CN103764822B - 具有蛋白酶活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及生产这些多肽及在例如动物饲料和洗涤剂中使用这些多肽的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽

对序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包括这些核酸序列的核酸构建体、载体、和宿主细胞（包括植物和动物细胞），以及用于生产及使用这些蛋白酶的方法，特别是这些蛋白酶在动物饲料和洗涤剂中的用途。

发明背景

在蛋白酶于动物饲料中的用途（体内）和/或此类蛋白酶用于处理植物蛋白的用途（体外）中，应指出的是蛋白质对于动物和人类而言是必需营养因子。大多数牲畜和人类从植物蛋白质来源获得必要的蛋白质。重要的植物蛋白质来源是例如油籽作物、豆类以及谷类。

当例如大豆被包括在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉固体不能被有效地消化（在小猪、生长中的猪以及家禽如肉鸡、蛋鸡和公鸡中表观回肠蛋白质消化率仅为大约80%）。

动物胃肠道由一系列的区段组成，每个区段代表不同的pH环境。在单胃动物例如猪和家禽以及许多鱼类中，胃展现出低到pH1-2的强酸性pH，而肠展现出在pH6-7区中的更加中性的pH。除了胃和肠外，家禽还在胃之前具有嗉囊，在嗉囊中的pH主要由消化的饲料决定并且因此典型地处于pH4-6的范围内。由蛋白酶进行的蛋白质消化可以沿着整个消化道进行，其前提是该蛋白酶是有活性的，并且可在消化道中的条件下存在。因此，对于存在于胃环境中是高度酸稳定的并且同时在目标动物的宽生理pH下具有有效活性的蛋白酶是尤其希望的。

并且，动物饲料常常被配制为颗粒形式，其中蒸汽应用于造粒过程中。因此，还希望的是用于动物饲料中的蛋白酶能够在暴露于蒸汽处理时依然有活性。

具有蛋白酶活性的多肽

具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时也称为肽酶、蛋白酶、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶（内肽酶）。内肽酶对N-和C-末端封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论蛋白酶的特异性有关。

在此术语“蛋白酶”被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义还适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括任何属于EC3.4组的酶（包括其13个亚类中的每一个）。EC编号参照来自NC-IUBMB,学术出版社（AcademicPress）,圣地亚哥,加利福尼亚州的《酶命名法》1992，包括分别发表于《欧洲生物化学杂志》（Eur.J.Bio-chem.）1994,223,1-5；《欧洲生物化学杂志》（Eur.J.Biochem.）1995,232,1-6；《欧洲生物化学杂志》（Eur.J.Biochem.）1996,237,1-5；《欧洲生物化学杂志》（Eur.J.Biochem.）1997,250,1-6；以及《欧洲生物化学杂志》（Eur.J.Biochem.）1999,264,610-650中的增补版1-5。命名法定期被增补并且更新，参见例如万维网（WWW）http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：

（a）属于EC3.4.21.酶组的蛋白酶；和/或

（b）肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶，或更确切地为S1A；

如在《生物化学杂志》（Biochem.J.）290:205-218（1993）和在MEROPS蛋白酶数据库,发表版（release）,9.4（2011年1月31日）（www.merops.ac.uk）中所描述的。该数据库描述于罗林斯（Rawlings）,N.D.,巴雷特（Barrett）,A.J.&贝特曼（Bateman）,A.（2010）MEROPS：肽酶数据库（MEROPS:the peptidase database），《核酸研究》（Nucleic AcidsRes）38,D227-D233中。.

更确切地，本发明的蛋白酶是偏爱P1位置上为疏水性芳香族aa残基的那些。

为了确定给定蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶以及S1A蛋白酶家族，参考了以上手册和其中指示的原则。可对所有蛋白酶类型进行这种确定，而不论其是天然存在的或野生型的蛋白酶，或经基因工程改造的或合成的蛋白酶。

S1家族的肽酶包含以下顺序的催化三联体His、Asp和Ser。催化三联体的任何氨基酸的突变将导致酶活性的损失。来自立枯韩国生工菌（Kribbella solani）（SEQ ID NO:2）和明矾韩国生工菌（Kribbella aluminosa）（SEQ ID NO:4）的S1蛋白酶1的催化三联体的氨基酸可能是位置His-138、Asp-168和Ser-250。

可使用任何测定法测量蛋白酶活性，在所述方法中使用底物，该底物包括与所讨论蛋白酶的特异性相关的肽键。使测定-pH和测定-温度同样地适配于所讨论蛋白酶。测定-pH值的实例为pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定-温度的实例是5、10、15、20、25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90、或95℃。蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如天青精-交联的酪蛋白（AZCL-酪蛋白），或suc-AAPF-pNA。适合的蛋白酶测定的实例描述于实验部分中。

相关技术说明

分离自韩国生工菌属（Kribbella）和链霉菌属的蛋白酶在本领域中是已知的。来自黄色韩国生工菌（Kribbella flavida）的蛋白酶披露于卢卡斯（Lucas）,S.等人，“黄色韩国生工菌DSM17836的全基因组（The complete genome of Kribbella flavidaDSM17836）”中；提交至（SEP-2009）EMBL/GenBank/DDBJ数据库（SWISSPROT：C1WJ16；在此的SEQ ID NO:6）。该序列具有与成熟蛋白酶的SEQ ID NO:2的序列80.23%的一致性以及与SEQID NO:4的序列80.81%的一致性。参照的DNA序列（在此为SEQ ID NO:5）具有与在此的SEQID NO:1的序列81.6%的一致性以及与SEQ ID NO:3的序列85.51%的一致性。

一种蛋白酶—链霉菌蛋白酶B披露于亨德森（Henderson）,G.克瑞斯曼（Krygsman）,P.刘（Liu）,C.J.戴维（Davey）,C.C.马莱克（Malek）,L.T.，“来自灰色链霉菌的蛋白酶A和B的基因的表征和结构（Characterization and structure of genes forproteases A and B from Streptomyces griseus）”，《细菌学杂志》（J.Bacteriol）.169:3778-3784（1987）中。对于此蛋白酶的序列一致性低于以上指示的那些：

本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是肽酶家族S1A的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现出令人惊讶的pH特性，尤其是pH稳定性和pH-活性特性，这使得它们成为令人感兴趣的用于在动物饲料中使用的候选者。因此本发明的蛋白酶在从pH4-11的宽范围内对Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA是有活性的并且在pH6-11的范围内展现特别高的活性，在从pH3-7的宽生理pH范围内对饲料相关大豆粉-玉米粉底物是有活性的，并且在经受低到2的pH持续2小时之后保持大于80%的活性。

在动物饲料中使用蛋白酶以改进饲料中的蛋白质的消化是已知的。WO95/28850披露了改进植物蛋白溶解性的植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶的组合。WO01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途。WO01/58276披露了与衍生自拟诺卡氏属（Nocardiopsis sp.）NRRL18262（10R蛋白酶）的蛋白酶和衍生自白拟诺卡氏菌（Nocardiopsis alba）DSM14010的蛋白酶相关的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途。WO04/072221、WO04/111220、WO04/111223、WO05/035747、和WO05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶以及它们在动物饲料中的用途。并且，WO04/072279披露了其他蛋白酶的用途。

WO04/034776披露了来自地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）的枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶PWD-1在家禽饲料中的用途。WO04/077960披露了通过施用细菌或真菌蛋白酶增加反刍动物对草料或谷物的消化率的方法。

包括蛋白酶并且上市用于动物饲料中的商品包括ProAct（DSMNP/诺维信公司（Novozymes））、（丹尼斯克公司（Danisco））、（丹尼斯克公司）、（丹尼斯克公司）、Allzyme^TM(阿尔泰克公司（Alltech））、（国际生物资源公司（BioResources,Int.））、Poultrygrow^TM（杰夫公司（Jefo））以及DP100（诺伟司公司（Novus））。

发明概述

本发明涉及选自下组的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该组由以下各项组成：

（a）具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的一种多肽；

（b）由一种具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少86%的序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；

（c）一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个（若干个）氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及

（d）（a）、（b）、或（c）的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包括这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、以及重组宿主细胞，并且涉及生产这些多肽的方法。

本发明还涉及用于制备供动物饲料使用的组合物、用于改进动物饲料的营养价值的方法，以及处理有待用于动物饲料组合物中的蛋白质的方法。

此外，本发明还涉及蛋白酶在洗涤剂组合物和此类洗涤剂组合物中的用途。

序列表综述

SEQ ID NO:1是如从立枯韩国生工菌（Kribbella solani）分离的DNA序列。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导出的氨基酸序列

SEQ ID NO:3是如从明矾韩国生工菌（Kribbella aluminosa）分离的DNA序列。

SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导出的氨基酸序列

SEQ ID NO:5是来自黄色韩国生工菌（Kribbella flavida）的DNA序列（EMBL:CP001736）

SEQ ID NO:6是来自黄色韩国生工菌（Kribbella flavida）的氨基酸序列（卢卡斯（Lucas）,S.等人“黄色韩国生工菌DSM17836的全基因组（The complete genome ofKribbella flavida DSM17836.）”UNIPROT:D2Q1F6）

SEQ ID NO:7是10R蛋白酶的DNA序列（WO05/035747，SEQID NO:1）

SEQ ID NO:8是10R蛋白酶的氨基酸序列（WO05/035747，SEQID NO:2）

SEQ ID NO:9是立枯韩国生工菌（Kribbella solani）S1肽酶特异性正向引物。

SEQ ID NO:10是立枯韩国生工菌（Kribbella solani）S1肽酶特异性反向引物。

SEQ ID NO:11是明矾韩国生工菌（Kribbella aluminosa）S1肽酶特异性正向引物。

SEQ ID NO:12是明矾韩国生工菌（Kribbella aluminosa）S1肽酶特异性反向引物。

SEQ ID NO:13上游侧翼片段特异性正向引物。

SEQ ID NO:14上游侧翼片段特异性反向引物。

SEQ ID NO:15下游侧翼片段特异性正向引物。

SEQ ID NO:16下游侧翼片段特异性反向引物。

SEQ ID:17是迟缓芽孢杆菌分泌信号。

序列的一致性矩阵：

定义

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性（EC3.4）。本发明的蛋白酶是内肽酶（EC3.4.21）。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要活性类型是：类胰蛋白酶，其中在P1处的Arg或Lys之后存在酰胺底物的切割；类胰凝乳蛋白酶，其中切割发生在P1处的疏水氨基酸之一之后；以及类弹性蛋白酶，其中切割在P1处的Ala之后。出于本发明的目的，根据下文的“材料与方法”中所述的程序来确定蛋白酶活性。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、以及至少100%的蛋白酶活性。

分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括（1）任何非天然存在的物质；（2）至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；（3）相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者（4）通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质（例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。

一种“分离的多肽”是至少1%纯的，例如至少5%纯的、至少10%纯的、至少20%纯的、至少40%纯的、至少60%纯的、至少80%纯的、以及至少90%纯的，如通过SDS-PAGE确定的。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指这样一种制品，该制品包括与其天然关联或重组关联的按重量计至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、以及至多0.5%的其他多肽物质。优选地，该多肽是按存在于制品中的全部多肽物质的重量计至少92%纯的，例如至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%纯的、至少99.5%纯的、以及100%纯的。优选地，本发明的多肽处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰（例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化、等）之后处于其最终形式的一种多肽。在在一方面，成熟多肽是在SEQ ID NO:2的编号中的氨基酸1至188，在SEQID NO:2的编号中的氨基酸-105至-75是信号肽。在另外一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:4的编号中的氨基酸1至189，在SEQ ID NO:4的编号中的氨基酸-105至-75是信号肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸316至879。另外另外，在SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸1至90编码信号肽。在另外一方面中，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸316至882。另外，在SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸1至90编码信号肽。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch）算法（尼德曼&翁施，1970，《分子生物学杂志》（J.Mol.Biol.）48:443-453）来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性程度，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件（The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite），赖斯（Rice）等人，2000，《遗传学趋势》（Trends Genet.）16:276-277）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的可选参数是10的空位开放罚分、0.5的空位扩展罚分、以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle的输出（使用非简化选项（nobrief option）获得）用作一致性百分比并且计算如下：

（一致的残基×100）/（比对的长度-比对中的空位总数）

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法（上文的尼德曼&翁施，1970）来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，上文的赖斯等人，2000）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的可选参数是10的空位开放罚分、0.5的空位扩展罚分以及EDNAFULL（NCBINUC4.4的EMBOSS版本）取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle的输出（使用非简化选项（nobrief option）获得）用作一致性百分比并且计算如下：

（一致的脱氧核糖核苷酸×100）/（比对的长度-比对中的空位总数）

片段：术语“片段”意指成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个（若干个）氨基酸的多肽，其中该片段具有蛋白酶活性。在一方面，一个片段含有至少168个氨基酸残基（例如，SEQ ID NO:2的氨基酸11至178），至少178个氨基酸残基（例如，SEQ ID NO:2的氨基酸6至183）；或相应于SEQ ID NO:4，一个片段包含至少169个氨基酸残基（例如，SEQ IDNO:4的氨基酸11至179）或至少180个氨基酸残基（例如，SEQ ID NO:4的氨基酸5至184），

