CN102395977B - 核酸定量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于定量扩增的核酸的方法,其包括以下步骤:计算靶和对比用核酸的循环到循环扩增效率ê(C)的随机性的量度M,-确定循环数CM,其中M对于靶和对比用核酸是最小的,从CM值计算特征性循环数CC。
Description
技术领域
本发明涉及通过聚合酶链式反应(PCR)进行核酸定量的领域。
背景技术
核酸的定量在从分子生物学和遗传学研究到诊断学和病原体检测的许多领域中是重要的。当足够量的核酸存在时,斑点技术可被用于定量。但是,这些技术有限的灵敏度妨碍了它们在许多情况中的应用。
不久前发展的定量PCR方法为需要更高灵敏度的情况中的分析提供了工具。这些技术基于在PCR扩增中产物的量指数增长并且因此在相对少量的循环后获得的产物的量可被传统方法(例如荧光检测)检测到的事实。此外,如果扩增循环数是已知的,原则上初始(即在扩增开始时)存在的产物的量,可从扩增结束时获得的产物的量中被确定。
简要概括,实际上,在给定的PCR反应条件下靶核酸及标准和/或对比用样品(comparative sample)进行PCR,并且PCR产物的形成在扩增程序的过程中被监控。PCR产物的检测通过例如当结合到靶标上发射特异性信号的荧光标记的杂交探针的方法或允许检测双链产物的DNA插入荧光染料的方法来完成。对获得特异地荧光阈值水平必需的扩增循环数,指定为Ct 值,被确定并且将靶标的Ct值与已知浓度(绝对量)的核酸标准品的稀释系列的Ct 值相比较。为确定靶标的绝对量,标准曲线从标准样品的Ct 值中建立并用于确定靶标的初始浓度。可选择地,靶标的Ct 值与单独的对比用兴趣核酸相比(相对定量)。在这种情况下靶标和对比用样品Ct 值的比值被确定并用于估定靶标和对比用核酸的初始量的比值。不幸地是,由于一些问题这些方法的实际应用是复杂的,这些问题中的一些将在下文中讨论。
定量PCR领域中的一些挑战涉及增长的在短时间间隔中分析大量样品的需求。由于定量PCR不断增长的应用范围需要以高通量的方式分析非常大量的样品,例如在临床实践中,开发可以完全自动化及需要非常少或无人员交互的定量PCR方法是必要的。这在一些情况中具有至关重要的价值,由于如果需要人员交互,简单地高通量应用(例如在临床实践中)无法在必需的短时间内进行。
用这种自动化方法实现的附加的好处是不同实验室之间分析数据的改进的可比较性,所述实验室普遍使用很不同的定量PCR实验室操作规程。鉴于增长的使用定量PCR技术于基础研究的实验室的数量,此问题具有极为重要的价值。建立自动化方法作为定量实验的客观参考将彻底地有助于这些研究成果。
扩增反应过程中形成的PCR产物的典型图显示了4个不同的扩增程序的阶段(参见图1):(1)荧光信号受背景荧光和噪声控制的本底阶段;(2)来自PCR产物的信号上升超过本底水平并指数增长的指数阶段;(3)由于如PCR试剂的消耗和检测探针的降解的因素引起扩增效率降低,信号增长少于指数速度的对数线性阶段;(4)由于上升减慢及扩增反应最终停止,信号边缘上升的平台阶段。
尽管表面上简单易懂的概念,为确定Ct 值选择适当的信号阈值水平不是一个简单的任务。如可从图1的图中看到的,选择高阈值水平可导致Ct 值在扩增反应的对数线性或平台阶段。这是不合需要的,由于在此区域中反应已经从指数增长减慢下来,使初始和现有核酸量之间的关系不明显。选择低阈值水平,另一方面,可导致Ct 值定位在扩增反应的本底阶段,其中噪声和背景信号可使测量复杂化。明显地,因此,精选导致Ct 值阈值水平对应到指数增长的循环数,即在指数阶段,是令人满意的。
许多方法已被开发以达到此目的(参见例如JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。基本阈值法需要实验人员观察扩增曲线并运用其自己的判断选择适当的在指数阶段相交的信号阈值。由于信号的绝对水平依赖于许多因素,包括核酸的长度和用于检测的方法,这种方法的阈值水平必须被检查,并如果必要,对每一种应用校对。类似地,在拟合点法中,实验人员必须根据其自己的判断选择适当的阈值。但是替代赋值Ct 到记录的信号相交于阈值的循环数,线性拟合是以曲线的指数部分的半对数图为模型,并且这条直线通过阈值的循环数被设定为Ct 。另一个概念称为最大二阶导数法,其中扩增曲线的二阶导数的最大值被数值地确定。相应的循环数被假设存在于指数增长阶段的末尾,在此处反应开始减慢下来到线性增长。这个循环数,类似于Ct ,用于确定靶标的量。相对于基本阈值和拟合点法,此方法需要很少或无人员交互,因为阈值水平不必须由实验人员设定。还另一种方法称为S形曲线拟合法,其中S形公式以扩增曲线为模型。对应于曲线拐点的循环数可以从模型中获得并类似于Ct被用于确定靶标的量。这种方法也需要很少或无人员交互。最大二阶导数法和S形曲线拟合法,原则上显示适合于完全地自动化。基本阈值法和拟合点法由其特性无论如何需要人员交互,并因此不适合于自动化。最大二阶导数法和S形曲线拟合法,尽管已被发现对需要高灵敏度的应用使用受限(JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。
因此,本发明的目的是提供适合于完全自动化的高灵敏度的核酸定量的方法。
