TWI666326B - 用於pcr陣列的多基因絕對定量方法 - Google Patents

用於pcr陣列的多基因絕對定量方法 Download PDF

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TWI666326B
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奎克生技光電股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，待測核酸樣品含有至少一種核酸標靶。在測試載具的多個反應孔中分別配置用以擴增多個標準品DNA或欲測定之核酸標靶的引子。之後，將已知拷貝數目的多個標準品DNA及核酸樣品混合加入反應孔中，對標準品DNA及核酸樣品進行qPCR。分別針對每一標準品DNA設計具有序列特異性的正向引子及反向引子的組合，在正向引子及反向引子所對應的區域之間具有相同的DNA模版序列。用以擴增多個標準品DNA以及欲測定之核酸標靶的引子具有相似的擴增效率。

Description

用於PCR陣列的多基因絕對定量方法
本發明是有關於一種絕對定量方法，且特別是有關於一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法。
隨著現代生醫技術的發展及臨床需求，許多診斷方法需要針對目標基因進行絕對定量。舉例而言，HIV或C型肝炎（HCV）等感染的病毒量（viral load）及療程監控，或是器官移植病人的病毒量監控。在現有技術中，若欲使用qPCR技術以96孔盤進行測定，則須將標準品與待測樣品放在不同的孔洞中，以避免彼此干擾，因此，須使用相當多的孔洞數，對實驗流程進行以及測試成本上造成不良影響。
基於上述，針對具有多個反應孔的測試載具，在運用qPCR技術對核酸樣品進行絕對定量時，如何改善實驗順暢度並降低測試成本，為目前所需研究的重要課題。
本發明提供一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，針對具有多個反應孔的測試載具，在運用qPCR技術對核酸樣品進行絕對定量時，能夠有效地改善實驗順暢度並降低測試成本。
本發明用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，包括以下步驟，待測核酸樣品含有至少一種核酸標靶。在測試載具的多個反應孔中分別配置用以擴增多個標準品DNA或欲測定之核酸標靶的引子。之後，將多個已知拷貝數目但數目不同的標準品DNA及待測核酸樣品混合加入多個反應孔中，對多個標準品DNA及核酸樣品進行qPCR。各標準品DNA分別具有針對每一標準品DNA設計之具序列特異性的正向引子及反向引子的組合，以避免在多個標準品之間產生干擾以及標準品與待測樣品之間彼此干擾，因此，多個標準品DNA可在相同反應中混合且獨立擴增而不彼此影響。此外，用以擴增多個標準品DNA以及欲測定之核酸標靶的引子具有相似的擴增效率，多個標準品DNA在正向引子及反向引子所對應的區域之間具有相同的DNA模版序列，用以確保擴增多個標準品DNA以及欲測定之核酸標靶時不會有差異，以準確測出待測物的拷貝數目。
在本發明的一實施例中，以拷貝數目對數值 [log(拷貝數目)]為橫軸，Cq值為縱軸，依據多個標準品DNA的拷貝數目對數值[log(拷貝數目)]以及Cq值製作標準曲線之後，將核酸標靶的Cq值代入標準曲線，以得到核酸標靶的拷貝數目。
在本發明的一實施例中，擴增效率包括Tm值。
在本發明的一實施例中，針對測試載具的多個反應孔分出多個叢集（cluster），每一叢集由多個反應孔組成，在每一叢集的多個反應孔中配置同一種用以擴增標準品DNA或核酸標靶的引子。
在本發明的一實施例中，每一叢集的反應孔組成為3×3。
在本發明的一實施例中，每一叢集用以針對多個標準品DNA中的其中一者或單一種類的核酸標靶進行qPCR。
基於上述，本發明提出一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，其中多個標準品分別具有不同的正向引子及反向引子，在正向引子及反向引子之間具有相同的擴增效率之DNA模版序列，因此，能夠避免在多個標準品之間產生效率偏差。此外，用以擴增多個標準品以及欲測定之核酸標靶的引子亦具有相似的擴增效率，因此，本發明將多個標準品及核酸樣品混合加入反應孔中，即可依據多個標準品的拷貝數目以及Cq值製作標準曲線，進而推算出核酸標靶的拷貝數目，也因為每一正向引子和反向引子具有不同DNA序列，故能夠有效地避免在多個標準品之間產生干擾以及標準品與待測樣品之間彼此干擾，也無須將標準品與待測樣品放在不同的反應孔中進行測定。如此一來，可改善習知技術中需使用額外孔洞對標準品測定的缺點，進而使實驗測定流程更為順暢並降低測試成本。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