子序列：术语“子序列”意指成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失一个或多个（若干个）核苷酸的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。在一方面，子序列包含至少504个核苷酸（例如，SEQ ID NO:1的核苷酸346至849），或例如至少534个核苷酸（例如SEQ ID NO:1的核苷酸331至864）；或对应于SEQ ID NO:3，一个片段包含至少507个核苷酸（例如SEQ ID NO:3的核苷酸346至852）或例如至少540个核苷酸（例如，SEQ ID NO:3的核苷酸328至867）。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而天然发生，并且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的（在编码的多肽中没有变化）或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。一个多肽的等位基因变体是由一个基因的等位基因变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指相对于自然界中发现的那种多核苷酸通过人工手动修饰的多核苷酸。在一方面，分离的多核苷酸是至少1%纯的，例如至少5%纯的、更至少10%纯的、至少20%纯的、至少40%纯的、至少60%纯的、至少80%纯的、至少90%纯的、以及至少95%纯的，如通过琼脂糖电泳确定的。多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成、合成来源、或其任意组合。

基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外来的或不需要的核苷酸的多核苷酸制品，并且其存在的形式适于在基因工程改造的多肽生产系统内进行使用。因此，基本上纯的多肽包含与其天然关联或重组关联的按重量计至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、以及至多0.5%的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90%纯的，例如至少92%纯的、至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%纯的、以及至少99.5%纯的。优选的是本发明的多核苷酸处于基本上纯的形式。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般是通过通常以起始密码子ATG或可替代的起始密码子（例如GTG和TTG）开始并以终止密码子（例如TAA、TAG和TGA）结束的一个开放读码框来确定。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的初级RNA转录物是通过一系列步骤加工的mRNA的前体，这些步骤包括在作为成熟剪接的mRNA出现之前进行剪接。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵照标准Southern印迹法程序，在42C℃下于5×SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50%甲酰胺中进行12至24小时的预杂交和杂交。最终，使用2×SSC、0.2%SDS在65℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵照标准Southern印迹法程序，在42C℃下于5×SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50%甲酰胺中进行12至24小时的预杂交和杂交。最终，使用2×SSC、0.2%SDS在70℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以一种方式被修饰成包含在自然界中不会另外存在的核酸区段的、或合成的单链或双链核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸而言可以是天然（native）的或外源的或者对彼此是天然或外源的。此类控制序列包括但不局限于前导子、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。这些控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有接头。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

表达:术语“表达”包括生产多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指包括编码一种多肽的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的其他核苷酸的线性或环形DNA分子。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中存在的突变而与亲本细胞不相同的该亲本细胞的任何子代。

变体:术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、包括一种改变（即在一个或多个（例如，若干个）位置处一个或多个（若干个）氨基酸残基的取代、插入和/或缺失）的一种多肽。取代意指用一种不同的氨基酸替换占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻近占据某一位置的氨基酸处添加1-3个氨基酸。

发明详述

具有蛋白酶活性的多肽

本发明涉及选自下组的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该组由以下各项组成：

（a）具有与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的一种多肽；

（b）由一种在高严格条件下或非常高严格条件下与以下项杂交的多核苷酸编码的一种多肽

（i）SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，和/或

（ii）SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或

（iii）（i）或（ii）的全长互补链；

（c）由一种与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少86%的序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；和/或

（d）一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个（若干个）氨基酸的取代、缺失、和/或插入。

本发明涉及具有与SEQ ID NO:2的成熟多肽至少85%、例如至少87%、至少89%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或者100%的序列一致性的分离多肽，这些分离多肽具有蛋白酶活性。在一方面，这些多肽以不多于十个氨基酸，例如以九个氨基酸、以八个氨基酸、以七个氨基酸、以六个氨基酸、以五个氨基酸、以四个氨基酸、以三个氨基酸、以二个氨基酸、以及以一个氨基酸而不同于SEQ ID NO:2的成熟多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少87%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少89%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少90%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少93%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少95%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少96%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少97%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少98%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少99%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:2的多肽至少100%的序列一致性的多肽。

本发明涉及具有与SEQ ID NO:4的成熟多肽至少85%、例如至少87%、至少89%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或者100%的序列一致性的分离多肽，这些分离多肽具有蛋白酶活性。在一方面，这些多肽以不多于二十五个氨基酸，例如以二十个氨基酸、以十五个氨基酸、以十个氨基酸、以九个氨基酸、以八个氨基酸、以七个氨基酸、以六个氨基酸、以五个氨基酸、以四个氨基酸、以三个氨基酸、以二个氨基酸、以及以一个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4的成熟多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少87%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少89%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少90%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少93%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少95%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少96%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少97%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少98%的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少99%的序列一致性的多肽。4.

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:4的多肽至少100%的序列一致性的多肽。

本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或者是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者由其组成。在另一个优选方面，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至188或SEQ ID NO:4的氨基酸1至189，或者由其组成。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由在高严格条件或非常高严格条件下与以下项杂交的多核苷酸编码：（i）SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，（ii）包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的[基因组DNA序列]，或（iii）（i）或（ii）的全长互补链（J.萨拉布鲁克（Sambrook）,E.F.弗里奇（Fritsch）,和T.马尼亚蒂斯（Maniatis）,1989,《分子克隆实验室手册》（Molecular Cloning,ALaboratory Manual）,第2版,冷泉港，纽约）。

SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸或其子序列，以及SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的氨基酸序列或其片段可以根据本领域中熟知的方法用于设计核酸探针，以鉴定和克隆编码具有蛋白酶活性的、来自不同属或种的菌株的多肽的DNA。具体地说，此类探针可用于遵照标准Southern印迹法程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可以显著短于整个序列，但是应至少为14个、例如至少25个、至少35个或者至少70个核苷酸长。优选地，该核酸探针是至少100个核苷酸长、例如至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或者至少900个核苷酸长。DNA探针与RNA探针两者都可以使用。这些探针典型地被标记用于检测相应的基因（例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或者抗生物素蛋白）。本发明涵盖了此类探针。

可从制备自此类其他菌株的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交的、并且编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其他分离技术来分离。可以将来自这些文库的DNA或者分离的DNA转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的运载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3、或其子序列同源的克隆或DNA,该运载体材料优选地在Southern印迹法中使用。

出于本发明的目的，杂交指示的是在非常低至非常高严格条件下，多核苷酸与相应于以下项的标记核酸探针杂交：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的[基因组DNA序列]；其全长互补链；或其子序列。在这些条件下核酸探针所杂交的分子可以使用例如X射线胶片来检测。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是其片段。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽或其片段的一种多核苷酸。在另一个优选的方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQID NO:3。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针来说，高至非常高严格条件定义为遵照标准Southern印迹法程序，在42℃,在5×SSPE，0.3%SDS、200微克/ml经剪切且经变性的鲑鱼精子DNA、和25%甲酰胺（用于非常低和低严格性）或35%甲酰胺（用于中等和中等-高严格性）或50%甲酰胺（用于高和非常高严格性）中进行最佳12至24小时的预杂交和杂交。最终，使用2×SSC、0.2%SDS在65℃（高严格）以及在70℃（非常高严格）下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针来说，严格条件定义为遵照标准Southern印迹法程序，在比使用根据博尔顿（Bolton）和麦卡西（McCarthy）（1962，《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences USA）48:1390）的计算而计算的Tm低大约5℃至大约10℃的温度下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HClpH7.6、6mM EDTA、0.5%NP-40、1×登哈特氏溶液（Denhardt's solution）、1mM焦磷酸钠、1mM酸式磷酸钠（sodium monobasic phosphate）、0.1mM ATP、和每ml0.2mg酵母RNA中进行最佳12至24小时的预杂交和杂交。最终，在比计算的T_m低5℃至10℃的温度下，将运载体材料在6×SCC加0.1%SDS中洗涤一次，持续15分钟，并且使用6×SSC洗涤两次且每次持续15分钟。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由具有与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列至少86%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少86%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少90%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少95%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少96%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少97%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少98%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少99%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列至少100%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由具有与SEQ IDNO:3的成熟多肽编码序列至少86%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少86%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少90%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少95%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少96%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少97%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少98%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少99%的序列一致性的多核苷酸编码。

本发明的一个实施例是具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽由具有与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少100%的序列一致性的多核苷酸编码。

在具体实施方案中，本发明的和根据本发明使用的亲本蛋白酶和/或蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：

（a）属于EC3.4.21酶组的蛋白酶；以及

（b）肽酶家族S1A的丝氨酸蛋白酶；如在《生物化学杂志》（Biochem.J.）290:205-218（1993）和在MEROPS蛋白酶数据库release9.5（www.merops.ac.uk）中所描述的。该数据库描述于罗林斯（Rawlings）,N.D.,巴雷特（Barrett）,A.J.&贝特曼（Bateman）,A.（2010）MEROPS:MEROPS：肽酶数据库（the peptidase database），《核酸研究》（Nucleic AcidsRes）38,D227-D233中。

为了确定给定蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶以及S1A蛋白酶家族，参考了以上手册和其中指示的原则。可对所有蛋白酶类型进行这种确定，而不论其是天然存在的或野生型的蛋白酶；或经基因工程改造的或合成的蛋白酶。

本发明还涉及包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个（或若干个）氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体，或其同源序列。优选地，氨基酸改变的性质较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而协助纯化的小段延伸，例如多组氨酸区段、抗原表位、或结合结构域。

保守取代的实例处于以下组内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸以及组氨酸）、酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸）、以及小氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸）。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特（Neurath）和R.L.希尔（Hill）,1979在《蛋白质》（TheProteins）,学术出版社（Academic Press）,纽约中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸变化具有改变这些多肽的物理化学特性的这样一种性质。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最适值、等。可根据本领域已知程序来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（坎宁安（Cunningham）和威尔斯（Wells），1989，《科学》（Science）244:1081-1085）。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变分子的蛋白酶活性以鉴定对该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿（Hilton）等人，1996，《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.）271:4699-4708。酶的活性位点或其他生物学相互作用还可以通过结构的物理分析来确定，如通过例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或者光亲和标记的此类技术结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见，例如德沃斯（de Vos）等人，1992，《科学》255:306-312；史密斯（Smith）等人，1992，《分子生物学杂志》224:899-904；乌拉达维（Wlodaver）等人，1992，《FEBS快报》（FEBS Lett.）309:59-64。也可从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析来推断必需氨基酸的身份。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多重氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，例如由瑞德哈尔-奥尔森（Reidhaar-Olson）和萨奥尔（Sauer），1988，《科学》241:53-57；鲍依（Bowie）和萨奥尔，1989，《美国国家科学院院刊》86:2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示（例如，洛曼（Lowman）等人，1991，《生物化学》30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204）以及定区诱变（德比希尔（Derbyshire）等人，1986，《基因》（Gene）46:145；内尔（Ner）等人，1988,《DNA》7:127））。

诱变/改组方法可以与高通量的自动化筛选方法进行组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变的多肽的活性（内斯（Ness）等人，1999，《自然生物技术》（NatureBiotechnology）17:893-896）。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以从这些宿主细胞中回收并使用本领域中的标准方法来快速测序。这些方法允许快速确定单独的氨基酸残基在多肽中的重要性。

SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是不多于20个，例如是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。

该多肽可以是其中一个多肽的一部分融合在另一个多肽的一部分的N-末端或C-末端的杂交多肽。

该多肽可以是其中另一个多肽融合在本发明的多肽的N-末端或者C-末端的一种融合多肽或者可切割的融合多肽。通过将编码另一个多肽的一种多核苷酸融合到本发明的一种多核苷酸上产生了一种融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码这些多肽的编码序列，这样使得它们同框并且该融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用其中在翻译之后产生融合物的内含肽技术（库珀（Cooper）等人，1993，《欧洲分子生物学杂志》12:2575-2583；道森（Dawson）等人，1994，《科学》266:776-779）来构建融合蛋白。

一个融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在分泌该融合蛋白时，该位点被切割从而释放这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以下文献中披露的位点：马丁（Martin）等人，2003，《工程微生物和生物技术杂志》（J.Ind.Microbiol.Biotechnol.）3:568-576；斯瓦蒂娜（Svetina）等人，2000，《生物技术杂志》（J.Biotechnol.）76:245-251；拉斯马森-威尔逊（Rasmussen-Wilson）等人，1997，《应用与环境微生物学》（Appl.Environ.Microbiol.），63:3488-3493；沃德（Ward）等人，1995，《生物技术》（Biotechnology）13:498-503；以及孔特雷拉斯（Contreras）等人，1991，《生物技术》（Biotechnology）9:378-381；伊顿（Eaton）等人，1986，《生物化学》（Biochemistry）25:505-512；柯林斯-瑞思（Collins-Racie）等人，1995，《生物技术》13:982-987；卡特（Carter）等人，1989，《蛋白质：结构、功能以及遗传学》（Proteins:Structure,Function,andGenetics）6:240-248；以及史蒂文斯（Stevens），2003，《世界药物发现》（Drug DiscoveryWorld）4:35-48。

本发明的蛋白酶展现出惊人的pH特性，尤其是pH稳定性和pH-活性特性，尤其是在低pH值时，这使得它们成为令人感兴趣的用于在动物饲料和洗涤剂中使用的候选者。

实施方案

在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现出有益的热特性（例如热稳定性、蒸汽稳定性等）和/或pH特性（例如酸稳定性、pH最优值等）。

