JP2006288400A - 耐熱性リボヌクレアーゼh - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、組換えDNAにより形質転換されてなる形質転換体、ならびに形質転換体を培養することを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有するポリペプチドの製造方法。
【選択図】なし
Description
1)cDNAのクローニングの際の鋳型mRNAの除去。
2)mRNAのポリA領域の除去。
3)RNAの断片化。
(a)配列表の配列番号9、17、23、32,37、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチド;
(b)配列表の配列番号9、17、23、32,37、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド;
(c)配列表の配列番号9、17、23、32、37、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも71%の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
(a)配列表の配列番号9、17、23、32、37、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドをコードする核酸;
(b)配列表の配列番号9、17、23、32、37、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸;
(c)配列表の配列番号8、16、22、31、36、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列を有する核酸;
(d)配列表の配列番号8、16、22、31、36、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列において、少なくとも1つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸;
(e)前記(a)〜(d)のいずれか記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸;
(f)配列表の配列番号8、16、22、31、36、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列に少なくとも69%の相同性を有する塩基配列である核酸。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152
本発明のポリペプチドを生産する微生物としては、例えば、ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンGmbH(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)より購入可能なバチルス カルドテナックス(DSM406)、ピロコッカス フリオサス(DSM3638)やサーモトガ マリティマ(DSM3109)、アルカエオグロバス フルギダス(DSM4139)、サーモコッカス リトラリス(DSM5473)、サーモコッカス セラー(DSM2476)又は理化学研究所より購入可能なピロコッカス ホリコシイ(JCM9974)等が挙げられる。微生物の培養は、その微生物の生育に適した条件で行えばよく、好ましくは、目的のポリペプチドの発現量が高くなるような培養条件が用いられる。かくして菌体あるいは培養液中に生産された目的のポリペプチドは、通常のタンパク質の精製に用いられる方法によって精製することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば配列番号8、16、22、31、36、46、56又は58に示される塩基配列を有する核酸を含む組換えDNAで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。配列番号8に示される塩基配列からは配列番号9に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号16に示される塩基配列からは配列番号17に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号22に示される塩基配列からは配列番号23に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号31に示される塩基配列からは配列番号32に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号36に示される塩基配列からは配列番号37に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号46に示される塩基配列からは配列番号47に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号56に示される塩基配列からは配列番号57に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号58に示される塩基配列からは配列番号59に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが、それぞれ生成する。
Tm=81.5−16.6 (log10[Na+])+0.41 (%G+C)−(600/N)
(式中、Nはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、%G+Cはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。)
好熱菌バチルス カルドテナックス由来のRNaseHの調製
トリプトン(ディフコラボラトリーズ社製)0.2%、酵母エキス(ディフコラボラトリーズ社製)1.5%を含む培地(pH6.5)100mlにバチルス カルドテナックスYT−G株(Bacillus caldotenax YT-G、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入:DSM406)を植菌し、60℃で140分間振とう培養し、この培養液を前培養液とした。ついで、同組成の培地3lに前培養液30mlを接種し、通気量2.5l/分、攪拌数250回転/分、温度60℃で5時間培養した。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152
バチルス カルドテナックス RNaseHII遺伝子のクローニング
(1)バチルス カルドテナックス ゲノムDNAの調製
バチルス カルドテナックス YT−G株(DSM406)を60mlのLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、pH7.2)に植菌し、65℃、20時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し集菌した。得られた菌体を2mlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、0.2mlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に12mlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、0.1mlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び1mlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。
様々な生物由来のRNaseHIIのアミノ酸配列の間で保存されている部分の内、モチーフIとモチーフIII〔バイオケミストリー(Biochemistry)、第38巻、第605−608頁(1999)〕をもとにしてオリゴヌクレオチドBsuII−3(配列番号1)とオリゴヌクレオチドBsuII−6(配列番号2)を合成した。
上記実施例2−(2)で得たプラスミド21−12の約0.4kbの挿入断片の塩基配列を決定し、それをもとにオリゴヌクレオチドRNII−S1(配列番号3)とオリゴヌクレオチドRNII−S2(配列番号4)を合成した。
実施例2−(3)で決定したプラスミド21−12の約0.4kbの挿入断片の塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドRNII−S5(配列番号5)とオリゴヌクレオチドRNII−S6(配列番号6)を合成した。
pRHB11又はpRHB1で形質転換された大腸菌HB101を100μg/mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地に植菌し、37℃で1晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を0.5mlのTE緩衝液に懸濁して超音波破砕し、遠心分離によって上清を得、これを菌体粗抽出液とした。