本發明提供一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法。下文中，先針對說明書內文所使用的名詞加以定義說明。
｢qPCR」或｢real-time quantitative PCR」（即時定量聚合酶鏈鎖反應）是指使用PCR以擴增並同時定量目標DNA的實驗方法。利用多種測定化學物質來進行定量(包括諸如SYBR ®green的螢光染料或Taqman探針的螢光報告寡核苷酸探針等)，隨著每次擴增循環之後反應中積累的擴增DNA來對其進行即時定量。
｢Cq值」為qPCR操作流程中，開始顯著地增加螢光強度時的擴增循環數目。
「樣品」是指被測試的核酸樣品。例如，樣品可以是從血液、組織、唾液等來源中提取的核酸片段（包括DNA或RNA等）。模板(template)是指有具體序列的DNA或RNA或微RNA鏈，也被稱為生物標記或核酸標靶，並且可以經由qPCR反應來檢測。
｢具有多個反應孔的測試載具」是指具有多個反應孔的載片板，其中每個反應孔用來進行qPCR反應。
本發明提供一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，其中核酸樣品含有至少一種欲測定的核酸標靶，包括以下步驟。先提供具有多個反應孔的測試載具，較佳例如是針對測試載具的多個反應孔分出多個叢集（cluster），每一叢集由多個反應孔組成，例如是由3×3個反應孔組成，但本發明並不以此為限。之後，在測試載具的多個反應孔中分別配置用以擴增多個標準品或欲測定之核酸標靶的引子，較佳例如是在每一叢集的多個反應孔中配置同一種用以擴增標準品或核酸標靶的正向及反向引子，以使每一叢集用以針對多個標準品中的其中一者或單一種類的核酸標靶進行qPCR。接著，將多個已知拷貝數目但數目不同的標準品DNA及核酸樣品混合加入多個反應孔中，對多個標準品及核酸樣品進行qPCR。然後，以拷貝數目對數值 [log(拷貝數目)]為橫軸，Cq值為縱軸，依據多個標準品的拷貝數目對數值 [log(拷貝數目)]以及Cq值製作標準曲線（如前所述多個標準品的拷貝數目在實驗前即已知）。最後，將核酸標靶的Cq值代入標準曲線，以得到核酸標靶的拷貝數目。
圖1是依照本發明5個標準品DNA的拷貝數目對數值[log(拷貝數目)]以及Cq值製作的標準曲線圖。如圖1所示，本發明設計5種標準品DNA，各標準品DNA以不同濃度進行qPCR。之後，以DNA拷貝數目對數值[log(拷貝數目)]為橫軸，Cq值為縱軸，依照本發明5個標準品DNA的拷貝數目對數值[log(拷貝數目)]以及Cq值製作標準曲線，待測物之濃度可依其Cq值與標準曲線計算得到。
必須說明的是，在本實施例中，多個標準品分別具有不同的正向引子及反向引子，且多個標準品的正向引子及反向引子不具有相同的DNA序列，這些具有序列特異性的引子可避免在多個標準品之間產生干擾以及標準品與待測樣品之間彼此干擾，更無須將標準品與待測樣品放在不同的反應孔中進行測定。至於所使用的標準品數目，例如可使用5個標準品，但本發明並不以此為限，亦可視實際操作情形調整所使用的標準品數目，以畫出符合實驗需求的標準曲線。此外，用以擴增多個標準品DNA以及欲測定之核酸標靶的引子具有相似的擴增效率，多個標準品DNA在正向引子及反向引子所對應的區域之間具有相同的DNA模版序列，用以確保擴增多個標準品DNA以及欲測定之核酸標靶時不會有差異，以準確測出待測物的拷貝數目。在本實施例中，正向引子及反向引子的長度分別例如是18至24 bp，相同的DNA模版序列的長度例如是80 bp。
以下，藉由實驗例來詳細說明上述核酸樣品的絕對定量方法。然而，下述實驗例並非用以限制本發明。 實驗例 反應條件測試
使用5個標準品DNA與其引子組進行反應條件測試，以得到最佳反應條件。透過SYBR ®green的螢光染料搭配具有多個反應孔的測試載具進行qPCR，所得到的最佳反應條件如下，可達到約90%至100%的PCR效率： 引子濃度：0.5 μm 反應溫度及時間：95℃44秒，60℃88秒 反應循環數：40循環 標準品 DNA 量化
將5個標準品DNA儲存溶液（stock）（10 ng/μl）進行系列稀釋，再以SYBR ®green的螢光染料搭配具有多個反應孔的測試載具分別進行qPCR及數位PCR（digital PCR，dPCR）（125孔洞/叢集，每種叢集四重複），以推算5個標準品DNA的濃度（拷貝數目/μl）。將5個標準品DNA分別進行系列稀釋所得的標準曲線及R 2、dPCR測得的DNA濃度（拷貝數目/μl）列於以下表1中。由表1可得知，5個標準品DNA的R 2都接近1，因此，系列稀釋良好。 表 1
趨勢線方程式 R2 dPCR測得的DNA濃度（拷貝數目/μl）
標準品DNA1 y=325387x-0.0027 0.9970 2.17×108
