JP4606492B2 - リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法 - Google Patents

Description

本発明は核酸の初期濃度を求める方法に係り、さらに詳細には核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）を使用して得たリアルタイム核酸増幅データから核酸の初期濃度を求める方法に関する。

核酸を検出して定量化するための多様な分析法のうち、ＰＣＲは、最も広く使われる方法であって、特許文献１及び特許文献２にその原理が開示されている。

既存のＰＣＲは、単に終末点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）でゲル電気泳動（ＡｇａｒｏｓｅＧｅｌ）を利用して増幅されたＤＮＡの定性的な結果だけを示すものであり、ＤＮＡの定量的な検出の正確性などに多くの問題点を有していた。かかる問題点を解決するために、光学的検出システムを利用して増幅されたＤＮＡの濃度に比例する蛍光信号の強度をリアルタイムで検出することにより、ＤＮＡの定量分析を可能にするリアルタイムＰＣＲが開発された。

核酸増幅データから核酸の初期濃度を定量化する従来の方法として、特許文献３及び特許文献４がある。ここでは、核酸を増幅して増幅の各サイクルでの核酸増幅量を表す関数を求めた後、その関数をｎ次微分し、その結果から核酸の初期濃度を求める方法を提供する。前記特許文献３は、微分の最大値をＣ_ｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）とする定量分析法、前記特許文献４は、微分の最大値、最小値、ゼロ値をＣ_ｔとする定量分析法を開示する。

また、核酸増幅データから核酸の初期濃度を定量化する従来の他の方法として、特許文献５がある。ここでは、微分の特定値を利用して核酸の濃度を定量化する方法を提供する。
米国特許第４６８３１９５号明細書 米国特許第４６８３２０２号明細書 米国特許第６３０３３０５号明細書 米国特許第６５０３７２０号明細書 米国特許出願公開第２００２−００３１７６８号明細書

本発明がなそうとする技術的課題は、リアルタイム核酸増幅データから核酸の初期濃度を微分／積分を使用せずに定量化する方法を提供するところにある。

上記の技術的課題を達成するための、本発明による初期核酸濃度を定量化する方法の実施例は、（ａ）核酸を増幅するステップと、（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号の強度と前記増幅サイクル数との相関関係を表す関数を生成するステップと、（ｃ）前記関数を利用し、前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップと、（ｄ）前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度と核酸の初期濃度との関係を表す補正曲線を利用し、前記（ｃ）ステップで前記算出した増幅前蛍光信号の強度から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含み、前記（ｂ）ステップは、前記相関関係をシグモイドモデルを用いて関数で表すステップを含み、前記（ｃ）ステップは、前記シグモイドモデルを用いた関数に対して非線形最小二乗フィッティングを使用し、前記関数から前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップを含む。

これにより、微分／積分を使用せずに核酸の初期濃度を定量化できる。

本発明によれば、リアルタイム核酸増幅（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）データから核酸の初期濃度を求める方法において、核酸の増幅量と増幅サイクルとの間の相関関係についての数学的モデルを基に、微分／積分を使用せずに背景蛍光信号を除外した最大蛍光信号の強度の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間、最大増幅効率に該当する増幅サイクル数または増幅時間、背景蛍光信号を除外した核酸の増幅前蛍光信号の強度から、核酸の初期濃度を求めることができる。

特に、最大増幅効率を使用する場合、リアルタイム核酸増幅データからリアルタイムに増幅効率を求めることができるので、他の方法に比べて一層速く核酸の初期濃度を求めることができる。

以下、添付された図面を参照し、リアルタイム核酸増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）データから初期核酸濃度を定量化する方法について詳細に説明する。

図１は、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係をモデリングしたグラフである。

酵素を利用した核酸増幅は、ＰＣＲ、ポリメラーゼ逆転写連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの熱的サイクルを必要とする核酸増幅法によるか、またはＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの等温核酸増幅法によって行われる。ここで、核酸は、生物やウイルスなどから抽出可能である。

