KR101771402B1 - 핵산 정량 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계, M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계, 및 CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계를 포함하여, 증폭된 핵산을 정량하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 핵산 정량의 분야에 관한 것이다.
핵산의 정량은 분자 생물학 및 유전적 연구로부터 진단 및 병원체 검출에 이르는 다수의 분야에서 중요하다. 충분한 양의 핵산이 존재하는 경우, 블롯-기술(blot-technique)을 정량에 적용할 수 있다. 그러나, 이들 기술의 제한된 민감성은 다수의 경우에서 이들의 사용을 방지한다.
최근 과거에 개발된 정량적 PCR-방법은, 보다 높은 민감성이 요구되는 경우에 분석용 도구를 제공한다. 이들 기술은 PCR 증폭 동안 생성물의 양이 기하급수적으로 증가해서, 상당히 적은 수의 사이클 후 수득된 생성물의 양이 통상적인 수단(예를 들면, 형광 검출)에 의해 검출될 수 있다는 사실을 기초로 한다. 또한, 원칙적으로 초기에, 즉 증폭 개시 시기에 존재하였던 생성물의 양은, 증폭 사이클의 수가 알려져 있는 경우 증폭 말기에 수득된 생성물의 양으로부터 측정할 수 있다.
간단하게 요약하면, 실제로, 표적 핵산뿐만 아니라 표준 및/또는 비교 시료는 정의된 반응 조건하에서 PCR에 적용되며 PCR 생성물의 형성은 증폭 공정의 과정에 걸쳐 모니터링된다. PCR 생성물의 검출은 예를 들면, 표적에 결합되는 경우 특이적인 시그널을 방출하는 형광으로 표지된 하이브리드화 프로브(probe)를 사용하여 또는 이본쇄 생성물을 검출하도록 하는 DNA-삽입(intercalating) 형광 염료를 사용하여 달성된다. Ct-값으로 지정된, 특정한 형광 역치 수준을 수득하기 위해 필요한 증폭 사이클의 수를 측정하고, 표적의 Ct-값을 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물의 시료들의 Ct-값과 비교한다(절대적인 정량). 표적의 절대량을 측정하기 위하여, 표준 곡선을 표준 시료의 Ct-값으로부터 작성하고 표적의 초기 농도를 측정하는데 사용한다. 달리는, 표적의 Ct-값을 목적한 단일의 비교 핵산의 Ct-값과 비교한다(상대적인 정량). 이 경우, 표적 시료 및 비교 시료의 Ct-값의 비를 측정하여 표적 핵산 및 비교 핵산의 초기량의 비를 평가하는데 사용한다. 불행하게도, 이들 시도의 실제 적용은 다수의 문제로 복잡해지며, 이중 일부는 하기에 논의할 것이다.
정량적 PCR에서 일부 도전 과제는 짧은 시간 간격에서 다수의 시료를 분석하기 위한 필요성이 커지는 것과 관련되어 있다. 정량적 PCR을 위한 적용 범위의 지금까지의 증가는 예를 들면, 임상 실시에서 고 처리량 방식(high-throughput fashion)으로 매우 많은 수의 시료의 분석을 필요로 하기 때문에, 완전 자동화될 수 있고 사람 상호작용이 거의 또는 전혀 필요 없는 정량적 PCR 방법을 개발하는 것이 필요하다. 이는, 일부 경우에 고 처리량 적용(예를 들면, 임상 실시)이 사람 상호작용이 필요한 경우 요구된 짧은 기간내에 간단히 수행될 수 없기 때문에 매우 중요하다.
이러한 자동화 방법으로 실현될 수 있는 추가의 이점은 정량적 PCR을 위한 광범위하게 상이한 실험실 프로토콜을 현재 사용하는 다른 실험실들 사이에서 분석 데이터의 개선된 비교가능성일 수 있다. 이러한 쟁점은 기본 연구를 위한 정량적 PCR 기술을 사용하는 증가하는 수의 실험실 측면에서 무엇보다 중요하다. 정량 실험을 위한 대상 참조물로서 자동화 방법의 확립은 이러한 연구 노력에 극적으로 유리할 수 있다.
증폭 반응의 과정에 걸쳐 형성된 PCR 생성물의 대표적인 플롯은 증폭 공정의 4개의 상이한 상을 나타낸다(참조: 도 1): (1) 형광 시그널이 배경 형광 및 노이즈에 의해 지배되는 기저 상(ground phase); (2) PCR 생성물이 상기 기저 상 수준 이상으로 상승하여 기하급수적으로 증가하는 기하급수 상; (3) PCR 시약의 소모 및 검출 프로브의 분해와 같은 인자에 의해 효율적으로 유발된 증폭 효율의 감소로 인하여 기하급수적 속도 미만으로 시그널이 증가하는 로그-선형 상(log-linear phase); (4) 증폭 반응의 증가하는 둔화 및 궁극적으로 중지로 인해 시그널이 미미하게 상승하는 정체기 상(plateau phase).
