CN100378229C - 从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法。从生物体或病毒中提取的核酸(DNA或RNA)应用酶进行扩增。然后核酸的初始浓度通过计算当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间，或者扩增效率为最大或最小值时的特征扩增循环数或特征扩增时间，或者扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度的方法获得。因此，核酸的初始浓度可不用微分或积分进行计算。

Description

从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法

技术领域

本发明涉及定量初始核酸浓度的方法，更具体的，涉及从通过聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，链置换扩增(SDA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，转录介导的扩增(TMA)，滚环扩增(RCA)等等得到的实时核酸扩增数据中定量初始核酸浓度的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)在多种用于检测和定量核酸的分析方法中是应用最为广泛的。PCR的原理在美国专利4,683,195和4,683,202中公开。

常规PCR只能给出在端点扩增的DNA通过琼脂糖凝胶的定性结果。然而，这样的常规PCR有一个问题即它不能用于定量分析。为了解决这个问题，开发了实时PCR(real-time PCR)。实时PCR应用光学检测系统实时检测与扩增的DNA的浓度成比例的荧光强度，于是进行DNA的定量分析成为可能。

从核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的常规方法在美国专利6,303,305和6,503,720中公开。在这些常规方法中，扩增了核酸而且得到了在每个扩增循环中表示核酸量的函数。然后，计算函数的第n阶导数(n-th orderderivative of the function)并由结果计算核酸的初始浓度。而且，应用导数的最大值作为阈值循环(threshold cycle)(Ct)的定量分析方法在美国专利6,303,305中公开，而应用导数的最大、最小和零值作为Ct的定量分析方法在美国专利6,503,720中公开。

而且，从核酸扩增数据中定量核酸的初始浓度的另一种方法在出版编号为2002-0031768的美国专利申请中公开。由此，应用导数的特定值定量核酸的浓度。

发明内容

本发明提供了由实时核酸扩增数据不用微分或积分定量核酸初始浓度的方法。

根据本发明的一个方面，定量核酸初始浓度的方法包括：扩增核酸；产生表示与核酸量成比例升高或降低的荧光强度和扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；应用上述函数计算当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为其最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

根据本发明的另一方面，定量核酸初始浓度的方法包括：扩增核酸；产生表示与核酸量成比例的荧光强度和核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；应用上述函数计算扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度；和由算得的扩增前的荧光强度减去背景荧光强度计算核酸的初始浓度。

根据本发明的又一方面，定量核酸初始浓度的方法包括：扩增核酸；产生表示核酸的扩增效率和核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；应用上述函数计算扩增效率为最大值或最小值时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

根据本发明，核酸的初始浓度可以不用微分或积分进行定量。

附图说明

根据附图，通过其详细的代表性的实施方案中的描述，本发明的上述或其他特点和优点会更加明显，其中：

图1为显示扩增的核酸的荧光强度与扩增循环数之间的相关性的数学模型的图；

图2A至2F为显示核酸的实时扩增数据和这些数据以图1的数学模型进行最小二乘拟合(least-square fitting)的结果的图；

图3为显示扩增效率与不同核酸初始浓度的扩增循环数之间关系的图；

图4为显示计算当扩增效率为图3中的最大值时的特征循环数的计算方法的图；

图5为显示图1的数学模型中核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度为荧光强度最大值的一半时的特征扩增循环数(n_1/2)与核酸的初始浓度的关系，扩增效率为图3的最大值时特征扩增循环数(n_Emax)与核酸的初始浓度的关系，和当荧光强度的二阶导数为最大值时的常规特征扩增循环数C_t与核酸的初始浓度的关系的图；

图6为显示R₀(图1的数学模型中扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度)与核酸的初始浓度之间关系的图；

图7A至7C为显示根据本发明计算核酸的初始浓度的方法和已有技术的结果的表；

图8为显示核酸的荧光强度和扩增循环数之间的关系变化的图和显示扩增效率和核酸的不同初始浓度的扩增循环数之间的关系变化的图；

图9为显示当扩增效率为最大值时的特征扩增循环数和由图8的测试结果得到的核酸初始浓度之间关系的图；

图10为显示采用不同的值作为核酸的背景荧光强度时，背景修正的扩增效率和扩增循环数之间关系的图；

图11为显示不同初始浓度下核酸的荧光强度的初始行为的变化的图；

图12A和12B为显示采用不同的值作为背景荧光强度时，不同的核酸初始浓度下背景修正的扩增效率曲线的变化的图；

图12C为显示核酸的初始浓度与当背景修正的扩增效率具有最大或最小值时的特征扩增循环数之间的关系变化的图，和显示核酸的初始浓度与图12A和12B中不同的R_b值下，当背景修正的扩增效率具有最大或最小值时的特征扩增循环数的CV％之间的关系变化的图；

