JP5787517B2 - ポリメラーゼ連鎖反応を使用して出発試薬の量を決定するためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Description
Log(Nn)=Log(N0)+nLog(1+E)n (3)
が得られ、
式中、n番目のサイクルにおける反応混合物中のテンプレートのコピー数の対数であるLog(Nn)は、テンプレートの数の初期値N0の対数と効率に1を足した値のn乗の対数のn倍との和である。図3を参照すると、Nnを式3の対数形式で表すことの利点は、閾値線Tを確定できるという点である。閾値線Tは、背景ノイズより高い値に設定される。閾値線Tの配置は、変えることができるが、背景ノイズより高い曲線の指数期内のいずれかに設定される。閾値線Tが配置された後の目的は、T以上の蛍光シグナルを得るために要求されるリアルタイムPCRサイクルの数CTを正確に決定することである。式(3)からCTは、
CT=−Log(N0)/Log(1+E)+Log(T)/Log(1+E) (4)
となる。
CT=−Log(N0)/Log(1+E)+Log(T)/Log(1+E) (6)
=−3.4Log(N0)+26.081 (7)
となる。
En=Nn/Nn-1−1 (8)
となる。
CT=−Log(N0)/Log(1+E)+Log(T)/Log(1+E) (9)
=−3.795Log(N0)+30.955 (10)
となる。
式中、
κRSは、遺伝子AおよびBに対する検出化学の相対的感度であり、
ηAは、遺伝子Aに対するcDNA逆転写酵素収量であり、
ηBは、遺伝子Bに対するcDNA逆転写酵素収量であり、
EAは、遺伝子Aに対するPCR反応の効率であり、
EBは、遺伝子Bに対するPCR反応の効率であり、
NAは、遺伝子AのmRNA存在量であり、
NBは、遺伝子BのmRNA存在量であり、
CTBは、遺伝子Aに対するCTであり、
CTBは、遺伝子Bに対するCTである。
式14では、異なる試料を定量的に比較するために、ΔCT≡CTB−CTAを比較するだけでよい。効率EAおよびEBが知られている場合、式14からのρを計算できる。
z=f(x1,x2,・・・,xn) (15)
EA≡EB≒96%、
CTA≒9.5、
CTB≒26、および
σ(CTA)=σ(CTB)≒0.12
を使用することで、
Log10ρの変動係数、CV(Log10ρ)を計算できる。Log10ρは、遺伝子AおよびBの比の尺度である。CV(EB)およびCV(EA)の関数として、CV(Log10ρ)≡σ(Log10ρ)/Log10ρである。図11の上のグラフに例示されているように、CV(Log10ρ)は、低いCTを有する遺伝子(ここでは遺伝子B)の変動係数の関数としてあまり大きく変化しない。典型的には、参照遺伝子は、低いCTを有する。そのため、参照遺伝子の効率の変動係数が例えば2%から8%に変わっても、CV(Log10ρ)は、図11の上側のグラフの平坦な曲線によって示されているように、それほど大きくは変化しない。他方で、図11の下側のグラフを参照すると、高いCTを有する遺伝子(ここでは遺伝子B)の効率の変動係数は、Log10ρの誤差に対し劇的な効果をもたらすことがわかる。図11の下側のグラフに示されているように、遺伝子Bの変動係数とLog10ρの誤差との間の関係は、直線関係を共有する。したがって、下側のグラフは、実際には変化しているのに効率が変化していないと仮定した場合に有意な誤差が生じることを示している。
いくつかの実施形態では、第1のモデルは、第1のPCR増幅実験のサイクル2における標的核酸の計算された量である、N2に対する式、
いくつかの実施形態では、第1のモデルは、第1のPCR増幅実験のサイクル3における標的核酸の計算された量である、N3に対する式、
発明の詳細な説明
本発明は、試料から取った個別PCR増幅曲線から試料中の核酸の初期量に関する定量的情報を抽出するためのシステムおよび方法を実現する。このアプローチは、PCR反応がミカエリスーメンテン式(MMK)によって律則されるという事実に基づく。
定義
本明細書で使用されている「受け取る(受信する)」および「受け取っている(受信している)」という用語は、それぞれ「入手する」または「入手しようとしている」を意味する。これは、例えば、ローカルまたはリモートコンピュータシステム、ネットワーク、またはインターネットからデータを取り出すことによって行うことができる。これは、例えば、直接測定によって行うこともできる。
MMKモデル
本発明では、試験試料中の標的核酸の濃度および/または存在量に関する定量的情報をもたらすためのアプローチは、本明細書ではMMKモデルと称するモデルを使用して構成される。MMKモデルは、PCR反応が酵素反応であり、したがってミカエリスーメンテン式によって律則されるという事実に基づく。PCR反応は、典型的な酵素反応を律則する同じミカエリスーメンテン式に基づくので、PCR反応のそれぞれのステップは式
式中、Zは酵素であり、Sは基質である。そこで、Z・Sに対し擬似定常状態を仮定して、Z・Sの濃度は、
[ZS]=[Z][S]/KM (19)
のようにミカエリスーメンテン式によって決定され、
式中、KM=(kcat+k-1)/k1は、ミカエリスーメンテン定数である。したがって、生成物生成速度は
式中、[Zt]は全酵素濃度である。式20は、ミカエリスーメンテン式によって律則される反応に対する生成物生成速度を与える。PCRにおける実際の伸長プロセスは、複雑な多段階酵素反応であるけれども、それぞれのPCRサイクルをミカエリスーメンテン式によって律則される有効な酵素反応として記述するのが妥当である。そこで、PCRサイクルnにおける生成物(DNA)生成速度vnは、