本发明的一个实施例是在pH4与pH9之间（例如，在pH5与pH8之间，例如在pH5、在pH6、在pH7或在pH8）在25℃具有与蛋白酶10R相比的改进的蛋白酶活性的分离多肽。

本发明的一个另外的实施例是在pH3.0与pH6.0之间（例如，在pH3.0、在pH4.0、在pH5.0或在pH6.0）在40℃对大豆-玉米粉具有相比于蛋白酶10R的改进的蛋白酶活性。

酸性/碱性特性

在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶在pH方面展现出有益的特性，例如酸稳定性、pH最优值等。在低pH时蛋白酶的稳定性是有益的，因为该蛋白酶在穿过胃之后在肠中可以具有活性。在本发明的一个实施例中，该蛋白酶在pH3下在2小时之后保留>95%的活性，如使用在实例3中所述的方法所确定的。

热稳定性

热稳定性可以如在实例6中所描述的来确定，即，使用DSC测量来确定纯化的蛋白酶蛋白的变性温度T_d。Td指示蛋白质的热稳定性：T_d越高，热稳定性越高。因此，在一个优选实施例中，本发明的蛋白酶具有高于参照蛋白酶的T_d的T_d，其中T_d是基于纯化的蛋白酶样品（优选地，具有至少90%或95%的纯度，如由SDS-PAGE所确定的）来确定的。

在优选实施例中，本发明的蛋白酶的热特性，例如如由残留活性提供的热力稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性、和/或造粒稳定性，变性温度T_d，或其他参数高于相应的值例如SEQ ID NO:5的蛋白酶的残留活性或T_d，更优选地是其至少101%、或其至少102%、103%、104%、105%、106%,107%、108%、109%、或至少110%。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数例如残留活性或T_d的值是对于SEQ ID NO:5的蛋白酶的值的至少120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、或至少190%。

在再另外的具体实施例中，本发明的热稳定蛋白酶具有至少50℃的熔解温度T_m（或变性温度T_d），如使用差示扫描量热法（DSC）所确定的，如在实例10中所描述的（即，在20mM乙酸钠，pH4.0中）。在再另外的具体实施例中，T_m是至少51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99℃或至少100℃。

蒸汽稳定性

可以如在实例7中所描述的通过在85℃或90℃蒸汽处理一段短的时间之后确定蛋白酶分子的残留活性来确定蒸汽稳定性。

造粒稳定性

可以如在实例8中所描述的通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定造粒稳定性。从混合器将饲料用蒸汽处理至95℃。在处理之后，将饲料压制成颗粒，并且确定残留活性。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

本发明的具有蛋白酶活性的多肽可获得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由一种多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生。在一方面，从给定来源获得的多肽分泌到细胞外。

该多肽可以是一种细菌多肽。例如，该多肽可以是来自在例如放线菌门门内的革兰氏阳性细菌或来自在例如变形菌门内的革兰氏阴性细菌的具有蛋白酶活性的多肽。

在一方面，该多肽是来自放线菌纲的细菌的蛋白酶，例如来自放线菌目，或来自丙酸杆菌亚目，或来自类诺卡氏菌科，或来自韩国生工菌属，糖单孢菌属，糖多孢菌属；或拟无枝酸菌属。

这些分类群的菌株对于公众来说是易于在多个培养物保藏中心获得的，例如美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）（ATCC）、德国微生物与菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（DSMZ）、荷兰国际微生物菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures）（CBS）、以及美国农业研究菌种保藏中心（Agricultural Research Service Patent CultureCollection）、北方地区研究中心（Northern Regional Research Center）（NRRL）。

利用上述探针可从其他来源，包括从自然界（例如土壤、堆肥、水等）中分离出的微生物中鉴定和获得该多肽。从自然环境中分离微生物的技术在本领域中是熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组文库或cDNA文库或者混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说熟知的技术来分离或克隆该多核苷酸（参见，例如上文的萨拉布鲁克等人，1989）。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组DNA中分离，从cDNA制备，或者两者的组合。从此类基因组DNA克隆多核苷酸可以例如，通过使用熟知的聚合酶链式反应（PCR）或者通过抗体筛选表达文库以检测具有共有的结构特征的所克隆DNA片段来实现。参见例如，英尼斯（Innis）等人，1990，《PCR：方法与应用指南》（PCR:A Guide to Methods and Application），学术出版社（Academic Press），纽约。还可以使用其他核酸扩增程序，诸如连接酶链式反应（LCR）、连接激活转录（LAT）、和基于多核苷酸的扩增（NASBA）。可从韩国生工菌属菌株或者从来自放线菌目的另外的或相关的生物体中克隆得到这些多核苷酸，并且因此这些多核苷酸可以是例如多核苷酸中多肽编码区的等位或物种变体。

本发明还涉及编码具有蛋白酶活性的多肽的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少86%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性程度的多核苷酸或由其组成。

对于合成与该多肽基本上类似的多肽而言，修饰编码本发明的多肽的多核苷酸可以是必要的。术语与该多肽“基本上类似”是指该多肽的非天然存在形式。这些多肽以一些经改造的方式区别于分离自其天然来源的多肽，例如在比活、热稳定性、pH最适值等方面有所不同的变体。变体可以基于作为SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码存在的多核苷酸（例如其子序列）而构建，和/或通过引入不会导致多肽氨基酸序列的变化但符合旨在用于生产酶的宿主生物的密码子使用的核苷酸取代，或者通过引入可产生不同氨基酸序列的核苷酸取代而构建。对于核苷酸取代的一般说明可参见例如福特（Ford）等人，1991，《蛋白质表达与纯化》（Protein Expression and Purification）2:95-107。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中等-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：（i）SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，（ii）包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或（iii）（i）或（ii）的全长互补链；或其等位基因变体和子序列（上文的萨拉布鲁克等人,1989），如在此定义的。

在一方面，该多核苷酸包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的片段的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的子序列，例如SEQ ID NO:1的核苷酸316至879或SEQ ID NO:3的核苷酸316至882的多核苷酸，或由其组成。

核酸构建体

本发明还涉及包括被可操作地连接至一个或多个（若干个）控制序列上的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中这些控制序列在合适的宿主细胞中在适于控制序列的条件下指导编码序列的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，从而为多肽的表达做准备。取决于表达载体，在该多核苷酸插入到该载体中之前，该多核苷酸的操纵可以是令人希望的或者必需的。用于利用重组DNA方法来修饰多核苷酸的技术在本领域中是熟知的。

控制序列可以是一个启动子序列，即由一个宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的一种多核苷酸。启动子序列包含转录控制序列，其介导多肽的表达。启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外多肽或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是获得自以下项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyQ）、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyL）、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP）、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦淀粉酶基因（amyM）、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB）、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因（dagA）、和原核β-内酰胺酶基因（维拉-卡玛若夫（Villa-Kamaroff）等人,1978,《美国国家科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）75:3727-3731），以及tac启动子（德波尔（DeBoer）等人,1983,《美国国家科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）80:21-25）。另外的启动子描述在“来自重组细菌的有用蛋白质（Useful proteins from recombinant bacteria）”，吉尔伯特（Gilbert）等人，1980，《科学美国人》（Scientific American）242:74-94；以及上文的萨拉布鲁克等人，1989中。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的适合启动子的实例是获得自以下项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA）、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰刀菌类胰蛋白酶蛋白酶（WO96/00787）、毒性镰刀菌（Fusarium venenatum）淀粉转葡糖苷酶（WO00/56900）、毒性镰刀菌Daria（达莉亚）（WO00/56900）、毒性镰刀菌Quinn（奎恩）（WO00/56900）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子（修饰的启动子，包括编码曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻译前导序列已经被来自编码曲霉中的磷酸丙糖异构酶的基因的非翻译前导序列替代；非限制性的实例包括这样的修饰的启动子，这些启动子包括编码黑曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻译前导序列已经被来自编码构巢曲霉或米曲霉中的磷酸丙糖异构酶的基因的非翻译前导序列替代）；及其突变体启动子、截短启动子和杂合启动子。

在一个酵母宿主中，有用的启动子获得自以下项的基因：酿酒酵母烯醇酶（ENO-1）、酿酒酵母半乳糖激酶（GAL1）、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH1、ADH2/GAP）、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶（TPI）、酿酒酵母金属硫蛋白（CUP1）以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯（Romanos）等人，1992，《酵母》（Yeast）8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。终止子序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的3’-末端。在所选择宿主细胞中具有功能的任何终止子可用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下项的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌类胰蛋白酶蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自以下项的基因：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C（CYC1）、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由上文的罗马诺斯等人（1992）描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

控制序列还可以是适合的前导序列，当被转录时是对宿主细胞翻译而言重要的mRNA非翻译区域。前导序列被可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在所选择的宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子获得自以下项的基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。

用于酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下项的基因：酿酒酵母烯醇酶（ENO-1）、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、以及酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP）。

控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’-末端可操作地连接并在转录时作为信号被宿主细胞识别从而向所转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的序列。可以使用在所选择的宿主细胞中具有功能的任何多聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列获得自以下项的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌类胰蛋白酶蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭（Guo）和谢尔曼（Sherman）,1995,《分子细胞生物学》（Mol.Cellular Biol.）15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接的并指导该多肽进入细胞的分泌通路的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端本身可包含在翻译阅读框中天然与编码该多肽的编码序列片段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含与该编码序列异源的信号肽编码序列。在该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可以需要一种外源信号肽编码序列。可替代地，为增强多肽的分泌，可以简单地用外源信号肽编码序列替代天然信号肽编码序列。然而，可以使用指导所表达多肽进入所选择宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB11837生麦淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT、nprS、nprM）、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳（Simonen）和帕尔瓦（Palva），1993，《微生物学评论》（Microbiological Reviews）57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉（Humicola insolens）纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉（Humicolalanuginosa）脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。上文的罗马诺斯等人（1992）描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列也可以是编码位于多肽N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽称为前酶（proenzyme）或多肽原（或者在一些情况下称为酶原（zymogen））。一种多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。该前肽编码序列可以从以下项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprE）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）漆酶（WO95/33836）、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽和前肽序列两者都存在于多肽的N-末端的情况下，该前肽序列紧接着多肽的N-末端并且该信号肽序列紧接着该前肽序列的N-末端。

加入对与宿主细胞生长相关的多肽的表达进行调节的调控序列也是希望的。调控系统的实例是响应于一种化学或物理刺激（包括一种调控化合物的存在）而引起基因的表达开启或关闭的那些。在原核系统中的调控系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在氨甲蝶呤存在下进行扩增的二氢叶酸还原酶基因以及随重金属进行扩增的金属硫蛋白酶基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸会与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、转录和翻译终止信号的重组表达载体。可将多种核苷酸和控制序列连接在一起，产生可包括一个或多个（若干个）方便的限制性位点的重组表达载体，从而可以允许在此类位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包括该序列的一种核酸构建体插入用于表达的一个适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生该表达载体过程中，将该编码序列定位在该载体中，这样使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体（例如，一种质粒或病毒）。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性或闭合环状质粒。

该载体可以是一种自主复制载体，即，作为一种染色体外实体存在的一种载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如一种质粒、一种染色体外元件、一种微型染色体、或一种人工染色体。该载体可以包含任何用于确保自我复制的构件。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时整合到基因组中并且与已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组之中的全部DNA）、或转座子。

该载体优选地包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个（若干个）可选择标记。一个可选择标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌选择性标记的实例为来自枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性，如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或者四环素抗性的标记。对于酵母宿主细胞适合的标记是ADE2、H1S3、LRU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的可选择标记包括但不局限于amdS（乙酰胺酶）、argB（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar（草胺膦乙酰转移酶）、hph（潮霉素磷酸转移酶）、niaD（硝酸还原酶）、pyrG（乳清苷-5’-磷酸脱羧酶）、sC（硫酸腺嘌呤基转移酶）、以及trpC（邻氨基苯甲酸合酶）、连同其等效物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS与pyro基因，以及吸水链霉菌的bar基因。

该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中独立于该基因组而自主复制的一个或多个元件。

为了整合入宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组而整合入基因组的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组在一个或多个染色体内的一个或多个精确位置处整合到该宿主细胞的基因组中的另外的多核苷酸。为了增加在一个精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在该宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在一个细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使一个质粒或载体能够在体内复制的一种多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌内进行复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米的复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1（格姆斯（Gems）等人，1991，《基因》98:61-67；卡伦（Cullen）等人，1987，《核酸研究》15:9163-9175；WO00/24883）。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将该序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括一个与该多核苷酸的可扩增的可选择标记基因可以获得该多核苷酸拷贝数目的增加，其中通过在适当的可选择试剂存在下培养细胞可以选择包含扩增的可选择标记基因拷贝和由此另外的该多核苷酸拷贝的细胞。

用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的（参见，例如上文的萨拉布鲁克等人，1989）。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的、可操作地连接至一个或多个（若干个）控制序列的一种多核苷酸，这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括一种多核苷酸的一个构建体或载体引入到一个宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为一个染色体整合体或作为一个自主复制的染色体外载体，如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中存在的突变而与亲本细胞不相同的该亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生本发明的多肽中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不局限于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、梭菌属（Clostridium）、地芽孢杆菌属（Geobacillus）、乳酸杆菌属、乳球菌属、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不局限于大肠杆菌、和假单胞菌属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌目细胞，包括但不局限于解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。

