ES2269614T3 - Cuantificacion de genes en tiempo real con estandares internos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de determinación de relaciones molares de unos primeros y unos segundos ácidos nucleicos diana presentes en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto los ácidos nucleicos diana con un indicador de ácido nucleico fluorescente, estando configurado el indicador para proporcionar una señal relacionada con la cantidad de indicador hibridado a los ácidos nucleicos diana, estando además configurado el indicador para discriminar los ácidos nucleicos diana en base a la temperatura de fusión, (b) iluminar la muestra de ensayo, (c) variar la temperatura de la muestra de ensayo, (d) controlar el cambio de fluorescencia a efectos de definir curvas de fusión fi para cada ácido nucleico diana, y (e) utilizar un algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica a efectos de determinar las relaciones molares de los ácidos nucleicos diana, encontrando simultáneamente dicho algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica un parámetro de suavizado s, la fracción de masa mi de cada uno de los ácidos nucleicos diana presentes en la muestra y los parámetros de temperatura de fusión y fracción de masa de las funciones restantes, y utilizándose un procedimiento de optimización e iteración unidos a efectos de minimizar en la que fr es la fluorescencia aproximada de la curva de fusión y en la que dicho procedimiento de optimización e iteración se repite hasta que una suma de las fracciones de masa es > 1 - e, siendo e un valor de tolerancia.

Description

Cuantificación de genes en tiempo real con estándares internos.

Antecedentes de la invención

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de síntesis de grandes cantidades de un segmento de ADN preseleccionado. La técnica es fundamental en biología molecular y es la primera técnica molecular práctica para el laboratorio clínico. La PCR se alcanza separando el ADN en sus dos cadenas complementarias, enlazando un cebador a cada cadena individual en el extremo del segmento determinado de ADN donde empezará la síntesis y añadiendo una ADN polimerasa a efectos de sintetizar la cadena complementaria sobre cada cadena individual con un cebador enlazado a la misma. El procedimiento se repite hasta haber sintetizado un número suficiente de copias del segmento de ADN seleccionado.

Durante una reacción PCR típica, se separa ADN de doble cadena en sus dos cadenas individuales aumentando la temperatura de la muestra que contiene el ADN hasta una temperatura de desnaturalización a la que se separan las dos cadenas de ADN (es decir, la "temperatura de fusión del ADN"), enfriándose a continuación la muestra hasta una temperatura inferior que permite que los cebadores específicos se unan (anillado) y tenga lugar la replicación (extensión). En las realizaciones ilustradas, en la reacción en cadena de la polimerasa se utiliza una polimerasa termoestable, tal como Taq ADN Polimerasa y derivados de la misma, incluyendo el fragmento Stoffel de Taq ADN Polimerasa y Klen Taq1 polimerasa (una variante deficiente en 5'-exonucleasa de la Taq polimerasa; ver patente USA Nº 5.436.149).

Entre los años 1991 y 1998, el número de presentaciones que utilizaban métodos PCR cuantitativos se multiplicaron por diez. Una de las razones principales para el aumento de la utilización de la PCR cuantitativa deriva del hecho de que la PCR presenta una sensibilidad mejor en cinco órdenes de magnitud que los mejores procedimientos de transferencia ("blotting"). Esta sensibilidad hace de la PCR una herramienta cuantitativa muy deseable. Sin embargo, la utilización de un sistema que sufre una amplificación exponencial no se ajusta idealmente a la cuantificación. Pequeñas diferencias entre los tamaños de las muestras pueden provocar grandes diferencias en los resultados cuando las mismas se amplifican mediante cuarenta duplicaciones.

PCR cinética

Puede considerarse que un perfil de reacción PCR típico presenta tres segmentos: una fase de latencia inicial, una fase de crecimiento exponencial y una meseta. La fase de latencia es principalmente un reflejo de la sensibilidad del instrumento y la señal de fondo del sistema de sonda utilizado para detectar el producto de la PCR. La fase de crecimiento exponencial empieza cuando se ha acumulado producto suficiente como para ser detectado por el instrumento. Durante esta fase "log", el desarrollo de la amplificación se describe mediante la ecuación T_{n} = T_{0}(E)_{n},
en la que T_{n} es la cantidad de secuencia diana en el ciclo n, T_{0} es la cantidad inicial de diana y E es la eficacia de amplificación. Finalmente, en la fase de meseta la eficacia de amplificación decrece con una rapidez extrema. El producto compite cada vez más eficazmente con los cebadores por el anillado y la cantidad de enzima se vuelve limitante. En la fase de meseta, la ecuación exponencial deja de cumplirse.

La mayoría de la información cuantitativa se determina en los ciclos exponenciales, pero los ciclos exponenciales típicamente comprenden sólo 4 ó 5 ciclos de 40. Con los procedimientos PCR tradicionales, encontrar estos ciclos informativos requiere que la reacción se desdoble en múltiples tubos de reacción que se someten a ensayo para determinar el producto de PCR tras un número variable de ciclos. Esto requiere someter a ensayo muchos tubos o tener una noción bastante aproximada del resultado antes de iniciar el experimento. Una vez que se determina la posición de la fase exponencial, la fase experimental puede compararse con estándares conocidos y puede calcularse el número de copias.

PCR competitiva cuantitativa

Los procedimientos de PCR competitiva cuantitativa fueron desarrollados con la intención de superar las dificultades asociadas a encontrar la fase exponencial de la reacción y para obtener una mayor precisión. Se construye una secuencia competidora que se amplifica utilizando los mismos cebadores que se utilizan para amplificar la secuencia diana. Se diferencian las secuencias competidora y diana, habitualmente por la longitud o la secuencia interna, y tras la amplificación se miden las cantidades relativas de competidor y de diana. Si el competidor y la diana se amplifican con una eficacia idéntica, su relación al final de la reacción será la misma que la relación que tenían al principio. Esto se cumple incluso en la fase de meseta siempre y cuando la eficacia de los dos decrezca a la misma velocidad. De este modo, encontrar la región exponencial deja de ser un problema. La disposición de estándares en los mismos tubos que contienen las dianas desconocidas permite un control adicional que no es posible llevar a cabo con métodos cinéticos. Por ejemplo, la adición del competidor antes de la purificación del ARNm controla las variaciones en la preparación de las muestras y la transcripción inversa.

La utilización de técnicas de PCR competitiva actualmente disponibles sigue presentando diversas deficiencias. En primer lugar, la secuencia competidor debe construirse de tal modo que sea tan similar como sea posible a la secuencia diana con respecto a la eficacia de amplificación, pero las dos secuencias deben poderse distinguir entre sí. Si el competidor presenta una secuencia demasiado similar a la secuencia diana, durante la PCR se forman heterodúplex que distorsionan la relación de producto con respecto al estándar.

Además, el competidor debe añadirse a la muestra desconocida en una concentración que se aproxime a la de la diana. Si un producto alcanza la meseta antes de que el otro supere la señal de fondo, de esa muestra no puede obtenerse ninguna información cuantitativa. Habitualmente, una muestra desconocida se divide y se mezcla con concentraciones diversas de competidor.

Se han manifestado otras preocupaciones con respecto a los procedimientos competitivos de cuantificación. Una crítica habitual es que, a pesar de todos los esfuerzos, la diana y el competidor juntos en una muestra pueden amplificarse con eficacias diferentes incluso si la diana y el competidor se amplifican con las mismas eficacias cuando se amplifican por separado (el control evidente). Cuando la diana y el competidor se combinan en un único recipiente y los reactivos son limitantes, las eficacias de las dos reacciones de amplificación pueden variar en diferentes velocidades. Las diferencias de longitud entre la diana y el competidor constituyen un punto esencial en este caso, dado que el producto más largo puede competir más eficazmente con los cebadores y puede verse más afectado por las limitaciones de reactivos. Estos dos problemas podrían solucionarse haciendo que la diana y el competidor sean suficientemente similares si no fuera por el problema de la formación de heterodúplex durante la reacción de PCR.

PCR cuantitativa en tiempo real

Actualmente, los desarrollos en la instrumentación han hecho posible el control en tiempo real de las reacciones PCR y, de este modo, han hacho que el problema de encontrar la fase "log" de la reacción sea trivial.

Puede llevarse a cabo termociclación utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia, incluyendo la utilización de PCR de ciclación rápida. Las técnicas de ciclación rápida son posibles mediante la utilización de recipientes de muestra con una relación área de superficie/volumen elevada, tal como tubos capilares. La utilización de recipientes de muestra con una relación área de superficie/volumen elevada permite una respuesta rápida a la temperatura y una homogeneización de la temperatura a través de la muestra biológica. Además, la mayor homogeneidad de temperatura aumenta la precisión de todas las técnicas analíticas utilizadas para controlar la PCR durante la amplificación.

Según una realización ilustrada de la presente invención, la amplificación de una secuencia de ácido nucleico se lleva a cabo por ciclación térmica de la secuencia de ácido nucleico en presencia de una ADN polimerasa termoestable, utilizando el dispositivo y las técnicas descritos en la patente USA Nº 5.455.175. Según la presente invención, la amplificación por PCR de una o más regiones diana de una muestra de ADN se lleva a cabo mientras se controla la reacción por fluorescencia.

La primera utilización de control por fluorescencia en cada ciclo para PCR cuantitativa fue desarrollada por Higuchi y otros, "Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences" ("Amplificación y detección simultáneas de secuencias de ADN específicas"), Bio. Technology, 10:413-417, 1992, con utilización de bromuro de etidio como entidad fluorescente. La fluorescencia se alcanzó una vez por ciclo para una medida relativa de la concentración de producto. El ciclo en el que pudo observarse fluorescencia por primera vez aparecía por encima de la fluorescencia de fondo (el umbral) en correlación con el número de copia inicial, permitiendo de este modo la construcción de una curva estándar. Poco después se desarrolló un sistema de detección por fluorescencia basado en sonda dependiente de la actividad 5'-exonucleasa de la polimerasa. Esto mejoró el método cinético en tiempo real añadiendo detección específica de secuencia.

Alternativamente, puede llevarse a cabo una amplificación por PCR de una o más regiones diana de una muestra de ADN en presencia de sondas de hibridación marcadas fluorescentemente, sintetizándose las sondas a efectos de hibridarse a un lugar específico presente en una región diana amplificada del ADN. En una realización ilustrada, el sistema de sonda de hibridación comprende dos sondas de oligonucleótido que se hibridan a regiones adyacentes de una secuencia de ADN, estando marcada cada sonda de oligonucleótido con un respectivo miembro de un par de transferencia de energía fluorescente. En esta realización, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana en una muestra biológica se detecta midiendo la transferencia de energía fluorescente entre los dos oligonucleótidos marcados.

Esta instrumentación y estas técnicas de control por fluorescencia han facilitado significativamente la PCR cinética en comparación con la PCR competitiva tradicional. Más particularmente, la PCR en tiempo real ha aumentado en gran medida la facilidad, la exactitud y la precisión de la PCR cuantitativa permitiendo la observación de la concentración de producto PCR en cada ciclo. En las realizaciones ilustradas de la presente invención, las reacciones PCR se llevan a cabo utilizando el LightCycler® (Roche Diagnostics), un instrumento de PCR en tiempo real que combina un ciclador térmico rápido con un fluorímetro. Utilizando este dispositivo se detecta el producto PCR por fluorescencia y no se requiere ningún procesamiento adicional de la muestra ni conjuntos de membrana, geles, capilares o herramientas analíticas adicionales. En la aplicación de la presente invención puede utilizarse otra instrumentación de PCR tal como se conoce en la técnica.

El documento Crockett, A.O. y Wittwer, C.T. (Anal. Biochem. (2001), Vol. 290, páginas 89-97) da a conocer las utilizaciones de oligonucleótidos marcados fluorescentemente para PCR en tiempo real utilizando la extinción inherente de los nucleótidos de desoxiguanosina. El documento no muestra el análisis de curvas de fusión a través de algoritmos a efectos de determinar las relaciones entre las diferentes secuencias de ácidos nucleicos diana.

Características de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de ácido nucleico para la determinación de la concentración o fracción de masa inicial de un ácido nucleico diana presente en una muestra. Más particularmente, un primer aspecto de la invención da a conocer un procedimiento de determinación de las relaciones molares de unos primeros y unos segundos ácidos nucleicos diana presentes en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) poner en contacto los ácidos nucleicos diana con un indicador de ácido nucleico fluorescente, estando configurado el indicador para proporcionar una señal relacionada con la cantidad de indicador hibridado a los ácidos nucleicos diana, estando además configurado el indicador para discriminar los ácidos nucleicos diana en base a la temperatura de fusión,

(b) iluminar la muestra de ensayo,

(c) variar la temperatura de la muestra de ensayo,

(d) controlar el cambio de fluorescencia a efectos de definir curvas de fusión f_{i} para cada ácido nucleico diana, y

(e) utilizar un algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica a efectos de determinar las relaciones molares de los ácidos nucleicos diana, encontrando simultáneamente dicho algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica un parámetro de suavizado \sigma, la fracción de masa m_{i} de cada uno de los ácidos nucleicos diana presentes en la muestra y los parámetros de temperatura de fusión y fracción de masa de las funciones restantes, y utilizándose un procedimiento acoplado de optimización e iteración a efectos de minimizar

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en la que f_{r} es la fluorescencia aproximada de la curva de fusión y en la que dicho procedimiento de optimización e iteración se repite hasta que una suma de las fracciones de masa es > 1 - \varepsilon, siendo \varepsilon un valor de tolerancia.

Un segundo aspecto de la invención da a conocer un procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico diana presente en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) combinar en un único recipiente de reacción, por lo menos, una parte de dicha muestra, una polimerasa termoestable, una concentración conocida de un ácido nucleico competidor, un par de cebadores de oligonucleótido PCR y una sonda de oligonucleótido; en el que se configura dicho par de cebadores de oligonucleótido PCR a efectos de amplificar un segmento seleccionado del ácido nucleico diana y del ácido nucleico competidor; en el que dicha sonda de oligonucleótido se hibrida a la región amplificada del ácido nucleico competidor o del ácido nucleico diana; en el que dicho ácido nucleico competidor presenta una única sección que tiene una secuencia diferente con respecto a una región correspondiente del ácido nucleico diana; y en el que el ácido nucleico competidor y el ácido nucleico diana se amplifican esencialmente con una eficacia idéntica; en el que se marca dicha sonda de oligonucleótido con un primer fluoróforo y la misma está configurada a efectos de hibridarse a la sección única del ácido nucleico competidor y a la región correspondiente del ácido nucleico diana; en el que la hibridación de la sonda de oligonucleótido, por lo menos, a uno de sus respectivos ácidos nucleicos diana complementarios provoca un cambio en la magnitud de fluorescencia del fluoróforo;

(b) amplificar el segmento seleccionado de los ácidos nucleicos diana y competidor;

(c) iluminar la muestra biológica y controlar el cambio de fluorescencia del primer fluoróforo; y

(d) llevar a cabo un análisis de curvas de fusión en el que el análisis de curvas de fusión incluye la utilización de un algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica, encontrando simultáneamente dicho algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica un parámetro de suavizado \sigma, la fracción de masa m_{i} de cada uno de los ácidos nucleicos diana presentes en la muestra, y los parámetros de temperatura de fusión y fracción de masa de las funciones restantes, y utilizándose un procedimiento acoplado de optimización e iteración a efectos de minimizar

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en la que f_{r} es la fluorescencia aproximada de la curva de fusión y en la que dicho procedimiento de optimización e iteración se repite hasta que una suma de las fracciones de masa es > 1 - \varepsilon, siendo \varepsilon un valor de tolerancia.

