CN102112611A - 新型蛋白酶及其应用 - Google Patents

Abstract

一种新型蛋白酶，其由以下(a)～(d)的氨基酸序列构成：(a)序列号1所示的氨基酸序列；(b)在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；(c)序列号3所示的氨基酸序列；或(d)在序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。该新型蛋白酶在高温且高碱性条件下具有高活性，对于蛋白变性剂、表面活性剂的稳定性高，作为洗涤剂用蛋白酶非常有用。

Description

新型蛋白酶及其应用

技术领域

本发明涉及新型蛋白酶及其应用，详细而言，涉及在高温且高碱性条件下具有高活性的新型蛋白酶及其前体、编码它们的多核苷酸以及它们的应用。

背景技术

蛋白酶是催化肽键水解的酶的总称，在微生物、动物和植物中广泛分布。另外，蛋白酶是在洗涤剂、皮革加工、食品加工、功能性肽生产中广泛使用的代表性的工业用酶。尤其是从预防医疗器具的二次感染的观点出发，利用蛋白酶分解感染性蛋白质污垢正在成为难以替代的技术。在作为工业用酶的实用方面最受到重视的是酶的稳定性和其在使用条件下的活性的高低。尤其是很多情况下要求在物理、化学上具有较高的热稳定性，因此工业用蛋白酶广泛使用耐热性蛋白酶。目前，作为工业用蛋白酶，已知枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、蛋白酶K等枯草杆菌蛋白酶家族蛋白酶(subtilisin family protease)。其中，美国Genencore公司出售的Prionzyme，作为在已实用化的蛋白酶中显示出最高稳定性的酶被用于器具清洗用途，以预防作为CJD(克雅氏病)等朊病毒病的病原体的异常型朊病毒的感染。但是，其最适作用条件为40～60℃、pH8～10，因而期望能够在更高温度下使用的蛋白酶的实用化。因此，为了发现能够在高温且高碱性条件下使用的新型蛋白酶，进行了大量的尝试。

例如，本发明人发现了一种蛋白酶(以下称为“Tk-枯草杆菌蛋白酶”(Tk-subtilisin))，其属于来源于超嗜热菌之一的Thermococcuskodakaraensis KOD1株的枯草杆菌蛋白酶家族，并且报道了Tk-枯草杆菌蛋白酶在pH9.5、温度80℃～100℃的条件下显示出最高的活性，以及在公知的蛋白酶中具有最高的热稳定性(参见非专利文献1和2)。另外，专利文献1中公开了同样来源于Thermococcus kodakaraensis KOD1株的耐热性蛋白酶，并且记载了以下内容：该耐热性蛋白酶的最适温度在80℃附近，对于耐热性，在120分钟的孵育后，在70℃下确认到约75％的残存活性，在80℃下确认到约50％的残存活性，对于耐碱性，在120分钟的孵育后，在pH11的条件下确认到90％以上的残存活性，在pH11.5的条件下确认到约85％的残存活性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-6846号公报

非专利文献

非专利文献1：Kannan，Y.，Koga，Y.，Inoue，Y.，Haruki，M.，Takagi，M.，Imanaka，T.et al.Active subtilisin-like protease from ahyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence.Appl.Environ.Microbiol.67，2445-2552.(2001).

非专利文献2：Pulido，M.，Saito，K.，Tanaka，S.，Koga，Y.，Takano，K.& Kanaya，S.Ca²⁺-dependent maturation of Tksubtilisin from ahyperthermophilic archaeon：propeptide is a potent inhibitor of the maturedomain but is not required for its folding.Appl.Environ.Microbiol.72，4154-4162.(2006).

发明内容

虽然发现了上述非专利文献1和2中记载的蛋白酶或专利文献1中记载的耐热性蛋白酶那样能够在高温且高碱性条件下使用的新型蛋白酶，但它们尚未达到实用化的程度。另外，在很多情况下，工业用蛋白酶是添加到洗涤剂中而使用的，因而要求其在表面活性剂的存在下也稳定，并且能够发挥活性。因此，进一步发现新型蛋白酶并明确其功能、从而使其作为工业用蛋白酶实用化的研究和开发成为目前该技术领域的重大课题。