可以例如通过原生质体转化（参见例如，常（Chang）和科恩（Cohen），1979，《分子基因组学与遗传学》（Mol.Gen.Genet.）168:111-115）、通过使用感受态细胞（参见，例如，杨格（Young）和斯皮宰曾（Spizizen），1961，《细菌学杂志》（J.Bacteriol.）81:823-829；或者杜博楠（Dubnau）和大卫多夫-阿贝尔森（Davidoff-Abelson），1971，《分子生物学杂志》56:209-221）、通过电穿孔（参见，例如，茂川（Shigekawa）和道尔（Dower），1988，《生物技术》（Biotechniques）6:742-751）、或者通过轭合（参见，例如凯勒（Koehler）和索恩（Thorne），1987，《细菌学杂志》169:5271-5278）实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞之中。可以例如通过原生质体转化（参见例如，哈那汗（Hanahan），1983，《分子生物学杂志》166:557-580）或者电穿孔（参见，例如，Dower（道尔）等人，1988，《核酸研究》16:6127-6145）实现将DNA引入到大肠杆菌细胞之中。可以例如通过原生质体转化和电穿孔（参见例如，宫（Gong）等人，2004，《微生物学报》（Folia Microbiol.）（布拉格（Praha））49:399-405）、通过轭合（参见，例如，马佐迪耶（Mazodier）等人，1989，《细菌学杂志》171:3583-3585）、或通过转导（参见，例如，伯克（Burke）等人，2001，《美国国家科学院院刊》98:6289-6294）实现将DNA引入到链霉菌属细胞中。可以例如通过电穿孔（参见，例如，崔（Choi）等人，2006，《微生物学方法杂志》（J.Microbiol.Methods）64:391-397）、或者通过轭合（参见，例如，皮内多（Pinedo）和斯麦茨（Smets），2005，《应用与环境微生物学》（Appl.Environ.Microbiol.）71:51-57）实现将DNA引入到假单胞菌属细胞之中。可以例如通过天然感受态（参见例如，佩里（Perry）和仓光（Kuramitsu），1981，《感染与免疫》（Infect.Immun.）32:1295-1297）、原生质体转化（参见，例如，卡特（Catt）和朱力克（Jollick），1991，《微体生物》（Microbios）68:189-207）、通过电穿孔（参见，例如，巴克利（Buckley）等人，1999，《应用与环境微生物学》65:3800-3804）或者通过轭合（参见，例如，克拉维尔（Clewell），1981，《微生物学评论》（Microbiol.Rev.）45:409-436）实现将DNA引入到链球菌属细胞之中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到一个宿主细胞中。

该宿主细胞还可以是一个真核细胞，例如一个哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或真菌细胞。

该宿主细胞可以是一种真菌细胞。如在此使用的“真菌类”包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和接合菌门（Zygomycota）（如在《安斯沃斯和拜斯比的真菌字典》（Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi），第八版，1995，CAB国际（International）,大学出版社（University Press）,剑桥，英国一书中霍克斯沃思（Hawksworth）等人定义的）以及卵菌门（Oomycota）（如上文的霍克斯沃思等人，1995，第171页中引用的）和所有的有丝分裂真菌类（上文的霍克斯沃思等人，1995）。

该真菌宿主细胞可以是一种酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊孢子酵母（ascosporogenous yeast）（内孢霉目（Endomycetale））、担子孢子酵母（basidiosporogenous yeast）、以及属于不完全菌类（芽生菌（Blastomycete））的酵母。因为酵母的分类在将来可以改变，出于本发明的目的，酵母将如《酵母生物学与活性》（Biology and Activities of Yeast）（斯金纳（Skinner）,F.A.,帕斯莫尔（Passmore）,S.M.，和达文波特（Davenport）,R.R.，编著，《科学应用细菌学研讨会系列》（Soc.App.Bacteriol.Symposium Series）9期，1980）中所描述的来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、糖酵母属、裂殖酵母属、或者亚罗酵母属细胞，例如一种乳酸克鲁维酵母、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁维氏酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母细胞。

该真菌宿主细胞可以是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括细分真菌门和卵菌门的所有丝状形式（如由上文的霍克斯沃思等人，1995所定义的）。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖组成的一个菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母（例如酿酒酵母）的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的、并且碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、网孢菌属（Filibasidium）、镰刀菌属、腐质霉属、稻瘟病菌属（Magnaporthe）、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉菌、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌（Bjerkandera adusta）、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌（Ceriporiopsis caregiea）、浅黄拟蜡孔菌（Ceriporiopsis gilvescens）、Ceriporiopsispannocinta、杯伞拟蜡菌（Ceriporiopsis rivulosa）、白翅拟蜡菌（Ceriporiopsissubrufa）、虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora）、狭边金孢子菌（Chrysosporiuminops）、嗜角质金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum）、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌（Chrysosporium pannicola）、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌（Chrysosporium tropicum）、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）、毛云芝菌（Coriolushirsutus）、杆孢状镰刀菌（Fusarium bactridioides）、纹镰刀菌（Fusarium cerealis）、克鲁克威尔镰孢菌（Fusarium crookwellense）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、禾镰刀菌（Fusarium graminum）、异孢镰刀菌（Fusariumheterosporum）、合欢木镰刀菌（Fusarium negundi）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、网状镰刀菌（Fusarium reticulatum）、粉红镰刀菌（Fusarium roseum）、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、肤色镰刀菌（Fusarium sarcochroum）、拟分枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）、硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）、囊珠镰刀菌（Fusarium torulosum）、拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）、毒性镰刀菌（Fusarium venenatum）、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉（Mucor miehei）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、产紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、射脉侧菌（Phlebia radiata）、白腐菌（Pleurotus eryngii）、太瑞斯梭孢壳霉（Thielaviaterrestris）、长绒毛栓菌（Trametes villosa）、彩绒栓菌（Trametes versicolor）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、康宁木霉（Trichoderma koningii）、长枝木霉（Trichodermalongibrachiatum）、里氏木霉、或者绿色木霉（Trichoderma viride）细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。在EP238023和意尔顿（Yelton）等人,1984,《美国国家科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）81:1470-1474中描述了对于曲霉属和木霉属宿主细胞转化而言适合的程序。Malardier（马拉迪耶）等人，1989，《基因》78:147-156和WO96/00787描述了用于转化镰刀菌属物种的适合的方法。可以使用贝克尔（Becker）和瓜伦特（Guarente），在阿贝尔森（Abelson）,J.N.和西蒙（Simon）,M.I.编著，酵母遗传学和分子生物学指南（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology）,《酶学方法》（Methods inEnzymology），第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司（Academic Press,Inc）纽约；伊托（Ito）等人，1983，《细菌学杂志》153:163；以及何妮诺（Hinnen）等人，1978，《美国国家科学院院刊》75:1920描述的程序来转化酵母。

生产方法

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：（a）在有益于生产该多肽的条件下，培养一种在处于其野生型形式下生产该多肽的细胞；并且（b）回收该多肽。在一个优选方面，该细胞是韩国生工菌属。在一个更优选的方面，该细胞是立枯韩国生工菌或明矾韩国生工菌。

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：（a）在有益于生产该多肽的条件下培养本发明的一种重组宿主细胞；并且（b）回收该多肽。

使用本领域中熟知的方法在适合于生产该多肽的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可通过在合适的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下进行在实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养，以及小规模或大规模发酵（包括连续、分批、补料分批，或固态发酵）来培养该细胞。使用本领域已知的程序，在包括碳源和氮源以及无机盐的一种合适的营养培养基中进行该培养。合适的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心目录中）来制备。如果多肽分泌到营养培养基中，那么可直接从培养基中回收该多肽。如果多肽不分泌，那么可从细胞裂解产物中对其进行回收。

可以使用对这些多肽具有特异性的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法可以包括特异抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域中已知的方法来回收该多肽。例如，可以通过包括但不局限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀的常规程序从营养培养基中回收该多肽。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不局限于色谱法（例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱）、电泳程序（例如，制备型等电点聚焦）、差别性溶解度（例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE、或者提取（参见，例如《蛋白质纯化》（Protein Purification），J.-C.詹森（Janson）和拉斯赖登（Lars Ryden）编著，VCH出版社（VCH Publishers），纽约，1989）。

在一个可替代方面，没有回收该多肽，而是将表达多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的一个来源。

植物

本发明还涉及包括本发明的分离的多核苷酸从而以可回收的量表达和生产多肽的植物，例如转基因植物、植物部分、或植物细胞。该多肽可以从该植物或植物部分回收。可替代地，可以按照这样使用含有该多肽的植物或植物部分以改善食品或饲料的品质，例如改进营养价值、适口性和流变学特性，或以破坏抗营养因子。

该转基因植物可以是双子叶的（双子叶植物）或单子叶的（单子叶植物）。单子叶植物的实例是草，例如草甸草（蓝草，早熟禾属（Poa））、饲料草（如羊茅属（Festuca）、黑麦草属（Lolium））、温带草（如剪股颖属（Agrostis）），以及谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉蜀黍（玉米）。

双子叶植物的实例是烟草，豆类（如羽扇豆），马铃薯，糖甜菜，豌豆，蚕豆（bean）和大豆，以及十字花科植物（Brassicaceae），如花椰菜、油菜和密切相关的模式生物拟南芥。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎，以及包括这些部分的单独组织，如表皮、叶肉、薄壁组织、微管组织、分生组织。特定的植物细胞小室，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体、和细胞质也认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，也被视为是植物部分。同样，植物部分，例如有利于本发明的应用的特定的分离组织和细胞也被视为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉、和种皮。

此类植物、植物部分、和植物细胞的后代也包括在本发明范围之内。

表达多肽的转基因植物或植物细胞可以依据本领域已知的方法来构建。简而言之，该植物或植物细胞可以通过将一种或多种（若干种）编码多肽的表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组中并将所得的经修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞来构建。

该表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽的多核苷酸且该多核苷酸可操作地与所选定的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调控序列连接。而且，该表达构建体可包括用于鉴定整合了此表达构建体的宿主细胞的可选择标记，和将此构建体引入所讨论植物所必需的DNA序列（后者取决于有待使用的引入DNA的方法）。

例如，根据希望在何时、何处、和怎样表达多肽来确定对调控序列例如启动子和终止子序列和可任选的信号或转运序列的选择。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段、或组织特异性的，并且基因产物可以靶向于特定组织或植物部分例如种子或叶。调控序列是例如由塔格（Tague）等人，1988,《植物生理学》（Plant Physiology）86:506所述的。

对于组成型表达，可使用35S-CaMV、玉米泛素1、和水稻肌动蛋白1启动子（弗兰克（Franck）等人,1980,《细胞》（Cell）21:285-294；克里斯坦森（Christensen）等人，1992，《植物分子生物学》（Plant Mol.Biol.）18:675-689；张（Zhang）等人，1991，《植物细胞》（PlantCell）3:1155-1165）。器官特异性启动子可以是例如来自如种子、马铃薯块茎和果实的贮藏库组织的启动子（爱德华兹（Edwards）和科尔兹（Coruzzi）,1990，《遗传学年度评论》（Ann.Rev.Genet.）24:275-303）,或来自如分生组织的代谢库组织的启动子（伊托（Ito）等人，1994，《植物分子生物学》（Plant Mol.Biol.）24:863-878），来自水稻的如谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子的种子特异性启动子（吴（Wu）等人，1998,《植物细胞生理学》（Plant Cell Physiol.）39:885-889），来自豆球蛋白B4和蚕豆（Vicia faba）未知种子蛋白质基因的蚕豆启动子（康拉德（Conrad）等人，1998，《植物生理学杂志》（J.PlantPhysiol.）152:708-711），来自种子油体蛋白质的启动子（陈（Chen）等人，1998，《植物细胞生理学》（Plant Cell Physiol.）39:935-941），来自甘蓝型油菜（Bressica napus）的贮藏蛋白napA启动子，或如WO91/14772中描述的本领域已知的任何其他种子特异性启动子。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子（科组卡（Kyozuka）等人，1993，《植物生理学》（Plant Physiol.）102；991-1000）,小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子（密特拉（Mitra）和希金斯（Higgins）,1994，《植物分子生物学》（PlantMol.Biol.）26:85-93）,来自水稻的aldP基因启动子（加贺谷穰（Kagaya）等人，1995,《分子基因组学与遗传学》（Mol.Gen.Genet.）248:668-674）,或者伤口诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子（徐（Xu）等人，1993,《植物分子生物学》（Plant Mol.Biol.）22:573-588）。同样，启动子可以通过非生物处理例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加能激活启动子的物质，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脱落酸和赤霉酸以及重金属来诱导。

还可以使用启动子增强子元件以在植物中实现多肽的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，该内含子位于启动子与编码多肽的多核苷酸之间。例如上文的徐（Xu）等人，1993披露了利用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含于来增强表达。

