CN107723343B - 一种基因定量分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因定量分析的方法，步骤是：（1）取初始样本，使用蛋白质分解酶处理细胞后，作相关基因预扩增；（2）以扩增的基因模板作定量PCR试验，检测相关基因起始拷贝数量，获得原始CT数据，即CT值；（3）依定量PCR仪器和试剂，设定可信赖的最大CT极限值，简称maxCT值；（4）依计算公式：eCT=maxCT‑CT，将获得的CT值转化成eCT；（5）根据获得的eCT，对单细胞或少量细胞的基因表达或基因拷贝数定量作分析比较，获得单细胞相关基因定量数据，用于细胞功能分析、定性鉴定、来源鉴定等科学和临床诊断信息。该方法简单易行、直接，使检测结果更加真实、明了，更加有利于清晰的比较，以达到更好的细胞定性和分类效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学技术领域，更具体涉及一种单细胞基因表达定量分析的方法，适用于单细胞基因表达检测、定量，作为细胞定性和细胞组织来源的分析比较。
背景技术
在分析基因表达或基因定量时，常用到定量PCR和CT值的分析比较方法。但是，传统的CT值是与基因量成反比的，即CT值越大，实际基因量却低，给分析比较结果带来了诸多的不便。一般使用定量PCR仪器和相关软件检测基因表达水平或者相关基因拷贝数时，获得的第一手资料是CT值(C代表Cycle，T代表Threshold，CT值的含义是：每个样本中的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环数)。研究结果表明，每个样本的CT值与该样本中的模板的起始拷贝数的对数存在着负线性关系，即起始的拷贝数越多，CT值越小。直接使用CT值作分析比较时，遇到一些问题，在图表表示基因定量结果时，CT值越大，表示起始时基因的拷贝数越少，那么，检测不到的基因一方面用“0”表示，但与CT含义又不吻合；有的软件用“999”表示，则极大地影响大图表的清晰度。在作基因定量分析比较时，也有必要作检测基因与持家基因的数据规范化，这时，999如此大的范围，给分析结果的清晰度，带来了许多不便，特别是单细胞分析时，更加不现实。
发明内容
针对上述传统的基因表达或定量分析方法上的不足，本发明的目的是在于提供了一种基因定量分析的方法，将传统的CT值转换成eCT值(eCT值为expression CT value，“表达CT值”的简称)，本发明简单易行、直接、明了的基因定量分析，特别是在作单细胞基因分析和少量样本的基因拷贝数分析时，使检测的结果更加真实、明了，更加有利于清晰的比较，以达到更好的细胞定性和分类效果。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
一种基因定量分析的方法，包括以下步骤：
(1)取初始样本，使用蛋白质分解酶处理细胞后，检测RNA时，直接合成cDNA，然后使用PCR方法定性预扩增基因模板；检测DNA时，则直接使用PCR方法定性预扩增基因模板；
所述的初始样本为单个细胞或少量细胞，是指该技术方法由细胞直接作基因定量分析的优势；该技术方法亦适用于使用DNA和RNA样本的基因定量，其包括RNA表达水平的比较分析和DNA拷贝数的比较分析；
所述的基因预扩增，是定性基因的扩增，或广谱性的基因扩增；
(2)以步骤(1)获得的定性扩增的基因模板作定量PCR试验，使用常规的定量PCR引物、探针和DNA聚合酶反应，检测相关基因的起始拷贝数量，获得原始的CT数据，即CT值；
(3)依定量PCR仪器和试剂，设定可信赖的最大CT极限值(简称：maxCT值),一般设定maxCT值为35-45之间，亦可依仪器和试剂的敏感度而定；
(4)依计算公式：eCT＝maxCT-CT，将步骤(2)获得的CT值利用人工或软件操作转化成eCT，eCT为负数的，全定为“0”；
所述转换CT为eCT的方法，在使用计算公式eCT＝maxCT-CT的原理下，包括不同的人为操作或不同的软件方式；