因此，本发明的目的在于提供一种新型蛋白酶，其在高温且高碱性条件下具有高活性，对于蛋白变性剂、表面活性剂的稳定性高，作为洗涤剂用蛋白酶非常有用。

本发明为了解决上述课题，包含以下发明。

[1]一种蛋白酶，其由以下(a)～(d)中任一项所述的氨基酸序列构成：

(a)序列号1所示的氨基酸序列；

(b)在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；

(c)序列号3所示的氨基酸序列；

(d)在序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

[2]如上述[1]所述的蛋白酶，其在以偶氮酪蛋白为底物、在pH7的条件下反应20分钟时的反应最适温度为100℃以上。

[3]如上述[1]所述的蛋白酶，其在pH7的50mM Tris-HCl中、100℃下处理90分钟时，具有40％以上的残存活性。

[4]如上述[1]所述的蛋白酶，其在含有5％十二烷基硫酸钠的pH8的20mM Tris-HCl中、55℃下处理60分钟时，具有80％以上的残存活性。

[5]如上述[1]所述的蛋白酶，其在80℃的反应温度下、以Suc-AAPF-pNA为底物时，Km值为0.1～1mM。

[6]一种前体，其为上述[1]～[5]中任一项所述的蛋白酶的前体，其由以下(e)或(f)所述的氨基酸序列构成：

(e)序列号5所示的氨基酸序列；

(f)在序列号5所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

[7]一种多核苷酸，其编码上述[1]～[5]中任一项所述的蛋白酶。

[8]如上述[7]所述的多核苷酸，其为由序列号2或4所示的碱基序列构成的多核苷酸，或者

与由序列号2或4所示的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码蛋白酶的多核苷酸。

[9]一种多核苷酸，其编码上述[6]所述的前体。

[10]如上述[9]所述的多核苷酸，其为由序列号6所示的碱基序列构成的多核苷酸，或者

与由序列号6所示的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码前体的多核苷酸。

[11]一种表达载体，其包含上述[7]～[10]中任一项所述的多核苷酸。

[12]一种转化体，其中，导入有上述[11]所述的表达载体。

[13]一种抗体，其与上述[1]～[5]中任一项所述的蛋白酶特异性结合。

[14]一种洗涤剂，其含有上述[1]～[5]中任一项所述的蛋白酶。

发明效果

根据本发明，能够提供一种蛋白酶，其与以往相比在高温且高碱性条件下具有高活性，对于蛋白变性剂、表面活性剂的稳定性高，能够分解低浓度的底物。该蛋白酶作为配合到在高温且高碱性条件下使用的各种洗涤剂中而使用的蛋白酶非常有用。

附图说明

图1的(a)是表示本发明的前体(proTk-SP)的SDS-PAGE结果的图像，(b)是表示将proTk-SP在80℃下孵育120分钟而得到的本发明的蛋白酶的SDS-PAGE结果的图像。

图2是表示利用MALDI-TOF MS进行的本发明的蛋白酶(Tk-SP)的分子量分析结果的图。

图3是表示本发明的蛋白酶(Tk-SP)的N末端分析结果的图。

图4是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)的pH依赖性和缓冲液依赖性进行研究的结果的曲线图。

图5是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)的温度依赖性进行研究的结果的曲线图。

图6是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)的热稳定性进行研究的结果的曲线图。

图7是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)对于尿素(Urea)的稳定性进行研究的结果的曲线图。

图8是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)对于盐酸胍(GdnHCl)的稳定性进行研究的结果的曲线图。

图9是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)对于TritonX-100的稳定性进行研究的结果的曲线图。

图10是表示对本发明的耐热性蛋白酶(Tk-SP)对于吐温20的稳定性进行研究的结果的曲线图。

图11是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)对于十二烷基硫酸钠(SDS)的稳定性进行研究的结果的曲线图。

图12是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)对于EDTA的稳定性进行研究的结果的曲线图。

图13是表示对钙离子给本发明的蛋白酶(Tk-SP)的稳定性带来的效果进行研究的结果的曲线图。

图14是表示对本发明的蛋白酶(Tk-SP)的结构形成中的钙离子要求性进行研究的结果的曲线图。

具体实施方式

[蛋白酶及其前体]

(1)蛋白酶的获得

本发明的蛋白酶是来源于超嗜热菌Thermococcus kodakaraensisKOD1株(Morikawa M等，Appl Environ Microbiol，1994 Dec；60(12)：4559-66，以下称为“KOD1株”)的新型蛋白酶。KOD1株保藏于独立行政法人理化学研究所生物资源中心，其保藏号为JCM12380。KOD1株的全基因组信息已经被解析，确定了2036个蛋白质编码区域(CDS)，其中约半数(1165个)的CDS标注了注释(Fukui T等，Genome Res，2005Mar；15(3)：352-63)。另外，KOD1株的全基因组2088737个碱基的序列收录于DDBJ/EMBL/GenBank中，其收录号为AP006878。

本发明人根据KOD1株的基因组信息，着眼于预测为编码枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶前体的碱基序列(收录号AP006878区域：1484233…1486224、序列号8)，并确定了构成该碱基序列所编码的全长蛋白质中具有蛋白酶活性的成熟蛋白质的部分序列。通常，枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶具有较长的前导-前(pre-pro)序列。前导(pre)序列(也称为信号序列)是酶向菌体外分泌所需的序列，前(pro)序列是酶形成活化型立体结构时所需的序列。因此，本发明人基于该碱基序列(序列号8)，对预测为编码包含前序列和成熟序列、但除去前导序列(信号序列)的蛋白酶前体的区域的DNA进行了扩增。将所得到的DNA片段插入表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中，对蛋白质(前体)进行表达。将得到的前体进行孵育(例如，在pH9、温度80℃的条件下孵育120分钟)使其进行加工(成熟化)，由此获得具有蛋白酶活性的成熟蛋白质、即本发明的蛋白酶。

本发明的蛋白酶只要由以下(a)～(d)中任一项所述的氨基酸序列构成即可。

(a)序列号1所示的氨基酸序列；

(b)在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；

(c)序列号3所示的氨基酸序列；

(d)在序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

序列号1所示的氨基酸序列相当于根据上述预测为编码枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶前体的碱基序列(收录号AP006878区域：1484233…1486224、序列号8)而推定的氨基酸序列(收录号BAD85878、序列号7)的第137位～第562位。另外，序列号3所示的氨基酸序列相当于根据上述预测为编码枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶前体的碱基序列(序列号8)而推定的氨基酸序列(序列号7)的第137位～第563位。