可选择标记基因和表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

根据本领域中已知的常规技术，核酸构建体被并入植物基因组中，这些常规技术包括农杆菌-介导的转化、病毒-介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物弹射击转化（biolistic transformation）和电穿孔（加塞尔（Gasser）等人，1990，《科学》（Science）244:1293；波特里库斯（Potrykus）,1990,《生物/技术》（Bio/Technology）8:535；岛本（Shimamoto）等人，1989,《自然》（Nature）338:274）。

当前，根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法（对于综述，参见胡卡斯（Hooykas）和斯切尔普如特（Schilperoort）,1992，《植物分子生物学》（Plant Mol.Biol.）19:15-38），并且还可以用于转化单子叶植物，虽然其他的转化方法常常用于这些植物。目前，用于产生转基因单子叶植物所选择的方法是对胚性愈伤组织或发育胚的粒子轰击（用转化DNA包被的显微金或钨颗粒）（克里斯托（Christou），1992，《植物杂志》（Plant J.）2:275-281;岛本（Shimamoto）,1994,《生物技术当前观点》（Curr.Opin.Biotechnol.）5:158-162；瓦西尔（Vasil）等人，1992，《生物/技术》10:667-674）。如欧米如勒（Omirulleh）等人，1993,《植物分子生物学》（Plant Mol.Biol.）21:415-428中所描述的，单子叶植物转化的一种替代方法是基于原生质体转化。用于依据本披露使用的另外的转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和7,151,204（将这两者均通过引用以其全文结合于此）中的那些。

转化以后，根据本领域中熟知的方法选择已经并入表达构建体的转化体，并再生成整株植物。通常，转化程序被设计成在再生期间或在后代中选择基因的选择性排除，例如通过两种分开的T-DNA构建体的共转化或通过特异重组酶进行的选择基因的位点特异性切除来进行。

除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型外，也可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制得转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽的构建体引入具体植物变种中，而不需要直接转化那个给定变种的植物。因此，本发明不仅涵盖了直接从已经依据本发明被转化的细胞而再生的植物，还涵盖了此类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指依据本发明制备的亲本植物的任何代的子代。这种后代可以包括依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。通过用供体植株系交叉授粉起始株系，杂交导致将转基因引入植株系。此类步骤的非限制性实例进一步明确表达于美国专利号7,151,204中。

可以通过回交转化的方法来产生植物。例如，植物包括称为回交转化基因型、系、近交系、或杂合种的植物。

基因标记可以用于辅助本发明的一种或多种转基因从一种基因背景经基因渐渗进入另一种基因背景。标记辅助的选择提供了相对于常规育种的优势，这些优势在于它可以用于避免由表型变异引起的错误。另外，基因标记可以提供在具体杂交的单独后代中的关于相对优异种质度的数据。例如，当具有所希望性状并且否则的话具有非农艺学希望的基因背景的一种植物与一种优异亲本杂交时，基因标记可以用于选择不仅具有感兴趣性状还具有相对大比例的所希望的种质的后代。以此方式，将一种或多种性状经基因渐渗进入具体的基因背景所要求的代数最小化。

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：（a）在有益于生产多肽的条件下，培养包括了编码该多肽的多核苷酸的一种转基因植物或植物细胞；并且（b）回收该多肽。

组合物

本发明还涉及包括本发明的蛋白酶的组合物。优选的是，这些组合物富含这样一种蛋白酶。术语“富含”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。

该组合物可以包括本发明的一种蛋白酶作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化氢酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。这种或这些另外的酶可以例如通过微生物（如细菌或真菌）或通过植物或通过动物来生产。这些组合物可依据本领域已知的方法制备并且可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，该组合物可以处于颗粒或微粒的形式。可以依据本领域中已知的方法来稳定蛋白酶。

用途

本发明还针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物的方法。

动物饲料

本发明还针对用于在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的蛋白酶的方法，并涉及包括本发明蛋白酶的饲料组合物和饲料添加剂。

术语动物包括所有动物，包括人。动物的实例为非反刍动物、和反刍动物。反刍动物包括，例如，诸如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非-反当动物包括单胃动物，如猪（包括但不局限于小猪，生长中的猪和大母猪）；家禽，如火鸡、鸭和鸡（包括但不局限于适于肉鸡、蛋鸡）；马（包括但不局限于热血、冷血和温血），牛犊；和鱼（包括但不局限于鲑鱼，蹲鱼，罗非鱼，鲶鱼和鲤鱼）；和甲壳类动物（包括但不局限于小虾米和对虾）。

术语饲料或饲料组合物指适于或者意在由动物摄入的任何化合物、制品、混合物或者组合物。

在根据本发明的用途中，可在饮食之前、之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。

在具体实施例中，很好地定义了往饲料中添加形式的蛋白酶或包括在饲料添加剂中的蛋白酶。很好地定义意指蛋白酶制品至少为50%纯，如通过尺寸排阻色谱（参见WO01/58275的实例12）确定的。在其它具体实施例中，如通过此方法确定的，蛋白酶制品至少为60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、94%或至少为95%纯。

很好地定义的蛋白酶制品是有利的。例如，将实质上不干扰或污染其他蛋白酶的蛋白酶正确地配量于饲料是更容易的。术语正确配量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果优化剂量的能力。

然而，对于在动物饲料中的使用，该蛋白酶不需要是那样纯的；它可以例如包括其他酶，在那种情况下它可以称为蛋白酶制品。

蛋白酶制品可以（a）直接加入饲料（或者直接用于蛋白质的处理过程），或者（b）它可以用于一种或多种随后加入饲料的中间体组合物（如饲料添加剂或者预混合物）的生产（或者用于处理过程中）。不论是否根据上述（a）或（b）来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制品的纯度。

具体地说，纯度为上述数量级的蛋白酶制品具体是使用重组生产方法可获得的，而当通过传统的发酵方法制备该蛋白酶时，要想获得所述蛋白酶制品却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。

这种蛋白酶制品当然可以与其他酶混合。

该蛋白质可以是动物蛋白，例如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或它可以是植物蛋白。

如在此使用的术语植物蛋白指的是包括至少一种衍生自或源自植物的蛋白质（包括修饰的蛋白质和蛋白质衍生物）的任何化合物、组合物、制品或混合物。在具体实施例中，这些植物蛋白质的蛋白质含量至少为10%、20%、30%、40%、50%或60%（w/w）。

植物蛋白质可以衍生自植物蛋白质来源，如豆类和谷类，例如来自豆科（Fabaceae）、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。

在一个具体实施例中，该植物蛋白质来源是来自豆科（Fabaceae）的一种或多种植物（如大豆、羽扇豆、豌豆或蚕豆）的材料。

在另一个具体实施例中，该植物蛋白质来源是来自藜科的一种或多种植物（如甜菜、糖甜菜、菠菜或奎奴亚藜）的材料。

植物蛋白质来源的其他实例是油菜籽、向日葵籽、棉籽和卷心菜。

大豆是优选的植物蛋白质来源。

植物蛋白质来源的其他实例是谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍（玉米）、水稻、黑小麦、和高粱。

在处理过程的一个具体实施例中，所讨论的一种或多种蛋白酶影响（或作用于或施加其水解或降解影响于）蛋白质，例如植物蛋白或蛋白质来源。为了实现此目的，典型地将该蛋白质或蛋白质来源悬浮于溶剂，例如水性溶剂，如水中，并且适当关注所讨论的酶的特征，调节pH和温度值。例如，可以在实际蛋白酶的活性至少为5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或至少90%的pH值下进行处理。同样地，例如，可以在实际蛋白酶的活性至少为5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或至少90%的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶解反应直至实现所希望的结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。

在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入蛋白质中，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适合的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论可以已经使用何种其他手段延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。

在一个实施例中，该处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白质，即蛋白质在摄入之前被水解。

术语改进动物饲料的营养价值意指改进饲料中营养物的可用性。在本发明中，改进营养价值具体是指改进饲料的蛋白质部分的可用性，由此导致增加的蛋白质提取、更高的蛋白质产率、和/或改进的蛋白质利用。当饲料的营养价值得以增加时，蛋白质和/或氨基酸消化率得以增加，并且动物的生长速度和/或体重增加量和/或饲料转化率（即相对于体重增加量的饲料摄取量）可以得到改进。

可以将任何形式的蛋白酶添加至饲料中，只要它是作为相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即处于动物饲料添加剂的形式，如所谓的动物饲料预混合物。在另一方面，本发明涉及用于在动物饲料中使用的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。

除本发明的蛋白酶外,本发明的动物饲料添加剂包含至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质，和/或至少一种大量矿物质。

另外，可选的饲料添加剂成分是着色剂，例如，类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；稳定剂；生长改进添加剂以及芳香化合物/风味剂，例如，甲氧甲酚，茴香脑，癸-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮，鸢尾酮，姜辣素，哌啶，亚丙基苯酞（propylidenephatalide），亚丁基苯酞（butylidene phatalide），辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸（PUFA）；活性氧生成种类；另外，可以使用一种支持物，该支持物可以包含例如按重量计40%-50%的木纤维、按重量计8%-10%的硬脂、按重量计4%-5%的姜黄粉、按重量计4%-58%的迷迭香粉、按重量计22%-28%的石灰石、按重量计1%-3%的胶（例如阿拉伯胶）、按重量计5%-50%的糖和/或淀粉、以及按重量计5%-15%的水。

本发明的饲料或饲料添加剂还可以包括至少一种选自以下项中的其他酶：植酸酶（EC3.1.3.8或3.1.3.26）；木聚糖酶（EC3.2.1.8）；半乳聚糖酶（EC3.2.1.89）；α-半乳糖苷酶（EC3.2.1.22）；另外的蛋白酶（EC3.4），磷脂酶A1（EC3.1.1.32）；磷脂酶A2（EC3.1.1.4）；溶血磷脂酶（EC3.1.1.5）；磷脂酶C（3.1.4.3）；磷脂酶D（EC3.1.4.4）；淀粉酶，例如，如α-淀粉酶（EC3.2.1.1）；和/或β-葡聚糖酶（EC3.2.1.4或EC3.2.1.6）。

在一个具体实施例中，这些其他酶被很好地定义（如上对蛋白酶制品所定义的）。

抗微生物肽（AMP）的实例是CAP18，林可霉素A（Leucocin A），三色肽（Tritrpticin），Protegrin-1，死亡素（Thanatin），防御素（Defensin），乳铁蛋白（Lactoferrin），乳铁蛋白肽（Lactoferricin），以及奥维司匹林（Ovispirin）如诺维司匹林（Novispirin）（Robert Lehrer（罗伯特莱勒）,2000），菌丝霉素（Plectasin），以及他汀类药物（Statin），包括披露于WO03/044049和WO03/048148中的化合物和多肽，以及保留抗微生物活性的以上的变体或片段。

抗真菌多肽（AFP）的实例是巨大曲霉（Aspergillus giganteus）和黑曲霉的肽，以及它们的保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO94/01459和WO02/090384中披露的。

多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。

活性氧生成种类的实例是化学品，例如过硼酸盐、过硫酸盐、或过碳酸盐；以及酶，例如氧化酶、加氧酶或合成酶。

通常，脂-和水-溶性维生素，以及痕量矿物质形成意在加入饲料中的所谓的预混合物的部分，而大量矿物质通常单独加入饲料中。这些组合物类型的任一种当富含本发明的蛋白酶时都是本发明的动物饲料添加剂。

在一个具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂意在以0.01%至10.0%；更优选0.05%至5.0%；或0.2%至1.0%（%指g添加剂/100g饲料）的水平包括（或规定为必须包括）在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。

下文列出了这些组分的非-排他性实例:

脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。

痕量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大量矿物质的实例是钙、磷和钠。

这些组分的营养要求（以家禽和小猪/猪举例）列于WO01/58275的表A中。营养要求指的是应在饮食中以所示浓度提供这些组分。

在替代方案中，本发明的动物饲料添加剂包括WO01/58275的表A中所限定的单独组分中的至少一种。至少一种意指一种或两种或三种或四种等直至所有十三种单独组分中的一种或多种，或直至所有15种单独组分。更确切地，本发明的添加剂包括该至少一种单独组分，其含量能使其在饲料中的浓度落入表A第4或第5或第6栏所指示的范围内。

在再另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包括以下维生素中的至少一种，优选使得其在饲料中的浓度落入在下表1中所限定的范围之内（分别对于小猪饮食，以及肉鸡饮食）。

表1：典型的维生素推荐规范

维生素	小猪饮食	肉鸡饮食
			维生素A	10,000-15,000IU/kg饲料	8-12,500IU/kg饲料
维生素D3	1800-2000IU/kg饲料	3000-5000IU/kg饲料
			维生素E	60-100mg/kg饲料	150-240mg/kg饲料
维生素K3	2-4mg/kg饲料	2-4mg/kg饲料
			维生素B1	2-4mg/kg饲料	2-3mg/kg饲料
维生素B2	6-10mg/kg饲料	7-9mg/kg饲料
			维生素B6	4-8mg/kg饲料	3-6mg/kg饲料
维生素B12	0.03-0.05mg/kg饲料	0.015-0.04mg/kg饲料
			烟酸（维生素B3）	30-50mg/kg饲料	50-80mg/kg饲料
泛酸	20-40mg/kg饲料	10-18mg/kg饲料
			叶酸	1-2mg/kg饲料	1-2mg/kg饲料
生物素	0.15-0.4mg/kg饲料	0.15-0.3mg/kg饲料
			氯化胆碱	200-400mg/kg饲料	300-600mg/kg饲料