En una realización ilustrada, la secuencia de ácido nucleico competidor se prepara de tal modo que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de ácido nucleico diana, a excepción de una única sección situada en una posición interna de la secuencia de ácido nucleico competidor. La sección única presenta la misma composición global de nucleótidos que la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico diana, pero con una secuencia sustancialmente diferente de la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico diana. En el presente documento, el término sustancialmente diferente se utiliza para designar que una sonda complementaria a la región única del competidor no experimentará una hibridación cruzada en la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico diana.

En otra realización, la sección única de la secuencia de ácido nucleico competidor difiere de la secuencia de ácido nucleico diana únicamente en un par de bases, de modo similar a una mutación puntual. En otra realización, la sección única de la secuencia de ácido nucleico competidor puede ser bastante diferente de la correspondiente región de la diana, variando en longitud y/o composición, pero las secuencias de ácido nucleico competidor y diana se amplifican esencialmente con la misma eficacia. Estas eficacias de amplificación pueden determinarse sobre la base del contenido por CG y de experimentos de rutina.

La sonda de anclado se configura a efectos de hibridarse a la sección adyacente a la sección única del ácido nucleico competidor y a la sección adyacente a la región correspondiente del ácido nucleico diana correspondiente a la región única de la secuencia de ácido nucleico competidor. La sonda competidora está configurada a efectos de hibridarse a la región única de la secuencia de ácido nucleico competidor, y la sonda diana está configurada a efectos de hibridarse a la región de la secuencia de ácido nucleico diana correspondiente a la región única de la secuencia de ácido nucleico competidor. Correspondientemente, cuando las sondas de anclado, diana y competidora se hibridan a sus secuencias de ácido nucleico diana respectivamente complementarias y secuencias de ácido nucleico competidor, el fluoróforo donador y el primer fluoróforo aceptor, así como el fluoróforo donador y el segundo fluoróforo aceptor se colocan en una relación de transferencia de energía de resonancia. En consecuencia, la medición de fluorescencia a partir del fluoróforo aceptor puede utilizarse para determinar las concentraciones relativas de la secuencia de ácido nucleico diana y la secuencia de ácido nucleico competidor. En las realizaciones ilustradas, tanto el primer fluoróforo como el segundo fluoróforo aceptan transferencia de energía a partir del fluoróforo donador, pero los dos fluoróforos aceptores emiten energía fluorescente en longitudes de onda diferentes. De este modo, las concentraciones de la secuencia de ácido nucleico diana y la secuencia de ácido nucleico competidor pueden medirse a la vez.

En otra realización, se utiliza un oligonucleótido marcado una vez y se obtiene la información deseada mediante análisis de curvas de fusión.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de cuantificación de la concentración inicial de secuencia de ácido nucleico diana sobre la base del desplazamiento de ciclo entre competidor y diana. Asumiendo que la eficacia de amplificación es esencialmente idéntica para la diana y el competidor, logC_{0} = logE(\Deltan) + logT_{0}, en la que C_{0} es la cantidad inicial de competidor, E es la eficacia promedio, \Deltan es el desplazamiento de ciclo entre competidor y diana, y T_{0} es la cantidad inicial de diana. Dado que esta ecuación presenta una forma y = mx + b, un gráfico de la concentración inicial de competidor en función del desplazamiento de ciclo entre competidor y diana proporcionará una recta con una pendiente igual al logaritmo de la eficacia y una intersección con el eje de coordenadas "y" igual al logaritmo de la concentración inicial de diana. Dado que el competidor puede disponerse en una variedad de concentraciones iniciales conocidas, la concentración inicial de la diana puede determinarse con relativa facilidad.

Una aplicación particularmente útil para cuantificación de ADN puede consistir en la determinación de los equivalentes genómicos de virus particulares en cualquier muestra clínica determinada. Diversos virus exhiben sus efectos patológicos en diversas etapas de su ciclo de replicación, y la cantidad de virus en las células huésped puede servir como indicador del progreso y la prognosis de la infección.

En un aspecto preferente de la presente invención, se da a conocer un procedimiento de determinación de relaciones molares de unos primeros y unos segundos ácidos nucleicos diana presentes en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de poner en contacto los ácidos nucleicos diana con un indicador de ácido nucleico fluorescente, estando configurado el indicador para proporcionar una señal relacionada con la cantidad de indicador hibridado a los ácidos nucleicos diana, estando además configurado el indicador para discriminar los ácidos nucleicos diana en base a la temperatura de fusión, iluminar la muestra de ensayo, controlar el cambio de fluorescencia a efectos de generar una curva de fusión y utilizar el algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica a efectos de determinar la fracción de masa de los ácidos nucleicos diana. El estándar interno puede consistir en un competidor artificial o un alelo endógeno diferente de la secuencia de ácido nucleico diana en una o más bases. Si se añade una cantidad conocida del estándar interno a la muestra, puede calcularse el número de copias inicial de la secuencia de ácido nucleico diana a partir de la fracción o relación de masa frente a la cantidad conocida de estándar interno. Las aplicaciones particularmente útiles para este tipo de cuantificación pueden consistir en la determinación de frecuencias de alelos en muestras de población combinada, el control de expresión diferencial de alelos en diversos tipos de células y tejidos, el control de la amplificación de genes, o el borrado, utilizando el desequilibrio del número de copias frente al número de copias de un pseudogen, y la obtención de la relación entre diferentes tipos de célula en una muestra de tejido mixta, tal como en muestras de tejido diseccionado en el margen de pacientes de cáncer.

Tras la consideración de la descripción detallada siguiente de las realizaciones ilustradas que ejemplifican el mejor modo de llevar a cabo la invención se harán evidentes características adicionales para los expertos en la materia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación en diagrama del diseño mecánico y óptico del LightCycler®;

las figuras 2a-f son representaciones en diagrama de los diversos procedimientos basados en fluorescencia para la detección de productos de amplificación. Las figuras 2a-b representan la detección de productos amplificados mediante colorantes específicos de doble cadena. Las figuras 2c-d representan la estrategia Taq Man, en la que la síntesis del producto amplificado causa emisión de donador. Las figuras 2e-f representan el procedimiento de sonda de hibridación, en el que dos sondas marcadas por separado se hibridan a regiones adyacentes de una secuencia de ácido nucleico, provocando transferencia de energía de resonancia fluorescente;

las figuras 3a-b representan curvas de estándar externo típicas utilizando datos de hibridación. La figura 3a es un gráfico del logaritmo de la relación de fluorescencia en función del número de ciclo. La figura 3b es un gráfico del logaritmo del número de copias en función del máximo de la segunda derivada;

las figuras 4a-b representan una curva estándar típica generada representando la fluorescencia en función de la temperatura (figura 4a) y la derivada de dicha curva en función de la temperatura (figura 4b), con mutante homozigótico (····), tipo salvaje homozigótico (-\bullet-), mutante heterozigótico (-) y sin ADN (- -);

las figuras 5a-c representan el análisis de fusión de diversos ácidos nucleicos. La figura 5a muestra picos de fusión generados a partir de una curva de fusión. El área bajo cada curva se calcula por regresión no lineal a efectos de ajustar los datos de picos de fusión a una curva gaussiana. La figura 5b muestra diversas curvas de amplificación en un gráfico del logaritmo de la fluorescencia en función del número de ciclo. La figura 5c muestra los datos de la figura 5b convertidos en una curva logC_{0} = logE(\Deltan) + logT_{0} (la línea continua muestra los puntos de intersección a partir de los datos de la figura 5b y la línea discontinua es la regresión lineal);

la figura 6 representa las secuencias de nucleótido del fragmento de ADN competitivo para HPV 16 y las sondas diana, competitiva y de anclado;

la figura 7 representa las secuencias de nucleótido de HER-2/neu (diana), su competidor y las sondas indicadora y de anclado; se muestran las temperaturas de fusión previstas Tm de la sonda indicadora hibridada a la diana o al competidor;

la figura 8 es una representación en diagrama de la estrategia utilizada para crear el fragmento de ADN competitivo para HPV 16;

la figura 9 es una representación en diagrama de las sondas de hibridación utilizadas para detectar los estándares internos de cuantificación y el modelo artificial de HPV 16;

la figura 10 es una representación gráfica de la eficacia de detección del Estándar Interno de Cuantificación (\blacktriangle) y del modelo artificial de HPV 16 (\Box). Los datos se presentan como el promedio, por lo menos, de tres puntos de datos separados con desviaciones estándar para cada uno de ellos;

las figuras 11a-b ilustran una reacción de control interno típica que muestra datos de fluorescencia a partir de una reacción de sonda de hibridación controlada internamente. En la figura 11a se representan estándares de cuantificación interna a concentraciones de 1 x 10^{9} (1); 5 x 10^{8} (2); 1 x 10^{8} (3); 5 x 10^{7} (4); 1 x 10^{7} (5); 5 x 10^{6} (6); 1 x 10^{6} (7); 5 x 10^{5} (8); 1 x 10^{5} (9). En la figura 11b se muestra HPV 16 a 1 x 10^{6} en cada una de las muestras;

las figuras 12a-c son representaciones gráficas de la fluorescencia detectada en función del número de ciclo para el estándar interno de cuantificación (triángulos huecos) y HPV 16 (cuadrados llenos). En cada caso, HPV 16 se encuentra en una concentración inicial de modelo de 1 x 10^{4}. El estándar interno de cuantificación se encuentra en concentraciones iniciales de modelo de 1 x 10^{5} (figura 12a), 1 x 10^{4} (figura 12b) y 1 x 10^{3} (figura 12c);

la figura 13 es una representación gráfica del logaritmo del número de copias del competidor inicial en función de la diferencia al cruzar el umbral (delta C.T.). Un gráfico de reacción de estándar interno de cuantificación con diferentes concentraciones de modelo artificial de HPV 16. Las concentraciones iniciales de modelo HPV 16 son: 1 x 10^{2} (círculos huecos), 1 x 10^{3} (triángulos huecos) y 1 x 10^{4} (cuadrados huecos), 1 x 10^{5} (círculos llenos), 1 x 10^{6} (triángulos llenos). Las barras de error se determinan a partir de la desviación estándar obtenida a partir de cuatro datos puntuales de reacción independientes. El intervalo de confianza del 95% en cada relación de competidor respecto a diana se indica en el eje x;

la figura 14 representa la correlación entre el área del pico de fusión y la concentración de producto para dianas mutantes y tipo salvaje HER-2/neu detectadas mediante sondas de hibridación y utilizando software de análisis de curvas de fusión. Se mezclaron modelos artificiales de oligonucleótido con sondas a varias concentraciones y se determinó el área del pico de fusión utilizando el software de análisis de curvas de fusión LightCycler®;

la figura 15 representa la cuantificación de dianas mutantes (M) y tipo salvaje (WT) HER-2/neu mediante análisis de curvas de fusión posterior a amplificación por PCR. Se amplificaron modelos mutantes y tipo salvaje, tanto individualmente como mezclados a diferentes relaciones (relación de entrada), para 40 ciclos de PCR y se generaron curvas de fusión a partir de los productos de PCR. Las curvas de fusión se analizaron mediante el algoritmo TMBSP a efectos de determinar las relaciones de productos de PCR mutantes y tipo salvaje (relación de salida);

las figuras 16a-d son gráficos de análisis por fusión de una muestra tipo salvaje (WT) (--), una muestra mutante (Mut) (····) y una mezcla (Mix) de alelos salvajes y mutantes en una relación 50:50 (- - - -), detectados únicamente mediante la sonda Sensor (figuras 16a, y b), o con las sondas de par FRET (figuras 16c, y d); las figuras 16a y c muestran datos de fusión (fluorescencia en función de temperatura) y las figuras 16b y d muestran los datos de picos de fusión (primera derivada negativa -dF/dT);

las figuras 17a-d son gráficos de análisis por fusión de una muestra tipo salvaje (WT) (--), una muestra mutante (Mut) (····) y una mezcla (Mix) de alelos salvajes y mutantes en una relación 95:5 (- - - -), detectados únicamente mediante la sonda Sensor (figuras 17a, y b), o con las sondas de par FRET (figuras 17c, y d); las figuras 17a y c muestran datos de fusión (fluorescencia en función de temperatura) y las figuras 17b y d muestran los datos de picos de fusión (primera derivada negativa -dF/dT);

la figura 18 es un diagrama de flujo del algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica;

la figura 19 es un gráfico de la entrada (la fracción real de alelo tipo salvaje en las muestras) en función de la diferencia entre la entrada y la salida (las fracciones estimadas por el software de análisis). Se muestran los resultados del algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (círculo hueco) y del software de relación de áreas de picos de fusión (círculo lleno);

la figura 20 es una representación gráfica de una curva de fusión modelo que presenta tres fases: la "fase anillada" no lineal, la transición de fusión (designada "fase de fusión") y la "fase fundida" lineal. El algoritmo de aproximación de función de base se basa en este modelo para aproximar la curva de fusión.

Descripción detallada de la invención

La presente invención permite la cuantificación de analitos, incluyendo analitos con una concentración demasiado baja para ser cuantificados utilizando técnicas estándar. El procedimiento utiliza una reacción PCR competitiva con un control en tiempo real durante la amplificación o análisis de curva de fusión, y la presencia de un estándar interno como medio para calcular la concentración inicial de la secuencia diana. Hasta el presente, todas las aplicaciones de cuantificación por PCR en tiempo real se han limitado a la cuantificación en relación con una curva de estándar externo. Aunque esta técnica resulta muy útil, le falta un control para las diferencias de tubo a tubo en eficacia de PCR. Esta limitación de la cuantificación con estándares externos ha sido superada por los procedimientos de PCR competitiva cuantitativa. En estas técnicas, un competidor con los mismos lugares de cebador que la diana pero con una secuencia interna distinta se inyecta en una concentración conocida en una muestra desconocida. Sin embargo, no se dispone de ninguna versión en tiempo real de este procedimiento.