另外，本发明的前体是上述本发明的蛋白酶的前体，该前体只要由以下(e)或(f)所述的氨基酸序列构成即可。

(e)序列号5所示的氨基酸序列；

(f)在序列号5所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

另外，本说明书中，“前体”是指不具有前导序列、但包含前序列和成熟序列的蛋白酶前体。

序列号5所示的氨基酸序列相当于根据上述预测为编码枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶前体的碱基序列(序列号8)而推定的氨基酸序列(序列号7)的第24位～第663位。将该前体的氨基酸序列(序列号5)的第1位～第113位和第540位～第640位除去后得到的是由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白酶，将第1位～第113位和第541位～第640位除去后得到的是由序列号3所示的氨基酸序列构成的蛋白酶。

“缺失、取代或添加一个或多个氨基酸”是指，利用定点突变法等公知的突变肽制作方法，使能够缺失、取代或添加的程度的数量(优选为10个以下、更优选为7个以下、进一步优选为5个以下)的氨基酸发生缺失、取代或添加。这种突变蛋白质不限于具有通过公知的突变多肽制作方法人为导入的突变的蛋白质，也可以是对天然存在的蛋白质进行分离纯化而得到的蛋白质。蛋白质的氨基酸序列中的若干个氨基酸可以容易地进行改变而不会显著影响该蛋白质的结构或功能，这在本领域中是公知的。此外，还公知的是：不仅对于人为改变是如此，在天然的蛋白质中，也存在不显著改变该蛋白质的结构或功能的突变体。

优选的突变体具有保守性或非保守性的氨基酸取代、缺失或添加。优选沉默取代、缺失和添加，特别优选保守性取代。这些突变不会改变本发明的多肽的活性。被看作代表性的保守性取代的是：脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的一个氨基酸取代为其它氨基酸；羟基残基Ser和Thr的交换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺基残基Asn和Gln间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳香族残基Phe、Tyr间的取代。

本发明的蛋白酶和前体可以含有附加性的肽。作为附加性的肽，可以列举例如多组氨酸标签(His-tag)或Myc、FLAG等表位标记肽。

本发明的蛋白酶和前体可以如下制造。(I)可以通过培养产生该蛋白酶的细菌并进行分离和纯化来制造。或者，(II)可以通过利用公知的基因工程学方法从细菌中分离编码本发明的蛋白酶或前体的基因，构建重组表达载体，并将其导入适当的宿主细胞中，以重组蛋白的形式进行表达来制造。或者，(III)可以利用体外(in vitro)转录-翻译系统来制造。本发明的蛋白酶制造中可以使用的细菌只要能够产生本发明的蛋白酶，则没有特别限定。作为优选的细菌，可以列举上述KOD1株。

使用KOD1株进行上述(I)的方法时，例如可以在Morikawa.等，Appl.Environ.Microbiol.60：4559-4566.(1994)中记载的培养条件下进行KOD1株的培养。培养数天后，利用公知的方法从分离菌体后残留的培养液中进行分离和纯化即可。具体而言，可以列举：例如，盐析法、沉淀法、超滤法等分离方法；例如，离子交换层析法、等电点层析法、疏水性层析法、凝胶过滤层析法、吸附层析法、亲和层析法、反相层析法等纯化方法；以及它们的组合；等。

对于上述(II)的方法，在后述的[多核苷酸]、[表达载体]和[转化体]中进行详细说明。

在利用上述(III)的方法进行时，可以使用编码本发明的蛋白酶或前体的DNA片段和公知的体外转录-翻译系统(例如，使用大肠杆菌、小麦胚芽细胞、兔视网膜细胞的无细胞抽提液的系统)。

所得到的蛋白酶或前体的鉴定可以使用公知的方法进行。例如，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将所得到的蛋白酶进行分离，并转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用考马斯亮蓝将膜染色后，切出目标蛋白质的条带。通过MALDI-TOF MS分析所切出的条带的胰蛋白酶消化产物，利用肽质量指纹谱分析能够进行鉴定。另外，例如，可以使用自动肽测序仪确定氨基酸序列。

(2)蛋白酶的生物化学特性

(i)最适pH(参见实施例2)

以Suc-AAPF-pNA为底物，在20℃孵育10分钟时的最适pH至少在pH6～11.5的范围内，可以预测到即使在pH超过11.5的范围内也显示出高活性。因此，本发明的蛋白酶适合在pH6以上的多样化的pH环境中使用。

(ii)最适温度(参见实施例3)

以偶氮酪蛋白为底物，在pH7的条件下反应20分钟时的最适温度为100℃以上。因此，本发明的蛋白酶适合在高温环境下使用，例如如果配合到用于分解感染性蛋白质的医疗器具用洗涤剂等中，则可以期待发挥优异的效果。

(iii)热稳定性(参见实施例4)

在溶液中、100℃下处理90分钟时具有40％以上的残存活性，在90℃下处理180分钟时具有80％以上的残存活性。在80℃下处理180分钟时，活性不降低。这样，本发明的蛋白酶具有非常高的热稳定性，因此适合在高温环境下使用。

(iv)对于蛋白变性剂、表面活性剂和螯合剂的稳定性(参见实施例5)

