BRPI1006682B1

BRPI1006682B1 - método para a quantificação relativa de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra, método para a quantificação absoluta de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra, meios legíveis por máquina e equipamento para a análise das amostras de ácido nucleico

Info

Publication number: BRPI1006682B1
Application number: BRPI1006682A
Authority: BR
Inventors: Yin Bin; Arnoldus Kahlman Josephus; Nijsen Tamara
Original assignee: Koninl Philips Electronics Nv; Koninklijke Philips Nv
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2020-04-22
Also published as: WO2010119407A1; KR20120030047A; EP2419846B1; EP2419846A1; BRPI1006682A2; RU2011146326A; US20120040348A1; RU2639515C2; JP5810078B2; CN102395977A; CN102395977B; US8700381B2; JP2012523830A; KR101771402B1

Abstract

método para a quantificação relativa de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra, método para a quantificação absoluta de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra, meios legíveis por máquina e equipamento para a análise das amostras de ácido nucleico a invenção se refere a um método para quantificação de ácidos nucleicos amplificados, compreendendo as etapas de: - cálculo de uma medição de aleatoriedade m da eficiência de amplificação ciclo a ciclo ê(c) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, - identificação dos números de ciclo cm em que m seja mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos, - cálculo dos números de ciclo característicos cc dos valores de cm.

Description

(54) Tftulo: MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, MEIOS LEGÍVEIS POR MÁQUINA E EQUIPAMENTO PARA A ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE ÁCIDO NUCLEICO (51) Int.CI.: G06F 19/00.

(30) Prioridade Unionista: 16/04/2009 EP 09158044.9.

(73) Titular(es): KONINKLIJKE PHILIPS N.V..

(72) Inventor(es): JOSEPHUS ARNOLDUS KAHLMAN; BIN YIN; TAMARA NIJSEN.

(86) Pedido PCT: PCT IB2010051615 de 14/04/2010 (87) Publicação PCT: WO 2010/119407 de 21/10/2010 (85) Data do Início da Fase Nacional: 11/10/2011 (57) Resumo: MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, MEIOS LEGÍVEIS POR MÁQUINA E EQUIPAMENTO PARA A ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE ÁCIDO NUCLEICO A invenção se refere a um método para quantificação de ácidos nucleicos amplificados, compreendendo as etapas de: - cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, identificação dos números de ciclo CM em que M seja mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos, - cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de CM.

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MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, MEIOS LEGÍVEIS POR MÁQUINA E EQUIPAMENTO PARA A ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE ÁCIDO NUCLEICO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se	refere	ao	campo	de
quantificação de ácido nucleico	por meio	da	reação	em
cadeia da polimerase (PCR).
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
A quantificação de	ácidos	nucleicos	é

importante em um número de campos variando de biologia molecular e pesquisa genética a diagnósticos e detecção de patógenos. Quando uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos está presente, podem ser aplicadas técnicas blot para quantificação. No entanto, a sensibilidade limitada dessas técnicas impossibilita seu uso em vários casos.

Métodos de PCR quantitativo desenvolvidos no passado recente oferecem ferramentas para análise nos casos em que é necessária uma sensibilidade mais alta. Essas técnicas se baseiam no fato de que durante a amplificação por PCR, a quantidade de produto cresce exponencialmente e, com isso, a quantidade de produto obtida após um número de ciclos comparavelmente menores pode ser detectada por meios convencionais (por exemplo, detecção de fluorescência) . Além disso, a quantidade de produto que está presente inicialmente, ou seja, no início da amplificação, pode ser a princípio determinada pela quantidade de produto obtida no final da amplificação, se for conhecido o número de ciclos de amplificação.

Petição 870190121940, de 22/11/2019, pág. 5/13

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Descritos de forma resumida, os ácidos nucleicos alvo, assim como amostras padrão e/õu comparativas, são submetidos na prática a PCR condições de reação definidas, e a formação do produto de PCR é monitorada ao longo do processo de amplificação. A detecção de produto de PCR é alcançada, por exemplo, por meio de sondas de hibridização rotuladas por fluorescência que emitem sinais específicos quando ligadas ao alvo ou por meio de corantes fluorescentes com intercalação de DNA que permitem detectar produtos de dupla fita duplos. O número de ciclos de amplificação que são necessários para se obter um nível de limiar de fluorescência específico, chamados de valores Ct, é determinado e o valor Ct do alvo é comparado com os valores Ct das amostras de uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida (quantificação absoluta). Para determinar a quantidade absoluta do alvo, é feita uma curva padrão a partir dos valores Ct das amostras padrão e usada para determinar a concentração inicial do alvo. De forma alternativa, o valor Ct do alvo é comparado com o valor Ct de um único ácido nucleico comparativo de interesse (quantificação relativa). Nesse caso, a proporção dos valores Ct da amostra alvo e da comparativa é determinado e usado para avaliar a proporção das quantidades iniciais de ácido nucleico alvo e comparativo. Infelizmente, a aplicação prática dessas abordagens é complicada por um número de problemas, alguns dos quais serão discutidos a seguir.