La presente exposición se refiere a la utilización de procedimientos en tiempo real para diferenciar la diana del competidor, permitiendo la cuantificación génica mediante referencia a un estándar interno. Los procedimientos proporcionan a los investigadores las ventajas de un sistema de PCR homogéneo en tiempo real, a la vez que proporciona el control adicional que permiten los estándares internos.

Según una realización, se describe un procedimiento para llevar a cabo PCR competitiva cuantitativa en tiempo real utilizando un competidor con un único lugar de enlace de sonda de hibridación. El competidor se distinguirá de la diana utilizando sondas de hibridación coloreadas distintamente para la diana y para el competidor.

En otra realización, se describe un procedimiento para llevar a cabo PCR competitiva cuantitativa en tiempo real utilizando un competidor que difiere de la diana únicamente por una base. La diana y el competidor se distinguirán entre sí por la fusión diferencial de sondas de hibridación marcadas fluorescentemente.

La figura 1 muestra una representación esquemática de una realización (400) del LightCycler®, un ciclador térmico que puede utilizarse de acuerdo con los procedimientos descritos. Tal como se muestra en la figura 1, el aire entra a través de una abertura (470) y generalmente sigue el recorrido indicado por las líneas (472). La temperatura del aire, y de este modo la temperatura del recipiente de muestra (450), se controla con el cartucho de calentamiento (474), que está dispuesto dentro de un conducto central (476), y con el ventilador (498), que se dispone a efectos de desplazar el aire en el recorrido (472) indicado. El ventilador se acciona a través de un eje (496) y un motor (494). El ventilador (498) empuja el aire hacia adentro de la abertura (470) y hacia afuera a través de los puertos de evacuación (478). En la realización ilustrada, se disponen veinticuatro recipientes de muestra (450) (dos de los cuales se representan en la figura 1) simétricamente alrededor del cartucho de calentamiento (474) y el conducto central (476). Los recipientes de muestra (450) se alojan en manguitos (452) en un carro circular (480). El carro (480) se posiciona mediante un motor paso a paso (488) dotado de un engranaje transmisor (484) conectado al motor (488) a través de un eje (486). La fluorescencia de cada recipiente de muestra se obtiene por el conjunto fotográfico (460), que incluye una fuente de radiación de excitación (468) y fotodetectores (464) y (466). Pueden encontrarse más detalles del LightCycler® en la solicitud de patente USA Nº 08/869.275. Se debe observar que esta realización descrita es únicamente ejemplar y que pueden utilizarse otros cicladores térmicos dentro del alcance de la invención.

A título de ejemplo, amplificar un analito por PCR comprende las etapas de colocar una muestra biológica que comprende la secuencia de ácido nucleico diana en un recipiente capilar, aumentar la temperatura de la muestra biológica desde una primera temperatura ("temperatura de anillado") hasta una segunda temperatura ("temperatura de desnaturalización"), siendo la segunda temperatura más alta que la primera, ilustrativamente, por lo menos, 15ºC más alta que la primera temperatura, mantener la muestra biológica a la segunda temperatura durante un periodo de tiempo predeterminado, disminuir la temperatura de la muestra biológica desde la segunda temperatura hasta, por lo menos, la primera temperatura y mantener la muestra biológica a una temperatura, por lo menos, tan baja como la primera temperatura durante un periodo de tiempo predeterminado. A continuación, la temperatura de la muestra biológica se vuelve a aumentar hasta la segunda temperatura y la muestra biológica se termocicla un número predeterminado de veces.

En una realización, el procedimiento de amplificar una secuencia de ADN comprende un perfil de dos temperaturas en el que las muestras se ciclan a través de una temperatura de desnaturalización y una temperatura de anillado por un número predeterminado de repeticiones. Pueden utilizarse otros perfiles de PCR dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, la reacción PCR también puede llevarse a cabo utilizando un perfil de tres temperaturas en el que las muestras se ciclan a través de una temperatura de desnaturalización, una temperatura de anillado y una temperatura de alargamiento durante un número predeterminado de repeticiones.

En las realizaciones ilustradas, la reacción PCR se lleva a cabo en presencia de una entidad fluorescente a efectos de permitir un control en tiempo real de la reacción. Se han dado a conocer diversos formatos de detección en base a señalización fluorescente dependiente de la diana que permiten el control continuo de la generación de productos de amplificación. Ver, por ejemplo, Wittwer y otros, "Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification" ("Control fluorescente continuo de amplificación de ADN de ciclo rápido"), BioTechiques, Vol. 22, No. 1, 130-138, 1997). Estos formatos de detección incluyen los siguientes, sin limitarse a los mismos:

1. Utilización de compuestos reconocedores de ADN de doble cadena fluorescentes (ver figuras 2a-b)

Dado que la cantidad de producto de amplificación de doble cadena habitualmente es mayor que la cantidad de ácido nucleico originalmente presente en la muestra a analizar, pueden utilizarse colorantes específicos de ADN de doble cadena que, tras la excitación con una longitud de onda apropiada, muestran una mayor fluorescencia únicamente si están enlazados a ADN de doble cadena (figura 2b). Preferentemente, sólo se utilizan colorantes tales como SYBR^{TM} Green I, que no afectan a la eficacia de la reacción PCR.

2. Principio Taq Man (ver figuras 2c-d)

A efectos de detectar el producto de amplificación, se utiliza una sonda de hibridación de cadena simple. La sonda de hibridación está marcada con una entidad fluorescente cuya emisión de fluorescencia es extinguida por una segunda marca situada en la misma sonda y que actúa como compuesto de extinción. Durante la etapa de anillado de la reacción PCR, la sonda se hibrida a su secuencia diana (figura 2c) y, a continuación, durante la extensión del cebador, una polimerasa de ADN que presenta actividad 5'-3'-exonucleasa digiere la sonda de hibridación en trozos más pequeños, separando la entidad fluorescente del compuesto de extinción (figura 2d). Tras una excitación apropiada, la emisión de fluorescencia puede controlarse como un indicador del producto de amplificación que se acumula.

3. Balizas moleculares ("molecular beacons")

Similarmente a las sondas Taq Man, se marca un oligonucleótido de baliza molecular con un compuesto fluorescente y un compuesto de extinción que, debido a la estructura secundaria de la molécula, se encuentran muy cerca entre sí. Tras enlazarse al ADN diana se rompe el enlace de hidrógeno intramolecular y el compuesto fluorescente situado en un extremo de la sonda se separa del compuesto de extinción, situado en el extremo opuesto de la sonda. Ver, por ejemplo, la patente USA Nº 5.118.801.

4. FRET aumentado tras la hibridación (ver figuras 2e-f)

Para este formato de detección, se utilizan dos sondas de hibridación de oligonucleótido, cada una de ellas marcadas con un resto fluorescente, las cuales son capaces de hibridarse a regiones adyacentes pero no superpuestas de una cadena del producto de amplificación. Preferentemente, un oligonucleótido se marca en el extremo 5' y el segundo oligonucleótido se marca en el extremo 3'. Una vez hibridadas al ADN diana, las dos marcas fluorescentes se ponen en estrecho contacto, de tal modo que puede tener lugar una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre los dos restos fluorescentes (figura 2f). En consecuencia, la hibridación puede controlarse a través de la excitación del resto donador y la medición posterior de la emisión de fluorescencia del segundo resto aceptor.

En una realización similar, sólo se utiliza una sonda marcada fluorescentemente que, junto con un cebador apropiadamente marcado, también puede servir como par FRET específico. Ver Bernard y otros, "Integrated Amplification and Detection of the C677T Point Mutation in the Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene by Fluorescence Resonance Energy Transfer and Probe melting Curves" ("amplificación y detección integradas de la mutación puntual C677T en el gen de la metilentetrahidrofolato reductasa"), Anal. Biochem. 255, p. 101-107 (1998).

Habitualmente, las sondas de hibridación tal como se dan a conocer presentan secuencias completamente idénticas o exactamente complementarias con respecto a la secuencia del analito. Sin embargo, también entra dentro del alcance de la invención que las sondas contengan uno o diversos desparejamientos siempre y cuando las sondas puedan hibridarse al analito en condiciones apropiadas de hibridación. En cualquier caso, se ha probado que resulta particularmente ventajoso que la identidad o complementariedad de secuencia sea del 100% a lo largo de un intervalo, por lo menos, de 10 residuos contiguos. También se ha probado ventajoso que la longitud de la sonda no exceda de 100 nucleótidos, preferentemente no sea superior a 40 nucleótidos.

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia tiene lugar entre dos fluoróforos cuando se encuentran en proximidad física entre sí y el espectro de emisión de un fluoróforo se superpone al espectro de excitación del otro. La tasa de transferencia de energía es

(8,785E^{-5})(t^{-1})(k^{2})(n^{-4})(q_{D})(R^{-6})(J_{DA}),

donde:

t = tiempo de vida del estado excitado del donador en ausencia del aceptor;

k^{2} = un factor de orientación entre el donador y el aceptor;

n = índice de refracción de la luz visible en el medio que interviene;

q_{D} = eficacia cuántica del donador en ausencia del aceptor;

R = distancia entre el donador y el aceptor medida en Angstroms; y

J_{DA} = integral de (F_{D})(e_{A})(W^{4}) con respecto a W en todas las longitudes de onda superpuestas, con:

F_{D} = espectro de fluorescencia normalizado de pico del donador;

e_{A} = coeficiente de absorción molar del aceptor (M^{-1}cm^{-1}); y

W^{4} = longitud de onda (nm).

Para cualquier donador y aceptor determinados, puede calcularse una distancia en la que tiene lugar una transferencia de energía de resonancia del 50% y se abrevia R_{0}. Dado que la tasa de transferencia de energía de resonancia depende de la 6ª potencia de la distancia entre donador y aceptor, la transferencia de energía de resonancia cambia rápidamente a medida que R varía desde R_{0}. Para R_{0}, tiene lugar muy poca transferencia de energía de resonancia, y para 0,5 R_{0}, la eficacia de la transferencia es prácticamente total a menos que predominen otras formas de desexcitación.

Los oligonucleótidos marcados fluorescentemente se diseñan para que se hibriden a la misma cadena de una secuencia de ADN de tal modo que los fluoróforos donador y aceptor están separados por una distancia comprendida entre aproximadamente 0 y aproximadamente 25 nucleótidos, más preferentemente de aproximadamente 0-5 nucleótidos y de la forma más preferente de aproximadamente 0-2 nucleótidos. Una separación particularmente preferente entre los fluoróforos donador y aceptor es de 1 nucleótido.

Cuando uno de los oligonucleótidos marcados funciona también como un cebador PCR ("cebador de sonda"), las dos entidades fluorescentes se encuentran en cadenas opuestas de una secuencia de ADN. En esta realización, los fluoróforos donador y aceptor son preferentemente de aproximadamente 0-15 nucleótidos y más preferentemente de aproximadamente 4-6 nucleótidos.

A menos que los dos oligonucleótidos marcados fluorescentemente estén hibridados a su secuencia complementaria del ADN diana, la distancia entre el fluoróforo donador y el fluoróforo aceptor generalmente es demasiado grande para que ocurra una transferencia de energía de resonancia. De este modo, en ausencia de hibridación, el fluoróforo aceptor y el fluoróforo donador no se encuentran en una relación de transferencia de energía de resonancia y la excitación del fluoróforo donador no producirá una fluorescencia aumentada detectable por parte del fluoróforo aceptor.

Los pares fluoróforos aceptables para su utilización como pares de transferencia de energía de resonancia fluorescente son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, sin limitarse a los mismos, fluoresceína/rodamina, ficoeritrina/Cy7, fluoresceína/Cy5, fluoresceína/Cy5.5, fluoresceína/LCRed 640 o fluoresceína/LCRed 705. LCRed 640 y LCRed 705 han sido descritos previamente en la publicación de patente europea EP 0 567 622.

La estabilidad térmica de un dúplex de ADN depende de la longitud del dúplex, contenido en CG y apareamiento de bases de Watson y Crick. Los cambios en el apareamiento de bases de Watson y Crick desestabilizan un dúplex en diversos grados en función de la longitud del dúplex desparejado, el desparejamiento particular, la posición del desparejamiento y los pares de bases vecinos. Correspondientemente, la identidad porcentual de las sondas de hibridación con respecto a su secuencia complementaria diana afecta directamente a la temperatura a la que la sonda de hibridación se separará (fundirá) de la cadena complementaria. Cuanto mayor es la diferencia entre la sonda y la secuencia complementaria diana, menor es la temperatura requerida para separar las cadenas en hibridación.

5. Oligonucleótidos marcados una vez

Los oligonucleótidos marcados una vez son oligonucleótidos con una marcación fluorescente sencilla. Los oligonucleótidos marcados una vez pueden utilizarse independientemente con respecto a cualquier otra entidad fluorescente, y el cambio de fluorescencia tiene lugar debido a la secuencia de las bases situadas en la cadena complementaria. Ver solicitud de patente USA Nº 09/927.842, presentada el 10 de agosto de 2001. Dependiendo de diversos factores, tal como la entidad fluorescente utilizada y la secuencia de la cadena complementaria, la hibridación puede dar lugar a una disminución o un aumento de la fluorescencia.

Sistemas de sonda para el LightCycler®

Se ha desarrollado un sistema de sonda específico a la secuencia para el LightCycler® para ser utilizado en la presente invención, en el que dos fluoróforos de un par FRET se acercan por hibridación durante la PCR, de tal modo que tiene lugar una transferencia de energía de resonancia (ver figuras 2e-f). Se diseñan dos sondas de hibridación adyacentes para hibridizarse entre los cebadores PCR, uno marcado en el extremo 3' con un fluoróforo donador y el otro marcado en el extremo 5' con un fluoróforo aceptor. A medida que el producto se acumula durante la PCR, las sondas se hibridizan una al lado de la otra durante el segmento de anillado de cada ciclo. La transferencia de energía de fluorescencia al colorante aceptor aumenta con la hibridación y se representa como relación de fluorescencia aceptor/donador. Para la cuantificación, la fluorescencia preferentemente se controla una vez en cada ciclo cerca del final de un segmento de extensión de anillado de dos temperaturas. Se ha optimizado una versión del LightCycler® para su utilización con un colorante donador, la fluoresceína, y dos colorantes aceptores distintos, LightCycler Red 640 (LCRed 640) y LightCycler Red 705 (LCRed 705). Aunque los pares de oligonucleótidos FRET se utilizan comúnmente con el LightCycler® y se utilizan en diversos ejemplos del presente documento, se debe entender que pueden utilizarse otras sondas específicas a la secuencia dentro del alcance de la presente invención.