在含有8M尿素的20mM Tris-HCl(pH8)中、55℃下处理60分钟时，具有80％以上的残存活性。

在含有2M盐酸胍的20mM Tris-HCl(pH8)中、55℃下处理60分钟时，具有60％以上的残存活性。

在含有10％TritonX-100的20mM Tris-HCl(pH8)中、55℃下处理60分钟时，具有95％以上的残存活性。

在含有10％吐温20的20mM Tris-HCl(pH8)中、55℃下处理60分钟时，具有95％以上的残存活性。

在含有5％十二烷基硫酸钠的20mM Tris-HCl(pH8)中、55℃下处理60分钟时，具有80％以上的残存活性。

在含有10mM EDTA的20mM Tris-HCl(pH8)中、55℃下处理60分钟时，活性不降低。

因此，本发明的蛋白酶对于各种蛋白变性剂、表面活性剂、螯合剂具有高稳定性，因此能够添加到含有蛋白变性剂、表面活性剂、螯合剂的组合物中使用，具有能够作为工业用蛋白酶在广泛的用途中使用的优点。

(v)Km值(参见实施例7)

在80℃的反应温度下、以Suc-AAPF-pNA为底物时，Km值为0.1～1mM。该值为上述的Tk-枯草杆菌蛋白酶(参见非专利文献1和2)的Km值的约1/10，表明与Tk-枯草杆菌蛋白酶相比，能够有效地分解低浓度的底物。因此，能够适合用于感染性蛋白质的二次感染成为问题的医疗器具用洗涤剂等用途。

(vi)结构形成中的钙离子非要求性(参见实施例8)

本发明的蛋白酶在结构形成中不需要钙离子，即使在不存在钙离子的状态下也能够稳定地发挥蛋白酶活性。与同样来源于Thermococcus kodakaraensis KOD1株的蛋白酶Tk-枯草杆菌蛋白酶具有非常强的钙要求性形成对照，这是本发明的蛋白酶的特征性的特性。因此，本发明的蛋白酶具有即使在例如含有螯合剂作为添加剂的洗涤剂中也能够稳定地发挥功能的极其优异的优点。

另外，本发明的蛋白酶的活性测定可以根据后述的实施例的记载进行。即，以Suc-AAPF-pNA或偶氮酪蛋白等为底物，进行肽键的分解反应，由吸光度对此时游离的色素量进行定量。由此，能够计算出被酶切断的肽键的量，从而测定酶活性。

[多核苷酸]

本发明的多核苷酸只要是编码上述本发明的蛋白酶的多核苷酸即可。具体而言，可以列举以下(A)～(D)的多核苷酸。

(A)编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白酶的多核苷酸；

(B)编码由在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的蛋白酶的多核苷酸；

(C)编码由序列号3所示的氨基酸序列构成的蛋白酶的多核苷酸；

(D)编码由在序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的蛋白酶的多核苷酸。

另外，本发明的多核苷酸只要是编码上述本发明的前体的多核苷酸即可。具体而言，可以列举以下(E)或(F)的多核苷酸。

(E)编码由序列号5所示的氨基酸序列构成的前体的多核苷酸；

(F)编码由在序列号5所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的前体的多核苷酸。

本说明书中，“多核苷酸”可以与“基因”、“核酸”或“核酸分子”交换使用。本发明的多核苷酸可以以RNA(例如，mRNA)的形态或DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)或非编码链(反义链)中的任一种。另外，本发明的多核苷酸也可以在其5’侧或3’侧融合有编码标签标记(标签序列或标记序列)的多核苷酸。

编码本发明的蛋白酶的多核苷酸优选为：由序列号2或4所示的碱基序列构成的多核苷酸，或者与由序列号2或4所示的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码蛋白酶的多核苷酸。

另外，编码本发明的前体的多核苷酸优选为：由序列号6所示的碱基序列构成的多核苷酸，或者与由序列号6所示的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码前体的多核苷酸。

序列号2所示的碱基序列相当于上述预测为编码枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶前体的碱基序列(收录号AP006878区域：1484233…1486224，序列号8)的第409位～第1686位，序列号4所示的碱基序列相当于第409位～第1689位。另外，序列号2所示的碱基序列相当于序列号8的第70位～第1992位。

杂交可以利用Sambrook等在“Molecular Cloning，A LaboratoryManual”(分子克隆实验指南)，第3版，冷泉港实验室(2001)中记载的方法等公知的方法进行。通常，温度越高，盐浓度越低，则严格程度越高(难以杂交)，从而能够获得更相同的多核苷酸。适合的杂交温度根据碱基序列、该碱基序列的长度而异，例如，在使用由编码6个氨基酸的18个碱基构成的DNA片段作为探针的情况下，优选50℃以下的温度。

“在严格条件下杂交”是指，在杂交溶液(含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM的NaCl、15mM的柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特(Denhardt′s)溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA)中、42℃下孵育一晚后，在约65℃下、0.1×SSC中清洗滤膜。

作为本发明的多核苷酸，优选由与序列号2或4所示的碱基序列的互补碱基序列至少80％同源、更优选至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同源的碱基序列构成且编码蛋白酶的多核苷酸。另外，作为本发明的多核苷酸，优选由与序列号6所示的碱基序列的互补碱基序列至少80％同源、更优选至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同源的碱基序列构成且编码前体的多核苷酸。