图13为显示对于不同背景荧光强度的采用方法，荧光强度与扩增循环数之间的关系变化的图；

图14为显示图13中不同的背景荧光强度的采用方法下，背景修正的扩增效率与扩增循环数之间的关系变化的图；

图15为显示进行或不进行背景荧光强度修正时，核酸的初始浓度与当背景修正的扩增效率为最大值时的特征扩增循环数之间关系的图；

图16显示背景荧光强度修正对核酸初始浓度的定量方法精确度的影响，所述定量方法使用当背景修正的扩增效率为最大值时的特征扩增周期数，所述特征循环周期数是利用图15的关系式得到的。

图17为显示一个实例以说明特征扩增循环数的CV％对于核酸初始浓度的定量的精确度的影响的图。

具体实施方式

现在根据附图，对一种从实时核酸扩增数据，特别是PCR数据，定量核酸初始浓度的方法进行描述。

图1为显示扩增的核酸的荧光强度与扩增循环数之间的关系的数学模型的图。

应用酶的核酸扩增通过需要热循环的方法，诸如PCR、RT-PCR、嵌套PCR(nested PCR)和LCR或等热的核酸扩增方法，诸如SDA、NASBA、TMA和RCA进行。这里，核酸可从生物体或病毒中提取。

在实时PCR实验的每一个扩增循环中，核酸的荧光强度的测量结果可以图1所示的图作为模型。图1的S型模型可由下面的式1表示。

[式1]

$R=R_b+\frac{R_{\max }}{1+e^{\frac{n-n_{1/2}}{k}}}$

其中，

R：核酸的荧光强度

R_b：核酸的背景荧光强度

R_max：核酸的最大荧光强度

n：扩增循环数

n_1/2：当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度为其最大值的一半时的特征扩增循环数

k：扩增反应中与荧光强度的改变速率相关的参数

数学模型与实际PCR数据的误差可由下面的式2进行计算。

[式2]

${\mathrm{\ϵ}}^2=\underset{n}{\mathrm{\Σ}}{[R_n-\{R_b+\frac{R_{\max }}{1+e^{\frac{n-n_{1/2}}{k}}}\}]}^2$

其中R_n表示实时PCR中第n个扩增循环时的核酸的实际荧光强度。

为了计算图1数学模型中的参数R_b、R_max 、n_1/2和k应用最小二乘法，得到了式3或式4a到4d的非线性方程组且该方程组可以应用Newton-Raphson方法解。

[式3]

$\frac{{\∂\mathrm{\ϵ}}^2}{{\∂R}_b}=0,$ $\frac{{\∂\mathrm{\ϵ}}^2}{{\∂R}_{\max }},$ $\frac{{\∂\mathrm{\ϵ}}^2}{{\∂n}_{1/2}}=0,$ $\frac{{\∂\mathrm{\ϵ}}^2}{\∂k}=0$

[式4a]

$\underset{n}{\mathrm{\Σ}}{[R_n-\{R_b+\frac{R_{\max }}{1+e^{-\frac{(n-n_{1/2})}{k}}}\}]}^2=0$

[式4b]

$\underset{n}{\mathrm{\Σ}}[R_n-\{R_b-\frac{R_{\max }}{1+e^{-\frac{(n-n_{1/2})}{k}}}\}\×\frac{1}{1+e^{\frac{n-n_{1/2}}{k}}}]=0$

[式4c]

$\underset{n}{\mathrm{\Σ}}[R_n-\{R_b+\frac{R_{\max }}{1+e^{-\frac{(n-n_{1/2})}{k}}}\}\×\frac{e^{-\frac{n-n_{1/2}}{k}}}{{\{1+e^{-\frac{n-n_{1/2}}{k}}\}}^2}]=0$

[式4d]