リアルタイムＰＣＲデータから核酸増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数とを測定して測定したデータを、図１に図示されたようなグラフにモデリング可能である。図１に図示されたシグモイドモデルは、次の数式１で表すことができる。

ここで、Ｒは、核酸の蛍光信号の強度、Ｒ_ｂは、核酸蛍光信号の背景強度、Ｒ_ｍａｘは、核酸の最大蛍光信号強度、ｎは、増幅サイクル数、ｎ_１／２は、核酸蛍光信号強度の背景強度を除外した核酸蛍光信号強度の最大値の半分に該当する増幅サイクル数、ｋは、蛍光信号の増加に対する傾きを表す。

数学的モデルと実際のＰＣＲ実験データとの誤差は、数式２から求めることができる。

ここで、Ｒ_ｎは、ｎ番目のサイクルで実際に実験で得た核酸の蛍光信号の強度である。

図１に図示された数学的モデルに対するそれぞれのパラメータ（Ｒ_ｂ、Ｒ_ｍａｘ、ｎ_１／２、ｋ）値を求めるために、最小二乗フィッティング方法を使用すれば、数式３及び数式４（ａ）から数式４（ｄ）の非線形方程式を得るが、これをＮｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法で解く。

ここで、ε^２は、数式２で定義されている。

そして、核酸の背景蛍光信号Ｒ_ｂを除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度は、数式１でｎ＝０である場合であるから、数式５のように定義される。

図２Ａから図２Ｆは、図１に図示された数学的モデルと実際の実験結果とを図示したグラフである。

図２Ａは、初期核酸濃度が１０^７ｃｏｐｙ／ｒｘｎ（反応溶液内のｃｏｐｙ数）である場合、図２Ｂは、１０^６ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、図２Ｃは、１０^５ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、図２Ｄは、１０^４ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、図２Ｅは、５×１０^５ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、そして、図２Ｆは、２．５×１０^６ｃｏｐｙ／ｒｘｎの初期核酸濃度を有している場合である。核酸の初期濃度により、核酸が急激に増幅されるサイクル数がそれぞれ異なるということが分かる。

そして、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係の実験結果と、図１で求めた数学的モデルのグラフとがほとんど似ていることが分かる。

図３は、増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフである。

図３は、ＰＣＲの増幅効率を図示した図面である。図３を参照すれば、ＰＣＲ過程で増幅効率が常に一定ではないことが分かる。この増幅効率を数学的モデルでモデリングすれば、次の数式６（ａ）及び数式６（ｂ）のようである。

ここで、Ｒ_ｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒ_ｎ−１は、（ｎ−１）番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｅ_ｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの増幅効率を表す。Ｅｎで数式６（ａ）をさらに整理すれば数式６（ｂ）のようである。

図４は、図３で増幅効率が最大であるときの増幅サイクル数を求める方法を説明するための図面である。

図４を参照すれば、曲線上の三ヵ所でのデータを知っている。このとき、ｙ軸の最大値に該当するｘ値を求めるために、放物線カーブフィッティングを使用する数学的方法は、次の通りである。

まず、３つの座標点（ｘ_１，ｙ_１）、（ｘ_２，ｙ_２）、（ｘ_３，ｙ_３）について、次の数式７（ａ）を立てる。

数式７（ａ）をさらに行列で整理すれば、数式７（ｂ１）のようである。

ここで、数式７（ｂ２）とすれば、定数ａ，ｂ，ｃは、次の通り求めることができる。

次の数式７（ｄ）から、ｘ_ｍａｘは次の通り求めることができる。

これまで、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との関係を数学的モデルを介して具現し、数学的モデルのそれぞれのパラメータを求める方法について述べた。以下で、数学的モデルの特定パラメータが核酸の初期濃度といかなる関連性があるか述べ、かかる関連性を基に核酸の初期濃度を定量化する方法について述べる。

図５は、図１の数学的モデルで、核酸の背景蛍光信号を除外した核酸の最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数（ｎ_１／２）、及び図３の数学的モデルで、最大増幅効率（ｎ_Ｅｍａｘ）と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。

