JP4718431B2 - 分析法及び分析装置 - Google Patents
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Description
本発明の対象は、検体の存在を決定するための方法及び当該方法を行うことができる分析装置である。
本発明は、分析又は診断の分野、特に核酸診断において有用である。EP 0 200 362及びEP 0 201 184に開示されるように、核酸分析は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の発明によりかなり改善された。この方法の過程の間、核酸の量は、少なくとも部分的に指数関数的に増加する。なぜなら、理論的には、各反応サイクルにおいて反応混合液中に存在する各核酸配列から更なる核酸が作成され、そして当該配列の各々が次の反応サイクルにおいて更なる核酸配列の作成のためのテンプレートとして働くことができるからである。作成される核酸量は、反応混合液中に含まれる試薬、例えば酵素、プライマー、及びヌクレオチドなどの量により制限される。その結果、時間又はＰＣＲのサイクル数に対してプロットされた濃度は、(非対称)シグモイド曲線に似る。
ＰＣＲのさらなる改良は、いわゆるリアルタイムＰＣＲである。この方法では、増幅の間、シグナルが作成され、そして検出される。当該シグナルは、増幅の間作成され、そうして反応混合液中に存在する核酸量を表す。第一の実施態様(例えば、EP 0 512 334に開示される)では、二本鎖核酸中にインターカレットでき、その間その蛍光性質を変えることができる化合物によりシグナルが作成される。EP 0 543 942に開示されるように別の実施態様では、プライマーの各伸張反応は、クエンチャー及びエミッター色素により標識されたプローブの切断を招き、その結果プローブが切断された場合、クエンチャーが当該レポーター色素の発光を消光できず、その結果シグナルが検出できる。
増幅前にサンプル中に元々存在する核酸量を測定すること(定量又は計量)は、幾つかの研究の目的であった。一般的に、量が多いほど、シグナルの規定の強度を得るために必要とされる反応回数(閾値)が小さくなる。その結果、初期の計算法は、閾値サイクル(ＣT)値を決定することに基づいた。ＣT値が高いほど、存在した元の核酸量が少なくなる。明らかに、実行された反応サイクル数(整数)は、元々存在していた量の概算見積もり値でありうる。濃度を決定するさらなる試みにおいて、異なる計測データー間のシグナル強度は(線形又は対数的に)補間される。この補間に基づく方法は、シグナル計測が不正確な場合又はさらに異常値(急増(spike))を計測した場合にいくらかの欠点を有した。これを避けるために、増幅反応の間の規定回数の計測から連続増加曲線を作成するアルゴリズムが確立された。このアルゴリズムの一例は、いわゆるSawitzky Golay Filterである。得られた曲線は、増加曲線(growth curve)と呼ばれた。EP 0 686 699では、計測されたデーターを理論曲線に近似するために使用されうる条件付帰納式を記載する。しかしながら、この適用は扱いにくく、そして近似プロセスは記載されていない。これは、ある場合において強力なパラメーター相関性及び不正確な結果をもたらしうる。
WO97/46714では、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)後のハイブリダイゼーションをモニターする方法が開示される。特に、当該出願により、蛍光対サイクル数のプロットを用いた開始テンプレートの感度が、非特異的増幅の対照に対して生産物の融解曲線を分析することにより、そして非線形回帰近似であるLevenberg-Marquard曲線近似アルゴリズムにより増加されうるということが開示される。しかしながら、本文献では、ダイレクトＰＣＲ増幅検出(蛍光対サイクル数のプロット)に対する任意の回帰法の適用が記載される。
Biotechnology Letters 24, 2002, 2053-2056では、４個のパラメーターによるシグモイドモデルを用いたＲＴ-ＰＣＲの増幅効率を測定する方法が開示される。
Biochemical and Biophysical Research Communications 294, 2002, 347-353において、ＰＣＲの効率を測定するためのＰＣＲシミュレーション法が記載される。
これらの２つの数学的に同等な４個のパラメーターのモデルは、正確な計算結果に通常決定的である領域において特に限定された正確性を提供する。ベースラインは、一定にされ、そして単純なシグモイド項 (sigmoid term)は、一般的な増加曲線の完全な複雑性を近似することができない。その結果、指数期は、二つの論文のグラフにおいて視覚的に観察されるように限定された正確性で近似される。これは、限定された正確性で結果、例えばＣT、を導く。
定量分析を改善すること、特に全体の増加曲線をよりよく見積もるための、特に不正確性の計測及び生じうる急増の計測を補正するための、数学的計算を用いた全自動方法を提供することが本発明の目的である。
第一実施態様では、本発明は、サンプル中の核酸の存在を測定する方法であって、以下の：
当該核酸を含む反応混合液を準備し、
既知の間隔で当該反応混合液からシグナルを検出し、
前記シグナルを計測データーに変換し、そして
当該計測データーから、数学的アルゴリズムを通して増加曲線を作成する
を含む方法であり、ここで当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、そしてここで当該パラメーターの最適な値が、回帰近似アルゴリズムを当該計測データーに適用することにより決定され、当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグランド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値、及び
以下の式：
[式中、
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数(multiplicative sigmoid function)の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である。]
に従った中間増加曲線見積もり値
を含む。
当該核酸を含む反応混合液を準備し、
既知の間隔で当該反応混合液からシグナルを検出し、