외견상 간단한 개념에도 불구하고, Ct-값을 측정하기 위하여 적합한 시그널-역치 수준(signal-threshold level)을 선택하는 것은 간단한 업무가 아니다. 도 1의 플롯으로부터 알 수 있는 바와 같이, 높은 역치 수준을 선택하는 것은 증폭 반응의 로그-선형 또는 정체기-상에서 Ct-값을 초래할 수 있다. 이는, 반응이 핵산의 초기량과 현재량 사이의 상관관계를 모호하게 하는 당해 영역내 대수 성장으로부터 둔화되므로 바람직하지 않다. 한편, 낮은 역치 수준을 선택하는 것은, 노이즈 및 배경 시그널이 측정을 복잡하게 할 수 있는 증폭반응의 기저 상에 위치하는 Ct-값을 초래할 수 있다. 따라서, 명확하게, 기하급수 성장을 가진 사이클, 즉, 기하급수 상에 상응하는 Ct-값을 초래하는 역치 수준을 고르는 것이 바람직하다.
다수의 시도가 당해 목표를 달성하기 위해 개발되어 왔다[참조: 예를 들면, JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64]. 기본 역치 시도는 증폭 곡선에서 고찰하기 위한 실험자 및 대수 상에서 교차되는 적합한 시그널 역치를 고르기 위한 실험자 자신의 판단의 이용을 필요로 한다. 시그널의 절대적인 수준은 핵산의 길이 및 사용된 검출 수단을 포함하는 다수의 인자에 의존하므로, 당해 방법을 위한 역치 수준은 점검되어야 하며, 필요한 경우, 각각의 적용을 위해 조절되어야 한다. 유사하게, 피트-포인트 방법(fit-point method)에서, 실험자는 자신의 판단에 의해 적합한 역치 수준을 골라야 한다. 그러나, 기록된 시그널이 역치를 교차하는 경우 사이클 수(cycle number)에 대해 Ct-값을 할당하는 것 대신에, 선형 피트(linear fit)를 곡선의 기하급수적 부분의 반-대수적 플롯에 모델화하고 당해 직선이 통과하는 사이클을 Ct로서 지정한다. 다른 개념은 2차 도함수 최대 방법(2차 도함수 최대 방법)이라 불리우며, 여기서, 증폭 곡선의 2차 도함수의 최대는 수치적으로 측정된다. 상응하는 사이클은 기하급수 성장 상의 말기를 나타내는 것으로 추정되며, 여기서, 반응은 선형 성장으로 둔화되기 시작한다. 당해 사이클 수는 표적의 양을 측정하기 위해 Ct와 유사하게 사용된다. 기본 역치 및 피트-포인트 방법과는 대조적으로, 당해 방법은, 역치 수준이 실험자에 의해 설정될 필요가 없으므로 사람 상호작용이 최소이거나 불필요함을 요구한다. 또 다른 시도는 S자형 곡선-피팅 방법(sigmoidal curve - fitting method)으로 불리며, 여기서, S자형 함수는 증폭 곡선에 대해 모델화된다. 곡선의 변곡점에 상응하는 사이클 수는 모델로부터 수득할 수 있으며, 표적의 양을 측정하기 위해 Ct와 유사하게 사용된다. 당해 방법은 또한 사람 상호작용을 최소로 필요로 하거나 전혀 필요로 하지 않는다. 2차 도함수 최대 방법 및 S자형 곡선-피팅 방법은 원칙적으로 완전한 자동화에 적합한 것으로 여겨진다. 본래 기본 역치 방법 및 피트-포인트 방법은, 그러나 사람 상호작용을 필요로 하므로, 자동화에 적합하지 않다. 그러나, 2차 도함수 최대 방법 및 S자형 곡선-피팅 방법은 높은 민감성을 필요로 하는 적용에 대해 제한된 용도를 지니는 것이 밝혀졌다[참조: JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64].
따라서, 본 발명의 목적은 고 민감성으로 핵산의 완전 자동화된 정량에 적합한 방법을 제공하는 것이다.
당해 목적은 본 발명에 따라,
(a) 시료 중에 함유된 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키고 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭에 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(b) 적어도 하나의 비교 핵산의 시료 각각을 증폭시키고 상기 적어도 하나의 비교 핵산 각각의 증폭에 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 상기 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(d) 표적 핵산 및 비교 핵산의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율(cycle-to-cycle amplification efficiency) 
를 계산하는 단계,
(e) 표적 핵산 및 비교 핵산에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(f) M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) CM의 값으로부터 고유 사이클 수(characteristic cycle number) CC를 계산하는 단계,
(h) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 비교 핵산들과 관련한 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 상대량을 측정하는 단계
를 포함하여, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 상대적인 정량 방법으로 달성된다.
달리는, 당해 목적은 본 발명에 따라,
(a) 시료 중에 함유된 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키고 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭에 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(b) 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물의 시료들을 증폭시키고 표준 시료들 중의 핵산들의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 상기 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(d) 표적들 및 표준 시료들의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(e) 표적들 및 표준 시료들에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(f) M이 표적들 및 표준 시료들에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 초기량을 측정하는 단계
를 포함하여, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 절대적인 정량 방법으로 달성된다.
달리는, 당해 목적은 본 발명에 따라,
(a) 시료 중에 함유된 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키는 단계,
(b) 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭에 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 상기 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(d) 표적 핵산 각각의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(e) 표적 핵산 각각에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(f) M이 표적 핵산 각각에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 상기 CC-값으로부터 Ct-값을 계산하는 단계
를 포함하여, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 Ct-값을 측정하는 방법으로 달성된다.
수득된 Ct-값을 당해 분야에 공지된 방법으로 핵산의 정량을 위해 사용할 수 있다.