Alguns desaprodutos de dupla fita no campo do PCR quantitativo se referem à crescente necessidade de se analisar grandes números de amostras em intervalos curtos de tempo. Como muitas aplicações para PCR quantitativo exigem a análise de números muito grandes de amostras e alto rendimento, por exemplo, em prática clínica, é necessário desenvolver métodos de PCR quantitativo que possam ser

3/26 automatizados completamente e exijam pouca ou nenhuma interação humana. Isso é de importância crucial em alguns casos, pois as aplicações de alto rendimento (por exemplo, em prática clínica) simplesmente não podem ser conduzidas nos períodos de tempo curtos desejados se for necessária interação humana.

Um benefício adicional que poderia ser realizado com esses métodos seria uma comparabilidade aprimorada de dados analíticos entre diferentes laboratórios empregando atualmente protocolos de laboratório muito diferentes para PCR quantitativo. O problema é de extrema importância em vista de um número cada vez maior de laboratórios usando técnicas de PCR quantitativo para pesquisa básica. Estabelecer um método automatizado como referência objetiva para experimentos de quantificação beneficiaria drasticamente esses esforços de pesquisa.

Um plano típico de produto de PCR formado ao longo do curso de uma reação de amplificação revela quatro diferentes fases do processo de amplificação (ver Fig. 1): (1) Uma fase inicial em que o sinal de fluorescência é dominado por fluorescência e ruído de fundo; (2) uma fase exponencial em que o sinal do produto de PCR sobe acima do nível inicial e aumenta exponencialmente; (3) uma fase linear em que o sinal aumenta com menos do que a taxa exponencial em função da diminuição da eficiência da amplificação causada por fatores como o consumo de reagentes de PCR e degradação de sondas de detecção; (4) uma fase platô com aumento marginal do sinal em função de uma redução cada vez maior da velocidade e por fim interrupção da reação de amplificação.

Apesar do conceito aparentemente direto, escolher um nível de limite de sinal adequado para determinar valores Ct não é tarefa simples. Como pode ser visto do plano da Fig. 1, escolher um nível alto de limiar pode gerar valores Ct na

4/26 fase linear ou platô da reação de amplificação. Isso é indesejável, pois a reação diminuiu desde o crescimento exponencial nesta região que oculta a correlação entre quantidades iniciais e atuais de ácidos nucleicos. Escolher um nível de limiar baixo, por outro lado, pode resultar em um valor Ct localizado na fase inicial da reação de amplificação em que o ruído e o sinal de fundo podem complicar medições. Obviamente, com isso, é desejável escolher um nível limiar resultante em valores Ct correspondentes a ciclos com crescimento exponencial, ou seja, na fase exponencial.

Foi desenvolvido um número de abordagens para alcançar este objetivo (veja, por exemplo, JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64) . A abordagem de limiar básico exige um experimentador para ver a curva de amplificação e utilizar de seu próprio julgamento para escolher um limitar de sinal adequado que seja cruzado na fase exponencial. Como o nível absoluto do sinal depende de um certo número de fatores, incluindo o comprimento do ácido nucleico e meio de detecção usado no nível limiar deste método deve ser checado e, se necessário, ajustado para cada aplicação. Da mesma forma, no método de ponto de encaixe um experimentador deve escolher um nível limiar adequado de acordo com seu próprio julgamento. No entanto, em vez de atribuir Ct ao número de ciclo onde o sinal gravado cruza o limiar, é modelado um encaixe linear em um plano semilogarítmico da peça exponencial da curva e o ciclo onde essa linha estreita passa o limiar é designado como Ct. Outro conceito é chamado de método de segunda máxima derivada em que a máxima da segunda derivada da curva de amplificação é determinada numericamente. Presume-se que o ciclo correspondente represente o fim da fase de crescimento exponencial, em que a reação começa a desacelerar para o crescimento linear. Este número de ciclo é usado,

5/26 analogamente ao Ct, para determinar a quantidade do alvo. Em contraste com o limiar básico e o método de ponto de encaixe, este método exige pouca ou nenhuma interação humana, uma vez que nenhum nível limiar deve ser estabelecido por um experimentador. Outra abordagem é chamada de método de encaixe de curva sigmoide em que uma função sigmoide é modelada na curva de amplificação. O número de ciclo correspondente ao ponto de inflexão da curva pode ser obtido a partir do modelo e é usado, analogamente ao Ct, para determinar a quantidade do alvo. Este método, também, exige pouca ou nenhuma interação humana. O método de segunda máxima derivada e o método de encaixe de curva sigmoide, em princípio, aparentam ser adequados para uma automação completa. 0 método limiar básico e o método de ponto de encaixe, por natureza, no entanto, exige interação humana e, com isso, não são adequados para automação. Descobriu-se que o método de segunda máxima derivada e o método de encaixe de curva sigmoide, no entanto, têm uso limitado para aplicações que exigem alta sensibilidade (JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64).

Ê, portanto, objetivo da presente invenção prover métodos que sejam adequados para a quantificação automatizada completa de ácidos nucleicos com alta sensibilidade.