关于任意特定的多核苷酸相对于例如序列号2所示的碱基序列是否至少有80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同源，可以使用公知的计算机程序(例如，Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，Unix(注册商标)版本8，Genetics Computer Group公司，大学研究园，575塞尔恩斯车道，麦迪逊，WI 53711)来确定。

本发明的多核苷酸不仅包含双链DNA，还包含构成双链DNA的有义链和反义链这样的单链的DNA或RNA。另外，本发明的多核苷酸还可以包含非翻译区(UTR)的序列或载体序列(包含表达载体序列)等序列。

作为获得本发明的多核苷酸的方法，可以列举使用PCR等扩增手段的方法。例如，根据序列号2所示的碱基序列的5’侧和3’侧的序列(或其互补序列)分别设计引物，使用这些引物以基因组DNA或cDNA等为模板进行PCR等，对夹在两引物间的DNA区域进行扩增，由此能够大量获得包含本发明的多核苷酸的DNA片段。

[表达载体]

本发明提供用于制造本发明的蛋白酶的表达载体。本发明的表达载体只要包含编码上述本发明的多肽的多核苷酸则没有特别限定，优选具有RNA聚合酶的识别序列的质粒载体(pSP64、pBluescript等)。作为重组表达载体的制作方法，可以列举使用质粒、噬菌体或柯斯质粒(Cosmid)等的方法，没有特别限定。载体的具体种类没有特别限定，可以适当选择在宿主细胞中能够表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，选择用于切实地表达本发明的多核苷酸的适当的启动子序列，使用将该启动子序列和本发明的多核苷酸插入各种质粒等中而得到的载体作为表达载体即可。

将使用本发明的表达载体转化后的宿主进行培养、栽培或饲育后，按照惯用的手法(例如，过滤、离心分离、细胞的破碎、凝胶过滤层析法、离子交换层析法等)能够从培养物等中回收、纯化本发明的蛋白酶或前体。

表达载体优选含有至少一个选择标记。作为这样的标记，对于真核生物细胞培养而言，可以列举二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因，对于大肠杆菌和其它细菌的培养而言，可以列举四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因。如果使用上述选择标记，则能够确认本发明的多核苷酸是否被导入到宿主细胞中，进而能够确认多核苷酸在宿主细胞中是否切实地表达。或者，可以使本发明的多肽以融合多肽的形式表达，例如，可以使用来源于维多利亚水母的绿色荧光多肽GFP(GreenFluorescent Protein)作为标记，使本发明的多肽以GFP融合多肽的形式表达。

上述宿主细胞没有特别限定，可以优选使用现有公知的各种细胞。具体而言，例如，可以列举大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌、酵母(芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae、裂殖酵母Schizosaccharomycespombe)、线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞、动物细胞(例如，CHO细胞、COS细胞和Bowes黑色素瘤细胞)等。将上述表达载体导入宿主细胞的方法、即转化法也没有特别限定，可以优选使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等现有公知的方法。

[转化体]

本发明提供导入有上述本发明的表达载体的转化体。本说明书中，“转化体”不仅包含细胞、组织或器官，还包含生物个体。另外，作为转化对象的生物也没有特别限定，可以列举作为上述宿主细胞例示过的各种微生物、植物或动物。

本发明的转化体的特征在于，其表达上述本发明的蛋白酶或前体。本发明的转化体优选稳定地表达上述本发明的蛋白酶或前体，但也可以一过性地表达。

[抗体]

本发明提供与上述本发明的蛋白酶特异性结合的抗体。本发明的抗体优选为与本发明的蛋白酶结合、但不与其前体结合的抗体。本发明的抗体能够用于本发明的蛋白酶的检测、分离。

本说明书中，“抗体”是指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和它们的片段(Fab片段、F(ab’)₂片段、Fc片段等))，作为例子，可以列举多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体等，但不限于此。可以根据各种公知的方法(例如，HarLow等、“Antibodies：a laboratory manual(抗体技术实验指南)，冷泉港实验室，纽约(1988)”；岩崎等、“単クロ一ソ抗体ハイブリド一マとELISA(单克隆抗体、杂交瘤和ELISA)、讲谈社(1991)”)来制作抗体。

[蛋白酶的用途]

本发明的蛋白酶与公知的工业用蛋白酶相比，在高温且高碱性条件下具有高活性，对于蛋白变性剂、表面活性剂也具有高稳定性，因而通过配合到在高温下使用的洗涤剂中，能够实现清洗力的增强。另外，由于能够分解低浓度的底物，因而在二次感染成为问题的医疗器具的感染性蛋白质污垢的分解和清洗方面非常有用。即，本发明的蛋白酶可以适合用于医疗器具用洗涤剂、餐具清洗机用洗涤剂、洗衣用洗涤剂等各种洗涤剂。另外，除洗涤剂以外，还能够用于饲料加工、食品加工(鱼油加工、食用肉加工等)、纤维加工、羊毛加工、皮革加工、隐形眼镜清洗、管道清洗等，还可以配合到沐浴剂或脱毛剂中。此外，在由组织或细胞制备DNA等核酸时，可以作为用于对试样进行预处理的蛋白酶使用。