前記シグナルを計測データーに変換し、そして
当該計測データーから、数学的アルゴリズムを通して増加曲線を作成する
を含む方法であり、ここで当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、そしてここで当該パラメーターの最適な値が、回帰近似アルゴリズムを当該計測データーに適用することにより決定され、当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグランド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値、及び
以下の式：
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数(multiplicative sigmoid function)の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である。]
に従った中間増加曲線見積もり値
を含む。
本発明の別の対象は、サンプル中の検体の存在を決定するための分析装置であって、以下の：
光源、
シグナル検出ユニット、
シグナルの計測データーへの変換ユニット
計測データー記憶装置
計測データーの増加曲線への変換ユニット、及び
増加曲線解釈ユニット
を含み、ここで当該計測データーの増加曲線への変換ユニットが、数学的アルゴリズムを用いて増加曲線を計測データーに非線形回帰近似するための全自動化アルゴリズムを搭載されたコンピューターを含む、前記分析装置である。ここで、当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、ここで前記パラメーターの最適値が、回帰近似アルゴリズムを前記計測データーに適用することにより測定され、そしてここで当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグランド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値
以下の式：
[式中、
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である。]
に従った中間増加曲線見積もり値を含む。
光源、
シグナル検出ユニット、
シグナルの計測データーへの変換ユニット
計測データー記憶装置
計測データーの増加曲線への変換ユニット、及び
増加曲線解釈ユニット
を含み、ここで当該計測データーの増加曲線への変換ユニットが、数学的アルゴリズムを用いて増加曲線を計測データーに非線形回帰近似するための全自動化アルゴリズムを搭載されたコンピューターを含む、前記分析装置である。ここで、当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、ここで前記パラメーターの最適値が、回帰近似アルゴリズムを前記計測データーに適用することにより測定され、そしてここで当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグランド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値
以下の式：
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である。]
に従った中間増加曲線見積もり値を含む。
本発明の別の対象は、計測データーから検体の存在を決定するためのコンピューター・プログラムであって、
数学的アルゴリズムを介して計測データーから増加曲線を作成する
を含むプログラムであり、ここで当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、ここで前記パラメーターの最適値が、回帰近似アルゴリズムを前記計測データーに適用することにより測定され、当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグランド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値
以下の式：
[式中、
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である。]
に従った中間増加曲線見積もり値を含む。
数学的アルゴリズムを介して計測データーから増加曲線を作成する
を含むプログラムであり、ここで当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、ここで前記パラメーターの最適値が、回帰近似アルゴリズムを前記計測データーに適用することにより測定され、当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグランド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値
以下の式：
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である。]
に従った中間増加曲線見積もり値を含む。
本発明は、任意の検体の測定に有用である一方、以下の多くの場合、本発明は、核酸の測定について示される。サンプル中の核酸の存在を決定する方法は、一般的に知られている。これらは、通常核酸プローブ、例えばオリゴヌクレオチド、の披測定核酸へのハイブリダイゼーションの発生、つまりハイブリッド形成を検出することに基づく。しかしながら、他の化合物と、被測定核酸又はそれから派生される化合物との相互作用の検出を用いる方法が存在する。例えば、インターカレット型色素の二本鎖核酸中へのインターカレットの発生を検出する方法が存在する。本発明は、ある期間に渡り反応コースを追跡することにより、例えば当該追跡から得られたデーターを回収し、そして得られたデーターを解釈することによって、検体を測定する方法を提供する。それゆえ、本発明は、検出可能な変化がサンプル中に存在する検体の有無及び／又は量の指標である反応の追跡に特に有用である。これらの測定は、いわゆる速度論的定量と呼ばれる。
本発明の定義におけるサンプルは、検体、例えば核酸及び／又はそれから派生する任意の核酸、例えば増幅反応の任意の産物を含有する液体であって、その中に核酸が存在するかを測定される液体である。元々のサンプルは、元の濃度又は量で検体を含んでいても含まなくてもよい。本発明は、検体が存在しているかを決定できる。本発明は、元々のサンプルが当該検体をどれだけ量又は濃度で含むかを測定することを支持し、そして改善することができる。計測されたデーターを前もって処理することは、統計的不正確性がない連続する増加曲線をもたらす。そこから派生された定量計測(例えば、ＣT)は、現在の方法に比較して改善された信頼性及び正確性を有する。
