JP2017533719A - 出発試料の特性を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
本方法は、出発試料の特性、例えばその中に存在する核酸(DNA)の量を決定するために提供される。
Description
本発明は、出発試料の特性、例えばそこに存在する核酸(DNA)の量を決定する方法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ごく少量のDNAであっても検出することを可能にする、DNAを増幅するための方法である。この方法は、そこに存在するサンプルDNA(標的DNA)の融解および酵素的複製のための反応混合物の加熱および冷却を繰り返すことからなる、それぞれ決定された数のサイクルを含む。反応進行中、それぞれの前のサイクル(または、前の複数サイクル)で産生されたDNAは、それぞれのランニングサイクルにおけるDNAの複製のためのマトリックス(鋳型)として利用される。これは、該DNAの指数関数的な増加(増幅)をもたらし、理想的な場合、1サイクルで二倍になる。
いわゆるリアルタイムPCR(または、定量的PCR、qPCR)は、PCR産物(DNA)の蓄積がPCR反応中に、すなわちリアルタイムで検出されることを特徴とする。この目的のために、DNA複製によって活性化される当初は不活性な蛍光色素がこの反応に添加される。蛍光は、各サイクルで、すなわち“リアルタイム”で測定され、増幅されたDNAの量は蛍光から推定することができる。
その結果、qPCRを用いて、出発試料中に元来存在するDNAのコピー数を決定することができる。この決定は、出発コピー数が多いほど、PCR産物の有意な蓄積を早期に検出できるという一般原則に従う。
PCR産物の蓄積のモニタリングは、原則として、反応混合物の励起後に放射される蛍光の検出に基づいており、それはPCR産物の量に正比例する。
PCR技術、中でも正確にはqPCRは、診断検査が中央ラボラトリではなく、現場(in situ)で、例えば病院、医療処置現場または薬局で行われる、ポイントオブケアテスト(POCT)の分野でこれまでに確立されている。ポイントオブケアテストは、状況次第では十分に訓練されていないスタッフによっても行われることがあるため、特に耐ノイズ性(noise-immune)のおよび可能な限り客観的な検査技術および評価技術が必要とされる。
Wiesnerら(Nucl. Acids Res., .20、5863-5864 (1992))により、結果データセットの各図形表示について、多重(multiplicity)サイクル値(n)に対して、1つの結果値(y)をそれぞれのサイクル値(n)に割り当て、次いで試料中の初期濃度(c)および増幅効率Eが次の式で決定される、結果値(y)の線形回帰によって決定する手順を取ることにより、ポリメラーゼ鎖連鎖反応(PCR)のデータを評価する方法が知られている。
Log(結果値)=Log(増幅効率)×サイクル値+Log(初期濃度c)
(Wiesnerらの表記で、logNn=logeff・n+logN0)。この方法は、特に、非常にノイズの多い測定信号の場合には、正しく機能しない。
Log(結果値)=Log(増幅効率)×サイクル値+Log(初期濃度c)
(Wiesnerらの表記で、logNn=logeff・n+logN0)。この方法は、特に、非常にノイズの多い測定信号の場合には、正しく機能しない。
この背景に対して、本発明の目的は、少なくとも上記の先行技術の欠点の1つを除いた方法で出発試料の特性を決定する方法を提案すること、または少なくとも先行技術とは異なる方法で出発試料の特性を決定する方法を提案することであった。
本発明は、出発試料の特性を決定するために結果データセットからデータセットを決定することが必要であり、そして特に、データセットの決定、さらに該データセットの最終のサイクル値の決定に重きが置かれるという基本的考え方に基づいて行われ、これは、特性の決定が、範囲が広すぎるまたは狭すぎるデータセットでは信頼できない程度にしか実行できないためである。この場合、多重サイクル値についての結果データセットにおいて、結果値はそれぞれのサイクル値に割り当てられ、複数(plurality)のサイクル値についてのデータセットにおいて、結果値はそれぞれのサイクル値に割り当てられ、多重サイクル値は、該データセットに含まれる複数のサイクル値よりも大きい結果データセットに含まれる。
本発明は、同様に、出発試料の特性を決定する際、結果値に含まれる測定誤差を考慮しなければならないという知見に基づいて行われる。このため、本発明の一態様は、結果値をサイクル値の関数として表す関数であって、初期値(c)がパラメーターとして特徴付けられ、そしてサイクル値が指数(n)として特徴付けられている指数項を含む関数のパラメーターをデータセットから計算するためのカーブフィッティングの使用を提供し、該関数が、指数項に加算されたシステム項を有することが本発明により認識されている。該態様により、本発明において、決定されるべき特性を、カーブフィッティングにおける初期値(c)に見出だされたパラメーターに基づいて決定することができると考えられる。
