KR101887518B1 - 표준물질로서 외부 생체분자를 이용한 생체분자의 분석 방법 및 그 키트 - Google Patents

표준물질로서 외부 생체분자를 이용한 생체분자의 분석 방법 및 그 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표준물질로서 외부 생체분자를 이용한 생체분자의 분석 방법 및 그 키트에 관한 것이다. 구체적으로는 표적 생체분자에 대한 핵산의 증폭물을 표준물질인 외부 생체분자에 대한 핵산의 증폭물을 정량하고 비교하여 상기 표적 생체분자에 대한 정량 정보를 얻을 수 있는 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

표준물질로서 외부 생체분자를 이용한 생체분자의 분석 방법 및 그 키트{Methods and kits for analyzing biomolecules using external biomolecules as reference substances}
본 발명은 핵산 분석을 통한 생체분자의 분석 방법 및 그 키트에 관한 것이다.
생체분자는 생체시료를 구성하는 수많은 단백질, 핵산, 지질 및 탄소화물 등의 물질이며 이런 생체분자들을 분석하는 기술 그리고 생체시료에서 생체분자들의 양적인 상태를 종합화한 정보, 즉 생체분자의 다중검사를 생산하는 기술은 물리학, 생화학 및 생물정보학의 발달로 널리 개발되었으나, 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다.
생체분자 분석 및 다중검사 기술은 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 목표를 이루기 위한 하나의 수단이지만, 미생물, 세포, 조직 등에 유용하게 사용할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다
생체시료인 조직, 세포덩어리, 세포 및 미생물 등을 구성하는 단백질 및 유기물질 등을 포함한 생체분자 분석 및 프로파일은, 물리, 화학적인 성질을 이용하여 여러 가지 방법으로 만들어지고 있다.
생체시료에 있는 생체분자 분석 및 분석결과를 이용한 생물학적 의미를 분석하기 위한 임상 의사 결정 지원 시스템(Clinical Decision Support System)는 환자 진료에서 의사가 진단과 치료에 관한 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정을 지원하는 시스템이다. 임상 의사 결정 지원 시스템은 크게 사례 기반 기계학습 추론 시스템(Case Based Machine Learning Inference System)과 전문가 시스템(Expert System)으로 나누어진다. 사례 기반 기계학습 추론 시스템은 질환이 판정된 환자들의 임상 정보(Clinical Information) 및 생물학적 정보 즉 생체분자 분석결과데이터들을 수집한 후 기계학습을 이용하여 주어진 임상 정보와 생물학적 정보 등으로 질환을 추론 또는 판별할 수 있도록 하는 시스템이다. 전문가 시스템은 의학 전문가에 의해 사전에 정해진 규칙(Rule)을 사용하여 질병을 진단하는 시스템이다.
또한 최근에는 생체분자를 다중 검사하는 대표적인 기술인 단백체에 대한 병렬고속분석(High Throughput Screening) 기법으로 단백질칩(Protein chip) 혹은 압타머칩(Aptamer chip)(Smith et al., Mol Cell Protomics, 11-18. 2003 및 McCauley et al., Anal Biochem, 319(2), 244-250. 2003)이 개발되어 사용되고 있다. 이런 병렬고속분석에는 사용되는 지지체로 유리슬라이드, 바이오센서의 감지표면, 비드, 나노입자 등이 있다.
또한 다중검사를 분석하여 유용한 생체분자를 결정하고 이를 분리한 후, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) 등으로 이들의 구성성분을 확인하는 방법 등이 수행되고 있다. 최근에는 SELDI-TOFMS(Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)에 의해 단백질 프로파일에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(Adam et al., Cancer Research, 62, 3609-3614. 2002; Li et al., Clinical Chemistry, 48, 1296-1304. 2002; and Petricoin et al., The Lancet, 359,572-577. 2002). 또 다른 접근 방법으로 DNA와 핵산 중합효소(polymerase)를 이용하여 신호를 증폭하는 기술인 immuno-PCR(IPCR) 방법이 개발되었다(Sano et al., Science 258, 120-122. 1992).
상기와 같이 생체분자 분석 방법은 검출감도의 향상 및 다중 분석능의 향상에 있어서 발전을 거듭했지만, 여전히 정도관리 및 측정용 표준물질, 분석비용절감, 분석시간의 단축, 민감도 향상 및 재현성 증대라는 기술적 과제에 직면해 있다.
상술한 종래의 생체분자들을 분석하는 기술들의 문제점을 극복하여, 생체분자들을 보다 개선된 효율성 및 민감도로 실시간 분석할 수 있는 기술을 개발하기 위하여 연구한 결과, 외부 생체분자를 표준물질로 사용하여 핵산 분석을 통하여 하나 이상의 생체분자들을 한 번의 검사로 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명의 목적을 달성하고자한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 측면에 있어서 본 발명은 핵산 분석을 통한 생체분자의 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 핵산 분석을 통한 생체분자의 분석 방법은 (a) 표적 생체분자가 하나 이상 존재하는 생체 시료 또는 그 가공 시료를 준비하는 단계와, (b) 상기 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 첨가하여, 생체분자와 그 특이적 연결 구조체의 복합체를 형성시키는 단계와, (c) 상기 복합체를 분리하는 단계와, (d) 상기 복합체의 설계핵산을 증폭하는 단계와, (e) 그 증폭 산물을 분석하여 표적 생체분자에 대한 정성적 또는 정량적 정보를 얻는 단계를 포함하되, 상기 설계핵산은 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역 그리고 그 영역 사이에 리간드가 특이적으로 결합하는 분자를 지시하여 그 분자를 식별하는 것을 가능하게 하는 영역을 가진 설계핵산인 것을 특징으로 한다.
상기 설계핵산은 그것이 연결된 리간드가 특이적으로 결합하는 분자를 지시(represent)하는 영역을 포함하고 있기 때문에, 그 설계핵산 증폭물의 존재 유무 및/또는 존재 양(즉 증폭 양)을 결정함으로써(정확히는 리간드가 특이적으로 결합하는 분자를 지시하는 영역의 증폭물의 존재 유무 및/또는 존재 양(즉 증폭량)을 결정함으로써), 그 설계 핵산에 연결된 리간드가 특이적으로 결합하는 분자를 정성적으로 분석하거나(즉 존재 유무를 확인하거나) 정량적으로 분석할 수 있다(즉 존재 양을 상대적 또는 절대적으로 확인할 수 있다).
여기서 리간드가 특이적으로 결합하는 분자를 지시하는 영역은 리간드가 특이적으로 결합하는 분자가 다르면 그에 따라 다르게 설계되는 영역을 말한다. 이러한 설계는 그 다름을 검출할 수 있는 한 어떻게 설계되든 무방하지만, 통상적으로는 염기서열을 달리하거나 그 길이를 달리하여 이루어질 것이다.
본 발명의 방법은 분석하고자 하는 생체분자가 둘 이상인 경우에도 그에 따라 그 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 첨가하고, 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(real time multiplex PCR) 등으로 증폭시킬 경우, 한 번의 증폭 과정으로(즉 한 번의 검사로 또는 하나의 튜브에서) 상기 둘 이상의 표적 생체분자들을 동시에 정성적 및/또는 정량적으로 분석할 수 있다. 여기서 설계핵산은, 그것이 결합된 리간드가 다르고 그에 따라 그 리간드가 각 다른 생체분자를 인지하여 결합하더라도, 그 정방향 프라이머가 결합하는 영역과 그 역방향 프라이머가 결합하는 영역이 모든 리간드와 설계핵산의 연결 구조체 사이에서 공통된 서열을 갖도록 설계되기 때문에, 모든 연결 구조체의 설계핵산은 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트로 증폭될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 리간드와 설계핵산의 연결 구조체는 리간드와 설계핵산을 공유적 또는 비공유적으로 결합시켜 얻어질 수 있다. 이러한 결합에는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 실시예에서 보여지는 바와 같이 설계핵산의 5' 끝에 아민기를 도입하여 공유적으로 리간드(단백질인 항체)에 결합시키거나, 바이오틴과 아비딘을 매개로(리간드에는 바이오틴을 결합시키고 설계핵산에는 아비딘을 결합시켜) 비공유적으로 결합시킬 수도 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 생체 시료의 가공 시료는 예컨대 생체 시료가 혈액인 경우 그것을 가공하여 얻어진 혈장 또는 혈청을 말하거나, 표적 생체분자가 단백질인 경우 총 단백질 추출 시약 등을 사용하여 생체 시료로부터 얻어진 총 단백질 시료를 말한다.
본 발명의 방법에서, 상대적 및/또는 절대적 정량 분석을 위한 표준물질을 사용할 수 있으며, 그러한 표준물질로서 분석하고자 하는 시료에는 존재하지 않는 외부 생체분자(외부 표준물질)를 사용할 수 있다.
이러한 외부 표준물질은 분석하고자 하는 시료에는 존재하지 않는 물질이라면 임의의 물질, 예컨대 분석하고자 하는 시료가 인간 유래의 생체시료이고 표적 생체분자가 단백질인 경우 아래의 실시예에서 사용한 대장균 유래의 단백질인 Enoyl-ACP Reductase 등을 들 수 있다.
외부 생체분자를 표준물질로 사용할 경우 그 표준물질에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체와 함께 첨가하여 복합체를 형성시키고, 그 형성된 모든 복합체(하나 이상의 생체분자와의 복합체와 표준물질과의 복합체 모두)를 분리한 후 그 복합체의 설계핵산을 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트로 증폭시켜, 외부 생체분자에 대한 증폭물을 표적 생체분자에 대한 증폭물과 정량하고 비교함으로써 생체분자의 상대적 또는 절대적 정량을 가능하게 할 수 있다. 여기서 외부 생체분자를 표준물질로 사용할 경우, 그 외부 생체분자를 정량하여 미리(복합체의 형성 전에) 분석하고자 하는 생체 시료 또는 그 가공 시료에 첨가할 필요가 있다. 이렇게 정량된 외부 생체분자를 표준물질로 사용하게 되면 그 표준물질에 대해서 생체분자의 분석과는 별도의 분석을 통해 검량선을 작성하지 않고도, 표적 생체분자를 절대적으로 정량하는 것이 가능해질 수 있다.
외부 생체분자를 표준물질로 사용할 경우 상기 표적 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도와 상기 외부 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이가 발생할 경우 상기 정량 결과가 표적 생체분자의 시료 중의 양(또는 농도)을 정확히 반영하지 못할 수 있다.
따라서 외부 생체분자를 표준물질로 사용할 경우 상기 표적 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도와 상기 외부 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이를 반영하여 상기 정량 결과를 보정하는 바람직할 수 있다.
그러한 차이를 반영하는 것은, (i) 상기 표적 생체분자와 상기 외부 생체분자를 정량하여 동일한 농도로 포함하는 대조시료를 준비하는 단계, (ii) 상기 대조시료의 표적 생체분자 또는 외부 생체분자에 특이적으로 결합하고 본 발명의 분석 방법에 사용한 연결 구조체와 동일한 연결 구조체를 첨가하여, 상기 표적 생체분자와 그 특이적 연결 구조체의 복합체와 상기 외부 생체분자와 그 특이적 연결 구조체의 복합체를 형성시키는 단계, (iii) 상기 복합체를 분리하는 단계, (iv) 상기 복합체들의 설계핵산을 증폭하는 단계, (v) 상기 표적 생체분자에 대한 증폭물과 상기 외부 생체분자에 대한 증폭물의 양적 차이를 구하는 단계, (vi) 상기 차이를 상기 표적 생체분자의 정량 결과에 반영하는 단계를 통하여 이루어질 수 있다.
상기 표적 생체분자는 단백질, 펩티드, 다당류, 지질, 이들 중 둘 이상이 결합하여 형성된 분자(당단백질, 당지질, 지질단백질, 지질다당체) 등, 그것을 인지하여 결합할 수 있는 리간드를 제조할 수 있는 한 특별한 제한이 없다.
또 상기 설계핵산은 이중가닥 핵산(DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA-RNA) 또는 단일가닥 핵산(DNA 또는 RNA)일 수 있으며, 아래의 실시예에서와 같이 리간드인 항체와의 결합을 용이하게 하기 위한 목적 등으로 아민기가 그 5' 끝에 도입되는 등 화학적으로 수식된 핵산일 수도 있다.
본 발명의 방법에서, 증폭 산물의 분석은, 증폭이 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR), 실시간 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(real time multiplex PCR), 실시간 멀티플렉스 역전사-중합효소 연쇄반응(real time multiplex RT-PCR) 등으로 이루어질 경우, 택맨(taqman) 프로브 등 적정 검출용 물질을 증폭 시에 사용하여 이루어질 수 있다. 또 상기 설계핵산의 증폭물(구체적으로 지시 영역의 증폭물)을 포착할 수 있는 프로브(일반적으로 상기 증폭물에 상보적인 염기서열을 가지는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드임)가 고착된 마이크로어레이를 사용하여 이루어질 수도 있으며, 아래의 실시예에서와 같이 모세관 전기영동을 실시하여 이루어질 수도 있다. 이러한 증폭 산물의 분석은 표적 생체분자에 대한 정성적 및/또는 정량적 정보를 제공할 것이다.
다른 측면에 있어서, 표준물질로서 외부 생체분자를 이용한 생체분자의 분석 키트를 제공한다.
이러한 분석 키트는 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 하나 이상 포함하여 구성될 수 있다.
바람직한 측면에 있어서, 상기 분석 키트는 1종 이상 표적 생체분자 각각에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 1 종 이상 포함하고, 또 표준물질로서 상기 표적 생체분자가 존재하는 생체시료에는 존재하지 않는 1종 이상 외부 생체분자 각각에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 1종 이상 포함하여 구성된다.
여기서 상기 설계핵산은 앞서 설명한 바와 같이 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역 그리고 이들 영역 사이에 리간드가 특이적으로 결합하는 분자를 지시하여 그 분자를 식별하는 것을 가능하게 하는 영역을 가진 설계핵산이고, 상기 설계핵산의 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역은 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트로 모든 설계핵산을 증폭할 수 있도록 모든 설계핵산에서 공통된 염기서열을 가진다.
바람직한 측면에 있어서, 상기 분석 키트는 상기 표적 생체분자와 그에 대한 상기 연결 구조체의 결합 친화도와 표준물질인 상기 외부 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이를 결정하기 위하여, 대조시료에 사용할 상기 1종 이상의 표적 생체분자와 상기 1종 이상의 외부 생체분자가 추가로 포함할 수 있다.
또 바람직한 측면에서, 상기 키트는 그 키트의 사용 설명서를 추가로 포함하고 그 사용 설명서는 생체분자의 분석 방법으로 전술한 바의 본 발명의 분석 방법을 프로토콜(protocol)로 교시할 수 있다.
또 바람직한 측면에서, 상기 키트에 포함되는 설명서는 표적 생체분자의 정량 정보에, 상기 표적 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도와 상기 외부 생체분자와 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이를 반영하는 것을, 추가로 교시할 수 있다.
또 바람직한 측면에서, 상기 키트에 포함되는 설명서는 상기 결합 친화도 차이의 반영에 대한 방법으로 전술한 바의 방법을 또한 추가로 교시할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
생체분자는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질(lipid), 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원균, 독성 물질, 기질, 대사 산물, 전이 상태 유사체(transition state analog), 보조 인자(cofactor), 저해제, 약, 염료, 영양분, 성장 인자, 세포, 조직 등일 수 있고, 제한이 없으며 거의 모든 화학적 또는 생물학적 작동체(effector)가 될 것이며 어떤 크기의 분자들이든 사용될 수 있는 표적분자 등을 의미한다.
생체시료에서 상기 생체분자를 분석하여 몸 안의 변화를 알 수 있으며 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있는 생물학적 의미를 결정할 수 있다.
리간드는 생체분자와 결합하는 물질로 대표적으로 항체, 압타머 및 펩타이드 등이며, 항체는 생체분자들과 특이적적으로 결합하는 물질로 항원의 항원결정부(epitope)와 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 단백질이다. 압타머 (aptamer)는 저분자 화합물로부터 단백질까지 다양한 종류의 리셉터에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 작은 (20~60 뉴클레오타이드) 단일가닥핵산 (DNA 혹은 RNA) 조각을 뜻한다.
표준물질은 정도관리 및 측정용의 물질로 분석하고자하는 시료에 항상 일정 양으로 존재하는 내부물질이거나 또는 상기 시료를 구성하는 생체분자들과 생물학적 분석방법에 의해 반응성이 없는 리간드에 결합하는 외부 생체분자를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 일반적으로 생체분자 분석의 경우 각종 시험, 검사시 비교를 위해 분석하고자하는 생체시료에 포함된 생체분자들로 내부정도관리를 한다. 상기 정도관리용 물질은 분석하고자하는 시료에 항상 일정량으로 존재하는 물질이 이상적이나 그렇지 못한 경우 시료에 포함되지 않는 물질인 외래물질을 사용할 수 있으며 바람직하게 분석하고자하는 시료가 생체시료인 경우 상기 생체시료에 포함되지 않는 외래생체분자들로 구성될 수 있다. 정도관리는 관리용 시료와 같은 외적표준을 사용하지 않고, 매회의 측정으로 얻을 수 있는 일군의 검사결과를 분석하여 측정치의 정밀도를 관리해 나가는 내부정도관리를 의미한다.