サンプルは、成分を取り除くか又は加えることにより元のサンプルから得られる液体であってもよい。例えば、核酸が単離又は精製され、その後液体に溶解させて測定を行う場合、サンプル中の核酸の測定が改善されるということが広く認められる。かかる核酸精製は、一般的に当業者に知られている。サンプル中に元々存在する核酸の量を、当該元のサンプルから得られるサンプル中に存在する核酸の量と相関させることがよく知られている。さらに、そこから得られたサンプル中に存在する核酸の量又は濃度から、当該元々のサンプル体積中の核酸濃度を導きだすことは広く認められている。
元々のサンプルは、任意の起源から得られてもよい。ヘルスケアの場合、一般的なサンプルは、体、好ましくは人体から取られたサンプルであり、例えば血液又は尿、又はそれらから得られたサンプル、例えば血清又は血漿である。食品分析では、サンプルは、ジュースなどの直接液体であるものであってもよいが、固体サンプルから得られた液体、例えばフルーツ、チーズ、又は肉から得られた液体であってもよい。
上に記載されるように、多くのサンプル、特に核酸測定分野におけるサンプルは、当該分析を妨げるサンプル中の構成要素から検体を単離することを必要とする。係る単離は、当業者に知られている。
本発明に記載された方法は、当該サンプルに、反応が生じるために必要とされる反応物質及び全ての化合物を加え、そうして反応混合液を作ることを含む。当該反応混合液は、検出の対象である。当該反応混合液は、当該方法の検出パートの間に準備されるが、好ましくは検出開始前に行われる。
本発明は、反応混合液からシグナルを検出することを含む。当該シグナルは、あるならば反応混合液中で生じている反応に関連するはずである。その結果、本発明に記載される方法において、検出されうるシグナルが生じる間、全ての反応が本発明に記載される方法においてモニターされうる。当該シグナルは、電気化学的に又は電磁的に検出できる任意のシグナルでありうる。好ましくは、当該シグナルは、電磁的シグナルであり、特に好ましくは、人の目に可視であろうとなかろうと特定の特性を有する電磁波、例えば光である。かかるシグナルを検出するための装置又は機器は、一般的に当業者に知られている。
核酸を測定するための好ましい方法は、被検核酸配列の増幅を含む。核酸増幅のための方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ、EP 0 201 184及びEP 200 362に開示される)である。当該方法は、例えば、二本鎖核酸の融解温度以上に加熱することにより反応混合液中の二本鎖核酸を可逆的変性条件にかけ、調製された一本鎖核酸の各々に対するプライマーをアニーリングさせ、そして新たに形成される配列用のテンプレートとして一本鎖核酸配列を使用して当該プライマーの末端にモノヌクレオチドを付加することによりプライマーを伸張させるステップを含む。本反応サイクルは、前のサイクルの伸張産物を、次サイクルのプライマー伸張のテンプレートとして使用して、その検出を可能にするために必要とされるだけ多くの伸張産物を調製するために、所望されるだけ繰り返される。１０〜１００回、より好ましくは２０〜６０回の反応サイクルを繰り返すことが十分であると証明された。検出可能な核酸の創作のために必要とされるサイクルの量は、測定される核酸の量に依存しうる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)又はＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)への感染の場合など、サンプル中にかなり少ない量で通常存在する検体核酸について分析を行うことは、高濃度で通常存在する検定について行うより多くのサイクルを要すると予期されよう。これらの考察は、当業者に知られている。
好ましくは、反応混合液中での核酸の増幅は、モニターされる反応である。この場合、核酸量の増加、特に検体核酸の存在及び/又は量を示す増加は、当該反応の過程の間検出されるシグナルと関連する。ＰＣＲに基づくこれらの方法は、通常、動的ＰＣＲと呼ばれる。好ましい反応は、EP 0 512 334、EP 0 543 942、及びWO 97/46714に開示されている。
当該シグナルは、更なる作用、つまり、当該反応により放たれるエネルギーによって反応混合液の温度上昇をもたらすことなく、反応コースの間作成されるシグナルでありうる。好ましい様式では、当該サンプルは、例えば、エネルギーを反応混合液に与えることにより、外側から影響を及ぼされる。当該エネルギーは、通常、反応混合液、例えば混合液中に含まれる標識からシグナルを発生させる形態で提供され、当該シグナルは、反応混合液中に生じる反応過程と相関する。一の好ましい実施態様では、当該エネルギーは、光照射を反応混合液に適用することにより提供される。光は、反応の進行に関連して反応混合液から、シグナルを誘起する性質を有すべきである。
好ましい様式では、当該シグナルは、反応混合液から放たれる光である。反応混合液に光照射する場合、当該光は、照射に使用される光と同じ特性を有することもある。次に、検出は吸収検出である。好ましい様式では、反応混合液から放出される光は、照射光とは異なっている。この場合、放射光は、好ましくは蛍光プロセスにより産生される。当該蛍光は、反応コースの指標として検出されよう。
当該シグナルは、既知の間隔で検出される。間隔は、次の検出との間の間隔であり、好ましくは二重に計数することはない。これらの間隔は、反応過程又は当該サンプル中で行われた反応コース又は反応数を適切にモニターするように選ばれる。その結果、シグナルは、好ましくは反応コースの間に検出される。検出が反応の開始と共に開始されてもよい一方、このことは必要とされない。検出は、反応が完了した際に停止されうるが、反応完了前に停止されてもよいし、又は反応完了後いくらかの時間の間続けてもよい。当業者は、シグナルの有意な変化がない場合、検出を停止できるということを知っている。