달리는, 당해 목적은 본 발명에 따라,
(a) 적어도 하나의 표적 핵산 및 적어도 하나의 비교 핵산의 증폭 곡선에 대해 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(b) 표적 핵산 및 비교 핵산의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(c) 표적 핵산 및 비교 핵산에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(d) M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(e) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(f) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 비교 핵산들과 관련한 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 상대량을 측정하는 단계
를 포함하여, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 상대적인 정량 방법으로 달성된다.
달리는, 당해 목적은 본 발명에 따라서,
(a) 적어도 하나의 표적 핵산 및 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물의 시료들의 증폭 곡선에 대해 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(b) 표적들 및 표준 시료들의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(c) 표적들 및 표준 시료들에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(d) M이 표적들 및 표준 시료들에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(e) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(f) 표적들 및 표준 시료들의 CC를 비교함으로써 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 초기량을 측정하는 단계
를 포함하여, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 절대적인 정량 방법으로 달성된다.
달리는, 당해 목적은 본 발명에 따라서,
(a) 적어도 하나의 표적 핵산의 증폭 곡선에 대해 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(b) 표적 핵산 각각의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(c) 표적 핵산 각각에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(d) M이 표적 핵산 각각에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(e) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(f) 상기 CC-값으로부터 Ct-값을 계산하는 단계
를 포함하여, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 Ct-값을 측정하는 방법으로 달성된다.
수득된 Ct-값은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 핵산을 정량하는데 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명은 완전히 자동화된 방식으로, 즉 사람 상호작용없이 수행되는, 위에서 기술된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 위에서 기술한 방법의 단계 (c) 내지 (h)를 수행하기 위한 명령이 저장된 기계 판독가능한 매체에 관한 것이다.
더구나, 본 발명은 위에서 기술된 방법을 수행하기 위한 정보를 함유하는 기계 판독가능한 메모리 장치를 포함하는 핵산 시료의 분석을 위한 장치에 관한 것이다.
도 1은 증폭 공정의 상이한 상을 나타내는 증폭 반응의 과정에 걸쳐 형성된 PCR 생성물의 대표적인 플롯을 나타낸다: GP = 기저 상, EP = 기하급수 상, LP = 로그-선형 상, PP = 정체기 상. C는 사이클의 수를 나타내고 IC는 기록된 시그널 강도를 나타낸다.
도 2는 25μl의 용적에서 106개 카피의 DNA의 초기량으로 출발하는 3회의 PCR 증폭의 수치적으로 계산된
-곡선을 나타낸다.
도 3a는 실시예 1에서 수득된 배경 보정된 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3b는 실시예 1에서 수득된 스펙트럴 엔트로피(spectral entropy)의 곡선을 나타낸다. 당해 도는, 스펙트럴 엔트로피(M)가 25μl당 106, 105, 104, 103, 102개 카피의 농도인 시료 각각에 대해 사이클 (C) 20, 23, 26, 31 및 34에서 특징적인 최소값을 나타냄을 보여준다.
도 2는 25μl의 용적에서 106개 카피의 DNA의 초기량으로 출발하는 3회의 PCR 증폭의 수치적으로 계산된
도 3a는 실시예 1에서 수득된 배경 보정된 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3b는 실시예 1에서 수득된 스펙트럴 엔트로피(spectral entropy)의 곡선을 나타낸다. 당해 도는, 스펙트럴 엔트로피(M)가 25μl당 106, 105, 104, 103, 102개 카피의 농도인 시료 각각에 대해 사이클 (C) 20, 23, 26, 31 및 34에서 특징적인 최소값을 나타냄을 보여준다.
증폭 효율의 무작위성 척도는 증폭의 특징적인 점으로서 사용될 수 있는 고유의 최소값을 갖는다.
기본 역치 방법 또는 피트-포인트 방법을 사용한 핵산 증폭의 과정에서 증폭 곡선에 대한 Ct-값의 지정은 사람 입력을 필요로 한다. 본 실험자의 판단을 기초로 하여, 실험자는, 증폭이 현저히 둔화되는 기하급수 상의 말기 전에 이르고, 또한 배경 시그널 및 노이즈에 의해 지배된 기저 상 후에 도달하는 시그널 역치 수준을 선택하여야 한다. 따라서, 본질적으로 이들 방법은 자동화에 부적합하다.
대조적으로, 2차 도함수 최대 방법 및 S자형 곡선-피팅 방법은 사람 입력이 없이 곡선에서 특징적인 점의 지정을 포함한다. 따라서, 원칙적으로 이들 방법은 자동화에 부적합한 것으로 나타나지 않는다. 그러나, 최근에, 2차 도함수 최대 방법 및 S자형 곡선-피팅 방법은 낮은 카피 수의 표적을 정량하기에는 신뢰할 수 없음이 밝혀졌다[참조: JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64].
기대하지않게도, 증폭 효율의 무작위성 척도의 플롯은 고유의 최소값 또는 최소값으로의 고유한 이전을 갖는다. 이러한 최소값 또는 최소값으로의 이전과 관련된 사이클 수는 사람 입력없이 각각의 증폭 곡선에 대해 특징적인 점으로서 지정될 수 있으며 낮은 카피 수 표적의 정량을 포함하는 핵산을 신뢰가능하게 정량하기 위해 사용될 수 있다.
