KR100738073B1 - 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법 - Google Patents

실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100738073B1
KR100738073B1 KR1020050030745A KR20050030745A KR100738073B1 KR 100738073 B1 KR100738073 B1 KR 100738073B1 KR 1020050030745 A KR1020050030745 A KR 1020050030745A KR 20050030745 A KR20050030745 A KR 20050030745A KR 100738073 B1 KR100738073 B1 KR 100738073B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
amplification
delete delete
fluorescence signal
intensity
Prior art date
Application number
KR1020050030745A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060045671A (ko
Inventor
남궁각
오광욱
김영아
김수현
김진태
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to JP2005246323A priority Critical patent/JP4440857B2/ja
Priority to EP07014693A priority patent/EP1842925B1/en
Priority to CN 200710084987 priority patent/CN101012484B/zh
Priority to DE200560015140 priority patent/DE602005015140D1/de
Priority to EP05019029A priority patent/EP1632580B1/en
Priority to DE200560008146 priority patent/DE602005008146D1/de
Priority to US11/217,694 priority patent/US7698072B2/en
Priority to DE200560019475 priority patent/DE602005019475D1/de
Priority to EP07014684A priority patent/EP1842924B1/en
Publication of KR20060045671A publication Critical patent/KR20060045671A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100738073B1 publication Critical patent/KR100738073B1/ko
Priority to JP2008313681A priority patent/JP4606492B2/ja
Priority to JP2008313682A priority patent/JP4885934B2/ja
Priority to US12/709,774 priority patent/US8340919B2/en
Priority to US13/161,788 priority patent/US8386191B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법이 개시된다. 생물 또는 바이러스 등으로부터 추출한 핵산(DNA 또는 RNA)을 효소를 이용하여 증폭한 다음, 배경 형광 신호를 제외한 최대 형광 신호의 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간; 최대 증폭 효율에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간; 배경 형광 신호를 제외한 핵산의 증폭 전 형광 신호의 세기를 산출하여 핵산의 초기 농도를 구한다. 이로써, 미분/적분 방법을 사용하지 않고 핵산의 초기 농도를 구할 수 있다.
증폭 사이클 수, 증폭 시간, 증폭 양, 형광 신호, 초기 농도, 증폭효율

