CN110619927B - 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实时荧光定量PCR的数据分析方法，包括：荧光信号的采集、指数区的确定、背景区的数据分析，阈值的确定，扩增曲线的获得。本发明的数据分析方法，采用线性回归拟合的算法，避免PCR的扩增效率不同产生的误差，简化实时PCR分析所涉及的计算，使荧光信号处理更准确、简便、快速，易于集成于便携式核酸分析系统。在必须进行小样本量核酸可靠检测时，优化的实时荧光定量PCR数据分析方法具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及实时荧光定量PCR的数据分析方法。
背景技术
实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR），是以聚合酶链反应（PCR）为基础的分子生物学实验技术，实时监控PCR过程中目标DNA分子的扩增，具有准确、灵敏度高、特异性强、简便快速及易于自动化等优点，被广泛应用于临床及生命科学等领域的核酸分子检测，如基因表达研究、传染病和癌症基因异常的检测、食品安全相关的微生物检测、植物病原体的检测、临床病毒感染的定量和基因分型等。
Real-Time PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现实时监测整个PCR过程，利用合适的数据分析方法，对起始模板进行定量分析。用于Real-Time PCR的荧光基团包括荧光染料和荧光探针。荧光染料与所有双链DNA PCR产物结合后发出荧光，每个循环的荧光强度被测量，从而检测PCR产物的量。荧光探针如TaqMan探针工作的基本原理是根据荧光共振能量传递（FRET）原理，荧光基团和淬灭剂距离很近使发射荧光被淬灭，当探针被DNA聚合酶降解时，两者分离，荧光发射出来被收集，特异性PCR产物被实时监测。
Real-Time PCR的扩增产物呈指数增长，扩增产物量的基本计算公式为：Yn=X（1+E）n（Yn为第n个循环后的PCR产物量，X为起始模板量，E为扩增效率，n为扩增循环数）。扩增曲线分为基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。
Real-Time PCR产物的定量测定可分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线推测未知样品的量。使用一系列稀释的已知浓度的标准品与样品同时进行测定，根据系列浓度标准品的阈值循环数（threshold cycle, Ct）与起始模板（DNA或RNA）量之间的线性比例关系，绘制标准曲线，根据待测样品的Ct值计算出其起始拷贝数。相对定量是使用内标，将待测样品与内标进行相同基因的表达比较，从而获得待测样品表达量的变化。
广泛使用的Real-Time PCR数据处理模式是假定样本与标准的扩增效率相同，并且在整个指数扩增期保持恒定，但在许多情况下并非如此。随着定量PCR仪的发展和改进，需要对PCR整个反应的每一个循环具体的荧光信号进行计算分析，使结果更加准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是实时荧光定量PCR仪改进后，样本与标准品扩增效率不同产生结果误差，提供一种优化的定量PCR数据分析方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种实时荧光定量PCR的数据分析方法，其特征在于，包括：荧光信号的采集、指数区的确定、背景区的数据分析，阈值的确定，扩增曲线的获得。
优选地，所述荧光信号的采集在延伸步骤完成，每个循环取最大值作为原始数据。
优选地，指数区的确定采用滑动窗口线性最小二乘法回归拟合算法分析。
优选地，背景区的数据分析采用线性回归拟合。
优选地，阈值的确定依赖于指数区的荧光信号值。
优选地，扩增曲线包括线性曲线和对数曲线。
优选地，数据分析方法用于DNA和RNA的扩增分析。
优选地，数据分析方法单独使用，或集成于实时荧光定量PCR仪器中使用。
本发明的有益效果在于：
本发明的实时荧光定量PCR的数据分析方法，可直接估计和比较样本和标准品的初始量，不需要假设PCR的扩增效率相等，简化了实时PCR分析所涉及的计算，使PCR反应每个循环的荧光信号采集处理更准确、简便、快速。在神经科学和医学诊断领域，必须进行小样本量可靠检测时，优化的数据分析方法具有重要的意义。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR的扩增曲线。
具体实施方式
实施例 DNA样本荧光信号的实时定量PCR数据分析
1.荧光信号采集
对于四个梯度的模板扩增反应，每个反应取每个循环（cycle）的延伸时荧光信号最大值作为原始数据，共40个值。
2. 指数区的数据分析
1）将所有cycle荧光值取log值;
