JP2013528384A - 変形されたRNaseH及び核酸増幅の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
CATACLEAVE(商標)プローブを含むことによって達成される。逆転写酵素−PCR増幅産物内の標的配列に相補的なCATACLEAVE(商標)プローブは、RNA配列及びDNA配列を含むキメラ構造を有し、その5’末端及び3’末端が、検出可能なマーカー(例えば、FRET対標識されたDNA配列に隣接する。FRET対の蛍光標識が消光剤(quencher)に近接すると、完全なプローブの蛍光を抑制する。逆転写酵素−PCR産物にプローブをアニーリングすれば、反応混合物に存在するRNase Hによって切断されるRNA:DNA二本鎖が生成される。アニーリングされたプローブのRNA部分内の切断は、消光剤から蛍光標識を分離させ、引き続いて蛍光の放出をもたらす。
ホットスタート組成物は、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素活性のようなポリメラーゼ活性を有することができる。前記RNase H活性は、熱誘導性またはpH誘導性であってもよい。
前記抗体断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、単一鎖Fvまたは単一鎖scFv、二硫化結合されたFv、V−NARドメイン、IgNar、イントラボディー(intrabody)、IgGDCH2、ミニボディ(minibody)、F(ab’)3、テトラボディ(tetrabody)、トリアボディ(triabody)、ジアボディ(diabody)、(scFv)2、単一ドメイン抗体、DVD−Ig、Fcab、mAb2またはscFv−Fcであってもよい。
標的DNA配列を含む試料と、
DNAポリメラーゼと誘導性RNase H活性とを含むホットスタート酵素組成物と、標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、
標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、
検出可能な標識と連結され、RNase Hによって切断される組成を有するプローブと、を有する増幅反応混合物を提供する段階;
一つ以上の増幅産物を生成するために、増幅反応組成物に一つ以上の増幅反応を遂行する段階;及び
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階を含み、前記増幅反応は、約90℃の温度に反応組成物を加熱する段階を含む方法である。
標的DNA配列を含む試料と、
逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNase H活性を含み、前記RNase H活性は、リガンドによって抑制されるものであるホットスタート酵素組成物と、
検出可能な標識を含み、RNase Hの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、
標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、
を含む増幅反応組成物を提供する段階;
RNA:DNA(cDNAは、産物が二重鎖DNAであり、逆転写酵素産物ではないものを意味する)二本鎖を形成するために標的RNAの逆転写を開始する段階;
約90℃以上の温度に反応組成物を加熱し、それにより、RNA:DNAデュプレックスのRNA部分を分解する誘導性RNase H活性を活性化させる段階;
一つ以上の増幅産物を生成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階;及び収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階;
を有する方法である。
標的RNA配列を含む試料と、
逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNase H活性
を含み、
前記RNase H活性は、前記リガンドによって抑制されるホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、
RNase Hの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、
標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、
を含む複数の増幅反応組成物を有するマイクロアレイを提供する段階;
マイクロアレイの中でそれぞれの増幅反応組成物に対して、RNA:cDNA二本鎖を形成するために標的RNAの逆転写を開始する段階;
約90℃以上の温度まで前記反応組成物を加熱し、それにより、RNA:cDNA二本鎖のRNA部分を分解する誘導性RNase H活性を活性化させる段階;
一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階;及び
収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階;を含む方法である。
前記標的RNA配列は、レトロウイルスであってもよい。前記反応組成物を加熱する段階は、誘導性RNase H活性を活性化させることができる約95℃で遂行されもする。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。
一実施態様において、本発明は、逆転写酵素活性またはDNAポリメラーゼ活性を有する酵素を含むことができるホットスタート組成物のマイクロアレイを有するキットを開示する。
本願は、CataCleave(商標)逆転写酵素PCR反応に使用するための変形された熱安定性RNase H酵素組成物を開示する。
RNase Hは、RNA−DNAハイブリッドのうちRNAを加水分解する。子牛胸腺で初めて発見されたRNase Hは、その後多くの生物で開示された。事実、RNase H活性は、真核生物及びバクテリアに偏在しているように見える。RNase Hは、多様な分子量と核酸分解活性とを有するタンパク質のファミリーを形成するが、基質要求性は、多様な亜型に対して類似していると見られる。例えば、現在まで研究されたほとんどのRNase Hは、エンドヌクレアーゼとして機能し、5’ホスフェート末端及び3’ヒドロキシル末端を有する切断産物を生成するために、二価陽イオン(例えば、Mg2+、Mn2+)を要求する。
DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER 120
RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL180
EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP 224
相同性領域2:LRNIGVKD SKQL(配列番号11;配列番号1の33ないし44の位置に相当する)
相同性領域3:HKADAKYPV VSAASILAKV(配列番号12;配列番号1の132ないし150の位置に相当する)
相同性領域4:KLK KQYGDFGSGYPSD(配列番号13;配列番号1の158ないし173の位置に相当する)
本明細書で使用される用語「変形されたRNase H(modified RNase H)」は、RNase Hのエンドヌクレアーゼ活性の喪失を誘発する抑制因子に可逆的に連結されたり、あるいは可逆的に結合したRNase Hであってもよい。RNase Hからの抑制因子の放出または分離(decoupling)は、RNase Hのエンドヌクレアーゼ活性の完全な、または少なくとも一部活性を回復させる。完全な(intact)RNase Hの活性の約30ないし100%が十分である。抑制因子は、リガンドまたは化学的変形であってもよい。リガンドは、抗体、アプタマー、受容体、共同因子またはキレート剤であってもよい。リガンドは、RNase H酵素の活性部位に結合し、これにより、酵素活性を阻害したり、あるいはRNaseの活性部位から遠く離れた部位に結合することができる。一部実施態様において、前記リガンドは、立体構造的変化を誘導することができる。前記化学的変形は、交差結合(例えば、ホルムアルデヒドによる交差結合)またはアシル化であってもよい。RNase HIIからの抑制因子の放出または分離は、連結されたRNase HII(不活性)を含む試料または混合物を、約65℃ないし約95℃、またはそれ以上の温度まで加熱し、かつ/または試料または混合物のpHを約7.0以下に下げることによって達成される。
一般的に、交差結合の程度が低いほど、交差結合の逆転後、酵素のエンドヌクレアーゼ活性がさらに高い。交差結合の程度は、ホルムアルデヒドの濃度及び交差結合反応の持続時間を変化させることによって調節される。例えば、約0.2%(w/v)、約0.4%(w/v)、約0.6%(w/v)または約0.8%(w/v)のホルムアルデヒドが、RNase H酵素を交差結合させることに使用される。約10分の0.6%ホルムアルデヒドを使用した交差結合反応は、ピューロコッカス・フリオスス由来のRNase HIIを不活性化するのに十分である。
一部実施態様において、試料は、精製された核酸テンプレート(例えば、mRNA、rRNA及びその混合物)を含む。試料からのRNA抽出及び精製の方法は、当業界に周知である。例えば、RNAは、TRIzol(商標)試薬(インビトロジェン)抽出方法を使用して細胞から分離することができる。RNAの量と質は、その次に、例えば、Nano drop(商標)分光光度計及びアジレント2100バイオアナライザを使用して決定される。
バッファーの例は、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、3−(N−モルホリノ−)−プロパンスルホン酸(MOPS)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン酸(トリシン)、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン酸(トリス)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、及びアセテートまたはホスフェートを含むバッファー(K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4)などを含むが、これらに限定されるものではない。
逆転写酵素−PCR過程は、終点(end-point)またはリアルタイム分析のうち一つに設定されもする。cDNA増幅は、本質的に2つの段階に分離された分子的合成を要求する:(i)RNAテンプレートからcDNAの合成、及び(ii)PCR増幅を介した新たに合成されたcDNAの複製。逆転写酵素−PCRとたびたび関連する技術的問題を解決するために、多数のプロトコルが下記過程の3種の基本段階を考慮して開発された:(a)RNAの変性とリバースプライマーとのハイブリダイゼーション;(b)cDNAの合成、及び(c)PCR増幅。いわゆる「分離された(uncoupled)」逆転写酵素−PCR過程(例えば、2段階逆転写酵素−PCR)で、逆転写は、逆転写酵素活性のための最適バッファー条件を使用して、独立した段階として遂行される。cDNA合成に続き、収得された反応液をTaq DNAポリメラーゼ活性のための最適条件により、MgCl2及びジオキシリボヌクルレオシドトリホスフェート(dNTP)mp濃度を低下させるように希釈し、標準条件によってPCRを遂行する(米国特許第4,683,195号明細書及び同第4,683,202号明細書参照)。一方、「連結された(coupled)」逆転写酵素PCR方法は、逆転写酵素及びTaq DNAポリメラーゼのための共通したバッファーを使用する。1つのバージョンで、リバースプライマーのアニーリングは、酵素添加の前の別個の段階であり、その後、1つの反応容器に添加される。他のバージョンで、逆転写酵素活性は、熱安定性Tth DNAポリメラーゼの成分である。アニーリング及びcDNA合成は、Mn2+の存在下で行われ、その後PCRは、キレート剤によって、Mn2+を除去した後、Mg2+の存在下で行われる。最後に、「持続的(continuous)」方法(例えば、1段階逆転写酵素−PCR)は、3段階の逆転写酵素−PCR段階を、構成要素または酵素の添加のための反応チューブを開くことを避ける単一持続的反応に統合する。持続的逆転写酵素−PCRは、最初の65℃RNA変性段階が省略されたものである熱安定性Taq DNAポリメラーゼ及びTthポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する一酵素システムと、AMV逆転写酵素及びTaq DNAポリメラーゼを使用した2つの酵素システムとで記載される。
リアルタイム逆転写PCRの第1段階は、テンプレート特異的なDNAプライマーのうち一つを使用して、相補的なDNA鎖を生成するのである。従来のPCR反応において、この産物は変性され、第2テンプレート特異的プライマーがcDNAに結合し、デュプレックスDNAを形成するために伸張される。この産物は、その後、PCR増幅の次の段階で増幅される。