Description

실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법{Method for quantification of initial nucleic acid concentration from real-time nucleic acid amplification data}
도 1은 핵산의 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계를 모델링한 그래프,
도 2a 내지 도 2f는 도 1에 도시된 수학적 모델과 실제 실험 결과를 도시한 그래프,
도 3은 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 관계를 도시한 그래프,
도 4는 도 3a에서 증폭 효율이 최대일 때의 증폭 사이클 수를 구하는 방법을 설명하기 위한 도면,
도 5는 도 1의 수학적 모델의 최대 형광 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수(n1/2) 및 도 3의 최대 증폭 효율(nEmax)과 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프,
도 6은 도 1의 수학적 모델에서 배경 형광 신호를 제외한 증폭 전 형광 신호의 세기 R0와 초기 핵산 농도와의 관계를 도시한 그래프,
도 7a 내지 도 7c은 본 발명에 따른 핵산의 초기 농도를 구하는 방법과 종래 의 결과를 도시한 표,
도 8은 핵산의 증폭량에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계를 도시한 그래프 및 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 관계를 도시한 그래프를 함께 도시한 도면,
도 9는 도 8의 실험결과 그래프로부터 얻은 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프,
도 10은 핵산의 배경 형광 신호를 고려한 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 관계를 도시한 도면,
도 11은 초기 형광 신호의 세기를 도시한 도면,
도 12a 내지 도 12b는 배경 형광 신호의 세기에 따른 증폭 효율의 변화를 도시한 그래프,
도 12c는 도 12a 및 도 12b에서 살핀 Rb의 값의 크기 변화에 따른 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프 및 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프를 각각 도시한 도면,
도 13 및 도 14는 배경 형광 신호의 세기에 따른 형광 신호 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계를 도시한 그래프,
도 15는 배경 형광 신호의 세기가 0인 경우와 0이 아닌 경우의 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프,
도 16은 도 15의 그래프를 통해 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV를 구한 결과를 도시한 도면, 그리고,
도 17은 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV에 따른 핵산의 초기 농도의 error를 도시한 그래프이다.
본 발명은 핵산의 초기 농도를 구하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 증폭 방법(예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction), LCR(Ligase Chain Reaction), SDA(Strand Displacement Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), RCA(Rolling-Circle Amplification) 등)을 사용하여 얻은 실시간(real-time) 핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 구하는 방법에 관한 것이다.
핵산을 검출하고 정량화하기 위한 다양한 분석 방법들 중에서, PCR은 가장 널리 쓰이는 방법으로 미국특허공보 4683195 및 4683202에 그 원리가 개시되어 있다.
기존의 PCR은 단지-종말점(end-point)에서 젤 전기영동(Agarose Gel)을 이용하여 증폭된 DNA의 정성적인 결과만을 보여주는 것으로서 DNA의 정량적 검출 정확성 등에 많은 문제점을 가지고 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 광학적 검출시스템을 이용하여 증폭된 DNA의 농도에 비례하는 형광 신호의 세기를 실시간 으로 검출함으로써 DNA의 정량 분석을 가능하게 하는 실시간(real-time) PCR이 개발되었다.
핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 정량화하는 종래의 방법으로 미국특허공보 등록번호 제6303305호 및 제6503720호가 있다. 여기서는, 핵산을 증폭하고 증폭의 각 사이클에서의 핵산 증폭 양을 나타내는 함수를 구한 다음 그 함수를 n차 미분하여 그 결과로부터 핵산의 초기 농도를 구하는 방법을 제공한다. 미국특허공보 제6303305호는 미분의 maximum값을 Ct(Threshold Cycle)로 하는 정량분석 방법, 제6503720호는 미분의 maximum, minimun, zero 값을 Ct로 하는 정량분석 방법을 개시한다.
또한, 핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 정량화하는 종래의 다른 방법으로 미국공개공보 공개번호 제2002-0031768호가 있다. 여기서는, 미분의 특정 값을 이용하여 핵산의 농도를 정량화하는 방법을 제공한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 미분/적분을 사용하지 않고 정량화하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위한, 본 발명에 따른 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법의 일 실시 예는, (a) 핵산을 증폭하는 단계; (b) 상기 핵산의 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간에 따라 실시간으로 나타나는 상기 핵산의 증폭 양에 따른 형광 신호 사이의 상관관계를 나타내는 함수를 생성하는 단계; (c) 상기 함수를 이용하여 상기 핵산의 배경 형광 신호를 제외한 상기 핵산의 형광 신호의 최대 값의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간을 산출하는 단계; 및 (d) 