发明目的和概述
根据本发明,此目的通过用于相对定量样品中至少一种靶核酸的方法来达到,所述方法包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增和同时获得与至少一种靶核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(b) 对比用核酸的至少一种样品中的每一种的扩增和同时获得与至少一种对比用核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(c) 获得的信号对背景信号做修正,
(d) 靶和对比用核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(e) 靶和对比用核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度(a measure of randomness)M的计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于靶和对比用核酸是最小的,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(h) 通过比较靶和对比用样品的CC,与对比用核酸相比,确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的相对量。
可选地,根据本发明,此目的通过用于绝对定量样品中至少一种靶核酸的方法来达到,所述方法包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增和同时获得与至少一种靶核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(b) 已知浓度的核酸标准品稀释系列的样品的扩增和同时获得与标准样品中的核酸的扩增相关的信号,
(c) 获得的信号对背景信号做修正,
(d) 靶和标准样品的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(e) 靶和标准样品的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于靶和标准样品是最小的,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(h) 通过比较靶和标准样品的CC确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的初始量。
可选地,根据本发明,此目的通过用于确定样品中至少一种靶核酸的Ct值的方法来达到,所述方法包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增,
(b) 同时获得关联于至少一种靶核酸中的每一种的扩增的信号,
(c) 获得的信号对背景信号做修正,
(d) 每一种靶核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(e) 每一种靶核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于每一种靶核酸是最小的,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(h) 从CC值中计算Ct值。
用本领域已知的方法,获得的Ct值可被用于定量核酸。
可选地,根据本发明,此目的通过用于相对定量样品中至少一种靶核酸的方法来达到,所述方法包括以下步骤:
(a) 获得的用于至少一种靶核酸和至少一种对比用核酸的扩增曲线的信号对背景信号做修正,
(b) 靶和对比用核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(c) 靶和对比用核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(d) 循环数CM的确定,其中M对于靶和对比用核酸是最小的,
(e) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(f) 通过比较靶和对比用样品的CC,与对比用核酸相比,确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的相对量。
可选地,根据本发明,此目的通过用于绝对定量样品中至少一种靶核酸的方法来达到,所述方法包括以下步骤:
(a) 获得的用于至少一种靶核酸和已知浓度的核酸标准品稀释系列的样品的扩增曲线的信号对背景信号做修正,
(b) 靶和标准样品的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(c) 靶和标准样品的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(d) 循环数CM的确定,其中M对于靶和标准样品是最小的,
(e) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(f) 通过比较靶和标准样品的CC确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的初始量。