一般的に、シグナルが検出される間隔は、測定の所望される正確性に依存するであろう。一般的に、間隔が短くなれば、正確性が高くなるであろう。動的ＰＣＲでは、好ましくはシグナルの検出に使用される各間隔の長さは、反応の一サイクルの時間と一致する。反応サイクルの長さが同一であるので、間隔は同一になるであろう。各検出が、かなり短い時間(例えば、上記間隔よりかなり短い、例えば上記間隔の１％未満ほど)のうちに一連の計測により構成されうるということが認められよう。好ましくは、ＰＣＲにおいて、各サイクルのプラトー期においてシグナルは１回以上、好ましくは２〜１０回、検出される。あるサイクルにおけるプラトー期は、反応混合液の温度が、実質的に時間にわたり変化されることがない期間である。通常、この期間は各サイクルのアニーリング期である。当該期間は、機器の間違いを除くために使用されうる。ＰＣＲでは、１つの間隔の長さは、好ましくは０.１秒〜１時間であり、より好ましくは１秒〜１０分であり、最も好ましくは５秒〜１分である。
他の方法、例えばＮＡＳＢＡ又はＳＤＡでは、サイクルは、互いに明確なプロセス・ステップにより分離されていないこともある。その結果、シグナルを検出する間隔は、より慎重に選ばれうる。例えば、係る反応の間の間隔は、０.１秒〜２分であり、より好ましくは１秒〜１分であり、そして最も好ましくは２秒〜２０秒であってもよい。
当該シグナルは、更に誘導することなく反応の結果として反応中に作成されうる。好ましくは、当該シグナルは、エネルギー、例えば電気化学的又は電磁的エネルギーを反応混合液に提供することにより誘導される。好ましくは、本発明に記載される方法は、電磁波、最も好ましくは光で反応混合液を照射することを含む。好ましくは光が選ばれ、その結果、光はモニターされている反応の進行に従属する反応混合液中の成分と相互作用する。好ましくは、任意の反応成分又は反応成分と関連する成分は、反応混合液に照射される光を吸収するように設計される。その結果、好ましい方法は、特定の特性を有する光でサンプルを照射し、そしてサンプルから放射される光を検出することに基づく。
当該サンプルに与えられる光の特性は、サンプルの特定のフォーマット及び成分に左右される。当業者に周知のアッセイ・フォーマットは、光吸収標識、例えば被測定核酸にハイブリダイズするように設計されたプローブに取り付けられた標識、又は光吸収化合物を利用する。これらのフォーマットは、検出可能な性質、例えば時間にわたりサンプル組成の変化により引き起こされる性質、好ましくは光の吸収又は放出、の変化を含む。当該反応により引き起こされる性質の変化は、反応時間の間サンプルから受け取られるシグナルを検出することにより測定される。ハイブリダイゼーションに基づいたフォーマットでは、その存在の有無を決定される核酸又はそれに由来する核酸とハイブリダイズするプローブに取り付けられた１以上の標識に関連するシグナルが検出される。
本発明の方法で使用されうる好ましい反応は、EP 0 512 334及びEP 0 543 942に開示され、当該開示は、その反応を実行するための条件に関して、本明細書中に援用される。
各シグナルは、次に計測データーに変換される。好ましくは当該データーは、記憶装置中に電気的に記録されうるデジタルの数字である。適切な記憶装置は、コンピューター・ビジネスにおいて、例えばパーソナル・コンピューターの記憶装置として周知である。変換は、当該技術分野に周知の方法、例えばアナログ/デジタル・コンバーターに従って行われうる。計測データーは、当該データーを用いた計算の対象とするべく、当該記憶装置から読み込まれうる。このプロセスの間、当該データーは、更なる操作、例えば暗信号補正及びマルチ・チャネル変換にかけられることもある。この結果を計測データーと呼ぶ。
次のステップでは、計測データーを連続増加曲線へと変換する。本発明の中核的要素は、当該変換が５〜１１個パラメーターを用いた数学的非線形増加曲線モデル式、及び増加曲線の計測データーへの非線形回帰近似のアルゴリズムを用いることにより行われるということである。非線形式は、パラメーターの直線関係に基づかない式である。非線形回帰は、D.M. Bates, D. G. Watts: Nonlinear Regression Analysis and its Applications, Wiley(1988)の一般用語に記載されている。
増加曲線モデルは、時間変化からのシグナル関数の連続依存性を記載する数学式である。シグナル値は、検出シグナルの計測値として定義される。時間変化は、シグナルが計測される際の整数のサイクル数及びその連続伸張として定義される。好ましくは、当該モデルは、７〜１０個、そして最も好ましくは９個のパラメーターを含み、シグナル値及び時間変化を含む。この数のパラメーターが真の増加曲線をほぼ正確に近似することが分かったが、これらのパラメーターがオーバー・パラメーターすることはない(パラメーター間で高度に相関することはない)。
より好ましくは、計測データー(シグナル)、時間(サイクル数)、ベースライン切片、相対移動度(relative drift)、増加、傾き１、変曲点１、傾き２、変曲点２、及び他のパラメーターであって、曲線特徴を記載するものからなる群から選ばれる。最も好ましくは、パラメーターは、計測データー(シグナル)、時間(サイクル数)、ベースライン切片、相対移動度、増加、傾き１、変曲点１、傾き２、及び変曲点２である。詳細及び好ましい定義が、表１から選ばれうる。
シグナル値(計測からの入力値)及び時間変数が、計測データーから利用できる一方、他のパラメーターは、非線形回帰アルゴリズムを適用することにより測定される。パラメーターｐ1は、基本的に任意のステップ(ｐ8を参照のこと)を行った後の、増加曲線とｙ軸との切片を表す。更なる項ｐ3/(１+ｅｘｐ(ｐ4ｐ5))/(１+ｅｘｐ(ｐ6ｐ7))は、本定義において無視できるものである。パラメーターｐ2は、サイクルあたりのネガティブベースラインの相対移動度を表す。パラメーターｐ3は、ベースラインに渡った、数値の最大増化の見積もり値を表す。パラメーターｐ4は、初期の指数期におけるおよそのシグモイド関数の傾きを表す。ｅｘｐ(ｐ4)は、ＰＣＲについてｐ4が、典型的にｌｎ(２)より小さいことを意味する期間において、増幅効率の見積もり値である。それに関連するパラメーターｐ5は、部分的なシグモイド関数の変曲点を表す。パラメーターｐ6は、飽和期におけるおよそのシグモイド関数の傾きを表す。それに関連するパラメーターｐ7は、部分的なシグモイド関数の変曲点を表す。パラメーターｐ7は、定義としてｐ5及びｐ6より大きく、そしてｐ4より小さい。任意のパラメーターｐ8は、計測条件の永続的変化、通常は温度変化のため予め決められた点で生じるシグナルステップサイズの見積もり値である。