상기 산출한 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간으로부터 상기 핵산의 초기 농도를 구하는 단계;를 포함한다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위한, 본 발명에 따른 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법의 다른 실시 예는, (a) 핵산을 증폭하는 단계; (b) 상기 핵산의 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간에 따라 실시간으로 나타나는 상기 핵산의 증폭 양에 따른 형광 신호의 세기와의 상관관계를 나타내는 함수를 생성하는 단계; (c) 상기 함수를 이용하여 상기 핵산의 배경 형광 신호를 제외한 상기 핵산의 증폭 전 형광 신호의 세기를 산출하는 단계; 및 (d) 상기 산출한 증폭 전 형광 신호의 세기로부터 상기 핵산의 초기 농도를 구하는 단계;를 포함한다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위한, 본 발명에 따른 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법의 다른 실시 예는, (a) 핵산을 증폭하는 단계; (b) 상기 핵산의 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간에 따라 실시간으로 나타나는 상기 증폭 사이클 또는 증폭 시간 동안의 증폭 효율을 나타내는 함수를 생성하는 단계; (c) 상기 함수를 이용하여 상기 증폭 효율의 최대 값에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간을 산출하는 단계; 및 (d) 상기 산출한 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간으로부터 상기 핵산의 초기 농도를 구하는 단계;를 포함한다.
이로써, 미분/적분을 사용하지 않고 핵산의 초기 농도를 정량화 할 수 있다.
이하에서, 첨부된 도면들을 참조하여 실시간 핵산 증폭, 특히 PCR 데이터로부터 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
도 1은 핵산의 증폭량에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계를 모델링한 그래프이다.
효소를 이용한 핵산 증폭은 PCR, RT-PCR, nested PCR, LCR 등의 열적 사이클(thermal cycle)을 필요로 하는 핵산 증폭 방법에 의하거나, SDA, NASBA, TMA, RCA 등의 등온(isothermal) 핵산 증폭 방법에 의하여 수행된다. 여기서, 핵산은 생물이나 바이러스 등으로부터 추출될 수 있다.
실시간 PCR 데이터로부터 핵산 증폭 양에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수를 측정하여 측정한 데이터를 도 1에 도시된 바와 같은 그래프로 모델링 할 수 있다. 도 1에 도시된 sigmoidal 모델은 아래 수학식 1로 나타낼 수 있다.
Figure 112005019224546-pat00001
여기서, R은 핵산의 형광 신호(Fluorescence Signal)의 세기, Rb는 핵산 형광 신호의 배경(background) 세기, Rmax는 핵산의 최대 형광 신호 세기, n은 증폭 사이클 수, n1/2는 핵산 형광 신호 세기의 배경 세기를 제외한 핵산 형광 신호 세기 의 최대 값의 반에 해당하는 증폭 사이클 수, k는 형광 신호의 증가에 대한 기울기를 나타낸다.
수학적 모델과 실제 PCR 실험 데이터와의 오차는 수학식 2로부터 구할 수 있다.
Figure 112005019224546-pat00002
여기서, Rn은 n번째 사이클에서 실제로 실험에서 얻은 핵산의 형광 신호의 세기이다.
도 1에 도시된 수학적 모델에 대한 각각의 파라메타(Rb, Rmax, n1/2, k) 값을 구하기 위해 least square fitting 방법을 사용하면, 수학식 3 및 수학식 4a 내지 4d의 비선형 방정식을 얻게 되는데, 이것을 Newton-Raphson 방법으로 푼다.
Figure 112005019224546-pat00003
여기서,
Figure 112005019224546-pat00004
은 수학식 2에서 정의되었다.
Figure 112005019224546-pat00005
Figure 112005019224546-pat00006
Figure 112005019224546-pat00007
Figure 112005019224546-pat00008
그리고, 핵산의 배경 형광 신호(Rb)를 제외한 상기 핵산의 증폭 전 형광 신호의 세기는 수학식 1에서 n=0 일 경우이므로 수학식 5와 같이 정의된다.
Figure 112005019224546-pat00009
도 2a 내지 도 2f는 도 1에 도시된 수학적 모델과 실제 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 2a는 초기 핵산 농도가 107 copy/rxn(반응용액 내 copy 수)인 경우, 도 2b는 106copy/rxn, 도 2c는 105copy/rxn, 도 2d는 104copy/rxn, 도 2f는 5x105copy/rxn, 그리고, 도 2e는 2.5x106copy/rxn의 초기 핵산 농도를 가진 경우이다. 핵산의 초기 농도에 따라 핵산이 급격하게 증폭되는 사이클 수가 각각 다르다는 것을 알 수 있다.
그리고, 핵산의 증폭 양에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관관계의 실험 결과와 도 1에서 구한 수학적 모델의 그래프가 거의 유사함을 알 수 있다.
도 3은 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 관계를 도시한 그래프이다.
도 3은 PCR의 증폭 효율을 도시한 도면이다. 도 3을 참조하면, PCR 과정에서 증폭 효율이 항상 일정하지 않음을 알 수 있다. 이 증폭 효율을 수학적 모델로 모델링하면 다음 수학식 6a 및 6b과 같다.
Figure 112005019224546-pat00010
여기서, Rn은 n번째 증폭 사이클에서 형광 신호의 세기, Rn-1은 (n-1)번째 증폭 사이클에서 형광 신호의 세기, En은 n번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율을 나타낸다. En으로 수학식 6a를 다시 정리하면 수학식 6b와 같다.
Figure 112005019224546-pat00011
도 4는 도 3에서 증폭 효율이 최대일 때의 증폭 사이클 수를 구하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 4를 참조하면, 곡선 상의 세 곳에서의 데이터를 알고 있다. 이 때, y 축의 최대 값에 해당하는 x 값을 구하기 위해 parabolic curve fitting을 사용하는 수학적 방법은 다음과 같다.