可选地,根据本发明,此目的通过用于确定样品中至少一种靶核酸的Ct值的方法来达到,所述方法包括以下步骤:
(a) 获得的用于至少一种靶核酸的扩增曲线的信号对背景信号做修正,
(b) 每一种靶核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(c) 每一种靶核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(d) 循环数CM的确定,其中M对于每一种靶核酸是最小的,
(e) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(f) 从CC值中计算Ct值。
用本领域已知的方法,获得的Ct值可被用于核酸的定量。
此外,本发明涉及如上描述的方法,所述方法以完全自动化,即无人员交互的方式进行。
另外,本发明涉及其上已储存用于进行上述方法的步骤(c)到(h)的指令的机器可读介质。
此外,本发明涉及用于分析核酸样品的仪器,其包含含有用于进行上述方法的信息的机器可读记忆装置。
附图说明
图1显示在扩增反应过程中形成的PCR产物的典型图,揭示了扩增过程中的不同阶段:GP=本底阶段,EP=指数阶段,LP=对数线性阶段,PP=平台阶段。C表示循环数及IC表示记录的信号强度。
图2显示数值计算的3个在25µl体积中以106拷贝DNA初始量开始的PCR扩增的Ê(C)曲线。
图3A显示由实施例1中获得的背景修正的扩增曲线。
图3B显示在实施例1中获得的谱熵曲线。该图显示:对于106、105、104、103、102拷贝数/25µl浓度的样品,谱熵(M)分别在20、23、26、31、34个循环数(C)展示特征性最小值。
发明详述
扩增效率的随机性的量度具有不同的最小值,其可被用作扩增的特征性点。
在核酸定量的过程中,使用基本阈值法或拟合点法将Ct值赋值(assignment)到扩增曲线需人员介入。基于其自己的判断,实验人员必须选择在指数阶段末端之前到达的(在指数阶段末端扩增明显地减慢下来)并进一步在本底阶段之后到达的由本底信号和噪声控制的信号阈值水平。因此,就其特性而言,这些方法不适合于自动化。
相反,最大二阶导数法和S形曲线拟合法包括无人员介入地在曲线上指定特征性点。因此,原则上这些方法对自动化未显示不适合。但是最近最大二阶导数法和S形曲线拟合法被发现对于定量低拷贝数的靶标是不可靠的(JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。
出乎意料地,结果证明扩增效率的随机性的量度的图具有不同的最小值或不同的向最小值的转变。与这个最小值或向最小值的转变相关的循环数可无人员介入地被赋值为对于每一个扩增曲线的特征性点,并可被用于可靠地定量核酸包括低拷贝数靶标的定量。
使用扩增效率的随机性的量度的最小值或向最小值的转变作为特征性点的优势源自此点通常定位于指数阶段的早期部分的事实。因为扩增效率被多种因素影响,例如PCR产物的长度、GC含量和潜在的二级结构及可能存在于扩增混合物中的抑制剂,使用在指数阶段早期部分的特征性点是有利的,原因在于在那个阶段扩增效率的差异具有有限的影响。
另一个使用扩增效率的随机性的量度的最小值或向最小值的转变作为特征性点的优势源自对于许多应用,期望在单反应批中进行多于一种核酸的扩增的事实。多重类型分析(每批多于一种靶标)或使用内标可因此容易进行。这些一管式(one-pot)反应的主要优势是必须操作的反应批次更少以及批次中的每种核酸都置于相同的可包含PCR反应抑制剂的化学环境。对于这些一管式分析的必要的前提条件是不同标记物必须用于每一种核酸,以便分别地监控每一种的扩增。许多不同的在低浓度下可用于此目的的荧光染料是可得到的。但是,随着增加浓度,荧光团的相互作用可能导致荧光信号的扰乱,因此降低分析的精确性。为了最小化这样的荧光团相互作用,因此在标记的PCR产物浓度相对低的指数阶段早期部分使用特征性点是有利的。
因此,本发明的另一个目的是提供用于定量核酸的方法,其中用于定量的信号是在扩增的指数阶段的早期部分获得的信号。在本发明优选的实施方案中,扩增的指数阶段的早期部分被认为是以下的一项:指数阶段的前半段、指数阶段的前10个循环、指数阶段的前5个循环、指数阶段的前3个循环或指数阶段的第一个循环。
绝对和相对定量
本发明涉及用于相对定量核酸的方法,其包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增和同时获得与至少一种靶核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(b) 对比用核酸的至少一种样品中的每一种的扩增和同时获得与至少一种对比用核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(c) 获得的信号对背景信号做修正,