本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对较高的蛋白质含量。家禽和猪饮食的特征可以是如WO01/58275，表B第2-3栏所指示的。鱼食的特征可以是如表B第4栏所指示的。此外，此类鱼食通常具有的粗脂肪含量是200-310g/kg。

WO01/58275相应于US09/779334，被通过引用特此结合。

根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，并且此外还包括至少一种如在此所要求保护的蛋白酶。

此外，或在（对以上所指示的粗蛋白含量）替代方案中，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙的含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO01/58275，表B，范围2、3、4或5中的任何一个中（R.2-5）。

粗蛋白质以氮（N）乘以系数6.25计算，即粗蛋白质（g/kg）=N（g/kg）×6.25。通过凯氏定氮法确定氮含量（A.O.A.C.,1984，《官方分析方法》（Official Methods ofAnalysis），第十四版,官方分析化学家协会（Association of Official AnalyticalChemists）,华盛顿特区）。

可代谢能量可以基于以下文献来计算：NRC出版物《猪的营养需求》（Nutrientrequirements in swine），第九次修订版1988，国家研究委员会，农业部，动物营养协会，猪营养分会，国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页，以及《家禽饲料材料的能量值的欧洲表》（European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs），家禽研究和延伸的斯皮尔德霍尔特（Spelderholt）中心，7361DA比克波登（Beekbergen），荷兰，格里菲施贝德瑞夫波森（Grafisch bedrijf Ponsen）&洛延bv（looijen bv）,瓦赫宁恩（Wageningen）。ISBN90-71463-12-5。

完整的动物饮食中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量是基于饲料表计算的：，比如化学成分数据（Veevoedertabel1997,gegevens over chemische samenstelling）,饲料的消化率和营养价值（verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen）,中央畜牧局（Central Veevoederbureau）,Runderweg6,8219pk莱利斯塔德（Lelystad）。ISBN90-72839-13-7。

在一个具体实施例中，本发明的动物饲料组合物含有如上定义的至少一种植物蛋白。

本发明的动物饲料组合物还可以含有动物蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，典型量为0-25%。本发明的动物饲料组合物还可以包括含可溶物的干谷物酒糟（DriedDestillers Grains with Solubles）（DDGS），典型量为0-30%。

在再另外的具体实施例中，本发明的动物饲料组合物含有0-80%的玉米；和/或0-80%的高粱；和/或0-70%的小麦；和/或0-70%的大麦；和/或0-30%的燕麦；和/或0-40%的大豆粉；和/或0-25%的鱼粉；和/或0-25%的肉和骨粉；和/或0-20%的乳清。

可将动物饮食制成例如糊状饲料（非颗粒）或颗粒饲料。典型地，将碾磨的饲料原料进行混合，并且根据关于所讨论的种类的说明加入足够量的必需维生素和矿物质。酶可以按固体或液体酶配制品进行添加。例如，对于糊状饲料来说，可以在成分混合步骤之前或期间添加固体或液体酶配制品。对于颗粒饲料，也可以在饲料成分步骤之前或期间添加（液体或固体）蛋白酶/酶制品。典型地，在造粒步骤之后添加液体蛋白酶/酶制品。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混合物中。

饮食中最终的酶浓度是在0.01-200mg酶蛋白质/kg饮食的范围内，例如在0.5-25mg酶蛋白质/kg动物饮食的范围内。

当然，应该以有效量，即足以改进饲料的水解、消化性、和/或改进营养价值的量来施用蛋白酶。目前考虑按以下量（剂量范围）中的一种或多种施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白质的mg数（ppm）。

为了确定每kg饲料中蛋白酶蛋白质的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关测定（参见蛋白酶活性，底物和测定）确定纯化蛋白酶的比活性。也按照这样使用相同测定确定饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次确定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白质的mg数计的剂量。

使用相同的原理确定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白质的mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可以从该样品确定比活性（无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶）。

洗涤剂组合物

可以将本发明的蛋白酶添加至洗涤剂组合物中，并且因此该蛋白酶成为洗涤剂组合物的组分。

例如，可将本发明的洗涤剂组合物配制成手洗或机洗洗涤剂组合物，包括适于预处理带有污渍的织物的洗衣用添加剂组合物和漂洗中添加的织物柔顺剂组合物，或配制成用于一般性的家中难清洁表面的清洗操作的洗涤剂组合物，或配制成用于手或机器洗碗盘操作。

在一个特定方面，本发明提供了包括本发明蛋白酶的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包括一种或多种其他酶，如另一种蛋白酶，如来自芽孢杆菌属的碱性蛋白酶，脂肪酶，角质酶，淀粉酶，糖酶，纤维素酶，果胶酶，甘露聚糖酶，阿拉伯糖酶，半乳聚糖酶，木聚糖酶，氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的洗涤剂相容（即pH最适值，与其他酶和非酶成分的相容性等），并且该一种或多种酶应以有效量存在。

适合的脂肪酶包括细菌来源或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括如EP258068和EP305216中所描述的来自腐质霉属（Humicola）（同义词为嗜热真菌属（Thermomyces）），例如来自柔毛腐质霉（H.1anuginosa，T.1anugiuosus）（的脂肪酶，或如WO96/13580中所描述的来自特异腐质霉（H.Insolens）的脂肪酶，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌（P.Alcaligenes）或类产碱假单胞菌（P.Pseudoalcaligenes）（EP218272）、洋葱假单胞菌（P.Cepacia）（EP331376）、施氏假单胞菌（P.stutzeri）（GB1,372,034）、荧光假单胞菌（P.Fluorescens）、假单胞菌属菌株SD705（WO95/06720和WO96/27002），威斯康辛假单胞菌（P.wisconsinensis）（WO96/12012）,芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌（达尔图瓦（Dartois）等人（1993），《生物化学与生物物理学学报》（Biochemica et Biophysica Acta）1131,253-360）,嗜热脂肪芽孢杆菌（JP64/744992）或短小芽孢杆菌（B.pumilus）（WO91/16422）。其他实例是如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的脂肪酶变体。优选可商购的脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM（Novozymes A/S）。适合的淀粉酶（α-和/或β-淀粉酶）包括来源于细菌或真菌的淀粉酶。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株的α-淀粉酶。有用的淀粉酶的实例是描述于WO94/02597、WO94/18314、WO95/26397、WO96/23873、WO97/43424、WO00/60060、以及WO01/66712中的变体，尤其是在以下一个或多个位置处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。可商购的淀粉酶是Natalase^TM、Supramyl^TM、Stainzyme^TM、Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM（诺维信公司（Novozymes A/S）），Rapidase^TM和Purastar^TM（来自杰能科国际公司（GenencorInternational Inc.））。

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭抱壳属、枝顶孢属的纤维素酶，例如披露于US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝菌（Myceliphthora thermophila）和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。尤其适合的纤维素酶是具有保护颜色益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及WO99/01544中的那些纤维素酶变体。可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM、和Carezyme^TM（诺维信公司（Novozymes A/S））、Clazinase^TM、以及Puradax HA^TM（杰能科国际公司（Genencor International Inc.））、和KAC-500（B）^TM（Kao公司）。

适合的过氧化物酶/氧化酶包括来源于植物、细菌或真菌的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属例如灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602、和WO98/15257中所描述的那些。可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM（诺维信（Novozymes））。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂（即单独添加剂或组合添加剂）可配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒剂，特别是非撒粉颗粒剂；液体，特别是稳定的液体；或浆液。

非撒粉尘颗粒剂可以例如如在US4,106,991和4,661,452中所披露的来生产，并且可以可任选地通过本领域中已知的方法被包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚（环氧乙烷）产物（聚乙二醇，PEG）；含有从16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中，该醇含从12到20个碳原子且其中存在15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB1483591中给出了适于通过流化床技术而应用的成膜包衣材料的实例。例如，液体酶制品可以根据确立的方法通过添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。受保护的酶可以根据EP238216中披露的方法来制备。

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何方便的形式，如棒状、片状、粉末、颗粒状、糊状或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有至多70%的水和0-30%的有机溶剂，或者是非水性的。

洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，这些表面活性剂可以是包括半-极性表面活性剂的非离子型表面活性剂，和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型表面活性剂。这些表面活性剂典型地是以按重量计从0.1%到60%的水平存在。

当包括在其中时，洗涤剂通常将含有从大约1%至大约40%的阴离子表面活性剂，例如线状的烷基苯磺酸酯、α-烯烃磺酸酯、烷基硫酸酯（脂肪醇硫酸酯）、醇乙氧基硫酸酯、二级烷基磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲醋、烷基-或烯基琥珀酸或皂。

当包括在其中时，洗涤剂将通常含有从大约0.2%到大约40%的非离子型表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物（“葡糖酰胺”）。

当包括在其中时，洗涤剂可以包含这样一种助水溶物，它是将疏水化合物溶解于水性溶液中（或相反地，极性物质于非极性环境中）的化合物。典型地，助水溶物具有亲水和疏水特征两者（所谓的两亲特性，如从表面活性剂已知的）；然而，助水溶物的分子结构通常不利于自发的自聚集，参见例如霍德格敦（Hodgdon）和卡勒（Kaler）（2007）的评论，《胶质与界面科学的当前观点》（Current Opinion in Colloid&Interface Science）12:121-128。助水溶物不展现临界浓度，在此临界浓度以上会发生自聚集，如对于形成胶束的、层状的或其他良好定义的中间相（meso-phase）的表面活性剂和脂质所发现的。取而代之，许多助水溶物显示连续型聚集过程，其中聚集团的大小随着浓度增加而增大。然而，许多助水溶物改变了包含极性和非极性特征物质的系统（包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物）的相行为、稳定性、和胶质特性。助水溶物经典地跨产业使用，从药物、个人护理、食品到技术应用。助水溶物在洗涤剂组合物中的使用允许例如表面活性剂的更浓缩的配制品（如通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中），而不引发不希望的现象例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0-5%例如大约0.5%至大约5%、或大约3%至大约5%的助水溶物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶物。助水溶物的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠（STS）、二甲苯磺酸钠（SXS）、异丙苯磺酸钠（SCS）、甲异丙苯磺酸钠、氧化胺、醇以及聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠、及其组合。

洗涤剂可包含0-65%的洗涤剂助洗剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐（例如来自Hoechst公司的SKS-6）。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚（乙烯吡咯烷酮）、聚（乙二醇）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯基吡啶-N-氧化物）、聚（乙烯基咪唑）、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以包含漂白体系，该体系可包括H₂O₂源，例如过硼酸盐或过碳酸盐，该源可与形成过酸的漂白活化剂（如四乙酰乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐）组合。可替代地，该漂白系统可包括例如酰胺型、酰亚胺型或砜型的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶可以使用常规稳定剂进行稳定，稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物（如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸），或肽醛，如例如在WO10/055052中所描述的，并且该组合物可以如在例如WO92/19709和WO92/19708中所描述的来配制。

洗涤剂还可以包含其他常规的洗涤剂成分，例如像包括粘土的织物调节剂，泡沫增强剂，泡沫抑制剂，抗侵蚀剂，污物悬浮剂，抗污物再沉淀剂，染料，杀细菌剂，光亮剂，助水溶物，晦暗抑制剂（tarnish inhibitor）或香料。

目前考虑在洗涤剂组合物中加入任何酶，特别是本发明的酶，加入量相应于每升洗涤液加0.01-100mg的酶蛋白质，优选每升洗涤液加0.05-5mg的酶蛋白质，特别是每升洗涤液加0.1-1mg的酶蛋白质。

可以将本发明的酶另外地掺入到WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中。

核酸构建体，表达载体，重组宿主细胞，以及用于生产蛋白酶的方法

本发明还涉及含有编码本发明的蛋白酶的此类多核苷酸的核酸构建体、表达载体、和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白酶的方法，该方法包括：（a）培养包括这种多核苷酸的重组宿主细胞；并且（b）回收该蛋白质。

对宿主细胞而言该蛋白质可以是天然的或异源的。在此术语“蛋白质”不是指具体长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽、和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖了组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。

优选的是，蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道子。例如，蛋白质可以是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

基因可从任何原核的、真核的、或其他来源中获得。

本发明进一步通过以下实例进行描述，这些实例不应被解释成限制本发明的范围。

实例

材料和方法

测定：

蛋白酶测定：

1）Suc-AAPF-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA（Bachem L-1400）。

温度：室温（25℃）

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150 mM KCl，0.01% Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH-值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，和11.0。

将20μl蛋白酶（稀释于0.01% Triton X-100中）与100μl测定缓冲液混合。测定起始于添加100μl pNA底物（50mg溶解于1.0ml DMSO并且用0.01%Triton X-100进一步稀释45×）。将OD₄₀₅的增加监测为蛋白酶活性的量度。