根据本发明，提供含有本发明的蛋白酶的洗涤剂(清洗用组合物)。洗涤剂中的蛋白酶的含量没有特别限定，但由于其活性高、且对表面活性剂稳定，因而少量添加即可发挥高清洗力。作为优选的含量，例如可以列举0.1～10重量％。若含量过少，则无法获得充分的清洗效果，相反地含量过多时，无法获得与含量正正比的清洗效果的提高，因而从经济性的方面考虑不优选。本发明的蛋白酶对于公知的任意洗涤剂均可以配合，而不会改变该洗涤剂的组成。另外，对于含有本发明的蛋白酶的洗涤剂的成分，没有特别限定。作为这样的洗涤剂的代表例，可以列举由选自由以单位洗涤剂重量计为10～50重量％的表面活性剂、0～50重量％的助洗剂、1～50重量％的碱剂或无机电解质、0.1～5重量％的再污染防止剂、酶、漂白剂、荧光染料、抗结块剂和抗氧化剂组成的组中的至少一种以上配合成分构成的洗涤剂。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。另外，在以下实施例中，有时将本发明的蛋白酶称为“Tk-SP”，将其前体称为“proTk-SP”。

[实施例1：新型蛋白酶(Tk-SP)的获得]

1-1.前体(proTk-SP)的表达和纯化

为了表达由Thermococcus Kodakaraensis KOD1株的基因组信息(收录号：AP006878)预测为编码枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶前体的碱基序列(收录号AP006878区域：1484233…1486224、序列号8)的推定氨基酸序列(收录号BAD85878、序列号7)中，除去预测为信号序列(前导序列)的氨基酸序列而包含预测为前序列和成熟序列的部分的前体，设计了用于扩增预测为编码该前体的DNA部分的引物对。即，包含NdeI位点的正向引物(5’-GGCCTTTATCATATGGCCCCCCAGAAG-3’(序列号9))和包含BamHI位点的反向引物(5’-GGCCTTGGATCCTCACCCGTAGTAAAC-3’(序列号10))。以KOD1株的基因组DNA为模板，使用上述引物对进行PCR，扩增DNA片段。所得到的DNA片段用NdeI和BamHI消化，将所得到的1.9kb的DNA片段连接到pET25b(Novagen公司制造)的NdeI/BamHI位点，构建pET25b-proTk-SP。使用该质粒(pET25b-proTk-SP)转化大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus，得到大量表达proTk-SP的菌株。

使用含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基在37℃进行培养。在OD₆₀₀达到0.8的阶段，添加终浓度为1mM的IPTG，再继续培养4小时。收集菌体，悬浮于20mM Tris-HCl(pH9.0)中，超声波破碎后，进行离心分离(30000×g，30分钟)。在上清中添加30％硫酸铵，通过离心分离(30000×g，30分钟)得到沉淀。将该沉淀溶解于20mM Tris-HCl(pH7.0)中，为了除去硫酸铵，对20mM Tris-HCl(pH7.0)进行透析。使用透析后的上清，通过阴离子交换柱Hitrap Q(GEHealthcare公司)进行纯化。

1-2.成熟蛋白质(Tk-SP)的获得、分子量分析和N末端分析

(i)利用SDS-PAGE对加工进行确认

将纯化后的proTk-SP溶解于1ml的50mM Tris-HCl(pH9.0)中(蛋白质浓度：0.013mg/ml)，在80℃下孵育120分钟。用TCA使其沉淀，供于15％SDS-PAGE。结果如图1的(a)和(b)所示。(a)是表示在80℃下孵育120分钟前的proTk-SP的SDS-PAGE结果的图像，(b)是表示将proTk-SP在80℃下孵育120分钟后的SDS-PAGE结果的图像。(a)的proTk-SP的条带出现在所预测的氨基酸序列(序列号5)的理论分子量68.6kDa附近。另一方面，在80℃下孵育120分钟后的(b)的条带位于约44kDa附近。由该结果可以确认，proTk-SP通过在80℃下孵育120分钟而接受了加工。

(ii)利用MALDI-TOF MS进行分子量分析

将纯化后的proTk-SP溶解于50mM Tris-HCl(pH9.0)中(蛋白质浓度：1mg/ml)，在80℃下孵育120分钟。取1μl孵育后的蛋白质溶液，与1μl的基质溶液(将10mg芥子酸溶解于0.1％TFA与乙腈以2∶1的体积比混合而成的溶液1ml中)混合，将该混合溶液1μl作为试样，供于MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics公司制造)。作为校正标准品，使用蛋白质标准品II。图2是表示MALDI-TOF MS的图。由图2可知，该蛋白质的分子量确定为44271Da。

(iii)N末端分析

将加工后的蛋白质(10μg)供于15％SDS-PAGE，为了将蛋白质从泳动后的凝胶转印到PVDF膜上，进行印迹。切出转印有目标条带的PVDF膜，供于蛋白测序仪(Procise自动测序仪，ABI 491型)进行N末端分析。结果示于图3。如图3所示，可知该蛋白质的N末端的氨基酸序列为VETE。

由N末端分析结果和分子量分析结果可知，加工后的蛋白质为由序列号5的第114位～第539位的氨基酸序列构成的蛋白质(序列号1、理论分子量：44207Da)、或者由序列号5的第114位～第540位的氨基酸序列构成的蛋白质(序列号3、理论分子量：44322Da)。将所得到的分子量约44kDa的蛋白质(Tk-SP)用于以下实验。