바람직하며, 본 발명에서 정도관리 및 측정용 표준물질 인간유래 생체시료를 분석하는 경우 인간유래 생체시료에 포함되지 않는 생체분자로 식물특이생체분자를 사용할 수 있다. 현재 인간, 대장균 및 식물의 일종인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 등의 게놈 프로젝트가 종결되어 종 특이적 단백질들이 보고되어 있다. 본 발명에서는 인간유래 생체시료를 분석하기 위해, 표준물질로 대장균 또는 식물 등의 특이단백질을 사용할 수 있다.
생체분자의 농도를 측정하여 평가하는 방법은 정밀도, 정확도, 재현성 면에서 신뢰받을 수 있어야 한다. 생체분자를 분석하는데 있어서 정확도가 중요시되는 이유는 시료는 단백질을 포함한 여러 종류 물질 등의 매우 복잡한 조성으로 구성되어 있으며, 그중 분석하고자 하는 대상 생체분자는 소량 존재하기 때문에 미량 성분의 분석을 위하여 정도관리 및 측정용의 표준물질이 필요성이 매우 높다.
시료에 존재하는 분석을 방해하는 물질들의 영향과 미량 분석이라는 점 때문에 분석값들의 실험실간 편차가 생길 수 있다. 실험실간의 편차를 줄이기 위하여, 분석하고하는 시료들에 같은 농도의 생체분자가 균질하게 함유하고 있는 정도관리 및 측정용 표준물질이 필요하게 되었으며, 이러한 표준물질을 사용하여 여러 실험실에서 분석한 분석값을 비교하여 분석기기 조건 등을 검토하여 정확한 분석 조건을 이끌어 내게 되는 것이다. 또한 분석하고자하는 시료에 상기 표준물질은 균질하게 분포하여 각 시료마다의 편차를 최소화하고 분석의 신뢰성을 높일 수 있는 생체분자 분석 방법이 필요하다.
따라서 본 발명은 도1에 제시한 바와 같은 개념으로 표적 생체분자 및 정도관리 및 측정용의 표준물질을 핵산분석기술로 함께 분석하는 기술인 가칭 리간드-핵산 분석 방법을 제공하여 생체분자 분석의 검사 한계, 정밀도, 정확도, 재현성 면을 개선하고자 한다.
본 발명에 있어서, 하나 또는 그 이상의 생체분자 분석하기 위해 정도관리 및 측정용의 표준물질은 분석하고자하는 시료에 항상 일정 양으로 존재하는 내부물질이거나 또는 상기 시료를 구성하는 생체분자들과 상기 리간드-핵산 분석 방법에 의한 결합 반응성이 없는 리간드에 결합하는 외부 생체분자이다.
상기 표준물질 및 표적핵산분자를 지시하는 설계핵산의 염기서열 및 핵산 길이를 이용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 리간드-핵산 분석 방법, 키트 및 장치를 제공한다.
설계핵산은 분석이 가능하도록 뉴클레오타이드(nucleotide)로 이루어진 핵산으로 상기 표준물질 및 분석하고자하는 특정 생체분자(가칭 표적 생체분자)를 염기서열 또는 염기서열의 길이로 지시하고 상기 표준물질 및 표적 생체분자에 결합하는 리간드에 결합하여 표준물질 및 생체분자 존재에 대한 신호를 핵산증폭 방법으로 증폭하여 증폭산물을 분석할 수 있도록 하는 역할을 한다.
상기 표준물질 및 표적 생체분자를 지시하는 설계핵산은 상기 표준물질과 표적 생체분자를 지시하는 설계핵산들 사이에는 생물학적 분석방법의 일종인 혼성화 반응성이 없거나 그 길이이 상이하며 핵산분석기술에 의해 분석 가능해야 해야 한다. 바람직하게, 설계핵산을 분석하는 동일한 방법으로 분석이 가능하도록 하며 설계핵산의 증폭에 사용하는 PCR 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.
특정 생체분자에 상응하는 리간드에 상기 설계핵산이 연결된 구조체를 분석리간드 및 표준물질에 상응하는 리간드에 설계핵산이 연결된 구조체를 표준분석리간드이라 지칭한다.
상기 설계핵산을 분석하기 위해 설계핵산 존재 신호를 증폭하는 방법인 "증폭반응(Polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은 타겟 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들 이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(Stemmer, W.P., et al., 1995, Gene, 164, 49-53; Carlson, B., 2008, Genet Eng Biotechn N, 28, 12-12), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediated amplification; TMA)(SantaLucia, J., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 1460-1465.) 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제 5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호) 및 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 표적 생체분자의 검사한계를 높이기 위해 디자인된 설계핵산을 사용하였으며 존재신호를 일차적으로 핵산 증폭기술로 하고 이차적으로 형광물질로 증폭하였으며, PCR에 의한 핵산의 증폭은 해상력을 높일 수 있다.
바람직하게, 상기 설계핵산 존재신호를 증폭하는 PCR 방법을 구현하기 위해, 분석리간드 및 표준분석리간드 구조체에서 특정 리간드에 연결되는 설계핵산의 구성은 다음의 일반식(I)로 표시된다.
5'-P1-NV-P3-3' (I)
상기 일반식(I)에서, P1 영역과 P3 영역은 각각 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머가 결합하는 영역이고, NV 영역은 특정 염기서열 또는 그 길이로 특정 생체분자에 결합하는 리간드를 지시하는 부분(즉 특정 생체분자를 지시하는 영역)으로 특정 생체분자를 정성 및 정량적으로 분석할 수 있도록 하는 역할을 한다. 이 NV 영역은 바람직하게 10~200 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
또 바람직하게는 리간드에의 결합을 용이하게 하기 위하여 5' 끝에 반응성 그룹인 아민가가 있을 수 있으며 정방향 프라이머가 결합하는 영역 상위(upstream)에 약 10개의 뉴클레오타이드로 구성된 스페이서(spacer)가 있을 수도 있다.
바람직하게는, 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 유니버셜 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.
상기 PCR 프라이머 쌍에서 정방향 프라이머는 설계핵산의 염기서열에 완전하게 상보적으로 결합하는 열기서열로 구성될 수 있으며 역방향 프라이머는 설계핵산의 염기서열과 동일할 수 있으며 바람직하게는 상기 PCR 프라이머는 유니버셜 PCR 프라이머 쌍일 수도 있다.
유니버셜 PCR 프라이머는 일반적으로 염기서열 결정이나 PCR 등에 많이 사용되는 염기서열인 올리고뉴클레오타이드로 상업적인 클로닝 벡터 등에 많이 사용된다.상기 유니버셜 PCR 프라이머는 14머 에서 40머 사이의 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 폴리머라제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.
"증폭산물"은 폴리뉴클레오티드 증폭 반응의 산물을 의미한다. 즉, 이것은 일반적으로 이중 가닥이고 하나 이상의 출발 서열로부터 복제되는 폴리뉴클레오티드 집단이다. 하나 이상의 출발 서열은 동일 서열의 하나 이상의 카피일 수 도 있거나, 이것은 상이한 서열의 혼합물일 수도 있다. 증폭 산물은 다양한 증폭반응에 의해 생성될 수 있는데, 상기 증폭 반응의 산물은 하나 이상의 표적 핵산의 다수의 복제물이다. 본 발명에서는 상기 설계핵산의 증폭산물을 핵산분석기술로 분석하여 시료에서 표적 생체분자를 분석할 수 있다.
본 발명에 따라, 설계핵산의 P1 부분에 있는 반응성 그룹 N과 리간드의 반응성 그룹 N에 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 결합이 상기 설계핵산의 적어도 하나의 표적 생체분자를 지시하는 것을 특징으로 하는, 상기 설계핵산의 적어도 하나의 표적 생체분자를 지시하는 방법이 제공된다.
상기 설계핵산과 리간드의 연결은 여러 가지 방법으로 할 수 있으며 바람직하게, 설계핵산 및 리간드 각각에 반응성 그룹을 결합시켜 화학적인 반응으로 분석리간드를 제조하는 것이다. 본 발명에 따라, 분석리간드가 제공된다. 본 발명에 따른 분석리간드는, 리간드에 위치하는 반응성 그룹 N에, 하나 이상의 설계핵산이 결합되어 있다.
바람직하게, 상기 설계핵산은, 표적 생체분자를 지시하고 핵산분석기술에 의해 분석할 수 있는 능력을 보유하거나 존재 신호를 증폭할 수 있도록 결합되어 있다.
바람직하게, 상기 반응성 그룹 N이 아미노그룹, 카르복실그룹, 치올그룹, 알킬, 알케닐, 알키닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 옥소알키닐, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 설포알킬, 설포알케닐, 설포알키닐 그룹, 포스포알킬, 포스포알케닐, 및 포스포알키닐 중에서 선택된 하나 이상의 그룹을 포함한다.
본 발명에 따라, 표적 생체분자에 특이적으로 결합하는 리간드를 효과적으로 지시하는 것을 특징으로 하는, 상기 표적 생체분자를 포함하는 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 개체 내 질환 또는 상태를 분석하기 위한 설계핵산을 제공된다.
생체분자와 리간드 복합체를 수확하는 방법은 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 한 방법은 분석하고하는 시료의 생체분자들을 비특이적으로 고체 지지체에 결합시키는 방법으로 바람직하게 상기 고체 지지체는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법에서 사용하는 플레이트(plate) 또는 나이트로셀룰로즈 막(Nitrocellulose membrane)이며 또 다른 방법은 상기 표준물질 및 표적 생체분자의 리간드를 고체 지지체에 결합시키는 방법으로 바람직하게, 상기 고체 지지체는 자성비트이다.
본 발명에서는 상기 표적 생체분자와 리간드 복합체를 수확할 수 있도록 하는 구조체를 수확리간드 및 상기 표준물질과 리간드 복합체를 수확할 수 있도록 하는 구조체를 표준수확리간드라 지칭하였다.
도 2에 제시한 바와 같이, 농도를 알고 있는 표준물질이 있는 분석하고자하는 시료에서 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 분석하기 위해, 상기 표준물질 및 표적 생체분자에 대한 설계핵산의 염기서열 또는 핵산 길이를 설계핵산을 증폭하여 얻은 증폭산물을 핵산분석기술로 분석하여 상기 표적 생체분자를 분석할 수 있다. 바람직하게, 상기 표적 생체분자를 분석한 결과는 표적 생체분자의 존재량 또는 존재량의 비율이거나 표준물질과 표적 생체분자별 비율이다.
상기 표적 생체분자 및 표준물질에 따라 상기 설계핵산의 염기서열을 결정하여 지시하도록 함으로써 상기 설계핵산의 염기서열을 결정하는 방법을 사용하여 상응하는 표적 생체분자를 분석할 수 있으며 바람직하게, 상기 표적 생체분자 및 표준물질에 상응하는 설계핵산 증폭산물의 염기서열로 하나 또는 그 이상의 상기 표적 생체분자의 정성 및 정량 분석을 동시에 할 수 있다.
바람직하게, 상기 증폭산물의 염기서열은 혼성화를 기반으로 한 FRET 프로브와 Real time PCR를 사용하는 방법 또는 포착(capture) 프로브와 혼성화 방법을 이용한 방법인 비드어레이 혹은 마이크로 어레이를 사용하여 결정한 후, 상기 표적 생체분자의 존재 유무 및 존재 양을 분석할 수 있다.
하나 또는 그 이상 종류의 설계핵산을 증폭한 후 암플리콘(amplicon) 검출은 힘들고 시간이 많이 소요되는 것일 수 있다. PCR 과정 동안 증폭을 모니터링하기 위해 실시간 방법들이 있다. 특정한 핵산 한 종류를 분석하기 위해 사용하는 이상적인 방법들은 통상적으로 새로 합성된 DNA에 어닐링하는 형광 표지 프로브이다.
한 튜브에서 농도를 알고 있는 표적물질이 있는 시료에서 상기 표준물질과 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 동시에 분석하기 위해, 이들에 상응하는 염기서열이 상이한 설계핵산을 제작하고 이들을 표적 생체분자와 결합하는 리간드에 결합시켜 분석리간드를 준비한 후, 분석하고자하는 시료와 반응시켜 수확한 분석리간드-생체분자-수확리간드 복합체 및 표준분석리간드-표준물질-표준수확리간드 복합체의 설계핵산을 주형으로 유니버셜 PCR 프라이머 쌍으로 PCR를 수행하면 증폭산물을 합성할 수 있다.
상기 표준물질을 포함한 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자의 리간드 및 설계핵산을 분석하기 위해, 설계핵산의 염기서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 FRET 프로브를 제조할 수 있다.
상기 FRET 프로브는 일반적으로 공여체 발광(donor emission)이 두 개의 발색소 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)에 의해 표적의 부재시 퀀칭되도록 설계된다. 공여체 발색소와 수용체 발색소의 쌍이 인접하여 위치한 경우, 여기 상태에 있는, 공여체 발색소 (donor chromophore)는 수용체 발색소에 에너지를 전달할 수 있다. 이 전달은 항상 비방사적(non-radiative)이며 쌍극자-쌍극자 커플링 (dipole-dipole coupling)을 통하여 일어날 수 있다. 상기 발색소 사이의 거리를 충분하게 증가시키는 경우, FRET 효율이 저하되고, 공여체 발색소 발광이 방사적으로 검출될 수 있다. 공여체 발색소의 예는 FAM(6-carboxyfluorescein), TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함한다. 수용체 발색소의 여기 스펙트럼은 공여체 발색소의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택된다. 그러한 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다.또한, 넓은 범위의 공여체를 퀀칭(quenching)하는 비형광 수용체(nonfluorescent acceptor)가 존재한다. 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.
PCR의 실시간 검출을 위해 이용될 수 있는 FRET 프로브의 일반적인 예는 분자 비콘(molecular beacon)(예를 들면, 미국특허 제5,925,517호), TaqMan 프로브 (예를 들면, 미국특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CATACLEAVE 프로브probes (예를 들면, 미국특허 제5,763,181호)를 포함한다.
상기 분자 비콘은 미결합 상태에서 프로브가 공여체 발색소와 수용체 발색소가 인접하게 존재하고 공여체 발광이 감소되는 것인 이차 구조를 형성하도록 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 적합한 반응 온도에서, 상기 비콘은 언폴딩되고(unfold) 암플리콘에 특이적으로 결합한다. 일단 언폴딩되면, 공여체 발색소와 수용체 발색소 간의 거리가 증가하여 FRET가 역전되고 특화된 장치를 이용하여 공여체 발광이 모니터링될 수 있다. TaqMan 및 CATACLEAVE 기술은 이용되는 FRET 프로브가 절단되어 공여체 발색소와 수용체 발색소가 FRET를 역전시킬 수 있도록 충분히 분리된다는 점에서 분자 비콘과 다르다.
TaqMan 기술은 5' 말단에서 공여체 발색소 및 3' 말단에서 수용체 발색소로 표지된 단일 가닥 올리코뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭을 위해 이용되는 DNA 폴리머라아제는 5'3' 엑소뉴클레아제 활성을 포함해야 한다. TaqMan 프로브는 프라이머가 결합하는 것과 동시에 암플리콘의 하나의 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라아제가 프라이머를 연장하면서, 상기 폴리머라아제는 궁극적으로 결합된 TaqMan 프로브와 만날 것이다. 이때, 상기 폴리머라아제의 엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 TaqMan 프로브를 분해할 것이다. 상기 프로브가 소화되면서, 상기 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드가 반응 버퍼 내로 방출된다. 공여체는 수용체로부터 멀리 확산되고 FRET가 역전된다. 프로브 절단을 확인하기 위해 공여체로부터의 발광이 모니터링된다. TaqMan이 작용하는 방식 때문에, PCR의 매 사이클마다 1회만 특정 암플리콘이 검출될 수 있다.
TaqMan 표적 부위를 통한 프라이머의 연장은 다음 PCR 사이클에서 암플리콘이 변성될 때까지 TaqMan 프로브의 추가적인 결합을 막는 이중 가닥 산물을 생성한다.
그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허 제5,763,181호는 또 다른 실시간 검출방법("CATACLEAVE"으로 지칭됨)을 기술한다. CATACLEAVE 기술은 프로브의 절단이 폴리머라아제 활성을 갖지 않는 제2 효소에 의해 이루어진다는 점에서 TaqMan과 다르다. CATACLEAVE 프로브는 엔도뉴클레아제, 예를 들면, 제한 효소 또는 RNase의 표적인 분자 내의 서열을 갖는다. 일 예에서, CATACLEAVE 프로브는 상기 프로브의 5' 및 3' 말단이 DNA로 이루어지고 절단 부위는 RNA를 포함하는 것인 키메라 구조를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 Taqman 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 상기 설계핵산에 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 가지는 것이다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YOPROTM-1 (509), YOYOTM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorXTM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon GreenTM 500 (522), Oregon GreenTM488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin (648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 Cy5, ROX, HEX, FAM, BHQ-1, BHQ-2 또는 Cy5.5-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 Cy5, ROX, HEX, FAM 및 Cy5.5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 FRET 프로브를 이용하여 상기 표준물질을 포함하여 5종류이상의 표적 생체분자를 분석하는 것을 특징으로 하는 리간드-핵산 분석 방법, 키트 및 장치를 제공한다.
TOCE(Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension)는 다수의(5개이상의) 목표 유전물질 검출과 유전변이를 확인 가능하게 하는 기술이다(Lee, D. H. TOCE: Innovative Technology for High Multiplex Real-time PCR.Seegene bulletin 1, 510 (2012)).