특징적인 점으로서 증폭 효율의 무작위성 척도의 최소값 또는 최소값으로의 이전의 장점은, 당해 점이 기하급수적 상의 조기 부분에서 일반적으로 위치한다는 사실로부터 기원한다. 증폭 효율은 PCR 생성물의 길이, GC-함량 및 잠재적인 제2 구조, 및 증폭 혼합물에 존재할 수 있는 억제제와 같은 다양한 인자에 의해 영향받기 때문에, 증폭 효율에서 차이가 이러한 단계에서 제한된 영향을 가지므로 기하급수 상의 조기 부분에서 특징적인 점을 사용하는 것이 유리하다.
특징적인 점으로서 증폭 효율의 무작위성 척도의 최소치 또는 최소치로의 이전을 사용하는 다른 장점은, 다수의 적용의 경우 단일 반응 배치(batch)에서 핵산의 하나 이상의 종의 증폭을 수행하는 것이 바람직하다는 사실로부터 기원한다. 분석물(배치당 하나 이상의 표적)의 복합화(multiplexing) 유형 또는 내부 표준물의 사용은 이에 의해 촉진될 수 있다. 이들 원-포트(one-pot) 반응의 주요 장점은, 보다 적은 반응 배치가 취급되어야 하며, 배치내 모든 핵산이 PCR 반응의 억제제를 포함할 수 있는 동일한 화학적 환경에 적용된다는 것이다. 이들 원-포트 분석의 필수적인 전제조건은 각각의 종의 증폭을 별도로 모니터링하기 위하여 핵산의 각각의 종에 대해 상이한 표지를 사용하여야 한다는 것이다. 낮은 농도에서 당해 목적을 위해 사용할 수 있는 다수의 상이한 형광 염료가 이용가능하다. 그러나, 농도가 증가되면, 형광단의 상호작용은 형광 시그널의 방해를 초래하는 경향이 있으므로, 분석의 정밀도를 해친다. 따라서, 형광단의 이러한 상호작용을 최소화하기 위하여, 표지된 PCR 생성물의 농도가 상당히 낮은 경우 기하급수 상의 조기 부분에서 특징적인 점을 사용하는 것이 유리하다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은, 핵산의 정량 방법을 제공하는 것이며, 여기서, 정량을 위해 사용된 시그널은 증폭의 기하급수 상의 조기 부분에서 수득된 시그널이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 증폭의 기하급수 상의 조기 부분은 다음 중 하나인 것으로 고려된다: 기하급수상의 처음 1/2, 기하급수 상의 처음 10개 사이클, 기하급수 상의 처음 5개 사이클, 기하급수 상의 처음 3개 사이클 또는 기하급수 상의 처음 사이클.
절대적 및 상대적인 정량
본 발명은,
(a) 시료 중에 함유된 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키고 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(b) 비교 핵산의 적어도 하나의 시료 각각을 증폭시키고 상기 적어도 하나의 비교 핵산 각각의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 상기 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(d) 표적 핵산 및 비교 핵산의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(e) 표적 핵산 및 비교 핵산에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(f) M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 비교 핵산들과 관련한 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 상대량을 측정하는 단계
를 포함하는, 핵산의 상대적인 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(a) 시료 중에 함유된 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키고 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭에 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(b) 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물의 시료들을 증폭시키고 표준 시료들 중의 핵산들의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 상기 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(d) 표적들 및 표준 시료들의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(e) 표적들 및 표준 시료들에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(f) M이 표적들 및 표준 시료들에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 초기량을 측정하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 절대적인 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
(a) 시료 중에 함유된 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키는 단계,
(b) 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭에 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 상기 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(d) 표적 핵산 각각의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(e) 표적 핵산 각각에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(f) M이 표적 핵산 각각에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 상기 CC-값으로부터 Ct-값을 계산하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 Ct-값을 측정하는 방법에 관한 것이다.
수득된 Ct-값은 당해 분야에 공지된 방법으로 핵산의 증폭을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 적어도 하나의 표적 핵산 및 적어도 하나의 비교 핵산의 증폭 곡선에 대해 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(b) 표적 핵산 및 비교 핵산의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(c) 표적 핵산 및 비교 핵산에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(d) M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(e) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(f) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 비교 핵산들과 관련한 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 상대량을 측정하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 상대적인 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
(a) 적어도 하나의 표적 핵산 및 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물의 시료들의 증폭 곡선에 대해 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(b) 표적들 및 표준 시료들의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(c) 표적들 및 표준 시료들에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(d) M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(e) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(f) 표적들 및 표준 시료들의 CC를 비교함으로써 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 초기량을 측정하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 절대적인 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
(a) 적어도 하나의 표적 핵산의 증폭 곡선에 대해 수득된 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계,
(b) 표적 핵산 각각의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
를 계산하는 단계,
(c) 표적 핵산 각각에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계,
(d) M이 표적 핵산 각각에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(e) CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(f) 상기 CC-값으로부터 Ct-값을 계산하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 Ct-값을 측정하는 방법에 관한 것이다.
수득된 Ct-값은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 핵산을 정량하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 상대적인 정량은 분석 전에 시료 중의 상응하는 핵산의 양의 비율의 정량적인 척도를 수득하는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 핵산의 절대적인 정량은 분석 전에 시료 중의 핵산의 양의 절대적인 척도, 예를 들면, 카피 수 또는 물질의 양을 수득하는 것을 나타낸다.