먼저, 세 개의 좌표점 (x1,y1),(x2,y2),(x3,y3)에 대해 다음 수학식 7a를 세운다.
Figure 112005019224546-pat00012
수학식 7a를 다시 행렬로 정리하면, 수학식 7b와 같다.
Figure 112005019224546-pat00013
여기서,
Figure 112005019224546-pat00014
라 하면, 상수 a, b, c는 다음과 같이 구할 수 있다.
Figure 112005019224546-pat00015
Figure 112005019224546-pat00016
Figure 112005019224546-pat00017
아래의 수학식 7d로부터 xmax는 다음과 같이 구할 수 있다.
Figure 112005019224546-pat00018
지금까지, 핵산의 증폭 양에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수의 관계를 수학적 모델을 통해 구현하고, 수학적 모델의 각각의 파라메타를 구하는 방법에 대해 살펴보았다. 이하에서, 수학적 모델의 특정 파라메타가 핵산의 초기 농도와 어떤 관련성이 있는지 살펴보고 이러한 관련성을 기초로 핵산의 초기 농도를 정량화하는 방법에 대해 살펴본다.
도 5는 도 1의 수학적 모델에서 핵산의 배경 형광 신호를 제외한 핵산의 최대 형광 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수(n1/2) 및 도 3의 수학적 모델에서 최대 증폭 효율(nEmax)과 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프이다.
도 5를 참조하면, 핵산의 초기 농도(log[copy/rxn))가 높을수록 최대 형광 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수(n1/2) 및 최대 증폭 효율(nEmax)이 낮아짐을 알 수 있다. 그리고, 종래의 미분 값을 이용하여 초기 핵산 농도를 구하는 방법에서의 기울기(도 5의 이차 미분에 의한 보정 곡선(CT))와 본 발명에서 사용할 n1/2 및 nEmax의 기울기가 거의 동일함을 알 수 있다. 다만, nEmax가 n1/2보다 아래 쪽에 위치하므로, nEmax를 이용하는 경우 n1/2보다 더 적은 증폭 사이클 수로 핵산의 초기 농도를 정량화 할 수 있다.
도 6은 도 1의 수학적 모델로부터 얻은 수학식 5에서의 R0와 초기 핵산 농도와의 관계를 도시한 그래프이다. 도 6을 참조하면, log(초기 핵산 농도)와 log(R0)가 선형적인 비례 관계임을 알 수 있다.
따라서, 도 5및 도 6의 선형적인 비례관계를 이용하여 핵산의 초기 농도를 구할 수 있는 세 가지 방법이 제시된다. 첫째, 핵산의 배경 형광 신호를 제외한 핵산의 최대 형광 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수를 이용하는 방법(n1/2), 둘째, 핵산 증폭 효율이 최대가 되는 증폭 사이클 수 또는 시간을 이용하는 방법(nEmax), 셋째, 핵산의 배경 형광 신호 세기를 제외한 증폭 전 핵산 샘플의 형광 신호의 세기를 이용하는 방법(R0)이다.
이상의 방법을 이용하여 초기 농도를 모르는 소정의 핵산 샘플에 대해 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 초기 농도를 알고 있는 소정의 핵산 표준 샘플들에 대해 핵산 증폭 반응(예를 들면, PCR,LCR,SDA,NASBA,TMA,RCA 등)을 수행하여 도 1 또는 도 3에서 제시한 수학적 모델의 각각의 파라메타를 구하고, 그 파라메타를 이용하여 도 5 또는 도 6에 도시된 바와 같은 비례관계를 나타내는 그래프, 즉 보정 곡선(calibration curve)를 구한다.
그리고, 소정의 핵산 샘플에 대해서도 같은 핵산 증폭 방법을 수행하여 n1/2, nEmax, 또는 R0를 구하여 도 5 또는 도 6과 같은 보정 곡선으로부터 핵산의 초기 농도를 구한다. 특히, nEmax를 이용하는 경우는 매우 간단한 계산으로 핵산의 초기 농도의 정량화가 가능하고 실시간으로 증폭 효율을 구하여 정량할 수 있으므로 증폭 사이클 수를 줄일 수 있다.
도 7a 내지 도 7c은 본 발명에 따른 핵산의 초기 농도를 구하는 방법과 종래의 결과를 도시한 표이다.
도 7a는 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같은 선형 그래프를 얻기 위해 초기 값을 알고 있는 핵산에 대한 모델링 및 모델링의 각 파라메타의 산출 값을 보여준다(6회 반복). 도 7b 및 도 7c는 도 7a에서 구한 보정 곡선을 이용하여 본 발명에 따른 방법으로 핵산의 초기 농도를 구한 값과 종래의 미분에 의해 초기 농도를 구한 경우를 비교한 값을 보여준다. 도 7b 및 도 7c에서 보듯이, n1/2, nEmax, 또는 R0가 Ct를 대신하여 핵산의 정량분석 인자로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 도 7b에서, Error는 [(보정 곡선으로부터 구한 값 copy/rxn) - (참 값 copy/rxn)]의 절대치 / (참 값 copy/rxn)의 백분율인데, 예를 들면, Error(Ct)는 [5.4E+05 - 5.0E+05]/5.0E+05 의 백분율로서, 8.08%이다. 도 7c에서, Avg error at 5.0E05는 5.00E+05 copy/rxn의 6회 반복결과 Error들(도 7b)의 평균값을 나타낸다.
도 8은 핵산의 증폭량에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계를 도시한 그래프 및 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 관계를 도시한 그래프를 함께 도시한 도면이다.
도 8을 참조하면, 핵산의 증폭량에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계 그래프는 핵산의 배경 형광 신호(수학식 1에서 Rb=0)를 제외한 경우의 그래프이다. 도 11을 통해, 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계 그래프는 형광 신호의 세기가 초기 0이 아닌 값으로부터 시작하여 0으로 줄어들다가 다시 증가하는 모양임을 알 수 있는데, 이것은 형광 염료(fluorescence dye)가 나타내는 일반적인 광표백 효과(photobleaching effect)에 의한 것이다. 또한, 배경 형광 신호를 제외한 경우의 증폭 효율 그래프는 도 8에 도시된 바와 같이 모양이 뾰족하고 날카롭다.
도 9는 도 8의 실험결과 그래프로부터 얻은 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프이다.