본 발명에서는 농도를 알고 있는 분석시료에서 상기 하나 또는 그 이상의 생체분자를 분석하기 위해, 상기 설계핵산에 DPO primer 기술과 Pitcher&Catcher 기술을 구현할 수 있도록 제작하는 방법을 제공한다.
*설계핵산 구조[일반식I]에서 상기 P1 영역은 DPO 정방향 프라이머와 상보적인 결합을 하는 일부 또는 전체로 구성하고, 상기 P3 영역은 DPO 역방향 프라이머와 동일한 염기서열을 일부 또는 전체로 구성하며, 상기 Nv 영역은 Tagging portion이 있는 Pitcher 프라이머와 상보적인 결합을 하는 부위를 일부 또는 전체로 구성한다.
본 발명은 바람직하게, 상기 Tagging portion이 상보적 결합하는 부분과 신호를 발생할 수 있는 FRET 프로브를 이루는 template 부분을 일부 또는 전부로 구성된 Catcher 올리고머를 제공한다.
본 발명은 상기 설계핵산을 상기 DPO 정방향 프라이머와 상기 DPO 역방향 프라이머로 증폭하는 과정에서 상기 Pitcher 프라이머의 Tagging portion이 방출되어 상기 Catcher 올리고머에 상보적으로 결합하여 신장되면서 신호를 발생하게 되는 하는 것을 특징으로 하는 리간드-핵산 분석 방법, 키트 및 장치를 제공한다.
TOCE 기술은 하나의 채널에서 여러 핵산에 대한 동시 확인이 가능하다. 형광 signal은 실시간으로 확인되기도 하며 Catcher의 융해온도 (Catcher-Tm)를 분석하여 Target의 존재여부를 확인할 수도 있다. 형광분자가 붙어있는 Artificial template인 Catcher는 각 Target에 해당하는 형광 signal을 생성한다. Catcher-Tm값은 Catcher의 길이나 염기서열을 변화시켜서 조절할 수 있다. TOCE반응의 적합화를 위해서 Catcher-Tm값은 Target의 염기 서열과는 관계없이 손쉽게 바꿀 수 있다.
현재 사용되고 있는 probe 방식의 Tm 분석 기법들은 목표 핵산 DNA에 직접적 결합하는 반면, TOCE 방식은 catcher를 이용하여 형광 signal을 생성하므로 Catcher의 길이나 염기서열 변화를 조절하여 Tm 값을 자유롭게 조절할 수 있다. 또한, 기존 방식들은 핵산의 염기서열 변화가 생길 경우 Tm 값에 차이를 갖게 되지만, TOCE 방식은 염기서열의 변화를 변지 않아 일정한 Tm 값을 유지하게 된다. 이러한 독특한 Pitcher & Catcher 방식으로 인해 단일 채널내에서 다수의 핵산 검사(multiplexing)가 정확하게 이루어지게 된다. Real-time PCR 과정 중에 cyclic-CMTA point를 설정하여 핵산의 존재 유무 뿐 아니라 정량적인 분석 결과를 동시에 확인할 수 있다. cyclic-CMTA point는 real-time PCR 과정 중에 30, 40, 50 cycle에 설정할 수 있으며, 결과 분석 시 존재하는 핵산의 양에 따른 melting peak의 양상에 따라 정량적인 분석을 수행할 수 있다.
Real-time PCR에서 증폭산물의 양을 측정하는 방법에는 절대정량(absolute quantification)과 상대정량(relative quantification)이 있다. 절대정량은 농도를 알고 있는 표준물질을 사용하여 표준곡선을 만들고 이를 이용하여 측정하고자 하는 대상 유전자의 농도를 산출해내는 방법으로 대상 유전자와 표준물질의 PCR 효율이 동일하다는 가정 하에서 시행되며, 보다 정확한 정량을 위해서 대상 유전자와 농도를 알고 있는 내부대조 물질을 동시에 증폭시켜 정량하게 된다.
한편 특정 대상 유전자 표현의 변화를 확인하기 위한 mRNA 정량에는 기준 유전자(reference gene)와 대상 유전자를 사용하여 각각의 표준곡선(standard curve)을 만들고 이를 이용하여 이들의 증폭정도를 농도로 산출한 후, PCR 간의 변이를 보상하기 위하여 기준 유전자에 대한 대상 유전자의 비율(대상 유전자의 농도/기준 유전자의 농도)을 계산하는 상대정량이 이용된다. 상대정량이 절대정량에 비하여 좀더 쉽고 경제적이며 신뢰성 있는 방법으로 생각되지만, 여전히 표준곡선의 조제와 보관 등에 따른 오류의 위험을 내포하고 있다.
본 발명에서는 한 튜브에서 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자와 정도관리 및 측정용 표준물질을 동시에 반응을 시켜 수확한 복합체에 있는 설계핵산을 Multiplex Real Time PCR로 분석하여 확보한 Ct 값을 이용하여 절대 정량 및 상대정량을 한다.
PCR에서는 1 cycle마다 DNA가 지수적으로 증폭하다가 plateau에 도달한다. 이 증폭의 모습을 Real time으로 모니터링한 그림이 증폭곡선이다. PCR 증폭산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 signal이 상승하다가 plateau에 도달한다.
초기 DNA량이 많을수록 증폭산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 Real time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 threshold를 설정하면 threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점인 Ct값(Threshold Cycle)이 산출된다.
Ct값과 초기 주형량 간에는 직선적인 관계가 있는 검량선을 만들 수 있다. 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 template량을 구할 수 있다.
본 발명에서 설계핵산인 앰플리콘(amplicon)의 구조가 상기 일반식(I)에 제시한 것처럼 동일한 구조와 동일한 PCR 프라이머 쌍으로 증폭하여 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자와 정도관리 및 측정용 표준물질을 지시하는 설계핵산의 증폭효율이 모두 동일하다(자료 미제시).
본 발명에서는 한 튜브에서 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자와 정도관리 및 측정용 표준물질을 동시에 반응을 시켜 수확한 복합체에 있는 설계핵산을 Multiplex Real Time PCR로 분석하여 확보한 Ct 값을 이용하여 절대 정량 및 상대정량을 하였다.
본 발명에서 설계핵산인 amplicon의 구조가 상기 [일반식(I)]에 제시한 바처럼 동일한 구조와 동일한 PCR 프라이머 쌍으로 증폭하여 상기 표적 생체분자와 정도관리 및 측정용 표준물질을 지시하는 설계핵산의 증폭효율이 모두 동일할 것이다.
본 발명의 아래의 실시예에서는 정도관리 및 측정용의 표준물질을 인위적으로 첨가된 분석하고자하는 시료에 있는 표적 생체분자에 의해 형성된 복합체 설계핵산의 존재량을 상기 실시예에서 얻어진 Ct (cycle threshold)값은 2-Ct법(comparative Ct method)으로 분석하였다 (Livak KJ. Comparative Ct Method. ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. User Bulletin No. 2. Relative Quantitation of Gene Expression. PE Applied Biosystems, 1997.).
본 Ct법에서는 검량선을 작성하지 않고 정량을 실시할 수 있다. 다만, 측정하는 모든 생체분자에 대해 PCR 증폭 효율이 거의 일정하다는 것이 전제이다.
표준물질이 첨가된 분석하고자하는 시료에서 분석된 표적 생체분자의 복합체 설계핵산의 Ct값을 표준물질 복합체의 설계핵산 Ct값으로 normalization(Ct표적 생체분자- Ct외부 표준물질)하고 이를 △Ct-n라고 하면, 표준물질이 첨가된 분석하고자하는 시료에서 표적 생체분자의 농도는 다음과 같이 산출되게 된다:
외부 표준물질의 농도 x 2-△Ct-n
외부 표준물질과 그 특이적 리간드의 결합력과 표적 생체분자와 그 특이적 리간드의 결합력 사이에 차이가 있을 경우 상기 결정된 표적 생체분자의 농도는 그것의 시료 중의 농도를 제대로 반영하지 못할 수도 있다. 따라서 그 결합력의 차이로 보정하는 것이 바람직하다.
이러한 보정을 위해서, 먼저 표적 생체분자와 표적 외부 표준물질을 정량하여 이들을 동일한 농도로 포함하는 대조시료 1개 이상을 준비하고, 이 대조시료(들)를 이용하여 표적 생체분자에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물로부터 산출된 Ct값(또는 대조시료가 2 이상인 경우 그 값들의 평균)과 외부 표준물질 복합체의 설계핵산의 증폭물로부터 산출된 Ct값(또는 대조시료 2 이상인 경우 그 값들의 평균)을 구하여, 그 차이 값(Ct대조시료의 표적 생체분자-Ct대조시료의 외부 표준물질)인 △Ct-c를 구한다. 다음에는 이 값으로 상기 △Ct-n를 Calibration한 △Ct-cal(△Ct-n - △Ct-c)를 구하여, △Ct-cal로 아래의 식에서와 같이 외부 표준물질의 농도로부터 표적 생체분자의 농도를 구하면 상기 결합력이 차이가 반영된 결과를 얻을 수 있다.
외부 표준물질의 농도 x 2-△Ct-cal
따라서 분석하고자 하는 시료 중의 표적 생체분자는 외부 표준물질의 농도보다 2-△Ct-cal의 농도로 존재한다고 할 수 있다.
또한, 상기 표적 생체분자에 따라 상기 설계핵산의 길이를 결정하여 상기 표적 생체분자를 설계핵산의 길이로 지시하도록 함으로써 상기 설계핵산의 길이를 결정하는 방법을 사용하여 상응하는 표적 생체분자를 분석할 수 있으며 바람직하게, 상기 설계핵산 증폭산물의 길이로 하나 또는 그 이상의 상기 표적 생체분자의 정성 및 정량 분석을 동시에 할 수 있다.
농도를 알고 있는 표준물질을 포함하는 분석하고자하는 시료에서 표준물질 및 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 분석하기 위해 이들에 상응하는 길이가 상이한 설계핵산을 제작하고 이들을 표준물질 및 표적 생체분자와 결합하는 리간드에 결합시켜 분석리간드를 준비한 후, 분석하고자하는 시료와 분석리간드를 반응시키고 수확한 표준물질 및 표적생체분자 복합체의 설계핵산을 주형으로 유니버셜 PCR 프라이머 쌍으로 PCR를 수행하면 증폭산물을 합성할 수 있다. 상기 증폭산물의 길이의 분석결과로부터 표준물질의 설계핵산의 분석결과를 이용하여 증폭산물 길이에 상응하는 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자의 존재 유무 및 존재 양을 결정할 수 있다.
바람직하게 복합체의 설계핵산의 PCR에 사용하는 프라이머 쌍은 유니버셜 프라이머 쌍이고 그 중 어느 한 프라이머에 표지물질인 형광물질로 표지하여 증폭산물을 표지한다.
본 발명에 있어서, 상기 표지물질은 비오틴(Biotin), Cy2, GFP, YO-PRO-1, YOYO-1, Calcein, FITC, FlourX, ALEXA 488, Rhodamine 110, ABI 5-FAM, Oregon Green 500, Oregon green 488, RiboGreen, Rhodamine Green, Rhodamine 123, Magnesium Green, Calcium Green, TO-PRO-1, TOTO-1, ABI JOE, BODIPY 530/550, Dil, BODIPY TMR, BODIPY558/568, BODIPY564/570, Alexa 546, TRITC, Magnesium Orange, Phycoerythrin R & B, Rhodamine Phalloidin, Calcium Orange, Pyronin Y, Rhodamine B, ABI TAMRA, Rhodamine Red, Cy3.5, ABI ROX, Calcium Crimson, Alexa 594, Texas Red, Nile Red, YO-PRO-3, YOYO-3, R-phycocyanin, C-phycocyanin, TO-PRO-3, TOTO-3, DiD DilC(5), Thiadicarbocyainie, Cy5.5, Cy5 또는 Cy3에서 선택되는 형광색소를 사용할 수 있다.
바람직하게, 상기 증폭산물의 크기를 젤 전기영동 혹은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)방법을 사용하여 결정한 후, 상기 표적 생체분자의 존재 유무 및 존재 양을 분석할 수 있다.
본 발명은 설계핵산 및 표준물질을 사용하여 분석하고자하는 시료에서 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 분석하기 위해, 상기 표준물질의 종류 및 상기 생체분자-리간드 복합체의 수확방법을 고려하여 구성한 리간드-핵산 분석 방법, 키트 및 장치를 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 상기 표적 생체분자를 생체분자로 이루어진 시료에서 정도관리 및 측정용의 표준물질을 사용하여 핵산분석기술로 분석하기 위해, 상기 시료로부터 상기 표적 생체분자를 분석하는 분석시료를 제조하는 단계, 상기 표준물질 또는 표적 생체분자의 리간드 및 설계핵산을 제조하는 단계, 한 튜브에서 상기 리간드 및 설계핵산과 상기 분석시료를 반응시켜 형성된 상기 표준물질 또는 표적 생체분자 복합체를 수확하는 단계, 상기 수확된 표준물질 또는 표적 생체분자 복합체들의 설계핵산을 증폭하여 증폭산물의 염기서열 또는 길이를 분석하는 단계 및 상기 증폭산물의 분석결과로부터 상기 표적 생체분자를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드-핵산 분석 방법, 키트 및 장치를 제공한다.
본 발명의 생체분자 분석 방법을 보다 효율적으로 측정하기 위하여, 분석하고자하는 시료를 준비하는 시료처리장치 그리고 상기 시료와 상기 분석리간드, 상기 수확리간드 및 상기 표준물질을 반응시켜 형성된 분석리간드-생체분자-수확리간드 복합체 및 표준물질을 제조하고 복합체에 포함된 설계핵산 및 표준물질을 증폭하는 모듈, 상기 증폭산물을 분석하는 모듈 등을 포함하는 리간드 PCR를 이용한 생체분자 분석 장치에 있어서, 본 발명의 장치 및 시스템은 혼합챔버, 용해챔버 및 반응챔버으로 구성된 시료처리장치 및 증폭장치로 구성되고 이들이 통합되어 운영될 수도 있다.
리간드-핵산 분석 방법을 이용한 생체분자 분석 장치 및 시스템은 핵산 증폭 및 분석 기술을 이용한 설계핵산을 분석하는 방법을 통해 실시하는 것을 특징으로 하고, 상기 표적 생체분자를 포함하는 시료에서 생체분자를 준비하는 시료처리장치, 상기 시료와 상기 분석리간드, 상기 수확리간드, 상기 표준분석리간드 및 상기 표준수확리간드를 반응시켜 형성된 분석리간드-생체분자-수확리간드 복합체 및 표준분석리간드-표준물질-표준수확리간드 복합체를 제조하고 세척한 후 이들 복합체의 설계핵산을 증폭하는 모듈, 상기 증폭산물을 분석하는 모듈로 리간드-핵산 분석 장치 및 시스템이다.
관심 대상의 생체분자를 분석하고자하는 시료의 분석은 일련의 시료 준비 단계를 수반하며, 혼합챔버와 용해챔버로 구성된 시료처리장치에서 이루어진다. 이들 단계에는 여과, 세포 용해, 핵산 그리고 시약과의 혼합을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게는 세포로 구성된 생체시료에서 세포를 가용화시켜 생체분자들을 제조하고 추가적인 단계를 공지된 방법으로 할 수 있다.
바람직하게는 ELISA에서 사용하는 플레이트를 사용한 제조된 분석리간드-생체분자 복합체 및 표준분석리간드-표준물질의 분리방법은 먼저, 상기 시료를 표적 생체분자 및 표준물질을 지지체에 결합시킨 후, 분석리간드를 반응시켜 생체분자-분석리간드 복합체를 제조하고 세척단계를 수행하여 미결합 분석리간드를 제거하여 정제된 복합체를 준비할 수 있다.
*상기 분석시료, 분석리간드, 수확리간드, 표준분석리간드 및 표준수확리간드를 반응시켜 분석리간드-생체분자-수확리간드 복합체 및 표준분석리간드-표준물질-표준수확리간드 복합체를 제조하여 다양한 방법으로 제조된 복합체들을 수확리간드 및 표준수확리간드의 자성을 이용하여 자석으로 수확하고 세척단계를 수행하여 미결합 분석리간드 및 표준분석리간드를 제거하여 정제된 복합체를 준비할 수 있다.
상기 분리된 표준분석리간드-표준물질-표준수확리간드 복합체 및 분석리간드-생체분자-수확리간드 복합체의 설계핵산들을 일반적인 핵산분석방법으로 핵산의 정량분석을 할 수 있다. 그리고 분석된 결과로부터 표적 생체분자가 포함된 생체시료에서 표적 생체분자의 생물학적 의미를 결정할 수 도 있다.
시료는 예를 들어 배양된 세포, 단백질, 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제, 또는 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군 또는 정소(testis)로부터 얻은 조직(tissue), 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨액(urine), 타액(saliva), 땀(sweat), 정액(semen) 또는 점액(mucus) 등의 체액(body fluid)일 수 있으며, 이에 한정되지는 않으며 선택되는 표적 생체분자를 함유하는 것으로 여겨지며, 이 표적 시료는 적어도 둘 또는 그 이상의 표적 생체분자를 포함한다. 상기 방법은, 시료와 시료 조제 대조군과 혼합하는 혼합챔버를 갖는 장치 안으로 시료를 도입하는 단계를 포함한다. 시료 조제 대조군은 단백질, 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 시료 조제 대조군은 정도관리 물질을 포함한다. 상기 장치는 또한 용해 챔버와 반응 챔버를 구비한다. 시료는 혼합 챔버에서 샘플 조제 대조군과 혼합된다.