(5)根据步骤(4)获得的eCT，对单细胞或少量细胞的基因表达或基因拷贝数定量作分析比较，获得单细胞相关基因定量数据，用于细胞功能分析、细胞定性鉴定、细胞来源鉴定等科学和临床诊断信息。
所述的eCT和使用eCT进行基因表达和拷贝数的定量分析比较，可以用于单细胞水平，亦可用于多细胞或DNA或RNA样本。
所述的利用eCT进行单细胞水平的单个基因或多个基因的分析比较，可以用于细胞的功能分析、细胞的定性鉴定、细胞来源的鉴定，为科研和临床诊断提供辅助信息。通过上述五个步骤的技术措施，最关键的是第一步、第三步、第四步和第五步。第一步解决了直接从细胞扩增基因而不用转换试管和另行抽提DNA和RNA，防止了操作过程中的单细胞基因的任何丢失；第三步解决了maxCT值这一关键系数；第四步是该发明的关键部分，将传统的CT间接使用转化成可直接使用和说明问题的直接系数eCT以及eCT的获得方法；第五步是有关于该发明的直接应用价值和范围。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
现有的技术方法，不使用与单细胞基因表达或拷贝数的直接比较，该发明无论从原理、精确度到使用性能上，都是传统方法所不能比拟的。比如，利用传统的方法，获得1-999范围的CT值，范围太大，没有实际意义，同时又不利于图表比较。比较起来，1-2倍的差别就很难从图表上看出来，如果CT为“0”，那么按传统的CT概念，越小的CT值，其基因拷贝数应该越大，那么在图标上，没有表达的或无拷贝数的，就无法表达也无法解释了。所以，此发明，不管从理论上还是实际应用上，都显示了无可比拟的优越性。
附图说明
图1为一种单细胞基因表达定量分析的方法示意图。通过转换传统的定量PCR的CT为eCT，得以更加准确、清楚地比较单细胞基因的表达量和变化。
图2为正常人的白细胞单细胞水平的持家基因beta-Actin表达水平分析(使用原始CT比较分析)，原始CT值越高，其单细胞表达水平越低。
图3正常人的白细胞单细胞水平的持家基因beta-Actin表达水平分析(使用原始CT和eCT的分析比较)，表达水平高的，eCT也高，但原始CT低。
图4以传统CT制成的单细胞多种基因表达分析图，由于表达量区间大，细胞之间无法清楚看出规律，无法进行有效比较。
图5使用此发明的eCT制成的单细胞多基因表达分析图，细胞和基因之间的差异可以明了地区分。
图6使用此发明的eCT，观察到的肿瘤细胞株SKBR3的单细胞多基因表达特征。
图7使用此发明的eCT，观察到的正常人白细胞的单细胞多基因表达特征。X轴的1，2，3，4，5，6，7分别代表GAPDH，CD45，EpCAM，CK7，CK8，CK18，CK19基因。
图8使用此发明的eCT，观察到的乳腺癌病人的骨髓播散性肿瘤细胞的单细胞多基因表达特征。X轴的1，2，3，4，5，6，7分别代表GAPDH，CD45，EpCAM，CK7，CK8，CK18，CK19基因。
图9使用此发明的eCT，观察到的乳腺癌病人的循环肿瘤细胞的单细胞水平的多基因表达特征。X轴的1，2，3，4，5，6，7分别代表GAPDH，CD45，EpCAM，CK7，CK8，CK18，CK19基因。
图10肿瘤细胞株(CL-SKBR3)、血液白细胞(NL-wbc)、乳腺癌病人的骨髓播散性肿瘤细胞(PT-DTC)、乳腺癌病人的血液循环肿瘤细胞(PT-CTC)在GAPDH，CD45，EpCAM，CK7，CK8，CK18，CK19基因单细胞水平的表达比较。
具体实施方式
实施例1：
一种单细胞持家基因beta-Actin定量分析的方法，包括以下步骤：
1、取一组含一个或少量细胞的样本，用蛋白质分解酶(Proteinase K)处理细胞后，使用CellsDirect qRT-PCR试剂盒(Invitrogen,USA)合成cDNA，预扩增beta-Actin基因的相关片段18cyces，作为beta-Actin基因定量使用。
2、以步骤1预扩增获得的基因模板，使用定量PCR仪器和试剂，检测预扩增样本中beta-Actin基因的起始拷贝数量，获得原始的CT数据，即，CT值，具体如表1所示。