도 9를 참조하면, 초기농도가 1E+03 부터 1E+08의 경우는 농도에 따른 최대 증폭 효율이 선형적이어서 본 발명에 따른 초기 농도를 구하기 위한 표준 곡선으로 사용가능하지만, 초기농도가 1E+3 이하인 경우는 농도에 따른 최대 증폭 효율이 불규칙하다.
도 10은 핵산의 배경 형광 신호를 고려한 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 관계를 도시한 도면이다.
배경 형광 신호의 세기(Rb)를 고려한 증폭 효율과 증폭 사이클 수와의 상관 관계 함수는 다음 수학식 8과 같다.
Figure 112005019224546-pat00019
여기서, Rn은 n번째 증폭 사이클에서 형광 신호의 세기, Rn-1은 (n-1)번째 증폭 사이클에서 형광 신호의 세기, Rb는 배경 형광 신호의 세기, En은 n번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율을 나타낸다.
도 10은 핵산의 초기 농도가 1.0E+07 copy/rxn인 경우에 대해 6회 반복 실험하여 4가지 다른 Rb의 정의에 따른 증폭 효율을 도시한 그래프이다. Rb의 값이 0인 경우, 즉 증폭에 따른 형광 신호 세기의 최소값(Rmin)이 0인 경우는 도 9에서 도시된 바와 같이 모양이 매우 뾰족하고 날카롭다. 또한, Rb의 값이 0인 경우의 최대 증폭 효율이 나타나는 시점은 일정하나 Rb의 값이 0이 아닌 경우보다는 최대 증폭 효율이 나타나는 시점이 빠르고 최대 증폭 효율의 값 또한 일정하지 않다.
이에 반해, Rb의 값이 0이 아닌 경우(즉, R1, 0.01, -(Rb)sigmoidal)는 최대 증폭 효율이 나타나는 시점 및 최대 증폭 효율의 값이 일정함을 알 수 있다.
이하에서, 먼저, Rb의 값으로 사용가능한 상수에 대해 살펴본 후, Rb의 값을 고려한 경우의 향상된 점들에 대해서는 도 15 내지 도 17을 참조하여 살펴본다.
첫째, 핵산의 증폭량에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계의 실험 데이터를 curve fitting 하여 얻은 도 1의 sigmoidal 모델(수학식 1)을 통해 산출한 배경 형광 신호의 세기((Rb)sigmoidal)를 Rb의 값으로 사용할 수 있다.
둘째, 증폭 사이클에 따른 형광 신호의 세기가 초기에 0이 아닌 값으로부터 출발하여 0으로 줄어들다가 다시 증가하는 경우(도 11 참조), 초기 형광 신호의 세기(증폭 사이클 = 0 인 경우) 값을 실험적으로 측정하여 Rb의 값으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 초기 형광 신호의 세기를 도시한 도 11을 참조하면, 초기 형광 신호의 세기는 초기 핵산 농도에 따라 다소 차이가 있지만 평균적으로 0.01이므로 Rb의 값으로 0.01을 사용할 수 있다. 이 방법은 시약, 형광 염료 및 형광 염료의 광 노출 시간 등이 바뀌지 않는 한, 초기 형광 신호의 세기는 일정할 것이기 때문에 처음에 한 번만 실험적으로 측정한 후에는 계속 Rb를 상수로 고정시켜 사용할 수 있는 장점이 있다. 다만, 시약, 형광 염료 및 형광 염료의 광 노출 시간 등이 바뀐다면, 처음에 한 번은 실험적으로 초기 형광 신호의 세기를 측정하여 상수 Rb의 값을 구해야 한다.
셋째, 첫 번째 사이클에서의 핵산 형광 신호의 세기(R1)를 Rb의 값으로 사용할 수 있다. 이 방법은 시약, 형광 염료 및 형광 염료의 광 노출 시간 등이 바뀌어 도 매 실험마다 자동적으로 초기 형광 신호의 세기를 보정하는 방법으로 상기 두 번째 방법에 비해 장점을 갖지만 초기 형광 신호의 세기가 0에 매우 가까울 경우에는 오차가 커지는 단점이 있다.
넷째, 수학식 8의 증폭 효율 함수에서 최대 증폭 효율의 값이 '1'이 되도록 하는 값을 Rb의 값으로 사용할 수 있다. 이 방법은 최대 증폭 효율이 1이 되는 Rb를 구하기 위해 반복적으로 Rb의 값을 변화시켜가며 Rb를 구하는 방법으로, 원리적으로 가장 타당한 방법이지만 반복계산을 해야 한다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 배경 형광 신호의 세기는 크게 1) 도 1의 sigmoidal 모델(수학식 1)을 통해 얻은 배경 형광 신호의 세기((Rb)sigmoidal), 2) 초기 형광 신호의 세기에 해당하는 값(도 11에서는 대략 0.01), 3) 첫 번째 사이클에서의 형광 신호의 세기(R1), 4) 최대 증폭 효율의 값이 '1'이 되도록 하는 값으로 설정할 수 있다.
여기서, (Rb)sigmoidal값을 사용하고 하는 경우는 curve fitting을 통해 그 값을 구해야 하는 불편함이 있으나, 그 외의 값들(초기 형광 신호의 세기, R1 등)은 curve fitting을 사용하지 않아도 된다.
Rb의 값으로 위에서 살핀 네 가지의 상수 외에 더 큰 양수 또는 음수의 값을 사용하는 경우에도 증폭 효율 그래프는 일정한 형태로 나타난다. 이를 도 12a 내지 도 12c에서 살펴본다.
도 12a 내지 도 12b는 배경 형광 신호의 세기에 따른 증폭 효율의 변화를 도시한 그래프이다.
도 12a를 참조하면, Rb의 값이 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000인 경우가 각각 도시되어 있다. 각각의 그래프는 초기농도에 따라 일정한 패턴을 가지므로 본 발명에 따른 초기 농도를 정량화하데 사용할 수 있다. 그러나, Rb의 값이 0.1 이상인 경우에 증폭 효율의 최대 값은 1 보다 매우 작게 된다. 증폭 효율이 1 보다 매우 작은 값을 가지는 것은 증폭이 되지 않았다는 것을 의미하므로 증폭 효율의 의미를 고려한다면 물리적 의미가 없다. 하지만, 도 12a에 도시된 Rb의 값에 따른 증폭 효율과 증폭 사이클 수의 관계를 보면, 초기 핵산의 농도에 따라 각각의 증폭 효율 함수가 최대값을 갖는 증폭 사이클이 일정한 간격으로 놓여있기 때문에, 모두 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법으로 사용할 수 있다. 다만, 도 12a에 도시된 Rb의 값들 중에는 증폭 효율이 0과 1 사이에 존재하는 경우인, Rb의 값이 0.01인 경우(즉, 초기 핵산의 형광 신호 세기)를 사용하는 것이 바람직하다.
도 12b를 참조하면, Rb의 값이 -0.01, -0.1, -1, -10, -100, -1000인 경우각 각각 도시되어 있다. Rb의 값이 -0.01과 -0.1인 경우는 증폭 효율 함수(수학식 8)의 분모가 0에 가까워져서 일정한 패턴의 그래프가 나타나지 않지만, 그보다 절대값이 큰 값들의 경우는 핵산 초기 농도에 따라 일정한 패턴으로 나타난다. 특히, Rb의 값이 -1이하인 경우에는 증폭 효율의 값이 음수로 나타난다. 증폭 효율은 0과 1사이 에서 물리적 의미를 가지므로 도 12b에서 도시한 값들을 사용하여 핵산의 초기 농도를 정량화할 수는 있으나 증폭 효율의 물리적 의미는 없다. 하지만, 도 12b에 Rb의 값에 따른 증폭 효율과 증폭 사이클 수의 관계를 보면, Rb가 -1 이하인 경우(-1, -10, -100, -1000) 초기 핵산 농도에 따라 각각의 증폭 효율의 함수가 최소값을 갖는 증폭 사이클이 일정한 간격으로 놓여있기 때문에, 모두 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법으로 사용할 수 있다.