OBJETIVO E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Este objetivo é alcançado de acordo com a invenção por um método para a quantificação relativa de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (b) amplificação de cada um de no mínimo uma amostra de ácidos nucleicos comparativos e obtenção

6/26 simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico comparativo, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) de cada ciclo de amplificação de ácidos nucleicos alvo e comparativos, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (f) identificação dos números de ciclo CM em que M seja mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (g) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de CM, (h) determinação das quantidades relativas de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra em relação aos ácidos nucleicos comparativos pela comparação de CC de amostras alvo e comparativas.

De forma alternativa, este objetivo é alcançado de acordo com a invenção por um método para a quantificação absoluta de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (b) amplificação das amostras de uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação dos ácidos nucleicos nas amostras padrão, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo,

7/26 (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada amplificação de amostras alvo e padrão, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para amostras alvo e padrão, (f) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para amostras alvo e padrão, (g) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (h) determinação das quantidades iniciais de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra, pela comparação de CC de amostras alvo e padrão.

De forma alternativa, este objetivo é alcançado de acordo com a invenção por meio um método para determinação do valor Ct de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra, (b) obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de cada um dos ácidos nucleicos alvo, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (f) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (g) cálculo dos números de ciclo característicos Cc dos valores de CM,

8/26 (h) cálculo de valores Ct a partir dos valores C_c.

Os valores Ct obtidos podem ser usados para a quantificação de ácidos nucleicos com métodos conhecidos na técnica.

De forma alternativa, este objetivo é alcançado de acordo com a invenção por meio de um método para a quantificação relativa de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) correção dos sinais obtidos para as curvas de amplificação de no mínimo um ácido nucleico alvo e no mínimo um ácido nucleico comparativo para sinais de fundo, (b) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação dos ácidos alvo e comparativo, (c) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (d) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (e) cálculo dos números de ciclo característicos C_cdos valores de C_M, (f) determinação das quantidades relativas de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra em relação aos ácidos nucleicos comparativos pela comparação de C_c de amostras alvo e comparativas.

(a) correção dos sinais obtidos para as curvas de amplificação de no mínimo um ácido nucleico alvo e as amostras de uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida para sinais de fundo,

9/26 (b) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de amostras alvo e padrão, (c) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para amostras alvo e padrão, (d) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para amostras alvo e padrão, (e) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (f) determinação das quantidades iniciais de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra, pela comparação de CC de amostras alvo e padrão.

(a) correção dos sinais obtidos para as curvas de amplificação de no mínimo um ácido nucleico alvo para sinais de fundo, (b) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de cada um dos ácidos nucleicos alvo, (c) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (d) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (e) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (f) cálculo de valores Ct a partir dos valores CC.

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Além disso, a presente invenção se refere a métodos conforme descrito acima, que são realizados de forma completamente automatizada, ou seja, sem interação humana.

Além disso, a presente invenção se refere a meios legíveis por máquina com instruções armazenadas para conduzir as etapas (c) a (h) dos métodos acima descritos.

Além disso, a presente invenção se refere a um equipamento para a análise das amostras de ácido nucleico compreendendo um dispositivo de memória legível por máquina contendo informações para conduzir os métodos acima descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 mostra um plano típico de produto de PCR formado pelo curso de uma reação de amplificação revelando fases diferentes do processo de amplificação: GP = fase inicial, EP = fase exponencial, LP = fase linear, PP = fase platô. C denota o número de ciclos e IC denota a intensidade de sinal registrada.

A Fig. 2 mostra curvas Ê(C) calculadas numericamente de três amplificações de PCR começando com uma quantidade inicial de DNA de 10⁶ cópias em um volume de 25 pl.

A Fig. 3 A mostra as curvas de amplificação de fundo corrigidas obtidas no exemplo 1.

A Fig. 3 B mostra as curvas de entropia espectral obtidas no exemplo 1. A figura mostra que a entropia espectral (M) exibe mínima característica nos ciclos (C) 20, 23, 26, 31 e 34 nas amostras com concentrações de ΙΟ⁶, 10⁵, 10⁴, ΙΟ³, 10² cópias por 25 μΐ, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

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Uma medição da aleatoriedade da eficiência de amplificação tem um mínimo distinto que pode ser usado como ponto característico de uma amplificação.

Atribuição de valores Ct para as curvas de amplificação no curso de quantificação de ácido nucleico usando-se o método de limiar básico ou o método de ponto de encaixe exige ação humana. Com base em seu próprio julgamento, o experimentador deve escolher um nível limiar de sinal que é alcançado antes do fim da fase exponencial em que a amplificação diminui significantemente e que é, além disso, alcançado após fase inicial dominado pelo sinal de fundo e o ruído. Portanto, por natureza, esses métodos são inadequados para automação.

Em comparação, o método de segunda máxima derivada e o método de encaixe de curva sigmoide envolvem a designação de pontos característicos nas curvas sem ação humana. Portanto, em princípio esses métodos não aparentam ser inadequados para automação. No entanto, descobriu-se recentemente que o método de segunda máxima derivada e o método de encaixe de curva sigmoide não são confiáveis para quantificação dos números para alvo (JD Durtschi et al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64) .