標準品DNA2 y=283479x-0.0078 0.9961 1.89×108
標準品DNA3 y=348829x-0.0011 0.9999 2.33×108
標準品DNA4 y=397037x+0.0578 0.9928 2.65×108
標準品DNA5 y=394724x-0.0005 0.9982 2.63×108
以dPCR結果推算的儲存溶液實際濃度與不同濃度標準品DNA所得Cq值繪示標準曲線，方程式為y=-3.3188x+25.672，R²為0.9987，關於5個標準品DNA的log(拷貝數目/孔洞)以及Cq值列於以下表2中，PCR效率為100.13%。 表 2
log(拷貝數目/孔洞) Cq
標準品DNA1 4.637 10.09
標準品DNA2 3.577 13.90
標準品DNA3 2.668 17.08
標準品DNA4 1.724 19.91
標準品DNA5 0.721 23.15
使用標準品 DNA 製作校正曲線
以dPCR結果推算的儲存溶液實際濃度與4種不同濃度標準品DNA所得Cq值繪製標準曲線，進而計算第5種標準品DNA濃度。趨勢線方程式（y：Cq；x：log (拷貝數目/孔洞)）、R²、PCR效率、目標DNA的Cq值及由此推算的拷貝數目/孔洞以及dPCR偵測的拷貝數目/孔洞列於以下表3中。如表3所示，在分別推算5個標準品DNA的結果中，Cq值計算出的拷貝數目/孔洞(A)與dPCR偵測的拷貝數目/孔洞(B)的比值都接近1，因此，可得知Cq值計算出的拷貝數目/孔洞(A)與dPCR偵測的拷貝數目/孔洞(B)的結果相當接近。 表 3
趨勢線方程式 R2 PCR 效率 目標 DNA 目標 DNA Cq值 Cq值計算出的拷貝數目/孔洞(A) dPCR偵測的拷貝數目/孔洞(B) A/B
y=-3.2133x+25.492 0.9992 104.47% 標準品 DNA1 10.09 6.21×104 4.34×104 1.43
y=-3.3319x+25.68 0.9987 99.59% 標準品 DNA2 13.90 3.43×103 3.78×103 0.91
y=-3.3184x+25.606 0.9995 100.15% 標準品 DNA3 17.08 3.71×102 4.66×102 0.80
y=-3.324x+25.698 0.9986 99.91% 標準品 DNA4 19.91 5.51×101 5.30×101 1.04
y=-3.3858x+25.917 0.9983 97.40% 標準品 DNA5 23.15 6.57 5.26 1.25
以dPCR結果推算的5種標準品儲存溶液實際濃度平均後，以不同濃度的標準品DNA所得Cq值繪製標準曲線，方程式為y=-3.213x+25.401，R²為0.9974，關於5個標準品DNA的log(平均拷貝數目/孔洞)以及Cq值列於以下表4中，PCR效率為104.76%。 表 4
log(平均拷貝數目/孔洞) Cq
標準品DNA1 4.669 10.09
標準品DNA2 3.669 13.90
標準品DNA3 2.669 17.08
標準品DNA4 1.669 19.91
標準品DNA5 0.669 23.15
以dPCR結果推算的儲存溶液實際濃度，將5種標準品DNA實際濃度平均後，與4種不同濃度標準品DNA所得Cq值繪製標準曲線，計算第5種標準品DNA濃度。趨勢線方程式（y：Cq；x：log (拷貝數目/孔洞)）、R²、PCR效率、目標DNA的Cq值及由此推算的拷貝數目/孔洞以及dPCR偵測的平均拷貝數目/孔洞列於以下表5中。如表5所示，在分別推算5個標準品DNA的結果中，Cq值計算出的拷貝數目/孔洞(A)與dPCR偵測的平均拷貝數目/孔洞(B)的比值都接近1，因此，可得知Cq值計算出的拷貝數目/孔洞(A)與dPCR偵測的平均拷貝數目/孔洞(B)的結果相當接近。 表 5
趨勢線方程式 R2 PCR 效率 目標 DNA 目標 DNA Cq值 Cq值計算出的拷貝數目/孔洞(A) dPCR偵測的平均拷貝數目/孔洞(B) A/B
y=-3.058x+25.143 0.9994 112.33% 標準品 DNA1 10.09 8.37×104 4.67×104 1.79
y=-3.254x+25.429 0.9984 102.91% 標準品 DNA2 13.90 3.49×103 4.67×103 0.75
y=-3.213x+25.338 0.9982 104.76% 標準品 DNA3 17.08 3.72×102 4.67×102 0.80
y=-3.2314x+25.488 0.9973 103.92% 標準品 DNA4 19.91 5.32×101 4.67×101 1.14
y=-3.264x+25.589 0.9954 102.48% 標準品 DNA5 23.15 5.59 4.67 1.20