증폭장치의 반응 용기의 반응 챔버 내의 반응 혼합물은 설계핵산 증폭 조건에 노출된다. 반응을 이용한 RNA 또는 DNA 주형의 증폭은 공지되어 있다[미국 특허 제4,683,195호; 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis et. al.,, 1990)]. DNA의 핵산증폭은 DNA를 열변성시키고, 증폭될 DNA 분절에 측접하는 서열에 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하며, 어닐링된 프라이머를 DNA 중합효소에 의해 연장시키는 것으로 이루어진 사이클의 반복을 수반한다. 프라이머는 표적 서열의 대향하는 가닥(strand)에 교배되는 한편, 중합 효소에 의한 DNA 합성이 프라이머 사이의 영역에 걸쳐 진행되도록 배향되어, DNA 분절의 양을 효과적으로 두배로 만든다. 또한, 확장 생성물은 또한 보완적이며 프라이머를 결합할 수 있기 때문에, 개개의 연속적인 사이클은 이전 사이클에서 합성된 DNA의 양을 실질적으로 두배로 만든다. 이는 사이클 당 2n(여기서, n은 사이클 수)의 비율로 특정 표적 분절의 지수적 축적을 가져온다. 증폭반응 및 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)과 같은 방법이 직접 표적 DNA 서열의 핵산 서열을 직접 증폭시키는 데에 사용될 수 있다. 등온 증폭 반응이 또한 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
설계핵산 증폭 반응은 바람직하게는 반응용기내의 반응 혼합물을 증폭반응에 필요한 온도로 가열 및/또는 냉각시키는 열처리장비를 사용하여 수행한다. 그러한 열처리 장비는 또한 시료 조제 대조군의 표준물질 핵산 서열 및 샘플에서 테스트하기 위한 하나 이상의 표준물질 핵산 서열을 검출하는 하나 이상의 검출 기구를 포함할 수 있다. 반응용기 내의 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 광학적 검출기가 내장된 바람직한 열처리 장비(미국 특허 제6,369,893호; 미국 특허 제6,391,541호)를 사용할 수 있다. 또한, 반응 혼합물의 온도를 제어하고, 이 반응 혼합물에서 핵산 서열을 검출하기 위해 본 발명에 적합한 많은 기타 공지의 방법이 있다.
증폭 생성물의 검출을 위한 다른 바람직한 방법으로, 형광 프로브는 형광 리포터 염료(fluorescent reporter dye) 모두에 의해 표지화된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 포착프로브의 분열은 리포터 염료의 형광 강도의 증가를 발생시킨다.
유체제어 장치는 원하는 프로토콜에 따라 컴퓨터로 제어될 수 있다. 단일 밸브를 사용하면 단지 하나의 실패 요소로 인해 높은 제조 수율을 생성할 수 있다. 유체 제어 및 처리 구성 부재의 통합은 컴팩트한 장치(예를 들면, 소형 카트 리지 형태)를 얻을 수 있고, 성형 및 조립의 자동화를 용이하게 한다. 전술한 바와 같이, 그러한 시스템은 유리하게는 희석 및 혼합 능력, 중간 세척 능력 및 확실한 가압 능력을 포함할 수 있다. 시스템 내의 유체 경로는 시스템 내의 유체의 오염을 최소화하고 또 그러한 유체의 수용 및 제어를 용이하게 하도록 통상 폐쇄된다. 반응 용기는 편리하게는 분리 및 교환 가능하며, 몇몇 실시예에서는 폐기 가능하다.
생체시료인 혈액을 이용한 암을 비롯한 만성질환을 검진하고 있으며 특히 암 검진의 검사는 환자 모니터링용 생체분자 5~6개를 검사하고 결과의 cut-off 수치만을 참고함으로 진단에는 한계가 있다. 만성질환은 다양한 유전자의 변이로 생성되는 질병이며 암은 대표적인 질병인데 하나의 표지자로 암의 효과적인 검진에는 한계가 있어 실제로 기존의 혈액검사로는 암 환자의 30~40% 정도를 찾아내는 정도에 불과하다.
여러 표적 생체분자들을 정량 검사하고 그 결과를 바탕으로 정상인 집단과 임 집단 간의 함수관계를 정량적으로 분석하여 진단할 수 있는 방법인 체외진단다지표검사(In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays;IVDMIA)이며, 생물학적 의미인 질병이나 다른 상태를 진단, 치료, 완화, 처치, 예방을 목적으로 해석함수를 사용하여 환자의 특이적 결과로 분류, 점수, 지수 등을 산출하기 위한 복수결과들의 결합장치이다
본 발명에서 상기 리간드-핵산 분석 방법으로 생산된 생체분자 분석정보를 이용한 생물적인 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템은 예시적으로 진단 및 질병에 대한 고위험군 선정이지만 이에만 국한된 것이 아니다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (A) 리간드-핵산 분석 방법에 의해 상기 표준물질과 상기 표적 생체분자 분석결과를 사용하여 시료 또는 시료를 채취한 환자에서 표적 생체분자의 생물학적 의미 결정방법에 있어서, 상기 시료에서 상기 리간드-핵산방법으로 상기 표준물질을 이용한 정도관리를 하면서 측정용의 표준물질로 상기 표적 생체분자 분석결과를 생산하는 단계, (B) 상기 생체분자 분석결과를 의사 결정 나무를 이용한 앙상블 기법의 partial dependency plot 내지는 partial dependency 함수 관계를 이용하여 변환하여 변환된 생체분자 분석결과를 생성하는 단계, 및 (C) 상기 변환된 생체분자 분석결과를 기설정된 생물학적 의미 결정 모델에 입력하여 상기 시료별 생물학적 의미 정보를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 의미를 결정하는 리간드-핵산 분석을 이용한 생물학적 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템을 제시한다.
상기 생물학적 의미 결정 모델은 로지스틱 회귀 모델인 것이 바람직하다.
상기 로지스틱 회귀 모델은 리지 벌점 함수(Ridge Penalty)를 사용한 것인 것이 바람직하다.
상기 앙상블 기법은 Boosting 및 Random Forest 중 어느 하나의 방법인 것이 바람직하다.
상기 생물학적 의미 결정 정보는 표적 생체분자별 생물학적 의미 결정 기여도에 대한 정보를 추가적으로 생성하는 것이며, 상기 표적 생체분자별 생물학적 의미 결정 기여도는 상기 생물학적 의미 결정 모델에 포함된 적어도 하나 이상의 개별 표적 생체분자에 대하여 로지스틱 모형으로 구한 기설정된 판별함수를 사용하여 생물학적 의미에 미치는 영향의 정도를 제공하는 것인 것이 바람직하다.
상기 표적 생체분자별 질병 생물학적 의미 결정 기여도는 coefficient plot의 형태로 제시되는 것이 바람직하다.
상기 표적 생체분자 항체를 포함하는 생물학적 의미 분석 키트에서 상기 표적 생체분자별 분석 정보를 생산하는 제3의 시스템에서 실시되거나, 상기 제3의 시스템과 유무선 네트워크로 연결되며, 상기 제3의 시스템으로부터 상기 표적 생체분자별 분석 정보를 전송받는 생물학적 의미 결정 시스템에서 실시되는 것인 것이 바람직하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (A) 상기 표적 생체분자를 활용하여 상기 생물학적 의미 결정 모델을 생성하는 방법에 있어서, 복수 명의 환자와 복수 명의 정상인으로 구성되는 대상자를 대상으로, 대상자의 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 대상자의 신체에서 분리한 채취 물질로부터 복수 개의 표적 생체분자별 분석 정보를 생성하고, 상기 생성된 분석 정보를 기설정된 변환을 수행하는 단계, (B) 상기 대상자 중 선택된 일부 대상자를 모델 생성 대상자군으로 하여 상기 변환된 표적 생체분자별 분석 정보로 의사 결정 나무를 활용하여 복수개의 분류기(classifier)를 생성하고, 상기 생성된 복수 개의 분류기를 접합하여 적어도 하나 이상의 표적 생체분자가 참여하는 복수 개의 생물학적 의미 결정 모델 후보를 생성하는 단계, (C) 상기 대상자 중 모델 생성 대상자군에 포함되지 않은 대상자를 모델 검증 대상자군으로 하여, 모델 검증 대상자의 변환이 수행된 상기 표적 생체분자별 분석 정보로 상기 생물학적 의미 결정 모델 후보에 입력하고, 상기 모델 검증 대상자별 생물학적 의미 결정 정보를 생성하는 단계, 및 (D) 상기 생물학적 의미 결정 정보에 대한 기 설정된 평가를 수행하고, 기설정된 평가 지표를 충족시키는 생물학적 의미 결정 모델을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변환된 표적 생체분자별 분석 정보를 사용하는 상기 표적 생체분자를 활용한 생물학적 의미 결정 모델을 생성 방법을 제시한다.
상기 분석 정보에는 적어도 한 쌍의 표적 생체분자별 분석결과 비율 정보가 더 포함될 수 있는 것인 것이 바람직하다.
상기 기설정된 변환을 수행하는 것은 상기 분석 정보를 의사 결정 나무를 이용한 앙상블 방법의 partial dependency plot 내지는 partial dependency 함수 관계를 이용하여 변환하는 것인 것이 바람직하다.
상기 생물학적 의미 결정 모델은 로지스틱 회귀 모델인 것이 바람직하다.
상기 기설정된 평가 지표는 정확도, 특이도, 민감도, ROC 커브의 면적 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 앙상블 기법은 Boosting 및 Random Forest 중 어느 하나의 방법인 것이 바람직하다.
상기 생물학적 의미 결정 정보는 표적 생체분자별 생물학적 의미 결정 기여도에 대한 정보를 추가적으로 생성하는 것이며, 상기 표적 생체분자별 생물학적 의미 결정 기여도는 상기 생물학적 의미 결정 모델에 포함된 적어도 하나 이상의 개별 표적 생체분자에 대하여 로지스틱 모형으로 구한 기설정된 판별함수를 사용하여 암에 미치는 영향의 정도를 제공하는 것인 것이 바람직하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (A) 분석 키트를 직접 또는 상기 분석 키트에서 기인하거나 분석 정보를 이용하여 생물학적 의미 결정 예측을 수행하는 생물학적 의미 결정 예측 시스템에 있어서, 대상자의 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 대상자의 신체에서 분리한 채취한 시료로부터 측정된 상기 표적 생체분자 조합을 구성하는 표적 생체분자별로 분석 정보 또는 분석결과 비율 정보를 입수하는 정보 입수 모듈, (B) 상기 분석 정보 또는 분석결과 비율 정보에 대하여 기설정된 적어도 하나 이상의 변환 모듈 상기 입수된 상기 분석 정보 또는 분석결과 비율 정보를 기설정된 생물학적 의미 결정 예측 모델로 처리하는 생물학적 의미 결정 예측 모듈, 및 (C) 상기 생물학적 의미 결정 예측 모듈로부터 적어도 하나 이상의 생물학적 의미 결정 예측 정보를 생성하는 생물학적 의미 결정 예측 정보 생성 모듈을 포함하며, 상기 변환 모듈은 상기 분석 정보에 대한 분석결과 변환 정보 또는 상기 분석결과 비율 정보에 대한 분석결과 비율 변환 정보를 우선 생성하는 것이며, 상기 생물학적 의미 결정 예측 모델은 상기 생성된 분석결과 변환 정보 또는 상기 분석결과 비율 변환 정보를 입력값으로 입력 받는 것인 것을 특징으로 하는 생물학적 의미 결정 예측을 수행하는 생물학적 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템을 제시한다.
상기 정보 입수 모듈이 상기 표적 생체분자별로 분석 정보 또는 분석결과 비율 정보를 입수하는 방법은, (A) 상기 생물학적 의미 예측 시스템이 상기 생물학적 의미 분석 키트로부터 직접 입수하는 방법, (B) 상기 생물학적 의미 결정 예측 시스템과 유무선 네트워크를 통하여 연결된 상기 분석 키트의 상기 표적 생체분자별 분석 정보를 생산할 수 있는 제3의 시스템으로부터 전송 받는 방식으로 입수하는 방법 및 (C) 상기 생물학적 의미 결정 예측 시스템과 유무선 네트워크로 연결된 상기 표적 생체분자별 분석 정보를 입수하는 자의 컴퓨터로부터 전송되는 방식으로 입수하는 방법 중 어느 하나 이상의 방법이 실시되는 것인 것이 바람직하다.
상기 변환 모듈은 tree를 이용한 앙상블 기법의 partial dependence plot 또는 partial dependency 함수 관계를 이용하여 분석결과 변환 정보 또는 분석결과 비율 변환 정보를 생성하는 것인 것이 바람직하다.
상기 생물학적 의미 결정 예측 모델은 로지스틱 모형인 것이며, 상기 로지스틱 모형은 상기 분석결과 변환 정보 또는 상기 분석결과 비율 변환 정보를 입력 받아 암으로 분류되는 확률값을 추정하는 기설정된 함수식인 것이 바람직하다.
상기 생물학적 의미 결정 예측 정보 생성 모듈은 표적 생체분자별 질병 분석 기여도에 대한 정보를 추가적으로 생성하는 것이며, 상기 표적 생체분자별 질병 분석 기여도는 상기 표적 생체분자 조합에 포함된 표적 생체분자에 대하여 로지스틱 모형으로 구한 기설정된 판별함수를 사용하여 암에 미치는 영향의 정도를 coefficient plot의 형태로 제시되는 것이 바람직하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (A) 생물학적 의미 결정을 위한 적어도 2 이상의 표적 생체분자를 포함하는 상기 표적 생체분자 정보를 처리하는 생물학적 정보 결정 통계 모델과 관련된 표적 생체분자별 변수값 처리 방법에 있어서, 적어도 2 이상의 샘플에 대하여 각 샘플별로 상기 표적 생체분자별 오리지널 변수값을 입수하는 단계, (B) 상기 표적 생체분자별 오리지널 입력 변수값으로 기설정된 처리를 수행하여 상기 표적 생체분자별 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계를 구성하는 단계, (C) 상기 표적 생체분자별 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계를 이용하여 상기 표적 생체분자별 오리지널 변수값에 대한 상기 표적 생체분자별 변환 변수값을 생성하는 단계, 및 (D) 상기 표적 생체분자별 변환 변수값을 기설정된 생물학적 의미 결정 통계 모델의 생성 또는 생물학적 의미 결정 통계 모델의 실행에 사용하는 단계를 포함하는 것이며, 상기 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계는 앙상블 기법을 활용한 것이며, 상기 앙상블 기법은 Boosting 알고리즘 기법과 Random Forest 알고리즘 기법 중 어느 하나 이상의 기법인 것을 특징으로 하는 표적 생체분자별 변수값 처리 방법을 제시한다.
상기 표적 생체분자별 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계를 구성하는 것은 상기 표적 생체분자를 구성하는 표적 생체분자들 중에서 상기 표적 생체분자를 제외한 타 표적 생체분자들에 대한 오리지널 변수값에 대해서 평균을 취해주는 방식으로 구성하는 것인 것이 바람직하다.
상기 오리지널 변수값은 상기 표적 생체분자별 분석 정보 또는 2 이상의 표적 생체분자의 분석결과 비율 정도 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 생물학적 의미 결정을 위한 적어도 2 이상의 표적 생체분자를 포함하는 상기 표적 생체분자 정보를 처리하는 생물학적 의미 결정 통계 모델과 관련된 표적 생체분자별 영향력 정보 처리 방법에 있어서, (A) 상기 표적 생체분자를 구성하는 개별 표적 생체분자별로 영향력 정보를 생성하는 단계, 및 (B) 상기 표적 생체분자를 구성하는 개별 표적 생체분자별로 영향력 정보를 개별 표적 생체분자별로 시각화하는 정보를 생성하는 단계를 포함하며, 상기 개별 표적 생체분자별 영향력은 로지스틱 모형으로부터 구한 판별 함수로 결정되는 것이며, 상기 판별 함수는 하기 [일반식 2]로 표현되는 것인 것이며, 상기 로지스틱 모형은 0과 1 사이의 값을 가지며, 상기 로지스틱 모형에 포함된 회귀 계수의 추정은 ridge 함수를 사용하는 것인 것을 특징으로 하는 상기 표적 생체분자에 대한 영향력 정보 처리 방법을 제시한다.
[일반식 2]
Figure 112016037892954-pat00001
상기 g(x)는 partial dependence plot 또는 partial dependency 함수 관계를 이용하여 상기 표적 생체분자별 오리지널 변수값에 대한 상기 표적 생체분자별 변환 변수값을 사용하는 것인 것이 바람직하다.
상기 시각화는 2차원 평면의 차트나 그래프로 표시되는 것인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 리간드-핵산 분석방법으로 생산된 상기 생체분자 분석정보를 이용한 생물적인 의미 분석을 위한 시스템의 구성은 (A) 대조군의 임상정보를 표준으로 상기 생체분자 분석결과를 입력 받고 데이터베이스를 구축하는 모듈, (B) 상기 입력된 생체분자 분석 결과를 이용하여 분석 시스템에서 전 처리를 수행하는 모듈; 상기 전 처리된 결과를 가지고 환자의 모델을 생성하는 모듈, (C) 상기 생성된 모델을 로딩하여 내원한 환자에 적용하여 블라인드 테스트(Blind test)인 진단을 수행하는 모듈, 및 (D) 교차검정을 통해 시스템의 성능을 평가하는 모듈; 을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 의미를 결정하는 방법 및 임상 의사 결정 지원 시스템을 제공한다.