2）Protazyme AK测定：

底物：Protazyme AK片剂（交联和染色的酪蛋白；来自Megazyme公司）

温度：控制的（测定温度）。

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Triton X-100，pH6.5或pH7.0。

通过轻柔搅拌将Protazyme AK片剂悬浮于2.0ml0.01%Triton X-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl测定缓冲液分散在Eppendorf管中，并且放在冰上。添加20μl蛋白酶样品（在0.01%Triton X-100中稀释）。通过将Eppendorf管转移到设到测定温度的Eppendorf热混合器来启动测定。将管在Eppendorf热混合器上以其最高摇速（1400rpm.）孵育15分钟。通过将管转移回冰浴中终止孵育。然后，将管在冰冷离心机中离心几分钟，并且将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。将空白缓冲液（buffer blind）包括在测定中（代替酶）。

3）Suc-AAPX-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPA-pNA（Bachem L-1775）

Suc-AAPR-pNA（Bachem L-1720）

Suc-AAPD-pNA（Bachem L-1835）

Suc-AAPI-pNA（Bachem L-1790）

Suc-AAPM-pNA（Bachem L-1395）

Suc-AAPV-pNA（Bachem L-1770）

Suc-AAPL-pNA（Bachem L-1390）

Suc-AAPE-pNA（Bachem L-1710）

Suc-AAPK-pNA（Bachem L-1725）

Suc-AAPF-pNA（Bachem L-1400）

温度：室温（25℃）

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Triton X-100，pH9.0。

将20μl蛋白酶（在0.01%Triton X-100中稀释）与100μl测定缓冲液混合。测定起始于添加100μl pNA底物（50mg溶解于1.0ml DMSO并且用0.01%Triton X-100进一步稀释45×）。将OD₄₀₅的增加监测为蛋白酶活性的量度。

大豆-玉米粉测定（SMM测定）

使用大豆-玉米粉底物的终点测定用于获得在pH3-7时蛋白酶的活性特征。

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCAPS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Triton X-100，使用HCl或NaOH调节至pH-值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，此时将10ml测定缓冲液与1g大豆-玉米粉（30:70比例）混合。

在添加蛋白酶之前将2mL大豆-玉米粉浆液混合30min，并且在40℃孵育3小时（500rpm）。经由100μl100mM乙酸钠（NaAc）缓冲液（9.565g/lNaAc，1.75g/l乙酸，5mM CaCl₂，0.01%BSA，0.01%Tween20，pH6.0）添加蛋白酶。在离心（10min，4000rpm，0℃）之后收集上清液，并且基于邻苯二醛（OPA）方法使用比色测定来确定蛋白酶活性，该方法基本上根据Nielsen等人（尼耳森（Nielsen）,PM,彼得森（Petersen）,D,戴普曼（Dampmann）,C.用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法（Improved method for determining food proteindegree of hydrolysis），《食品科学杂志》（JFood Sci）,2001,66:642-646）。该测定检测游离的α-氨基基团，并且因此可以将蛋白酶活性测量为吸光度的增加。将各上清液的第一个500μl通过离心（60min，11,000rpm，5℃）经100kDa Microcon过滤器来过滤。将样品在去离子水中稀释10×，并且将各样品的25μl加载在96孔微量滴定板中（5个重复）。最后，将200μlOPA试剂分散在所有孔中，并且将板进行振摇（10sec，750rpm），并且在340nm测量吸光度。将蛋白酶活性的水平计算为酶处理样品与空白样品的吸光度之间的差。

结果提供于以下实例4中。

体外消化测定

使用体外消化测定，在被设计为模拟在单胃动物中消化的设置中，评估蛋白酶对饲料底物（大豆-玉米粉）的作用。

孵育过程由以下过程组成：用猪的胃蛋白酶（SP7000，西格玛-奥瑞奇公司（Sigma-Aldrich）,圣路易斯，密苏里州（MO），美国）在pH3下进行的胃消化阶段，随后是在pH3.8下短暂的十二指肠孵育，以及用胰酶（8xUSB，P-7545，西格玛-奥瑞奇公司，圣路易斯，密苏里州，美国）在pH7.0下进行的小肠孵育。

体外消化是使用基于吉尔森液体处理器（Gilson liquid handler）（Biolab公司，丹麦）的自动化系统进行的。对于每个样品，称量0.8g饲料放入管中，并且将所有的管放在液体处理器中（40℃，500rpm）。自动地进行溶液的添加以及pH的测量。在时间0min处，添加4.1mL HCl（24mM CaCl₂）以使溶液达到pH3.0。在时间30min处，添加0.5ml HCl（24mM CaCl₂，3000U胃蛋白酶/g饲料）以及100μL的100mM乙酸钠缓冲液（258.6g NaAc/升，0.57%乙酸，pH6.0）。在时间90min处，添加900μL NaOH以达到pH～3.8，并且在时间120min处，添加400μL的含6.5mg胰酶/g饲料的1M NaHCO₃溶液，导致溶液pH为6.8。时间在时间30、60、90、115、120和180min处测量pH。在时间30min处经由100μl NaAc添加测试蛋白酶。

在测定中，将使用LECO FP-528蛋白质/氮分析仪测量的可溶粗蛋白水平（N×6.25）用作蛋白酶效力的指示。

统计分析：使用方差分析（ANOVA）程序进行所记录参数的统计学分析，并且使用由ANOVA程序提供的杜凯氏检验（Tukey test）（α=0.05）进行均值比较（SAS，年度许可窗口的5管理者指南（5Administrators Guide to Annually Licensed Windows），麦金托什（Mackintosh），以及Linux版本，Release5.1。SAS，卡协会里（Cary），NC.（2003））。

结果提供于以下实例5中。

菌株

立枯韩国生工菌，分离物O67P2，是分离自来自英国的在1990年从华威大学（Warwick University）获得的土壤样品。

明矾韩国生工菌，分离物O5C3Y，是分离自来自中国的在2009年在与昆明的云南微生物研究所的接触下提供至诺维信的样品。

实例1：

立枯韩国生工菌和明矾韩国生工菌基因组的DNA制备和测序

立枯韩国生工菌和明矾韩国生工菌的染色体DNA是通过QIAamp DNA血液迷你试剂盒（凯捷公司（Qiagen），希尔登（Hilden），德国）分离的。将各菌株的5ug的染色体DNA寄出以用于在瑞士的FASTERIS SA公司进行基因组测序。通过Illumina测序来对基因组进行测序。将基因组序列针对分泌型S1蛋白酶和经鉴定的两种S1蛋白酶（SEQ ID:1/SEQ ID:2和SEQID:3/SeqID:4）进行分析。

立枯韩国生工菌和明矾韩国生工菌S1肽酶的表达

将线性整合载体系统用于分别来自立枯韩国生工菌（SEQ ID NO:1）和明矾韩国生工菌（SEQ ID NO:3）的两种S1肽酶基因的表达克隆。线性整合构建体是通过在两种枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因连同强启动子和氯霉素抗性标记进行融合得到的PCR融合产物。融合是通过SOE PCR得到的（霍尔顿（Horton）,R.M.,洪特（Hunt）,H.D.,霍（Ho）,S.N.,普伦（Pullen）,J.K.和皮斯（Pease）,L.R.（1989）不使用限制性酶工程化杂合基因，通过重叠延伸进行基因剪接（Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymes,gene splicing by overlap extension）《基因》（Gene）77:61-68）。SOE PCR方法还描述于专利申请WO2003095658中。在三联启动子系统（如WO99/43835中所述）的控制下表达基因，该启动子系统由地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子（amyL），解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子（amyQ）和包括稳定化序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记物（描述于例如戴德瑞奇森（Diderichsen）,B.；普尔森（Poulsen）,G.B.；乔耳金森（Joergensen）,S.T.；对于枯草芽孢杆菌有用的克隆载体（A useful cloning vector for Bacillus subtilis），《质粒》（Plasmid）30:312（1993）中）。通过同源重组将最终的基因构建体整合在芽孢杆菌染色体上进入果胶裂解酶基因座。

将两个基因的基因片段，用针对来自立枯韩国生工菌的S1蛋白酶的特异性引物（KS-正向（SEQ ID NO:9）和KS-反向（SEQ ID NO:10））以及针对来自明矾韩国生工菌的S1蛋白酶的特异性引物（KA-正向（SEQ ID NO:11）和KA-反向（SEQ ID NO:12）），从两个菌株的染色体DNA进行扩增。从菌株iMB1361的基因组DNA，用引物260558（SEQ ID NO:13）和iMB1361Uni2（SEQ ID NO:14）扩增上游侧翼片段，并且用引物260559（SEQ ID NO:15）和oth435（SEQ ID NO:16）扩增下游侧翼片段（描述于专利申请WO2003095658中）。

用迟缓芽孢杆菌分泌信号（具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA（SEQ ID:17））替代天然分泌信号来表达两种S1肽酶。该信号位于上游侧翼片段上。这些正向引物被设计为使得这些基因从信号肽切割位点扩增，并且它们具有26bp突出，并且这些反向引物包含由24-27bp组成的突出（这些突出以斜体显示于下表中）。这些突出各自与两个线性载体片段的一者或另一者的部分互补，并且在这些基因片段和载体片段组装时使用（描述于下文）。所有的使用的引物列于下表2中。

根据制造商的说明书，使用校对聚合酶PHUSION^TMDNA聚合酶（Finnzymes公司，芬兰）来扩增基因片段。根据标准程序（遵照制造商的推荐），用“扩张高保真PCR系统（ExpandHigh Fidelity PCR System）”（罗氏应用科学公司（Roche-Applied-Science））扩增这两种侧翼DNA片段。对于明矾韩国生工菌S1基因的PCR条件如下：98℃持续30秒，随后35个循环（98℃持续10秒，54℃持续20秒，72℃持续1.5分钟），并且以在72℃持续10分钟的一个循环结束。对于立枯韩国生工菌S1基因的PCR条件如下：98℃持续30秒，随后35个循环（98℃持续10秒，72℃持续20秒，72℃持续45秒），并且以在72℃持续10分钟的一个循环结束。对于两种表达载体，通过重叠延伸（SOE）PCR反应使这3个PCR片段经受随后的剪接，从而将这3个片段组装在一个线性载体构建体中。

这是通过以等摩尔比混合这3个片段来进行的，并且在以下条件下运行新的PCR反应：最初的在94℃2分钟，随后10个循环的（94℃持续15秒，55℃持续45秒，68℃持续5分钟），10个循环的（94℃持续15秒，55℃持续45秒，68℃持续8分钟），15个循环的（94℃持续15秒，55℃持续45秒，68℃持续8分钟，再加上20秒额外的pr循环）。在第一个循环后，添加两个末端引物260558和260559（各自20pMol）。将各PCR产物的两微升转化进枯草芽孢杆菌中。在补充有6μg氯霉素/ml的LB平板上选择转化子。在液体培养中培养各自包含了整合的表达构建体之一的两种重组枯草芽孢杆菌克隆。收获含酶上清液，并且如在实例2中所描述的对这两种酶进行纯化。

表2.所使用的引物

实例2：

蛋白酶的纯化

来自立枯韩国生工菌的S1A蛋白酶的纯化

将培养肉汤进行离心（20000×g，20min），并且将上清液小心地从沉淀物倒出。将上清液通过Nalgene0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至在G25葡聚糖凝胶柱（来自GE医疗公司）上的50mM H₃BO₃、20mM CH₃COOH/NaOH、1mM CaCl₂（pH4.5）中。经G25葡聚糖凝胶转移的酶是轻微浑浊的，并且将其通过GF/A玻璃微纤维过滤器（来自沃特曼（Whatman）公司）进行过滤。将澄清的滤液施加到SP-琼脂糖FF柱（来自GE医疗公司）上，该柱以50mM H₃BO₃、20mMCH₃COOH/NaOH、1mM CaCl₂（pH4.5）平衡。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度（0-->0.5M）进行洗脱超过五个柱体积。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析（使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定）。将蛋白酶峰进行池化，并且将固体硫酸铵添加至池中以达到最终的1.8M（NH₄）₂SO₄的硫酸铵浓度。将经硫酸铵调节的池施加到苯基-琼脂糖FF（高取代（highsub））柱（来自GE医疗公司）上，该柱平衡以100mM H₃BO₃、10mM MES/NaOH、2mM CaCl₂、1.8M（NH₄）₂SO₄（pH6.0）平衡。在用平衡缓冲液充分地洗涤柱之后，将蛋白酶用线性梯度在平衡缓冲液与具有25%（v/v）2-丙醇的100mM H₃BO₃、10mMMES/NaOH、2mM CaCl₂（pH6.0）之间进行洗脱超过八个柱体积。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析（使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定）。将蛋白酶峰进行池化，并且将池转移至在G25葡聚糖凝胶柱（来自GE医疗公司）上的50mM H₃BO₃、20mM CH₃COOH/NaOH、1mM CaCl₂（pH4.5）。将经G25葡聚糖凝胶转移的酶施加到SOURCE S柱（来自GE医疗公司）上，该柱以50mM H₃BO₃、20mM CH₃COOH/NaOH、1mM CaCl₂（pH4.5）平衡。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度（0-->0.5M）进行洗脱超过二十个柱体积。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析（使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定），并且通过SDS-PAGE来对活性部分进行进一步分析。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上仅有一条带可见的情况下，将各部分池化并且转移至G25葡聚糖凝胶柱（来自GE医疗公司）上的100mM H₃BO₃、10mM MES/NaOH、2mM CaCl₂（pH6.0）。经G25葡聚糖凝胶转移的酶是纯化的制品，并且将其用于另外的表征。