[实施例2：Tk-SP的pH依赖性和缓冲液依赖性]

为了研究Tk-SP的pH依赖性和缓冲液依赖性，使用醋酸盐缓冲液(pH 4.5，5.0，5.2，5.4和5.6)、MES缓冲液(pH 5.5，6.0，6.5和7.0)、HEPES缓冲液(pH 7.0和7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.0，7.5，8.0，8.5和9.0)、甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5，9.0，9.5和10.0)以及CAPS-NaOH缓冲液(pH 9.0，9.5，10.0，10.5，11.0和11.5)，按照以下步骤进行酶反应。即，将含有50mM的缓冲液和2mM的合成底物Suc-AAPF-pNA的反应液100μl在20℃下孵育5分钟，向其中添加0.1μg的Tk-SP，再在20℃下孵育10分钟。添加10μl的醋酸使反应停止，通过紫外分光光度计(Beckman DU640型)，根据使用8900M^-1cm^-1吸光系数的波长410nm的吸收，对由合成底物Suc-AAPF-pNA生成的对硝基苯胺(p-nitroaniline)的量进行定量。将1分钟内生成1μmol对硝基苯胺的酶量定义为“1个单位”。特异性活性定义为每1mg蛋白质的酶活性。

结果示于图4。由图4可知，Tk-SP的反应最适pH范围较宽，为pH6～11.5，因此可知，Tk-SP是适合在pH6以上的多样化的pH环境中使用的酶。

[实施例3：Tk-SP的温度依赖性]

为了研究Tk-SP的温度依赖性，在20℃～100℃的范围内使用偶氮酪蛋白(Azocasein)作为底物，按照以下步骤进行酶反应。即，将含有50mM Tris-HCl(pH7.0)和2％偶氮酪蛋白的反应液270μl在各温度下孵育5分钟，向其中添加3.3μg的Tk-SP 30μl(约0.1μg)，进一步孵育20分钟。添加200μl的15％三氯乙酸(终浓度6％)使反应停止。离心分离(15000×g，15分钟)后取上清160μl，与40μl的2M NaOH混合，测定波长440nm的吸光值(A₄₄₀)。将使300μl反应液的A₄₄₀在1分钟内上升1所需要的酶量定义为“1个单位”。

结果示于图5。由图5所示的结果可以推测，Tk-SP的活性最适温度为100℃以上，可知Tk-SP在高温环境下显示出较高的肽分解活性。

[实施例4：Tk-SP的热稳定性]

通过将Tk-SP溶液(Tk-SP 3.3μg/ml、50mM Tris-HCl(pH7))在80℃、90℃和100℃下进行处理来研究Tk-SP对于不可逆的热失活的稳定性。取热处理后的Tk-SP溶液30μl，使用偶氮酪蛋白作为底物，在80℃下测定残存活性。测定的步骤与实施例3相同，反应温度为55℃。通过用热处理后的活性值除以热处理前的活性值，计算出残存活性。

结果示于图6。由图6可知，Tk-SP即使在90℃以下的温度下处理180分钟也不失活，另外，即使在100℃下处理90分钟，仍维持了一半的活性。由该结果可知，Tk-SP是热稳定性极高的酶。

[实施例5：Tk-SP对蛋白变性剂、表面活性剂和螯合剂的稳定性]

使用尿素(Urea)和盐酸胍(GdnHCl)作为蛋白变性剂。使用TritonX-100、吐温20和十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂。使用EDTA作为螯合剂。将含有0.05mg/ml Tk-SP的20mM Tris-HCl(pH8.0)在55℃下与上述蛋白变性剂、表面活性剂或螯合剂一起孵育。蛋白变性剂和表面活性剂的浓度设定为3～4个等级。EDTA仅设定1个等级(10mM)。时间设定为0、2、5、10、15、30和60分钟。对于孵育后的Tk-SP，使用Suc-AAPF-pNA作为底物，在20℃下测定活性。测定的步骤与实施例2相同，pH为8。

尿素(Urea)的结果示于图7。由图7可知，即使在最高浓度8M下处理60分钟，Tk-SP仍具有约90％的残存活性。

盐酸胍(GdnHCl)的结果示于图8。由图8可知，以4M的浓度使用时，Tk-SP在30分钟以内失活，但以2M的浓度使用时，即使处理60分钟也维持了约65％的活性。

TritonX-100的结果示于图9。由图9可知，即使以最高浓度10％处理60分钟，Tk-SP的活性也不降低。

吐温20的结果示于图10。由图10可知，即使以最高浓度10％处理60分钟，Tk-SP的活性也不降低。

十二烷基硫酸钠(SDS)的结果示于图11。由图11可知，即使以最高浓度5％处理60分钟，Tk-SP仍具有约90％的残存活性。

EDTA的结果示于图12。由图12可知，即使用10mM的EDTA处理60分钟，Tk-SP的活性也不降低。即可知，钙离子对于Tk-SP显现活性不是必须的。

以上结果表明，Tk-SP对于各种蛋白变性剂、表面活性剂、螯合剂具有高稳定性，作为工业用蛋白酶非常有用。

[实施例6：钙离子对Tk-SP的稳定性带来的效果]