PCR cinética en tiempo real en el LightCycler®

El LightCycler® puede utilizarse con colorantes de enlace de ADN de doble cadena, tal como SYBR^{TM} Green I, o sondas de hibridación a efectos de controlar la reacción PCR. Las figuras 3a y 3b muestran curvas de estándar externo típicas utilizando sondas de hibridación. La sonda donadora se marcó con fluoresceína y la aceptora con LCRed 640. Los datos se representan como la relación de fluorescencia aceptor/donador. La concentración inicial del estándar estaba en el intervalo de entre 10^{5} y 10^{1} copias de diana por 10 \mul de reacción.

Detección de mutaciones utilizando el LightCycler®

El control una vez por ciclo proporciona información útil para la cuantificación. Se obtiene una información adicional si se controla la fluorescencia de forma continua durante las transiciones de temperatura. El estado de hibridación de las sondas puede determinarse midiendo el cambio de fluorescencia a medida que se varía la temperatura. La fusión de la sonda de hibridación tiene lugar a una temperatura característica que puede aprovecharse para la identificación del producto y la detección de mutaciones.

Cuantificación por PCR cinética

La dependencia con respecto a la temperatura de la fluorescencia por hibridación de las sondas puede demostrarse mediante gráficos de fluorescencia en función de temperatura (figura 4a). Los gráficos ilustrados se generaron controlando una única muestra cada 0,1ºC durante una rampa de temperatura lenta (0,2ºC/segundo) desde 45ºC hasta 75ºC. El producto se desnaturaliza y a continuación se enfría rápidamente (10ºC/segundo) hasta 45ºC. A baja temperatura, las sondas se hibridan al producto de cadena simple y la relación de fluorescencia (por ejemplo LCRed 640/fluoresceína) aumenta. Durante el calentamiento, las sondas se disocian en el intervalo comprendido entre 55 y 65ºC, retornando la relación de fluorescencia hasta niveles de señal de fondo. La derivada de esta curva se calcula con respecto a la temperatura y se representa en función de la temperatura (figura 4b). Esto produce un pico de fusión centrado alrededor de la T_{m} de la sonda. La discriminación basada en las temperaturas de hibridación es una potente herramienta para la detección de mutaciones.

Procedimiento que combina detección de mutaciones con cuantificación

La utilización de un estándar interno en ensayos de PCR competitiva cuantitativa implica una selección cuidadosa del competidor utilizado como estándar interno. En ensayos de PCR competitiva cuantitativa, el competidor y la diana deben cumplir criterios contradictorios. Las dos secuencias de ácido nucleico deben amplificar con la misma eficacia, lo que generalmente exige que sean lo más similares posible. Sin embargo, también deben ser diferenciables y no tener tendencia a la formación de heterodúplex, lo que exige que sean distintos.

El caso extremo de similitud entre la diana y el modelo es un cambio de un único par de bases. Resulta extremadamente improbable que un cambio en una única base tenga un efecto significativo en la eficacia de ampliación. Según una realización de esta invención, se utiliza el LightCycler® para diferenciar entre una diana y un competidor que difieren únicamente en un único par de bases, tal como en una mutación de un único par de bases. En condiciones apropiadas, las sondas de hibridación detectan únicamente una de las cadenas de ADN, de modo que la formación de heterodúplex durante la amplificación no afecta a los resultados.

En el curso del desarrollo del LightCycler®, se ha desarrollado software para el análisis de datos de fluorescencia en tiempo real. La figura 5a es una curva de fusión representativa. El software calcula el área por debajo de cada curva utilizando regresión no lineal a efectos de ajustar los datos de pico de fusión a una curva gaussiana. Este módulo sirve como base del software para cuantificación con el procedimiento T_{m}. Las áreas de pico relativas de la diana y el competidor se utilizan para calcular las cantidades relativas de los dos productos.

La figura 5b muestra diversas curvas de amplificación en un gráfico del logaritmo de la fluorescencia en función del número de ciclo. Para cada curva, se identifica el punto de la curva de amplificación en el que la segunda derivada se encuentra en un máximo, es decir, el punto de máximo aumento en la velocidad de aumento. Este número de ciclo fraccionario se utiliza para describir la posición de la curva de amplificación. A diferencia de los métodos tradicionales "de umbral", que definen la posición de la curva con relación al ruido de fondo, este enfoque permite la determinación automática de las posiciones de las curvas de amplificación en base a la forma de la curva. Ver patente USA Nº 6.387.621. Este módulo sirve como base del software para el procedimiento multicolor. Las cantidades relativas de diana y competidor se determinan observando la diferencia de ciclo fraccionario en las posiciones de las dos curvas de amplificación, tal como se muestra en la figura 5c.

Procedimiento que combina PCR cinética con estándares internos

En una realización alternativa, el competidor/estándar interno se distingue del ácido nucleico diana por hibridación de sonda diferencial durante la reacción PCR. De este modo, la reacción se controla y la hibridación se detecta a medida que tiene lugar: una "captura de sonda en tiempo real". Esto permite determinar la cantidad de diana y competidor cinéticamente, no únicamente a partir de una medición de punto final.

En una realización ilustrada, se utiliza un procedimiento de cuantificación cinético por estándar interno en el que la diana y el competidor difieren únicamente en el lugar de enlace de la sonda. La sonda competidora y la sonda diana se marcan con fluoróforos coloreados distintamente (LCRed 640 y LCRed 705). Las dos sondas se emparejan con una "sonda de anclado" más larga con fluoresceína. Tanto la diana como el competidor se controlan simultáneamente, una vez por cada ciclo. Ilustrativamente, el diseño óptico del sistema utilizado en esta realización es de tres colores y se basa en iluminación epifluorescente paraxial de la punta capilar. La reflexión interna total a lo largo del eje capilar aumenta la intensidad de señal aproximadamente 10 veces. La fuente de excitación es un diodo emisor de luz azul "súper brillante". Las señales de fluorescencia son obtenidas mediante fotodiodos tras filtración de paso de banda en los tres canales a 520 nm, 640 nm y 705 nm.

Como en el método T_{m}, la formación de heterodúplex no constituye ningún problema, dado que únicamente una de las cadenas de ADN es detectada mediante las sondas de hibridación. El trabajo con estándares externos ha puesto de manifiesto que la posición de las curvas de amplificación es más reproducible que los niveles finales de fluorescencia. Correspondientemente, dado que en este procedimiento cinético los datos se recogen en cada ciclo, se utilizan los datos más fiables de ciclos anteriores. Ventajosamente, el presente procedimiento no depende de una única medición para definir las relaciones de los productos. En lugar de ello, se utilizan las posiciones correspondientes de la totalidad de las curvas de amplificación a efectos de determinar la relación entre los dos productos.

Si las reacciones que contienen las mismas concentraciones de diana y competidor proporcionan curvas de amplificación en la misma posición, el desplazamiento de la posición de las curvas entre la diana y el competidor puede utilizarse para calcular la relación entre diana y competidor. Este procedimiento proporciona estimaciones precisas de las cantidades de diana y competidor.

Determinación de la ecuación de delta C.T.

El enfoque anterior no se ha utilizado anteriormente con cuantificación con estándares internos. De este modo, se requiere una relación matemática conveniente, preferentemente lineal, entre las posiciones de las curvas de la diana y el competidor y sus concentraciones relativas. Si la diana y el competidor tienen la misma eficacia, en el máximo de la segunda derivada para la diana se cumple:

T_{nt} = T_{0}(E)^{nt}

en la que T_{nt} es la cantidad de diana en el máximo de la segunda derivada, T_{0} es la cantidad inicial de diana, E es la eficacia promedio de la reacción y nt es el número de ciclo fraccionario del máximo de la segunda derivada. Similarmente, en el máximo de la segunda derivada para el competidor se cumple:

C_{nc} = C_{0}(E)^{nc}

en la que C_{nc} es la cantidad de competidor en el máximo de la segunda derivada, C_{0} es la cantidad inicial de competidor, E es la eficacia promedio de la reacción y nc es el número de ciclo fraccionario del máximo de la segunda derivada.

El método de la segunda derivada es sensible a la forma de la curva de amplificación, no al nivel de fluorescencia absoluto. La posición de la curva de amplificación no debería verse significativamente afectada por diferencias en la eficacia de señalización entre LCRed 640 y LCRed 740. El punto en el que la segunda derivada presenta un máximo no refleja cierto nivel de señal, sino la acumulación de cierta cantidad de producto. En sus respectivos máximos de la segunda derivada, las concentraciones de diana y competidor deben ser idénticas. En consecuencia se cumple:

C_{nt} = T_{nc}

Y de ello se deriva que:

C_{0}(E)^{nc} = T_{0}(E)^{nt}

Reordenando, resulta que:

C_{0}/T_{0} = (E)^{nt}/(E)^{nc}

Aplicando el logaritmo a ambos lados, resulta:

log(C_{0}/T_{0}) = log[(E)^{nt}/(E)^{nc}]

logC_{0} - logT_{0} = ntlogE - nclogE

logC_{0} - logT_{0} = logE(nt-nc)

nt-nc es el desplazamiento de ciclo entre la diana y el competidor, que se puede designar \Deltan. Sustituyendo, resulta:

logC_{0} - logT_{0} = logE(\Delta n)

Y reordenando:

logC_{0} = logE(\Delta n) + logT_{0}

Esta ecuación de delta C.T. presenta la forma y = mx + b, de tal modo que un gráfico de la concentración inicial de competidor en función del desplazamiento de ciclo entre competidor y diana proporcionará una recta con una pendiente igual a la eficacia y una intersección con el eje de coordenadas "y" igual al logaritmo de la concentración inicial de diana.

Ejemplo 1

El ejemplo siguiente se lleva a cabo a efectos de confirmar que concentraciones iniciales idénticas de diana y modelo competidor proporcionan máximos de la segunda derivada idénticos.

Se mezclan concentraciones iguales de diana y competidor PCR purificados en concentraciones comprendidas desde 10 a 10^{6} copias por reacción en etapas de factor 10 y se amplifican en 35 ciclos. Se comparan las posiciones del máximo de la segunda derivada para todos los pares de diana y competidor y se espera que los máximos de la segunda derivada sean idénticos para concentraciones idénticas. Este experimento se repite cinco veces y se llevan a cabo ensayos estadísticos a efectos de determinar si una diferencia cero en el punto de intersección está dentro del 95% de intervalo de confianza de \Deltan. Si la diferencia no es cero pero la diferencia es consistente, puede utilizarse un "\Delta\Deltan", es decir la diferencia en la posición de la curva menos cualquier diferencia sistemática entre los dos canales.

Ejemplo 2

El experimento siguiente se lleva a cabo a efectos de confirmar que el intervalo dinámico del ensayo es, por lo menos, un orden de magnitud a los dos lados de la concentración de diana.

Si la diana o el competidor están presentes en un gran exceso, el producto más concentrado alcanzará una meseta antes de que el producto menos concentrado supere el límite de detección del instrumento. El LightCycler® tiene un intervalo de detección de aproximadamente dos órdenes de magnitud. Este intervalo de detección define el límite superior del intervalo dinámico. Resulta deseable un intervalo dinámico mínimo de, por lo menos, una diferencia de un orden de magnitud.

Se ensaya la diferencia máxima en la relación diana/competidor que permite aún la detección de los dos productos. Se mezcla diana a 10^{4} copias por reacción con competidor entre 10^{2} y 10^{6} copias por reacción en etapas de un tercio de logaritmo. Se espera un intervalo dinámico de entre uno y dos órdenes de magnitud. El número de copias de la diana se calcula utilizando el procedimiento cinético y se compara a la concentración real de diana. Este experimento se repite cinco veces y se determina la precisión del número de copias de la diana calculado.

Una vez que se ha establecido la diferencia máxima de diana con respecto a competidor con 10^{4} copias de la diana, se determina la diferencia máxima en la relación diana/competidor a lo largo de un intervalo de concentraciones de diana. Se mezcla diana entre 10^{1} y 10^{6} copias por reacción con competidor que difiere en un factor de 2, 5, 10, 20 hasta la diferencia máxima en relación de diana/competidor definida por los experimentos anteriores. El número de copias de la diana se calcula utilizando el procedimiento cinético y se compara a la concentración real de diana. Este experimento se repite cinco veces y se determina la precisión del número de copias de la diana
calculado.

Ejemplo 3

El experimento siguiente se lleva a cabo a efectos de determinar el efecto del número de copias de la diana sobre la exactitud y precisión del ensayo.

Se analiza la exactitud y precisión de los resultados de los experimentos PCR. Para cada número de copias inicial de diana entre 10^{1} y 10^{6}, se calcula un intervalo de confianza del 95%. La precisión interensayos e intraensayos también se calcula midiendo el coeficiente de variación (%CV) dentro de los experimentos y entre los mismos para cada número de copias inicial de diana entre 10^{1} y 10^{6}. Para 10^{1} ó 10^{2} copias, se espera que los %CV serán de aproximadamente el 100%. Para los números de copias mayores, se espera que los %CV serán de aproximadamente el 25%. Un 25% CV permitiría una fácil discriminación de diferencias de factor dos.

Software

Las posiciones de las curvas se calculan utilizando el método del máximo de la segunda derivada. Se considera que este método, que depende de la forma de la curva y no de la señal absoluta, es más resistente a las diferencias en la eficacia de señalización entre los canales. El desplazamiento de ciclo se representa en función de la concentración inicial de competidor y se ajusta una recta a los datos. Si el método del punto único proporciona respuestas razonables (%CV < 50), el software también puede realizar este cálculo.

Ejemplo 4

En el experimento siguiente se describe un procedimiento para PCR competitiva cuantitativa en tiempo real en el LightCycler® utilizando un competidor que difiere de la diana únicamente por una sola base. La diana y el competidor se distinguen por la fusión diferencial de sondas de hibridación marcadas fluorescentemente.

Diseño experimental

La diana para la cuantificación en este ejemplo es el gen humano HER-2/neu. El gen HER-2/neu se amplifica en el 25% de los tumores de pecho y el grado de amplificación (habitualmente, en un factor de 2-50) se correlaciona con el tiempo de supervivencia. La figura 7 muestra un diseño de sondas para HER-2/neu. Con este diseño, el competidor presenta un desparejamiento CA con respecto a la sonda de hibridación. Un desparejamiento CA en el centro de una sonda provoca un desplazamiento de la T_{m} de 5-10ºC, que es suficiente para permitir la separación de los picos de fusión emparejados y desparejados. Los cebadores que flanquean estas sondas (no mostrados) fueron diseñados utilizando el software Primer Designer^{TM} (Scientific and Educational Software).