본 발명에 적용가능한 핵산은 DNA, RNA 뿐만 아니라 변형된 골격 및/또는 염기 구조를 갖는 핵산도 포함한다. 일반적으로 증폭은 당해 분야의 숙련가가 이용할 수 있는 기기장치를 이용하여 및 방법에 의해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 수행한다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해, PCR에 의해 증폭가능하지 않은 핵산은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 수단으로 DNA로 전사되어야 할 수도 있다. 예를 들어, RNA는 역전사 효소를 사용하여 증폭 전에 DNA로 전사되어야 할 수도 있다. 상응하는 핵산의 원래의 양의 재구성을 허용하기 위하여, 이러한 전사 공정은 DNA로 전사된 핵산의 양 및 전사 과정시 생산된 DNA의 양의 비율에 관한 추측이 충분히 잘 확립되도록 할 수 있는 조건하에서 수행되어야 한다. 이러한 유형의 반응 조건은 당업계에 익히 공지되어 있다.
본 발명을 실시하는 과정에서 증폭되는 각각의 핵산은 일반적으로 선택적 방식으로 증폭된다. PCR 동안 선택적인 증폭을 달성하는 한가지 방법은 특이적인 프라이머를 사용하는 것이다. 이러한 프라이머의 설계 및 사용은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
본 발명에 따라서, 핵산의 증폭과 상호관련된 시그널이 증폭 반응 과정에 걸쳐 기록된다. 증폭 반응의 모든 사이클의 과정에 걸쳐 기록된 시그널의 표시는 일반적으로 증폭 곡선으로 나타낸다. 일반적으로 이러한 시그널은 형광 방사이지만, 당해 분야에서 사용된 다른 시그널도 본 발명에서 또한 포함된다. 형광 방사는 형광 염료에 의해 방출될 수 있으며, 이들 중 일부는 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 형광 염료는 동일한 시료에서 동시 검출을 허용하기 위해 충분히 분리되는 흡수 및 방사 스펙트럼을 갖는다.
본 발명의 목적을 위하여, 핵산 증폭, 즉, 증폭 반응에 의한 핵산의 생산은 핵산의 증폭과 상호관련된 시그널을 기록함으로써 검출한다. 이는 예를 들면, 표적에 결합하는 경우 특이적인 시그널을 방사하는 형광 표지된 하이브리드화 프로브를 사용하여 또는 이본쇄 생성물을 검출하도록 하는 DNA-삽입(intercalating) 형광 염료를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 형광 표지된 하이브리드화 프로브 및 DNA-삽입 형광 염료는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 핵산 증폭은 다음 중 적어도 하나를 이용하여 검출된다: 형광 표지된 하이브리드화 프로브, FRET 하이브리드화 프로브, 분자 비컨(molecular beacon), 스콜피온 프라이머(scorpion primer), 럭스-프라이머(Lux-primer), 태크만 프로브(TaqMan probe), DNA-결합 염료.
본 발명은 핵산을 분석하기 위한 방법 및 수단을 포함한다. 단일 분석은 표적 핵산의 하나 이상의 종 또는 표적 핵산의 단일 종에서 지시될 수 있다. 하나 이상의 표적 핵산을 분석에 적용하는 경우에, 각각의 표적 핵산의 증폭을 모니터링하기 위해 기록된 시그널들은 구별가능한 시그널들, 즉 동시에 별도로 기록될 수 있는 시그널들이어야 한다. 이러한 시그널을 달성하기 위한 방법 및 수단은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 충분히 분리된 흡수 및 방사 스펙트럼을 나타내는 일부 형광 염료는 동시에 이들의 형광 시그널들의 동시 기록을 허용한다. 따라서, 본 발명은 동시에 시료 중의 몇개 표적의 복합 분석을 포함한다.
본 발명에 따라서, 비교 핵산을 사용하여 표적 핵산의 상대적인 정량을 위한 참조 값을 측정할 수 있다. 하나 또는 수개의 이러한 비교 핵산을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 분석 전에 시료 중의 비교 핵산의 절대량은 알려져 있을 필요는 없다. 예를 들면, 세포내 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 mRNA를 비교 핵산으로서 사용할 수 있다. PCR로 증폭시키기 위하여, mRNA는 일반적으로 미리 DNA로 전사시킨다.
본 발명에 따라서, 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물를 사용하여 표적 핵산의 절대적인 정량에 대한 참조 값을 측정할 수 있다. 표적 및 핵산 표준물의 희석된 시료는 상이한 반응 배치내에서 분석하거나 하나의 반응 배치에서 동시에 분석할 수 있다. 하나의 반응 배치 속에서 분석하는 경우 동시에 상이한 핵산 및 일련의 희석물의 상이한 시료를 구별가능한 시그널들, 즉, 동시에 별도로 기록될 수 있는 시그널들을 사용하여 검출하여야만 한다.
본 발명을 실시하는 과정에서 배경 항은 기록된 시그널로부터 감해진다. 이러한 배경 보정을 달성하기 위하여, 선형 곡선을 증폭 곡선의 처음 몇몇 사이클에서, 예를 들면, 선형 회귀(linear regression)에 의해 모델화한다. 바람직하게는, 증폭 곡선의 처음 10회 사이클을 사용하여 당해 선형 곡선을 작성한다. 달리는, 통계적인 시험 방법을 사용하여, 특히 시그널이 노이즈성(noisy)인 경우, 당해 선형 곡선을 작성하는데 적합한 증폭 곡선의 사이클을 결정할 수 있다. 후속적으로, 당해 선형 곡선은 증폭 곡선으로부터 감해진다.