将Tk-SP与10mM的EDTA一起在80℃下孵育30分钟，用含有0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH8.0)进行透析。然后，在80℃、90℃和100℃下处理Tk-SP溶液，研究Tk-SP的稳定性。使用偶氮酪蛋白作为底物，在80℃下测定残存活性。测定的步骤与实施例3相同，反应温度为55℃。

结果示于图13。由图13所示的结果可知，除去钙离子后的Tk-SP的耐热性降低。因此暗示：在使Tk-SP有效地热失活时，添加EDTA是有效的。

[实施例7：Tk-SP的速度参数]

使用Suc-AAPF-pNA作为底物，底物浓度设定为0.01～2mM的范围内的各种浓度，在20℃和80℃下测定Tk-SP的特异性活性。测定的步骤与实施例2同样进行。将所得到的数据代入米氏方程中，计算出速度参数。为了进行比较，对公知的耐热性蛋白酶Tk-枯草杆菌蛋白酶(参见非专利文献1)也同样地测定特异性活性，计算出速度参数。

结果示于表1。由表1可知，在任何一个温度下Tk-SP的Km均小于Tk-枯草杆菌蛋白酶(表中为Tk-sub)的Km。因此可知，Tk-SP与Tk-枯草杆菌蛋白酶相比能够更有效地分解低浓度的底物。

表1

[实施例8：结构形成中的钙离子要求性的研究]

使用将proTk-SP的氨基酸序列(序列号5)的第359位的丝氨酸取代为丙氨酸而失去蛋白酶活性的突变体(以下称为“proS359A”)。proS359A通过如下方法获得：对实施例1中构建的pET25b-proTk-SP应用公知的突变诱导法，制作proS359A表达载体，利用与实施例1同样的方法将该载体导入大肠杆菌中，并进行表达、纯化。

二级结构的形成通过圆二色性测定(CD光谱测定)进行确认。测定时的蛋白质浓度为0.1mg/ml，缓冲液为20mM Tris-HCl(pH7.5)，温度为25℃。

对于以下4种试样，确认了二级结构形成。

试样1：将纯化的proS359A用20mM Tris-HCl(pH7.5)透析后得到的试样。

试样2：将纯化的proS359A用20mM Tris-HCl(pH7.5)透析后，添加EDTA(浓度1mM)和盐酸胍(浓度6M)，在80℃下保温过夜后得到的试样。

试样3：将试样2用20mM Tris-HCl(pH7.5)稀释5倍，并在冰上孵育30分钟后得到的试样。

试样4：将试样2用20mM Tris-HCl(pH7.5)透析过夜后得到的试样。

结果示于图14。如图14所示，与表示正常形成二级结构的试样1的谱图的曲线相比，添加盐酸胍使其变性、并添加EDTA使其呈不含钙离子状态的试样2的曲线变浅，由此可知二级结构被破坏而发生了变性。将变性的试样2用缓冲液稀释5倍而得到的试样3，除200～210nm的范围以外，与试样1的曲线显示出几乎相同的形状。另外，将变性的试样2用缓冲液透析过夜而得到的试样4，与试样1显示出完全相同的曲线。可见试样3和试样4的二级结构得到了恢复，由此可知Tk-SP的结构形成不依赖于钙离子。

该结果表明，Tk-SP的活化不需要钙离子，即使在含有螯合剂作为添加剂的洗涤剂中也能够稳定地发挥功能，因而是非常有用的。

另外，本发明不限于上述各实施方式和实施例，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当结合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的所有学术文献和专利文献均作为参考而援引到本说明书中。

Claims (14)

1.一种蛋白酶，其由以下(a)～(d)中任一项所述的氨基酸序列构成：

(a)序列号1所示的氨基酸序列；

(b)在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；

(c)序列号3所示的氨基酸序列；

(d)在序列号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的蛋白酶，其在以偶氮酪蛋白为底物、在pH7的条件下反应20分钟时的最适温度为100℃以上。

3.如权利要求1所述的蛋白酶，其在pH7的50mM Tris-HCl中、100℃下处理90分钟时，具有40％以上的残存活性。

4.如权利要求1所述的蛋白酶，其在含有5％十二烷基硫酸钠的pH8的20mM Tris-HCl中、55℃下处理60分钟时，具有80％以上的残存活性。

5.如权利要求1所述的蛋白酶，其在80℃的反应温度下、以Suc-AAPF-pNA为底物时，Km值为0.1～1mM。

6.一种前体，其为权利要求1～5中任一项所述的蛋白酶的前体，其由以下(e)或(f)所述的氨基酸序列构成：

(e)序列号5所示的氨基酸序列；

(f)在序列号5所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

7.一种多核苷酸，其编码权利要求1～5中任一项所述的蛋白酶。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，其为由序列号2或4所示的碱基序列构成的多核苷酸，或者

与由序列号2或4所示的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码蛋白酶的多核苷酸。

9.一种多核苷酸，其编码权利要求6所述的前体。

10.如权利要求9所述的多核苷酸，其为由序列号6所示的碱基序列构成的多核苷酸，或者

与由序列号6所示的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码前体的多核苷酸。

11.一种表达载体，其包含权利要求7～10中任一项所述的多核苷酸。

12.一种转化体，其中，导入有权利要求11所述的表达载体。

13.一种抗体，其与权利要求1～5中任一项所述的蛋白酶特异性结合。

14.一种洗涤剂，其含有权利要求1～5中任一项所述的蛋白酶。

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