従って、本発明は、データセットを関数logNn=logeff・n+logN0(すなわち、結果値(Nn)をサイクル値(n)の関数として表す関数の対数であって、ここで関数が、対数変換前に、初期値(N0)がパラメーターとして特徴付けられ、そしてサイクル値(n)が指数として特徴付けられている指数項を含む)で表すことができることのみが認識されていた、Wiesnerらの(Nucl. Acids Res., .20, 5863-5864 (1992))の手順とは異なる。しかしながら、該手順は、データセットを作成するシステムに起因する影響を完全に無視するため、可能な限り自動で使用するのには適していない。このように大部分を自動化されているため信頼性の高い方法は、PCRに基づくポイントオブケアテストのために適確に望ましい。
本発明により、データセットを作成するためのシステムの影響は、指数項に加算されたシステム項によって最もよく表されることが認識されている。システムの影響および指数関数的増加が、カーブフィッティングにおいて同時に考慮されている場合にのみ、初期値(c)の値を確実に発生させることができ、それに基づいて決定すべき特性を確実に出力することができる。
本発明の方法は、結果値が複数のサイクル値についてそれぞれのサイクル値に割り当てられているデータセットを使用する。好ましくは、複数のサイクル値が一連の自然数であるデータセット、特に一連の自然数が、1つの自然数が次の自然数によって次のサイクル値に続く場合の連続した自然数(例えば、“1、2、3、4、5、…”または“3、4、5、6、7、8、…”)であるデータセットに関する。
本発明の適用の大部分において、したがって好ましい態様によれば、データセットは、サイクル値およびそれにそれぞれ割り当てられた結果値を含む一連の値のペアリングからなり、データセット内の値のペアリングの配列は、結果値を作成するための測定値が記録される配列順から得られる。特に好ましい態様において、配列内の第一の値のペアリングに続く第二の値のペアリングは、第一の値のペアリングの作成が記録された測定値の次に記録された測定値から作成される値のペアリングである。
qPCRにおいて、結果値は、好ましくは、それぞれのサイクルの終わりに測定された蛍光強度yである。該蛍光強度は、通常、無次元の任意の単位で表される。
本発明の方法は、データセットにカーブフィッティングを行う。カーブフィッティングはまた、時に、補正計算(compensating computation)、補正(compensation)、パラメーター推定、マッチング、回帰またはフィット(フィッティング)とも呼ばれる。好ましい態様において、最小二乗法をカーブフィッティングとして使用する。
本発明の方法において、カーブフィッティングは、結果値をサイクル値の関数として表す関数であって、初期値(c)がパラメーターとして特徴付けられ、そしてサイクル値が指数として特徴付けられる指数項を含む関数であり、該関数が指数項に加算されたシステム項を有する、関数のパラメーターを決定するためにデータセットのデータを使用するために該データセットに実行される。該関数は、以下のように表すこともできる。
F(n)=A+cEn、
式中、F(n)は、それぞれのサイクル値(n)に関する結果値と相関する関数によって計算される値であり、Aはシステム項であり、そしてcEnは、初期値(c)がパラメーターとして特徴付けられ、かつサイクル値(n)が指数として特徴付けられる、指数項である。好ましい態様において、指数項のパラメーターEは、増幅効率の尺度とすることができる。
F(n)=A+cEn、
式中、F(n)は、それぞれのサイクル値(n)に関する結果値と相関する関数によって計算される値であり、Aはシステム項であり、そしてcEnは、初期値(c)がパラメーターとして特徴付けられ、かつサイクル値(n)が指数として特徴付けられる、指数項である。好ましい態様において、指数項のパラメーターEは、増幅効率の尺度とすることができる。
好ましい態様において、システム項Aは、関係式A=a+b・nで表され得る。この場合、パラメーター(a)は、結果値の作成における背景ノイズの平均値の尺度として理解され得る。パラメーター(b)は、好ましい態様において、作成された結果値が最初の方ほど小さくなるか、または大きくなるという効果を説明するために使用され得る。
従って、好ましい態様において、カーブフィッティングは、少なくとも項a+b・n+cEnを含む関数のパラメーターを決定するためにデータセットのデータを使用するために該データセットに実行される。a+b・n+cEnで表され得る関数のパラメーターを決定するためにデータセットのデータを使用することを目的とする、データセットでのカーブフィッティングは、特に好ましい。
好ましい態様において、線形項(a+b・n)となるように選択された項Aは、好ましい一態様において、例えば、n次の多項式を形成するために、さらなる項を追加してもよい。従って、カーブフィッティングの過程でさらに正確に標的パラメーター(c)を決定することが可能となる。