Construcción del competidor

Se utiliza como diana un producto PCR HER-2/neu tipo salvaje generado a partir de ADN genómico humano. El competidor se genera por amplificación de HER-2/neu a partir de ADN genómico con un cebador PCR mutagénico que contiene un cambio de G a A, tal como se muestra en la figura 7. Los productos de PCR se purifican en gel, se diluyen y a continuación se reamplifican con los cebadores de amplificación. Estos productos se purifican en gel y se utilizan como diana y competidor. La introducción de la mutación se confirma por secuenciación.

Las concentraciones de diana y competidor se determinan por ensayo de cuantificación de ADNds con sondas moleculares PicoGreen o por el procedimiento de dilución limitante, tal como se ha descrito anteriormente.

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Síntesis y purificación de sondas

Las sondas se muestran en la figura 7. La sonda de anclado está marcada con fluoresceína en 3'. La sonda aceptora está marcada con LightCycler Red 640 en el extremo 5' y está bloqueada en el extremo 3' por un fosfato. Las sondas se sintetizan y se purifican tal como se ha descrito anteriormente.

Cuantificación con estándares internos

En primer lugar, se lleva a cabo la determinación de que las señales de la diana y el competidor (es decir, las áreas de picos de fusión) son proporcionales a la cantidad de diana presente. Esto se realiza en primer lugar con productos PCR purificados. Se mezclan HER-2/neu tipo salvaje y competidor en concentraciones idénticas de entre 10^{10} y 10^{12} copias por tubo. Los picos de fusión se obtienen haciendo descender rápidamente la temperatura por debajo de la temperatura de anillado de las sondas y posteriormente calentando lentamente (0,2ºC/segundo) hasta una temperatura 15ºC superior a la temperatura de fusión de las sondas. La fluorescencia se obtiene cada 0,1ºC durante la rampa. La relación entre las áreas por debajo de las curvas gaussianas mejor ajustadas se compara a la relación inicial diana/competidor conocida de 1,0. Los ensayos estadísticos producen una relación de 1,0, que entra dentro de los intervalos de confianza del 95%.

Preferentemente, no sólo cantidades idénticas de producto PCR purificado producen señales idénticas; las proporciones deben mantenerse constantes a lo largo de la amplificación. Correspondientemente, se mezclan productos PCR diana y competidores purificados en concentraciones iguales de entre 10^{1} y 10^{6} copias por reacción en etapas de factor 10, se amplifican en 35 ciclos y a continuación se estudian llevando a cabo un análisis de curvas de fusión. Este experimento se repite cinco veces. La relación entre las áreas por debajo de las curvas gaussianas más ajustadas se compara con la relación inicial diana/competidor conocida de 1,0. Se llevan a cabo ensayos estadísticos a efectos de determinar si una relación de 1,0 entra dentro de los intervalos de confianza del 95%, y los resultados muestran que las eficacias de amplificación de las moléculas diana y competidoras son indistinguibles.

La cantidad total de producto PCR producido y, por lo tanto, disponible para el análisis de curvas de fusión, depende de muchas variables, pero no superará la cantidad de cebador utilizada. Típicamente, las reacciones de sondas de hibridación utilizan cebadores entre 0,1 \muM y 0,5 \muM, de tal modo que la concentración más alta de producto que puede producirse teóricamente por PCR está comprendida entre 0,1 y 0,5 \muM. Los experimentos preliminares indicaron que una medición precisa de las cantidades de producto por áreas de pico de fusión requerían concentraciones de sonda en exceso con respecto a la cantidad total de producto PCR producido tras la amplificación. Esto suponía problemas para la óptica del LightCycler® estándar, dado que las concentraciones de sonda con fluoresceína mayores de ~0,2 \muM exceden el nivel de detección en el canal F1. Para solucionar este problema, se modificó la óptica F de un LightCycler® a efectos de bloquear ~90% de la señal fluorescente transmitida al detector F1. De este modo pudieron utilizarse mayores concentraciones de sonda, de tal modo que las concentraciones de sonda se encuentran siempre en exceso con respecto al producto. Se diseñaron experimentos de fusión reconstruida utilizando modelos artificiales de concentración conocida a efectos de medir áreas de pico con este instrumento modificado con utilización de exceso de sonda. La figura 14 muestra que existe una correlación lineal entre las áreas de pico de fusión y las concentraciones de producto comprendidas entre 0,1 y 0,4 \muM utilizando 1,0 \muM de cada sonda. Estos resultados indican que el producto PCR de punto final (utilizando una concentración de cebador de 0,5 \muM o menor) producirá consistentemente áreas de pico de fusión dentro de este intervalo lineal, proporcionando información cuantitativa.

Intervalo dinámico de cuantificación por análisis de pico de fusión

Pudo establecerse una relación lineal entre el área de pico de fusión y la cantidad de producto PCR para una diferencia en un factor de diez en las cantidades relativas de las dos moléculas en experimentos de fusión reconstruida utilizando el software de análisis de fusión LightCycler® convencional. A efectos de ampliar el intervalo dinámico de esta técnica, se desarrolló un nuevo procedimiento de análisis de curvas de fusión en base a un procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (TMBSP, ver ejemplo 6) de los datos de curvas de fusión: los componentes de una curva de fusión heterogénea se describen cuantitativamente en términos de sus fracciones de volumen con respecto a curvas de fusión homogéneas para cada componente.

La figura 15 muestra los resultados de la mezcla de moléculas de modelo tipo salvaje (WT) y mutantes (M) en relaciones de entrada comprendidas entre 20:1 y 1:100, seguida de 45 ciclos de amplificación PCR y análisis de curvas de fusión a efectos de identificar las cantidades relativas de producto tipo salvaje y mutante tras la amplificación (relaciones de salida). Estos resultados muestran que el análisis TMBSP de curvas de fusión puede distinguir 1 molécula de 100 tras 45 ciclos de amplificación PCR.

Precisión del ensayo

La tabla 1 indica la exactitud de la cuantificación por análisis de pico de fusión. Relaciones de hasta 1 en 50 son distinguibles con una exactitud razonable, y para una diferencia en un factor de 100 las especies menores aún pueden ser detectadas rutinariamente, aunque con una menor exactitud.

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1

Debido a la naturaleza exponencial de la PCR, las pequeñas diferencias en las eficacias de reacción tendrán efectos aún mayores al aumentar el número de ciclo. Sin embargo, el hecho de que la información cuantitativa puede obtenerse tras 45 ciclos de amplificación indica que las eficacias de reacción de moléculas mutantes y tipo salvaje no difieren en la práctica significativamente lo suficiente como para afectar la cuantificación del producto.

Software

El software actual de análisis utilizado para obtener los datos recoge los datos de curva de fusión, los diferencia con respecto a la temperatura a efectos de obtener picos de fusión, y a continuación calcula el mejor ajuste de 1 a 3 curvas gaussianas con los datos de pico de fusión. El único dato introducido por el usuario consiste en el número de gaussianas a ajustar. El software actual puede modificarse adicionalmente para hacer posible el análisis de datos de fusión para cuantificación.

Los parámetros en una ecuación de curva gaussiana son el área del pico, la posición del centro del pico (promedio) y la anchura del pico (desviación estándar). El software actualmente disponible preferente permite la fluctuación de estos tres valores. Para la cuantificación con estándares internos, el número de curvas es ilustrativamente dos, y se conoce que los promedios están dentro de la reproducibilidad de la máquina. Únicamente el área y la desviación estándar de la curva deben fluctuar de forma completamente libre. El software de regresión no lineal puede modificarse a efectos de permitir que el usuario introduzca las temperaturas de fusión esperadas de la diana y el competidor y la concentración del competidor en cada muestra.

Las áreas de pico de fusión relativas se utilizan para calcular el número de copias de la diana HER-2/neu. Los usuarios introducen el número de copias del competidor para cada muestra. El software recoge los datos de diversas muestras y representa el logaritmo de la relación diana/competidor final en función del logaritmo de la concentración de competidor. Este gráfico debe proporcionar una recta de pendiente -1 con una intersección con el eje de coordenadas "y" igual al logaritmo de la concentración inicial de diana.

Ejemplo 5

El experimento siguiente se lleva a cabo a efectos de determinar la cuantificación de HPV 16 utilizando estándares internos de cuantificación con fluorescencia PCR en tiempo real en el LightCycler®.

ADN/oligonucleótidos

El ADN del virus del papiloma humano se subclona en pBR322. Las sondas y los cebadores siguientes se utilizan para la clonación, amplificación y detección.

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Colorantes fluorescentes

El oligonucleótido marcado con LCRed 640 en 5' (Roche Molecular Systems) se conjuga con el oligonucleótido postsíntesis. El oligonucleótido marcado con LCRed 705 en 5' (Roche Molecular Systems) se conjuga con el oligonucleótido durante la reacción de síntesis como fosforamidita. El oligonucleótido marcado con fluoresceína en 3' (Operon, Inc.) se purifica por HPLC.

Reacciones

Se creó un sistema artificial para la detección de número de copias inicial de modelo de ADN a partir de ADN genómico de HPV 16 que previamente había sido clonado en un plásmido bacteriano. El modelo artificial de HPV 16 se produjo introduciendo un lugar de endonucleasa de restricción EcoRI en el cebador anterior, y un lugar de endonucleasa de restricción BamIII en el cebador inverso. El producto PCR se amplificó a partir del plásmido de HPV 16 a efectos de producir una secuencia que pudiera ser fácilmente clonada en un plásmido pUC19.

Similarmente, el estándar interno de cuantificación se creó a partir del 11PV 16 que contenía ADN plásmido utilizando una combinación de cebadores PCR anidados. El diseño para crear esta secuencia artificial puede observarse en la figura 8. En resumen, se amplificó ADN plásmido que contenía una parte superior de ADN genómico de HPV 16 con cebadores PCR 900F16 y 1300R16. El 16ICS es un cebador largo con una secuencia interna de HPV 16 que se ha aleatorizado. A continuación, el ADN se amplificó con este cebador a efectos de crear la secuencia de Estándar Interno de Cuantifiación (IQS). Esta región aleatorizada sirve como lugar de enlace de sonda del estándar interno de cuantificación. Los cebadores 16RI9 y 16HI13 se han diseñado a efectos de introducir lugares de endonucleasa de restricción EcoRI y BamHI para la subclonación direccional de la secuencia artificial final en un plásmido pUC19. A efectos de asegurar fondos similares de modelo, HPV 16 también se amplificó con los cebadores 16RI9 y 16HI13, a efectos de facilitar la subclonación direccional de este amplicón en un plásmido pUC19.

Producción de los plásmidos artificiales IQS y HPV 16

Se dispusieron alícuotas de ADN plásmido de HPV 16 a 107 copias por \mul en placas de 96 micropocillos. Se prepararon soluciones que contenían las concentraciones finales siguientes: 0,1 \muM de cebador 16HI13, 0,1 \muM de cebador 16RI9 o cebador 16IQS, 50 mM Tris pH 8,3 (25ºC), 4,0 \muM de MgCl_{2}, 0,25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 200 \muM de cada dNTP, y ADN polimerasa KlenTaq 0,2 unidades/\mul, dilución 1:30.000 de SYBR® Green I (Molecular Probes). Las condiciones de ciclación térmica para la amplificación de los modelos artificiales de HPV 16 e IQS incluían 1 ciclo de desnaturalización de la muestra a 97ºC durante 30 segundos. El protocolo de amplificación incluía 30 ciclos de desnaturalización a 90ºC durante 1 segundo, anillado a 55ºC durante 2 segundos, extensión a 78ºC durante 18 segundos con obtención de fluorescencia tras la extensión. Las velocidades de rampa para cada transición se ajustaron al máximo de 20ºC/segundo, excepto para la transición entre la etapa de anillado y de extensión, a 10ºC/segundo. Las reacciones se llevaron a cabo sobre un gel de agarosa SeaKem al 0,8% (1xTris, borato, EDTA, bromuro de etidio) a 80 mA durante 1,5 horas. Los productos de reacción se visualizaron con luz UV y se separaron del gel bandas de producto. Los productos se purificaron a partir de los geles mediante Amicon Gel Nebulizers^{TM} (número de pieza 42600, Beverly, MA) según las indicaciones del fabricante. Tras la purificación, el modelo de IQS parcial se sometió a una segunda ronda de amplificación a efectos de completar la secuencia de IQS artificial. La reacción es la misma que anteriormente, excepto por el ADN modelo, que fue el IQS parcial; y los cebadores, 16RI9 y 16HI13. La secuencia final de IQS completa se aisló en bandas a partir de un gel de agarosa al 0,8% y se purificó tal como se ha descrito anteriormente.

Los modelos artificiales de HPV 16, IQS y ADN pUC 19 se sometieron a digestión por endonucleasa con restricción Eco RI y Bam HI (Boehringer Manneheim Biochemicals) según las indicaciones del fabricante. Tras la digestión, el ADN se aisló en bandas a partir de geles de agarosa al 0,8% y se purificó tal como se ha descrito anteriormente. Los ADN modelo purificados se ligaron en el ADN pUC 19 digerido con T4 ADN ligasa (Boehringer Manneheim Biochemicals) a 14ºC durante una noche. Los ADN ligados se transformaron en células de E. Coli DH5\alpha competentes y se colocaron con caldo Luria en placas de agar que contenían ampicilina a 125 \mug/ml. Las células se incubaron a 37ºC durante una noche. Se aislaron colonias individuales y se cultivaron en caldo Luria que contenía ampicilina a 125 \mug/ml durante 16 horas. Los plásmidos se aislaron mediante Promega Wizard Minipreps. Las preparaciones finales se hirvieron durante 5 minutos y la concentración de ADN se determinó por lecturas espectrofotométricas a A_{260} y A_{280}. Las inserciones se confirmaron por amplificación con los cebadores 900f16 y 1300r16 y especificidad de sonda FRET pBECIQS o pBEC16.