O que não era esperado era que o plano de uma medida de aleatoriedade da eficiência de amplificação tem um mínimo distinto ou uma transição distinta à mínima. O número de ciclo associado a esse mínimo ou à transição ao mínimo pode ser atribuída como um ponto característico para cada curva de amplificação sem ação humana e pode ser usada para quantificar de forma confiável os ácidos nucleicos incluindo quantificação de alvos de número de baixa cópia.

Uma vantagem de utilizar o mínimo ou a transição para o mínimo de uma medida de aleatoriedade da eficiência de amplificação como ponto característico vem do fato de que

12/26 esse ponto geralmente se localizada na parte anterior da fase exponencial. Como a eficiência de amplificação é influenciada por vários fatores como comprimento, conteúdo de GC e estrutura potencial secundária do produto de PCR, assim como inibidores que podem estar presentes na mistura de amplificação, é vantajoso usar um ponto característico na parte anterior da fase exponencial uma vez que as diferenças na eficiência de amplificação têm impacto limitado nesse estágio.

Outra vantagem de utilizar o mínimo ou a transição para o mínimo de uma medida de aleatoriedade da eficiência de amplificação como ponto característico vem do fato de que para um número de aplicativos, é desejável realizar a amplificação de mais de uma espécie de ácido nucleico em um único lote de reação. A análise do tipo multiplexador (mais de um alvo por lote) ou o uso de padrões internos podem ser facilitados com isso. As principais vantagens dessas reações one-pot são que menos lotes têm de ser trabalhados e cada ácido nucleico no lote está sujeito ao mesmo ambiente químico que pode compreender inibidores da reação de PCR. Um prérequisito essencial para essas análises one-pot é que diferentes rótulos devem ser usados para cada espécie de ácido nucleico para monitorar a amplificação de cada espécie separadamente. Há um número de diferentes corantes de fluorescência disponíveis que podem ser usados para este fim em baixas concentrações. Com o aumento da concentração, no entanto, é provável que a interação dos fluoróforos resulte em distúrbio dos sinais de fluorescência, com isso, prejudicando a precisão da análise. Para minimizar essa interação dos fluoróforos, portanto, é vantajoso utilizar um ponto característico na parte anterior da fase exponencial quando as concentrações de produtos rotulados de PCR são comparaveImente baixas.

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Ê, portanto, outro objetivo da presente invenção prover métodos para a quantificação de ácidos nucleicos, em que os sinais que são usados para a quantificação são sinais obtidos na parte anterior da fase exponencial da amplificação. Em realizações preferidas da presente invenção, a parte anterior da fase exponencial da amplificação é considerada como parte do seguinte: a primeira metade da fase exponencial, os primeiros 10 ciclos da fase exponencial, os primeiros cinco ciclos da fase exponencial, os primeiros três ciclos da fase exponencial ou o primeiro ciclo da fase exponencial.

QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA E RELATIVA

A presente invenção é voltada para métodos de quantificação relativa de ácidos nucleicos que compreende as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (b) amplificação de cada um de no mínimo uma amostra de ácidos nucleicos comparativos e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico comparativo, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação dos ácidos alvo e comparativo, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (f) identificação dos números de ciclo CM em que M seja mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos,

14/26 (g) cálculo dos números de ciclo característicos C_cdos valores de C_M, (h) determinação das quantidades relativas de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra em relação aos ácidos nucleicos comparativos pela comparação de CC de amostras alvo e comparativas.

A presente invenção é também voltada para métodos para a quantificação absoluta de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (b) amplificação das amostras de uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação dos ácidos nucleicos nas amostras padrão, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de amostras alvo e padrão, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para amostras alvo e padrão, (f) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para amostras alvo e padrão, (g) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (h) determinação das quantidades iniciais de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra, pela comparação de CC de amostras alvo e padrão.

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A presente invenção é também voltada para métodos para determinar o valor Ct de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra, (b) obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de cada um dos ácidos nucleicos alvo, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (f) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (g) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (h) cálculo de valores Ct a partir dos valores CC.

A presente invenção é também voltada para métodos para a quantificação relativa de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra que compreende as etapas:

(a) correção dos sinais obtidos para as curvas de amplificação de no mínimo um ácido nucleico alvo e no mínimo um ácido nucleico comparativo para sinais de fundo, (b) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação dos ácidos nucleicos alvo e comparativo,

16/26 (c) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (d) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (e) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M/ (f) determinação das quantidades relativas de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra em relação aos ácidos nucleicos comparativos pela comparação de C_c de amostras alvo e comparativas.

(a) correção dos sinais obtidos para as curvas de amplificação de no mínimo um ácido nucleico alvo e as amostras de uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida para sinais de fundo, (b) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de amostras alvo e padrão, (c) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para amostras alvo e padrão, (d) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para amostras alvo e padrão, (e) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (f) determinação das quantidades iniciais de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra, pela comparação de CC de amostras alvo e padrão.