最も好ましくは、アルゴリズムにおける増加曲線モデルは、以下の式Ｉ：
を有する。
パラメーターの定義は、表１に見ることができる。
１の点での計測条件を変化させる場合、当該モデルは、上記式Ｉに比較してさらなる項を含む以下の式ＩＩ：
で表される数学的表現を有する。
式ＩＩにおいて、加えられた変数は、以下に定義される：
ｓｉｇｎ： 符号関数 ｓｉｇｎ(ｘ)：＝ｘ/√(ｘ2)、ｘ＜＞０；ｓｉｇｎ(０)：＝０
ｓ： 予め決められたサイクル数(計測条件、例えば温度、を変化させたサイクル数)。
ｓｉｇｎ： 符号関数 ｓｉｇｎ(ｘ)：＝ｘ/√(ｘ2)、ｘ＜＞０；ｓｉｇｎ(０)：＝０
ｓ： 予め決められたサイクル数(計測条件、例えば温度、を変化させたサイクル数)。
上記式が、同じ結果のｆ(ｘ)を導く異なる形態で書かれることが当業者に明らかである。これらの式は、当該モデルと同程度によく適しており、そして本発明の定義によりカバーされると考えられる。書き直された式は、いわゆる数学的同等式である。統計的に理に適っている方法は、ｙ分散安定性を増加させるためにｙ計測データーを変換することである。別の変換は、いわゆる非線形回帰アルゴリズムにおいていわゆる曲率効果を低減しうる。提示された式は、全範囲に渡る一定の計測データー分散に適している。
モデルパラメーターの翻訳は、ベースライン、指数期、及びプラトー(飽和)期という用語の助けを借りて記載されうる(図２を参照のこと)。ベースライン開始期ｆBは、線形式：
で記載される。
飽和、つまりプラトー期ｆSは、シグモイド関数：
で記載され、そして指数期は、指数関数：
で記載される。
ＰＣＲでは、ｐ4とｐ6の合計が約ｌｎ(２)に等しくなり、これは各サイクル後のシグナル倍化を指す。
好ましい実施態様では、本発明に記載される方法は、回帰アルゴリズムを開始する前に計測データーから全てのパラメーターについて開始値のセットを自動的に計算することにより、非線形回帰アルゴリズムについて適切な開始増加曲線を測定するステップを含む。
開始パラメーターについての値の好ましい開始値のセットを表２に与える。当該パラメーターの各々が、各々予め決められるか、又は実際の計測データーから計算されうる。
パラメーターｐ1についての開始値の見積もり値は、全ての計測データーの中の最小値である。ｐ2については、０を使用する。パラメーターｐ3についての開始値の見積もり値は、全ての計測されたデーターの最大値から、全ての計測されたデーターの最小値を引いた値である。パラメーターｐ4については、開始値ｌｎ(１.８)＝０.５９を使用する。ｐ5の開始見積もり値については、当該データー全計測データー範囲の２５％に増加した際のサイクル数を使用する。パラメーターｐ6では、開始値ｌｎ(１.２)＝０.１８を使用する。ｐ7の開始見積もり値について、データーが計測データー範囲の中間に増加した際のサイクル数が使用される。
開始パラメーター値の選択は、必要とされる反復回数を決定し、そうして計算期間を決定する。本発明に従ったパラメーターの好ましい選択、並びにそれらの値は、驚くべきことにその計算労力をかなり低減することを発見した。
次に、いかなる時間においても、シグナルを検出するために使用される時間の間でさえ、反応コースを最も良く反映するパラメーターを有する増加曲線を得る目的で、得られた開始増加曲線を最良近似に反復して適用する。増加曲線の反復適用を開始するために、開始曲線において使用されるパラメーターを変更する。これは、既知の非線形回帰アルゴリズムにより行われうる。これらの中で、式は、偏差の最小和を測定する非線形回帰法である。好ましくは、これはｙ方向における偏差の二乗和を最小にすることにより行われる。好ましくは、これは、Levenberg-Marquardt又はNeler-Mead単純アルゴリズムにより行われる。Levenberg-Marquardtアルゴリズムは、パラメーターにおける二次導関数について単純化された近似を用いて、ステップバイステップ増加プロセス(step-by-step increment process)を使用する。さらに、混合型の最適化方法が、好ましい(早い)そのサブ-方法のうちの一つを自動的に適用する。Levenberg-Marquardtアルゴリズムは、当業者に一般的に知られている。本発明の好ましい実施態様では、Levenberg-Marquardtアルゴリズムは、本発明に従った増加曲線モデルと組み合わせて使用される。アルゴリズムについての判断基準を止めるとき、５の反復ステップの後に止めることが適切であることが分かっており、ここで各ステップが、二乗偏差関数の和の予め決められた相対減少未満に導く。この相対改善限界について、１×１０-2/サイクル数は、信頼できる十分に自動化された計算に適切であることが分かった。１００回以内の繰り返しで達成されない場合、当該アルゴリズムは止められる。次の繰り返しを行うためにパラメーター限界範囲(例えばｐ3＞０)又は最適化項(二乗偏差の和)にペナルティ関数を加えることが、数値のオーバーフローを避けるために適切である。
繰り返しの目的は、増加曲線の計測データーへの最適適用を発見することである。その方法の間、パラメーターのセットが決定される。当該セットの最適化されたパラメーターについての値が、以下において最適化パラメーター値と呼ばれる。最適化パラメーター値を含む増加曲線は、最適化増加曲線と呼ばれる。好ましくは、増加曲線は、広範囲の増加曲線である。広範囲の増加曲線は、ｘ値の全範囲に渡って定義される曲線である。パラメーターの種類(ｐ1〜ｐ8)は、完全に任意である。他の記号、例えばａ〜ｈが選ばれてもよい。
ほぼ直線である曲線の場合、二乗偏差の和の局所最適への収束をもたらしうるパラメーターの重複決定(over determination)に関して問題が存在しうる。この問題に打ち勝つために、一の方法は、単純化されたモデルを使用し(例えば、ｐ6＝ｐ7＝０又はさらにｐ3＝０.２)、そして回帰結果を、Schwarz Information Criterion(SIC)と比べて、適切な数のパラメーターでモデルを選別することである。
当該モデルの別の適用は、ｙ見積もり値の標準誤差を、曲線妥当性チェックのモデルに使用することである。尺度不変性について、以下の数字を計算し、そして予め決められた限界に対して比較した。
上記表現が、相対偏差の限界を超える場合、データーセットは、不正確であると特徴付けられる。