実施例2−(4)で得られたpRHB11で形質転換された大腸菌HB101を100μg/mlのアンピシリンを含む1lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を52.3mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、2mM 2−メルカプトエタノール、10%グリセロール、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を60℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分間の遠心分離を行い、上清を集め、50.0mlの熱処理上清液を得た。
バチルス カルドテナックス RNaseHIII遺伝子のクローニング
(1)RNaseHIII遺伝子断片のクローニング
バチルス サブチリス(Bacillus subtilis)のRNaseHIIIのアミノ酸配列〔Otani Nら、バイオケミストリー、第38巻、第605―608頁(1999)〕について、他の生物由来のRNaseHIIIのアミノ酸配列とのホモロジーを調べ、これらの間でよく保存されている領域のアミノ酸配列からRNaseHIIIをコードする遺伝子を探索するためのプライマーBsuIII−1(配列番号10)、BsuIII−3(配列番号11)、BsuIII−6(配列番号12)、BsuIII−8(配列番号13)を合成した。
実施例3−(1)で得られたpBCA3204に挿入されたDNA断片の塩基配列を決定し、得られた配列もとにプライマーRNIII−S3(配列番号14)及びBcaRNIII−3(配列番号15)を合成した。このプライマーRNIII−S3及びBcaRNIII−3を用いて、pBCA3204を鋳型にし、100μlの容量でPCRを行なった。PCRでのDNAポリメラーゼはタカラZタック(宝酒造社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは98℃で0秒、55℃で0秒、72℃で20秒を1サイクルとして、30サイクル行った。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行った。そして、アガロースゲル電気泳動を行い、約0.4kbのDNA断片をゲルから回収した。得られた約0.4kbのDNA断片をDIG DNA標識キット(ベーリンガー マンハイム社製)で標識し、プローブを調製した。
実施例3−(2)で得られたプラスミドpBCA3P88の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
実施例3−(2)に記載のプラスミドpBCA3P88を鋳型にし、上記で得られたRNaseHIIIのオープンリーディングフレームの周辺の配列を参考として設定したBcaRNIIINde(配列番号18)及びM13プライマーM4(宝酒造社製)を用いて、100μlの容量でPCRを行なった。PCRでのDNAポリメラーゼはパイロベストDNAポリメラーゼ(宝酒造社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で3分を1サイクルとして、30サイクル行った。この結果増幅した約4kbのDNA断片をNdeI(宝酒造社製)で消化し、アガロース電気泳動を行い、約1.4kbのNdeI断片をゲルから回収した。得られた約1.4kbのDNA断片を、NdeI消化した後アルカリフォスファターゼ(宝酒造社製)を用いて脱リン酸化したpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)とライゲーションを行い、大腸菌JM109を形質転換した。
実施例3−(4)で得られたpBCA3Nd2で形質転換された大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を39.6mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を60℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分間の遠心分離を行い、上清を集め、39.8mlの熱処理上清液を得た。
ピロコッカス フリオサスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)ピロコッカス フリオサス ゲノムDNAの調製
トリプトン(ディフコラボラトリーズ社製)1%、酵母エキス(ディフコラボラトリーズ社製)0.5%、可溶性でんぷん(ナカライテスク社製)1%、ジャマリンS・ソリッド(ジャマリンラボラトリー社製)3.5%、ジャマリンS・リキッド(ジャマリンラボラトリー社製)0.5% 、MgSO4 0.003%、NaCl 0.001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、CoSO4 0.0001%、CaCl2・7H2O 0.0001%、ZnSO4 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.1ppm、KAl(SO4)2 0.1ppm、H3BO4 0.1ppm、Na2MoO4・2H2O 0.1ppm、NiCl2・6H2O 0.25ppmの組成の培地2lを2l容のメジュウムボトルにいれ、120℃、20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furiosus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入:DSM3638)を接種して、95℃、16時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
ピロコッカス ホリコシ(Pyrococcus horikoshii)の全ゲノム配列が公開されており〔Kawarabayasi,Yら、DNA リサーチ(DNA Research)、第5巻、第55−76頁(1998)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(PH1650)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号19、日本国 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ:http://www.nite.go.jp/)。
実施例4−(2)で得られたpPFU220の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
実施例4−(2)で得られたpPFU220で大腸菌HMS174(DE3)(ノバジェン社製)を形質転換し、得られたpPFU220を含む大腸菌HMS174(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含む2lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を66.0mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を80℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、61.5mlの熱処理上清液を得た。
サーモトガ マリティマ RNaseHII遺伝子のクローニング
(1)サーモトガ マリティマ ゲノムDNAの調製
トリプトン1%、酵母エキス0.5%、可溶性でんぷん1%、ジャマリンS・ソリッド3.5%、ジャマリンS・リキッド0.5%、MgSO4 0.003%、NaCl 0.001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、CoSO4 0.0001%、CaCl2・7H2O 0.0001%、ZnSO4 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.1ppm、KAl(SO4)2 0.1ppm、H3BO3 0.1ppm、Na2MoO4・2H2O 0.1ppm、NiCl2・6H2O 0.25ppmの組成の培地2lを2l容のメディウムボトルにいれ、120℃、20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにサーモトガ マリティマ(Thermotoga maritima、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM3109)を接種して、85℃、16時間静置培養した。
サーモトガ マリティマ ゲノムDNAを鋳型としたPCRを行うことによりRNaseHII遺伝子を含む増幅DNA断片を得るため、サーモトガ マリティマ ゲノムDNAの塩基配列(http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)のうちRNaseHII遺伝子と同定されている部分の塩基配列をもとにして、オリゴヌクレオチド915−F1(配列番号24)、915−F2(配列番号25)、915−R1(配列番号26)及び915−R2(配列番号27)を合成した。