Los modelos artificiales de IQS y HPV 16 sirvieron como modelos en todas las reacciones posteriores. El diseño de la detección del producto IQS y el producto HPV 16 se basa en el objetivo de minimizar las diferencias entre los ADN diana y competidor. Los modelos IQS y HPV 16 se amplificaron con un conjunto de cebador único, 900f16 y 1300r16. Se utilizó una única sonda de "anclado" marcada con fluoresceína a efectos de posicionar el fluoróforo inductor de FRET adyacente a las sondas de detección, tal como puede observarse en la figura 6. Las sondas de detección están específicamente diseñadas para hibridizarse al producto IQS, IQSp913, o al producto HPV 16, 16p913. IQSp913 es una sonda marcada con LCRed 640 que puede detectarse en el canal 2 del LightCycler®. 16p913 es una sonda marcada con LCRed 705 que puede detectarse en el canal 3 del LightCycler®. Este diseño de estándar interno permite la amplificación simultánea del ADN competidor y del ADN diana en un único recipiente de reacción, y también proporciona un procedimiento basado en el color para distinguir los dos productos.

La figura 9 ilustra la detección de estándares internos de cuantificación (IQS) y del modelo artificial de HPV 16. Se diseñó un par de cebador único a efectos de amplificar el modelo artificial BPV 16 (900f16/1300r16). Este mismo par de cebador también amplifica la secuencia del estándar interno de cuantificación. Un oligonucleótido 58-mero marcado con fluoresceína (16an913), que iguala exactamente tanto las secuencias del HPV 16 como del IQS artificiales, sirve como anclado FRET. Se diseñaron dos sondas adicionales, una para detectar específicamente la secuencia de HPV 16 (16p913) y la otra para detectar la secuencia de IQS (ICSp913).

Amplificaciones para análisis de cuantificación

Se realizaron diluciones en serie de pBECIQS plásmido y pBEC16 plásmido. Se tomaron alícuotas de modelos de ADN y se introdujeron en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las soluciones madre para la cuantificación contenían las concentraciones finales siguientes: 0,4 \muM de cebador 900f16, 0,1 \muM de cebador 1300r16, 0,3 \muM de sonda 16an913 marcada con fluoresceína, 0,1 \muM de cada una de las sondas 16p913 marcada con LCRed 705 y IQSp913 marcada con LCRed 640, 50 mM Tris pH 8,3 (25ºC), 3,25 \muM MgCl_{2}, 0,25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 200 \muM de cada dNTP, y Taq ADN polimerasa 0,2 unidades/\mul. Las condiciones de ciclación térmica para la amplificación del estándar interno de cuantificación y los modelos artificiales de ADN de HPV 16 incluían 1 ciclo de desnaturalización de la muestra a 97ºC durante 30 segundos. El protocolo de amplificación incluía 50 ciclos de desnaturalización a 92ºC durante 1 segundo, anillado a 47ºC, obtención de fluorescencia tras mantener la temperatura a 5ºC durante 6 segundos y extensión a 78ºC durante 12 segundos. Las velocidades de rampa para cada transición se ajustaron al máximo de 20ºC/segundo, excepto para la transición entre la etapa de anillado y de obtención de fluorescencia, donde fue de 0,4ºC/segundo.

Resultados

Tal como se ha indicado anteriormente en la derivación de la ecuación de delta C.T., la eficacia de detección de los ADN tanto diana como de estándar interno de cuantificación debería ser idéntica. Para determinar si esto se cumple realmente para este sistema, se determinó el umbral de cruce para HPV 16 o para IQS en reacciones en las que las dos sondas estaban presentes y únicamente estaba disponible un modelo de ADN para la detección. Tal como se observa en la figura 10, los umbrales de cruce tanto para el ADN diana como para el ADN competidor son similares. La figura 10 muestra el umbral de cruce de las curvas de amplificación tras la compensación de color, la sustracción de la línea de base, el ajuste de la banda de ruido y finalmente la detección del umbral de ciclo en el que las curvas de amplificación pueden ser detectadas. Aunque la eficacia de amplificación o detección de estas reacciones no es lineal a lo largo del intervalo de concentraciones ensayado, los umbrales de cruce son consistentes tanto para el estándar interno de cuantificación como para el ADN diana.

La figura 10 muestra la eficacia de detección del Estándar Interno de Cuantificación y el modelo artificial de HPV 16. Los datos se presentan como el promedio de, por lo menos, tres datos puntuales, con desviaciones estándar para cada uno de ellos.

En las figuras 11a y 11b se representa una reacción de control interno típico. Se prepararon diluciones en serie del modelo IQS (1x10^{9}, 5x10^{8}, 1x10^{8}, 5x10^{7},... 1x10^{3}). Cada muestra contenía 1x10^{6} copias iniciales de ADN diana de HPV 16 y se inyectó con una de las diluciones en serie del ADN competidor de IQS. El estándar interno se detecta en el canal dos (figura 11a), las concentraciones decrecientes de IQS muestran un desplazamiento de ciclo de umbral de cruce típico a medida que disminuye el número inicial de copias del modelo. En la figura 11b, se muestra ADN de HPV 16 tal como se detecta en el canal 3. Tal como se espera con una concentración única de ADN modelo inicial, 1x10^{6}, el umbral de ciclo de detección es consistentemente en el ciclo 28. Los datos de las figuras 11a y 11b se han compensado con respecto a la superposición de color del canal 2 en el canal 3 utilizando un archivo de compensación de color.

El desplazamiento de ciclo que tiene lugar durante la amplificación cuando están presentes copias iniciales de ADN diana y ADN competidor se observa regularmente en reacciones en las que un modelo de ADN se mantiene a un único número de copias iniciales y el otro modelo se varía. En las figuras 12a-c se presenta un ejemplo de un desplazamiento de ciclo típico. Se representan tres reacciones. Cada reacción comprende los modelos y las sondas para la amplificación y detección de IQS y HPV 16. El estándar interno de cuantificación (triángulos) y el HPV 16 (cuadrados) son multiplexados. En cada caso, el HPV 16 se encuentra en una concentración de modelo inicial de 1x10^{4}. El estándar interno de cuantificación se encuentra a concentraciones de modelo iniciales de 1x10^{5} (figura 12a), 1x10^{4} (figura 12b) y 1x10^{3} (figura 12c). Correspondientemente, las copias iniciales de ADN IQS varían desde diez veces mayor que el HPV 16 (figura 12a) hasta diez veces menor que ADN de HPV 16 (figura 12c). Tal como puede observarse en la figura 12b, en la que el número de copias inicial de los ADN diana y competidor son idénticos, los umbrales de cruce son idénticos. Sin embargo, cuando el competidor es diez veces mayor (figura 12a) o diez veces menor (figura 12c), el umbral de ciclo para el estándar interno de cuantificación ocurre antes o después, respectivamente, que el umbral de ciclo para el ADN HPV 16.

El desplazamiento de ciclo para diferencias de número de copias entre el ADN competidor (IQS) y el ADN diana (HPV 16) se representó como el cambio en el umbral de ciclo, entre el IQS en el canal 2 y el HPV 16 en el canal 3, en función del logaritmo del número de copias inicial del IQS en la reacción. La figura 13 representa los datos de dos experimentos separados para cada concentración de ADN diana HPV 16, cada uno realizado por triplicado. Las concentraciones iniciales de modelo HPV 16 son: 1x10^{2}, 1x10^{3}, 1x10^{4}, 1x10^{5} y 1x10^{6}. Las barras de error se determinan a partir de la desviación estándar a partir de cuatro datos puntuales de reacción independientes. De este modo, las desviaciones estándar son una combinación de variación intraexperimental e interexperimental. La mayoría del error de umbral de ciclo proviene de la variación interexperimental. Las rectas representadas muestran las líneas de tendencia para los puntos de delta C.T. promediados para cada concentración de IQS y HPV 16. Una línea de tendencia para los puntos de delta C.T. promediados para cada concentración de IQS y la concentración de HPV 16 1x10^{4} se muestra en la figura 13. Las líneas de tendencia se calculan a partir de un análisis de mínimos cuadrados del mejor ajuste lineal a los puntos. La tabla 2 presenta las ecuaciones para el ajuste lineal hasta obtener las líneas de tendencia.

El análisis de datos de delta C.T. a partir de curvas de estándar interno de cuantificación se muestra en la tabla 2. Las ecuaciones de líneas de tendencia utilizadas para calcular concentraciones diana se muestran con el log[T_{0}] indicado en negrita. También se indican las eficacias de amplificación y las concentraciones reales y calculadas de ADN diana HPV 16.

2

El logaritmo de las pendientes de cada una de estas rectas se calculó a efectos de producir la eficacia de reacción promedio, y el logaritmo de la intersección con el eje y se utilizó para calcular la concentración de ADN diana observada. Las concentraciones de diana observadas no variaron, en cada una de las muestras, más del 24 por ciento a partir de la concentración estimada en base a la determinación de dilución limitante de la concentración de ADN y subsiguientemente el número de copias de modelo inicial en cada reacción.

Aparentemente, la utilización de un conjunto común de cebadores para amplificar modelos similares y dos sistemas de sonda de hibridación para detectar los productos de esos modelos da lugar a muestras que presentan umbrales de cruce similares. La aplicación de este sistema de detección de dos colores a estándares internos de cuantificación se ha facilitado por la derivación de una ecuación que utiliza sólo una manipulación simple de los datos de umbral de cruce a efectos de producir cuantificación interna con un intervalo dinámico mínimo de un factor de 10 en cada lado de la concentración de ADN diana.

Si bien los ejemplos anteriores han incorporado sistemas de sonda de oligonucleótido FRET, se debe entender que pueden utilizarse otros sistemas de sonda dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, pueden utilizarse sondas de oligonucleótido marcadas una vez, eliminándose de este modo la necesidad de una sonda de anclado. El ejemplo siguiente utiliza tanto el sistema de sonda de oligonucleótido FRET (Sensor y Aceptor) como el sistema de sonda marcada una vez (únicamente sonda Sensor).

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra que las relaciones entre diferentes ácidos nucleicos diana en una mezcla pueden cuantificarse utilizando un algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica. En un sistema bialélico de ejemplo, pueden determinarse de forma exacta fracciones de alelo tan pequeñas como de 1 parte en 100 mediante este algoritmo. Este procedimiento puede utilizarse, por ejemplo, para determinar patrones alélicos de expresión génica, frecuencias de alelos en poblaciones combinadas y relaciones entre diferentes tipos de célula en una muestra de tejido mixta.

Sistema bialélico de modelo

Un locus de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen humano p53 (nº de acceso GenBank U94788) se utiliza como diana. La detección y el análisis del locus SNP es posible mediante una sonda Sensor marcada en 3' con fluoresceína (5'GTTCCTGCATGGGCGGCATGAAC-F (ID.SEC. Nº9)). Cuando se empareja perfectamente con la secuencia diana tipo salvaje, esta sonda presenta una Tm de 70ºC. Cuando se hibrida al alelo mutante, la Tm de la sonda se desplaza a aproximadamente 62ºC debido al desparejamiento GA en la posición 12 del extremo 5' de la sonda.

Esta sonda Sensor puede utilizarse sola a efectos de detectar el locus SNP mediante el mecanismo de extinción de fluorescencia en el que la señal de la sonda disminuye tras la hibridación por efecto de un residuo G en la cadena diana (ver Crockett y Wittwer, Anal Biochem. 2001, 290(1):89-97). El cambio de señal se observa en el canal F1 del equipo LightCycler. Ilustrativamente, esta sonda también puede estar apareada con una sonda aceptora marcada con un colorante aceptor de energía de resonancia de fluorescencia, LCRed 640, en su extremo 5' (5'640-GGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAG (ID. SEC. Nº 10), Tm = 75ºC). El cambio de señal de este sistema de sonda de par FRET se observa en el canal F2.

Preparación de la diana

Se generan dianas con alelos tipo salvaje y mutantes por PCR utilizando el cebador anterior 5' GCGCACTGGCCTCATCTT (ID. SEC. Nº 11) (Tm=62,9ºC), y cebador inverso 5' GGTCAGCGGCAAGCAGA (ID. SEC. Nº 12) (Tm=
62,6ºC). Las muestras amplificadas se purifican, se cuantifican por espectrofotometría y se mezclan en diversas relaciones molares conocidas.

Análisis de curvas de fusión

La mezcla de reacción consiste en ADN (2.000 copias/10 \mul), enzima KlenTaq (0,8 U/10 \mul), anticuerpo TaqStart (0,088 \mug/10 \mul), 0,2 mM de dNTP, 1X PCR amortiguador incluyendo 3 mM Mg^{++} (Idaho Technology Inc., UT), y 0,2 \muM de la sonda de anclado y/o la sonda Sensor. A diferencia del ejemplo 4, no es necesario utilizar una cantidad elevada de sonda, dado que la muestra heterozigótica en este sistema proporciona una relación de área de pico de fusión de aproximadamente 1. Las condiciones de ciclación térmica son 94ºC (alcanzados por una velocidad de transición de 20ºC/s mantenida durante 0 segundos); 56ºC (velocidad de transición de 20ºC/s mantenida durante 5 segundos); 74ºC (velocidad de transición de 2ºC/s mantenida durante 7 segundos). Tras cuarenta ciclos de PCR, se lleva a cabo un análisis de curva de fusión desnaturalizando la muestra a 94ºC, anillando a 40ºC y fundiendo el ADN de doble cadena utilizando una velocidad de rampa de 0,2ºC/s. La fluorescencia se controla continuamente durante la fusión. Los datos de curva de fusión resultantes (mostrados como ejemplo en las figuras 16a y 16c para una relación de alelo de 50:50, y en las figuras 17a, 17c para una relación de alelo de 95:5) se analizan directamente con el software de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (TMBSP), y se estiman las relaciones de alelo. Se disponen dos estándares externos (100% de alelo tipo salvaje y 100% de alelo mutante) para el procedimiento de análisis TMBSP. Para estimaciones de fracciones de alelo utilizando el procedimiento de relación de área de pico, en primer lugar los datos de curva de fusión se convierten en datos de pico de fusión realizando la primera derivada negativa (mostrada como ejemplo en las figuras 16b, 16d para relación de alelo de 50:50, y en las figuras 17b, 17d para una relación de alelo de 95:5). A continuación se analizan los datos tal como se describe en el ejemplo 4, utilizando software tal como el LCDA Software (Roche Molecular Biochemicals).

Algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (TMBSP)

Este algoritmo acopla procesamiento digital de señales con una observación termodinámica a efectos de calcular las fracciones de masa de los materiales de una mezcla. El procesamiento digital de señales se lleva a cabo utilizando transformadas rápidas de Fourier y asociando modos de Fourier de amplitud pequeña con el ruido de la señal. La modelización termodinámica se basa en la energía libre de Gibbs de una mezcla, y asume que no existen interacciones químicas entre los materiales fundidos. Adicionalmente, el algoritmo incluye la capacidad de analizar la señal de fusión de una muestra mixta en ausencia de estándares. El procedimiento proporciona la temperatura de fusión y la fracción de los componentes desconocidos.