当該モデルのさらなる適用は、異常値の検出及び除去又は補正である。２個の直接的な方法が存在する。一つ目は、予め決められた限界に対するモデル回帰からの残りのデーターの逸脱をチェックし、そして限界を超える場合異常値を取り除くことである。回帰モデルにより発見された曲線により、検出された異常値を置き換えることが可能である。第二の方法は、モデル回帰からの全曲線の相対総偏差(relative total deviation)を使用する。判断基準：
を通過するならば、取り除かれる異常値は存在しない。失敗した場合、最も高い残留自差が取り除かれ、そして回帰が再び行われる。相対偏差限界より小さい予め決められた基準相対偏差異常値限界を有することは意味あることである。
上記式において、パラメーターｐ3は、特別な重要性を有する。増加曲線においてｐ3が０である場合、シグナルの増加は生じない。これは、言い換えると、サンプル中で検出される核酸が存在しないことを意味する。或いは、ｐ3が、正の値である場合、検出される核酸は、サンプル中に存在している。
統計的に有意な増加を測定するために、増殖パラメーターｐ3の帰無仮説についてのｔ-パラメーターの基準を、以下のｔ-検定に従って設定する：
ｔ＝ｐ3 */ｃ33に比較されるｔ0(ｐ3＝０)
ｔ0： ｔ値について予め決められた識別限界
ｔ： 帰無仮説についてのｔ値(負)
ｐ3 *： 増殖モデルパラメーターの見積もり値
ｃ33： 回帰の共分散行列の第三の対角線要素。この値は、測定された最適パラメーターの標準誤差を見積もる。当該値は、標準文献に従って誘導体行列の逆から計算されうる。
ｔ＝ｐ3 */ｃ33に比較されるｔ0(ｐ3＝０)
ｔ0： ｔ値について予め決められた識別限界
ｔ： 帰無仮説についてのｔ値(負)
ｐ3 *： 増殖モデルパラメーターの見積もり値
ｃ33： 回帰の共分散行列の第三の対角線要素。この値は、測定された最適パラメーターの標準誤差を見積もる。当該値は、標準文献に従って誘導体行列の逆から計算されうる。
ｔ値が、予め決められた値より小さい場合、ｐ3が、０とは有意に異ならないということが仮定される(帰無仮説)。それ自身正のｐ3値の存在は、検体の存在の指標として使用されてもよく、そしてｐ3値が０である測定は、特定の検体が存在しないことを指し示す。これは、定性的な測定が必要とされる場合有用である。分析装置中のデーター比較ユニットにおいて、又は当該データーの見積もりに使用されるコンピューター上で適切なメッセージが作成されてもよいし、そして当該プロセスの管理者に示されうる。或いは、データーは記憶装置に記憶され、そして他のソースからのデーターに繋がれていてもよく、至る所に移送されてもよい。
検体の存在の定性測定のための他の方法であって、その飽和期に十分達していない増加曲線に好ましい方法が、適用されうる。これは、少数の計測又は後のシグナル増殖を伴って起こりうる。当該方法は、ネガティブ曲線(直線)見積もり仮定と、全増加曲線(モデル)評価仮定の統計的比較からなる。これについて、モデル回帰及び直線回帰の両者からの二乗分散の合計が測定される。自由度についての適切な数と共に、統計的Ｆ検定が行われる。Ｆ値が、予め決められた値より小さい場合、Ｆ値は、フルモデル曲線が線形回帰から有意に異なっていないということが仮定されうる(帰無仮説)。図３は、当該方法のグラフ表示を示す。当該検定の数学的表示は、以下の式：
[式中、
Ｆ 計算されたＦ値
ＳＳＲ(Ｌ) 直線回帰の剰余の二乗和
ＳＳＲ(Ｍ) モデル回帰の剰余の二乗和
ｎ 計測データーポイントの数、及び
ｍ モデルパラメーターの数、式Ｉのモデルにおいて７である]
[式中、
ｘｉ 計測データーのサイクル数
ｙｉ 計測データー
ｙ＾ 計測されたモデル値、そして
ｐ モデルパラメーター]
に示される。
Ｆ 計算されたＦ値
ＳＳＲ(Ｌ) 直線回帰の剰余の二乗和
ＳＳＲ(Ｍ) モデル回帰の剰余の二乗和
ｎ 計測データーポイントの数、及び
ｍ モデルパラメーターの数、式Ｉのモデルにおいて７である]
ｘｉ 計測データーのサイクル数
ｙｉ 計測データー
ｙ＾ 計測されたモデル値、そして
ｐ モデルパラメーター]
に示される。
詳細に記載すると、Ｆ値が、予め設定された値(例えば、２０)より小さい場合、本増加曲線が、ネガティブ曲線とは有意に異ならないということが想定されうる。それ自身予め決められた値を超えるＦ値の存在は、検体の存在の指標として使用されてもよいし、そして予め設定された値以下のＦ値の測定が、特定の検体が存在しないことの指標として使用されてもよい。これは、定性的測定が必要とされるとき有用である。適切なメッセージは、分析装置におけるデーター比較ユニットにおいて作成されることもあり、又はデーターの評価に使用されるコンピューターに基づいて作成されてもよく、そして当該方法の管理者に示されてもよい。或いは、当該データーは、記憶装置中に記憶され、そして他のソースからのデーターと繋がっており、そして他の至る所に移送されてもよい。
回帰プロセスの改良は、パラメーターｐ4、ｐ5、ｐ6、ｐ7が０とは有意に異なっていない場合、ＰＣＲモデルを単純化することからなる。これについて、共分散行列を用いたパラメーターについての同様のｔ検定が使用されうる。次に、第二ステップにおいて、洗練されたＰＣＲモデルは、ｐ4’＝ｐ5’＝０及びｐ3’＝２*ｐ3で使用されうる。これは、ベースライン移動度及び任意のステップを伴った単純なシグモイド関数を表す。次に、上で記載されるのと類似の非線形回帰の後に、ｐ3’のｔ検定は、ポジティブ-ネガティブ識別について同様に行われうる。
本発明に記載されるモデル、好ましくは本発明の式を用いた増加曲線の非線形回帰近似を使用して、計測データーを増加曲線へと変換した結果は、最適化パラメーターにより定義される最終的な増加曲線を導く。当該増加曲線は、ｘ軸上の各値を、計測データーに比較して変更されうるＹ軸上の値に関連付けさせる。その結果、増加曲線は、検出器により誤って読み取られるか又は誤った照射を通して作成される急増した計測データーを都合よく補正する。
本発明に記載される方法の次の好ましいステップは、参照値(単数又は複数)に固有の１以上の増加曲線を比較することを含む。参照値は、本測定の目的から独立して異なりうる。典型的に、参照値は、参照計測の増加曲線のパラメーターのうちの一つ又は組合せからなる。
２つの例は、図４において視覚化される。典型的な値としてｐ２及びｐ3/ｐ1が使用される。内部対照シグナルのパラメーター値が、グラフの左下の範囲に存在する場合、試薬の使用期限を過ぎたことが想定されうる。内部コントロールシグナルのパラメーター値が、右下側に存在する場合、サンプル中の赤血球細胞含量の増加が検出されうる。