$\underset{n}{\mathrm{\Σ}}[R_n-\{R_b-\frac{R_{\max }}{1+e^{-\frac{(n-n_{1/2})}{k}}}\}\×\frac{(n-n_{1/2})e^{-\frac{n-n_{1/2}}{k}}}{{\{1+e^{-\frac{n-n_{1/2}}{k}}\}}^2}]=0$

当式1中n＝0，扩增反应前核酸的荧光强度减去背景荧光强度R_b可用式5定义。

[式5]

$R_0=\frac{R_{\max }}{1+e^{n_{1/2}/k}}$

图2A至2F为显示HBV质粒DNA的实时扩增数据和这些数据以图1的数学模型进行最小二乘拟合的结果的图。

图2A是当核酸的初始浓度为10⁷拷贝/反应(反应体积中的拷贝数)时的结果，图2B是当初始浓度为10⁶拷贝/反应时的结果，图2C是当初始浓度为10⁵拷贝/反应时的结果，图2D是当初始浓度为10⁴拷贝/反应时的结果，图2E是当初始浓度为10⁵拷贝/反应时的结果，和图2F是当初始浓度为2.5×10⁶拷贝/反应时的结果。可以看出，当核酸的初始浓度增加时，核酸开始快速扩增时的循环数减少。

而且可以看出，核酸的荧光强度与扩增循环数之间的相关性的有关实验结果的图几乎与应用式1的数学模型进行最小二乘拟合结果的图相似。

扩增效率可以式6a和6b作为数学模型。

[式6a]

R_n＝(1+E_n)R_n-1

其中，

R_n：第n个扩增循环中的荧光强度

R_n-1：第(n-1)个扩增循环中的荧光强度

E_n：第n个扩增循环的扩增效率

式6a可以重写为下面的式6b。

[式6b]

$E_n=\frac{R_n-R_{n-1}}{R_{n-1}}$

图3为显示扩增效率与核酸不同初始浓度的扩增循环数之间关系的图。关于图3，可以看出在PCR循环中扩增效率不是不变的。

图4为显示当扩增效率为图3中的最大值时的特征扩增循环数的判定方法的图。

关于图4，假定在最大值或最小值附近的三个点的x-y坐标已知。现在对应用抛物曲线拟合判定使y值最大或最小的x值的数学方法进行描述。

首先，对于三个坐标(x₁，y₁)，(x₂，y₂)，(x₃，y₃)建立下面的式7a。

[式7a]

$y1={\mathrm{ax}}_1^2+{\mathrm{bx}}_1+c,$ $y2={\mathrm{ax}}_2^2+{\mathrm{bx}}_2+c,$ $y3={\mathrm{ax}}_3^2+{\mathrm{bx}}_3+c$

如果式7a重写为矩阵格式，结果由式7b给出。

[式7b]

$\left(\begin{array}{ccc}{x}_1^2& x_1& 1\\ x_2^2& x_2& 1\\ x_3^2& x_3& 1\end{array}\right)\left(\begin{array}{c}a\\ b\\ c\end{array}\right)=\left(\begin{array}{c}{y}_1\\ y_2\\ y_3\end{array}\right)$

如果定义 $\left|\begin{array}{ccc}{x}_1^2& x_1& 1\\ x_2^2& x_2& 1\\ x_3^2& x_3& 1\end{array}\right|=\det \left(A\right),$ 常数a，b和c可以由克莱姆法则(Cramer’srule)表示如下。

[式7c]

$a=\left|\begin{array}{ccc}{y}_1& x_1& 1\\ y_2& x_2& 1\\ y_3& x_3& 1\end{array}\right|/\det \left(A\right)$

$b=\left|\begin{array}{ccc}{x}_1^2& y_1& 1\\ x_2^2& y_2& 1\\ x_3^2& y_3& 1\end{array}\right|/\det \left(A\right)$

$c=\left|\begin{array}{ccc}{x}_1^2& x_1& y_1\\ x_2^2& x_2& y_2\\ x_3^2& x_3& y_3\end{array}\right|/\det \left(A\right)$

然后，x_max可以由下面的式7d计算。

[式7d]

$x_{\max }=-\frac{b}{2a}=\frac{y_1(x_2^2-x_3^2)+y_2(x_3^2-x_1^2)+y_3(x_1^2-x_2^2)}{2[y_1(x_2-x_3)+y_2(x_3-x_1)+y_3(x_1-x_2)]}$