増幅後のアンプリコン検出は、労動と時間とを必要とする。リアルタイム方法は、PCR過程間の増幅をモニタリングするために開発された。このような方法は、一般的に、新たに合成されたDNAに結合する蛍光標識プローブまたは二重鎖DNAの間に挿入されると、蛍光放出が増加する染料を利用する。
用語「プローブ」は、特異的な核酸配列、例えば、標的核酸配列の相補的な領域と、配列特異的な方式でハイブリダイゼーションされるようにデザインされた特異的な部分を有するポリヌクレオチドを含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、長さが、約15個ないし約60個のヌクレオチド範囲にある。他の実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、長さが約18個ないし約30個のヌクレオチド範囲にある。オリゴヌクレオチド・プローブの正確な配列と長さは、前記プローブが結合する標的ポリヌクレオチドの属性に部分的に依存する。結合位置と長さは、特定の実施態様で、適切なアニーリング及び融解特性をなすように多様である。このようなデザイン選択をするための指針は、米国特許第5,763,181号明細書、同第6,787,304号明細書及び同第7,112,422号明細書に記載された、Taq−man分析またはCataCleaveを記載する多数の参照文献に見られ、その内容が全体として本明細書に参照として含まれる。
本発明の一部実施態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、固体支持体に付着することができる。互いに異なるプローブが固体支持体に付着し、試料で互いに異なる標的配列を同時に検出するために使用される。互いに異なる蛍光波長を有するレポーター分子は、互いに異なるプローブに使用され、従って、互いに異なるプローブに対するハイブリダイゼーションが別個に検出されもする。
標識されたオリゴヌクレオチド・プローブは、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のためのプローブとして使用される(図1及び図2参照)。
本発明はまた、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のための一つ以上の試薬を有する包装単位を含むキット形態を提供する。該キットはまた、下記の品目を一つ以上含んでもよい:バッファー、使用説明書、及び陽性または陰性の対照群。該キットは、本明細書に記載された方法を遂行するために、適切な比率で共に混合した試薬の容器を含んでもよい。試薬容器は、望ましくは、本方法を遂行するとき、測定する段階を不要にさせる単位量の試薬を含む。
プローブ:テンプレートの比率を変化させ、反応中のPfuの量を一定に維持し、Pfu RNase HIIの定量的切断活性を調査した。また、反応中のPfuの量を変化させ、プローブ:テンプレートの比率を一定に維持して活性を調査した。
Pfu RNase HIIを、多様な濃度のホルムアルデヒドを使用したホルムアルデヒド交差結合に供した。
2xRNase HII保存バッファー:100mM Tris−HCl、pH8.0、200mM NaCl及び0.2mM EDTA
ホルムアルデヒド交差結合されたPfu RNase HIIの性能を、サルモネラinvA CataCleave(商標)PCR実験を使用して測定した。処理されていないPfu RNase HIIと、ホルムアルデヒド交差結合されたPfu RNase HII(実施例2の試料#4)とを、5ないし5x106コピーのサルモネラinvA遺伝子標的を検出するためのCataCleave(商標)PCR分析で機能する能力についてテストした。
Pfu RNase HIIを50:1ないし200:1モル比のcis−アコニット酸無水物対酵素の多様な濃度のcis−アコニット酸無水物を使用して、cis−アコニチン化させた(図3参照)
各反応混合物を−20℃で保管するために、同じ体積のグリセロールで希釈した。cis−アコニット酸無水物とRNase HIIとのモル比、及び他のアシル化条件を下記表2に表示する。
該結果は、約200:1モル比のcis−アコニット酸無水物:酵素が、50℃でRNase HIIの活性を完全に不活性化させるために必要であるということを示している。Tris−アセテート、pH8.4バッファーを使用して再活性化(すなわち、95℃で加熱)を行った場合、使用されたあらゆる濃度のcis−アコニット酸無水物が、95℃で15分後にRNase HII活性をほぼ完全に再活性化させた。
ホルムアルデヒド交差結合されたPfu RNase HIIの性能(実施例2の試料4)を、サルモネラinvA及びCataCleave(商標)PCR分析を使用して測定した。増幅のためのマスター混合物は、以下である。分析は、pH8.4またはpH8.7で行った。
前記で準備したような可逆的に変形されたRNase HIIは、特にウイルスRNA標的の一段階RT PCR増幅に使用するのに適する。変形された不活性RNase HIIは、試料内の標的RNA分子を切断せずに、逆転写酵素がRNA核酸からウイルスcDNA分子を生成することができる。
50℃で30分
95℃で15分
95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で60秒のサイクル50回
RNase HIIのエンドヌクレアーゼ活性は、実施例2で記載した過程に沿って測定した。
変形されたRNase HIIの感度を決定するために、アシル化されたRNase HII(実施例3の試料#4)を使用し、HIV−1標的RNAの濃度が増幅組成物で異なるという点以外において、実施例6に記載されたところと同一の過程を遂行した。
50℃で30分
95℃で15分
95℃で30秒、60℃で30秒、及び72℃で60秒のサイクル50回
Claims (50)
- 誘導性RNase H活性を有する酵素を含むホットスタート酵素組成物。