前の(n−1)サイクル[Dn-1]〜Nn-1からの標的DNAの濃度は、サイクルnにおける基質濃度の役割を果たす。KMは、PCRプロセスの実効ミカエリスーメンテン定数であり、プロセス全体を通して一定であると仮定される(つまり、KM(n)=KM=一定)。式21では、前のサイクルからのDNAの濃度は、次のサイクルに対する基質と考えられる。
式21を使用した場合、n番目のサイクルの効率は、前のサイクル[Dn-1]においてDNAのコピーがいくつあったかに依存する。
そこで、標的核酸のコピーの出発数であるN0から始めて、PCRプロセス全体を続けることができる。第1のサイクルにおける標的核酸のコピーの数N1は、1+第1のサイクルにおける効率E1をN0に掛けた値である。しかし、次に、第1のサイクルにおける効率が式22からわかる。これは、KをK+N0で割った値であり、Kはミカエリスーメンテン定数である。第2のサイクルにおける標的核酸のコピーの数N2は、1+第2のサイクルにおける効率E2をN1に掛けた値である。しかし、第2のサイクルにおける効率が式22からわかる。これは、KをK+N1で割った値である。さらに、N1がわかり、N0で表すことができる。このようにして、与えられたステップに対するNnを、式23によって例示されている再帰的方法で計算することができる。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で説明されている方法のどれかを実行するためのキットを備えることもできる。限定しない一実施例において、プライマー、逆転写用の酵素、増幅用の酵素、および追加作用物質、ならびに本明細書で開示されている方法の任意の組合せを実行するためのソフトウェアをキットに入れることができる。したがって、これらのキットは、好適な容器手段内にこれらの試薬の1つまたは複数を収容する。キットは、RNA単離、増幅生成物の精製、標識などのための薬剤も入れることができる。
図47は、本発明の方法により試料中の標的核酸の初期量N0を計算する際に使用するための例示的なシステム11の詳細を示している。このシステムは、好ましくは、以下のコンポーネントを有するコンピュータシステム10を含む。
・ 中央演算処理装置22。
・ ストレージコントローラ12によって制御される、ソフトウェアおよびデータを格納するための主不揮発性ストレージユニット14、例えば、ハードディスクドライブ。
・ 不揮発性ストレージユニット14からロードされたプログラムおよびデータを含む、システム制御プログラム、データ、およびアプリケーションプログラムを格納するための、システムメモリ36、好ましくは高速ランダムアクセスメモリ(RAM)。システムメモリ36は、読み取り専用メモリ(ROM)も含むことができる。
・ 1つまたは複数の入力デバイス(例えば、キーボード28、マウス)およびディスプレイ26または他の出力デバイスを含む、ユーザインターフェース32。
・ 有線または無線通信ネットワーク34(例えば、インターネットなどのワイドエリアネットワーク)に接続するためのネットワークインターフェースカード20(通信回路)。
・ 前述の要素に給電するための電源24。
・ システムの前述の要素を相互接続するための内部バス30。
・ 本発明によって使用されるさまざまなファイルおよびデータ構造体へのアクセスを制御するためのファイルシステム42。
・ PCR増幅実験46における複数の蛍光測定値48を生成し、複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値FSn 48は試料のPCR増幅実験46において異なるサイクルnでとられる蛍光測定値である、PCR解析モジュール44。
・ PCR増幅実験52のモデルを精密化することによって複数の蛍光測定値48を処理するように適合され、複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値48についてモデル52はNnに対する各式54を含む、インテリジェント型モジュール50。
図35を参照すると、上側のグラフに示されているのは、革新的なMMKモデルを使用して計算されたそれぞれの試料に対し3つの複製を用意した4つの異なる試料の参照遺伝子18SのN0値である。下側のグラフに示されているのは、3つの複製に基づく18Sの平均N0値およびその95%信頼区間である。図35は、革新的MMKモデルを使用して計算したときにどのように18SのN0が試料毎にあまり変化しないかを示している。さらに、N0の変動係数は、7.5%〜9.5%である(N0の均等目盛に注意)。図36を参照すると、上側グラフには、図35に示されている18Sデータセットに対するミカエリスーメンテン定数K値が、4つの測定される異なる試料のそれぞれの3つの複製のそれぞれについて与えられている。図36の下側のグラフには、4つの試料のそれぞれに対する信頼区間が与えられている。データは、Kの平均がそれぞれの試料についてほとんど同じであることを示している。しかし、Kは、複製毎に著しく異なり、(K)の変動係数は8%〜13.5%程度である。反応がそれぞれのウェル内で同じ速度で進むと予期する理由はないが、18Sに対する平均Kは、4つの試料のそれぞれについてほぼ同じであるべきである。図36の下側のグラフからわかるように、試料の平均Kの変動は非常に小さい。