至此，描述了应用数学模型实现核酸的荧光强度与扩增循环数之间的相关性的方法和数学模型参数的计算方法。现在，对数学模型中的具体参数与核酸的初始浓度之间的关联进行描述。并且，基于这种关联对核酸的初始浓度的定量方法进行描述。

图5为显示图1的数学模型中核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度为其最大值的一半时的特征扩增循环数(n_1/2)与核酸的初始浓度的关系，扩增效率为图3的最大值时特征扩增循环数(n_Emax)与核酸的初始浓度的关系，和当荧光强度的二阶导数为最大值时的常规特征扩增循环数C_t与核酸的初始浓度的关系的图。

关于图5，当初始浓度(log[拷贝/反应])较高时，特征扩增循环数n_1/2和n_Emax都减少。而且可以看出，应用[a]二阶导数[值value]计算核酸初始浓度的常规方法的斜率几乎与本发明应用的采用n_1/2和n_Emax计算时一致。这里，应用n_Emax的标准校正曲线位于应用n_1/2的标准校正曲线之下。因此，当应用n_Emax时，核酸的初始浓度相比应用n_1/2的情况，可以在更少的扩增循环数下定量。

图6为显示式5中的R₀与核酸的初始浓度之间关系的图。关于图6，可以看出，log(核酸初始浓度)与log(R₀)成线性比例。

描述了应用图5和6的比例关系得到核酸初始浓度的三种新方法。第一种方法是应用当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度为其最大值的一半时的特征扩增循环数或时间n_1/2第二种方法是应用当核酸的扩增效率为最大值(n_Emax)或最小值(n_Emin)时的特征扩增循环数或特征扩增时间，第三种方法是应用R₀，扩增前的荧光强度减去背景荧光强度。

现在，对关于应用上述新方法，定量其初始浓度未知的核酸的初始浓度的方法进行描述。

首先，核酸扩增反应(例如，PCR，LCR，SDA，NASBA，TMA，RCA等等)在预定的其初始浓度已知的标准核酸样品中进行。然后，计算图1或3所示的数学模型中的参数。然后，应用n_1/2，n_Emax和R₀中的参数得到如图5或6的标准校正曲线。

同时，在未知的样品中进行同样的核酸扩增反应并计算标准校正曲线中应用的同样的参数(n_1/2或n_Emax或R₀)。然后，未知核酸样品的初始浓度由图5或6所示的标准校正曲线得到。具体地，当应用n_Emax时，可以花费非常少的数值计算的气力，在实时得到并且显示扩增效率。而且，核酸的初始浓度可以用非常简单的计算进行定量，从而降低定量未知核酸样品所需的扩增循环数。

图7A至7C为显示应用本发明的方法和由已有技术中的荧光强度的二阶导数得到的C_t进行核酸定量的结果的实例的表。

图7A显示算得的用于核酸定量的参数值，核酸初始浓度为10⁴，10⁵，10⁶和10⁷拷贝/反应，以得到如图5或6所示的标准校正曲线(重复6次)。图7B和7C显示应用根据本发明图7A得到的标准校正曲线和应用已有技术得到的标准校正曲线，测试的核酸样品的定量结果。关于图7B和7C，替代C_t，n_1/2、n_Emax或R₀可用作核酸定量分析的特征因子。在图7B中，误差为以[(用校正曲线算得的拷贝/反应值)-(实际拷贝/反应值)]的绝对值除以(实际拷贝/反应值)得到的值的百分数。例如，误差(C_t)的第一个值计算为(5.4E+0.5-5.0E+05)/5.0E+05，即8.08％。在图7C中，在5.0E05时的平均误差代表图7B中的重复6次实验的误差平均值。

图8为显示核酸的荧光强度和扩增循环数之间的关系变化的图和显示10⁰，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷和10⁸拷贝/反应的不同初始核酸浓度下(重复9次)，扩增效率和扩增循环数之间的关系变化的图。

关于图8，显示荧光强度与扩增循环数之间的关系的图中减去了核酸的背景荧光信号。由图11可以看出，荧光强度从一个正值开始，在初始阶段减小而后又增加。这是由荧光染料的众所周知的特征-光漂白效应造成的。图11中所有的荧光强度的最小值均为0，因为减去了背景荧光强度。这引起扩增效率图中出现如图8的突出而尖锐的最大值。图8中的最大效率大于1.0，这不能作为一个物理上的效率的概念被接受。