본 발명으로 생성되는 많은 생체분자 분석결과는 고차원의 특성을 갖는 방대란 양의 정보로 세포, 조직이나 질병에 관련된 다양한 정보를 생산할 수 있다. 상기 입력된 데이터를 이용하여 분석 시스템에서 전 처리를 수행하는 모듈은 환자의 상태에 영향을 미치는 특징들을 찾아내고 분류 성능을 향상시키기 위한 다변량 분석방법은 정확한 치료와 진단을 위해 중요 변수를 찾아 차원을 축소하거나 특성의 변형을 통해 주요 특질들을 찾아내는 특징 추출(Feature Selection) 절차이다.
특질 추출은 세부적으로 클래스 정보를 학습에 사용하는 지 여부에 따라 무감독 학습(Unsupervised Learning) 또는 감독 학습방식(Supervised Learning) 방식이 있다. 무감독 학습 방식에 주로 활용되고 있는 PCA(Principal Component Analysis) 또는 ICA(Independent Component Analysis)는 변수들의 특성을 고려하여 특질을 추출할 수 있다. 감독방식은 클래스 정보와 변수간의 통계적인 유의성이나 변수들 간의 상관관계를 활용하여 변수를 선택하는 방식이다. 이 방식은 주어진 특질 집합에서 전 방향(Forward) 또는 후 방향(Backward)으로 특질들을 순차적으로 추가하거나 제거해가면서 분류기에 적용시킨 성능을 통하여 주요 특질을 산출할 수 있다.
상기 전 처리된 결과를 가지고 학습을 수행하여 환자의 모델을 생성하는 모듈은 선택된 특질들을 적합한 분류기(Classifier)를 통해 각 클래스별로 분류하는 절차이다.
본 발명에서 인공신경망(Artificial Neural Network)을 사용하였는데, 입력과 출력에 따라 행동을 결정하는 특성 때문에 패턴인식, 함수근사, 분류기법 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 인공신경망은 그 구조는 여러 개의 층(layers), 노드(nodes), 신경망간 연결 가중치로 구성된다. 본 발명에 사용하는 신경망 층간 연결방식은 전향(Feed-forward)방식이다. 입력패턴에 다라 각 노드에 대한 신경망 연결 가중치와 활성화 함수를 이용하여 출력값을 산출하였다. 생성된 결합정보를 통하여 어떤 일을 처리했을 때 추정한 값과 실제 결과 값이 상이한 경우, 산출된 값을 실제 결과 값과 비교하면서 오차를 줄이는 과정을 반복해서 찾아내는 방식이다.
상기 환자의 모델을 생성하는 방법은 선형 모델(linear models), 지지 벡터 기계(support vector machines), 신경망(neural networks), 분류 및 회귀 트리(classification and regression trees), 앙상블 학습법(ensemble learning methods), 판별식 분석(discriminant analysis), 근접 네이버 방법(nearest neighbor method), 베이즈 네트워크(Bayesian networks), 독립 성분 분석(independent components analysis)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체분자 분석방법 및 장치를 제공한다.
정확하고 종합적인 메커니즘(Mechanism)이 밝혀지지 않은 대다수의 질환들에 대해서는 사례를 기반으로 하는 진단의 중요성이 매우 크다고 할 수 있다. 그러나 특정 기계학습 기법에 국한하여 고안된 기존의 사례 기반 기계학습 추론 시스템은 정확도가 낮아 개선된 시스템의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 또한, 기존의 시스템은 학습된 임상 검사 항목 모두를 이용한 질환 판별기로만 고안되어 있으며 각 질환별 임상 검사 항목의 중요도나 우선순위를 활용할 수 있는 방법을 제공하고 있지 않다.
본 발명은 의사의 정확한 질환 진단을 지원하기 위한 사례 기반 기계학습 추론을 이용한 질환 진단 및 검사항목 선정 시스템에 관한 것으로, 환자들의 사례 데이터베이스(Database)를 통해 훈련된 인공신경망(Neural Network)로 한 기계학습기인 질환 판별기를 통해 새로운 환자의 검사 정보를 분석하여 질환을 판별하고 예비진단에 의한 각 질환의 최종 판별을 위한 최소의 중요 검사 항목을 선정하여 제공하는 시스템에 관한 것이다. 기계학습 추론을 통한 질환 진단 기법은 기계학습 기법을 개별적으로 적용하여 구성하고 있다. 상기 환자의 모델을 생성하는 방법은 선형 모델(linear models), 지지 벡터 기계(support vector machines), 신경망(neural networks), 분류 및 회귀 트리(classification and regression trees), 앙상블 학습법(ensemble learning methods), 판별식 분석(discriminant analysis), 근접 네이버 방법(nearest neighbor method), 베이즈 네트워크(Bayesian networks), 독립 성분 분석(independent components analysis) 등이 있다.
본 시스템의 구성 및 실무에서의 응용은 2가지로 나누어서 구성할 수 있는데 진단만을 위한 독립된(stand alone) 형태의 진단시스템과 기존의 병원정보시스템 즉 OCS, PACS, LIS 등과 연계된 통합된 시스템으로 구성할 수 있다. 통합된 시스템과의 연동을 위해서는 HL7, 및 DICOM 규약에 의거하여 시스템을 구성하여야 한다. 본 시스템은 초기모델로 PMS(Patient Monitoring System) 와 연동하여 진단의 정확도를 높게 하였다. 또한 PMS 뿐만 아니라 OCS, EMR, PACS 등 다양한 의료정보시스템과 연동된 시스템으로 개발하여 다양한 질환인자를 포함하고 있는 보다 정확한 진단시스템으로 개발할 수 있다.
본 발명은 상기 생체시료는 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직으로 구성된 군으로 부터 선택된 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 생체분자의 분석방법 및 장치를 제공한다.
본 발명은 리간드 PCR를 이용하여 둘 또는 그 이상의 생체분자를 분석함으로써 시료에서 생체분자의 생물학적 의미를 확인할 수 있으며, 생체분자 존재의 신호를 PCR방법에 의한 증폭 및 형광학적으로 높은 감도로 검출할 수 있다. 더욱이, 한 번의 검사로 다양한 생체분자들을 분석하고 그 분석한 결과를 소프트웨어를 사용하여 시료에서 생체분자의 변화, 질병에 대한 민감성, 질병의 진단, 질병에 대한 민감성 그리고 치료 약제에 대한 반응의 차이 등 개인 간의 차이를 효율적으로 결정하는 방법을 제공한다.
도 1은 리간드-핵산 분석 방법의 개념도이고,
도 2는 리간드-핵산 분석 방법의 설계핵산 증폭 및 분석의 개념도이고,
도 3은 Real time PCR로 상기 serial dilution된 표준물질을 리간드-핵산 분석으로 분석한 결과로 복합체의 설계핵산 증폭산물을 Taqman 프로브로 분석한 결과이고,
도 4는 모세관 전기영동방법으로 상기 표준물질 및 표적생체분자를 지시하는 설계핵산의 증폭산물 길이를 분석한 결과이고,
도 5는 생물학적 의미 결정 시스템의 논리 아키텍쳐이고,
도 6은 생물학적 의미 결정 시스템 구조이고,
도 7은 생물학적 의미 결정 소프트웨어 구조이고,
도 8은 생물학적 의미 결정 소프트웨어에서 통합관리 도구 ACS의 역할이고,
도 9는 생물학적 의미 결정의 데이터 분석 모듈이고,
도 10은 리간드-핵산 분석방법으로 생산된 상기 표적 생체분자의 분석결과로 급성심근경색 환자 또는 패혈증 환자의 생물학적 의미를 결정하는 흐름도이고,
도 11은 생산된 분석결과를 질환군 별로 구성된 데이터베이스 및 인공신경망을 이용한 프로그램으로 특정한 사람의 혈액시료에 대해 생체분자 분석결과를 생산하는 임상 의사 결정 지원 시스템으로 질병을 진단하는 흐름도이고,
도 12는 생물학적 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템에 의해 상기 리간드-핵산 분석에 의해 생산된 표적 생체분자의 결과를 분석하여 환자의 진단을 실시한 예이다.
이하, 첨부도면과 실시예를 참조하여 본 발명에 따른 정도관리 및 측정용의 표준물질 및 설계핵산의 제조방법, 및 이들을 이용한 하나 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 시료에 있는 생체분자 리간드 PCR 분석방법을 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.
실시예 1. 표적 생체분자 및 정도 관리 및 측정용 외부 표준물질
환자의 급성심근경색을 정확하게 진단하고, 신속한 진단을 위한 특이성과 민감도가 높은 진단용 생체지표 즉, 급성심근경색 특이 마커 발굴이 요구되고 있다. 지금까지 환자의 혈액으로부터 급성심근경색(AMI) 진단을 위해 사용되는 잘 알려져 있는 AMI 진단 마커로는, 미오글로빈(myoglobin), CK-MB, 트로포닌 I (TroponinI), 트로포닌 T (TroponinT) 등이 있다. 심근경색 특히, 급성심근경색은 흉통발생 후 6시간 내에 처치를 하지 않으면 사망에 이르게 되므로 신속한 진단이 매우 중요하다.
패혈증은 각종 장기 부전을 동반한 중증 패혈증으로 진행할 수 있으며, 심한 경우 불응성 저혈압을 나타내는 패혈증 쇼크에 이르게 되므로 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 따라서 패혈증의 진단, 중등도 판정 및 경과 관찰에는 빠르고, 예민하고, 특이적인 표지자가 요구된다. 감염이나 조직 손상 등에 의해 나타나는 염증 반응은 시간 경과에 따른 일련의 과정으로서, 국소적으로 시작하여 interleukin (IL)-6를 비롯한 시토카인이 분비되고 간에서 급성기 반응 물질들이 생성된다. 염증이나 감염의 진단에는 임상적인 증상이나 징후뿐만 아니라 객관적인 표지자의 역할이 중요한데, 현재까지 알려진 표지자들로는 백혈구 수(호중구나 미성숙 분획을 포함), 반응성 C-단백(C-reactive protein, CRP), 프로칼시토닌(procalcitonin, PCT) 및 IL-6, IL-10 나 TNF-α 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용한 표적 생체분자는 급성심근경색 지표인 미오글로빈(myoglobin;, Life technologies 사, 미국), CK-MB (Life technologies 사, 미국), 트로포닌 I (TroponinI; Life technologies 사, 미국), 트로포닌 T (TroponinT; Life technologies 사, 미국) 그리고 패혈증 지표인 반응성 C-단백(C-reactive protein, CRP; Life technologies 사, 미국), 프로칼시토닌(procalcitonin, PCT; Life technologies 사, 미국), IL-6(Life technologies 사, 미국) 및 IL-10(Life technologies 사, 미국) 등의 단백질이다.
또한 정도관리 및 측정용의 표준물질은 대장균 단백질인 E.coli Enoyl-ACP Reductase (Sino Biological Inc. 중국)와 식물 단백질인 Phototropin2(Cosmo Bio Co. Ltd. 일본) 이다.
실시예 2. 설계핵산 및 Taqman probe의 준비
정도관리 및 측정용의 표준물질이 있는 시료에서 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 이들에 상응하는 리간드 및 설계핵산을 이용하는 리간드-핵산 분석 방법으로 분석하기 위해 본 발명에서 제안하는 설계핵산의 기본 구성은 다음의 일반식(I)로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
5'-N-P1α-NV-P3β-3' (I)
상기 일반식(I)에서, P1 영역은 정방향 프라이머와 완전하게 상보적 결합하는 부분이고, 5' 끝에 반응성 그룹 N은 아민기가 있어 표적 생체분자와 결합하는 물질인 리간드에 연결되는 부분이 있다. 바람직하게는 설계핵산은 정방향 프라이머가 결합하는 염기서열 부분의 상위(upstream)에 약 10개의 뉴클레오타이드로 구성된 스페이서(spacer)가 있을 수 있다. 이 스페이서는 일반식(1) 구조체에 결합한 리간드의 입체적인 효과로 정방향 프라이머가 P1 영역의 결합이 방해되는 것을 방지하는 기능을 가지며, 스페이서의 염기서열은 5'-TGATTGAATT-3'이다.
NV 영역은 특정 염기서열 또는 그 길이를 이용하여 리간드가 결합하는 특정 생체분자(또는 내부 표준물질, 외부 표준물질)를 지시할 수 있는 염기서열로 리간드에 결합하는 특정 생체분자를 검출·분석할 수 있도록 한다. 바람직하게 그 길이는 10~200 뉴클레오타이드이다.
P3 영역은 역방향 프라이머가 결합하는 부분이다.
α 및 β는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, α 및 β는 8-30의 정수이다.
바람직하게는, 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 모든 설계핵산에서 공통된 염기서열을 갖는 유니버셜 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.
본 실시예에 사용할 프라이머 쌍을 [표1]에 제시하였다.
[일반식(I)]에 제시한 바와 같이, 반응성 그룹, 스페이서 및 유니버셜 프라이머 쌍을 고려하여 디자인된 설계핵산은 [염기서열(I)]와 같이 제시하였다.
5'-NH2-TGATTGAATT-CGGAAGCGTGCTGGGCC NV CATAACCCAGAGGTCGA-3' [(염기서열(I)]
여기서 CGGAAGCGTGCTGGGCC는 서열번호 1, CATAACCCAGAGGTCGA는 서열번호 2로 특정된다.
유니버셜 프라이머 쌍의 염기서열
프라이머 염기서열(5'→3') 길이(nt) 서열번호
정방향프라이머 5'-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3' 17 3
역방향프라이머 5'-TCGACCTCTGGGTTATG-3' 17 4
표적 생체분자, 외부 표준물질(E. coli Enoyl-ACP Reductase)을 특정 염기서열로 지시하는 설계핵산의 NV 영역의 염기서열을 [표 2]에 제시하였다.
표적 생체분자 및 외부 표준물질을 지시하는 설계핵산의 NV 영역의 염기서열
단백질 염기서열(5'→3') 길이(nt) 서열번호
표준물질 GATTTGTATTGATGCTCGCTCCAACCGACAGATTGAGATT 40 4
Myoglobin GATTTGTATTACGTGAAAACGGCAACAATTGATTGAGAT 40 5
Creatine Kinase
Isoform MB		 GATTTGTACCACTACCAGGAGGACCCTGTATTTTGATTG A 40 6
Cardiac Troponin I GATTTGTATTGACGGGCGAACTGCACCAGTTGAGATTAAA 40 7
Cardiac Troponin T GATTTGTATTTCAGGTACTCCGAGGCGTCCTGATTGAGAT 40 8
IL-10 GATTTGTATTGATGCTCGCTCCAACCGACAGATTGAGATT 40 9
IL-6 GATTTGTATTACGTGAAAACGGCAACAATTGATTGAGAT 40 10
CRP
(C-reactive protein)		 GATTTGTACCACTACCAGGAGGACCCTGTATTTTGATTG A 40 11
PCT(Procalcitonin) GATTTGTATTGACGGGCGAACTGCACCAGTTGAGATTAAA 40 12
상기 외부 표준물질 및 표적 생체분자를 분석하기 위해, 상기 설계핵산 NV 영역을 인지하고 신호를 발생시키는 역할을 하는 Taqman 프로브의 구조 및 염기서열은 [표 3]에 제시하였다.
외부 표준물질 및 표적 생체분자를 지시하는 설계핵산의 염기서열을 분석하는 Taqman probe
Taqman probe 염기서열(5'→3') 길이(nt) 서열번호
표준물질 Cy5.5-AGTCGGTTGGAGCGAGCATC-BHQ2 20 13
Myoglobin HEX-AATTGTTGCCGTTTTCAGCGT-BHQ1 21 14
Creatine Kinase
Isoform MB		 FAM-AATACAGGGTCCTCCTGGTAGTGG-BHQ1 24 15
Cardiac Troponin I ROX-CTGGTGCAGTTCGCCCG-BHQ2 17 16
Cardiac Troponin T Cy5-AGGACGCCTCGGAGTACCTGA-BHQ2 21 17
IL-10 HEX-AATTGTTGCCGTTTTCAGCGT-BHQ1 20 18
IL-6 FAM-AATACAGGGTCCTCCTGGTAGTGG-BHQ1 21 19
CRP ROX-CTGGTGCAGTTCGCCCG-BHQ2 24 20
PCT Cy5-AGGACGCCTCGGAGTACCTGA-BHQ2 17 21
표적 생체분자, 외부 표준물질(E. coli Enoyl-ACP Reductase)을 핵산 길이로 지시하는 설계핵산의 NV 영역의 염기서열과 길이를 [표 4]에 제시하였다.
표적 생체분자 및 정도관리 및 측정용의 표준물질을 설계핵산의 길이로 지시하는 설계핵산의 NV영역의 염기서열 및 길이
단백질 염기서열(5'→3') 길이(nt) 서열번호
표준물질 GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTG 26 22
Myoglobin GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATG 31 23
Creatine Kinase
Isoform MB		 GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGA 36 24
Cardiac Troponin I GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGAATGAT 41 25
Cardiac Troponin T GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGAATGATGAAAT 46 26
IL-10 GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGAATGATGAAATTGAAA 51 27
IL-6 GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGAATGATGAAATTGAAAGGATT 56 28
CRP GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGAATGATGAAATTGAAAGGATTAAAGT 61 29
PCT GATTTGTATTGATTGAGATTAAAGTGAAATGAATGAATGATGAAATTGAAAGGATTAAAGTGAAGT 66 30
실시예 3. 분석리간드 , 수확리간드 , 표준분석리간드 및 표준수확리간드 준비
표적 생체분자의 각기 상이한 epitope에 대한 2종류의 단클론 항체 또는 표적 생체분자에 결합하는 다클론 항체를 두 개의 그룹으로 나누어 한 그룹은 설계핵산, 또 다른 그룹은 자성물질을 결합시켜 전자는 분석리간드, 후자는 수확리간드라고 명명하였다. 또한 표준물질의 항체인 경우는 설계핵산이 결합된 항체를 표준분석리간드, 또 자성물질을 결합된 항체를 표준수확리간드라고 명명하였다.