図５を参照すれば、核酸の初期濃度（ｌｏｇ［ｃｏｐｙ／ｒｘｎ］）が高いほど、最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数（ｎ_１／２）及び最大増幅効率（ｎ_Ｅｍａｘ）が低くなることが分かる。そして、従来の微分値を利用して初期核酸濃度を求める方法での傾き（図５の二次微分による補正曲線（Ｃ_Ｔ））と、本発明で使用するｎ_１／２及びｎ_Ｅｍａｘの傾きとがほとんど同一であることが分かる。ただし、ｎ_Ｅｍａｘがｎ_１／２より下方に位置するので、ｎ_Ｅｍａｘを利用する場合、ｎ_１／２よりさらに少ない増幅サイクル数で核酸の初期濃度を定量化できる。

図６は、図１の数学的モデルから得た数式５でのＲ_０と初期核酸濃度との関係を図示したグラフである。図６を参照すれば、ｌｏｇ（初期核酸濃度）とｌｏｇ（Ｒ_０）とが線形的な比例関係であることが分かる。

したがって、図５及び図６の線形的な比例関係を利用し、核酸の初期濃度を求めることができる３つの方法が提示される。第一に、核酸の背景蛍光信号を除外した核酸の最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数を利用する方法（ｎ_１／２）、第二に、核酸増幅効率が最大になる増幅サイクル数または時間を利用する方法（ｎ_Ｅｍａｘ）、第三に、核酸の背蛍光信号強度を除外した増幅前核酸サンプルの蛍光信号の強度を利用する方法（Ｒ_０）である。

以上の方法を利用し、初期濃度の分からない所定の核酸サンプルに対し、初期核酸濃度を定量化する方法は次の通りである。

まず、初期濃度を知っている所定の核酸標準サンプルに対し、核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＲＣＡ）を行い、図１または図３で提示した数学的モデルのそれぞれのパラメータを求め、そのパラメータを利用し、図５または図６に図示されたような比例関係を表すグラフ、すなわち補正曲線を求める。

そして、所定の核酸サンプルについても同じ核酸増幅法を行い、ｎ_１／２、ｎ_Ｅｍａｘ、またはＲ_０を求め、図５または図６のような補正曲線から核酸の初期濃度を求める。特に、ｎ_Ｅｍａｘを利用する場合は、非常に簡単な計算で核酸の初期濃度の定量化が可能であり、リアルタイムで増幅効率を求めて定量できるので、増幅サイクル数を減らすことができる。

図７Ａから図７Ｃは、本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果とを図示した表である。

図７Ａは、図５及び図６に図示されたような線形グラフを得るために、初期値を知っている核酸に対するモデリング及びモデリングの各パラメータの算出値を示す（６回反復）。図７Ｂ及び図７Ｃは、図７Ａで求めた補正曲線を利用し、本発明による方法で核酸の初期濃度を求めた場合と、従来の微分により初期濃度を求めた場合とを比較した値を示す。図７Ｂ及び図７Ｃで分かるように、ｎ_１／２、ｎ_Ｅｍａｘ、またはＲ_０がＣ_ｔの代わりに核酸の定量分析因子として使われうることが分かる。図７Ｂで、Ｅｒｒｏｒは、［（補正曲線から求めたｃｏｐｙ／ｒｘｎ値）−（真のｃｏｐｙ／ｒｘｎ値）］の絶対値／（真のｃｏｐｙ／ｒｘｎ値）の百分率であるが、例えばＥｒｒｏｒ（Ｃ_ｔ）は、［５．４Ｅ＋０５−５．０Ｅ＋０５］／５．０Ｅ＋０５の百分率であり、８．０８％である。図７Ｃで、Ａｖｇ ｅｒｒｏｒ ａｔ５．０Ｅ０５は、５．００Ｅ＋０５ ｃｏｐｙ／ｒｘｎの６回反復結果のＥｒｒｏｒ（図７Ｂ）の平均値を表す。

図８は、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフ及び増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフを共に図示した図面である。