(d) 靶和对比用核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(e) 靶和对比用核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于靶和对比用核酸是最小的,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(h) 通过比较靶和对比用样品的CC,与对比用核酸相比,确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的相对量。
本发明进一步涉及用于绝对定量样品中的至少一种靶核酸的方法,其包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增和同时获得与至少一种靶核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(b) 已知浓度的核酸标准品稀释系列的样品的扩增和同时获得与标准样品中的核酸的扩增相关的信号,
(c) 获得的信号对背景信号做修正,
(d) 靶和标准样品的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(e) 靶和标准样品的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于靶和标准样品是最小的,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(h) 通过比较靶和标准样品的CC确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的初始量。
本发明进一步涉及用于确定样品中至少一种靶核酸的Ct值的方法,其包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增,
(b) 同时获得关联于至少一种靶核酸中的每一种的扩增的信号,
(c) 获得的信号对背景信号做修正,
(d) 每一种靶核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(e) 每一种靶核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于每一种靶核酸是最小的,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(h) 从CC值中计算Ct值。
用本领域已知的方法,获得的Ct值可被用于定量核酸。
本发明进一步涉及用于相对定量样品中至少一种靶核酸的方法,其包括以下步骤:
(a) 获得的用于至少一种靶核酸和至少一种对比用核酸的扩增曲线的信号对背景信号做修正,
(b) 靶和对比用核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(c) 靶和对比用核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(d) 循环数CM的确定,其中M对于靶和对比用核酸是最小的,
(e) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(f) 通过比较靶和对比用样品的CC,与对比用核酸相比,确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的相对量。
本发明进一步涉及用于绝对定量样品中至少一种靶核酸的方法,其包括以下步骤:
(a) 获得的用于至少一种靶核酸和已知浓度的核酸标准品稀释系列的样品的扩增曲线的信号对背景信号做修正,
(b) 靶和标准样品的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(c) 靶和标准样品的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(d) 循环数CM的确定,其中M对于靶和标准样品是最小的,
(e) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(f) 通过比较靶和标准样品的CC确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的初始量。
本发明进一步涉及用于确定样品中至少一种靶核酸的Ct值的方法,其包括以下步骤:
(a) 获得的用于至少一种靶核酸的扩增曲线的信号对背景信号做修正,
(b) 每一种靶核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,
(c) 每一种靶核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,
(d) 循环数CM的确定,其中M对于每一种靶核酸是最小的,
(e) 从CM值中计算特征性循环数CC,
(f) 从CC值中计算Ct值。
用本领域已知的方法,获得的Ct值可被用于核酸的定量。
根据本发明相对定量核酸涉及在分析前获得样品中相应核酸的量的比例的定量量度。
根据本发明绝对定量核酸涉及在分析前获得样品中核酸量的绝对量度,例如物质的拷贝数或量。