来自明矾韩国生工菌的S1A蛋白酶的纯化

将培养肉汤进行离心（20000×g，20min），并且将上清液小心地从沉淀物倒出。将上清液通过Nalgene0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至在G25葡聚糖凝胶柱（来自GE医疗公司）上的10mM琥珀酸/NaOH、1mM CaCl₂（pH5.0）。经G25葡聚糖凝胶转移的酶是轻微浑浊的，并且将其通过GF/A玻璃微纤维过滤器（来自沃特曼公司（Whatman））进行过滤。将澄清的滤液施加至SP-琼脂糖FF柱（来自GE医疗公司），该柱以10mM琥珀酸/NaOH、1mM CaCl₂（pH5.0）平衡。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度（0-->0.5M）进行洗脱超过五个柱体积。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析（使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定）。将蛋白酶峰进行池化，并且将固体硫酸铵添加至池中以达到最终的1.2M（NH₄）₂SO₄的硫酸铵浓度。将经硫酸铵调节的池施加到苯基-Toyopearl柱（来自TosoHaas公司），该柱以100mM H₃BO₃、10mM MES/NaOH、2mM CaCl₂、1.2M（NH₄）₂SO₄（pH6.0）平衡。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性（NH₄）₂SO₄梯度（1.2-->0M）进行洗脱超过五个柱体积。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析（使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定），并且通过SDS-PAGE来对活性部分进行进一步分析。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上仅有一条带可见的情况下，将各部分池化并且将池转移至G25葡聚糖凝胶柱（来自GE医疗公司）上的10mM琥珀酸/NaOH、1mM CaCl₂（pH5.0）。将经G25葡聚糖凝胶转移的酶施加到SOURCE S柱（来自GE医疗公司），该柱以10mM琥珀酸/NaOH、1mM CaCl₂（pH5.0）平衡。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用10mM琥珀酸/NaOH、1mM CaCl₂、0.5M NaCl（pH5.0）进行阶跃洗脱。来自柱的洗脱峰是纯化的制品，并且将其用于另外的表征。

实例3：

来自韩国生工菌属的S1A蛋白酶的表征

使用Suc-AAPF-pNA测定以用于获得pH-活性特征和pH-稳定性特征（在指示的pH值下在2小时之后的残留活性）。对于pH稳定性特征，将蛋白酶在不同的测定缓冲液中稀释10×以达到这些缓冲液的pH值，并且然后在37℃孵育2小时。在孵育之后，在针对残留活性进行测定之前，将蛋白酶孵育的pH通过在pH9.0的测定缓冲液中稀释转移至相同的pH值。使用Protazyme AK测定以获得在pH6.5（立枯韩国生工菌）或在pH7.0（明矾韩国生工菌）下的温度-活性特征。使用Suc-AAPX-pNA测定和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得酶在pH9.0下的P1特异性。

结果示于下表3-6中。对于表3，这些活性是相对于酶的最适pH而言的。对于表4，这些活性是相对于保持在稳定条件（5℃，pH9.0）下的样品的残留活性。对于表5，这些活性是相对于这些酶的在pH6.5或pH7.0下的最适温度而言的。对于表6，这些活性是相对于这些酶的最佳底物（Suc-AAPF-pNA）而言的。

表3：pH-活性特征

表4：pH-稳定性特征（在37℃下在2小时之后的残留活性）

表5：在pH6.5或pH7下的温度活性特征

表6：在pH9下P1对10种Suc-AAPX-pNA底物的特异性

来自立枯韩国生工菌的S1A蛋白酶的其他特征

抑制剂：PMSF。

如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是M_r=23kDa。

通过完整分子量分析（Intact molecular weight analysis）所确定的分子量是18900.5Da。

成熟序列（来自MS-EDMAN数据和P23BSS序列）是如在SEQ ID NO:2中所指示的。

从这个成熟序列计算的分子量是18900.5Da。

来自明矾韩国生工菌的S1A蛋白酶的其他特征

抑制剂：PMSF。

如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是M_r=21kDa。

通过完整分子量分析所确定的分子量是19078.1Da。

成熟序列（来自MS-EDMAN数据和P23XDA序列）是如在SEQ ID NO:4中所指示的。

从这个成熟序列计算的分子量是19077.7Da。

实例4

在大豆-玉米粉测定（SMM测定）中的蛋白酶活性

使用大豆-玉米粉测定来描述蛋白酶对动物饲料的相关底物的活性。结果示于下表7中。每个蛋白酶的最大活性被设定为1.00，并且将其他值表示为相对于最大活性的值。相比于10R，本发明的蛋白酶显示对于大豆-玉米粉的更低的pH最适值，以及在从3-7的宽生理pH范围内更高的相对活性。这指示本发明的蛋白酶在猪和家禽的整个消化道中水解饮食蛋白质的可能性。在胃肠道中的pH是从猪的胃以及家禽的前胃和砂囊中的酸性（典型地为pH2-4）到在家禽的嗉囊中的pH4-6以及在猪和家禽的小肠中的pH6-7而变化。

表7：在pH3.0、4.0、5.0、6.0和7.0下对于大豆-玉米粉的相对蛋白酶活性

实例5

体外消化测定

进行模拟的胃肠消化测定以评估蛋白酶增加单胃动物中蛋白质消化率的潜力。将蛋白酶的作用测量为蛋白质溶解的增加。结果示于下表8中。来自立枯韩国生工菌的S1A蛋白酶增加了样品中的可溶性蛋白质的量，指示蛋白质的水解，然而未达到如对于蛋白酶10R的相同水平。对此的合理解释是：如被设计用于此研究的体外消化孵育包括在pH7下的4小时孵育以及在pH≤6下的仅11/2小时的孵育，在pH≤6的范围中本发明的立枯韩国生工菌S1A蛋白酶具有超越蛋白酶10R的优势。

表8：在用立枯韩国生工菌S1A蛋白酶或蛋白酶10R处理之后，作为体外消化样品中 的全部蛋白质的百分比的可溶性蛋白质水平

¹不同的上标字母指示显著的差异（P<0.05）。

实例6：热稳定性

将蛋白酶（如在实例2中所描述的进行纯化的）的蛋白质样品的等分部分使用预先包装的PD-10柱进行脱盐或缓冲液改变为20mM乙酸钠（pH4.0）中，或在4℃在2-3小时步骤中用2×500ml20mM乙酸钠（pH4.0）进行透析，随后为过夜步骤。将样品进行0.45μm过滤，并且用缓冲液稀释至大约2A280单位。在差示扫描量热法（DSC）中将透析缓冲液用作参照。将样品使用真空抽吸并且搅拌大约10分钟来脱气。

DSC扫描是在MicroCal VP-DSC上从20-90℃以1.5℃/min的恒定速率进行的。数据处理是使用MicroCal Origin软件（4.10版本）进行的，并且变性温度T_d（也称为熔解温度T_m）被定义为在温谱图中峰值的顶点时的温度。

实例7：蒸汽稳定性

在蒸汽处理之后蛋白酶的残留活性可以使用以下测定来评估。

在这些实验中，使用了改变的设置，由此蒸汽是从蒸汽生成器提供的并且被导入盒中。样品将放置在盘上的样品通过抽屉插入到盒中，此时温度已经达到大约93-94℃。在插入样品时，温度下降4℃。孵育进行30秒，同时温度维持为大致恒定的90℃。此后，将盘快速地从盒中移除，将样品放置在冰上，重悬浮，并且使用例如Suc-AAPF-pNA或邻苯二醛（OPA）测定来针对蛋白酶活性进行评估。将每个酶样品与没有经过蒸汽处理的类似样品进行比较以便计算残留活性。

实例8：造粒稳定性测试

酶粒化是按照如在美国专利号4,106,991实例1中所描述的方式进行的。将获得颗粒在流化床中干燥至低于1%的水含量，并且进行过筛以获得具有粒度范围250μm至850μm的产物。最终，将产物用棕榈油和碳酸钙按照如在美国专利号4,106,991实例22中所描述的方式进行包衣。

在一个小的水平混合器中，将大约50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在一个更大的水平混合器中，将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。以大约300kg/小时的速率，从混合器将饲料导入调节器（一种具有蒸汽注入的级联混合器）中。通过注入蒸汽，调节器将饲料加热至95℃（在出口测量）。在调节器中的驻留时间是30秒。从调节器将饲料导入配备有3.0×35mm水平冲模的西蒙黑森压制机（Simon Heesen press）中，并且压制为具有15mm左右长度的颗粒。在压制之后，将颗粒放置在制冷器中并且冷却15分钟。

使用Suc-AAPF-pNA测定在造粒之前对蛋白酶活性进行测量，并且在造粒之后对饲料颗粒中的蛋白酶活性进行测量。通过比较颗粒饲料中的蛋白酶活性相对于非颗粒饲料中的活性来确定造粒稳定性。

在此描述的和要求保护的本发明并非由在此所披露的特定方面来限定范围，因为这些方面旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等价的方面都旨在处于本发明的范囷之内。实际上，根据先前描述，除了在此所显示和描述的那些以外，本发明的各种改变对本领域的技术人员来说将变得清楚。这样的改变也旨在落在所附权利要求书的范围之内。在冲突的情况下，包括定义的本披露将优先。

Claims (26)

1.一种选自下组的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该组由以下各项组成：

(a)由SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4的成熟多肽构成的一种多肽；

(b)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列构成的多核苷酸编码的一种多肽；和/或

(c)一种变体，该变体由SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4的成熟多肽的不多于1个氨基酸的取代构成；

其中所述多肽来源于立枯韩国生工菌或明矾韩国生工菌；

其中SEQ ID NO:2的成熟多肽指SEQ ID NO:2中的第1-188位氨基酸；SEQ ID NO:4的成熟多肽指SEQ ID NO:4中的第1-189位氨基酸；SEQ ID NO:1中的成熟多肽编码序列指其中的第316-879位核苷酸；SEQ ID NO:3中的成熟多肽编码序列指其中的第316-882位核苷酸。

2.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸构成。

3.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：4第1-189位氨基酸构成。

4.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少90％蛋白酶活性。

5.权利要求1所述的多肽，其中催化三联体为SEQ ID NO：2成熟多肽和SEQ ID NO：4成熟多肽的His-33、Asp-63和Ser-145。

6.权利要求1所述的多肽，其中所述取代为保守取代。

7.权利要求6所述的多肽，其中所述保守取代选自Ala/Ser，Val/Ile,Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly。

8.权利要求1所述的多肽，使用Suc-AAPF-pNA分析在37℃测定时，相比于10R蛋白酶，所述多肽在pH5-7范围内具有更高的相对蛋白酶活性。

9.权利要求1所述的多肽，使用大豆-玉米粉分析在37℃测定时，相比于10R蛋白酶，所述蛋白酶在pH3-6范围内具有更高的相对活性。

10.一种组合物，包括如权利要求1-9中任一项所述的多肽。

11.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1-9中任一项所述的多肽。

12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一种表达宿主细胞内生产的一个或更多个控制序列。

13.一种重组表达宿主细胞，包括如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的生产的一个或更多个控制序列。

14.一种生产如权利要求1-9中任一项所述的多肽的方法，包括：

(a)在有益于生产该多肽的条件下，培养一种细胞，该细胞在处于其野生型形式下生产该多肽；并且

(b)回收该多肽。

15.一种生产如权利要求1-9中任一项所述的多肽的方法，包括：

(a)在有益于生产该多肽的条件下，培养如权利要求13所述的宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

16.如权利要求1-9中任一项所述的至少一种多肽在以下项中的用途

(i)动物饲料；

(ii)动物饲料添加剂；

(iii)用于在动物饲料中使用的一种组合物的制备；

(iv)改进一种动物饲料的营养价值；

(v)增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白质；

(vi)增加动物饮食中的蛋白质的水解程度；和/或

(vii)蛋白质的处理。

17.一种用于改进一种动物饲料的营养价值的方法，其中将如权利要求1-9中任一项所述的至少一种多肽添加至该饲料。

18.一种动物饲料添加剂，包括

(i)如权利要求1-9中任一项所述的至少一种多肽；以及

(ii)至少一种脂溶性维生素，和/或

(iii)至少一种水溶性维生素，和/或

(iv)至少一种痕量矿物质。

19.如权利要求18所述的动物饲料添加剂，进一步包括一种或多种淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混合物。

20.一种动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白质含量并且包括如权利要求1-9中任一项所述的至少一种多肽。

21.一种用于蛋白质处理的方法，包括将如权利要求1-9中任一项所述的至少一种多肽添加至至少一种蛋白质或蛋白质来源的步骤。

22.如权利要求21所述的方法，其中大豆被包括在该至少一种蛋白质来源之中。

23.如权利要求1-9中任一项所述的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。

24.一种洗涤剂组合物，包括如权利要求1至9中任一项所述的至少一种多肽。

25.如权利要求24所述的洗涤剂组合物，其中该组合物包括一种或更多种另外的酶。

26.如权利要求25所述的洗涤剂组合物，其中这些另外的酶选自下组，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶(xanthanases)、过氧化物酶、卤代加过氧酶(haloperoxygenases)、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。