図８を参照すれば、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係のグラフは、核酸の背景蛍光信号（数式１で、Ｒ_ｂ＝０）を除外した場合のグラフである。図１１を介し、蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係グラフは、蛍光信号の強度が初期０でない値から始まって０に減っていって、再び増加する形であることが分かるが、それは、蛍光染料が表す一般的な光漂白効果によるものである。また、背景蛍光信号を除外した場合の増幅効率グラフは、図８に図示されているように、形が尖っていて鋭い。

図９は、図８の実験結果のグラフから得た最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。

図９を参照すれば、初期濃度が１Ｅ＋０３から１Ｅ＋０８の場合は、濃度による最大増幅効率が線形的であり、本発明による初期濃度を求めるための標準曲線として使用可能であるが、初期濃度が１Ｅ＋３以下である場合は、濃度による最大増幅効率が不規則である。

図１０は、核酸の背景蛍光信号を考慮した増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示した図面である。

背景蛍光信号の強度Ｒ_ｂを考慮した増幅効率と増幅サイクル数との相関関係関数は、次の数式８のようである。

ここで、Ｒ_ｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒ_ｎ−１は、（ｎ−１）番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒ_ｂは、背景蛍光信号の強度、Ｅ_ｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの増幅効率を表す。

図１０は、核酸の初期濃度が１．０Ｅ＋０７ ｃｏｐｙ／ｒｘｎである場合について６回反復実験し、四種の異なるＲ_ｂの定義による増幅効率を図示したグラフである。Ｒ_ｂの値が０である場合、すなわち増幅による蛍光信号強度の最小値（Ｒ_ｍｉｎ）が０である場合は、図８で図示されているように、形が非常に尖っていて鋭い。また、Ｒ_ｂの値が０である場合の最大増幅効率が現れる時点は、一定しているが、Ｒ_ｂの値が０ではない場合よりは、最大増幅効率が現れる時点が早く、最大増幅効率の値もまた一定ではない。

一方、Ｒ_ｂの値が０ではない場合（すなわち、Ｒ_１，０．０１，−（Ｒ_ｂ）_{ｓｉｇｍｏｉｄａｌ}）は、最大増幅効率が現れる時点及び最大増幅効率の値が一定であることが分かる。

以下で、まず、Ｒ_ｂの値として使用可能な定数について述べた後、Ｒ_ｂの値を考慮した場合の向上された点については、図１５ないし図１７を参照して述べる。

第一に、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係の実験データをカーブフィッティングして得た図１のシグモイドモデル（数式１）を介して算出した背景蛍光信号の強度（−（Ｒｂ）_{ｓｉｇｍｏｉｄ}）をＲｂの値として使用可能である。

第二に、増幅サイクルによる蛍光信号の強度が初期に０ではない値から出発して０に減っていて、再び増加する場合（図１１参照）、初期蛍光信号の強度（増幅サイクル＝０である場合）値を実験的に測定し、Ｒ_ｂの値として使用可能である。例えば、初期蛍光信号の強度を図示した図１１を参照すれば、初期蛍光信号の強度は、初期核酸濃度によって多少差があるが、平均的に０．０１であるから、Ｒ_ｂの値として０．０１を使用できる。この方法は、試薬、蛍光染料及び蛍光染料の光露出時間などが変わらない限り、初期蛍光信号の強度は、一定であるために、最初の一回だけ実験的に測定した後には、続けてＲ_ｂを定数として固定させて使用できるという長所がある。ただし、試薬、蛍光染料及び蛍光染料の光露出時間などが変わるならば、最初の一回は、実験的に初期蛍光信号の強度を測定し、定数Ｒ_ｂの値を求めねばならない。

第三に、最初のサイクルでの核酸蛍光信号の強度（Ｒ_１）をＲ_ｂの値として使用可能である。この方法は、試薬、蛍光染料及び蛍光染料の光露出時間などが変わっても、実験ごとに自動的に初期蛍光信号の強度を補正する方法であり、前記の第二の方法に比べて長所を有するが、初期蛍光信号の強度が０に非常に近い場合には、誤差が大きくなるという短所がある。