図37を参照すると、上側のグラフに示されているのは、革新的なMMKモデルを使用して計算されたそれぞれの試料に対し3つの複製を用意した4つの異なる試料の発現遺伝子PBEF1のN0値である。下側のグラフに示されているのは、3つの複製に基づくPBEF1の平均N0値およびその95%信頼区間である。図37は、PBEF1のN0の大きさは18Sの場合に比べて4〜5桁小さいことを示している。さらに、PBEF1(および典型的には他の発現遺伝子も)の平均N0値は、異なる試料に対し十分に隔たっており、これは、MMKモデルが、異なる試料に対するN0の値の差を認識できることを意味している。図37の下側のグラフでは、信頼区間は、3つの複製に基づいており、N0の変動係数(CV(N0))は均等目盛で4%〜9%程度である。図38を参照すると、上側グラフには、図37に示されているPBEF1データセットに対するミカエリスーメンテン定数K値が、4つの測定される異なる試料のそれぞれの3つの複製のそれぞれについて与えられている。図38の下側のグラフには、4つの試料のそれぞれにおけるKの平均およびその信頼区間が与えられている。データは、Kの平均がそれぞれの試料についてほとんど同じであることを示している。しかし、Kは、複製毎に著しく異なり、(K)の変動係数は1%〜6%程度である。反応がそれぞれのウェル内で同じ速度で進むと予期する理由はないが、それぞれの試料に対する平均Kは、ほぼ同じであるべきである。図38の下側のグラフからわかるように、試料の平均Kの変動は非常に小さい。
図39を参照し、試料毎に5〜10%程度の効率の変動があると仮定する標準qPCRを使用するlog10ρに対する変動係数CVの計算と遺伝子に対するデータセットを使用する革新的なMMKqPCRアプローチ(それぞれの試料が3つの複製を含む、4つの異なる試料を含む)とを比べると、標準qPCRアプローチのlog10ρの変動係数は、10.14%から10.58%までの範囲であるが、MMKqPCRアプローチの変動係数は、0.7%から0.9%の範囲であることがわかる。図40を参照すると、効率Eに変動がないと仮定しても、標準qPCRアプローチは、log10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
図41を参照すると、試料毎に効率が5〜10%程度変動すると仮定して標準qPCRを使用するlog10ρに対する変動係数CVの計算が、遺伝子IL1R2に対するデータセットを使用する革新的なMMKqPCRアプローチに基づく同じ値の計算と比較されている(それぞれの試料が3つの複製を含む4つの異なる試料を含む)。標準qPCRアプローチに対するlog10ρの変動係数は、12.87%から13.87%までの範囲であるが、MMKqPCRアプローチに対する変動係数は、0.77%から0.84%までの範囲であることがわかる。図42を参照すると、効率Eに変動がないと仮定しても、標準qPCRアプローチは、log10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
図43を参照すると、試料毎に効率が5〜10%程度変動すると仮定して標準qPCRを使用するlog10ρに対する変動係数CVの計算が、遺伝子IRAK3に対するデータセットを使用する革新的なMMKqPCRアプローチに基づく同じ値の計算と比較されている(それぞれの試料が3つの複製を含む4つの異なる試料を含む)。標準qPCRアプローチに対するlog10ρの変動係数は、7.32%から7.73%までの範囲であるが、MMKqPCRアプローチに対する変動係数は、0.72%から1.23%までの範囲であることがわかる。図42を参照すると、効率Eに変動がないと仮定しても、標準qPCRアプローチは、log10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
図45を参照すると、試料毎に効率が5〜10%程度変動すると仮定して標準qPCRを使用するlog10ρに対する変動係数CVの計算が、遺伝子JAK3に対するデータセットを使用する革新的なMMKqPCRアプローチに基づく同じ値の計算と比較されている(それぞれの試料が3つの複製を含む4つの異なる試料を含む)。標準qPCRアプローチに対するlog10ρの変動係数は、6.57%から7.05%までの範囲であるが、MMKqPCRアプローチに対する変動係数は、0.96%から1.5%までの範囲であることがわかる。図46を参照すると、効率Eに変動がないと仮定しても、標準qPCRアプローチは、log10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
本明細書で引用されているすべての参考文献は、そっくりそのまま参照により、またそれぞれの個別の刊行物または特許もしくは特許出願が、すべての目的に関して参照によりそっくりそのまま組み込まれることを特に、また個別に指示されていた場合と同じ程度にすべての目的に関して、本明細書に組み込まれる。
本発明の多くの修正ならびに変更は、当業者には明らかなように、本明細書の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書で説明されている特定の実施形態は、例としてのみ示されており、本発明は、付属の請求項の表現によってのみ、そのような請求項が関係する均等物の全範囲ともに、制限されるものとする。
Claims (49)
- 試料中の標的核酸の初期量N0を計算する方法であって、
該方法が、
第1の複数の蛍光測定値を受け取るステップ(A)であって、
前記第1の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値FSnは、前記試料の第1のPCR増幅実験において異なるサイクルnでとられる蛍光測定値である、
受け取るステップと、
前記第1のPCR増幅実験において前記標的核酸の前記初期量N0をコンピュータシステムにより計算する第1のモデルを計算するステップ(B)であって、
前記第1の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記第1のモデルが以下のNnに対する式を有し、
