JP4438480B2 - アルカリプロテアーゼ - Google Patents
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(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
枯草菌が産生するセリンプロテアーゼファミリー1において高度に保存されている領域である64番目のHis周辺及び221番目のSer周辺のアミノ酸配列His-Gly-Thr-His-Val-Ala-Gly及びGly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser-Pro-His-Val-Ala-Glyに対して、これらの領域間を増幅させるように設計したプライマー1(配列番号3:5’−CAYGGNACNCAYGTNGCNGG−3’)、プライマー2(配列番号4:5’−CCNGCNACRTGNGGNGNNGCCATNGANGTNCC−3’)、プライマー3(配列番号5:5’−CCNGCNACRTGNGGNGNNGCCATRCTNGTNCC−3’)を合成した。なお、アミノ酸番号はズブチリシンBPN’を基準に示したものである。
実施例1にて決定したアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をプライマー4(配列番号6:5’−GCATTTTTTCTGGGATCCCGATTGGTTTAAAAAAAC−3、下線部は新たに付加したBamHIサイトを示す)、プライマー5(配列番号7:5’−GTTTTCGTCTAGAAGAATGGGGAAGAGG−3、下線部は新たに付加したXbaIサイトを示す)各20pmolを用い、0.1〜1.0ngのBacillus sp. KSM-LD1株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCR条件は94℃で1分間の熱変性後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で3分間を1サイクルとし30サイクル行なった。得られたPCR増幅断片をHigh Pure PCR Product Purification キットにて精製し、BamHI、XbaIにて消化した後、同様に処理したベクターpHA64(特開平8−323050)に導入し、組換えプラスミドを調製した。これを用いてプロトプラスト法によりB.subtilis ISW1214株を形質転換した。得られた形質転換株を3%(w/v)ポリペプトンS、0.5%魚肉エキス、0.1%酵母エキス、0.1%リン酸1カリウム、0.02%硫酸マグネシウム、3%マルトース(別滅菌)から成る培地にて30℃、72時間好気的に振盪培養を行なったところ、培養液当たりの生産量は約5U/mLであった。
実施例2で得た培養液250mLに脱イオン水250mLを加え、予め50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)にて平衡化しておいたスーパーQトヨパール650M(2.5X9 cm;東ソー)に添着した。その後、同緩衝液にて洗浄し、0〜0.2M塩化カリウムを含む同緩衝液(500mL)にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。次いで0.2〜0.4M塩化カリウムを含む同緩衝液(500mL)にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。プロテアーゼ活性は0.25〜0.3M塩化カリウムで溶出され、各フラクションを集め(180mL)、限外濾過膜(PM10;アミコン)にて濃縮、脱塩を行った。この濃縮液を予め10mMリン酸緩衝液(pH7)にて平衡化しておいたDEAEトヨパール650M(1.5×7cm;東ソー)に添着した。その後、同緩衝液にて洗浄し、0〜0.1M塩化カリウムを含む同緩衝液(150mL)にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。次いで0.1〜0.2M塩化カリウムを含む同緩衝液(150mL)にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。プロテアーゼ活性は0.18M塩化カリウムで溶出され、各フラクションを集め(22mL)、限外濾過膜(PM10;アミコン)にて濃縮、脱塩を行った。本標品のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のプロテアーゼバンドをイモビロン膜(ミリポア)にブロットした。アミノ末端配列を解析するため、その膜片をプロテインシークエンサー(476A型;アプライドバイオシステムズ)に供した。その結果、22番目までのアミノ末端配列は、NDNVEWNIQQVGAPQAWEMGVDであることが判り、この配列は塩基配列から推定したアミノ酸配列(配列番号1及び2参照)の194番目のアスパラギンから215番目のアスパラギン酸までと完全に一致した。
0.05mLの0.5Mトリス/塩酸緩衝液(pH9)、0.05mLの20mM塩化カルシウム、0.35mLの脱イオン水及び0.025mLの50mM AAPF(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide:シグマ)からなる反応液を30℃で3分間恒温した後、0.025mLの酵素液を加え反応を開始した。30℃で10分間恒温した後、2mLの5%(w/v)クエン酸を加え反応を停止した。420nmにおける吸光度を測定し、遊離したp−ニトロアニリンを定量した。酵素1unitは上記反応条件下において1分間に1μmolのp−ニトロアニリンを遊離する量とした。
pH4〜11の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、アルカリプロテアーゼSCはpH9〜11のグリシン/水酸化ナトリウム緩衝液中において最も高い分解活性を示した。また、pH9〜11のホウ酸緩衝液中においても同様の傾向を示した。更にpH7以上で最大活性値の85%以上の相対活性値を示した。尚、使用した緩衝液は、酢酸(pH4〜6)、MOPS(pH6〜8)、トリス/塩酸(pH7〜9)、グリシン/水酸化ナトリウム(pH9〜11)及びホウ酸(pH9〜11)であった。
Claims (6)
- 以下の(a)又は(b)のタンパク質:
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)又は(b)のDNAからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子:
(a)配列番号2に示す塩基配列で示されるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項2又は3記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 宿主が微生物である請求項5記載の形質転換体。
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