プラスミドNo.1〜7又はpUC19で形質転換された大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地(トリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、NaCl 5g/l、pH7.2)に植菌し、37℃で振盪培養した。660nmにおける吸光度が0.5になったときに終濃度が1mMになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを加え、更に1晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を集め、1mlのTE緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。これを80℃で10分間熱処理し、遠心によって得た上清を菌体粗抽出液とした。
実施例5−(2)で得られたプラスミドNo.7(プラスミドpTM−RNH)で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpTM−RNHを含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む1lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を31.0mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、2mM 2−メルカプトエタノール、10%グリセロール、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpm、10分の遠心分離を行い、上清を集め、32.0mlの熱処理上清液を得た。
ピロコッカス ホリコシイのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)ピロコッカス ホリコシイ ゲノムDNAの調製
トリプトン(ディフコラボラトリーズ社製)1%、酵母エキス(ディフコラボラトリーズ社製)0.5%、可溶性でんぷん(ナカライテスク社製)1%、ジャマリンS・ソリッド(ジャマリンラボラトリー社製)3.5%、ジャマリンS・リキッド(ジャマリンラボラトリー社製)0.5%、MgSO4 0.003%、NaCl 0.001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、CoSO4 0.0001%、CaCl2・7H2O 0.0001%、ZnSO4 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.1ppm、KAl(SO4)2 0.1ppm、H3BO4 0.1ppm、Na2MoO4・2H2O 0.1ppm、NiCl2・6H2O 0.25ppmの組成の培地2lを2l容のメジュウムボトルにいれ、120℃、20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス ホリコシイOT3(Pyrococcus horikoshii、理化学研究所より購入:JCM9974)を接種して、95℃、16時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
ピロコッカス ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)は全ゲノム配列が公開されており〔DNA リサーチ(DNA Research)、第5巻、第55−76頁(1998)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(PH1650)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号28、日本国 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ:http://www.nite.go.jp/)。
実施例6−(2)で得られたpPHO238の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
実施例6−(2)で得られたpPHO238で大腸菌HMS174(DE3)(ノバジェン社製)を形質転換し、得られたpPHO238を含む大腸菌HMS174(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含む1lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を34.3mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を80℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、33.5mlの熱処理上清液を得た。
アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔Klenk,HPら、ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号33、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
実施例7−(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
実施例7−(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。
サーモコッカス リトラリス RNaseHII遺伝子のクローニング
(1)サーモコッカス リトラリス ゲノムDNAの調製
サーモコッカス リトラリス(Thermococcus litoralis、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM5473)11ml相当分の菌体を集め、500μlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、100μlの0.5M EDTA、50μlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に4mlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、50μlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び250μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に100μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
様々な耐熱性RNaseHIIのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドRN−F1(配列番号38)とオリゴヌクレオチドRN−R0(配列番号39)を合成した。
上記実施例8−(2)で得た約0.5kbの断片TliF1R0の塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTliRN−1(配列番号40)と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTliRN−2(配列番号41)を合成した。さらに、表1に示す48種類のプライマーを合成した。表1中のタグ配列を配列表の配列番号60に示す。
TliRNaseHIIを含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号42に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号43に示す。上記塩基配列をもとにプライマーTliNde(配列番号44)及びTliBam(配列番号45)を合成した。
実施例8−(4)で得られたpTLI223NdおよびpTLI204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
pTLI223Ndで形質転換された大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンおよび1mM IPTGを含む10mlのLB培地に植菌し、37℃で1晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を196μlのバッファーAに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、10分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にpTLI204で形質転換された大腸菌HMS174(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地に植菌し、37℃で1晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。
実施例8−(4)で得られたpTLI223Ndで大腸菌JM109を形質転換し、得られたpTLI223Ndを含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を38.7mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで20分の遠心分離を行い、上清を集め、37.2mlの熱処理上清液を得た。
サーモコッカス セラー RNaseHII遺伝子のクローニング
(1)サーモコッカス セラー ゲノムDNAの調製