(i)前記Nnは、前記各蛍光測定値が測定された前記第1のPCR増幅実験のサイクルnにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
(ii)前記Nnに対する前記式は、前記第1のPCR増幅実験のサイクルnに関係なく、KおよびN0のみで表され、Kは、前記第1のPCR増幅実験のミカエリスーメンテン定数である、
計算するステップと、
前記第1のモデルを用いて、前記第1のPCR増幅実験における前記標的核酸の初期量N0を計算するステップ(C)と、
前記第1のモデルによってコンピュータシステムにより計算される値Nnと前記第1の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでKおよびN0を調節し、
それにより標的核酸の前記初期量N0を前記第1のモデルに対するN0の前記最小値として計算することによって前記第1のモデルを精密化するステップ(D)と、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記計算ステップ(C)で計算された標的核酸の前記計算された初期量N0を、ユーザ可読形式でユーザインターフェースデバイス、
モニタ、
コンピュータ可読ストレージ媒体、
コンピュータ可読メモリ、または
ローカルもしくは、
リモートコンピュータシステムに出力するか、
あるいは前記計算ステップ(C)で計算された標的核酸の前記計算された初期量N0を表示するステップ(E)をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
KおよびN0の調節による前記第1のモデルの精密化は、N0およびKに関する複数の残差Nn−FSnの平方和を最小にするステップを含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記第1のPCR増幅実験が、直線期のサイクルと指数期のサイクルを含み、
前記第1の複数の蛍光測定値が、前記第1のPCR増幅実験の前記指数期のサイクルおよび前記第1のPCR増幅実験の前記直線期のサイクルからとられる蛍光測定値からなることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記第1の複数の蛍光測定値が、
前記第1のPCR増幅実験の複数の連続するサイクルからとられる蛍光測定値からなり、
前記第1のPCR増幅実験における前記複数の連続するサイクルの最初のサイクルはnstartと表され、および前記第1のPCR増幅実験における前記複数の連続するサイクルの最後のサイクルはnendと表される、ことを特徴とする方法。 - 請求項5に記載の方法であって、
前記nstartが、
(i)前記第1のPCR増幅実験におけるその後のすべてのサイクルの効率が一貫して減少し、及び、
(ii)前記第1のPCR増幅実験の前記サイクルnstart+1の効率が1.05未満である前記第1のPCR増幅実験における前記PCRサイクルであることを特徴とする方法。 - 請求項5に記載の方法であって、
nendは、前記観察された蛍光シグナルの二次導関数(d2FS/dn2)がゼロ未満となる前記第1のPCR増幅実験における第1のサイクルであることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記第1のPCR増幅実験は、
直線期のサイクルを含み、
前記第1の複数の蛍光測定値が、前記第1のPCR増幅実験の測定可能な指数および直線期の7個から12個までの点からなることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記受け取るステップ(A)が、
複数の増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験に対する複数の蛍光測定値を受け取り、
前記第1のPCR増幅実験が前記複数のPCR増幅実験に含まれることを含み、
前記計算ステップ(B)が、
前記複数のPCR増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験に対する以下の式で示される複数のモデルのうちのあるモデルを計算し、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、前記各モデルは、前記各モデルに対応する前記PCR増幅実験における前記対応する蛍光測定値に対するNnの式中、
(i)前記各モデルにおけるそれぞれのNnは、前記各蛍光測定値が測定された前記各モデルに対応する前記PCR増幅実験のサイクルnにおける標的核酸の量であり、
(ii)前記各モデルにおけるNnに対する式は、Nnに対する式に対応している前記対応するPCR増幅実験における前記対応する蛍光測定値の前記サイクルnに関係なく、KXおよびN0のみで表され、
KXは前記対応するPCR増幅実験xのミカエリスーメンテン定数である式を含み、
(iii)それぞれのモデルはNnに対する式
- 請求項9に記載の方法であって、
前記複数のモデルのうちの各モデルの精密化を、
前記各モデルによって計算される値Nnと前記各モデルに対応する前記PCR増幅実験の前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまで前記各モデルにおけるNnに対するそれぞれの式についてKおよびN0を調節し、
それにより標的核酸の前記初期量N0を各モデルに対するN0の前記最小値として計算することによって行うステップ(D)をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
前記複数のPCR増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験は、