カーブフィッティングにおける初期値(c)に見出されたパラメーターは、決定すべき特性を直接的に表し得る。好ましい態様において、決定すべき特性を出力するために、カーブフィッティングにおける初期値(c)に見出されたパラメーターは、システム特有の係数sが乗算される。例えば、試料の元のDNA量(Qe)が決定されるべき特性として標的化される場合、該量は、式Qe=s×cを用いて決定することができる。システム特有の係数sは、元のDNA量が既知である対照試料を用いて容易に決定することができ、本発明の方法を用いて実行し、こうして決定されたパラメーターcおよび対照試料について既知の元のDNA量(Qe)を用いて式Qe/c=sを用いて、係数sを決定する。係数sは、所望の単位でパラメーターを表すためにも使用することができ、例えば、PCRにおいて、元の試料中のDNAの量は、コピー数または濃度として、例えば、g/lまたはmol/lで、無次元で表され得る。
別の態様において、出発試料の特性は、さらなる計算に基づいて得られる。上記の手段でシステム項Aを同定したならば、その結果値のサイクル値に適用可能なシステム項Aの値をデータセット内の各結果値から差し引くことにより修正されたデータセットを作成することができる。システム項Aが定数である場合、この定数は、データセットの各結果値から差し引かれ、修正されたデータセットが作成される。システム項Aがサイクル値の関数である場合、例えば、A=a+b・nである場合、この結果値に対応するサイクル値に適用可能なシステム項Aが結果値から差し引かれ、修正されたデータセットの一部となる修正された結果値が作成される。修正されたデータセットがプロットされた場合、プロットされた点は、修正されたデータセットのデータがシステムから生じる曖昧さから解放されたために、データセットがプロットされた場合よりも明らかに指数曲線により近くなる。この指数曲線は、F(n)=cEnとして表すことができる。
この別の態様において、初期値(c)は、修正されたデータセットの部分にカーブフィッティングを行うことにより、例えば式F(n)=cEnへのカーブフィッティングにより決定することができる。あるいは、対数データセットを修正データセットから作成することができる。対数データセットを作成するために、各修正された結果値の対数を取り、対数結果値を作成する。例えば、自然対数または底2もしくは底10に対する対数または他の任意の好適な底に対する対数を取ることができる。対数データセットの一部のグラフ表示は、ほとんど線形となる(ln(cEn)=n・ln(E)+ln(c))。対数結果値のカーブフィッティングを式n・ln(E)+ln(c)に対して行うとき、初期値(c)を縦軸との交点から求めることができる。
この別の態様において、対数データセットに最もよく適合する直線に対するカーブフィッティングを行う場合、最小二乗法を用いることができる。1つの可能な態様において、予め設定された連続する数値、例えば4つの連続する値に対して、直線に対するカーブフィッティングをこれらの値に対して行うことができる。複数の点からフィットした直線までの標準偏差を求めることができる。かかるアプローチにおいて、連続する値のセットおよびこの値のセットにフィットさせた線が選択され、最小標準偏差を提供する。初期値(c)は、この線の縦軸との交点から得られる。この結果得られる初期値の質をさらに向上させるために、線が、所定の値Eminと所定の値Emaxとの間にある上記の手段で計算されたパラメーターEを全てが有するそれらの連続する値にのみフィッティングされることがさらに必要であり得る。このようにして、カーブフィッティングは、指数期からの値に対してのみ行われることが明らかにされる。標準偏差を決定することに加えて(結果を検証するために)またはその代わりに、観察された連続した値のすべてのセットおよびそれによって作成された直線のすべてのセットについて、最大傾斜を有する直線が選択される。初期値(c)は、この線の縦座標との交点から得られる。結果として得られる初期値の質をさらに向上させるために、線が、所定の値Eminと所定の値Emaxとの間にある上述のアポローチで計算されたパラメーターEを全てが有するそれらの連続する値にのみフィッティングされることがさらに必要であり得る。このようにして、カーブフィッティングは、指数期からの値に対してのみ行われることが明らかにされる。
PCR法において、サイクル中、DNA含有反応混合物(試料)をシステム内で加熱する。一般的なPCRに適するシステムは、当業者によく知られており、例えばいわゆるサーモサイクラーである。DNAの二本鎖は特定の温度に加熱されると融解する。次いで、反応混合物中に存在するプライマーの一本鎖へのハイブリダイゼーション(アニーリング)を可能にするために、試料をそれに適する温度まで冷却する。これは、通常、システムにより自動的に行われる。その際、プライマーは、反応混合物中に存在するポリメラーゼにより伸長される(DNA複製)。この目的のために、同様に、反応混合物はシステムにより好適な温度に加温されてもよい。この結果、新規の二本鎖が得られる(増幅)。これによりサイクルが終了する。新しいサイクルは、DNAを融解するためにシステムを再加熱することから始まる。