图9为显示特征扩增循环数n_Emax和由图8的测试结果得到的核酸初始浓度之间关系的图。

关于图9，核酸的初始浓度范围为10³-10⁷时图是线性的，所以该图可以用作在此范围内的标准校正曲线以根据本发明计算初始浓度。然而，当核酸的初始浓度低于10³时，数据具有不规则的图案。

为了防止扩增效率图型具有突出而尖锐的大于1.0的最大值，表示扩增效率的式6b可以如下面重写。

[式8]

$E_n=\frac{(R_n+R_b)-(R_{n-1}+R_b)}{R_{n-1}+R_b}=\frac{R_n-R_{n-1}}{R_{n-1}+R_b}$

其中，R_n为第n个扩增循环的荧光强度，R_n-1为第(n-1)个扩增循环的荧光强度，R_b为表示背景荧光强度的任意常数，和E_n为第n个扩增循环的扩增效率。

图10为显示根据在六次重复实验中当核酸的初始浓度为10⁷拷贝/反应时四种不同的背景荧光强度R_b的定义的背景修正的扩增效率图型的图。当R_b为0时，即，当扩增反应中荧光强度的最小值R_min为0，扩增效率的图型具有突出(pointed)而尖锐的形状，如图8。虽然当R_b为0时，出现最大扩增效率的扩增循环数看起来几乎为不变，但是当重复6次后，它出现在更早的循环数并且它的值也不是常数。

相反地，当R_b为非零(即R₁，0.01，-(R_b)_{S型(sigmoidal))}，出现最大扩增效率的扩增循环数看起来几乎为不变且重复6次的扩增效率的最大值也不变。

现在根据图15-17，描述了可接受作为常数R_b的常数和当R_b以扩增效率的定义加以考虑时的改进。

首先，由所有扩增循环的荧光强度数据以式1中的S型模型进行最小二乘拟合得到的-(R_b)_S型，可以用作式8中的R_b。

第二，当荧光强度在扩增反应的初始阶段自非零开始，减少到0然后又增加(参考图11)，对应于初始荧光强度的值可以用作R_b的值。例如，参考图11，虽然初始荧光强度与不同的核酸初始浓度有微小的不同，它平均为0.01。因此，0.01的值可以用作R_b的值。如果扩增条件，诸如试剂、荧光染料和视觉曝光时间不改变，初始荧光强度就不会显著变化。因此，一旦与初始荧光强度对应的值由实验确定，它可以从那时起被用作R_b。相反，如果扩增条件，诸如试剂、荧光染料和视觉曝光时间改变，对应于初始荧光强度的值就必须由实验重新确定。

第三，第一个扩增循环的荧光强度R₁，可以用作R_b的值。即使扩增条件，诸如试剂、荧光染料和视觉曝光时间改变，这种方法具有的优势为使用者不需要多花费额外气力来确定R_b，因为每次实验时第一个扩增循环的荧光强度总是要进行测定的。虽然这种方法比第二种方法具有这个优势，但是当第一个扩增循环的荧光强度非常接近0时，定量误差会增加第四，式8的扩增效率函数中使最大扩增效率为“1”(单位)的值可以用作R_b的值。为了获得最大扩增效率为1的R_b，R_b的值必须以迭代法(iterativemethod)如在每轮扩增实验进行连续的置换得到。虽然此法在原则上是理想的，但迭代计算是复杂或耗费时间的。

如上所述，背景荧光强度R_b可以设为下列的值之一：1)由所有扩增循环的荧光强度数据以式1中的S型模型进行最小二乘拟合得到的-(R_b)_S型；2)对应于初始荧光强度的值(图11中大约0.01)；3)第一个扩增循环的荧光强度[的R₁强度]，R₁；和4)使扩增效率的最大值为“1”的值。