前記試料の連続希釈を表し、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、
前記PCR増幅実験で使用される前記試料の相対濃度の関数として前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の前記初期量N0のlog10(N0)をプロットするステップ(D)をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
前記複数のPCR増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験は、前記試料の連続希釈を表し、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、
前記PCR増幅実験で使用される前記試料の相対濃度の関数として前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の前記初期量N0をプロットするステップ(D)をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
前記複数のPCR増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験は、前記試料の連続希釈を表し、
前記試料の相対濃度の関数として前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された前記値N0を精密化し、
N0に対する単一の精密化された値が前記複数のモデルについて計算されるようにするステップ(D)をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
前記複数のPCR増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験は、
前記試料の連続希釈を表し、
前記連続希釈は、2点併行または3点併行で行われ、
異なるモデルは、それぞれの連続希釈のそれぞれの2点併行について、またはそれぞれの連続希釈のそれぞれの3点併行について計算されることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記受け取るステップ(A)は、
前記試料を使用して第2のPCR増幅実験に対する複数の蛍光測定値を受け取ることを含み、
前記計算ステップ(B)は、
前記第2のPCR増幅実験に対する第2のモデルを計算することを含み、
前記第2の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記第2のモデルは、Nnに対する式を含み、
式中、
(i)Nnは、前記各蛍光測定値が測定された前記第2のPCR増幅実験のサイクルnにおける標的核酸の前記計算された量であり、
(ii)前記第2のモデルにおけるNnに対する前記式は、サイクルnに関係なく、K2およびN0のみで表され、
K2は、前記第2のPCR増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、
第2のモデルへの式Nnは
前記第1のモデルによってコンピュータシステムにより計算されるN0に対応する前記試料、および前記第2のモデルによって計算されるN0に対応する前記試料をコンピュータシステムにより計算するステップ(D)と、
式
を計算するステップ(E)をさらに含み、
式中、
NAMは、前記第1のモデルによって計算される前記試料に対する前記計算されたN0であり、
NBMは、前記第2のモデルによって計算される前記試料に対する前記計算されたN0であることを特徴とする方法。 - 請求項16に記載の方法であって、
前記第2のモデルは、前記第2のモデルによって計算された値Nnと、
前記第2の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでK2およびN0を調節することによって前記計算ステップ(B)の実行において精密化されることを特徴とする方法。 - 請求項16に記載の方法であって、
前記第1の増幅実験は、第1の遺伝子のmRNAを増幅し、
前記第2の増幅実験は、第2の遺伝子のmRNAを増幅し、
式中、
NAMは、前記試料中の前記第1の遺伝子の前記mRNAの存在量の尺度であり、
NBMは、前記試料中の前記第2の遺伝子の前記mRNAの存在量の尺度であることを特徴とする方法。 - 請求項18に記載の方法であって、
前記第1の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、
前記第2の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子であることを特徴とする方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。 - 請求項19に記載の方法であって、ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。
- 請求項19に記載の方法であって、ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。
- 請求項19に記載の方法であって、ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。
- 請求項19に記載の方法であって、前記表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態であることを特徴とする方法。
- 請求項19に記載の方法であって、