可用于本发明核酸包含DNA、RNA、及带有修饰的骨架和/或碱基结构的核酸。通常扩增通过本领域普通技术人员可获得的方法和设备的帮助由聚合酶链式反应(PCR)进行。但是,对于本发明的目的,不能直接由PCR扩增的核酸可能必须通过本领域普通技术人员已知的方法转录成DNA。例如RNA可能必须在扩增前用逆转录酶转录成DNA。为了允许重建相应核酸的初始量,这样的转录过程必须在能够合理地良好建立关于转录成DNA的核酸和在转录过程中产生的DNA的量的比例的假设情况下进行。此类反应条件是本领域众所周知的。
实施本发明的过程中扩增的每一种核酸通常以选择的方法扩增。PCR中一种完成选择性扩增的方法是使用特异性引物。设计和使用这样的引物是本领域普通技术人员众所周知的。
根据本发明,与核酸扩增相关的信号在扩增反应过程中被记录。在扩增反应的所有循环的过程中记录的信号的表示通常命名为扩增曲线。通常这样的信号是荧光发射,但是本领域中使用的其他信号也包含在本发明中。一些荧光染料具有充分分开的吸收和发射谱以允许相同样品中的平行检测。
为了本发明的目的,核酸扩增,即通过扩增反应产生核酸,通过记录相关于核酸扩增的信号来检测。这可通过例如当结合到靶标上时发射特异性信号的荧光标记的杂交探针的方法或允许检测双链产物的DNA嵌入式荧光染料的方法来达到。这样的荧光标记杂交探针和DNA嵌入式荧光染料是本领域众所周知的。在本发明优选的实施方案中,核酸扩增检测用以下至少一项的帮助:荧光标记杂交探针、FRET杂交探针、分子灯塔、蝎尾引物、Lux引物、Taqman探针、DNA结合染料。
本发明包含分析核酸的方法和手段。单一分析可涉及单一种类的靶核酸或多于一种的靶核酸。在对多于一种靶核酸进行分析的情况下,记录的以监控每一种靶核酸扩增的信号必须是不同的信号,即可在同时被分别记录的信号。达到这样的信号的方法和手段是本领域众所周知的。一些荧光染料(例如其展示充分分开的吸收和发射谱)允许同时平行记录它们的荧光信号。本发明因此包含样品中的几个靶标的同时多重分析。
根据本发明,对比用核酸可被用于确定靶核酸相对定量的参考值。一种或几种这样的对比用核酸可根据本发明被使用。分析前样品中对比用核酸的绝对数量不必须是已知的。例如细胞中看家基因的mRNA可被用作对比用核酸。为了通过PCR扩增,mRNA通常预先转录成DNA 。
根据本发明,已知浓度的核酸标准品的稀释系列可被用于确定靶核酸绝对定量的参考值。靶标和核酸标准品的稀释样品可在不同的反应批中分析或可同时在一个反应批中分析。如果同时在一个反应批中分析,稀释系列的不同核酸和不同样品必须用不同的信号(即可同时分别记录的信号)检测。
在实施本发明的过程中,背景项从记录的信号中减去。为了完成这样的背景修正,线性曲线以扩增曲线前几个循环为模型建立,即线性回归。优选地,扩增曲线的前10个循环被用于建立此线性曲线。可选地,统计学检验方法可被用于确定适于建立此线性曲线的扩增曲线的循环数,特别是当信号有噪音时。随后,此线性曲线从扩增曲线中减去。
根据本发明,使用如下等式计算循环到循环扩增效率Ê:
Ê(C) = [Ĩ(C+1)
/ Ĩ(C)] – 1
其中
-
Ê =循环到循环扩增效率
-
C =循环数
-
Ĩ =对背景信号修正的信号强度
在本发明的一些实施方案中,使用多于2个连续循环的Ĩ值化来计算扩增效率Ê,即应用平滑。在本发明优选的实施方案中,使用3、5或7个数据点应用平滑化。
图2显示数字化计算的三个以106拷贝/25µl 的DNA初始量开始的PCR扩增反应的Ê(C)曲线。
根据本发明,计算循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度(measure
of randomness) M。谱熵是这样的随机性量度的实例。谱熵可如下计算:
(1) 形成Ê(C)的数组,如
W(C)=[ Ê(C-L), Ê(C-L+1), … , Ê(C), …, Ê(C+L-1), Ê(C+L)]
其中2L+1是以循环数C为中心的数组中Ê的数量。优选地L取3或4的值,那么W(C)具有7或9个元素。为了不使Ê的指数小于1或超过最终可用的扩增曲线循环数Cmax,C必须在如下范围中
L < C <= (Cmax-L);
(2) 对W(C)使用离散傅里叶变换(DFT)以获得通常是复质的数组S(C)
S(C)= DFT{W(C)}=[ s(1), s(2), …,
s(2N-1), s(2N)]
其中2N是DFT大小,并可以是例如16或32;
(3)取S(C)的模数并形成具有其元素的部分的新数组
P(C)=[|s(2)|, |s(3)|, …, |s(N-1)|,
|s(N)|];
(4)归一化P(C)的元素的总和到一个以获得
Pn(C)=P(C)/sum{P(C)}
其中sum{ }是计算数组元素的总和的数组运算符;
(5)计算数组Pn(C)的谱熵(M),如
M(C)=sum{Pn(C)*log2{Pn(C)}}
其中乘法*和对数操作都是元素智能的;
(6)通过将其中心定位在循环C+1以升级数组W(C)并重复步骤(1)到(5)。
以上方法将Ê(C)的谱熵 (M)作为C的函数计算。谱熵越小,信号的随机性的程度越低。
M通过在扩增曲线本底阶段后和指数阶段中定位的区别的最小值特征性化。
本发明包括使用其它随机性量度的实施方案。例如其他的随机性量度是:(a)多项式曲线拟合的剩余误差;(b)零交点计数;(c)高通滤波后的能量(RMS)计算。所有这些方法在上述数组W(C)上操作。前者方法(a)基于多项式函数能够拟合确定性的函数直到某精确度而不是随机的精确度的概念。后面两个方法(b)和(c)利用噪声波动多于其平均值附近的确定的信号的观察以便产生更多零交点及能量。