본 발명에서 사용한 표적 생체분자에 대한 항체는 급성심근경색 지표인 항 미오글로빈 다클론 항체(Life technologies 사, 미국), 항 CK-MB 다클론 항체 (Life technologies 사, 미국), 항 트로포닌 I 다클론 항체 (Life technologies 사, 미국), 항 트로포닌 T 다클론 항체 (Life technologies 사, 미국) 그리고 패혈증 지표인 항 반응성 C-단백질 다클론 항체(Liife technologies 사, 미국), 항 프로칼시토닌 다클론 항체(Life technologies 사, 미국), 항IL-6 다클론 항체(Life technologies 사, 미국) 및 항 IL-10 다클론 항체(Life technologies 사, 미국) 등이다.
본 발명에 사용한 정도관리 및 측정용의 외부 표준물질에 대한 항체는 다클론 E. coli Enoyl-ACP Reductase 항체 (Sino Biological Inc. 중국) 및 다클론 Phototropin 1 항체(Cosmo Bio Co. Ltd. 일본)이다.
설계핵산은 실시예 2의 [일반식(1)] 및 [염기서열(I)]에 따라 제시된 염기서열로 주문하여 올리고머를 제작하였다(바이오니아사, 한국).
Taqman 프로브를 사용하여 설계핵산의 증폭산물을 분석하기 위해, 실시예 2에서 제시한 설계핵산으로, 아민기가 붙어 있는 9종류의 올리고머를 주문 제작하였으며, 하나는 정도관리 및 측정용의 외부 표준물질을 지시하고 8종류의 올리고머는 각각 8종류의 표적 생체분자를 지시하며 그 내용은 [표2]와 같다
설계핵산의 길이를 설계핵산의 증폭산물을 분석하기 위해, 실시예 2에서 제시한 설계핵산으로, 아민기가 붙어 있는 9종류의 올리고머를 주문 제작하였으며, 하나는 정도관리 및 측정용의 외부 표준물질을 지시하고 8종류의 올리고머는 각각 8종류의 표적생체분자를 지시하며 그 내용은 [표4]와 같다.
각 설계핵산을, 각 표적 생체분자의 특이적 리간드(항체) 또는 정도 관리 및 측정용의 외부 표준물질의 특이적 리간드(항체)에, Thunder-Link oligo conjugation system (Innova Biosciences Ltd., 영국)을 사용하여 그 프로토콜에 따라 결합시켰다.
100㎕의 60~100M 제작된 올리고머를 Oligo Activation Reagent 튜브에 첨가하며, 또한 100㎕의 1mg/ml 항체를 Antibody Activation Reagent 튜브에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 활성화시켰다. 상기 활성화된 반응용액을 준비된 컬럼을 이용하여 탈염시킨 후, 상기 탈염된 설계핵산과 항체를 적절한 비율로 혼합하여 실온에서 12~24시간 반응시켰다. Conjugate Clean Up Reagent을 상기 설계핵산-항체 반응용액에 첨가하여 10분간 반응시키고 15,000g에서 5분간 원심분리하여 수확된 설계핵산-항체 구조체에 Conjugate Clean Up Reagent을 첨가한 후 다시 원심분리하여 정제된 상기 설계핵산-항체 구조체를 수확하였다.
상기와 같이 제작된 18종류의 수확된 설계핵산-항체 구조체는 항체가 표적 생체분자의 항체인 경우는 분석리간드라 하고, 정도관리 및 측정용의 표준물질의 항체인 경우는 표준 분석리간드라 한다.
Taqman 프로브를 사용하여 설계핵산의 증폭산물을 분석하기 위해, 자성물질과 8종류의 표적생체분자 그리고 1종류의 정도관리 및 측정용의 표준물질의 결합은 Dynabeads Antibody Coupling Kit(Life technologies, 미국)을 사용하여 프로토콜에 따라 실시하였다.
상기 항체와 자성비트인 Dynabeads M-270 Epoxy를 37℃에서 12~24시간 반응시킨 후 자석을 이용하여 수확하였다. 키트에 포함된 세척용액을 첨가하고 재현탁을 시키고 다시 자석으로 수확하는 방법으로 세척을 하여 미결합 항체를 제거하는 과정으로 정제된 Dynabead-항체 구조체를 수확하였다. 수확된 Dynabead-항체 구조체에서 항체가 표적 생체분자의 항체인 경우는 수확리간드이고 정도관리 및 측정용의 외부 표준물질의 항체인 경우는 표준 수확리간드이다.
실시예 4. 분석용 생체 시료의 준비
정도관리 및 측정용의 표준물질인 E. coli Enoyl-ACP Reductase 및 표적 생체분자는 TBS [Tris-buffered saline; 150 mM NaCI, 20 mM tris-CI (pH 7.5), 및 0.02% NaN3]에 최종농도 10 ng/ml로 PCR 튜브에 준비하였다.
분석시료는 표준물질과 표적 생체분자를 serial dilution 방법으로 다양한 양 (1 ng/ml에서 1 ag/ml까지)으로 PCR 튜브에 준비하였다.
실시예 5. 복합체의 형성 및 자석을 이용한 복합체의 수확
45 ul의 상기에서 준비된 분석시료 용액을 마이크타이터 플레이트 (Falcon 3911; Becton Dickinson)의 well에 넣었다. 상기 분석시료 용액에 50 ㎕의 0.45% nonfat dried milk 와 denatured salmon sperm DNA (0.1 mg/ml)가 있는 TETBS (0.1 mM EDTA 및 0.1% Tween 20이 포함된 TBS)을 첨가하였다.
10 ㎕의 실시예 3에서 제조된 8종류의 분석리간드, 8종류의 수확리간드, 1종류의 표준 분석리간드, 1종의 표준 수확리간드를 동량으로 혼합된 TETBS를 상기 준비된 분석시료에 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다.
250 ㎕의 TETBS를 첨가하고 자석을 이용하여 형성된 생체분자 복합체와 표준물질 복합체를 여러 번 세척한 후, 최종적으로 수확하였다. 수확한 복합체 설계핵산의 핵산분석은 실시예 7에서 실시하였다.
실시예 6. 복합체의 형성과 ELISA 방법을 이용한 복합체의 수확
45 ul의 상기에서 준비된 분석시료를 마이크타이터 플레이트 (Falcon 3911; Becton Dickinson)의 well에 넣었다. 분석시료가 있는 플레이트를 4℃에서 약 15시간 동안 처리하여 생체분자를 플레이트의 well 표면에 고정시킨다. 250 ul의 TBS으로 플레이트의 well을 3회 세척하였다.
200 ㎕의 4.5% nonfat dried milk 및 denatured salmon sperm DNA (1 mg/ml)을 포함하는 ETBS (0.1 mM EDTA이 포함된 TBS)를 각각 well에 첨가하여 37℃에서 80분간 반응시켰다. 각 well에 150 ㎕의 TETBS를 첨가하여 5 분간 반응시키는 과정을 7회 반복하였다.
상기 준비된 well에 50 ㎕의 8종류의 분석리간드, 표준 분석리간드, 0.45% nonfat dried milk 및 denatured salmon sperm DNA (0.1 mg/ml)이 포함된 TETBS를 첨가하여 실온에서 45분간 반응시켰다. 각 well에 250 ㎕의 TETBS을 첨가하여 10분간 반응시키는 과정을 15회 실시하여 미결합 리간드들을 제거하였다. 각 well을 NaN3이 없는 TBS로 3회 세척하여 정제된 복합체를 확보하였다. 확보한 복합체 설계핵산의 핵산분석은 실시예 8에서 실시하였다.
실시예 7. 설계핵산의 염기서열을 이용한 생체분자의 분석
설계핵산의 염기서열을 이용한 정도관리 및 측정용 표준물질이 첨가된 시료에서 하나 도는 그 이상의 표적 생체분자의 분석은 설계핵산의 염기서열에 상응하는 Taqman 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응법(multiplex real-time PCR)으로 실시하였다.
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응은 Real-time LightCycler™ (Roche, 스위스) PCR 및 FastStart DNA Master Hybridization Probe PCR mix (Roche, 스위스)를 사용하였다.
PCR 반응액은 2.4 ㎕의 25 mM MgCl2, 2 ㎕의 5 pmole/l의 정방향 프라이머, 5 pmole/l의 역방향 프라이머, 그리고 2.5 pmole/l의 프로브로 이루어진 프라이머-프로브 혼합물(primer-probes mix), 2 ㎕의 LightCycler DNA FastStart Hybridization mix에 멸균 증류수를 가하여 18 ㎕를 만들어 잘 혼합한 후 유리 capillary로 옮기고, 수확한 복합체(표준곡선) 2 ㎕를 분주하였다. 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총 부피가 25 ㎕이기 때문에, 표적 생체분자 및 정도관리 및 측정용의 표준물질을 검출하는 프라이머 및 프로브의 농도는 각각 0.4 uM(12.5 pmoles/25 ㎕) 및 0.2 uM(62.5 pmole/25 ㎕)이었다.
Real time PCR을 수행하는 반응물의 구성 및 농도
성 분 부피(㎕) 농도
10x LightCycler DNA FastStart Hybridization mix 2.5 1X
프라이머-프로브 혼합물 프라이머(5pmol/ul) 2.0 0.4 uM
프로브(2.5 pmol/ul) 0.2 uM
뉴클레아제-결핍 멸균 증류수 11.0 -
25 mM MgCl2 2.5
수확 복합체 용액 2.0 -
합 계 25.0 -
상기에서 복합체 정제 및 수확 단계를 실시한 후, PCR을 다음과 같은 조건으로 실시하였다: (a) 전-변성(pre-denaturing) 단계, 95℃에서 5분 및 (b) 40℃ 사이클, 95℃에서 15초(변성 단계) 및 56℃에서 15초(어닐링 및 연장 단계)로 구성된 1사이클. 이 때, 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 상기 표 5에 제시되어 있다.
상기 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 실-시간 중합효소연쇄반응의 매 주기마다 실-시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 실-시간 모니터 상에서 FAMTM이 발색되는 경우 녹색채널(510±5 nm), HexTM이 발색되는 경우 노랑채널(555±5 nm), Cy5TM이 발색되는 경우 빨강채널(660±10 nm), ROXTM이 발색되는 경우 주황채널(610±5 nm) 및 Cy5.5TM이 발색되는 경우 진홍채널(712 log pass)에서 표시하도록 지정하였다. 녹색채널, 노랑채널, 빨강채널, 주황채널 및 진홍채널에서 형광을 관찰하였다.
각 튜브에서 진홍채널의 역치(threshold) 값은 0.04로 지정하고 나머지 채널의 역치 값은 0.03으로 지정한 뒤 Ct(Threshold cycle) 값을 확인한다. Ct 값이 <36에서 피크(peak)가 관찰되면 양성으로 판독한다.
10 ng/ml의 정도관리 및 측정용 표준물질인 E. coli Enoyl-ACP Reductase을 10배수씩 단계적으로 희석하였다. 이렇게 제조한 표준물질 시료를 본 발명의 프라이머 및 프로브를 적용하여 Real-time PCR을 수행하여 검출한계를 확인하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
상기 Real-time PCR 결과와 비교하기 위해, 동일한 표준물질을 10배수씩 단계적으로 희석한 후 본 발명의 프라이머 및 프로브를 적용하여 conventional PCR을 통해 검출한계를 확인하였다. conventional PCR에서는 희석배수 105 까지 검출한계를 보였지만 Multiplex Real-time PCR에서는 희석배수 107까지 검출한계를 보였다. 따라서 Multiplex Real-time PCR이 102만큼 더 우수한 검출한계를 보임을 알 수 있었다. 도 3에 Multiplex Real-time PCR 결과를 나타내었다.
한 튜브에서 정도관리 및 측정용의 표준물질을 포함한 시료에 8종류 표적 생체분자를 분석하는 과정에서 형성되는 이들의 복합체를 자석으로 수확한 경우 또는 ELISA방법으로 수확한 경우 모두, 형성된 표준물질 복합체의 설계핵산을 Real time PCR하여 얻은 커브를 분석한 결과로 본 발명에 의한 리간드 PCR로 분석하고자하는 시료에서 표준물질 및 표적 생체분자 분석이 정상적으로 수행됨을 알 수 있다.
또한 상기에서 형성되고 자석으로 수확한 경우 또는 ELISA방법으로 수확한 경우 모두, 수확된 표적생체분자 복합체의 설계핵산을 Real time PCR 하여 얻은 커브와 정도관리 및 측정용의 표준물질에 상응하는 커브를 비교분석하여 표적 생체분자를 정량하거나 표준물질/표적 생체분자의 양적 비율을 계산할 수 있다.
한 튜브에서 8종의 급성심근경색에 대한 표적생체분자 복합체 및 정도관리 및 측정용의 표준물질 복합체를 자석으로 수확한 경우 및 ELISA 방법으로 수확한 경우 모두, 이들에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 다중 생체분자 분석을 위한 Real time PCR은 해당 형광채널에서 표적 생체분자를 특이적으로 확인시켜 주었다.
표준곡선의 정밀도 평가를 위하여 정제된 PCR 산물을 10배씩 연속적으로 희석하여(10-4-10-9) 검사 중(within-run) 변이계수(coefficient of variation, CV)와 검사 간(between-run) 변이계수를 측정하였다.
검사 중 변이계수는 한번의 real-time PCR동안 각 농도의 연속 희석한 표적 생체분자인 Myoglobin과 표준물질인 ACT1 PCR 산물을 각각 3개로 나누어 반복 측정하였고, 검사 간 변이계수는 표준물질, Myoglobin, Creatine Kinase isoform MB, Cardiac TroponinI, Cardiac TroponinT, IL10, IL6, CRP, 및 PCT 에 대한 real-time PCR 측정을 통하여 분석하였다.
표준곡선은 Light-Cycler (Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN, USA) 자체에서 연속 희석된 초기 주형 농도의 log값(y축)에 대한 Cp값(x축)을 표시하여 그려지게 되고, 이때 기울기(slope)와 error값이 주어지며 기울기를 이용하여 PCR의 효율(efficiency, E=10-1/slope)을 계산하였다.
표준곡선의 Ct값을 이용한 급성심근경색 모니터링용 Myoglobin과 표준물질 복합체의 설계핵산에 대한 검사 중 변이계수는 각각 0.12~0.84%와 0.20~1.05%였고, 평균 표준편차(SD)는 0.09 주기였다(표 6).
LightCycler real-time PCR에 의한 표준물질 및 표적생체분자에 대한 표준곡선의 검사 중 변이계수
Concentration
(ng/ul)		 Ct(Mean±SD) CV(%)
Myoglobin
(n=3)		 810-4 15.30±0.02 0.12
810-5 18.60±0.08 0.38
810-6 22.91±0.05 0.20
810-7 25.22±0.22 0.03
E. coli Enoyl-ACP Reductase
(n=3)		 1010-4 15.26±0.16 0.05
1010-5 18.74±0.05 0.29
1010-6 22.25±0.05 0.20
1010-7 25.75±0.06 0.23
상기 급성심근경색 모니터링용 4종류의 표적 생체분자 Myoglobin, Creatine Kinase isoform MB, Cardiac TroponinI, Cardiac TroponinT 및 표준물질 복합체의 설계핵산에 대한 검사 간 변이계수는 각각 0.07-0.92%, 0.12-0.55%, 0.25-0.81%, 0.12-0.44%, 0.26-0.49%, 0.05-0.29%, 였고, 평균 표준편차는 0.97 주기였다. 각 표적 생체분자 및 설계핵산 복합체의 설계핵산에 대한 PCR 효율은 1.90(Range, 1.60-2.14), 1.78(Range, 1.65-1.88), 1.78(Range, 1.65-1.88), 1.82(Range, 1.67-2.00), 1.80(Range, 1.50-2.03)를 보여 분석한 복합체의 설계핵산들 간에는 유의한 차이를 보이지 않았다(표 7).