リアルタイムPCR(qPCR)においては、蛍光シグナルによりDNAの増幅を示す試薬を反応混合物に添加する。該蛍光シグナルを、例えば、サイクルの結果値として用いることができる。可能性のある試薬は当業者によく知られており、一例としてはサイバーグリーン(SYBR green)があり、それは増幅中に取り込まれて、二本鎖のDNAとなり、蛍光を発する。しかしながら、例えば、初めに蛍光を消光し、増幅の際に除去される消光剤を反応混合物に添加することも可能である。消光剤が除去されたときにのみ、蛍光を検出することができる。別の例は、蛍光シグナルを生じるために使用され得る加水分解プローブである。
こうして、PCR法では、結果値が、多重サイクル値についてそれぞれのサイクル値に割り当てられる結果データセットを作成することができる。好ましい態様において、本発明の方法に使用されるデータセットは、結果データセットから作成される。従って、結果データセットに含まれる多重サイクル値は、データセットに含まれる複数のサイクル値よりも大きい。好ましい態様において、データセットのサイクル値の配列は、結果データセットのサイクル値の配列のサブグループである。
一態様において、本発明の方法は、データセットのサイクル値の配列が、結果データセットのサイクル値の配列のサブグループであり、データセットのサイクル値の配列の最終の結果値が以下のように決定される方法を提供する。すなわち、結果データセットにおける配列順によってそれぞれ検討される配列内の第一のサイクル値、第二のサイクル値および第三のサイクル値としてそれぞれ示される3つのサイクル値の複数の連続配列に対して結果データセットの出発サイクル値から出発して、配列は以下の場合に決定され、
− 検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値が、検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値より大きく、そして
− 検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値と第三のサイクル値に割り当てられた結果値との和から、検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値の2倍を減算して得られる曲率値(curvature value)zが、該検討される配列の中で最も高い値を取る、
という要件を満たす配列の第二のサイクル値が、データセットの最終のサイクル値として使用される。
− 検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値が、検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値より大きく、そして
− 検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値と第三のサイクル値に割り当てられた結果値との和から、検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値の2倍を減算して得られる曲率値(curvature value)zが、該検討される配列の中で最も高い値を取る、
という要件を満たす配列の第二のサイクル値が、データセットの最終のサイクル値として使用される。
本発明を使用する複数の領域において、結果値は、サイクル値の増加に伴って少なくともサイクル値のサブグループに対して指数関数的に増大することが予想される。出発試料の特性は、特に、評価されるべきデータセットが、結果値がもはや指数関数的に増大しないが、結果値のプロファイルが平坦になるサイクル値までの(それを含む)サイクル値(およびそれに割り当てられた結果値)のみを含む場合によく決定できることが認識されている。この場合、該最終のサイクル値を特定の精度で決定しようと試みるべきである。具体的には、標的とする特性を決定するためにデータセットを用いてカーブフィッティングを実行する場合、さらなる1サイクル値の加算(および、それに割り当てられた結果値の加算)は、カーブフィッティングで決定されたパラメーターに相当な変動をもたらし得る。この場合、データセットの最終のサイクル値は、請求項1に記載の方法によって特に確実に決定され得ることが認識されている。
好ましい態様において、曲率値(z)が決定される場合、さらにより好ましい態様において、曲率値(z)が0になるとき、配列の探索を停止するか、あるいは、曲率値(z)が負になるとき、配列の探索を停止することができる。曲率値(z)が0になる場合、または負になる場合において、それまで指数関数的であった曲線の曲率は変化し、曲線が平らになる。これにより、更なるサイクルを実行する必要がなくなり、初期値の決定に必要な時間を短縮することができる。