根据本发明,循环数CM被确定,其中M具有其最小值。CM可根据本领域众所周知的普通运算法则数字地获得。在本发明的一些实施方案中,循环数CM被确定为M第一次到达其最小值的循环。
根据本发明,特征性循环数CC从CM
值中计算出。进行此计算为了修正用于计算随机性测量的任何窗口的宽度。如果例如M如上描述的以谱熵计算,CC通过从CM中减去L而获得:
CC = CM - L
其中L是数组W(C)的展式的一半。
依赖于用于计算随机性的量度的方法,从CM中获得CC的其它方法对本领域普通技术人员是显而易见的。本发明进一步包括这样的实施方案,其中CM值被用作CC 值,即其中CC
= CM。
CC值可用于计算Ct值(阈值循环数),Ct值进而可以本领域普通技术人员已知的方式用于核酸定量(参见例如JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。在本发明优选的实施方案中,Ct值通过取CC值作为Ct值,即Ct
= CC,从CC值中计算出。
根据本发明,确定靶核酸(T)相对于对比用核酸(#)的相对量(R)可通过如下计算完成:
R = 2(CC(T) -
CC(#))
其中:
-
R =靶和对比用核酸量的比例
-
CC(T) =靶核酸的CC值
-
CC(#) =对比用核酸的CC值
可选地,如果关于扩增效率E的信息可获得,比例R可计算为:
R = (1 + E)(CC(T) -
CC(#)) 。
根据本发明,通过比较靶和标准样品的CC值确定样品中每一种靶核酸的初始量可通过如下完成:
从标准样品中建立标准曲线(标准样品的初始浓度相对于标准样品的CC值)及使用此标准曲线从靶标的CC值中获得靶标的初始浓度。标准曲线可以是CC值对浓度值对数的线性函数。但是,可选的本领域已知的方法也包含在本发明中。
本发明包含允许以自动化的方式进行本发明的方法,即无或很少人员交互(human interaction)。在优选的实施方案中,本发明涉及允许无人员交互地进行本发明方法的方法和装置。本发明使本领域普通技术人员能够使用本领域可得的设备以无或很少人员交互地进行本发明的方法。在优选的实施方案中,本发明使本领域普通技术人员能够使用本领域可得的设备以无人员交互地进行本发明的方法。
机器可读介质
本发明涉及其上已储存用于进行本发明方法的步骤(c)到(h)的指令的机器可读介质。
分析核酸样品的仪器
本发明涉及分析核酸样品的仪器,其包含含有用于进行本发明方法的信息的机器可读记忆装置。
实施例
实施例
1
将在25µl体积中由稀释获得的106、105、104、103、102
拷贝/25µl浓度的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus )DNA样品(442 Sau3Al基因组片段的5’部分,256个碱基对,在pCR2.1-TOPO中,从金黄色葡萄球菌ATCC-25923中克隆)在分别的管中通过40个PCR循环在ABI 7099HT版本2.3实时PCR循环仪上扩增。对于PCR反应,使用ABI的Taqman Universal
PCR mastermix和Taqman探针FAM-Black
Hole Quencher 1。随后进行产物扩增。获得的信号通过从获得的PCR前10个循环的信号建立线性函数模型并从每一个样品获得的扩增曲线中减去此线性曲线来对背景信号进行修正。图3A显示获得的曲线。对每一个扩增曲线,使用如下等式计算循环到循环扩增效率Ê(C):
Ê(C) = [Ĩ(C+1)
/ Ĩ(C)]
- 1
其中:
-
Ê =循环到循环扩增效率
-
C =循环数
-
Ĩ =对背景信号修正的信号强度。
对于每一个扩增曲线,计算谱熵作为循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M。计算沿着Ê(C)曲线的9点的移动窗口,反映窗口内的数据点的随机性程度。结果显示在图3B中:谱熵M对每一个扩增反应的循环到循环扩增效率Ê(C)展示了不同的最小值。对于106、105、104、103和102
拷贝/25µl的浓度,得到的CM值分别是20、23、26、31和34。对于106、105、104、103和102
拷贝/25µl的浓度,CC值由CC = CM – 4计算,因此分别是16、19、22、27和30。针对分别的拷贝数的对数获得的CC 值的线性回归产生R2
= 0.9908的皮尔森系数,表明结果与预期的线性关系的很好的吻合性。
Claims (10)
1.用于相对定量样品中至少一种靶核酸的方法,其包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增和同时获得与至少一种靶核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(b) 对比用核酸的至少一种样品中的每一种的扩增和同时获得与至少一种对比用核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(c) 由于将背景项从记录的信号中减去,获得的信号对背景信号做修正,
