sp., 이로부터 생산되는 신규한 호염기성 단백질 분해효소 및 상기 균주를 이용하여 호염기성 단백질 분해효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하. 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해 효소를 생산하는 슈도모나스종 균주는 다음과 같은 방법으로 분리하였다.

우선, 극한적 호염기성 단백질 분해효소를 분비하는 균주가 존재할 만한 환경으로부터 균주들을 채집하여 채집된 균주를 호염기성 및 내염기성 균주 증폭배지에서 배양하여 호염기성 균주들을 증폭한 다음 호염기성 단백질 분해효소 탐색 한천 배지 플레이트와 호염기성 지방질 분해효소 탐색 한천 배지 플레이트에 도말하여 호염기성 단백질분해효소 및 지방질 분해효소의 활성에 의해 생기는 투명환의 존재 여부를 관찰하여 투명환을 나타내는 탐색된 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소 양성 균주를 분리하여 이를 하기 실시예 1에 기재된 방버에 따라 동정하여 슈도모나스종 균주임을 밝혔다.

상기 슈도모나스 종 균주는 1994년 3월 20일자로 한국 종균협회(KFCC에 기탁번호 KFCC-10818로 기탁되었으며 pSEUDOMONAS SP., 라 명명되었다. 상기 기탁된 균주 외에도 다른 특성에 다소간의 변화가 가해지는 상기 균주의 돌연변이주도 본 발명의 호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소와 실질적으로 동일한 활성과 규조를 갖는 단백질을 생산하는 한, 본 발명의 범위에 포함됨은 물론이다.

또한 상기 균주에 의해 제조되는 본 발명의 호염기성 단백질 분해효소는 분자량 약 31KD의 단백질로 키모트립신의 인공 합성 기질인 Suc-AAPF-pNA(N-숙시닐-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드)에 대해 상대적으로 강한 활성을 나타내는 반면에 트립신의 기질인 Nα-벤조일-DL-Arg-p-니토로아닐리드와 엘라스타제의 기질인 N-숙시닐-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-니트로아닐리드에 대해서는 거의 활성을 보이지 않으므로 일차적으로 방향족 측쇄에 특이하게 작용하며 pH 12.0에서 최고 활성을 보인다. 한편, 본 발명의 단백질 분해효소는 세린 계열 효소의 활성 저해제인 1mM PMSF에 의해서는 활성이 완전히 상실되나 5mM EDTA에 의해서는 아무런 영향을 받지 않으므로 세린 계열 단백질 분해효소임을 알 수 있다.

본 발명의 단백질 분해쇼고는 상기 슈도모나스 종 균주를 배양함으로써 생산할 수 있는데, 상기 균주를 TB배지를 사용하여 37℃에서 진탕배양하며, 배양후 이온 교환 크로마토그래피등에 의해 상기 단백질 분해효소를 분리·정제할 수 있다.

이러한 단백질 분해효소 유전자의 클로닝, 염기서열결정 및 상기 유전자를 포함하는 대장균을 이용한 단백질의 제조방법은 본 출원인의 동일자출원 제 호에 기술되어 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거 상세히 설명하지만, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소 분비 균주의 탐색 및 분리

호염기성 단백질 분해효소 및 지방질 분해효소를 생산하는 균주가 선호할 만한 극한성 환경을 갖고 있다고 여겨지는 서울 중랑천에서 균주들을 채집하여 호염기성 균주 증폭배지(박토 트립톤 10g, 효모 추출물g, NaCl 10g 및 탄산나트륨 20g을 탈이온수에 녹여 최종 부피가 1ℓ가 되게 함) 플레이트 및 호염기성 지방질 분해효소 탐색 한천배지(박토 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 탄산나트륨 20g, 트리카프릴린 10g 및 한천 15g을 탈이온수에 녹여 최종부피 1ℓ가 되게 함) 플레이트에 도말하여 호염기성 단백질 분해효소 및 호염기성 지방질 분해효소의 활성에 의해 생기는 투명환의 존재여부를 관찰하여 호염기성 단백질 분해효소 및 호염기성 지방질 분해효소 양성 균주를 탐색하여 이를 분리하였다. 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에 나타내었다. 제1도에서 a는 균주를 호염기성 단백질 분해 효소 탐색 한천 배지 플레이트에 접종하여 투명대로 단백질 분해효소의 활성을 확인한 결과이고, b는 균주를 호염기성 지방질 분해효소 탐색 한천배지 플레이트에 접종하여 투명대로 지방질 분해효소의 활성을 확인한 결과이다. 이 균주를 문헌(Holt J. G., et al., Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed.(1994))의 방법에 따라 동정한 결과 슈도모나스 중에 속하는 균주임이 밝혀졌으며 이를 Pseudomonas sp.라 명명하였다. 상기 균주의 각 특성을 하기 표 1에 나타내었다.