本発明の方法では、後にデータセットの初期のサイクル値ともなる、結果データセットの初期のサイクル値について、第一の結果値、すなわち、例えば、PCR法によるサイクルを出発試料に対して最初に実行するとき、決定された増幅の測定値、の使用が考えられる。しかしながら、結果データセットの後のサイクル値がデータセットの初期のサイクル値として使用される場合の態様を考えることも可能である。この手順により、とりわけ、出発試料で実施されたPCR法の第一のサイクルにおいて起こり得る、結果値の決定における初期の不正確さの除外が可能になる。例えば、第三のサイクルは、データセットの初期サイクルとして使用することができる。
好ましい態様において、最大のサイクル値を予め決定することができる(NR)。該最大サイクル値は、結果データセットからデータセットを調整する際にエラーが生じたかどうかを調査するために使用することができる。例えば、曲率値(z)が0になるか、または負になることなく、所定の最大サイクル値に達した場合に、エラーメッセージを通知することができる。一例として、数字40を最大のサイクル値として選択することができる。
さらに、サイクル値の最小値を固定することも可能である。これは、結果データセットからデータセットを作成する際にエラーが生じたかどうかを調査するためにも使用することができる。最小サイクル値よりも小さいサイクル値を含むことが確認された場合、本発明の方法の好ましい態様において、操作者(operator)に対するアドバイスを作成することが可能である。
好ましい態様において、最小値Eminは、再作成される式においてパラメーターEに対して固定されてよい。値Emin以下の値がパラメーターEに対するカーブフィッティングにおいて決定される場合、警告を出力することが可能である。
好ましい態様において、最大値Emaxは、再作成される式においてパラメーターEに対して固定されてよい。値Emax以上の値がパラメーターEに対するカーブフィッティングにおいて決定される場合、警告を出力することが可能である。
好ましい態様において、最小結果値の差Δymaxは、固定することができる。データセットの最終のサイクル値の結果値と、データセットの最初のサイクル値の結果値との差異が、該最小結果値の差Δymaxより小さい場合に、警告を出力することが可能である。
好ましい態様において、初期値(c)について決定されるパラメーターが0未満であるとき、警告を出力することが可能である。
本発明の方法は、PCRの任意の所望の形態を評価するために使用することができ、ここで、反応混合物中に存在するDNAの増幅をシグナルにより、特に蛍光シグナルにより追跡することができる。唯一の仮定は、多重サイクル値を有する結果データセットが作成されるということであり、ここで、それぞれのサイクル値は、結果値に割り当てられ得る。この場合、出発試料は、DNA、または他の形態の核酸(例えば、RNA)であり得て、それは、次いで、当業者によく知られている方法を用いて対応するDNAに転写される。この一例は、逆転写酵素によってDNAに転写され得て、その後リアルタイムPCRにより定量され得る、RNAの使用である。リアルタイムPCRは、本発明の方法に必要な結果データセットを作成する。
本発明の方法は、特に、ポイントオブケアシステムにおいて利用されるPCRシステムにおける使用に適している。正確には、システムの特殊性を考慮して、より良好なフィッティングが本発明によって可能となり、測定値プロファイルのよりよい表示が本発明によって同定され、操作者の資質とは分離した形でポイントオブケアシステムを実施することにより評価の信頼性の向上を可能にする。
本発明は、本発明の1つのみの例示的態様を示す図面と共に、以下に詳しく説明される。
図1に示すグラフは、結果データセットを示す図である。結果データセットは、多重サイクル値、具体的には、番号1〜40の配列の値を示す。このグラフは、結果データセットのそれぞれのサイクル値に割り当てられた結果値を示す。結果値は、それぞれのサイクルの最後に決定される蛍光強度yである。
結果値が複数のサイクル値についてそれぞれのサイクル値に割り当てられたAデータセットは、結果データセットから作成された。該データセットのサイクル値の配列は、結果データセットのサイクル値の配列のサブグループである。初期サイクル値として、データセットはサイクル値1を含み、最終サイクル値として、サイクル値24(n=24)を含む。
データセットのサイクル値の配列の最終サイクル値は、次のように決定される。すなわち、結果データセット内のそれらの配列順によりそれぞれの検討される配列(例えば、n=4、5、6)内の第一のサイクル値(例えば、n=4)、第二のサイクル値(例えば、n=5)および第三のサイクル値(例えば、n=6)としてそれぞれ示されている、3つのサイクル値の複数の連続した配列(n=1、2、3;n=2、3、4;n=3、4、5;n=4、5、6など)に対する結果データセットの開始サイクル値(n=1)から開始し、配列は、