樣本分析測試
以具有多個反應孔的測試載具PanelChip（由奎克生技光電股份有限公司所製造）分析人類細胞株中不同mRNA的表現。針對PanelChip的多個反應孔分出32種叢集（cluster），其中每一叢集由3×3個反應孔組成，每一種叢集事先分別配置標準品DNA或目標DNA的引子，且PanelChip上每一叢集有三重複。32種叢集所針對的目標DNA如表6所示。標準品DNA在每個孔洞中的平均拷貝數目如表7所示。 表6
目標DNA 目標DNA 目標DNA 目標DNA
1 標準品DNA1 9 BRAF 17 ERBB4 25 PD-1
2 標準品DNA2 10 BRCA1 18 HBAC100 26 PD-L1
3 標準品DNA3 11 BRCA2 19 HER2 27 緩衝液
4 標準品DNA4 12 CDK6 20 HPRT 28 PTEN
5 標準品DNA5 13 CTNNB1 21 IDHI 29 pUC57(miRNA)
6 ALK 14 EGFR 22 KIT 30 qPCR-控制
7 AR-V7 15 ERBB2 23 KRAS 31 RT-控制
8 β-actin 16 ERBB3 24 MET 32 SMO
表 7
每個孔洞中的平均拷貝數目
標準品DNA1 2.33×104
標準品DNA2 2.33×103
標準品DNA3 2.33×102
標準品DNA4 2.33×101
標準品DNA5 2.33
測試 1
針對5個標準品DNA繪製標準曲線，方程式為y=-3.3046x+26.104，R²為0.9974，關於5個標準品DNA的log(平均拷貝數目/孔洞)以及平均Cq值列於以下表8中，PCR效率為100.73%。 表 8
log(平均拷貝數目/孔洞) 平均Cq值
標準品DNA1 4.37 11.593
標準品DNA2 3.37 15.239
標準品DNA3 2.37 18.223
標準品DNA4 1.37 21.205
標準品DNA5 0.37 25.133
測試 2
將5個標準品DNA加入HBAC100標準品進行測試，針對5個標準品DNA繪製標準曲線，方程式為y=-3.2074x+25.482，R²為0.9968，關於5個標準品DNA的log(平均拷貝數目/孔洞)以及平均Cq值列於以下表9中，PCR效率為105.01%。HBAC100標準品的平均Cq值、log(拷貝數目/孔洞)、拷貝數目/孔洞、所計算出的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(A)、dPCR偵測的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(B)列於以下表10中。如表10所示，在推算HBAC100標準品的結果中，所計算出的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(A)與dPCR偵測的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(B)的比值都接近1，因此，可得知所計算出的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(A)與dPCR偵測的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(B)的結果相當接近，即使和其他標準品混合（HBAC100標準品），也不影響本發明絕對定量方法的表現。 表 9
log(拷貝數目/孔洞) 平均Cq值
標準品DNA1 4.37 11.14
標準品DNA2 3.37 14.962
標準品DNA3 2.37 18.028
標準品DNA4 1.37 21.29
標準品DNA5 0.37 24.013
表 10
平均Cq值 log(拷貝數目/孔洞) 拷貝數目/孔洞 計算出的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(A) dPCR偵測的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(B) A/B
17.74 2.41 2.57×102 1.72×108 1.78×108 0.97
測試 3
將5個標準品DNA加入10倍稀釋的A549細胞株cDNA進行測試，針對5個標準品DNA繪製標準曲線，方程式為y=-3.3129x+25.669，R²為0.9974，關於5個標準品DNA的log(平均拷貝數目/孔洞)以及平均Cq值列於以下表11中，PCR效率為100.38%。針對A549細胞株cDNA中不同目標基因所測試的平均Cq值、log(拷貝數目/孔洞)、所計算出的拷貝數目/孔洞(A)、dPCR的拷貝數目/孔洞(B)列於以下表12中。如表12所示，在測試A549細胞株cDNA中不同目標基因的結果中，所計算出的拷貝數目/孔洞(A)與dPCR的拷貝數目/孔洞(B)的比值都接近1，因此，可得知所計算出的拷貝數目/孔洞(A)與dPCR的拷貝數目/孔洞(B)的結果相當接近。在實際測量樣本的情況下，當5個標準品DNA與人類細胞株混合進行目標基因的測量，本發明的絕對定量方法呈現出符合期望的表現結果。 表 11