2）以滑动窗口（sliding window）为“4”开始，从第一个cycle开始至37个cycle进行线性最小二乘法回归拟合（linear least-squares regression fit），计算拟合所有线段的斜率（slope）和拟合优度（r2），选择最大斜率（greatest slope）和拟合优度r2大于0.99的线段。以滑动窗口为“5”，“6”，“7”，“8”，“9”，“10”，“11”，“12”等，循环进行回归拟合，直至找到含有最大滑动窗口，拟合优度r2大于0.99和最大斜率（greatest slope）的线段；
3) 选取拟合优度r2大于0.99，最大斜率（greatest slope），含有最长cycles（记为Ca-Cb cycle）数的线段作为指数区（Exponential Region）。
3. 背景区的数据分析
1）背景区（Noise Region）的区域确定为1cycle到Ca-1 cycle；
2）将背景区的原始数据进行线性回归拟合，得到循环数x与背景（baseline）荧光值y的最佳拟合直线y=mx+b，得到背景值与cycle数的等式关系；
3）将等式带入每个cycle，计算baseline的数值，原始数据减去baseline值，得到
每个cycle的数据校正荧光值
Rn。
4. 扩增曲线及Ct的计算结果
1）将校正荧光值
Rn与对应的cycle数做散点图，得到扩增曲线线性图Linear
Plot；
2）将每个cycle的调整荧光值取对数log，荧光log值与对应的cycle数做散点图，得到扩增曲线图Log Plot；
3) 将Log 值以滑动窗口（sliding window）为“4”开始，从第一个cycle开始至37个cycle进行线性最小二乘法回归拟合，计算拟合所有线段的斜率（slope）a和拟合优度（r2），以滑动窗口为“5”，“6”，“7”，“8”，“9”，“10”，“11”，“12”等，循环进行回归拟合，选择最大斜率（greatest slope）和最佳拟合优度（r2）的线段，荧光值y与cycle数x的最佳拟合直线等式为y=ax+c，计算扩增效率E=10a-1；
5）每一个稀释梯度的模板做一个反应，找出每个反应计算扩增效率的最佳拟合线段所包含的cycle数，得到每个反应相应cycle数的荧光Log值，把不同模板量的多个反应指数区所有cycle的荧光Log值取平均数作为阈值（Threshold）值；
6）根据Threshold值及每个反应拟合线段的等式计算Ct值。Ct值如表1。
表1
| 样本量 | 10<sup>7</sup> | 10<sup>6</sup> | 10<sup>5</sup> | 10<sup>4</sup> |
| Ct | 18.77 | 22.32 | 26.28 | 29.69 |
以上所述的实施例只是本发明的优选实施方式，用于举例说明，对于本领域的技术人员在本发明的基础上所做的若干变形和改进，均属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种实时荧光定量PCR的数据分析方法，其特征在于，包括：荧光信号的采集、指数区的确定、背景区的数据分析，阈值的确定，扩增曲线的获得；
所述荧光信号的采集在延伸步骤完成，每个循环取最大值作为原始数据；
所述指数区的确定采用滑动窗口线性最小二乘法回归拟合算法分析，分析对象为所有原始数据取log值，找到含有最大滑动窗口，计算拟合所有线段的斜率a，拟合优度r2大于0.99和最大斜率的线段，含有最长循环数的线段作为指数区，最长循环数记为Ca-Cb循环；
所述背景区的数据分析采用线性回归拟合，背景区选择第一个循环至Ca-Cb循环，将背景区的原始数据进行线性回归拟合，得到循环数x与背景荧光值y的最佳拟合直线y＝mx+b，得到背景值与循环数的等式关系；将等式带入每个循环，计算baseline的数值，原始数据减去baseline值，得到每个循环的数据校正荧光值ΔRn；
所述阈值的确定依赖于指数区的荧光信号值；
所述扩增曲线包括线性曲线和对数曲线；
所述的扩增曲线的获得方法为：
1)将校正荧光值ΔRn与对应的循环数做散点图，得到扩增曲线线性图，即线型曲线；
2)将每个循环的调整荧光值取对数log，荧光log值与对应的循环数做散点图，得到扩增曲线图，即对数曲线；
3)将Log值以滑动窗口进行线性最小二乘法回归拟合，计算拟合所有线段的斜率a，选择最大斜率和最佳拟合优度的线段，荧光值y与循环数x的最佳拟合直线等式为y＝ax+c，计算扩增效率E＝10a-1；
4)不同模板量的多个反应指数区所有循环的荧光Log值取平均数作为阈值值；
5)根据阈值及每个反应拟合线段的等式计算Ct值。
2.根据权利要求1所述的数据分析方法，其特征在于，所述数据分析方法用于DNA和RNA的扩增分析。
3.根据权利要求1所述的数据分析方法，其特征在于，所述数据分析方法单独使用，或集成于实时荧光定量PCR仪器中使用。
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