도 12c는 도 12a 및 도 12b에서 살핀 Rb의 값의 크기 변화에 따른 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프 및 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래플를 각각 도시한 도면이다.
도 12c를 참조하면, Rb의 값이 양수로 증가(도 12a) 또는 음수로 감소(도 12b)하면 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 곡선은 일정한 곡선으로 수렴한다. 또한, Rb의 값이 0 및 -0.01인 경우를 제외하면 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV는 핵산의 초기 농도가 1.0E+03과 1.0E+08인 범위 내에서 5% 이내에 들어옴을 알 수 있다. 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV와 핵산의 초기 농도의 error와의 관계는 도 17을 참조하여 살펴본다.
Rb의 값이 일정이상이면 %CV 값은 별로 변화가 없으므로, 증폭 효율의 값이 0과 1사이에 위치하면서 %CV 값을 향상하고자 할 경우 도 10에서 설명한 4가지의 상수 중 Rb=0을 제외한 나머지, 즉 R1, 0.01, -(Rb)sigmoidal을 Rb의 값으로 사용하는 것이 바람직하다.
도 13 및 도 14는 배경 형광 신호의 세기에 따른 형광 신호 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계를 도시한 그래프이다.
도 13 및 도 14를 참조하면, Rb의 값이 0인 경우에는 형광 신호 세기의 최저 값이 거의 0이 되어(즉, Rb=Rbmin= 0) 수학식 8의 분모(Rn-1)가 0에 가까워지므로, 증폭 효율(En)이 현실과 맞지 않게 커지고, Emax peak는 매우 날카로워지고, noise의 영향을 많이 받는다. Rb의 값이 0이 아닌 경우는 증폭 효율이 일정한 패턴으로 나타난다. 다만, 도 14에서 Rb=R1을 사용한 경우, 증폭 사이클의 초기(cycle number≤5)에 1보다 큰 최대 증폭 효율이 나타나고 그 peak의 모양이 매우 날카로운데, 일반적인 핵산 증폭 방법에서는 이와 같이 초기에 핵산이 급격히 증폭되는 일은 발생하지 않고 증폭 효율이 1보다 큰 것은 물리적으로 의미가 없으므로 그 peak을 무시해야 한다.
도 15는 배경 형광 신호의 세기가 0인 경우와 0.01인 경우의 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수와 핵산의 초기 농도와의 관계를 도시한 그래프이다. 그리고, 도 16은 도 15의 그래프를 통해 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV를 구한 결과를 도시한 도면이다.
도 15를 참조하면, 배경 형광 신호의 세기가 0인 경우 그래프와 배경 형광 신호의 세기가 0.01인 경우의 그래프는 1E+03과 1E+08사이의 농도에서 선형적이다. 다만, 배경 형광 신호의 세기가 0.01인 경우의 그래프가 위쪽에 위치한다.
도 16을 참조하여, 도 15의 분석 결과를 살펴보면, 배경 형광 신호의 세기가 0.01인 경우에 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV(=St.Dev(표준편차)/Avg(평균))가 매우 향상됨을 알 수 있다.
도 17은 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV에 따른 핵산의 초기 농도의 error를 도시한 그래프이다.
도 17을 참조하면, 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV가 0.5에서 5.0으로 변할 때, error(in copy)는 6.85%에서 48.5%로 매우 큰 변화가 있음을 알 수 있다. 즉, 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV의 값이 조금만 커져도 실제 핵산의 초기 농도의 정량 값에 큰 오차를 가져올 수 있기 때문에 매우 정확한 정량방법이 요구되며, 도 16에서 도시된 바와 같이 배경 형광 신호의 세기가 0.01인 경우, 0인 경우에 비해 핵산의 초기 농도 정량의 정확도가 매우 높다고 할 수 있다.
본 발명은 또한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체에 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록장치를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체의 예로는 ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피디스크, 광데이터 저장장치 등이 있으며, 또한 캐리어 웨이브(예를 들어 인터넷을 통한 전송)의 형태로 구현되는 것도 포함한다. 또한 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템에 분산되어 분산방식으로 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드가 저장되고 실행될 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명에 따르면, 실시간 핵산 증폭(PCR,LCR,SDA,NASBA,TMA,RCA 등) 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 구하는 방법에 있어서 핵산의 증폭 양과 증폭 사이클 사이의 상관 관계에 대한 수학적 모델을 기초로 미분/적분을 사용하지 않고 배경 형광 신호를 제외한 최대 형광 신호의 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간, 최대 증폭 효율에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간, 배경 형광 신호를 제외한 핵산의 증폭 전 형광 신호의 세기로부터 핵산의 초기 농도를 구할 수 있다.
특히, 최대 증폭 효율을 사용하는 경우 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 실시간으로 증폭 효율을 구할 수 있으므로 다른 방법에 비해 더 빨리 핵산의 초기 농도 를 구할 수 있다.