表1持家基因beta-Actin的单细胞水平分析
| 白细胞 | 原始CT |
| NL-wbc | 24.37 |
| NL-wbc | 23.15 |
| NL-wbc | 25.1 |
| NL-wbc | 25.21 |
| NL-wbc | 25.57 |
| NL-wbc | 25.05 |
| NL-wbc | 24.92 |
| NL-wbc | 24.93 |
| NL-wbc | 24.6 |
| NL-wbc | 24.87 |
3、依定量PCR仪器和试剂，设定可信赖的最大CT极限值(简称：maxCT值)为35。
4、依计算公式：eCT＝maxCT-CT＝35-CT，将获得的CT值人工或软件操作转化成eCT，如表2所示。
所述的软件操作具体为：
表2单细胞水平的持家基因beta-Actin的表达水平分析
| 白细胞 | 原始CT | maxCT | eCT |
| NL-wbc | 24.37 | 35 | 10.63 |
| NL-wbc | 23.15 | 35 | 11.85 |
| NL-wbc | 25.1 | 35 | 9.9 |
| NL-wbc | 25.21 | 35 | 9.79 |
| NL-wbc | 25.57 | 35 | 9.43 |
| NL-wbc | 25.05 | 35 | 9.95 |
| NL-wbc | 24.92 | 35 | 10.08 |
| NL-wbc | 24.93 | 35 | 10.07 |
| NL-wbc | 24.6 | 35 | 10.4 |
| NL-wbc | 24.87 | 35 | 10.13 |
5、根据步骤4获得的eCT，对单细胞或少量细胞的beta-Actin基因表达或基因拷贝数定量作分析比较，获得单细胞beta-Actin基因定量数据，用于细胞功能分析、细胞定性鉴定、细胞来源鉴定等科学和临床诊断信息。
图2为正常人的白细胞单细胞水平的持家基因beta-Actin表达水平分析(使用原始CT比较分析)，结果表明：原始CT值越高，其单细胞表达水平越低。
图3正常人的白细胞单细胞水平的持家基因beta-Actin表达水平分析(使用原始CT和eCT的分析比较)，结果表明：表达水平高的，eCT也高，但原始CT低，eCT比传统的CT更能直接表示基因拷贝数量的高低。
实施例2：
一种单细胞持家基因GAPDH、CD45、EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19基因的单细胞水平的定量分析的方法，包括以下步骤：
1、取一组含一个或少量细胞的样本，用蛋白质分解酶(Proteinase K)处理细胞后，使用CellsDirect qRT-PCR试剂盒(Invitrogen,USA)合成cDNA，预扩增GAPDH、CD45、EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19基因的相关片段18cyces，预扩增获得的基因模板作为后续的定量PCR使用；
2、以步骤1预扩增获得的基因模板作定量PCR试验，使用定量PCR仪器和试剂，检测同一样本中多种基因GAPDH、CD45、EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19基因的起始拷贝数量，获得原始的CT数据，即CT值，具体如表3所示。
表3 GAPDH、CD45、EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19基因的单细胞水平的原始CT值
| 细胞类型 | GAPDH | CD45 | EpCAM | CK7 | Ck8 | CK18 | CK19 |
| CL-SKBR3 | 10.94 | 999 | 15.35 | 999 | 19.82 | 22.75 | 999 |
| CL-SKBR3 | 13.34 | 999 | 17.13 | 999 | 21.42 | 25.73 | 999 |