第四に、数式８の増幅効率関数で最大増幅効率の値を「１」とする値をＲ_ｂの値として使用可能である。この方法は、最大増幅効率が１になるＲ_ｂを求めるために、反復的にＲ_ｂの値を変化させつつ、Ｒ_ｂを求める方法であり、原理的に最も妥当な方法であるが、反復計算をしなければならない。

以上で述べたように、背景蛍光信号の強度は、大きく見て、１）図１のシグモイドモデル（数式１）を介して得た背景蛍光信号の強度（−（Ｒ_ｂ）_{ｓｉｇｍｏｉｄａｌ}）、２）初期蛍光信号の強度に該当する値（図１１では、ほぼ０．０１）、３）最初のサイクルでの蛍光信号の強度（Ｒ_１）、４）最大増幅効率の値を「１」とする値に設定できる。

ここで、−（Ｒ_ｂ）_{ｓｉｇｍｏｉｄａｌ}値を使用する場合は、カーブフィッティングを介してその値を求めるという不便さがあるが、その他の値（初期蛍光信号の強度、Ｒ_１など）はカーブフィッティングを使用せずともよい。

Ｒ_ｂの値として、以上で説明した４つの定数以外にさらに大きい正数、または負数の値を使用する場合にも、増幅効率グラフは、一定の形態として表される。これを図１２Ａから図１２Ｃで説明する。

図１２Ａ及び図１２Ｂは、背景蛍光信号の強度による増幅効率の変化を図示したグラフである。

図１２Ａを参照すれば、Ｒｂの値が０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００である場合がそれぞれ図示されている。それぞれのグラフは、初期濃度によって一定のパターンを有するので、本発明による初期濃度を定量化するのに使用可能である。しかし、Ｒ_ｂの値が０．１以上である場合に、増幅効率の最大値は、１よりはるかに小さくなる。増幅効率が１よりはるかに小さな値を有するということは、増幅されていないということを意味するので、増幅効率の意味を考慮するならば、物理的意味がない。しかし、図１２Ａに図示されたＲ_ｂの値による増幅効率と増幅サイクル数との関係を見れば、初期核酸の濃度により、それぞれの増幅効率関数が最大値を有する増幅サイクルが一定の間隔に置かれるために、いずれも初期核酸濃度を定量化する方法として使用可能である。ただし、図１２Ａに図示されたＲ_ｂの値のうちには、増幅効率が０と１との間に存在する場合である、Ｒ_ｂの値が０．０１である場合（すなわち、初期核酸の蛍光信号強度）を使用することが望ましい。

図１２Ｂを参照すれば、Ｒ_ｂの値が−０．０１、−０．１、−１、−１０、−１００、−１０００である場合がそれぞれ図示されている。Ｒ_ｂの値が−０．０１と−０．１である場合は、増幅効率関数（数式８）の分母が０に近づいて一定のパターンのグラフが現れないが、それより絶対値が大きい値の場合は、核酸初期濃度により、一定のパターンに示される。特に、Ｒ_ｂの値が−１以下である場合には、増幅効率の値が負数として示される。増幅効率は、０と１との間で物理的意味を有するので、図１２Ｂで図示した値を使用して核酸の初期濃度を定量化することはできるが、増幅効率の物理的意味はない。しかし、図１２Ｂで、Ｒ_ｂの値による増幅効率と増幅サイクル数との関係を見れば、Ｒ_ｂが−１以下である場合（−１、−１０、−１００、−１０００）、初期核酸濃度によってそれぞれの増幅効率の関数が最小値を有する増幅サイクルが一定の間隔に置かれるために、いずれも初期核酸濃度を定量化する方法として使用可能である。

図１２Ｃは、図１２Ａ及び図１２Ｂで述べたＲ_ｂの値の大きさ変化による最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフ及び最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶと核酸の初期濃度との関係を図示したグラフをそれぞれ図示した図面である。