Claims (30)

  1. (a) 핵산을 증폭하는 단계;
    (b) 상기 핵산의 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간에 따라 실시간으로 나타나는 상기 핵산의 증폭 양에 따른 형광 신호 사이의 상관관계를 sigmoidal model을 이용하여 함수로 생성하는 단계;
    (c) 상기 함수를 이용하여 상기 핵산의 배경에 나타나는 배경 형광 신호를 제외한 상기 핵산의 형광 신호의 최대 값의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간을 산출하는 단계; 및
    (d) 상기 핵산의 배경 형광 신호를 제외한 상기 핵산의 형광 신호의 최대 값의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간과 핵산의 초기 농도와의 관계를 나타내는 보정 곡선을 이용하여 상기 (c) 단계에서 산출한 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간으로부터 상기 핵산의 초기 농도를 구하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계는,
    효소를 이용하여 상기 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계는,
    열적 사이클(Thermal cycling)을 필요로 하는 핵산 증폭 방법에 의해 상기 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초기 핵산 농도를 정량화하 는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계는,
    등온(isothermal) 핵산 증폭 방법에 의해 상기 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계는,
    상기 sigmoidal model을 이용한 함수에 대해 비선형 least square fitting을 사용하여 상기 함수로부터 상기 핵산의 배경 형광 신호를 제외한 상기 핵산의 형광 신호의 최대 값의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간을 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초기 핵산 농도를 정량화하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
KR1020050030745A 2004-09-01 2005-04-13 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법 KR100738073B1 (ko)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005246323A JP4440857B2 (ja) 2004-09-01 2005-08-26 リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法
EP07014684A EP1842924B1 (en) 2004-09-01 2005-09-01 Method for quantifying initial concentration of nucleic acids from real-time amplification data
DE200560015140 DE602005015140D1 (de) 2004-09-01 2005-09-01 Verfahren zur Bestimmung einer anfänglichen Nukleinsäurekonzentration anhand von Echtzeit-Nukleinsäure-Verstärkungsdaten
EP05019029A EP1632580B1 (en) 2004-09-01 2005-09-01 Method for quantifying initial concentration of nucleic acids from real-time amplification data
DE200560008146 DE602005008146D1 (de) 2004-09-01 2005-09-01 Methode für die Quantifizierung der Ausgangs-Konzentration von Nukleinsäuren ausgehend von real-time Amplifikationsdaten
US11/217,694 US7698072B2 (en) 2004-09-01 2005-09-01 Method for quantifying initial concentration of nucleic acid from real-time nucleic acid amplification data
EP07014693A EP1842925B1 (en) 2004-09-01 2005-09-01 Method for quantifying initial concentration of nucleic acids from real-time amplification data
CN 200710084987 CN101012484B (zh) 2004-09-01 2005-09-01 从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法
DE200560019475 DE602005019475D1 (de) 2004-09-01 2005-09-01 Verfahren zur Bestimmung einer anfänglichen Nukleinsäurekonzentration anhand von real-time Amplifikationsdaten
JP2008313681A JP4606492B2 (ja) 2004-09-01 2008-12-09 リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法
JP2008313682A JP4885934B2 (ja) 2004-09-01 2008-12-09 リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法
US12/709,774 US8340919B2 (en) 2004-09-01 2010-02-22 Method for quantifying initial concentration of nucleic acid from real-time nucleic acid amplification data
US13/161,788 US8386191B2 (en) 2004-09-01 2011-06-16 Method for quantifying initial concentration of nucleic acid from real-time nucleic acid amplification data