前記表現型の特徴は、前記試料が採取された試験被検体が敗血症を起こす可能性のあることを示す指標であることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記試料中の標的核酸の前記初期量N0は、前記試料中の第1の遺伝子の前記mRNAの濃度であることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記試料中の標的核酸の前記初期量N0は、前記試料中の第1の遺伝子から転写されたmRNA分子の個数であることを特徴とする方法。 - 試料が表現型の特徴を有するかどうかを判定する方法であって、
第1の複数のサイクルを含む第1のPCR増幅実験に対する第1のモデルを計算するステップ(A)であって、
(i)前記第1のPCR増幅実験は、第1の複数の蛍光測定値を含み、
(ii)前記第1の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの測定は、前記第1のPCR増幅実験の前記第1の複数のサイクルのうちの異なる1つのサイクルから行われ、
(iii)前記第1のPCR増幅実験は、前記試料中の第1の遺伝子のPCR増幅であり、
(iv)前記第1のモデルは、前記第1のPCR増幅実験におけるそれぞれのサイクルnに対する以下の前記第1の遺伝子の量Nnの式を含み、
(v)前記第1のモデルにおけるNnに対する式は、前記式Nnによって表される前記サイクルnに関係なく、K1およびNAMのみで表され、および、
前記第1のモデルに対するNnに対応する前記式は
式
式中、
(vi)K1は、前記第1のPCR増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、
(vii)NAMは、前記試料の前記第1のPCR増幅実験の前の前記試料中の前記第1の遺伝子の量である、計算するステップと、
第2の複数のサイクルを含む第2のPCR増幅実験に対する第2のモデルを計算するステップ(B)であって、
(i)前記第2のPCR増幅実験は、第2の複数の蛍光測定値を含み、
(ii)前記第2の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの測定は、前記第2のPCR増幅実験の前記第2の複数のサイクルのうちの異なる1つのサイクルから行われ、
(iii)前記第2のPCR増幅実験は、前記試料中の第2の遺伝子のPCR増幅であり、
(iv)前記第2のモデルは、前記第2のPCR増幅実験におけるそれぞれのサイクルnに対する前記第2の遺伝子の量Nnの式を含み、
(v)前記第2のモデルにおけるNnに対する式は、前記式Nnによって表される前記
サイクルnに関係なく、K2およびNBMのみで表され、および、
前記第2のモデルに対するNnに対応する前記式は
式
式中、
(vi)K2は、前記第2のPCR増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、
(vii)NBMは、前記試料の前記第2のPCR増幅実験の前の前記試料中の前記第2の遺伝子の量である、計算するステップと、
NAMを計算させる前記第1のモデルおよび、NBMを計算させる前記第2のモデルを用いるステップ(C)と、
式
をコンピュータシステムにより計算するステップ(D)と、および、
ρは閾値よりも上か下かをコンピュータシステムにより決定するステップ(E)であって、
ρについて計算された前記値は、前記試料が前記表現型の特徴を有するかどうかを示すことを決定するステップと、
を含み、
前記複数のPCR増幅実験のうちのそれぞれのPCR増幅実験は、前記試料の連続希釈を表し、前記方法がさらに、
前記計算するステップ(C)の前に前記試料の相対濃度の関数として前記複数の第1のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された前記値NAMを精密化すること、および、
前記計算するステップ(C)の前に前記試料の相対濃度の関数として前記複数の第2のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された前記値NBMを精密化することを含み、
前記NAMの精密化は、前記第1のモデルのそれぞれによって計算されたNAMに関して複数のARE値の平均ARE(絶対相対誤差)を最小にする加重回帰を実行するステップを含み、
前記複数のARE値におけるそれぞれの
値は、前記複数の第1のモデルのうちの各第1のモデルに対する値であり、
は前記各第1のモデルに対応する第1のPCR増幅実験で使用される前記試料の実際の相対濃度であり、
は前記各第1のモデルに対する前記計算された値NAMによって決定される前記各第1のモデルに対応する前記第1のPCR増幅実験に使用される前記試料の前記計算された相対濃度であり、
NBMの精密化は、前記第2のモデルのそれぞれによって計算されたNBMに関して複数のARE値の平均ARE(絶対相対誤差)を最小にする加重回帰を実行することを含み、
前記複数のARE値におけるそれぞれの
値は、前記複数の第2のモデルのうちの各第2のモデルに対する値であり、
は前記各第2のモデルに対応する第2のPCR増幅実験で使用される前記試料の実際の相対濃度であり、
は前記各第2のモデルに対する前記計算された値NAMによって決定される前記各第2のモデルに対応する前記第2のPCR増幅実験に使用される前記試料の前記計算された相対濃度であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記ステップ(A)は、複数の第1のモデルを計算し、
それぞれの第1のモデルは、前記試料の連続希釈からの前記第1の遺伝子のPCR増幅実験であり、
式中、
NAMは、前記第1のモデルのそれぞれから決定された前記値NAMの中心傾向の尺度としてみなされることをさらに含み、
前記ステップ(B)は、複数の第2のモデルを計算し、