Las tecnologías anteriores difieren del procedimiento ilustrativo de cuatro modos. En primer lugar, la mayoría de tecnologías llevan a cabo el procesamiento de señales utilizando desconvolución basada en Fourier a efectos de identificar componentes individuales de una señal compuesta por muchas especies diferentes. Estos procedimientos asumen que la señal de entrada es una convolución de las señales individuales con un núcleo de convolución predeterminado. Se encuentran ejemplos de este tipo de procedimiento en las patentes USA Nº 5.273.632, 5.748.491 y 5.346.306. Los procedimientos ilustrativos de la presente descripción determinan el núcleo de desconvolución como un componente de determinación de las fracciones de masa de los materiales.

En segundo lugar, las tecnologías anteriores determinan las cantidades deseadas a razón de una cada vez. Una vez que se determina una componente de la señal, estos procedimientos sustraen el resultado de la señal y determinan el siguiente componente. Se encuentra un ejemplo de este tipo de tecnología en la patente USA Nº 5.985.120. Los procedimientos de la presente descripción determinan las fracciones de masa con un enfoque "todos a la vez".

En tercer lugar, las tecnologías anteriores que utilizan procesamiento digital de señales han participado en el análisis de imágenes de muestras amplificadas de PCR sobre un gel electroforético o dispositivos similares, tal como en las patentes USA Nº 5.906.919; 5.912.165; 6.066.459; y 6.054.268, o con espectrometría de masas, tal como en las patentes USA Nº 6.054.268 ó 6.268.131. Los procedimientos según la presente invención no requieren una manipulación post-amplificación de las muestras PCR.

En cuarto lugar, las tecnologías anteriores que utilizan procesamiento digital en aplicaciones basadas en PCR, tal como la patente USA Nº 6.221.600, no utilizan modelización termodinámica.

La presente invención une el procedimiento de determinación de un conjunto de parámetros del material deseados y simultáneamente de determinación de un esquema óptimo de procesamiento de señales.

El procesamiento digital de señales con transformada discreta de Fourier (DFT) se ha utilizado ampliamente desde el descubrimiento de la transformada rápida de Fourier (FFT). La idea básica consiste en representar la señal como combinación lineal de señales sinusoidales (o funciones de base) y mantener sólo las funciones de base sinusoidales que contienen información fiable sobre la señal.

Una DFT utiliza un número finito de términos de una serie de Fourier a efectos de aproximar una función periódica. La serie de Fourier puede representar una función periódica con una cantidad razonable de suavidad. Si se supone que f(T) es una señal de fusión de fluorescencia, la ferie de Fourier de f(T) es

100

en la que la temperatura se reescala mediante el cambio de variables

203

Las variables g(k) son los coeficientes discretos de Fourier de f(T). Cada coeficiente g(k) se obtiene calculando la integral

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y la FFT es un procedimiento eficaz para calcular un conjunto de estas integrales.

En la práctica, sólo un número finito de estos términos puede ser calculado, y algunos términos no significan nada porque representan ruido de la señal. La DFT proporciona un procedimiento sencillo para eliminar el ruido de una señal ajustando a cero estos coeficientes discretos de Fourier asociados al ruido de la señal. Cada persona debe decidir qué coeficientes corresponden a ruido y cuáles corresponden a señal.

Una obviedad matemática resulta útil para cumplir esto. La suma de los módulos de los coeficientes discretos de Fourier es igual a la norma de la función f(T), o

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Asumiendo que el ruido de la señal es pequeño, un procedimiento común y seguro de eliminación del ruido consiste en utilizar esta propiedad y mantener términos suficientes de la DFT, de tal modo que las normas de la señal real y de la señal procesada son cercanas entre sí. Específicamente, se ajusta g(k) = 0 si |g(k)| < \sigma, siendo \sigma un pequeño parámetro de modulación. Si K(\sigma) es el conjunto de coeficientes discretos de Fourier que no se han ajustado a cero, la señal procesada es

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y presenta la propiedad de que la señal procesada se acerca a la señal real dado que

206

es pequeño por construcción. Adicionalmente, las funciones de base periódicas que contribuyen únicamente en una pequeña cantidad a la señal real se ignoran. Habitualmente estas funciones de base oscilan rápidamente y se identifican con ruido. Este procedimiento presenta la ventaja adicional de que aproxima la señal real con un pequeño conjunto de datos. Los únicos datos que deben almacenarse son los números de onda en el conjunto K(\sigma) y los correspondientes coeficientes discretos de Fourier.

Modelización termodinámica

La señal de fluorescencia de un producto PCR disminuye o aumenta cuando el producto se desnaturaliza. Este procedimiento es una transición de fase que puede entenderse utilizando la termodinámica. La termodinámica de las transiciones de fase de un material mixto se basa en la termodinámica de una transición de fase de la sustancia base.

Considérese una mezcla de muchas sustancias, numeradas 1, 2,..., N. Si G_{i}(T) es la energía libre de Gibbs de la sustancia i como función de la temperatura, la energía libre de Gibbs de una mezcla de estas sustancias viene dada por

207

donde m_{i} es la fracción de masa de la sustancia i. La energía de mezclado es \DeltaG_{mix}, y corresponde a cambios de entropía introducidos por las especies mezcladas i y j. En soluciones acuosas, este término es habitualmente pequeño.

Las señales de fusión de fluorescencia no miden la energía libre de Gibbs de un material. Sin embargo, dado que las señales cambian monotónicamente como función de la temperatura, la propia temperatura puede considerarse como una función de la fluorescencia, es decir T(f), donde f es la señal de fusión fluorescente.

Esto es una observación útil, dado que G_{i}(T) es típicamente una función monotónica de la temperatura, particularmente a temperaturas cercanas a una transición de fase. Dado que la temperatura es una función de f, la composición de G_{i}(T) con T(f) implica que G_{i} es una función de la fluorescencia. Finalmente, dado que G_{i} es una función monotónica, puede considerarse la fluorescencia como una función de G_{i}.

Estas observaciones sugieren que puede modelizarse la fluorescencia de una mezcla PCR como

208

donde f_{i} es la señal de fusión de fluorescencia de la especie i y donde f_{mix} es la señal de fusión de fluorescencia de la mezcla de la especie i con la especie j.

Dadas las señales de fusión de fluorescencia f_{i}, f_{mix}, e ignorando los términos de mezclado de fluorescencia, puede encontrarse una buena aproximación para las fracciones de masa de las sustancias minimizando la siguiente función objetiva a lo largo de todas las opciones de m_{i} entre cero y uno.

209

Aproximación de la función de base

La señal de fusión de fluorescencia que debe analizarse puede tener o no una señal de fusión estándar, tal como la f_{i} descrita anteriormente. Cuando faltan las señales estándar, deben aproximarse. El esquema de aproximación ilustrativo se basa en la observación de que la señal de fusión de fluorescencia de los productos es esencialmente lineal a temperaturas mayores que la transición de fusión (es decir, en la "fase fundida"), y no lineal a temperaturas inferiores a la transición de fusión (es decir, en la "fase anillada", ver figura 20).

Para aproximar las señales estándar, las señales de fusión de fluorescencia de todas las mezclas PCR se escalan en relación a una señal razonable y se calcula una aproximación de los datos restantes. El modelo matemático utilizado es:

210

y los términos del modelo se definen del modo siguiente:

T - temperatura

f^{r}(T) - fluorescencia aproximada de la curva de fusión

P_{1}(T) - función no lineal que representa la fluorescencia en la fase anillada

P_{2}(T) - función polinomial lineal que representa la fluorescencia en la fase fundida

M_{j}(T) - fracción de especies j que se ha fundido; M_{j}(T) = 0 implica que la especie j está anillada y T_{j} es la temperatura de fusión

m_{j} - fracción de masa constante de la especie j en el recipiente de muestra.

Finalmente, todas las sumas del modelo incluyen N términos, con un término para cada fusión.

El modelo se construyó utilizando una combinación de comportamiento observado y termodinámica elemental. Los términos de fondo P_{j}(T) están completamente basados en la experiencia con los datos, mientras que las combinaciones lineales de las ecuaciones de fusión fraccionales están basadas en la energía libre de una mezcla de materiales. La energía libre es igual a la suma de las energías libres de los componentes de la mezcla de primer orden. Los cambios en la energía libre de los materiales son la fuerza impulsora para una transición de fase en los experimentos de fusión de sondas, en consecuencia, se espera que las fluorescencias de las muestras serán aproximadamente combinaciones lineales de las fluorescencias de las especies individuales. En este contexto, los términos M_{j}(T) representan la probabilidad de que una sonda tipo j se una a su diana. Los términos de fusión M_{j}(T) dependen de dos parámetros: la temperatura de fusión T_{j} a la que la curva tiene mayor pendiente en la transición de fusión, y la anchura de la transición de fusión wj.

Acoplamiento de algoritmo

En la primera etapa del algoritmo completo se lleva a cabo un escalado y se identifican las muestras sin señal de fusión ("negativos"). A continuación se determinan parámetros que especifican las funciones restantes. Finalmente, un procedimiento iterativo añade un resto cada vez y minimiza la función objetiva

211

a efectos de encontrar simultáneamente el parámetro de suavizado \sigma, las fracciones de masa de los estándares conocidos m_{i} y los parámetros de temperatura de fusión y fracción de masa de las funciones restantes, T_{j} y m_{j}. El procedimiento iterativo termina cuando la suma de fracciones de masa es mayor que 1 - \varepsilon, siendo \varepsilon una tolerancia, y cuando la señal de fusión aproximada del material mixto está suficientemente cercana a f_{mix}. Los resultados previamente calculados sirven como datos de entrada para el software de optimización que minimiza la función objetiva. El límite de tolerancia \varepsilon utilizado en los algoritmos es proporcional al tamaño relativo del ruido en la señal. Pueden utilizarse otros métodos de selección de la tolerancia.

En la figura 18 se muestra un diagrama de flujo del proceso algorítmico completo. La caja superior es la entrada al algoritmo, y los usuarios especifican los estándares y los desconocidos. La segunda caja determina los factores de escala de todas las señales y determina si alguna de las señales es negativa. La tercera caja indica dónde se determinan los parámetros de la función restante. Si las combinaciones de los estándares modelizan adecuadamente la curva de fusión desconocida, los parámetros restantes serán cero. En ausencia de estándares conocidos f_{i}, se utilizarán exclusivamente las curvas aproximadas f^{r}.

Las tres cajas inferiores forman el algoritmo iterativo para encontrar todos los componentes de los desconocidos. En primer lugar, el problema de minimización definido en esta sección se resuelve para el conjunto actual de estándares y restos. A continuación, el modelo se compara con los desconocidos y, si el ajuste está dentro de un límite de tolerancia, el algoritmo se detiene y proporciona sus resultados. Si el ajuste no está dentro de un límite de tolerancia, el algoritmo determina un nuevo estándar y repite la solución del problema de minimización.

Resultados

La fracción de alelo tipo salvaje se estima (como "salida") utilizando (1) el método de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (TMBSP), y (2) el método de análisis de relación de área de pico de fusión utilizando el software LCDA. En las tablas 3 y 4 se comparan estas salidas con la fracción real de alelo en la muestra ("entrada"). La salida del análisis TMBSP se obtiene para todas las fracciones de alelo, independientemente del sistema de sonda utilizado. Los valores están bastante de acuerdo con los valores de entrada. La salida del análisis de relación de área de pico de fusión se obtiene únicamente para las sondas de par FRET en las que las fracciones de alelo son mayores del 10% y menores del 90% (tabla 3). El software LCDA utilizado para este análisis fue incapaz de proporcionar la relación de área de pico de fusión para el sistema sólo con sonda Sensor debido a la dirección opuesta de cambio de señal en los datos de curva de fusión (figuras 16b, 17b). El software LCDA tampoco es capaz de detectar fracciones de alelo del 10% e inferiores, o del 90% y mayores.

TABLA 3

Datos obtenidos utilizando sólo sonda Sensor
Fracción de entrada de	Salida de análisis de relación de	Salida de análisis
alelo tipo salvaje (%)	área de pico de fusión (%)	TMBSP (%)
2	-	2
5	-	5
10	-	11
20	-	20
50	-	49
80	-	78
90	-	85
95	-	92
98	-	94

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TABLA 4

Datos obtenidos utilizando sondas de par FRET (sensor y aceptor)
Fracción de entrada de	Salida de análisis de relación de	Salida de análisis
alelo tipo salvaje (%)	área de pico de fusión (%)	TMBSP (%)
2	-	3
5	-	7
10	7	14
25	16	24
33	29	34
40	33	39
50	47	52
60	56	61
66	67	70
80	78	80
90	-	87
95	-	92
98	-	95

La diferencia entre los valores de salida y entrada se representa en función del valor de entrada (figura 19). Una diferencia de cero indica una concordancia completa entre los valores de salida y de entrada. La diferencia entre la entrada y la salida utilizando el procedimiento TMBSP tiene un promedio de -0,15 (SD = 2,4) y el intervalo de confianza a 95% incluye el cero, lo que indica la gran exactitud de las estimaciones generadas por el algoritmo TMBSP. La diferencia promedio entre la entrada y la salida utilizando el análisis de relación de área de pico de fusión es de -4,2 (SD = 2,9). El intervalo de confianza del 95% no incluye el cero, lo que indica una desviación en el procedimiento de relación de área de pico de fusión.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra que la dosis de gen en una mezcla puede cuantificarse utilizando el algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (TMBSP).

En un sistema de ejemplo, se estudia un locus génico de interés para el borrado o duplicación utilizando la adición de una cantidad conocida de ADN competidor no amplificable antes de la PCR. Tras la PCR, la relación de dosis entre el locus génico y el competidor en una muestra tipo salvaje se compara con la relación en muestras desconocidas con ayuda del algoritmo. Por ejemplo, se sabe que existen borrados y duplicaciones al nivel del exón en genes supresores de tumores, y aunque se consideran importantes en una variedad de tumores, incluyendo cáncer de pecho, cáncer de vejiga y cánceres colorrectales hereditarios sin poliposis, ha sido difícil llevar a cabo estudios detallados de estos grandes borrados y duplicaciones debido a las limitaciones de los procedimientos analíticos convencionales. En este sistema ejemplar, se facilita el análisis de estos grandes borrados y duplicaciones.