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(a) correção dos sinais obtidos para as curvas de amplificação de no mínimo um ácido nucleico alvo para sinais de fundo, (b) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação de cada um dos ácidos nucleicos alvo, (c) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (d) identificação dos números de ciclo C_M em que M seja mínimo para cada um dos ácidos nucleicos alvo, (e) cálculo dos números de ciclo característicos CC dos valores de C_M, (f) cálculo de valores Ct a partir dos valores C_c.

A quantificação relativa de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção se refere à obtenção de medição quantitativa da proporção das quantidades dos ácidos nucleicos correspondentes em uma amostra antes da análise.

A quantificação absoluta de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção se refere à obtenção de uma medida absoluta da quantidade de ácido nucleico em uma amostra antes da análise, por exemplo, número da cópia ou quantidade da substância.

Ácidos nucleicos que são adequados a presente invenção compreendem DNA, RNA, além de ácidos nucleicos com estrutura principal e/ou estrutura de base modificada. Normalmente a amplificação é feita pela reação em cadeia da

18/26 polimerase (PCR) por métodos e com a ajuda de instrumentação disponível para uma pessoa especialista na técnica. No entanto, para os fins desta invenção, ácidos nucleicos que não puderem ser amplificados por PCR diretamente podem ser transcritos em DNA por meios conhecidos de uma pessoa especialista na técnica. RNA, por exemplo, pode ser transcrito em DNA antes da amplificação com o uso de uma enzima transcriptase reversa. Para permitir a reconstrução das quantidades originais dos ácidos nucleicos correspondentes, como um processo de transcrição deve ser feito sob condições que possibilitam presumir de forma razoável a proporção da quantidade de ácido nucleico que foi transcrita no DNA e o DNA que foi produzido no curso da transcrição. As condições de reação desse tipo são conhecidas na técnica.

Cada ácido nucleico que é amplificado no curso da prática da presente invenção é normalmente amplificado de forma seletiva. Uma forma de se obter a amplificação durante o PCR é o emprego de iniciadores específicos. 0 desenho e uso desses iniciadores são conhecidos por especialistas na técnica.

De acordo com a presente invenção, sinais correlacionados com a amplificação de ácidos nucleicos são registrados no curso de uma reação de amplificação. A representação dos sinais registrados ao longo do curso de todos os ciclos de uma reação de amplificação é geralmente denotada como curva de amplificação. Geralmente, esses sinais são emissões de fluorescência, no entanto, outros sinais empregados na técnica também são compreendidos na presente invenção. Emissões de fluorescência podem ser liberadas por corantes fluorescentes, dos quais vários são conhecidos na técnica. Alguns corantes fluorescentes têm espectros de

19/26 absorção e emissão que são suficientemente separados para permitir a detecção na mesma amostra.

Para os fins da presente invenção, a amplificação de ácido nucleico, ou seja, a produção de ácidos nucleicos por meio da reação de amplificação, é detectada registrandose sinais que estejam correlacionados à amplificação de ácidos nucleicos. Isso pode ser alcançado, por exemplo, por meio de sondas de hibridização rotulada por fluorescência que emitem sinais específicos quando ligadas ao alvo ou por meio de corantes fluorescentes para intercalação de DNA que permitem detectar produtos de dupla fita. Essas sondas de hibridização rotulada por fluorescência e corantes fluorescentes de intercalação de DNA são conhecidas na técnica. Em uma realização preferida da presente invenção, a amplificação de ácido nucleico é detectada com a ajuda de no mínimo um dos seguintes itens: sondas de hibridização marcadas com fluorescência, sondas de hibridização FRET, sinalizadores moleculares, iniciadores scorpions, iniciadores Lux, sondas TaqMan, corantes ligados a DNA.

A presente invenção compreende métodos e meios para analisar ácidos nucleicos. Uma única análise pode ser voltada para uma única espécie de ácido nucleico alvo ou mais de uma espécie de ácido nucleico alvo. Nos casos em que mais de um ácido nucleico alvo esta sujeito a uma análise, os sinais registrados para monitorar a amplificação de cada ácido nucleico alvo devem ser sinais distinguíveis, ou seja, sinais que possam ser registrados ao mesmo tempo separadamente. Métodos e meios para se atingir tais sinais são conhecidos na técnica. Alguns corantes fluorescentes, por exemplo, exibindo espectros de absorção e emissão que são suficientemente separados permitem o registro paralelo de seus sinais de fluorescência ao mesmo tempo. A presente invenção, com isso,

20/26 compreende análise multiplexas de vários alvos em uma amostra ao mesmo tempo.

De acordo com a presente invenção, ácidos nucleicos comparativos podem ser usados para determinar valores de referência para a quantificação relativa de ácidos nucleicos alvo. Um ou vários desses ácidos nucleicos comparativos podem ser usados de acordo com a presente invenção. A quantidade absoluta de um ácido nucleico comparativo em uma amostra antes da análise não precisa ser conhecida. Os mRNAs de genes reguladores em uma célula, por exemplo, podem ser usados como ácidos nucleicos comparativos. Para ser amplificado por PCR, o mRNA é normalmente transcrito no DNA com antecedência.