サーモコッカス セラー(Thermococcus celer、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM2476)11ml相当分の菌体を集め、実施例8−(1)の記載の方法によりゲノムDNA溶液を得た。
様々な耐熱性RNaseHIIのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドRN−F1(配列番号48)とオリゴヌクレオチドRN−R0(配列番号49)を合成した。
上記実施例9−(2)で得られたプラスミドpTceF1R0塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTceRN−1(配列番号50)と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTceRN−2(配列番号51)を合成した。
TceRNaseHIIを含む遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号52に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号53に示す。上記塩基配列をもとにプライマーTceNde(配列番号54)及びTceBam(配列番号55)を合成した。
実施例9−(4)で得られたpTCE265NdおよびpTCE207の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
pTCE265Ndで形質転換された大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンおよび1mM IPTGを含む10mlのLB培地に植菌し、37℃で1晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を203μlのバッファーAに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、10分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にpTCE207で形質転換された大腸菌HMS174(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地に植菌し、37℃で1晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。
実施例9−(4)で得られたpTCE265Ndで大腸菌JM109を形質転換し、得られたpTCE265Ndを含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2lのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を39mlのソニケーションバッファー〔50mM トリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフ ェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで20分の遠心分離を行い、上清を集め、37.5mlの熱処理上清液を得た。
実施例2から実施例9において得られたバチルス カルドテナックス(以下BCAとする)、ピロコッカス フリオサス(PFU)、サーモトガ マリティマ(TMA)、アルカエオグロバス フルギダス(AFU)、サーモコッカス リトラリス(TLI)、サーモコッカス セラー(TCE)、ピロコッカス ホリコシイ(PHO)のアミノ酸配列と塩基配列について、ホモロジー検索を行なった。検索プログラムは、DNASIS−Mac(宝酒造社製)のMaximum MatchingとコンピュータアルゴリズムFASTA(バージョン3.0;パーソン(Pearson,W.R.)ら、Pro.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988)で算出した。
相同性として表示される数値に大きな違いがないことがわかった。
各種RNaseHの作用機作と性質
(1)Bca RNaseHIIIの作用機作
Bca RNaseHIIIとE.coli RNaseHIの切断様式を比較するため以下のように基質を調製した。大腸菌O157熱抽出物を鋳型に3’側から3塩基がRNAである5’端FITC標識キメラプライマーVT2−R280N3−I7(配列番号61)とDNAプライマーVT2−F110(配列番号62)を用いてPCRを行い、2本鎖の一方の鎖にRNAを3つ含むDNA断片を得た。PCR産物よりマイクロコンー100(ミリポア社製)によりプライマーを除去してRNaseHによる切断の基質とした。
Pfu(パイロコッカス フリオサス)、Pho(パイロコッカス ホリコシイ)、Afu(アルカエオグロバス フルギダス)のRNaseHIIの切断様式を解析するため、以下のように基質を調製した。大腸菌O157熱抽出物を鋳型に3’側から3塩基がRNAである5’端FITC標識キメラプライマーVT2−IF20N3(配列番号63)、2塩基がRNAである5’端FITC標識キメラプライマーVT2−IF19N2(配列番号64)、1塩基がRNAである5’端FITC標識キメラプライマーVT2−IF18N1(配列番号65)とDNAプライマーVT2IR20(配列番号66)を用いてPCRを行い、2本鎖の一方の鎖にRNAを3つ、2つ、あるいは、1つ含むDNA断片、VFN3、VFN2、VFN1を得た。これらのPCR産物よりマイクロコンー100によりプライマーを除去してRNaseHによる切断の基質とした。
実施例1で記載したRNaseH活性測定法においてMn2+要求性でMg2+では全く活性を示さないBca RNaseHIIとTma RNaseHIIに関して、実施例11−(2)に記載のVFN3を基質としてMg2+あるいは、Mn2+存在下での切断を比較した。
バチルス カルドテナックス RNaseHとして実施例2−(5)、実施例3−(4)で得られたpRHB11、pBCA3Nd2、ピロコッカス フリオサス RNaseHとして実施例4−(2)で得られたpPFU220、サーモトガ マリティマ RNaseHとして実施例5−(2)で得られたpTM−RNH、ピロコッカス ホリコシイ RNaseHとして実施例6−(2)で得られたpPHO238、アルカエオグロバス フルギダス RNaseHとして実施例7−(2)で得られたpAFU204、サーモコッカス リトラリス RNaseHとして実施例8−(4)で得られたpTLI204、pTLI223Nd、サーモコッカス セラー RNaseHとして実施例9−(4)で得られたpTCE207、pTCE265Ndでそれぞれ形質転換された大腸菌を用いて耐熱性を調べた。すなわち、上記大腸菌を培養し、培養液から調製した素酵素抽出液を60℃、15分の条件で熱処理を行ない、実施例1と同様の方法でRNaseH活性を調べた。その結果、どの菌株由来のRNaseHにおいてもRNaseH活性が確認できた。
本発明によって、さまざまな用途で本発明のRNaseHを用いることが可能となった。
SEQ ID NO:2: PCR primer BsuII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:3: PCR primer RNII-S1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:4: PCR primer RNII-S2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:5: PCR primer RNII-S5 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:6: PCR primer RNII-S6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:7: PCR primer RNII-Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:10: PCR primer BsuIII-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:11: PCR primer BsuIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:12: PCR primer BsuIII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:13: PCR primer BsuIII-8 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:14: PCR primer RNIII-S3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:15: PCR primer BcaRNIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:18: PCR primer BcaRNIIINde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO:20: PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus.