본 발명에 따라서, 사이클-대-사이클 증폭 효율 
는 다음 수학식을 사용하여 계산한다:
상기 수학식에서,
C는 사이클 수이며,
본 발명의 일부 양태에서, 증폭 효율 
는 2개 이상의 연속적인 사이클에서 
-값을 사용하여 계산되는데, 즉, 스무딩(smoothing)이 적용된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 스무딩은 3, 5 또는 7개 데이터-점을 사용하여 적용된다.
도 2는 25μl당 106개 카피의 DNA의 초기량으로 출발하는 3회의 PCR 증폭의 수치적으로 계산된 
-곡선을 나타낸다.
본 발명에 따라서, 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M이 계산된다. 스펙트럴 엔트로피는 이러한 무작위성 척도의 예이다. 스펙트럴 엔트로피는 다음과 같이 계산할 수 있다:
(1) 
과 같은 
의 배열(array)을 형성한다:
여기서,
2L+1은 중심이 사이클 C에 있는 당해 배열내 
의 수이다. 바람직하게는, L은 3 또는 4의 값을 취하므로, W(C)는 7 또는 9개 성분을 갖는다. 1보다 작거나 증폭 곡선의 마지막의 이용가능한 사이클 수 Cmax를 초과하는 
의 지표를 가지지 않기 위하여, C는 다음의 범위내에 있어야 한다:
L < C <= (Cmax-L);
(2) W(C)에서 이산 푸리에 변환(discrete Fourier transform)(DFT)을 적용하여 일반적으로 복소값인 배열 S(C)를 얻는다:
S(C)= DFT{W(C)}=[ s(1), s(2), ..., s(2N-l), s(2N)]
[여기서, 2N은 DFT 크기이고, 예를 들면, 16 또는 32일 수 있다];
(3) S(C)의 모듈러스(modulus)를 취하고 이의 성분의 일부로 새로운 배열을 형성한다:
P(C)=[|s(2)|, |s(3)|,..., |s(N-l)|, |s(N)|];
(4) P(C)의 성분의 총계가 1이 되도록 정규화하여
Pn(C)=P(C)/sum{P(C)}
를 얻는다[여기서, sum{ }는 배열의 성분들의 합을 계산하는 배열 연산자이다];
(5) M(C)=sum{Pn(C)*log2{Pn(C)}}[여기서, 곱셈 * 및 대수 연산은 둘다 성분별로 수행한다]로서 배열 Pn(C)의 스펙트럴 엔트로피(M)을 계산한다;
(6) 배열 W(C)를 사이클 C+1에서 중심으로 하여 업데이트하고 단계 (1) 내지 (5)를 반복한다.
상기 방법은 C의 함수로서 
의 스펙트럴 엔트로피(M)를 계산한다. 스펙트럴 엔트로피가 낮아질수록, 시그널의 무작위성의 정도가 더 낮아진다.
M은 증폭 곡선의 기저 상 후에 및 기하급수 상내에 위치하는 고유의 최소값으로 특징화된다.
본 발명은, 다른 무작위성 척도가 사용되는 양태를 포함한다. 다른 무작위성 척도에 대한 예는 (a) 다항식 곡선 피팅의 잔차 오차(residual error of polynomial curve fitting); (b) 제로-교차 계수(zero-crossing counting); (c) 고역 통과 필터링 후 에너지(RMS) 계산(energy (RMS) calculation after high-pass filtering)이다. 이들 방법들 모두는 앞서의 배열 W(C)에서 연산한다. 전자의 방법 (a)는, 다항 함수가 특정의 정확도까지 확정 함수(deterministic function)를 피팅할 수 있지만 확률적인 것이 아니라는 인식에 기초한다. 후자의 2개 방법[(b) 및 (c)]은, 노이즈가 이의 평균 값 주변의 확정 시그널보다 더 변동하여 더 많은 제로-교차 뿐만 아니라 에너지도 생성되도록 한다는 관측을 사용한다.
본 발명에 따라서, 사이클 수 CM은, M이 이의 최소값을 갖는 경우 결정된다. CM은 당해 분야에 익히 공지된 일반적인 알고리즘에 따라 수치적으로 수득될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 사이클 수 CM은, M이 처음으로 이의 최소값에 이르는 경우의 사이클로서 결정된다.
본 발명에 따라서, 고유 사이클 수 CC는 CM의 값으로부터 계산된다. 당해 계산은 무작위성 척도를 계산하는데 사용된 임의의 윈도우(window)의 너비에 대해서도 보정하기 위해 수행된다. 예를 들어, M이 위에서 기술한 바와 같이 스펙트럴 엔트로피로서 계산되는 경우, CC는 L을 감함으로써 CM으로부터 수득된다:
CC = CM - L
여기서, L은 배열 W(C)의 전개의 1/2이다.
무작위성 척도를 계산하는데 사용된 방법에 따라서, CM으로부터 CC를 수득하기 위한 다른 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 본 발명은 또한, CM의 값이 CC의 값으로서 사용되는 경우(즉, 여기서, CC = CM이다)의 양태를 포함한다.
CC-값은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방식으로 핵산 정량을 위해 이어서 사용될 수 있는 Ct-값(역치 사이클 수)을 계산하는데 사용될 수 있다[참조: 예를 들면, JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64]. 본 발명의 바람직한 양태에서, Ct-값은 Ct-값으로서 CC-값을 취함으로써(즉, Ct = CC) CC-값으로부터 계산한다.