Los cebadores PCR se seleccionan para que amplifiquen un segmento del locus génico de interés. Típicamente, el segmento tiene una longitud comprendida entre 100 y 200 bp, aunque el segmento puede ser más largo o más corto. Se proporciona un sistema de sonda específico a la secuencia, por ejemplo un conjunto de sondas de hibridación, o alternativamente una sonda marcada una vez, que sea complementaria a una parte del segmento amplificado. Ilustrativamente, este segmento no contiene polimorfismos de un solo nucleótido. Además, se proporciona un polinucleótido competidor de cadena simple, generalmente también complementario a la sonda o sondas pero desparejado en una o más bases. Esta cadena competidora es ilustrativamente más corta que el segmento amplificado, típicamente entre 50 y 60 bases, y le falta la región necesaria para la hibridación de cebadores, de tal modo que el competidor no se amplifica durante la PCR. Además, el extremo 3' del competidor está fosforilado a efectos de inhibir la autoaspiración. Para una sonda indicadora típica con una longitud comprendida entre 17 y 19 bases, un desparejamiento de una sola base y/o el borrado adicional de una base en la cadena competidora crea un desplazamiento de entre 10 y 12ºC en la temperatura de fusión (Tm). Con un cambio de este tipo en la secuencia competidora, el competidor y la diana de interés pueden diferenciarse por la Tm. Alternativamente, la sonda puede estar diseñada para emparejarse completamente con el competidor (con un desparejamiento con respecto a la diana).

Ilustrativamente, se añade 1 \muM de competidor a 10 ng de ADN genómico humano en una mezcla de reacción de PCR de 10 \mul que contiene entre 0,1 y 0,2 \muM de cebadores y otros reactivos para la amplificación. La sonda o sondas también se disponen en una concentración de 0,2 \muM.

Tras la PCR, se lleva a cabo un análisis de curvas de fusión sobre muestras todas las cuales contienen la misma cantidad conocida de competidor. Típicamente, no resulta necesario iniciar el análisis de curvas de fusión en la fase exponencial de la PCR. El material amplificado producido después de entre 40 y 45 ciclos de PCR, es decir en la fase de meseta, proporcionará datos adecuados. Se utilizan dos hileras de estándares: la primera hilera comprende 1) una muestra tipo salvaje sin el competidor y 2) el competidor solo; la segunda hilera comprende la muestra tipo salvaje mezclada con el competidor. A partir de curvas de fusión de los estándares de la primera hilera, el algoritmo TMBSP calcula la relación de locus génico con respecto al competidor en el estándar mixto tipo salvaje. A continuación, las muestras desconocidas se analizan de modo similar y se normalizan con respecto a la relación del tipo salvaje. Las muestras de tipo salvaje tienen una relación normalizada de 1,0. Las muestras en las que el locus de interés está borrado en un cromosoma (aunque no en el otro) tienen una relación normalizada de 0,5. Las muestras con una duplicación en un factor de uno del locus en un cromosoma tienen una relación normalizada de 1,5.

Ejemplo 8

El sistema ejemplar del ejemplo 7 se modifica adicionalmente a efectos de que se adapte a situaciones en las que la cantidad de ADN de muestra antes de la PCR no está controlada. La utilización de un gen constitutivo a efectos de normalizar la cantidad de ADN a lo largo de las muestras es bien conocida. A la muestra se añaden un segundo conjunto de sondas para el gen constitutivo, preferentemente marcado con un colorante de color fluorescente distinto del primer conjunto de sondas, y un segundo competidor para el gen constitutivo exactamente en la misma cantidad que el primer competidor. Alternativamente se utiliza un competidor quimérico que soporta las secuencias del primer y el segundo competidores a efectos de asegurar una dosificación idéntica de las dos secuencias competidoras. La relación del gen constitutivo con respecto al competidor se calcula mediante el algoritmo en todas las muestras y, a continuación, se utiliza para normalizar la dosificación del locus génico.

\newpage

Ejemplo 9

El sistema descrito en el ejemplo 7 se simplifica adicionalmente mediante la utilización adicional del algoritmo de aproximación de la función de base (detallado en el ejemplo 6). En este caso, únicamente se requiere una curva de fusión estándar. El algoritmo de aproximación recoge la curva de fusión de la muestra tipo salvaje que está mezclada con su competidor y separa la curva en dos curvas estándares (una sólo para el gen y otra sólo para el competidor). A la relación del locus génico con respecto al competidor en la muestra tipo salvaje se le asigna el valor 1,0. A continuación, se utilizan las curvas estándar generadas por el algoritmo a efectos de calcular las relaciones en muestras desconocidas utilizando el algoritmo TMBSP. Las respuestas finales son las mismas que las generadas en el ejemplo 7.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra que la fracción de masa (o relación molar) de dos o más ácidos nucleicos en una muestra biológica puede cuantificarse utilizando el algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica (TMBSP) sin limitación para la utilización del mismo conjunto de cebador PCR para amplificación, o los mismos conjuntos de sonda para los diferentes ácido nucleicos.

Se amplifican segmentos del gen humano HER-2/neu y del gen constitutivo beta-actina utilizando cebadores PCR separados para cada gen, y se lleva a cabo análisis de fusión también utilizando sondas separadas. Las sondas están marcadas fluorescentemente a efectos de permitir la detección de los dos genes por un canal de detección del equipo LightCycler®. Las sondas también tienen diferentes temperaturas de fusión (Tm), de tal modo que los dos genes pueden distinguirse. El ejemplo 4 describe las sondas HER-2/neu en las que se utiliza el colorante LCRed 640 en la sonda indicadora con una Tm de 64ºC. Las patentes USA Nº 6.174.670 describe sondas de beta-actina en las que la sonda indicadora está marcada con Cy5 y tiene una Tm de aproximadamente 74ºC (patente USA Nº 6.174.670 ID. SEC. Nº 3 y ID. SEC. Nº 4). Los datos de curva de fusión a partir del estándar tipo salvaje se analizan en primer lugar mediante el algoritmo de aproximación de la función de base a efectos de convertir los datos en dos curvas de fusión separadas. A continuación, la relación de HER-2/neu con respecto a beta-actina en otras muestras se calcula mediante el algoritmo TMBSP, utilizando la relación en el estándar tipo salvaje como 1,0. También se contempla que, utilizando enfoques similares, puedan cuantificarse en una muestra biológica fracciones de masa (o relaciones molares) de más de dos especies de ácidos nucleicos.

<110> University of Utah Research Foundation

\hskip1cm

Idaho Technology

\hskip1cm

Eyre, David J.

\hskip1cm

Rasmussen, Randy P.

\hskip1cm

Caplin, Brian E.

\hskip1cm

Wade, Stevenson

\hskip1cm

Desilva, Deepika M.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> CUANTIFICACIÓN DE GENES EN TIEMPO REAL CON ESTÁNDARES INTERNOS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 7475-71277

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/316,614

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-08-31

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<160> 12

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada para clonación.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatccac ttcagtattg c

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintetizada para clonación.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattcca tggctgatcc tgcaggtac

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 59

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintetizada para clonación.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctgcag gtaccgatcg gatagtgagc gagagatagg tagggatggt tttatgtag

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintetizada para detección de estándar interno de cuantificación.

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(1)

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<223> marcación fluorescente 5'-LC640

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<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacctatct ctcgctcact atccatc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintetizada para detección de secuencia de HPV 16 artificial.

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Marcación fluorescente 5'-LC705

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<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attacatccc gtaccctctt ccccatt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada para clonación.

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<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatggctga tcctgcaggt ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintetizada para clonación.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacttcagt attgccatac cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintetizada para detección de estándar interno de cuantificación y secuencia de HPV artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_feature

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<222> (59)..(59)

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<223> Marcación fluorescente 3'-fluoresceína

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgtcatct gatatagcat cccctgtttt tttttccact acagcctcta cataaaacc

\hfill

59

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (23)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Marcación fluorescente 3'-fluoresceína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcctgcat gggcggcatg aac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

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<223> Marcación fluorescente 5'-LC640

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggcccat cctcaccatc atcacactgg aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcactggc ctcatctt

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcagcggc aagcaga

\hfill

17

Claims (10)

1. Procedimiento de determinación de relaciones molares de unos primeros y unos segundos ácidos nucleicos diana presentes en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) poner en contacto los ácidos nucleicos diana con un indicador de ácido nucleico fluorescente, estando configurado el indicador para proporcionar una señal relacionada con la cantidad de indicador hibridado a los ácidos nucleicos diana, estando además configurado el indicador para discriminar los ácidos nucleicos diana en base a la temperatura de fusión,

(b) iluminar la muestra de ensayo,

(c) variar la temperatura de la muestra de ensayo,

(d) controlar el cambio de fluorescencia a efectos de definir curvas de fusión f_{i} para cada ácido nucleico diana, y

(e) utilizar un algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica a efectos de determinar las relaciones molares de los ácidos nucleicos diana, encontrando simultáneamente dicho algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámica un parámetro de suavizado \sigma, la fracción de masa m_{i} de cada uno de los ácidos nucleicos diana presentes en la muestra y los parámetros de temperatura de fusión y fracción de masa de las funciones restantes, y utilizándose un procedimiento de optimización e iteración unidos a efectos de minimizar

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en la que f_{r} es la fluorescencia aproximada de la curva de fusión y en la que dicho procedimiento de optimización e iteración se repite hasta que una suma de las fracciones de masa es > 1 - \varepsilon, siendo \varepsilon un valor de tolerancia.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las relaciones molares de los ácidos nucleicos diana proporcionan información referente a un borrado o una duplicación en un gen.

3. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1-2, en el que el indicador fluorescente de ácido nucleico comprende una sonda de oligonucleótido específica de la secuencia marcada fluorescentemente.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la sonda de oligonucleótido específica de la secuencia se selecciona de entre el grupo que consiste en un sistema de sonda de par FRET y un oligonucleótido marcado una vez.

5. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1-4, en el que el segundo ácido nucleico diana es un competidor del primer ácido nucleico diana para el indicador de ácido nucleico fluorescente.

6. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1-5, en el que la muestra de ensayo comprende además una polimerasa termoestable y un par de cebadores de oligonucleótido configurados a efectos de amplificar el primer ácido nucleico diana, comprendiendo además dicho procedimiento la etapa de amplificar el ácido nucleico diana, teniendo lugar dicha etapa de amplificación antes de la etapa de utilización del algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámicamente.

7. Procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico diana presente en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

(a) combinar en un único recipiente de reacción, por lo menos, una parte de dicha muestra, una polimerasa termoestable, una concentración conocida de un ácido nucleico competidor, un par de cebadores de oligonucleótido PCR y una sonda de oligonucleótido; en el que se configura dicho par de cebadores de oligonucleótido PCR a efectos de amplificar un segmento seleccionado del ácido nucleico diana y del ácido nucleico competidor; en el que dicha sonda de oligonucleótido se hibrida a la región amplificada del ácido nucleico competidor o del ácido nucleico diana; en el que dicho ácido nucleico competidor presenta una única sección que tiene una secuencia diferente con respecto a una región correspondiente del ácido nucleico diana; y en el que el ácido nucleico competidor y el ácido nucleico diana se amplifican esencialmente con una eficacia idéntica; en el que se marca dicha sonda de oligonucleótido con un primer fluoróforo y la misma está configurada a efectos de hibridarse a la sección única del ácido nucleico competidor y a la región correspondiente del ácido nucleico diana; en el que la hibridación de la sonda de oligonucleótido, por lo menos, a uno de sus respectivos ácidos nucleicos diana complementarios provoca un cambio en la magnitud de fluorescencia del fluoróforo;

(b) amplificar el segmento seleccionado de los ácidos nucleicos diana y competidor;

(c) iluminar la muestra biológica y controlar el cambio de fluorescencia del primer fluoróforo; y

(d) llevar a cabo un análisis de curvas de fusión en el que el análisis de curvas de fusión incluye la utilización de un algoritmo de procesamiento de señales basado en modelización termodinámica, encontrando simultáneamente dicho algoritmo de procesamiento de señales de base termodinámicamente un parámetro de suavizado \sigma, la fracción de masa m_{i} de cada uno de los ácidos nucleicos diana presentes en la muestra, y los parámetros de temperatura de fusión y fracción de masa de las funciones restantes, y utilizándose un procedimiento de optimización e iteración unidos a efectos de minimizar

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en la que f_{r} es la fluorescencia aproximada de la curva de fusión y en la que dicho procedimiento de optimización e iteración se repite hasta que una suma de las fracciones de masa es > 1 - \varepsilon, siendo \varepsilon un valor de tolerancia.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico competidor comprende además una primera sección que presenta una secuencia idéntica a la correspondiente primera región del ácido nucleico diana; en el que la sonda de oligonucleótido es una sonda de anclado configurada a efectos de hibridarse a la primera sección del ácido nucleico competidor y a la primera región del ácido nucleico diana, adyacente a la sección única del ácido nucleico competidor y adyacente a la región correspondiente del ácido nucleico diana; en el que la etapa de combinación comprende además la combinación de una sonda diana y una sonda competidora en el recipiente de reacción, estando marcada dicha sonda competidora con un segundo fluoróforo y estando configurada a efectos de hibridarse a dicha sección única de la secuencia de ácido nucleico competidor, y estando marcada dicha sonda diana con un tercer fluoróforo y estando configurada a efectos de hibridarse a dicha correspondiente región de la secuencia de ácido nucleico diana; y en el que la hibridación de las sondas de anclado, diana y competidora a sus ácidos nucleicos diana y ácidos nucleicos competidores respectivamente complementarios coloca el primer fluoróforo y el segundo fluoróforo, así como el primer fluoróforo y el tercer fluoróforo, en una relación de transferencia de energía de resonancia.

9. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que la etapa (c) incluye controlar la fluorescencia como función del tiempo, comprendiendo además el procedimiento las etapas de

(e) crear un perfil de amplificación para el ácido nucleico diana y un perfil de amplificación para el ácido nucleico competidor; y

(f) comparar el perfil de amplificación del ácido nucleico diana con el perfil de amplificación del ácido nucleico competidor a efectos de determinar un desplazamiento de ciclo entre los ácidos nucleicos competidor y diana.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que las etapas (a) a (c) se repiten utilizando concentraciones conocidas variables del ácido nucleico competidor, y en el que el procedimiento comprende además la etapa de

(g) determinar una concentración inicial del ácido nucleico diana utilizando la ecuación logC_{0} = logE(\Deltan) + logT_{0}, en la que C_{0} representa la concentración inicial del ácido nucleico competidor, E representa la eficacia de amplificación, \Deltan representa el desplazamiento de ciclo entre los ácidos nucleicos competidor y diana y T_{0} representa la concentración inicial del ácido nucleico diana, presentando una recta generada a partir de la misma una pendiente igual al logaritmo de la eficacia de amplificación y una intersección con el eje de coordenadas "y" igual al logaritmo de la concentración inicial del ácido nucleico diana.