− 検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値が、検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値より大きく、そして
− 検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値と第三のサイクル値に割り当てられた結果値との和から、検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値の2倍を減算して得られる曲率値(curvature value)zが、該検討される配列の中で最も高い値を取る
という要件を満たす場合に決定される。
− 検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値が、検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値より大きく、そして
− 検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値と第三のサイクル値に割り当てられた結果値との和から、検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値の2倍を減算して得られる曲率値(curvature value)zが、該検討される配列の中で最も高い値を取る
という要件を満たす場合に決定される。
該要件を満たす配列の第二のサイクル値が、データセットの最終のサイクル値として使用され、ここで、サイクル値は、n=24である。
図1は、関数のグラフもまた含んでいる。関数は、
f(n)=a+bn+cEn=A(n)+cEn
である。
パラメーター(a)、(b)、(c)、関数のEは、カーブフィッティングの過程でデータセットにて実施された。この場合、図中に再現されたパラメーター(左上)は、同様に決定された。
f(n)=a+bn+cEn=A(n)+cEn
である。
パラメーター(a)、(b)、(c)、関数のEは、カーブフィッティングの過程でデータセットにて実施された。この場合、図中に再現されたパラメーター(左上)は、同様に決定された。
決定すべき特性、具体的には、出発試料モル数での分子数を、初期値cについて決定されたパラメーター2.611e−07から決定することができる。
図2は、対数データセットを表すグラフを示す。上記のようにシステム項A(n)を同定したが、修正されたデータセットは、データセットにおける各結果値から、結果値のサイクル値に適用可能なシステム項A(n)の値を差し引くことによって作成される。修正されたデータセットから、対数データセットは、各修正された結果値の2を底とする対数を計算することにより作成される。図2から明らかなように、対数データセットの部分のグラフ表示は、ほぼ直線(ln(cEn)=n・ln(E)+ln(c))であるが、他の部分は、様々な値を示している。これらの部分について、対数結果値を式n・ln(E)+ln(c)にカーブフィッティングする際、初期値(c)は、縦軸との交点から求めることができる。
この別の態様において、対数データセットに最もフィットする直線に対するカーブフィッティングを実施する場合、最小二乗法が使用される。1つの可能な態様において、4つの連続する値について、直線に対するカーブフィッティングをこれらの値に対して行うことができる。複数の点からフィットした直線までの標準偏差を求めることができる。このような手法では、連続する値のセットおよびこの値のセットにフィットさせた直線が選択され、最小標準偏差を提供する。初期値(c)は、この直線の縦座標との交点から得られる。図2から明らかなように、第一のサイクル値について、4つの連続する値の対数結果値は、大きな標準偏差を有する直線にのみフィットされ得る。しかしながら、対数データセットのグラフ表示において、図1に見出される指数期に対応する特徴的な一連の値がある。この特徴的な一連の値において、図2の値は、直線で近似することができる。値(c)を決定するために、最小標準偏差で値にフィットする直線となる一連の4つの値を選択し、そして値(c)を、この直線と縦座標との交点から得ることができる。
標準偏差を決定することに加えて(結果を検証するために)、または標準偏差を決定する代わりに、観察された連続する値の全てのセットおよびそれによって作成された直線の全てのセットについて、最大傾斜を有する直線が選択される。さらに質を高めるために、直線が、所定のEminと所定のEmaxとの間に位置する上記の手法で計算されたパラメーターEを有するそれらの連続する値に対してのみ傾きがあり、そして標準偏差が所定の値未満であることが要される。初期値(c)は、この線の縦軸との交点から得られる。
Claims (7)
- 出発試料の特性を決定する方法であって、
− 出発試料を、システムにおける第1サイクルにおいて増幅させ、該増幅の測定値が結果値として取得され、