それぞれの第2のモデルは、前記試料の連続希釈からの前記第2の遺伝子のPCR増幅実験であり、
式中、
NBMは、前記第2のモデルのそれぞれから決定された前記値NBMの中心傾向の尺度としてみなされることをさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項29に記載の方法であって、
前記試料の第1のアリコートは、ステップ(A)の前記連続希釈で使用され、
前記試料の第2のアリコートは、ステップ(B)の前記連続希釈で使用されることを特徴とする方法。 - 請求項29に記載の方法であって、
前記ステップ(A)の前記連続希釈は、2点併行または3点併行で行われ、
異なる第1のモデルは、前記第1の遺伝子について、それぞれの希釈のそれぞれのPCR増幅実験についてコンピュータシステムにより計算され、
式中、
NAMは、前記第1のモデルのそれぞれから計算された前記値NAMの中心傾向の尺度としてみなされ、
前記ステップ(B)の前記連続希釈は、2点併行または3点併行で行われ、
異なる第1のモデルは、前記第2の遺伝子について、それぞれの希釈のそれぞれのPCR増幅実験についてコンピュータシステムにより計算され、
式中、
NBMは、前記第2のモデルのそれぞれから計算された前記値NBMの中心傾向の尺度としてみなされることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
式中、
前記NAMは、前記試料中の前記第1の遺伝子の前記mRNAの濃度であり、
前記NBMは、前記試料中の前記第2の遺伝子の前記mRNAの濃度であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
式中、
前記NAMは、前記試料中の前記第1の遺伝子から転写されたmRNA分子の個数であり、
前記NBMは、前記試料中の前記第2の遺伝子から転写されたmRNA分子の個数であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記第1の増幅実験は、第1の遺伝子のmRNAを増幅し、
前記第2の増幅実験は、第2の遺伝子のmRNAを増幅し、
式中、
NAMは、前記試料中の前記第1の遺伝子の前記mRNAの存在量の尺度であり、
NBMは、前記試料中の前記第2の遺伝子の前記mRNAの存在量の尺度であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記第1の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、
前記第2の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子であることを特徴とする方法。 - 請求項35に記載の方法であって、
ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。 - 請求項35に記載の方法であって、
ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。 - 請求項35に記載の方法であって、
ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。 - 請求項35に記載の方法であって、
ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。 - 請求項35に記載の方法であって、
前記表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記試料の前記第1のPCR増幅実験の前の前記試料中の前記第1の遺伝子の量は、前記試料中の前記第1の遺伝子の前記mRNAの濃度であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記試料の前記第1のPCR増幅実験の前の前記試料中の前記第1の遺伝子の量は、前記試料中の前記第1の遺伝子から転写されたmRNA分子の個数であることを特徴とする方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
ρをユーザ可読形式でユーザインターフェースデバイス、
モニタ、
コンピュータ可読ストレージ媒体、
コンピュータ可読メモリ、または
ローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力すること、あるいは
ρを表示するステップ(D)をさらに含むことを特徴とする方法。 - PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)システムであって、
複数の蛍光測定値を生成し、前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値FSnが試料のPCR増幅実験において異なるサイクルnでとられる蛍光測定値である、PCR解析モジュールと、
前記試料中の前記標的核酸の計算された初期量N0をもたらす前記PCR増幅実験のモデルをコンピュータシステムにより計算することによって前記複数の蛍光測定値を処理するように適合されたインテリジェント型モジュールとを備え、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について前記インテリジェント型モデルが以下のNnに対する式を含み、
式中、
(i)Nnは、前記各蛍光測定値が測定された前記PCR増幅実験のサイクルnにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
(ii)Nnに対する前記式は、前記PCR増幅実験のサイクルnに関係なく、KおよびN0のみで表され、