(d) 靶和对比用核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,其中使用如下等式计算循环到循环扩增效率Ê:
Ê(C) = [Ĩ(C+1)
/ Ĩ(C)] – 1
其中
-
Ê =循环到循环扩增效率
-
C =循环数
-
Ĩ =对背景信号做修正的信号强度,
(e) 靶和对比用核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,其中计算的随机性的量度选自:谱熵、多项式曲线拟合的剩余误差、零交点计数、高通滤波后的能量(RMS)计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于靶和对比用核酸具有其最小值,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,以对在计算随机性的量度中使用的任何窗口的宽度做修正,
(h) 通过比较靶和对比用样品的CC,与对比用核酸相比,确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的相对量。
2.用于绝对定量样品中至少一种靶核酸的方法,其包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增和同时获得与至少一种靶核酸中的每一种的扩增相关的信号,
(b) 已知浓度的核酸标准品稀释系列的样品的扩增和同时获得与标准样品中的核酸的扩增相关的信号,
(c) 由于将背景项从记录的信号中减去,获得的信号对背景信号做修正,
(d) 靶和标准样品的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,其中使用如下等式计算循环到循环扩增效率Ê:
Ê(C) = [Ĩ(C+1)
/ Ĩ(C)] – 1
其中
-
Ê =循环到循环扩增效率
-
C =循环数
-
Ĩ =对背景信号做修正的信号强度,
(e) 靶和标准样品的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,其中计算的随机性的量度选自:谱熵、多项式曲线拟合的剩余误差、零交点计数、高通滤波后的能量(RMS)计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于靶和标准样品具有其最小值,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,以对在计算随机性的量度中使用的任何窗口的宽度做修正,
(h) 通过比较靶和标准样品的CC确定样品中至少一种靶核酸中的每一种的初始量。
3.确定样品中至少一种靶核酸的Ct值的方法,其包括以下步骤:
(a) 包含在样品中的至少一种靶核酸中的每一种的扩增,
(b) 同时获得关联于至少一种靶核酸中的每一种的扩增的信号,
(c) 由于将背景项从记录的信号中减去,获得的信号对背景信号做修正,
(d) 每一种靶核酸的每一个扩增循环的循环到循环扩增效率Ê(C)的计算,其中使用如下等式计算循环到循环扩增效率Ê:
Ê(C) = [Ĩ(C+1)
/ Ĩ(C)] – 1
其中
-
Ê =循环到循环扩增效率
-
C =循环数
-
Ĩ =对背景信号做修正的信号强度,
(e) 每一种靶核酸的循环到循环扩增效率Ê(C)的随机性的量度M的计算,其中计算的随机性的量度选自:谱熵、多项式曲线拟合的剩余误差、零交点计数、高通滤波后的能量(RMS)计算,
(f) 循环数CM的确定,其中M对于每一种靶核酸具有其最小值,
(g) 从CM值中计算特征性循环数CC,以对在计算随机性的量度中使用的任何窗口的宽度做修正,
(h) 从CC值中计算Ct值。
4.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中特征性循环数CC被定义为等于相应的CM值(CC = CM)。
5.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中所述步骤“循环数CM的确定,其中M对于每一个靶核酸具有其最小值”由以下步骤替代:
“初始循环数CM的确定,其中M对靶和对比用核酸达到最小值”。
6.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中获得的信号是荧光信号。
7.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中核酸扩增检测用以下至少一项的帮助:荧光标记杂交探针、FRET杂交探针、分子灯塔、蝎尾引物、Lux引物、TaqMan探针、DNA结合染料。
8.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中同时分析样品中多于一种靶核酸。
9.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中同时分析样品中的一种靶核酸。
10.根据权利要求1到3的任意一项的方法,其中所有步骤以完全自动化方式进行,即无人员交互。
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