− システムにおけるそれぞれのサイクルにおける増幅およびそれぞれのサイクルの結果値としての増幅の測定値の取得は、少なくともn回繰り返され、各サイクルには、識別のためにサイクル値が割り当てられ、
− そうして、結果データセットは、結果値が多重サイクル値に対するそれぞれのサイクル値に割り当てられて作成され、
結果データセットから、結果値が複数のサイクル値に対するそれぞれのサイクル値に割り当てられているデータセットが作成され、そして結果データセットに含まれる多重サイクル値は、データセットに含まれる複数のサイクル値よりも大きく、
データセットのサイクル値の配列は、該結果データセットのサイクル値の配列のサブグループであり、そしてデータセットのサイクル値の配列の最終のサイクル値は、以下の通りに決定される、すなわち、結果データセットにおける配列順によってそれぞれ検討される配列内の第一のサイクル値、第二のサイクル値および第三のサイクル値としてそれぞれ示される3つのサイクル値の複数の連続配列に対して結果データセットの出発サイクル値から出発して、配列は以下の場合に決定され、
− 検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値が、検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値より大きく、そして
− 検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値と第三のサイクル値に割り当てられた結果値との和から、検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値の2倍を減算して得られる曲率値zが、該検討される配列の中で最も高い値を取る、
という要件を満たす配列の第二のサイクル値が、データセットの最終のサイクル値として使用される、方法。 - 出発試料の特性を決定するための方法であって
− 出発試料を、システムにおける第1サイクルにおいて増幅させ、増幅の測定値が結果値として取得され、
− サイクルを少なくともn回繰り返し、各サイクルに識別のためのサイクル値が割り当てられ、
結果値が複数のサイクル値についてそれぞれのサイクル値に割り当てられているデータセットが作成され、ここで、
− 結果値をサイクル値の関数として表す関数であって、初期値(c)がパラメーターとして特徴付けられ、サイクル値が指数として特徴付けられる指数項を含む関数であり、該関数が指数項に加算されたシステム項を有する、関数のパラメーターを決定する目的でデータセットのデータを使用するために、データセットにカーブフィッティングを行い、そして
− 決定されるべき特性が、カーブフィッティングにおける初期値(c)に見出されるパラメーターに基づいて出力される、方法。 - データセットが結果データセットから作成され、結果データセットにおいて、多重サイクル値について、結果値がそれぞれのサイクル値に割り当てられ、結果データセットに含まれる多重サイクル値が、データセットに含まれる複数のサイクル値よりも大きいことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- データセットのサイクル値の配列が、結果データセットのサイクル値の配列のサブグループであり、そしてデータセットのサイクル値の配列の最終のサイクル値が、以下の通りに決定されることを特徴とする、請求項3に記載の方法であって、該結果データセットにおける配列順によってそれぞれ検討される配列内の第一のサイクル値、第二のサイクル値および第三のサイクル値としてそれぞれ示される3つのサイクル値の複数の連続配列に対して該結果データセットの出発サイクル値から出発して、
− 検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値が、検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値より大きく、
− 検討される配列の第一のサイクル値に割り当てられた結果値と第三のサイクル値に割り当てられた結果値との和から、検討される配列の第二のサイクル値に割り当てられた結果値の2倍を減算して得られる曲率値zが、該検討される配列の中で最も高い値を取る、
という要件を満たす配列の第二のサイクル値が、該データセットの最終のサイクル値として使用される、方法。 - カーブフィッティングを実行するために最小二乗法を使用することを特徴とする、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
- 出発試料がDNAであり、結果値が蛍光強度の測定値であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ポイントオブケアシステムで使用するためのPCRシステムにおける、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。
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