- 前記酵素は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列を有するRNase H相同性領域を含むことを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H相同性領域は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列と70%以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H相同性領域は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項2に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H相同性領域は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列と90%以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項2に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H活性は、ピューロコッカス・フリオスス(Pyrococcus furiosus)、ピューロコッカス・ホリコシ(Pyrococcus horikoshi)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)または大腸菌(E.coli)から分離することを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- ポリメラーゼ活性をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記ポリメラーゼ活性は、DNAポリメラーゼ活性を含むことを特徴とする請求項7に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記DNAポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項8に記載のホットスタート酵素組成物。
- 逆転写酵素活性をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H活性は、熱誘導性であることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H活性は、酵素を含む溶液のpHを変形させることによって誘導されることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記誘導性RNase H活性を有する酵素は、可逆的に変形されることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記酵素は、前記酵素のアミノ酸残基のアシル化によって可逆的に変形されることを特徴とする請求項13に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記アミノ酸は、リシンであることを特徴とする請求項14に記載のホットスタート酵素組成物。
- 誘導性RNase H活性を有する前記酵素は、ホルムアルデヒドによって可逆的に変形されることを特徴とする請求項13に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記ホルムアルデヒドは、約0.2ないし1%(w/v)の濃度でホルムアルデヒドを含む溶液であることを特徴とする請求項16に記載のホットスタート酵素組成物。
- リガンドをさらに含み、前記誘導性RNase H活性は、前記リガンドと酵素との結合によって阻害され、前記結合が干渉されることによって誘導されることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記リガンドは、熱不安定性(thermolabile)であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記酵素と前記リガンドとの結合は、非共有性であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記リガンドは、前記酵素に対して、10−1M以下のKD解離定数を有するペプチド、核酸または小分子であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記リガンドは、前記RNase Hドメインに結合することを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記リガンドは、前記RNase Hドメインで、立体構造変化を誘導することを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマーまたはキレート剤であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記抗体断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、単一鎖Fvまたは単一鎖scFv、二硫化結合されたFv、V−NARドメイン、IgNar、イントラボディー(intrabody)、IgGDCH2、ミニボディ(minibody)、F(ab’)3、テトラボディ(tetrabody)、トリアボディ(triabody)、ジアボディ(diabody)、(scFv)2、単一ドメイン抗体、DVD−Ig、Fcab、mAb2またはscFv−Fcであることを特徴とする請求項24に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H活性は、酵素を含む溶液を約90℃以上の温度まで加熱することによって誘導されることを特徴とする請求項11に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記RNase H活性は、酵素を含む溶液のpHを約7.0以下に下げることによって誘導されることを特徴とする請求項12に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記溶液は、標的核酸配列を含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試料であることを特徴とする請求項27に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記酵素と前記リガンドとの結合は、共有結合であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 前記リガンドは、交差結合剤(cross-linking agent)であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。
- 標的配列を増幅する方法であって、
標的DNA配列を含む試料と、
DNAポリメラーゼと誘導性RNase H活性とを含む請求項18に記載のホットスタート酵素組成物と、
前記標的DNA配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、