LightCycler real-time PCR에 의한 표적 생체분자에 대한 표준곡선의 검사간 변이계수 및 증폭 효율
Concentration
(ng/ul)		 Ct(Mean±SD) CV(%) Efficiency
(Mean±SD)
E. coli Enoyl-ACP Reductase
(n=20)		 810-4 15.26±0.16 0.05 1.80±0.13
(Range, 1.50-2.03)
810-5 18.74±0.05 0.29
810-6 22.25±0.05 0.20
810-7 25.75±0.06 0.23
Myoglobin
(n=10)		 810-4 15.47±0.34 0.17 1.90±0.23
(Range, 1.60-2.14)
810-5 18.39±0.43 0.12
810-6 22.89±0.47 0.55
810-7 25.65±0.36 0.43
Creatine Kinase isoform MB
(n=10)		 710-4 15.56±0.35 0.31 1.78±0.07
(Range, 1.65-1.88)
710-5 18.87±0.10 0.81
710-6 22.66±0.15 0.52
710-7 25.23±0.18 0.25
Cardiac TroponinI
(n=10)		 810-4 15.42±0.25 0.44 1.85±0.10
(Range, 1.69-2.03)
810-5 18.13±0.05 0.17
810-6 22.71±0.26 0.36
810-7 25.04±0.38 0.12
Cardiac TroponinT
(n=10)		 1010-4 15.93±0.09 0.34 1.82±0.07
(Range, 1.67-2.00)
1010-5 18.50±0.12 0.26
1010-6 22.13±0.21 0.26
1010-7 25.67±0.33 0.49
상기 패혈증 모니터링용 4종류의 표적 생체분자 IL10, IL6, CRP, PCT 및 표준물질 복합체의 설계핵산에 대한 검사 간 변이계수는 각각 0.25~0.48%, 0.32-0.52%, 0.29-0.46%, 0.22-0.45%, 0.05-0.29%였고, 평균 표준편차는 0.97 주기였다. 각 표적 생체분자 및 표준물질 복합체의 설계핵산에 대한 PCR 효율은 1.72(Range, 1.54-2.07), 1.83 (Range, 1.62-2.27), 1.82 (Range, 1.59-2.05), 1.79 (Range, 1.52-2.27), 1.80(Range, 1.60-2.15)를 보여 분석한 복합체의 설계핵산들 간에는 유의한 차이를 보이지 않았다(표 8).
LightCycler real-time PCR에 의해 표적 생체분자의 표준곡선에서 검사간 변이계수
Concentration
(ng/ul)		 Ct(Mean±SD) CV(%) Efficiency (Mean±SD)
E. coli Enoyl-ACP Reductase
(n=20)		 810-4 15.26±0.16 0.05 1.80±0.13
(Range, 1.60-2.15)
810-5 18.74±0.05 0.29
810-6 22.25±0.05 0.20
810-7 25.75±0.06 0.23
IL-10
(n=10)		 810-4 15.54±0.34 0.25 1.72±0.19
(Range, 1.54-2.07)
810-5 18.46±0.63 0.25
810-6 22.96±0.87 0.48
810-7 25.72±0.36 0.32
IL-6
(n=10)		 710-4 15.26±0.85 0.52 1.83±0.03
(Range, 1.62-2.27)
710-5 18.55±0.10 0.52
710-6 22.37±0.15 0.32
710-7 25.95±0.18 0.47
CRP
(n=10)		 810-4 15.97±0.27 0.37 1.82±0.30
(Range, 1.59-2.05)
810-5 18.65±0.25 0.29
810-6 22.16±0.46 0.46
810-7 25.55±0.58 0.32
PCT
(n=10)		 1010-4 15.65±0.19 0.37 1.79±0.16
(Range, 1.52-2.27)
1010-5 18.12±0.22 0.22
1010-6 22.05±0.15 0.37
1010-7 25.39±0.27 0.45
본 발명에서는 한 튜브에서 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자와 정도관리 및 측정용 표준물질을 동시에 반응을 시켜 수확한 복합체에 있는 설계핵산을 Multiplex Real Time PCR로 분석하여 확보한 Ct 값을 이용하여 절대 정량 및 상대정량을 하였다.
본 발명에서 설계핵산인 amplicon의 구조가 상기 [일반식(I)]에 제시한 바처럼 동일한 구조와 동일한 PCR 프라이머 쌍으로 증폭하여 상기 표적 생체분자와 정도관리 및 측정용 표준물질을 지시하는 설계핵산의 증폭효율이 모두 동일할 것이다.
본 발명에서는 정도관리 및 측정용의 표준물질을 인위적으로 첨가된 분석하고자하는 시료에 있는 표적 생체분자에 의해 형성된 복합체 성계핵산의 존재량을 상기 실시예에서 얻어진 Ct (cycle threshold)값은 2-Ct법(comparative Ct method)으로 분석하였다 (Livak KJ. Comparative Ct Method. ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. User Bulletin No. 2. Relative Quantitation of Gene Expression. PE Applied Biosystems, 1997.).
본 Ct법에서는 검량선을 작성하지 않고 정량을 실시할 수 있다. 다만, 측정하는 모든 생체분자에 대해 PCR 증폭 효율이 거의 일정하다는 것이 전제이다.
표준물질이 첨가된 분석하고자하는 시료에서 분석된 표적 생체분자의 복합체 설계핵산의 Ct값을 표준물질 복합체의 설계핵산 Ct값으로 normalization(Ct표적 생체분자- Ct외부 표준물질)하고 이를 △Ct-n라고 하면, 표준물질이 첨가된 분석하고자하는 시료에서 표적 생체분자의 농도는 다음과 같이 산출되게 된다:
외부 표준물질의 농도 x 2-△Ct-n
외부 표준물질과 그 특이적 리간드의 결합력과 표적 생체분자와 그 특이적 리간드의 결합력 사이에 차이가 있을 경우 상기 결정된 표적 생체분자의 농도는 그것의 시료 중의 농도를 제대로 반영하지 못할 수도 있다. 따라서 그 결합력의 차이로 보정하는 것이 바람직하다.
이러한 보정을 위해서 표적 생체분자와 표적 외부 표준물질을 정량하여 이들을 동일한 농도로 포함하는 대조시료 1개 이상을 준비하고, 이 대조시료(들)를 이용하여 표적 생체분자에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물로부터 산출된 Ct값(또는 대조시료가 2 이상인 경우 그 값들의 평균)과 외부 표준물질 복합체의 설계핵산의 증폭물로부터 산출된 Ct값(또는 대조시료 2 이상인 경우 그 값들의 평균)을 구하여, 그 차이 값(Ct대조시료의 표적 생체분자-Ct대조시료의 외부 표준물질)인 △Ct-c를 구한다. 다음에는 이 값으로 상기 △Ct-n를 Calibration한 △Ct-cal(△Ct-n - △Ct-c)를 구하여, △Ct-cal로 아래의 식에서와 같이 외부 표준물질의 농도로부터 표적 생체분자의 농도를 구하면 상기 결합력이 차이가 반영된 결과를 얻을 수 있다.
외부 표준물질의 농도 x 2-△Ct-cal
따라서 분석하고자 하는 시료 중의 표적 생체분자는 외부 표준물질의 농도보다 2-△Ct-cal의 농도로 존재한다고 할 수 있다.
실시예 8. 설계핵산의 길이를 이용한 생체분자의 분석
설계핵산의 길이를 이용한 정도관리 및 측정용 표준물질이 첨가된 시료에서 하나 도는 그 이상의 표적 생체분자의 분석은 설계핵산의 길이를 분석할 수 있는 모세관 전기영동으로 실시하였다.
상기 실시예에서 한 튜브에서 형성된 정도관리 및 측정용의 표준물질 복합체와 8종류의 표적생체분자 복합체를 자석으로 수확한 경우 또는 ELISA 방법으로 수확한 경우 모두 PCR를 수행하여 증폭산물을 확보하였다.
상기 수확된 복합체를 20uM의 Cy5가 표지된 유니버셜 PCR 정방향 프라이머 (5'-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3), 10uM의 유니버셜 PCR 역방향 프라이머 (5'-TCGACCTCTGGGTTATG-3')를 첨가하고 3차 증류수를 사용하여 반응부피를 20㎕로 조절한 혼합액을 pfu-PCR 프리믹스 (바이오니아. 한국)를 사용하여 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30 초를 35회 수행하여 완전한 이중가닥핵산을 증폭시켰다.
복합체 설계핵산의 증폭산물 분석을 핵산의 길이로 실시하기 위해, 상기 증폭산물을 모세관 전기영동을 수행하였다. 모세관 전기영동은 ABI 3130XL Genetic Analyzer (36-cm capillary array 및 POP7 polymer; Applied Biosystems 사, 미국)를 사용하여 제공된 프로토콜을 따라 수행하였다. 1,0 ul의 상기 PCR 반응물을 9L의 Hi-Di formamide 와 혼합하고, 80℃에서 2 분간 반응시킨 후, 얼음에 넣었다. 샘플들을 모세관에 주입하고 1.6 kV의 전압에서 15초간 적용한 후, 10 kV 의 전기영동 전압 및 60℃ 온도에서 모세관 전기영동하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 수확한 8종류의 생체분자 및 정도관리 및 측정용의 표준물질 복합체를 자석으로 수확한 경우 및 ELISA 방법으로 수확한 경우, 이들 복합체의 설계핵산을 PCR하여 얻은 증폭산물을 모세관 전기영동을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
한 튜브에서 정도관리 및 측정용의 표준물질을 포함한 시료에 8종류 표적 생체분자를 분석하는 과정에서 형성되는 이들의 복합체를 자석으로 수확한 경우 또는 ELISA방법으로 수확한 경우 모두, 형성된 표준물질 복합체의 설계핵산을 PCR하여 얻은 증폭산물을 모세관 전기영동으로 분석한 결과로 본 발명에 의한 리간드 PCR로 분석하고자하는 시료에서 정도관리 및 측정용의 표준물질 및 표적 생체분자 분석이 정상적으로 수행됨을 알 수 있다.
또한 상기에서 형성되고 자석으로 수확한 경우 또는 ELISA방법으로 수확한 경우 모두, 수확된 표준물질 및 표적생체분자 복합체의 설계핵산을 PCR 하여 얻은 증폭산물을 모세관 전기영동으로 얻은 결과를 확보한 후, 상기 표적 생체분자의 분석결과를 상기 표준물질의 분석결과와 비교분석하여 궁극적으로 상기 표적 생체분자를 정량하거나 표준물질/표적 생체분자 또는 표적생체분자간의 양적 비율을 계산할 수 있다.
모세관 전기영동의 도 4의 결과(electropherogram)에서 각 피크는 길이에 따른 각 증폭물을, 그 면적은 증폭물의 양을 나타낸다. 따라서 일정한 농도를 가진 외부 표준물질을 사용하였으므로, 표적 생체분자의 피크 면적을 외부 표준물질의 피크 면적과 비교, 계산함으로써 시료 중의 표적 생체분자의 농도를 얻을 수 있다. 또한 Ct법에서처럼 표적 생체분자와 외부 표준물질을 동일 농도로 포함하는 대조시료를 이용하여 모세관 전기영동을 하여 그 각 리간드와의 결합력의 차이를 반영할 수도 있다. 이러한 결합력이 차이가 반영될 경우 시료 중의 표적 생체분자의 농도를 더 정확히 산출할 수 있게 된다.
실시예 9. 생물학적 의미의 분석
생체시료인 혈액을 이용하여 급성심근경색 도는 패혈증 등의 만성질환을 검진하고 있으며 특히 일반적으로 환자 모니터링용 생체분자 3~4개를 검사하고 결과의 cut-off 수치만을 참고함으로 진단을 하고 있다.
여러 표적 생체분자들을 정량 검사하고 그 결과를 바탕으로 정상인 집단과 환자 집단 간의 함수관계를 정량적으로 분석하여 진단할 수 있는 방법인 체외진단다지표검사(In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays;IVDMIA)는 생물학적 의미인 질병이나 다른 상태를 진단, 치료, 완화, 처치, 예방을 목적으로 해석함수를 사용하여 표적 생체분자의 복수결과들을 결합시켜 환자의 특이적 결과로 분류, 점수, 지수 등을 산출하는 장치 또는 기술이다.
본 발명의 생물학적 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템(Clinical Decision Support System)은 증폭산물 분석 장치(핵산의 염기서열을 확인할 수 있는 장치인 Real time PCR 또는 핵산의 길이를 확인할 수 있는 장치인 모세관 전기영동 장치 등)를 통해 생산된 표준물질 및 표적생체분자와 리간드 복합체에 있는 설계핵산의 증폭산물 분석결과를 보정한 데이터와 OCS(operation control system) 시스템의 환자정보를 입력으로 한다. 출력은 임상의가 분석결과를 입력하고 확인하는 화면과, 진단의가 위험성과 분류를 환자에게 설명할 수 있는 화면과 환자에게 가시적으로 설명할 수 있는 화면을 갖는다. 생물학적 의미 분석 시스템은 증폭산물 분석 장치, OCS와 Interface를 갖고 있어야 하며, Data Mining을 통해 얻어진 결과를 DB에 저장할 수 있어야 한다. HL7에 정의된 XML 데이터를 처리하기 위해 XML Repository를 갖고 있다. Data Mining할 때 필요한 항목을 설정하고 Mining 엔진을 제어할 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 상기 임상 의사 결정 지원 시스템의 학습 엔진 모듈은 상기 표적 생체분자를 지시하는 설계핵산의 증폭산물 분석결과를 이용하여 질환을 판단하기 위해 필요한 인공지능 학습 엔지 모듈이다.
생물학적 의미 분석 시스템은 HL7을 지원하도록 한다. 생물학적 의미 분석 시스템 내부에서 데이터를 처리할 때, HL7에 정의된 Schema를 포함하도록 데이터 구조를 설계하는 것을 의미한다. XML 문서의 Schema 정보를 저장하고 사용하기 위해 XML Repository Module과 XML Repository Client를 갖는다.
표적생체분자를 지시하는 설계핵산의 증폭산물 분석할 수 있 증폭산물 분석 장치와의 연동을 위해 증폭산물 분석결과 Interface Module을 갖는다. 증폭산물 분석결과에서 SDK(software development kit)를 제공하는 경우에는 Gateway를 개발하는 것을 원칙으로 한다. OCS Interface Module은 OCS에서 환자 정보를 읽어 Data Mining에 필요한 정보를 제공한다. 또한 Data Mining에 의해 분석된 질환 정보를 OCS(LIS)에 저장한다.
도 5에 도시되어 제시하는 바와 같이, 상기 임상 의사 결정 지원 시스템의 생물학적 의미 분석은 크게 네 개의 부분 시스템으로 구성되어 있으며, 생물학적 의미 결정 엔진인 데이터분석/예측모델 생성 모듈과 진단클라이언트모듈, 그리고 압타머칩 데이터를 생성하는 증폭산물 분석 장치와의 연동 모듈인 증폭산물 분석 장치 인터페이스, 다른 모듈간의 통신과 데이터 저장을 담당하는 통신서버가 유기적으로 결합된 시스템이다. 시스템의 구동은 크게 시스템 구축단계와 시스템 적용 단계로 구분된다.
시스템 구축 단계는 질병의 특성을 잘 반영하도록 구성된 정상인/환자 시료 집합을 구성하여, 해당 시료 집합에 대한 정도관리 및 측정용의 표준물질을 활용한 표적 생체분자를 리간드-핵산 분석을 실시하고, 표적 생체분자-리간드 복합체 및 표준물질 리간드 복합체의 설계핵산 정보를 증폭산물 분석 장치 인터페이스 모듈을 통해 시스템에 입력, 데이터 분석/예측모델 생성 모듈에서 기본적인 전처리를 하여 인공신경망 알고리즘의 학습데이터 생성, 인공신경망 알고리즘으로 학습데이터를 이용하여 생물학적 의미 분석 모델 생성, 생성된 생물학적 의미 분석모델을 컴퓨터에 저장하는 과정을 거친다.
도 6에 도시되어 제시하는 바와 같이 시스템 적용 단계는 DB에 저장된 생물학적 의미 분석모델을 생물학적 의미 분석 클라이언트에 장착, 생물학적 의미 분석 클라이언트 구동, 생물학적 의미 분석 대상자의 리간드-핵산 분석 및 증폭산물 분석 장치를 이용한 분석결과 정보 생성, 증폭산물 분석 장치 인터페이스를 통한 데이터 입력, 생물학적 의미 분석 클라이언트에서 생물학적 의미 분석 및 결과 가시화, 생물학적 의미 분석 결과 DB에 저장으로 구성된다.
도 7에 도시되어 제시하는 바와 같이, 시스템의 입력 데이터는 환자의 혈액시료 표적 생체분자 정보 및 인적 사항, 타 진료결과 등의 임상정보이다. 리간드-핵산 분석 방법은 시료에 있는 표준물질-리간드 복합체의 설계핵산을 활용하여 표적 생체분자- 리간드 복합체에 있는 설계핵산의 분석결과를 측정하기 위한 분석기술로, 이 리간드-핵산 분석 방법을 통해 환자의 혈액 시료로부터 질병과 관련이 깊은 표적 생체분자의 분포 양상을 파악할 수 있다. 정상(normal)시료와 환자 시료는 모든 실험에서 동일한 표적 생체분자로부터 얻어진 정보만을 학습과 테스트에 사용한다. 표적 생체분자 세트 분석결과 정보는 일차적으로 표적 생체분자를 지시하는 설계핵산의 증폭산물 분석으로 얻어지고, 증폭산물 분석 장치인 Real time PCR에 의한 증폭산물 Ct (cycle threshold)분석 단계를 거쳐 수치화된다.
도 7에 도시되어 제시하는 바와 같이, 표적 생체분자 분석결과 데이터의 각 Ct 값은 표적 생체분자 양태 정도를 나타내는 것이다. 수치 데이터는 증폭산물의 Ct 데이터로부터 얻어진 것으로, 각 값은 하나의 표적 생체분자의 값을 의미하며, 숫자 값은 각 표적 생체분자에 대한 양태의 정도를 의미한다고 할 수 있다.