这里，背景荧光强度-(R_b)_S型的应用是不方便的，因为它必须通过S型

模型的非线性曲线拟合计算得到。然而，本发明的其他方法(初始荧光强度R₁，和使最大扩增效率为“1”的值)则不需要用曲线拟合。

为了计算背景修正的扩增效率，甚至更大的正值或负值可以用作R_b的值。这将根据图12A至12C进行描述。

图12A和12B为显示应用如图8中同样的实验数据，在背景荧光强度的不同值下，背景修正的扩增效率的变化的图。

当R_b为正值0.01、0.1、1、10、100和1000时的情况如图12A所示。

由于各个情况下背景修正的扩增效率具有可很好地辨别的正峰，并根据核酸初始浓度在扩增循环数有几乎相等的间隔，根据本发明，它们可以用于定量核酸的初始浓度。然而，当Rb的值大于0.1时，背景修正的扩增效率的最大值变得远小于1，这在扩增效率的意义上没有物理意义。但是，如图12A可以看出，各个背景修正的扩增效率图型具有最大值时的扩增循环n_Emax位于几乎相等的区间。这样，它们所有都可用于定量核酸的初始浓度。但是，优选应用背景修正的扩增效率在0-1的范围内的情况，即Rb的值为0.01(此值对应于核酸的初始荧光强度)的情况。

当R_b为负值-0.01、-0.1、-1、-10、-100和-1000时的情况如图12B所示。当R_b的值为-0.01和-0.1，背景修正的扩增效率函数(式8)的除数(divisor)非常接近0，这样背景修正的扩增效率图型具有突出而尖锐的峰且不呈现当R_b的绝对值大时的常规区间图样，背景修正的扩增效率图型具有可很好地辨别的负峰，并根据核酸初始浓度在扩增循环数有几乎相等的间隔。具体地，当R_b小于-1时，背景修正的扩增效率值为负值。由于扩增效率只在从0到1的范围内具有物理意义，虽然核酸的初始浓度可以用图12B给出的值进行定量，但是扩增效率没有物理意义。但是，如图12B可以看出，当R_b的值小于-1(例如-1、-10、-100、-1000)时，各自的背景修正的扩增效率图型具有最小值时的扩增循环n_Emin位于几乎相等的区间。这样，它们所有都可用于定量核酸的初始浓度。

图12C为显示核酸的初始浓度与当背景修正的扩增效率具有最大或最小值时的特征扩增循环数n_Emax或n_Emin之间的关系变化的图，和显示核酸的初始浓度与图12A和12B中不同的R_b值下n_Emax或n_Emin的CV％之间的关系变化的图。

关于图12C，当R_b的值增加到正值(图12A)或减小到负值(图12B)时，核酸的初始浓度和n_Emax或n_Emin之间的关系的图分别收敛到曲线(converge toa curve)。除去R_b的值为0和-0.01的情况之外，当核酸的初始浓度在10³-10⁸拷贝/反应的范围内时，n_Emax的CV％不超过5％。核酸初始浓度的定量误差与n_Emax或n_Emin的CV％之间的关系将根据图17进行描述。

当R_b的值大于某些值，CV％的值几乎不改变。这样，这些值除去图10中R_b＝0即，R₁，0.01之外，-(R_b)_S型可以优选作为R_b的值以在扩增效率在0-1的范围内改善n_Emax的CV％。

图13为显示对于不同的背景荧光强度的采用方法，荧光强度与扩增循环数之间的关系变化的图。

图14为显示图13中不同的背景荧光强度的采用方法下，背景修正的扩增效率与扩增循环数之间的关系变化的图。

关于图13和14，当R_b的值为0，该值是荧光强度图型的最小值(即，R_b＝R_bmin＝0)，所以式8中的除数(R_n-1+R_b)接近0。这样，扩增效率E_n增加太大，E_max峰变得突出而尖锐。而且，扩增效率容易被噪音影响。当R_b的值为非零，扩增效率图型具有可完全辨别的峰，并根据核酸初始浓度在扩增循环数有几乎相等的间隔。然而，在图14中，如果R_b＝R₁，背景修正的扩增效率的最大值在扩增循环的初始阶段(循环数＝5)大于1而且峰型非常尖锐而突出。在扩增核酸的常规方法中，在这一早期阶段通常不发生这样的快速扩增而且大于1的扩增效率没有物理意义。因此，必须忽视这些峰而且应用第二大的峰值定量核酸的初始浓度。

图15为显示核酸的初始浓度与进行(R_b＝0.01)或不进行(R_b＝0)背景荧光强度修正时的特征扩增循环数n_Emax之间的标准校正曲线的图。

关于图15，进行和不进行背景荧光修正时的标准校正曲线在核酸初始浓度范围从10³到10⁸下均为线性。[后图置于前图之上。]可以看出，进行背景荧光修正的标准校正曲线位于不进行背景荧光修正的标准校正曲线之上。