| CL-SKBR3 | 13.83 | 999 | 18.13 | 999 | 21.67 | 999 | 999 |
| CL-SKBR3 | 12.81 | 999 | 16.74 | 999 | 21.06 | 23.99 | 999 |
| NL-wbc | 23.55 | 21.31 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 |
| NL-wbc | 22.24 | 22.55 | 999 | 25.31 | 999 | 999 | 999 |
| NL-wbc | 25.38 | 21.56 | 999 | 999 | 999 | 999 | 999 |
| NL-wbc | 23.91 | 23.31 | 999 | 25.66 | 999 | 999 | 999 |
| PT-DTC | 18.08 | 999 | 21.69 | 999 | 20.16 | 22.62 | 21.88 |
| PT-DTC | 14.36 | 999 | 18.88 | 26.04 | 22.12 | 23.62 | 19.79 |
| PT-DTC | 16.7 | 999 | 21.91 | 25.76 | 999 | 25.2 | 19.82 |
| PT-DTC | 15.45 | 999 | 19.23 | 999 | 23.87 | 999 | 19.69 |
| PT-CTC | 19.19 | 999 | 999 | 999 | 21.05 | 22.52 | 22.75 |
| PT-CTC | 21.27 | 999 | 999 | 999 | 24.59 | 999 | 24.55 |
| PT-CTC | 21.42 | 999 | 999 | 999 | 24.68 | 999 | 999 |
表3中的GAPDH、CD45、EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19分别为不同的基因，CL-SKBR3为肿瘤细胞株的单个细胞实验；NL-wbc为正常人的单个白血细胞；PT-DTC和PT-CTC分别为乳腺癌病人的播散性骨髓肿瘤细胞和血液循环肿瘤细胞。表中可以看出，CT区间达到999，非常之大。原则上，CT大的，表示基因起始拷贝数低，999表示没有检测到有基因拷贝的存在；CT小的，表示基因起始拷贝数高。
3、依定量PCR仪器和试剂，设定可信赖的最大CT极限值(简称：maxCT值)为35。
4、依计算公式：eCT＝maxCT-CT＝35-CT，将获得的CT值人工或软件操作转化成eCT，从公式中获得的eCT为负值的，统一为0，其结果表示如表4所示。
表4单细胞水平的持家基因GAPDH的表达水平(eCT)分析
表4中可以看出，eCT区间都在maxCT以下(此处为eCT为35以下，比相同样本组的CT区间达到999，要小很多倍)。eCT值大，表示基因起始拷贝数高，反之，则低，直接明了，同时因为区间小，较小变化的差异比较都能在图表上清楚看出。
5、根据步骤4获得的eCT，对单细胞或少量细胞的GAPDH基因表达或基因拷贝数定量作分析比较，获得单细胞GAPDH基因定量数据，用于细胞功能分析、细胞定性鉴定、细胞来源鉴定等科学和临床诊断信息。
表4中显示，肿瘤细胞株SKBR3表达GAPDH，EpCAM和CK等基因，但不表达CD45基因；正常人的白血细胞表达GAPDH和CD45，但不表达EpCAM，也极少表达CK等基因；乳腺癌病人的骨髓播散性肿瘤细胞表达GAPDH，EpCAM和CK等基因,但不表达CD45基因；循环肿瘤细胞表达GAPDH和CK等基因,但没有检测到不表达CD45和EpCAM基因的表达。肿瘤细胞株的单个细胞GAPDH基因表达水平比乳腺癌病人的骨髓播散性肿瘤细胞高，骨髓播散性肿瘤细胞单个细胞的GAPDH基因表达又比乳腺癌病人的血液循环肿瘤细胞高，乳腺癌病人的血液循环肿瘤细胞单个细胞的GAPDH基因表达又比正常人白血细胞的单个细胞表达水平高。这是一部分细胞的单细胞水平的多基因比较结果，意味着，本发明成功实现了单细胞多基因的检测和比较。