[실시예 2]

슈도모나스(Pseudomonas sp.)에서의 단백질 분해효소의 생산

상기한 슈도모나스로부터 생성된 단백질 분해효소를 분리정제 하기 위해 상기 슈도모나스를 TB배지(1ℓ당 암피실린더 0.1g, 트립톤 12g, 효모추출물 24g, KHPO2.3g, KHPO, 12.5g, 글리세롤 4ml를 함유함)에서 37℃로 500rpm에서 진탕 배양하여 600nm에서의 광학밀도(O.D.)가 19가 되면 배양액 5ml를 취해 원심분리하여 상충액을 얻었다. 상기 상충액에 3배 부피의 무수 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 단백질을 첨진시킨 후 침전물을 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0) 30ml에 녹이고 동일완충액으로 밤새 투석시키며, 이때 잘 녹지 않는 단백질은 초음파 처리하였다. 투석한 단백질 용액을 CM-세피로즈 컬럼에서 0.05M-0.5M NaCl 구배로 용출시켜 단백질 분해효소 활성에 해당하는 분획을 모았다. 상기 분획을 불연속상 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동하여 순도를 확인하였다. 그 결과를 제2도에 나타내었다. 제2도에서 제1열은 표준 분자량 단백질로서 위로부터 66, 45, 36, 29, 24, 20 및 14Kd을 각각 나타내고, 제2열 내지 제9열은 CM-세파로즈 크로마토그래피에서 얻은 각 분획의 단백질 용액이다.

[실시예 3]

호여기성 단백질 분해효소의 활성확인

상기 실시예 2에서 얻은 단백질 분해 효소의 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

기질인 Suc-AAPF-pNA(Sigma)를 0.3mM 포함하는 0.1 글리신/NaOH완충액(pH10.5)에 적당한 양의 효소용액을 가하여 25℃에서 반응시키면서 410nm에서의 흡광도 증가를 계속적으로 측정하였다. 410nm에서의 흡광도 증가하는 단백질 분해효소 활성에 의해 Suc-AAPF-pNA가 가수분해되어 만들어지는 산물인 p-니트로아닐린에 기인한다. 호염기성 단백질 분해효소 활성의 1단위는 1분 동안 p-니토로아닐린( ε0=8480Mcm)을 1μmole 생성하는 양으로 정의하였다.

[참조예 1]

pH에 따른 호염기성 단백질 분해효소(AprJ)의 활성의 변화

실시예 2에서 얻은 단백질 분해효소의 효소 활성을 25℃에서 기질로서 0.3mM Suc-AAPF-pNA를 함유하는 다양한 pH의 0.1M 완충액에서 측정하였다. 그 결과는 제3도에 나타내었다(시트르산 나트륨/시트르산:pH 3 내지 4, 인산나트륨:pH 6 내지 8, 트리스-HCl:pH 7.5 내지 9.5, 글리신/NaOH:pH 9 내지 11, NaHPO/NaOH:pH 11내지 12 및 KCl/NaOH:pH 12 내지 13).

제3도에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 호염기성 단백질 분해효소는 pH 12에서 최고의 활성을 나타낸다.

[참조예 2]

단백질 분해효소의 활성저해제에 대한 특이성

실시예 2에서 얻은 단백질 분해효소를 pH8.5의 0.1M 트리스-HCl 완충액에서 25℃에서 30분 동안 배양하였을 때 1mM PMSF를 첨가한 경우에는 활성이 완전히 상실되었으나 TLC 100㎍ 및 5mM EDTA를 첨가한 경우에는 아무런 영향을 받지 않았다.

[참조예 3]

온도에 따른 호염기성 단백질 분해효소의 활성의 변화

실시예 2에서 얻은 단백질 분해효소의 온도에 따른 효소-활성의 변화를 측정하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 0.3mM Suc-AAPF-pNA를 포함하는 0.1M 글리신-NaOH완충액(pH 10.5) 및 0.3mM Suc-AAPF-pNA와 2mM CaCl를 포함하는 0.1M 글리신-NaOH 완충액(pH 10.5)을 다양한 온도(15℃ ∼ 30℃)의 수욕에 5분간 방치하였다.

상기 완충액에 호염기성 단백질 분해효소 (0.05㎍/ml)를 첨가한 후 벡크만 분광광도계(Beckman DU-65 spectrophotometer)와 온도 조절기를 이용하여 각각의 온도에서 410nm에서의 흡광도를 1분간 계속적으로 측정하였다. 그 결과를 제4도에 나타내었다.

[참조예 4]

금속이온이 단백질 분해 효소 활성에 미치는 영향

호염기성 단백질 분해효소를 최종 농도 1mM의 다양한 금속이온을 함유하는 0.1M 글리신-NaOH완충액(pH 10.5)에 첨가하여 37℃에서 20분간 방치하였다. 상기 혼합물에 0.3mM Suc-AAPF-pNA를 첨가하여 남아있는 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

Claims

호염기성 단백질 분해 효소 및 지방질 분해효소를 생산하는 슈도모나스 에스피.(Pseudomonas sp.; 기탁번호 KFCC-10818).
제1항의 균주를 배양함을 포함하는 호염기성 단백질 분해효소의 제조방법.