本発明は、検体の定性的測定、つまり検体が予め決められた閾値を越える量で存在するかを測定すること(陽性又は陰性)に特に有用である。この場合、検体の有無を測定するための統計的計測を使用することが好ましい。
本発明は、検体物の定量測定、つまりサンプル中の検体又はその濃度の量を測定するために有用である。この場合、元々の計測データーに代えて最適化増加曲線が使用される。つまり、計測データーの不正確性の負の効果、計測データーの異常値が最小にされる。最終結果を測定するさらなる計算ステップは、標準方法と同じでありうる。
本発明の別の対象は、以下の：
シグナル検出ユニット
シグナル計測データー変換ユニット
計測データー記憶装置
計測データーの増加曲線への変換ユニット
増加曲線のデジタルデーターへの変換ユニット、及び
増加曲線比較ユニット
を含む検体の存在の測定用の分析装置であって、当該計測データーの増加曲線変換ユニットが、５〜１１個のパラメーターにより定義される増加曲線モデルを用いて、増加曲線を計測データーに非線形的回帰近似するためのアルゴリズムを搭載されたコンピューターを含む。
シグナル検出ユニット
シグナル計測データー変換ユニット
計測データー記憶装置
計測データーの増加曲線への変換ユニット
増加曲線のデジタルデーターへの変換ユニット、及び
増加曲線比較ユニット
を含む検体の存在の測定用の分析装置であって、当該計測データーの増加曲線変換ユニットが、５〜１１個のパラメーターにより定義される増加曲線モデルを用いて、増加曲線を計測データーに非線形的回帰近似するためのアルゴリズムを搭載されたコンピューターを含む。
かかる装置は、市販のユニットから組み立てることができる。しかしながら、検体の測定の同等の又はさらに優れた結果を達成するために、高価でないユニットを使用できるということが提供される。特に、本発明の装置において使用されるシグナル検出ユニットは、正確ではないものが選ばれうる。これは、例えば少ない数のディジット(digits)を有するアナログ-デジタルコンバーター、前増幅器を欠いているもの、又は暗い光源の場合である。特に魅力的なオプションは、多検体の平衡マルチカラー検出の場合、光のクロスオーバー(クロストーク又はブリード・オーバー)の低減をもたらす狭い波長の透過フィルターである。本発明に記載されるユニットは、物理的に分離される必要はないが、１以上の組合せユニットにおいて組み合わせられてもよい。
本発明の好ましい態様では、当該装置は光源を含む。さらに、本発明のアルゴリズムは、様々な光源強度により産生される急増をよりうまく選別することができ、現在より安い光源を使うことができ、又は光源の安定化があまり必要とされない。
本発明の一の態様では、当該シグナルは蛍光シグナルである。当該光検出器は、蛍光を受容できそして検出できるように適用される。
当該装置上で実行されるコンピューター・プログラムにおいて使用される好ましいモデルは、以下の式：
又はその数学的同等式に基づく。
当該コンピューターが、当該サンプル中に存在する当該核酸の濃度を指し示す増加曲線上の値を選ぶアルゴリズムをさらに搭載される場合、当該装置は、検体の定量測定に使用されうる。
新たなアルゴリズムを用いる利点は、多岐にわたる。アッセイの不正確性のため、例えば、計測の間の不所望の出来事、例えば急増により、計測データーは不正確でありうる。新たなアルゴリズムは、かかる誤ったデーターの補正を改善する。他方、検出に使用される装置の要素は、光源により提供される光度変化により検体の存在に関連しない計測データーの変化に寄与しうる。かかる変化は、新たな増加曲線モデルにより補正されうる。さらに、低い正確性を有する装置内の構成要素を使用することが可能である。なぜなら、当該モデルは、本構成要素により作成された不正確性を補正するからである。
増加曲線を比較するための本発明の方法は、実際に測定された増加曲線の固有値を使用し、そして例えばＣT、ベースライン切片、ベースライン移動度(傾き)、最大シグナルレベル(１００％のオリゴヌクレオチド・プローブの分裂、ハイブリダイゼーション、インターカレーションなどに関する)、切断効率、増幅効率、相対及び絶対シグナル増加、閾値サイクル数、第一又は第二導関数の最大値及び他の「エルボー(elbow)」計測値における任意の誤差を統計的に見積もる。
本発明に記載されるパラメーターの物理的意味を示す代表的な増加曲線を、図１に示す。図１は、計測データーを点線で示し、連続増加曲線、ベースライン(下側の線)、及び飽和線(上側の線)を示す。ｐ1はベースライン上でｘ＝０のｙ値であり、ｐ2はベースラインの傾きであり、ｐ3は、飽和線のｘ＝０でのｙ値であり、ｐ4はｘ値がｐ5における増加曲線の傾きであり、そしてｐ6はｘ＝ｐ7での増加曲線の傾きである。
本発明のさらなる対象は、計測データーから検体の存在を測定するコンピュータープログラムであって、以下の：
- 数学的アルゴリズムを介した計測データーからの増加曲線の作成
ここで、当該数学的アルゴリズムは、非線形回帰近似により測定される５〜１１のパラメーター間により規定される増加曲線モデル式を含む。
- 数学的アルゴリズムを介した計測データーからの増加曲線の作成
ここで、当該数学的アルゴリズムは、非線形回帰近似により測定される５〜１１のパラメーター間により規定される増加曲線モデル式を含む。
当該コンピューター・プログラムの好ましい詳細は、本発明の方法及び装置について上で記載される。特に、コンピューター・プログラムは、本発明に記載されるユニットを含む装置に基づく本発明の方法のステップに仕向けるために、本発明に記載される装置に好ましくは搭載される。別の好ましい実施態様では、当該コンピューター・プログラムはまた、コンピューターが読み取り可能な媒体に記録されうる。
前述の発明は、明確さと理解のために幾つかの詳細について記載する一方、形態及び詳細における様々な変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされうるということが、本開示を読むことから明らかであろう。例えば、上記技術及び装置の全ては、様々な組合せで用いられてもよい。
Claims (7)
- サンプル中の核酸の存在を決定する方法であって、以下の：
被検出核酸を増幅し、
シグナル検出ユニットを用いて、既知の間隔で反応混合液からの蛍光シグナルを検出し、
シグナル−計測データ変換ユニットを用いて、当該蛍光シグナルを計測データーに変換し、
増加曲線を計測データーに非線形的回帰近似するための数学的アルゴリズムを搭載されたコンピューターを含む計測データ−増加曲線変換ユニットを用いて、上記蛍光計測データーから、数学的アルゴリズムを通して増加曲線を作成し、