図１２Ｃを参照すれば、Ｒｂの値が正数に増加（図１２Ａ）、または負数に減少（図１２Ｂ）すれば、最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示した曲線は、一定の曲線に収斂する。また、Ｒ_ｂの値が０及び−０．０１である場合を除外すれば、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶは、核酸の初期濃度が１．０Ｅ＋０３と１．０Ｅ＋０８とである範囲内で５％以内に入ることが分かる。最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶと核酸の初期濃度のｅｒｒｏｒとの関係は、図１７を参照して述べる。

Ｒ_ｂの値が一定以上ならば、％ＣＶ値は、特別に変化がないので、増幅効率の値が０と１との間に位置しつつ、％ＣＶ値を向上しようとする場合、図１０で説明した四種の定数のうち、Ｒ_ｂ＝０を除外した残り、すなわちＲ_１、０．０１、−（Ｒ_ｂ）_{ｓｉｇｍｏｉｄａｌ}をＲ_ｂの値として使用することが望ましい。

図１３及び図１４は、背景蛍光信号の強度による蛍光信号強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフである。

図１３及び図１４を参照すれば、Ｒ_ｂの値が０である場合には、蛍光信号強度の最低値がほぼ０になり（すなわち、Ｒ_ｂ＝Ｒ_ｂｍｉｎ＝０）、数式８の分母（Ｒ_ｎ−１）が０に近づくので、増幅効率（Ｅ_ｎ）が現実と合わないほどに大きくなり、Ｅ_ｍａｘピークは、非常に鋭くなり、ノイズの影響を非常に受ける。Ｒ_ｂの値が０でない場合は、増幅効率が一定のパターンで示される。ただし、図１４で、Ｒ_ｂ＝Ｒ_１を使用した場合、増幅サイクルの初期（サイクル数≦５）に、１より大きい最大増幅効率が現れ、そのピークの形が非常に鋭いが、一般的な核酸増幅法では、かように初期に核酸が急激に増幅されることは発生せず、増幅効率が１より大きいことは、物理的に意味がないので、そのピークを無視しなければならない。

図１５は、背景蛍光信号の強度が０である場合と０．０１の場合の最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。そして、図１６は、図１５のグラフを介して最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶを求めた結果を図示した図面である。

図１５を参照すれば、背景蛍光信号の強度が０である場合のグラフと背景蛍光信号の強度が０．０１である場合のグラフは、１Ｅ＋０３と１Ｅ＋０８との間の濃度にて線形的である。ただし、背景蛍光信号の強度が０．０１である場合のグラフが上側に位置する。

図１６を参照し、図１５の分析結果について述べれば、背景蛍光信号の強度が０．０１である場合に最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶ（＝Ｓｔ．Ｄｅｖ（標準偏差）／Ａｖｇ（平均））が非常に向上することが分かる。

図１７は、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶによる核酸の初期濃度のｅｒｒｏｒを図示したグラフである。

図１７を参照すれば、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶが０．５から５．０に変わるとき、ｅｒｒｏｒ（ｉｎ ｃｏｐｙ）は、６．８５％から４８．５％に非常に大きい変化していくことが分かる。すなわち、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶの値が若干大きくなっても、実際の核酸の初期濃度の定量値に大きい誤差を有していることもあるために、非常に正確な定量方法が要求され、図１６で図示されているように、背景蛍光信号の強度が０．０１である場合、０である場合に比べ、核酸の初期濃度定量の正確度が非常に高いということができる。

本発明は、またコンピュータで読み取り可能な記録媒体にコンピュータで読み取り可能なコードとして具現することが可能である。コンピュータで読み取り可能な記録媒体は、コンピュータシステムによって読み込み可能なデータが保存されるあらゆる種類の記録装置を含む。コンピュータで読み取り可能な記録媒体の例としては、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ−Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気テープ、フレキシブルディスク、光データ保存装置などがあり、またキャリアウエーブ（例えば、インターネットを介した伝送）の形で具現されるものも含む。また、コンピュータで読み取り可能な記録媒体は、ネットワークに連結されたコンピュータシステムに分散され、分散方式でコンピュータで読み取り可能なコードが保存されて実行可能である。