SEQ ID NO:21: PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus.
SEQ ID NO:24: PCR primer 915-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO:25: PCR primer 915-F2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO:26: PCR primer 915-R1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO:27: PCR primer 915-R2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO:29: PCR primer PhoNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii.
SEQ ID NO:30: PCR primer PhoBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii.
SEQ ID NO:34: PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:35: PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:38: PCR primer RN-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.
SEQ ID NO:39: PCR primer RN-R0 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.
SEQ ID NO:40: PCR primer TliRN-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.
SEQ ID NO:41: PCR primer TliRN-2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.
SEQ ID NO:44: PCR primer TliNde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus litoralis.
SEQ ID NO:45: PCR primer TliBam for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Thermococcus litoralis.
SEQ ID NO:48: PCR primer RN-F1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.
SEQ ID NO:49: PCR primer RN-R0 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.
SEQ ID NO:50: PCR primer TceRN-1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.
SEQ ID NO:51: PCR primer TceRN-2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.
SEQ ID NO:54: PCR primer TceNde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermococcus celer.
SEQ ID NO:55: PCR primer TceBam for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Thermococcus celer.
SEQ ID NO:61: Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-R280N3-I7 for amplifying a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:62: Designed oligonucleotide primer as VT2-F110 for amplifying a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
SEQ ID NO:63: Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF20N3 for amplifying a VFN3 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:64: Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF19N2 for amplifying VFN2 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:65: Designed chimeric oligonucleotide primer as VT2-IF18N1 for amplifying a VFN1 from hemorrhagic Escherichia coli 0-157."Nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:66: Designed oligonucleotide primer as VT21R20 for amplifying a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
Claims (6)
- 下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有することを特徴とするポリペプチド:
(a)配列表の配列番号9、17、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列表の配列番号9、17、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド;
(c)配列表の配列番号9、17、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも71%の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(d)配列表の配列番号8、16、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列を有する核酸、当該核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸にコードされるポリペプチド。 - 下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有するポリペプチドをコードする核酸:
(a)配列表の配列番号9、17、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸;
(b)配列表の配列番号9、17、47、57又は59のいずれか1つに示されるアミノ酸配列において、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸;
(c)配列表の配列番号8、16、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列を有する核酸;
(d)配列表の配列番号8、16、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列において、少なくとも1つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸;
(e)前記(c)記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸;
(f)配列表の配列番号8、16、46、56又は58のいずれか1つに示される塩基配列に少なくとも69%の相同性を有する塩基配列である核酸。 - 請求項2記載の核酸を含んでなる組換えDNA。
- 請求項3記載の組換えDNAにより形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項4記載の形質転換体を培養し、該培養物中より耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有するポリペプチドの製造方法。
- プラスミドpRHB11(FERM BP−7655として寄託)、pBCA3Nd2(FERM BP−7653として寄託)、pTM−RNH(FERM BP−7652として寄託)、pTLI204(FERM BP−7693として寄託)又はpTCE207(FERM BP−7694として寄託)のいずれか1つを導入した形質転換体を培養して得られる、耐熱性リボヌクレアーゼH活性を有するポリペプチド。
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