log(平均拷貝數目/孔洞) 平均Cq值
標準品DNA1 4.37 10.912
標準品DNA2 3.37 14.902
標準品DNA3 2.37 17.914
標準品DNA4 1.37 20.923
標準品DNA5 0.37 24.466
表 12
目標基因 平均Cq值 log(拷貝數目/孔洞) 計算出的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(A) dPCR偵測的儲存溶液濃度（拷貝數目/μl）(B) A/B
β-actin 16.86 2.659 4.56×102 1.03×103 0.44
HPRT 22.184 1.052 1.13×101 1.46×101 0.77
IDHI 20.449 1.576 3.76×101 5.07×101 0.74
MET 22.211 1.044 1.11×101 2.92×101 0.38
PTEN 22.344 1.004 1.01×101 1.73×101 0.58
綜上所述，本發明提出一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，適用於具有多個反應孔的測試載具，在測試載具的反應孔分別配置不同標準品DNA或目標DNA的引子，其中多個標準品DNA分別具有不同的正向引子及反向引子，正向引子及反向引子具有不同的DNA序列，而有序列特異性，因此，能夠避免在多個標準品DNA之間產生相互干擾。此外，用以擴增多個標準品DNA以及欲測定之核酸標靶的引子具有相似的擴增效率，因此，本發明將多個標準品DNA及核酸樣品混合加入反應孔中，即可依據多個標準品DNA的不同拷貝數目以及Cq值製作標準曲線，進而推算出核酸標靶的拷貝數目，能夠有效地避免標準品DNA與待測樣品的引子之間彼此干擾，故無須將標準品DNA與待測樣品放在不同的反應孔中進行測定。如此一來，可改善習知技術中需使用額外孔洞對標準品DNA測定的缺點，進而使實驗測定流程更為順暢並降低測試成本。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是依照本發明5個標準品DNA的拷貝數目對數值[log(拷貝數目)]以及Cq值製作的標準曲線圖。

Claims (6)

  1. 一種用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，包括： 在測試載具的多個反應孔中分別配置用以擴增多個標準品DNA或欲測定之核酸標靶的引子；以及 將已知拷貝數目但數目不同的多個所述標準品DNA及核酸樣品混合加入多個所述反應孔中，所述核酸樣品含有至少一種所述核酸標靶，對多個所述標準品DNA及所述核酸樣品進行qPCR， 其中分別針對每一所述標準品DNA設計具有序列特異性的正向引子及反向引子的組合，在所述正向引子及所述反向引子所對應的區域之間具有相同的DNA模版序列，用以擴增多個所述標準品DNA以及欲測定之所述核酸標靶的引子具有相似的擴增效率。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，更包括以log(拷貝數目)為橫軸，Cq值為縱軸，依據多個所述標準品DNA的不同拷貝數目以及Cq值製作標準曲線之後，將所述核酸標靶的Cq值代入所述標準曲線，以得到所述核酸標靶的拷貝數目。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，其中所述擴增效率包括Tm值。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，其中針對所述測試載具的多個所述反應孔分出多個叢集（cluster），每一所述叢集由多個所述反應孔組成，在每一所述叢集的多個所述反應孔中配置同一種用以擴增所述標準品DNA或所述核酸標靶的引子。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，其中每一所述叢集的所述反應孔組成為3×3。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的用於PCR陣列的多基因絕對定量方法，其中每一所述叢集用以針對多個所述標準品DNA中的其中一者或單一種類的所述核酸標靶進行qPCR。
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