본 발명에 따라서, 비교 핵산(#)과 관련하여 표적 핵산(T)의 상대량(R)을 측정하는 것은 R = 2( CC (T)- CC (#))를 계산함으로써 달성할 수 있으며, 여기서, R은 표적 핵산 및 비교 핵산의 양의 비이고, CC(T)는 표적 핵산에 대한 CC-값이며, CC(#)는 비교 핵산에 대한 CC 값이다.
달리는, 증폭 효율 E에 관한 정보가 이용가능한 경우, R 비는 다음과 같이 계산할 수 있다:
R = (I + E)(CC(T) - CC(#))
본 발명에 따라서, 표적들 및 표준 시료들의 CC를 비교함으로써 시료 중의 표적 핵산 각각의 초기량을 측정하는 것은 표준 시료로부터의 표준 곡선(표준 시료의 초기 농도 대 표준 시료의 CC-값)을 작성하고 표적의 CC-값으로부터 표적의 초기 농도를 유도하기 위해 당해 표준 곡선을 사용함으로써 달성할 수 있다. 표준 곡선은 CC-값 대 농도-값의 대수의 선형 함수일 수 있다. 그러나, 당해 분야에 공지된 대안적 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 방법을 자동화 방식으로, 즉, 사람 상호작용이 없거나 최소로 수행하도록 하는 방법 및 수단을 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 사람 상호작용 없이 본 발명의 방법을 수행하도록 하는 방법 및 수단에 관한 것이다. 본 발명은, 당해 분야의 숙련가가 당해 분야에서 이용가능한 기기 장치를 사용하여 사람 상호작용 없이 또는 최소의 사람 상호작용으로 본 발명의 방법을 수행하도록 할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명은, 당해 분야의 숙련가가 당해 분야에서 이용가능한 기기 장치를 사용하여 사람 상호작용 없이 본 발명의 방법을 수행할 수 있도록 한다.
기계 판독가능한 매체
본 발명은 본 발명의 방법의 단계 (c) 내지 (h)를 수행하기 위한 명령이 저장된 기계 판독가능한 매체에 관한 것이다.
핵산 시료의 분석을 위한 장치
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 정보를 포함하는 기계 판독가능한 메모리 수단을 포함하는 핵산 시료 분석용 장치에 관한 것이다.
실시예
실시예 1
용적이 25μl이고 희석에 의해 수득된 25μl당 106, 105, 104, 103, 102개 카피의 농도를 지닌 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 DNA 시료(에스. 아우레우스 ATCC-25923으로부터 클로닝된, pCR2.1-TOPO내 256개 염기쌍의 442 Sau3Al 게놈 단편의 5' 부분)를 별도의 바이알 속에서 ABI 7099HT 버전 2.3 실시간 PCR 사이클러에서 40 사이클의 PCR로 증폭시켰다. PCR 반응을 위해, ABI의 태크만 유니버셜 PCR 마스터믹스(Taqman Universal PCR mastermix) 및 태크만 프로브 FAM-Black Hole Quencher 1을 사용하였다. 생성물 증폭이 이어졌다. 수득된 시그널은 PCR의 처음 10회 사이클에 대해 수득된 시그널에 대해 선형 함수를 모델링하고 당해 선형 곡선을 각각의 시료에 대해 수득된 증폭 곡선으로부터 감함으로써 배경 시그널에 대해 보정하였다. 도 3a는 수득된 곡선을 나타낸다. 사이클-대-사이클 증폭 효율 
는 하기 식을 사용하여 각각의 증폭 곡선에 대해 계산하였다:
여기서,
C는 사이클 수이며,
스펙트럴 엔트로피는 각각의 증폭 곡선에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율 
의 무작위성 척도 M으로서 계산하였다. 
곡선을 따라 9개 점의 이동 윈도우를 계산하여, 윈도우내 데이터 점의 무작위성 정도를 반영하였다. 당해 결과를 도 3b에 나타낸다: 스펙트럴 엔트로피 M은 각각의 증폭 반응의 사이클-대-사이클 증폭 효율 
에 대한 고유의 최소값을 나타낸다. CM에 대해 유도된 값은 106, 105, 104, 103 및 102개 카피/25μl의 농도에 대해 각각 20, 23, 26, 31 및 34이다. 따라서, CC = CM - 4를 사용하여 계산된, CC에 대한 값은 106, 105, 104, 103 및 102개 카피/25μl의 농도 각각에 대해 16, 19, 22, 27 및 30이다. 각각의 카피 수의 대수에 대해 수득된 CC-값의 선형 회귀는 R2 = 0.9908의 피어슨 계수(Pearson's coefficient)를 산출하여, 예측한 대로 선형 관계를 갖는 결과의 우수한 피팅을 나타낸다.