图16显示背景荧光强度修正对使用特征扩增循环数n_Emax定量核酸初始浓度的方法的精确度的影响，所述特征扩增循环数n_Emax是应用利用图15的标准校正曲线得到的。

由图16可以看出，应用背景荧光修正(R_b＝0.01)，n_Emax的CV％(＝St.Dev(标准偏差)/Avg(平均值))明显地减小。

图17为显示实例以说明特征扩增循环数的CV％对于核酸初始浓度的定量的精确度的影响的图。

关于图17，当特征扩增循环数的CV％从0.5变到5.0，误差(拷贝误差)发生很大变化，从6.85％变到48.5％。即，即使是特征扩增循环的误差轻微地增加，也会引起核酸初始浓度的定量结果产生大的误差。由于这些原因，非常精确的定量方法是不可缺少的。如图16所示，应用背景荧光校正(R_b＝0.01)，n_Emax的CV％极大地减少，所以与不应用背景荧光修正的情况(R_b＝0)比较，定量精确度得到了极大地改进。

根据本发明，描述了从实时核酸扩增(PCR、LCR、SDA、NASBA、TMA、RCA等)的数据中得到核酸的初始浓度的三种新方法，应用当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度为其最大值的一半时的特征扩增循环数或时间，当扩增效率为最大值或最小值时的特征扩增循环数或时间，和扩增前的荧光强度减去背景荧光强度，基于关于核酸的扩增量与扩增循环之间的相关性的数学模型，不用进行微分或积分。

具体地，当应用扩增效率为最大值或最小值时的特征扩增循环时，可以花费较少的数值计算的气力从实时核酸扩增数据中，得到并且在实时显示扩增效率。因此，可以比其他方法更快地得到核酸的初始浓度。

本发明也可以具体体现为计算机可读的记录介质上的计算机可读的编码。计算机可读的记录介质为任何数据存储设备，该设备可以存储此后可被计算机系统读取的数据。计算机可读的记录介质的实例包括只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、CD-ROM、磁带、软盘、光学数据存储设备，和载波(诸如通过Internet的数据传输)。计算机可读的记录介质也可散布于网络连接的计算机系统中，使得计算机可读的编码也以散布的方式被存储和执行。

当具体显示和以其例证性的实施方案描述本发明时，本领域的普通技术人员理解可以在其中的形式和细节上产生的而不脱离如下面的权利要求所定义的本发明的精神和范围的各种变化。

Claims (13)

1.定量核酸初始浓度的方法，包含：

扩增核酸；

产生表示与核酸量成比例升高或降低的荧光强度与核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；

利用所述函数计算当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为荧光强度最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间；和

由特征扩增循环数或特征扩增时间计算核酸的初始浓度。

2.权利要求1的方法，其中核酸是用酶扩增的。

3.权利要求1的方法，其中核酸是利用需要热循环的核酸扩增方法扩增的。

4.权利要求1的方法，其中核酸是利用等温的核酸扩增方法扩增的。

5.权利要求1的方法，其中表示相关性的函数是利用S型模型产生的。

6.权利要求5的方法，其中当核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为荧光强度最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间是采用关于利用S型模型的函数的非线性最小二乘拟合法计算的。

7.权利要求1的方法，其中核酸的初始浓度是由特征扩增循环数或特征扩增时间通过使用标准校正曲线计算的，该标准校正曲线表示核酸的初始浓度和核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度后为其最大值的一半时的特征扩增循环数或特征扩增时间之间的关系。

8.定量核酸初始浓度的方法，包含：

扩增核酸；

产生表示与核酸量成比例升高或降低的荧光强度与核酸的扩增循环数或扩增时间之间的相关性的函数；

利用所述函数计算扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度；和

由算得的扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度计算核酸的初始浓度，

其中核酸的初始浓度是由扩增前核酸样品的荧光强度通过使用标准校正曲线计算的，该标准校正曲线表示核酸的初始浓度与扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度之间的关系。

9.权利要求8的方法，其中核酸是用酶扩增的。

10.权利要求8的方法，其中核酸是利用需要热循环的核酸扩增方法扩增的。

11.权利要求8的方法，其中核酸是利用等温的核酸扩增方法扩增的。

12.权利要求8的方法，其中表示相关性的函数是利用S型模型产生的。

13.权利要求12的方法，其中扩增前核酸的荧光强度减去核酸的背景荧光强度采用关于利用S型模型的函数的非线性最小二乘拟合法计算。

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