ここで、当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、ここで当該パラメーターの最適値が、回帰近似アルゴリズムを当該計測データーに適用することにより測定され、当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
以下の式：
ｘは、計測時間又は計測回数であり、
ｐ 1 は、反応開始時の増加曲線の切片であり、
ｐ 2 は、ベースラインの相対移動度であり、
ｐ 3 は、ベースラインと飽和線との間の距離であり、
ｐ 4 は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ 5 は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ 6 は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ 7 は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である]
又はその数学的同等式に従った中間増加曲線見積もり値を含み、
１又は複数の増殖曲線特徴をレファレンス値と比較して、サンプル中の核酸の存在を検出する、
を含む、前記方法。 - 前記アルゴリズムが、以下の式：
ｘが、計測時間又は計測回数であり、
ｐ1は、反応開始時の増加曲線の切片であり、
ｐ2は、ベースラインの相対移動度であり、
ｐ3は、ベースラインと飽和線との間の距離であり、
ｐ4は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ5は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ6は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ7は、第二乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ8は、計測条件が変化した点でのシグナル・ステップサイズであり、そしてｓｉｇｎは、関数ｓｉｇｎ(ｘ)：＝Ｘ／√(ｘ2)、ｘ＜＞０；ｓｉｇｎ(０)：＝０を意味し、そしてｓは、計測条件がそこから変更される予め決められたサイクルステップ数である]
又はその数学的同等式を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記増加曲線モデルの前記パラメーターは、非線形回帰近似アルゴリズムを用いて測定され、ここで、
前記パラメーターの開始値が、当該計測データーを用いて作成され、
前記パラメーターの範囲が、チェックされ、そして
アルゴリズム自動停止基準が使用される、
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプル中に存在する核酸濃度を指し示す前記増加曲線から得た値を測定するアルゴリズムを用いることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸の存在を決定する分析装置であって、以下の：
上記核酸を潜在的に含む反応混合液から蛍光シグナルを検出するためのシグナル検出ユニット、
上記蛍光シグナルから計測データーへと変換するためのシグナル−計測データー変換ユニット、
計測データー記憶装置、
上記計測データーから増加曲線を作成するための計測データー−増加曲線変換ユニット、
増加曲線からデジタルデーターへの変換ユニット、及び
上記増加曲線の１又は複数の特徴を、レファレンス値と比較して、上記反応混合液中の核酸の存在を測定するための増加曲線比較ユニット
を含み、ここで、当該計測データーから増加曲線への変換ユニットが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含む数学的アルゴリズムを用いて増加曲線を計測データーへ非線形回帰近似するための全自動アルゴリズムを搭載したコンピューターを含み、ここで、当該パラメーターの最適値が、回帰近似アルゴリズムを前記計測データーに適用することにより測定し、そしてここで当該増加曲線モデル式が、少なくとも
以下の式：
ｘは、計測時間又は計測回数であり、
ｐ 1 は、反応開始時の増加曲線の切片であり、
ｐ 2 は、ベースラインの相対移動度であり、
ｐ 3 は、ベースラインと飽和線との間の距離であり、
ｐ 4 は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ 5 は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ 6 は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ 7 は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である]
又はその数学的同等式に従った増加曲線見積もり値を含む、前記分析装置。 - 光源をさらに含む、請求項５に記載の装置。
- 数学的アルゴリズムを搭載したコンピューターを含む核酸検出用の分析装置において使用され、計測データーから核酸の存在を決定するコンピューター・プログラムであって、以下の：
数学的アルゴリズムを通して計測データーから増加曲線を作成する
を含み、ここで、当該数学的アルゴリズムが、５〜１１個のパラメーターに依存する数学的増加曲線モデル式を含み、そしてここで、回帰近似アルゴリズムを前記計測データーに適用することにより前記パラメーターの最適値を測定し、当該増加曲線モデル式が、少なくとも以下の：
バックグラウンド曲線見積もり値
飽和曲線見積もり値、及び
以下の式：
ｘは、計測時間又は計測回数であり、
ｐ 1 は、反応開始時の増加曲線の切片であり、
ｐ 2 は、ベースラインの相対移動度であり、
ｐ 3 は、ベースラインと飽和線との間の距離であり、
ｐ 4 は、指数増加を示す第一乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、
ｐ 5 は、第一乗算シグモイド関数の変曲点であり、
ｐ 6 は、飽和増加を示す第二乗算シグモイド関数の変曲点での傾きであり、そして
ｐ 7 は、第二乗算シグモイド関数の変曲点である]
又はその数学的同等式に従った中間増加曲線見積り値を含む、前記プログラム。
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