KはPCR増幅実験のミカエリスーメンテン定数である式を含み、
前記Nnに対する式が、
前記インテリジェント型モジュールは、
前記モデルによって計算される値Nnと、及び、
前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでKおよびN0を調節し、それにより前記試料中の前記標的核酸の前記計算された初期量N0を決定するための命令とを含む、
ことを特徴とするPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)システム。 - 請求項44に記載のPCRシステムであって、
前記インテリジェント型モジュールは、
N0をユーザインターフェースデバイス、
モニタ、
コンピュータ可読ストレージ媒体、
コンピュータ可読メモリ、
またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、
あるいはN0を表示するための命令をさらに備えることを特徴とするPCRシステム。 - 試料中の標的核酸の初期量N0を計算するためのコンピュータシステムであって、
前記コンピュータシステムはプロセッサ、前記プロセッサに結合されたメモリおよび前記メモリ格納するモジュールを備え、
前記モジュールは、
第1の複数の蛍光測定値を受け取るための命令であって、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値FSnが前記試料の第1のPCR増幅実験において異なるサイクルnでとられる蛍光測定値である命令(A)と、
前記試料中の前記標的核酸の計算された初期量N0をもたらす前記PCR増幅実験のモデルを計算するための命令(B)とを含み、
前記第2の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記モデルは、以下のNnに対する式を含み、
式中、
(i)Nnは、前記各蛍光測定値が測定された前記PCR増幅実験のサイクルnにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
(ii)Nnに対する前記式は、前記PCR増幅実験のサイクルnに関係なく、KおよびN0のみで表され、Kは、PCR増幅実験のミカエリスーメンテン定数であって、
前記Nnに対する式が、
命令からなるモジュールを備え、
前記命令は前記モデルを計算するための命令であって、
前記命令は、
前記モデルによって計算される値Nnと前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでKおよびN0を調節し、それにより前記モデルに対するN0の前記最小値として標的核酸の前記計算された初期量N0を計算することによって前記モデルを精密化するための命令であることを特徴とするコンピュータシステム。 - 請求項46に記載のコンピュータシステムであって、
前記モジュールは、
前記計算(B)のための前記命令によって計算された標的核酸の前記計算された初期量N0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、あるいは前記計算(B)のための前記命令によって計算された標的核酸の前記計算された初期量N0を表示するための命令をさらに備えることを特徴とするコンピュータシステム。 - 試料中の標的核酸の初期量N0を計算するためのコンピュータによって実行可能なコンピュータプログラムを格納する固定ストレージ内に埋め込まれたコンピュータ可読媒体であって、
前記コンピュータプログラムが、
複数の蛍光測定値を受け取るための命令(A)であって、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値FSnが前記試料のPCR増幅実験において異なるサイクルnでとられる蛍光測定値である、命令と、
前記試料中の前記標的核酸の計算された初期量N0をもたらす前記PCR増幅実験のモデルを計算するための命令(B)であって、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記モデルは、以下のNnに対する式を含み、
(i)Nnは、前記各蛍光測定値が測定された前記PCR増幅実験のサイクルnにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
(ii)Nnに対する前記式は、前記PCR増幅実験のサイクルnに関係なく、KおよびN0のみで表され、Kは、PCR増幅実験のミカエリスーメンテン定数である命令と、を含み、
前記固定ストレージ内に埋め込まれたコンピュータ可読媒体であって、
計算するための前記命令は、
前記モデルによって計算される値Nnと、
前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでKおよびN0を調節し、
それにより前記モデルに対するN0の前記最小値として標的核酸の前記初期量N0を計算することによって前記モデルを精密化することをさらに含むコンピュータプログラムを格納することを特徴とするコンピュータ可読媒体。 - 請求項48に記載の固定ストレージ内に埋め込まれたコンピュータ可読媒体であって、
前記コンピュータプログラム製品は、
ユーザ可読形式で計算(B)のための前記命令によって計算された標的核酸の前記計算された初期量N0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、
あるいは計算(B)のための前記命令で計算された標的核酸の前記計算された初期量N0を表示するための命令をさらに備えることを特徴とするコンピュータ可読媒体。
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