표적 생체분자 정보와 함께 시스템에서 입력으로 받는 것은 각 환자에 대한 임상 정보이다. 각 환자들에 대한 나이, 성별, 혈압, 가계 상의 질병 내력, 흡연 여부 등 각 환자에 대한 임상 정보 역시 입력으로 받는다. 이들 자료들은 모두 데이터베이스에 저장된다. 시스템 구축을 위해 사용되는 임상 데이터는 기본적으로 협력 의료기관에서 받는 것으로 하며, 표적 생체분자의 양태 데이터는 표적 생체분자-리간드 복합체의 설계핵산 분석 실험 데이터를 이용하는 것으로 한다.
입력으로 받는 Ct 데이터는 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 리간드-핵산 분석 방법으로 표적 생체분자에 상응하는 Ct 값 정보를 이용하게 된다.
도 8에 도시되어 제시하는 바와 같이, 리간드-핵산 분석 실험 결과는 증폭산물 분석 장치를 통해 수치 데이터로 변환된다. 질환 생물학적 의미 결정 시스템에서 이 데이터를 직접 이용하기 위해서는 표적 생체분자를 지시하는 설계핵산의 증폭산물 Ct 데이터를 읽을 수 있는 증폭산물 분석 장치와 생물학적 의미 결정 시스템을 연동시키는 것이 필요하다. 따라서 SDK를 제공하는 증폭산물 분석 장치를 사용하는 것을 기본으로 하여, 생물학적 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템과의 연동을 위한 게이트웨이(gateway)를 개발한다.
한편 생물학적 의미 결정을 위한 임상 데이터는 OCS 시스템의 환자 정보가 입력으로 들어오도록 한다. OCS로부터 환자 정보를 OCS interface module을 통해 읽어서, 데이터마이닝에 필요한 정보들을 시스템 엔진에 제공한다.
*도 8에 도시되어 제시하는 바와 같이, 질병에 대한 생물학적 의미 결정에 대한 지표 예측은 데이터베이스 내의 정보들을 기반으로 이루어진다. 저장되어있는 정보들을 이용하여 여러 가지 기계학습(machine learning) 방법을 적용하면, 질병에 대한 지표 분석이 가능하다. 인공신경망(artificial neural network), 결정트리(decision tree), 베이지안망(Bayesian network), 서포트벡터머신(support vector machine, SVM) 등의 대표적인 기계학습 방법이 분석을 위한 핵심 알고리즘으로 사용된다. 일반적으로 이들 방법들은 벡터 형태의 수치 데이터가 입력으로 들어오면, 이를 학습하여 새로운 데이터에 대한 예측을 가능하게 해준다. 인공신경망과 서포트벡터머신은 데이터를 분류하는 데에 있어서 우수한 성능을 보이기 때문에 기계학습 분야의 연구에서 가장 많이 사용되는 분류 알고리즘들이다. 또한 결정트리와 베이지안망은 결과를 사람이 이해하기 쉽도록 가시화 할 수 있다는 장점을 가진다. 본 생물학적 의미 결정 시스템은 인공신경망 알고리즘을 통해 지속적인 테스트를 거치면서 학습 모델을 최적화(optimize)하고, 이를 통해 질병지표 예측 성능이 우수하게 나올 수 있도록 한다.
정도관리 및 측정용의 표준물질을 이용한 새로운 환자에 대한 하나 또는 그 이상의 표적 생체분자를 리간드-핵산 분석방법에 의해 생산된 Ct의 분석결과 정보와 임상정보가 입력으로 들어오면, 분석 시스템에서는 여러 가지 다양한 형태로 특정한 질병에 대한 지표를 비롯한 분석 결과를 보여준다. 의료진들이 질병에 관한 의사 결정을 하는데 있어서 도움을 줄 수 있는 정보들을 보여주는 것이다. Client에서는 질병지표에 대한 단순한 수치 정보뿐 아니라, 생물학적 네트워크 등을 통해 보다 가시적으로 질병지표 정도를 보여줄 수 있도록 한다. 특정 질병에 대한 분석 결과는 의료진뿐 아니라 환자들이 본인의 질병에 관련된 지표와 그 원인 등에 대해 보다 쉽게 이해하는데 도움이 될 수 있도록 한다.
통신서버는 생물학적 의미를 결정하는 임상 의사 결정 지원 시스템의 통신을 제어한다. 증폭산물 분석 장치 인터페이스, 생물학적 의미 결정 엔진, 생물학적 의미 결정 클라이언트, 데이터베이스 서버 등 데이터가 오가는 모든 부분을 제어한다. 즉, 환자의 실험 정보를 DB에 입력하고, 생물학적 의미 결정 엔진은 환자의 실험 정보를 가져와서 진단하고, 생물학적 의미 결정 결과를 DB에 저장하고, 생물학적 의미 결정 결과를 생물학적 의미 결정 클라이언트 화면에 내보내는 등 데이터를 관리하는 모든 부분을 담당한다. 그리고, 데이터베이스 서버는 환자의 검사 정보, 환자의 실험 정보, 생물학적 의미 결정에 필요한 학습 정보, 생물학적 의미 결정 엔진 모델 정보, 시스템 설정 정보, 시스템 로그 정보, 생물학적 의미 결정 결과 정보 등 다양한 데이터를저장하다. 통신서버와 데이터베이스는 상호 밀접한 관계를 가지며, 각 모듈별 데이터 전송을 관리한다.
도 9에 도시한 바와 같이, 상기 정도관리 및 측정용의 표준물질이 첨가된 혈액시료를 리간드-핵산분석 방법으로 혈액시료에서 상기 표준물질의 분석결과를 기준으로 상기 표적 생체분자의 분석결과를 확인할 수 있으며 또한 급성심근경색 환자 또는 패혈증 환자의 혈청 생체분자의 분석결과가 상이함을 확인하여 생물학적 의미를 결정할 수 있다.
도 10은 생산된 분석결과를 질환군별로 구성된 데이터베이스 및 인공신경망을 이용한 임상 의사 결정 지원 시스템으로 특정한 사람의 혈액시료에 대해 생체분자 분석결과를 생산하여 질병을 진단하는 흐름도이다. 도11에 제시한 바처럼, 많은 생체시료에서 생산되는 분석결과로 구축된 데이터베이스를 생물정보학기술로 분석하여 얻은 유용한 정보로 생물학적 의미를 결정할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 리간드 핵산 분석방법을 사용하여 시료에 있는 표적 생체분자들을 한 번의 검사로 분석함으로써 시료에서 표적 생체분자들의 생물학적 의미를 확인할 수 있으며, PCR 및 형광학적으로 존재신호를 증폭하여 높은 감도로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 내부 정도관리하면서 한 번의 검사로 표적 생체분자들을 분석함으로써 시료에서 질병의 스크리닝, 질병 진단, 질병에 대한 민감성 그리고 치료 약제에 대한 반응의 차이 등 개인 간의 차이를 효율적으로 결정하는 방법을 제공하는 것이 가능함으로써 인간 질병 극복에 크게 기여하며, 경제적 차원에서 의료 산업상 매우 유용한 효과가 있다.

Claims (20)

  1. (a) 기지의 표적 단백질이 1종 이상 존재하는 시료를 준비하는 단계;
    (b) 상기 시료에 외부 표준물질로서 그 시료에는 존재하지 않는 단백질을 정량하여 첨가하는 단계;
    (c) 상기 외부 표준물질이 첨가된 시료에, 그 시료 중의 표적 단백질과 상기 외부 표준물질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 첨가하여, 상기 표적 단백질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체 및 상기 외부 표준물질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체를 형성시키는 단계;
    (d) 상기 복합체를 분리하는 단계;
    (e) 상기 복합체들의 설계핵산을 동시에 증폭하는 단계;
    (f) 상기 표적 단백질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물과 상기 외부 표준물질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물을 정량하고 비교하여 상기 표적 단백질에 대한 정량 정보를 얻는 단계; 및
    (g) 상기 (f) 단계의 표적 단백질의 정량 정보에, 상기 표적 단백질과 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도와 상기 외부 표준물질과 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이를 반영하는 단계를 포함하되,
    상기 설계핵산은 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역 그리고 이들 영역 사이에 상기 리간드가 특이적으로 결합하는 표적 단백질 또는 외부 표준물질을 지시하여 그 분자를 식별하는 것을 가능하게 하는 영역을 가진 설계핵산이고,
    상기 설계핵산의 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역은 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트로 모든 설계핵산을 동시에 증폭할 수 있도록 모든 설계핵산에서 공통된 염기서열을 가지는,
    상기 외부 표준물질의 정량 값을 표적 단백질의 정량에 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 시료 중 단백질의 분석 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (g) 반영 단계는 아래의 (i) 내지 (vi) 단계를 포함하는 방법:
    (i) 상기 표적 단백질과 상기 외부 표준물질을 정량하여 동일 농도로 포함하는 대조시료를 준비하는 단계;
    (ii) 상기 대조시료에, 그 시료 중의 정량된 표적 단백질과 정량된 외부 표준물질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는, 상기 (c) 단계에서 사용한 연결 구조체와 동일한 연결 구조체를 첨가하여, 상기 표적 단백질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체 및 상기 외부 표준물질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체를 형성시키는 단계;
    (iii) 상기 복합체를 분리하는 단계;
    (iv) 상기 복합체들의 설계핵산을 동시에 증폭하는 단계;
    (v) 상기 표적 단백질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물과 상기 외부 표준물질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물을 정량하여 그 차이를 구하는 단계; 및
    (vi) 상기 차이를 상기 (f) 단계의 표적 단백질의 정량 정보에 반영하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    모든 증폭은 그 증폭물을 실시간으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 이루어지고,
    그 증폭물의 양은 Ct(Threshold cycle) 값으로 산출되고,
    상기 (f) 단계의 정량하고 비교한 결과가 △Ct-n(Ct표적 단백질- Ct외부 표준물질)로 산출되고,
    상기 (f) 단계의 표적 단백질에 대한 정량 정보가, 상기 (b) 단계의 외부 표준물질의 농도×2-△Ct-n로 산출되고,
    상기 (v) 단계의 차이가 △Ct-c(Ct대조시료의 표적 단백질- Ct대조시료의 외부 표준물질)로 산출됨으로써,
    상기 (vi) 단계가 상기 △Ct-n와 △Ct-c의 차이 값인 △Ct-cal(△Ct-n - △Ct-c)를 반영하여, 상기 (f) 단계의 표적 단백질의 정량 정보가, 상기 (b) 단계의 외부 표준물질의 농도×2-△Ct-cal로 결정되도록 수행되는,
    방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 시료 중의 표적 단백질은 2종 이상이고,
    이에 따라 그 표적 단백질에 특이적인 리간드와 설계핵산의 연결 구조체도 2종 이상이되,
    상기 2종 이상의 연결 구조체의 설계핵산에서 그 정방향 프라이머가 결합하는 영역과 그 역방향 프라이머가 결합하는 영역은 그 종류를 불문하고 모든 연결 구조체의 설계핵산 사이에서 공통된 염기서열을 갖는,
    방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 리간드는 항체인,
    방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 설계핵산은 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 RNA이며,
    상기 리간드가 특이적으로 결합하는 표적 단백질 또는 외부 표준물질을 지시하는 영역은 염기서열 또는 그 길이로 지시하는 영역인,
    방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 증폭기술은 중합효소 연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR), 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR), 실시간 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(real time multiplex PCR) 및 멀티플렉스 역전사-중합효소 연쇄반응(multiplex RT-PCR) 중 하나의 중합효소 연쇄반응으로 이루어지는,
    방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (e) 단계의 증폭은 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR), 실시간 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(real time multiplex PCR) 및 실시간 멀티플렉스 역전사-중합효소 연쇄반응(real time multiplex RT-PCR)으로 구성된 군에서 선택된 중합효소 연쇄반응으로 이루어지고,
    상기 증폭 시에 택맨 프로브(Taqman probe)가 첨가되어 그 택맨 프로브로 그 증폭물을 정량하는 것을 특징으로 하는,
    방법.
  10. 1종 이상 기지의 표적 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 1 종 이상 포함하고,
    외부 표준물질로서, 상기 표적 단백질이 존재하는 시료에는 존재하지 않는 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 포함하는, 시료 중의 표적 단백질 분석 키트로서,
    상기 설계핵산은 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역 그리고 이들 영역 사이에 리간드가 특이적으로 결합하는 표적 단백질 또는 외부 표준물질을 지시하여 그 분자를 식별하는 것을 가능하게 하는 영역을 가진 설계핵산이고,
    상기 설계핵산의 정방향 프라미어가 결합하는 영역과 역방향 프라이머가 결합하는 영역은 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트로 모든 설계핵산을 증폭할 수 있도록 모든 설계핵산에서 공통된 염기서열을 가지며,
    상기 키트는 시료 중 표적 단백질의 분석 방법으로 아래의 (a) 내지 (g) 단계를 포함하는 방법을 교시하는 사용 설명서를 추가로 포함하 키트:
    (a) 기지의 표적 단백질이 1종 이상 존재하는 시료를 준비하는 단계;
    (b) 상기 시료에 외부 표준물질로서 그 시료에는 존재하지 않는 단백질을 정량하여 첨가하는 단계;
    (c) 상기 외부 표준물질이 첨가된 시료에, 그 시료 중의 표적 단백질과 상기 외부 표준물질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 리간드와 설계핵산의 연결 구조체를 첨가하여, 상기 표적 단백질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체 및 상기 외부 표준물질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체를 형성시키는 단계;
    (d) 상기 복합체를 분리하는 단계;
    (e) 상기 복합체들의 설계핵산을 동시에 증폭하는 단계;
    (f) 상기 표적 단백질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물과 상기 외부 표준물질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물을 정량하고 비교하여 상기 표적 단백질에 대한 정량 정보를 얻는 단계; 및
    (g) 상기 (f) 단계의 표적 단백질의 정량 정보에, 상기 표적 단백질과 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도와 상기 외부 표준물질과 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이를 반영하는 단계.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 표적 단백질과 그에 대한 상기 연결 구조체의 결합 친화도와 외부 표준물질과 그에 대한 연결 구조체의 결합 친화도 사이의 차이를 결정하기 위하여, 대조시료에 사용할 상기 1종 이상의 표적 단백질과 상기 외부 표준물질을 추가로 포함되는 키트.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제10항에 있어서,
    상기 설명서는, 상기 (g) 반영 단계가 (i) 내지 (vi) 단계를 포함함을 추가로 교시하고 있는 키트:
    (i) 상기 표적 단백질과 상기 외부 표준물질을 정량하여 동일 농도로 포함하는 대조시료를 준비하는 단계;
    (ii) 상기 대조시료에, 그 시료 중의 정량된 표적 단백질과 정량된 외부 표준물질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는, 상기 (c) 단계에서 사용한 연결 구조체와 동일한 연결 구조체를 첨가하여, 상기 표적 단백질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체 및 상기 외부 표준물질과 그 특이적 연결 구조체의 복합체를 형성시키는 단계;
    (iii) 상기 복합체를 분리하는 단계;
    (iv) 상기 복합체들의 설계핵산을 동시에 증폭하는 단계;
    (v) 상기 표적 단백질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물과 상기 외부 표준물질에 대한 복합체의 설계핵산의 증폭물을 정량하여 그 차이를 구하는 단계; 및
    (vi) 상기 차이를 상기 (f) 단계의 표적 단백질의 정량 정보에 반영하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 설명서는,
    모든 증폭은 그 증폭물을 실시간으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 이루어지고,
    그 증폭물의 양은 Ct(Threshold cycle) 값으로 산출되고,
    상기 (f) 단계의 정량하고 비교한 결과가 △Ct-n(Ct표적 단백질- Ct외부 표준물질)로 산출되고,
    상기 (f) 단계의 표적 단백질에 대한 정량 정보가, 상기 (b) 단계의 외부 표준물질의 농도×2-△Ct-n로 산출되고,
    상기 (v) 단계의 차이가 △Ct-c(Ct대조시료의 표적 단백질- Ct대조시료의 외부 표준물질)로 산출됨으로써,
    상기 (vi) 단계가 상기 △Ct-n와 △Ct-c의 차이 값인 △Ct-cal(△Ct-n - △Ct-c)를 반영하여, 상기 (f) 단계의 표적 단백질의 정량 정보가, 상기 (b) 단계의 외부 표준물질의 농도×2-△Ct-cal로 결정되도록 수행됨을 추가로 교시하는 키트.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 2종 이상의 표적 단백질를 분석할 수 있는 키트.
  17. 제10항에 있어서,
    상기 리간드는 항체인 키트.
  18. 제10항에 있어서,
    상기 설계핵산은 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 RNA이며,
    상기 리간드가 특이적으로 결합하는 표적 단백질 또는 외부 표준물질을 지시하는 영역은 염기서열 또는 그 길이로 지시하는 영역인, 키트.
  19. 제10항에 있어서,
    상기 설명서는
    상기 증폭 단계가 중합효소 연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR), 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR), 실시간 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(real time multiplex PCR) 및 멀티플렉스 역전사-중합효소 연쇄반응(multiplex RT-PCR) 중 하나의 중합효소 연쇄반응으로 이루어짐을 추가로 교시하고 있는 키트.
  20. 제10항에 있어서,
    상기 설명서는
    상기 증폭 단계가 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR), 실시간 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(real time multiplex PCR) 및 실시간 멀티플렉스 역전사-중합효소 연쇄반응(real time multiplex RT-PCR)으로 구성된 군에서 선택된 중합효소 연쇄반응으로 이루어지고,
    상기 증폭 시에 택맨 프로브(Taqman probe)가 첨가되어 그 택맨 프로브로 그 증폭물을 정량할 수 있음을 추가로 교시하고 있는 키트.
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