前記標的DNA配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、
検出可能な標識と連結され、RNase Hによって切断され得る組成を有するプローブと、含む増幅反応混合物を提供する段階と、
前記増幅反応組成物に、一つ以上の増幅反応を遂行し、一つ以上の増幅産物を生成する段階と、
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、
を含み、前記増幅反応は、約90℃の温度で、前記反応組成物を加熱する段階を含む方法。 - 前記反応組成物を加熱する段階は、約95℃で行われることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 前記プローブは、一つ以上のDNA配列部分と、1つのRNA配列部分とを含み、前記RNA部分が、RNA配列の3’末端と5’末端とが2つのDNA配列のそれぞれに連結される方式で、2つのDNA配列間に配列されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 前記加熱段階は、前記RNase H活性を有する酵素と前記リガンドとの結合を破壊することによって、RNase H活性を誘導することを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 前記リガンドは、熱不安定性であることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 試料で、標的RNA配列を検出する方法であって、
標的RNA配列を含む試料と、
逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNase H活性を含み、前記RNase H活性は、前記リガンドによって抑制されるものである請求項18に記載のホットスタート酵素組成物と、
検出可能な標識を含み、RNase Hの切断配列を含むプローブ配列と、
前記標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、
前記標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、含む増幅反応組成物を提供する段階と、
RNA:cDNA二本鎖を形成するために、標的RNAの逆転写を開始する段階と、
約90℃以上の温度まで前記反応組成物を加熱し、それによってRNA:cDNAデュプレックスのRNA部分を分解するために、誘導性RNase H活性を活性化させる段階と、
一つ以上の増幅産物を形成するために、一つ以上の増幅反応を開始する段階と、
収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、
を含む方法。 - 前記プローブは、一つ以上のDNA配列部分と、1つのRNA配列部分とを含み、前記RNA部分が、RNA配列の3’末端と5’末端とが2つのDNA配列のそれぞれに連結される方式で、2つのDNA配列間に配列されたものであるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記標的RNA配列は、レトロウイルスであることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記反応組成物を加熱する段階は、約95℃で行われることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記加熱段階は、前記誘導性RNase H活性を活性化させることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記リガンドは、熱不安定性であることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 請求項1、13及び18のうちいずれか1項に記載のホットスタート酵素組成物を含むマイクロアレイ。
- 複数の試料で、標的RNA配列を検出する方法であって、
標的RNA配列を含む試料と、
逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNase H活性を含み、前記RNase H活性は、リガンドによって抑制される請求項18に記載のホットスタート酵素組成物と、
検出可能な標識を含み、RNase Hの切断配列を含むプローブ配列と、
標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、
標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、
それぞれ含む複数の増幅反応組成物を有するマイクロアレイを提供する段階と、
前記マイクロアレイのうちそれぞれの増幅反応組成物に対して、RNA:cDNAデュプレックスを形成するために標的RNAの逆転写を開始する段階と、
約90℃以上の温度まで反応組成物を加熱し、それによってRNA:cDNA二本鎖のRNA部分を分解するために、誘導性RNase H活性を活性化させる段階と、
一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階と、
収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、を含む方法。 - 前記標的RNA配列は、レトロウイルスであることを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 前記反応組成物を加熱する段階は、約95℃で行われることを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 前記加熱段階は、前記誘導性RNase H活性を活性化させることを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 前記リガンドは、熱不安定性であることを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 請求項42に記載のマイクロアレイを含むキット。
- 逆転写酵素活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項48に記載のキット。
- DNAポリメラーゼ活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項48に記載のキット。
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