图4为以传统CT制成的单细胞多种基因表达分析图，由于表达量区间大，细胞之间无法清楚看出规律，无法进行有效比较。
图5为使用此发明的eCT制成的单细胞多基因表达分析图，细胞和基因之间的差异可以明了地区分。
图6为使用此发明的eCT，观察到的肿瘤细胞株SKBR3的单细胞多基因表达特征。
图7为使用此发明的eCT，观察到的正常人白细胞的单细胞多基因表达特征。
图8为使用此发明的eCT，观察到的乳腺癌病人的骨髓播散性肿瘤细胞的单细胞多基因表达特征。
图9为使用此发明的eCT，观察到的乳腺癌病人的循环肿瘤细胞的单细胞水平的多基因表达特征。
表5为单细胞水平的多基因分析的细胞定性分析比较；图10为肿瘤细胞株(CL-SKBR3)、血液白细胞(NL-wbc)、乳腺癌病人的骨髓播散性肿瘤细胞(PT-DTC)、乳腺癌病人的血液循环肿瘤细胞(PT-CTC)在GAPDH、CD45、EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19基因单细胞水平的表达比较。
从表5和图10来看，在各种细胞都表达持家基因GAPDH的同时，血液白细胞表达CD45基因，而肿瘤细胞却不表达，但肿瘤细胞表达EpCAM、CK7、CK8、CK18、CK19基因，而血液白细胞基本不表达。使用该单细胞多基因分析技术，可以为肿瘤细胞定性，也可以鉴定来源，为科研和临床提供辅助。
表5单细胞水平的多基因分析的细胞定性分析比较
| eCT | |||||||
| 细胞类型 | GAPDH | CD45 | EpCAM | CK7 | Ck8 | CK18 | CK19 |
| CL-SKBR3 | 24.06 | 0 | 19.65 | 0 | 15.18 | 12.25 | 0 |
| NL-wbc | 11.45 | 13.69 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| PT-DTC | 16.92 | 0 | 13.31 | 0 | 14.84 | 12.38 | 13.12 |
| PT-CTC | 15.81 | 0 | 0 | 0 | 13.95 | 12.48 | 12.25 |
表5显示，通过检测细胞的不同基因表达，达到定性不同细胞的目的。
Claims (2)
1.一种基因定量分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取初始样本，使用蛋白质分解酶处理细胞后，检测RNA时，直接合成cDNA，然后使用PCR方法定性预扩增基因模板；检测DNA时，则直接使用PCR方法定性预扩增基因模板；
所述的初始样本为单个细胞或少量细胞；
所述的基因预扩增，是定性基因的扩增，或是广谱性的基因扩增；
（2）以步骤（1）获得的定性扩增的基因模板作定量PCR试验，使用定量PCR引物、探针和DNA聚合酶反应，检测相关基因的起始拷贝数量，获得原始的CT数据，即CT值；
（3）依定量PCR仪器和试剂，设定可信赖的最大CT极限值，简称：maxCT值，设定maxCT值为35-45之间，或依仪器和试剂的敏感度而定；
（4）依计算公式：eCT=maxCT-CT，将步骤（2）获得的CT值转化成eCT，eCT为负数的，全定为0；
（5）根据步骤（4）获得的eCT，对单细胞或少量细胞的基因表达或基因拷贝数定量作分析比较，获得单细胞相关基因定量数据。
2.权利要求1所述的基因定量分析的方法在RNA表达水平的比较分析和DNA拷贝数的比较分析中的应用。
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| CN201711215167.XA CN107723343B (zh) | 2017-11-28 | 2017-11-28 | 一种基因定量分析的方法 |
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