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040069560 2004-09-01
KR20040069560 2004-09-01

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060083659A Division KR100723430B1 (ko) 2004-09-01 2006-08-31 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법
KR1020060083660A Division KR100738118B1 (ko) 2004-09-01 2006-08-31 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060045671A KR20060045671A (ko) 2006-05-17
KR100738073B1 true KR100738073B1 (ko) 2007-07-12

Family

ID=36751038

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050030745A KR100738073B1 (ko) 2004-09-01 2005-04-13 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법
KR1020060083659A KR100723430B1 (ko) 2004-09-01 2006-08-31 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법
KR1020060083660A KR100738118B1 (ko) 2004-09-01 2006-08-31 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060083659A KR100723430B1 (ko) 2004-09-01 2006-08-31 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법
KR1020060083660A KR100738118B1 (ko) 2004-09-01 2006-08-31 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법

Country Status (5)

Country Link
EP (2) EP1842925B1 (ko)
JP (2) JP4885934B2 (ko)
KR (3) KR100738073B1 (ko)
CN (2) CN100378229C (ko)
DE (3) DE602005019475D1 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101413659B1 (ko) 2007-12-06 2014-07-01 삼성전자주식회사 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의초기 농도를 결정하는 방법
EP2877952B1 (en) 2012-07-27 2023-04-12 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
DE102013215166B3 (de) * 2013-08-01 2014-10-30 Gna Biosolutions Gmbh PCR-Verfahren zur Superamplifikation
DE102013215168B4 (de) * 2013-08-01 2016-01-07 Gna Biosolutions Gmbh Verwendung von einem oder mehreren Nanopartikeln zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren
WO2016070945A1 (de) 2014-11-07 2016-05-12 Gna Biosolutions Gmbh Pcr-verfahren zur superamplifikation
WO2016074701A1 (de) 2014-11-10 2016-05-19 Gna Biosolutions Gmbh Verfahren zum vervielfältigen von nukleinsäuren
US11410751B2 (en) 2016-05-27 2022-08-09 Life Technologies Corporation Methods and systems for graphical user interfaces for biological data
US10510436B2 (en) * 2016-07-05 2019-12-17 Credo Biomedical Pte Ltd. Using serial dilutions of reference samples to construct a reference table for sigmoidal fitting in real-time PCR copy number analysis
CN107312850A (zh) * 2017-07-19 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种pcr无效扩增的检测方法
CN111149170A (zh) * 2017-09-28 2020-05-12 Seegene株式会社 分析试样内靶分析物的方法及装置
CN107784197B (zh) * 2017-10-27 2021-01-19 领航基因科技（杭州）有限公司 一种pcr实验优化方法
CN107622185B (zh) * 2017-10-27 2020-08-21 领航基因科技（杭州）有限公司 一种数字pcr浓度计算方法
US20220025449A1 (en) * 2018-12-14 2022-01-27 Seegene, Inc. Method for detecting a target analyte in a sample using an s-shaped function for a slope data set
CN111816256B (zh) * 2020-01-07 2024-03-29 江苏普瑞悉恩生物科技有限公司 核酸样本检测方法及装置、存储介质及电子设备
CN111944883A (zh) * 2020-08-25 2020-11-17 杭州博日科技股份有限公司 荧光定量的指标确定方法
CN112582026B (zh) * 2020-12-07 2022-07-12 上海科源电子科技有限公司 基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法
CN113607937B (zh) * 2020-12-30 2022-07-12 北京中科生仪科技有限公司 一种pcr检测方法的数据处理方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303305B1 (en) 1999-03-30 2001-10-16 Roche Diagnostics, Gmbh Method for quantification of an analyte
US6387621B1 (en) 1999-04-27 2002-05-14 University Of Utah Research Foundation Automated analysis of real-time nucleic acid amplification
US20030104438A1 (en) 2001-08-31 2003-06-05 Eyre David J. Real-time gene quantification with internal standards

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6691041B2 (en) 2000-03-31 2004-02-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method for the efficiency-corrected real-time quantification of nucleic acids
US6783934B1 (en) 2000-05-01 2004-08-31 Cepheid, Inc. Methods for quantitative analysis of nucleic acid amplification reaction

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303305B1 (en) 1999-03-30 2001-10-16 Roche Diagnostics, Gmbh Method for quantification of an analyte
US6387621B1 (en) 1999-04-27 2002-05-14 University Of Utah Research Foundation Automated analysis of real-time nucleic acid amplification
US20030104438A1 (en) 2001-08-31 2003-06-05 Eyre David J. Real-time gene quantification with internal standards

Also Published As

Publication number Publication date
DE602005015140D1 (de) 2009-08-06
KR20060045671A (ko) 2006-05-17
EP1842925A1 (en) 2007-10-10
JP2009072206A (ja) 2009-04-09
CN101012484B (zh) 2012-11-28
JP4885934B2 (ja) 2012-02-29
DE602005008146D1 (de) 2008-08-28
CN100378229C (zh) 2008-04-02
KR100738118B1 (ko) 2007-07-12
DE602005019475D1 (de) 2010-04-01
KR20060106789A (ko) 2006-10-12
EP1842925B1 (en) 2010-02-17
CN1769494A (zh) 2006-05-10
JP2009106298A (ja) 2009-05-21
EP1842924A1 (en) 2007-10-10
KR20060106790A (ko) 2006-10-12
CN101012484A (zh) 2007-08-08
JP4606492B2 (ja) 2011-01-05
KR100723430B1 (ko) 2007-05-30
EP1842924B1 (en) 2009-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100738073B1 (ko) 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법
JP4440857B2 (ja) リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法
CA2571454C (en) Analytical method and instrument
US10133843B2 (en) Systems and methods for step discontinuity removal in real-time PCR fluorescence data
EP2107470B1 (en) PCR elbow determination using quadratic test for curvature analysis of a double sigmoid
JP6602374B2 (ja) 試料の分析方法
CN101872386A (zh) 利用双s形levenberg-marquardt和稳健线性回归的温度阶跃校正
CN109923613B (zh) 利用信号变化量数据集的样品内的目标分析物质检测方法
EP3090372B1 (en) Detection and correction of jumps in real-time pcr signals
KR101413659B1 (ko) 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의초기 농도를 결정하는 방법
KR101771402B1 (ko) 핵산 정량 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130701

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140630

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150630

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160630

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170630

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180629

Year of fee payment: 12