De acordo com a presente invenção, uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida pode ser usada para determinar valores de referência para a quantificação absoluta de ácidos nucleicos alvo. Amostras alvo e amostras diluídas do padrão de ácido nucleico podem ser analisadas em diferentes lotes de reação ou podem ser analisadas em um lote de reação simultaneamente. Se analisados em um lote de reação simultaneamente, diferentes ácidos nucleicos e diferentes amostras da série de diluições devem ser detectadas com sinais distinguíveis, ou seja, sinais que podem ser registrados ao mesmo tempo separadamente.

No curso da prática da presente invenção, um termo de fundo é subtraído dos sinais registrados. Para se obter essa correção do fundo, uma curva linear é modelada nos primeiros ciclos da curva de amplificação, por exemplo, por regressão linear. Preferivelmente, os primeiros 10 ciclos da curva de amplificação são usados para construir esta curva linear. De forma alternativa, um método estatístico de teste pode ser usado para determinar os ciclos da curva de amplificação que são adequados para construção desta curva

21/26 linear, em específico quando o sinal foi ruidoso. Em seguida, esta curva linear é subtraída da curva de amplificação.

De acordo com a presente invenção, a eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê é calculada com o uso de:

Ê(C) = [Í(C+1) / 1(C)] - I

Em que:

- Ê = eficiência de amplificação ciclo a ciclo

- C = número de ciclo

- Ϊ = intensidade de sinal corrigida do sinal de fundo

Em algumas realizações da presente invenção, a eficiência de amplificação Ê é calculada pelo uso de valores Ϊ em mais de dois ciclos consecutivos, ou seja, é necessário aplainar. Em realizações preferidas da presente invenção, o aplainamento é feito usando-se pontos de dados 3, 5 ou 7.

A Fig. 2 mostra curvas de Ê(C) calculadas numericamente de três amplificações de PCR que começam com uma quantidade inicial de DNA de 10⁶ cópias por 25 μΐ.

De acordo com a presente invenção, uma medida de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) é calculada. A entropia espectral é um exemplo de medida de aleatoriedade. A entropia espectral pode ser calculada conforme segue:

(1) Forma uma estrutura de dados de Ê(C) como

W(C) = [ Ê(C-L), Ê(C-L+1), ... , Ê(C), ..., Ê(C+L-1),

Ê(C+L)]

Em que 2L+1 é o número de Ê nessa estrutura de dados que é centralizada no ciclo C. Preferivelmente, L recebe um valor de 3 ou 4, portanto W(C) tem 7 ou 9 elementos. Para não haver um índice de Ê menor que um ou excedendo o ultimo número de ciclo Cmax disponível de uma curva de amplificação, C deve estar na faixa de

L < C <= (Cmax-L);

22/26 (2) Aplicar uma transformada discreta de Fourier (DFT) em W(C) para obter uma estrutura de dados S(C) que tenha normalmente um valor complexo,

S(C)= DFT{W(C) }= [ S(l), s(2), ..., s(2N-l), s(2N)]

Em que 2N seja o tamanho de DFT e pode ser, por exemplo, 16 ou 32;

(3) Tire o módulo de S(C) e forme uma nova estrutura de dados com parte de seus elementos

P(C) = [|s(2) | , |s(3)|, ..., |s(N-l) |, | S (N) | ] ;

(4) Normalize a soma dos elementos de P(C) para um para obter

Pn(C)=P(C)/sum{P(C)}

Em que sum{ } é um operador de estrutura de dados que calcula a soma dos elementos da estrutura de dados;

(5) Calcule a entropia espectral (M) da estrutura de dados Pn(C) como

M(C)=sum{Pn(C)*log2{Pn(C)}}

Em que a multiplicação * e a operação logarítmica sejam voltadas para elementos;

(6) Atualize a estrutura de dados W(C) centralizando-a no ciclo C+l e repita as etapas (1)-(5).

O método acima calcula a entropia espectral (M) de Ê(C) como uma função de C. Quanto menor for a entropia espectral, mais baixo será o grau da aleatoriedade do sinal.

M é caracterizado por um mínimo distinto que está localizado após a fase inicial e na fase exponencial de uma curva de amplificação.

A presente invenção compreende realizações em que outras medidas de aleatoriedade são usadas. Exemplos de outras medidas de aleatoriedade são: (a) O erro residual de encaixe de curva polinomial; (b) contagem de zero; (c) cálculo de energia (RMS) após filtragem de banda alta. Todos esses métodos funcionam na estrutura de dados acima

23/26 mencionada W(C) . O método anterior (a) se baseia na noção de que uma função polinomial pode encaixar uma função determinista até determinada precisão, mas não é estocástico. Os dois últimos métodos ( (b) e (c) ) fazem uso da observação de que o ruído flutua mais do que sinal determinista ao redor de seu valor médio, para que mais contagens de zero, sejam gerados, além de energia.