Claims (16)
- 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 상대적인 정량 방법으로서,
(a) 상기 시료 중에 함유된 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키고 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(b) 적어도 하나의 비교 핵산의 시료 각각을 증폭시키고 상기 적어도 하나의 비교 핵산 각각의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 수득된 상기 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계로서, 기록된 상기 시그널들로부터 배경 항을 감산하는 단계,
(d) 표적 핵산 및 비교 핵산의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율(cycle-to-cycle amplification efficiency)를 계산하는 단계로서, 여기서 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율
는
을 사용하여 계산하고, 여기서
는 사이클-대-사이클 증폭 효율이고,
C는 사이클 수이며,
는 배경 시그널에 대해 보정된 시그널 강도인 단계,
(e) 표적 핵산 및 비교 핵산에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계로서, 여기서, 계산되는 상기 무작위성 척도는 스펙트럴 엔트로피(spectral entropy), 다항식 곡선 피팅의 잔차 오차(residual error of polynomial curve fitting), 제로-교차 계수(zero-crossing counting), 고역 통과 필터링 후 에너지(RMS) 계산(energy (RMS) calculation after high-pass filtering)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단계,
(f) M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소값을 갖는 사이클 수(cycle number) CM을 확인하는 단계,
(g) 상기 무작위성 척도를 계산하는데 사용된 임의의 윈도우(window)의 너비에 대해 보정하기 위해, CM의 값으로부터 고유 사이클 수(characteristic cycle number) CC를 계산하는 단계,
(h) 표적 시료 및 비교 시료의 CC를 비교함으로써 상기 비교 핵산들과 관련한 상기 시료 중의 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 상대량을 측정하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 상대적인 정량 방법. - 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 절대적인 정량 방법으로서,
(a) 상기 시료 중에 함유된 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키고 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(b) 공지된 농도의 핵산 표준물의 일련의 희석물의 시료들을 증폭시키고 상기 표준 시료들 중의 핵산들의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 수득된 상기 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계로서, 기록된 상기 시그널들로부터 배경 항을 감산하는 단계,
(d) 표적들 및 표준 시료들의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율를 계산하는 단계로서, 여기서 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율
는
을 사용하여 계산하고, 여기서
는 사이클-대-사이클 증폭 효율이고,
C는 사이클 수이며,
는 배경 시그널에 대해 보정된 시그널 강도인 단계,
(e) 표적들 및 표준 시료들에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계로서, 여기서, 계산되는 상기 무작위성 척도는 스펙트럴 엔트로피, 다항식 곡선 피팅의 잔차 오차, 제로-교차 계수, 고역 통과 필터링 후 에너지(RMS) 계산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단계,
(f) M이 표적들 및 표준 시료들에 대해 최소값을 갖는 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) 상기 무작위성 척도를 계산하는데 사용된 임의의 윈도우의 너비에 대해 보정하기 위해, CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 표적들 및 표준 시료들의 CC를 비교함으로써 상기 시료 중의 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 초기량을 측정하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 절대적인 정량 방법. - 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 Ct-값을 측정하는 방법으로서,
(a) 상기 시료 중에 함유된 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각을 증폭시키는 단계,
(b) 상기 적어도 하나의 표적 핵산 각각의 증폭과 상호관련된 시그널들을 동시에 수득하는 단계,
(c) 수득된 상기 시그널들을 배경 시그널들에 대해 보정하는 단계로서, 기록된 상기 시그널들로부터 배경 항을 감산하는 단계,
(d) 상기 표적 핵산 각각의 각 증폭 사이클에 대해 사이클-대-사이클 증폭 효율를 계산하는 단계로서, 여기서 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율
는
을 사용하여 계산하고, 여기서
는 사이클-대-사이클 증폭 효율이고,
C는 사이클 수이며,
는 배경 시그널에 대해 보정된 시그널 강도인 단계,
(e) 상기 표적 핵산 각각에 대한 상기 사이클-대-사이클 증폭 효율의 무작위성 척도 M을 계산하는 단계로서, 여기서, 계산되는 상기 무작위성 척도는 스펙트럴 엔트로피, 다항식 곡선 피팅의 잔차 오차, 제로-교차 계수, 고역 통과 필터링 후 에너지(RMS) 계산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단계,
(f) M이 상기 표적 핵산 각각에 대해 최소값을 갖는 사이클 수 CM을 확인하는 단계,
(g) 상기 무작위성 척도를 계산하는데 사용된 임의의 윈도우의 너비에 대해 보정하기 위해, CM의 값으로부터 고유 사이클 수 CC를 계산하는 단계,
(h) 상기 CC-값으로부터 Ct-값을 계산하는 단계
를 포함하는, 시료 중의 적어도 하나의 표적 핵산의 Ct-값을 측정하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(g)의 고유 사이클 수 CC가, 단계(f)의 상기 CM-값과 동일한 것(CC = CM)으로 정의되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, "M이 상기 표적 핵산 각각에 대해 최소인 사이클 수 CM을 확인하는 단계"가 "M이 표적 핵산 및 비교 핵산에 대해 최소값에 이르는 제1 사이클 수 CM을 확인하는 단계"로 대체되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 시그널이 형광 시그널인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 증폭이 형광 표지된 하이브리드화 프로브, FRET 하이브리드화 프로브, 분자 비컨(molecular beacon), 스콜피온 프라이머(scorpion primer), 럭스-프라이머(Lux-primer), 태크만 프로브(TaqMan probe) 및 DNA-결합 염료 중 적어도 하나를 이용하여 검출되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중의 하나 이상의 표적 핵산이 동시에 분석되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중의 하나의 표적 핵산이 동시에 분석되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 단계가 완전 자동화 방식으로, 즉 사람 상호작용이 없이 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법의 단계 (c) 내지 (h)를 수행하기 위한 명령이 저장된 기계 판독가능한 매체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 명령을 포함하는 기계 판독가능한 메모리 수단을 포함하는, 핵산 시료 분석용 장치.
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