以上、本発明についてその望ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野で当業者は、本発明が本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態で具現できることを理解できるであろう。従って、開示された実施例は、限定的な観点でなくして説明的な観点で考慮されるものである。本発明の範囲は、前述した説明ではなくして特許請求の範囲に示され、それと同等な範囲内にあるあらゆる差異点は、本発明に含まれていると解釈されねばならない。

本発明のリアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法は、所定のＤＮＡサンプルをＰＣＲを利用して増幅する過程でリアルタイムに初期拡散濃度を検出できるので、例えば大量のＤＮＡ定量分析関連の技術分野に効果的に適用可能である。

核酸の蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係をモデリングしたグラフである。 図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。 図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。 図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。 図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。 図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。 図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。 増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフである。 図３で増幅効率が最大であるときの増幅サイクル数を求める方法を説明するための図面である。 図１の数学的モデルの最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数（ｎ_１／２）及び図３の最大増幅効率（ｎ_Ｅｍａｘ）と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。 図１の数学的モデルで、背景蛍光信号を除外した増幅前蛍光信号の強度Ｒ_０と初期核酸濃度との関係を図示したグラフである。 本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果をと図示した表である。 本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果をと図示した表である。 本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果をと図示した表である。 核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフ、及び増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフを共に図示した図面である。 図８の実験結果のグラフから得た最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。 核酸の背景蛍光信号を考慮した増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示した図面である。 初期蛍光信号の強度を図示した図面である。 背景蛍光信号の強度による増幅効率の変化を図示したグラフである。 背景蛍光信号の強度による増幅効率の変化を図示したグラフである。 図１２Ａ及び図１２Ｂで説明したＲ_ｂの値の大きさ変化による最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフ、及び最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶと核酸の初期濃度との関係を図示したグラフをそれぞれ図示した図面である。 背景蛍光信号の強度による蛍光信号強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフである。 背景蛍光信号の強度による蛍光信号強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフである。 背景蛍光信号の強度が０の場合と０でない場合の最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。 図１５のグラフを介して最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶを求めた結果を図示した図面である。 最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶによる核酸の初期濃度のｅｒｒｏｒを図示したグラフである。

Claims (6)

1. （ａ）核酸を増幅するステップと、
   （ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号の強度と前記増幅サイクル数との相関関係を表す関数を生成するステップと、
   （ｃ）前記関数を利用し、前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップと、
   （ｄ）前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度と核酸の初期濃度との関係を表す補正曲線を利用し、前記（ｃ）ステップで前記算出した増幅前蛍光信号の強度から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含み、
   前記（ｂ）ステップは、前記相関関係をシグモイドモデルを用いて関数で表すステップを含み、
   前記（ｃ）ステップは、前記シグモイドモデルを用いた関数に対して非線形最小二乗フィッティングを使用し、前記関数から前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップを含むことを特徴とする初期の核酸濃度を定量化する方法。
2. 前記（ａ）ステップは、
   酵素を利用し、前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
3. 前記（ａ）ステップは、
   熱的サイクルを必要とする核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
4. 前記（ａ）ステップは、
   等温核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
5. 前記（ｂ）ステップは、
   前記相関関係を数式１で表現されたシグモイドモデルを利用し、関数で表すステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
   （ここで、Ｒは前記蛍光信号の強度、前記Ｒ _ｂ は前記蛍光信号の背景強度、前記Ｒ _ｍａｘ は最大蛍光信号強度、ｎは前記増幅サイクル数、前記ｎ _１／２ は前記蛍光信号の背景強度を除外した前記蛍光信号の強度の最大値の半分に該当する増幅サイクル数、前記ｋは前記蛍光信号の増加に対する傾きを表す。）
6. 前記（ｃ）ステップは、
   前記数式１で表現されたシグモイドモデルを利用した関数について、非線形最小二乗フィッティングを使用し、前記関数から前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップを含むことを特徴とする請求項５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。