De acordo com a presente invenção, é determinado o número de ciclo C_M, em que M tem um valor mínimo. O C_M pode ser obtido numericamente de acordo com algoritmos genéricos conhecidos na técnica. Em algumas realizações da presente invenção, o número de ciclo C_M é determinado como o ciclo em que M atinge seu mínimo pela primeira vez.

De acordo com a presente invenção, os números de ciclo C_c característico são calculados a partir dos valores de C_M. Este cálculo é feito para corrigir a largura de qualquer janela usada para calcular a medida de aleatoriedade. Se, por exemplo, M for calculado como a entropia espectral conforme descrita acima, o C_c é obtido a partir de C_M subtraindo L:

Cc = Cm - L

Em que L seja metade da expansão da estrutura de dados W(C).

Dependendo do método usado para calcular a medida de aleatoriedade, outros métodos para obtenção de C_c a partir de C_M são evidentes a uma pessoa especialista na técnica. A presente invenção também compreende realizações em que o valor de C_M é usado como o valor de C_c, ou seja, em que C_c = C_M.

Valores C_c podem ser usados para calcular valores Ct (número limite de ciclos) que por sua vez pode ser usado para quantificação de ácido nucleico de forma que uma pessoa especialista na técnica (veja, por exemplo, JD Durtschi et

24/26 al. Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64). Em uma realização preferida da presente invenção, os valores Ct são calculados a partir de valores CC tomando-se os valores CC como valores Ct, ou seja, Ct = C_c.

De acordo com a presente invenção, determinar a quantidade relativa (R) de um ácido nucleico alvo (T) em relação a um ácido nucleico comparativo (#) pode ser feito calculando-se:

R = 2 (C_c(T) - C_c (#) )

Em que:

- R = proporção da quantidade de ácido nucleico alvo e ácido nucleico comparativo

- C_c(T) = valor C_c do ácido nucleico alvo

- c_c(#) = valor C_c do ácido nucleico comparativo

De forma alternativa, se as informações referentes à eficiência de amplificação E estiverem disponíveis, a proporção R pode ser calculada da seguinte forma:

R = (1 + E) (C_c(T) - C_c(#) )

De acordo com a presente invenção, a determinação das quantidades iniciais de cada ácido nucleico alvo na amostra, pela comparação de C_c de amostras alvo e padrão pode ser obtida da seguinte forma:

Construção de uma curva padrão a partir das amostras padrão (concentrações iniciais das amostras padrão em comparação com valores C_c das amostras padrão) e uso dessa curva padrão para derivar a concentração inicial do alvo do valor C_c do alvo. A curva padrão pode ser uma função linear de valores C_c em comparação com os logaritmos dos valores de concentração. No entanto, métodos alternativos conhecidos na técnica também são compreendidos pela presente invenção.

A presente invenção compreende métodos e meios que permitem realizar os métodos da invenção de forma automatizada, ou seja, com pouca ou nenhuma interação humana.

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Em uma realização preferida, a presente invenção é voltada para métodos e meios que permitem realizar os métodos da invenção sem interação humana. A presente invenção possibilita que uma pessoa especialista na técnica use a instrumentação disponível na técnica para realizar os métodos da invenção com pouca ou nenhuma interação humana. Em uma realização preferida, a presente invenção possibilita que uma pessoa especialista na técnica use a instrumentação disponível na técnica para realizar os métodos da invenção sem interação humana.

Meios legíveis por máquina

A presente invenção é voltada para meios legíveis por máquina com instruções armazenadas para conduzir as etapas (c) a (h) dos métodos da invenção.

Equipamento para análise de amostras de ácido nucleico

A presente invenção é voltada para um equipamento para a análise das amostras de ácido nucleico compreendendo um meio de memória legível por máquina contendo informações para condução dos métodos da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Amostras do DNA de Staphylococcus aureus (parte 5' do fragmento genômico 442 Sau3Al, 256 pares de bases, em pCR2.1-TOPO, clonado de S. aureus ATCC-25923) com um volume de 25 μΐ e concentrações de 10⁶, 10⁵, ΙΟ⁴, ΙΟ³, 10² cópias por 25 μΐ obtidas por diluição foram amplificadas em frascos separados por 40 ciclos de PCR em uma versão ABI 7099HT 2.3 PCR cycler em tempo real. Para a reação de PCR, foram usados Taqman Universal PCR mastermix de ABI e sondas Taqman FAMBlack Hole Quencher 1. A amplificação do produto foi seguida. Os sinais obtidos foram corrigidos para sinais de fundo pela modelação de uma função linear sobre o sinal obtido para os

26/26 primeiros 10 ciclos de PCR e subtraindo-se esta curva linear das curvas de amplificação obtidas para cada amostra. A Fig. 3 A mostra as curvas que foram obtidas. A eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) foi calculada para cada curva de amplificação usando-se a equação

Ê(C) = [Ϊ (C+l) / Ϊ (C) ] - - 1

Em que:

- Ê = eficiência de amplificação ciclo a ciclo

- C = número de ciclo

- Ϊ = intensidade de sinal corrigida para sinal de fundo

A entropia espectral foi calculada como uma medida de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) de cada curva de amplificação. Uma janela que move 9 pontos ao longo da curva Ê(C) foi calculada, refletindo o grau de aleatoriedade dos pontos de dados dentro da janela. O resultado é mostrado na Fig. 3 B: A entropia espectral M exibe mínima distinta para a eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) de cada reação de amplificação. Os valores derivados para CM são 20, 23, 26, 31 e 34 em concentrações de 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ e 10² cópias por 25 μΐ, respectivamente. Os valores de Cc, calculados com Cc = Cm - 4, são, portanto 16, 19, 22, 27 e 30 em concentrações de 10^s, ΙΟ⁵, ΙΟ⁴, 10³ e 10²cópias por 25 μΐ, respectivamente. Uma regressão linear dos valores C_c obtidos em comparação com os logaritmos dos números de cópia respectivos gerou um coeficiente de Pearson de R2 = 0,9908 indicando um bom encaixe dos resultados com uma relação linear conforme esperado.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

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1. MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO NUCLEICO ALVO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (b) amplificação de cada um de no mínimo uma amostra de ácidos nucleicos comparativos e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico comparativo, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo em que um termo de fundo é subtraído dos sinais registrados, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para cada ciclo de amplificação dos ácidos nucleicos alvo e comparativo, em que a eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê é calculada com o uso de

Ê(C) = [I (C+1) / 1(C)] - 1

Em que:

- Ê = eficiência de amplificação ciclo a ciclo

- C = número de ciclo

- I = intensidade de sinal corrigida para sinal de fundo, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para ácidos nucleicos alvo e comparativos, em que a medida de aleatoriedade que é calculada é selecionada do grupo que consiste de: entropia espectral, erro residual de encaixe de curva polinomial, contagem de zero, energia (RMS) cálculo após filtragem de banda alta,

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2/4 (f) identificação dos números de ciclo Cm em que M tenha seu valor mínimo para ácidos nucleicos alvo e comparativos, (g) cálculo dos números de ciclo característicos Cc dos valores de Cm, para corrigir para a largura de qualquer janela usada no cálculo da medida de aleatoriedade, (h) determinação das quantidades relativas de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra em relação aos ácidos nucleicos comparativos pela comparação de Cc de amostras alvo e comparativas.

2 . MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE NO MÍNIMO UM ÁCIDO nucleico ALVO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas:

(a) amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo contido na amostra e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo, (b) amplificação das amostras de uma série de diluições de um padrão de ácido nucleico com concentração conhecida e obtenção simultânea dos sinais correlacionados com a amplificação dos ácidos nucleicos nas amostras padrão, (c) correção dos sinais obtidos para sinais de fundo em que um termo de fundo é subtraído dos sinais registrados, (d) cálculo da eficiência de amplificação ciclo a ciclo ê(C) para cada ciclo de amplificação de amostras alvo e padrão, em que a eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê é calculada usando-se ê(C) = [I (C+1) / 1(C)] - 1

Em que:

- Ê = eficiência de amplificação ciclo a ciclo

- C = número de ciclo

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- I = intensidade de sinal corrigida para sinal de fundo, (e) cálculo de uma medição de aleatoriedade M da eficiência de amplificação ciclo a ciclo Ê(C) para amostras alvo e padrão, em que a medida de aleatoriedade calculada é selecionada do grupo que consiste de: entropia espectral, erro residual de encaixe de curva polinomial, contagem de zero, cálculo de energia (RMS) após filtragem de banda alta, (f) identificação dos números de ciclo Cm em que M tem seu valor mínimo para amostras alvo e padrão, (g) cálculo dos números de ciclo característicos Cc dos valores de Cm, para corrigir a largura das janelas usadas no cálculo da medida de aleatoriedade, (h) determinação das quantidades iniciais de cada um de no mínimo um ácido nucleico alvo na amostra, pela comparação de Cc de amostras alvo e padrão.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelos números de ciclo característicos Cc serem definidos como iguais aos valores Cm correspondentes (Cc = Cm) .

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelos sinais obtidos serem sinais de fluorescência.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela amplificação de ácido nucleico ser detectada com a ajuda de no mínimo um dos seguintes itens: sondas de hibridização marcadas com fluorescência, sondas de hibridização FRET, sinalizadores moleculares, iniciadores scorpions, iniciadores Lux, sondas TaqMan, corantes ligados a DNA.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por mais de um ácido nucleico alvo em uma amostra serem analisados ao mesmo tempo.

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7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por um ácido nucleico alvo em uma amostra ser analisado ao mesmo tempo.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das

5 reivindicações 1 a 7, caracterizado por todas as etapas serem realizadas de forma completamente automatizada, ou seja, sem interação humana.

9. MEIOS LEGÍVEIS POR MÁQUINA, caracterizados por compreender instruções armazenadas para conduzir as etapas

10 (c) a (h) dos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

10. EQUIPAMENTO PARA A ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender uma memória legível por máquina contendo informações para a condução dos

15 métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

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