CN109212222A - 糖尿病孕妇维生素d代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法，它涉及孕妇检测技术领域；它的检测方法为：1)研究对象的选择；2)研究资料的收集：3)样本的收集：4)血液糖代谢相关指标的测定；5)、血液VD代谢相关指标的测定；6)、胎盘形态学观察；7)、脂肪细胞因子检测；8)、胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；9)、胎盘VD代谢通路相关指标检测；10)、质量控制；11) 统计分析；本发明的胎盘可通过多种途径促进GDM的发生发展，还可表达VD系统代谢所必须的分子，使得妊娠期VD代谢发生变化，有别于非妊娠状态；进一步明确VD与GDM发生发展关系及VD对GDM防治作用提供新证据，对减少妊娠不良结局和提高人口健康素质。

Description

糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法
技术领域
本发明涉及一种妊娠期糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法，属于孕妇检测技术领域。
背景技术
妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）指妇女在妊娠期间（排除妊娠前）发生的不同程度的糖代谢异常，是最常见的妊娠并发症之一。近年来，由于妇女生育时间的推迟、生活方式及膳食结构的改变、营养知识的匮乏等因素，GDM的发病率在全球各地均呈明显上升趋势。国际糖尿病联盟估计，约16.8 %的孕妇在妊娠期处于高血糖状态，其中84%为GDM。我国GDM的流行形势更为严峻。最近一次中国大陆地区来自13家医院17186名孕妇的筛查结果显示，采用国际妊娠期糖尿病专家组诊断标准，2010年1月至2012年2月期间，中国GDM发病率占全部妊娠的17.5%。虽然GDM引起的血糖升高程度不及糖尿病合并妊娠，但对孕妇及胎儿均产生严重危害。国内外大量研究证实，GDM除了可造成孕妇在怀孕和分娩期间出现其他并发症以及胎儿发生畸形、巨大儿、高胆红素血症、呼吸窘迫征等的风险增加外；还可引起母亲产后及子代生后远期2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）和代谢综合征的发病风险增加。所以，积极防治GDM，对减少妊娠不良结局和提高人口健康素质具有深远意义。
正常妊娠是一种生理性胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）状态，有利于母亲脂肪沉积和胎儿生长的代谢环境。主要表现为胎盘产生的雌激素、孕酮、催乳素和胎盘生长激素等多种拮抗胰岛素的物质明显增加；胎盘分泌胰岛素酶，加速胰岛素的分解；胎盘产生瘦素、脂连素、抵抗素等脂肪细胞因子增强IR；妊娠引起外周靶组织（骨骼肌、肝脏和脂肪组织）胰岛素受体后信号通路发生改变等。为了将血糖水平维持在正常范围内，在雌、孕激素的作用下，孕妇的胰岛会出现结构和功能上的变化，胰岛β细胞明显肥大和增生，胰岛素的分泌代偿约增加3倍。如果孕妇存在严重的IR和（或）胰岛β细胞功能受损，将导致糖代谢异常，出现GDM。鉴于妊娠期生理状态和机体代谢的复杂改变，IR和胰岛β细胞功能受损的形成又是一个多因素相互联系的过程，目前为止学术界对GDM的具体发生机制并未明确。通常认为其是在有异常遗传易感性的基础上，受环境因素如年龄、肥胖、饮食和活动等诱发。因此，排除遗传易感性、年龄等这些不可改变的因素，进一步深入研究可改变的环境因素，并由此寻找安全而又有效的干预措施，已成为阻止GDM发生和恶化的关键。
近年来，维生素D（vitamin D, VD）因其广泛的骨外生物学效应而再次成为学术界研究的热点。VD属于脂溶性维生素，与健康关系密切的主要是维生素D2（vitamin D2, VD2）和维生素D3（vitamin D3, VD3）。自然界中含VD的食物较少，人体所需的VD主要通过紫外线（波长290-315 nm）照射皮肤合成。人的皮下脂肪组织含有生理性的VD3原，经过光化学转换变成VD3。在正常生理状态下，由摄入或皮肤合成的VD进入血循环后，由维生素D结合蛋白（vitamin D binding protein, DBP）携带到肝脏，在肝脏经25-羟化酶（基因型CYP2r1）催化下形成25(OH)D。25(OH)D是VD在体内的主要循环形式，在生理条件下不具有生理活性，且具有稳定性高、半衰期长的特点，因此其在血中的水平代表了VD的营养状况。25(OH)D进入血液后又被DBP转运至肾，经肾小管上皮细胞线粒体内1α-羟化酶（基因型CYP27b1）的作用生成VD的活性形式1,25(OH)2D。该活性形式最终在肝脏经24-羟化酶（基因型CYP24a1）的作用分解而失去活性。VD的活性形式主要通过维生素D受体（vitamin D receptor, VDR）发挥生物学效应。现已证明VDR不仅存在于经典的靶组织（小肠、肾脏、骨骼和甲状旁腺），还广泛分布于胰腺、肌肉、肝脏、脂肪组织、胎盘、免疫炎症细胞等组织和细胞中，再加上许多肾外组织也含1α-羟化酶，由此生成的1,25(OH)2D不再进入循环系统，而是与这些部位的受体结合后发挥一系列的非传统生理作用。研究表明，1,25(OH)2D可作用于周围胰岛素靶细胞，促进胰岛素受体基因的表达，从而增加胰岛素敏感性，减轻IR；也可激活过氧化物酶体增殖激活受体，调节骨骼肌和脂肪组织的脂肪酸代谢，参与糖异生；肾组织或胰岛β细胞合成的1,25(OH)2D可作用于胰岛β细胞的VDR，促进胰岛素基因的表达；1,25(OH)2VD还可通过调节钙离子浓度影响胰岛素的分泌及靶细胞对胰岛素的反应。因此，大多数研究者认为VD可能与糖尿病、糖尿病前期、肥胖、血脂异常等的代谢性疾病有关。然而，由于妊娠期生理状态和机体代谢的特殊性，目前关于VD与GDM的研究较少，且结果存在不一致性，有必要进一步来探究GDM孕妇VD代谢与糖代谢的相关性，为临床VD应用提供实验依据和指导方案，并为寻找GDM的防治途径提供新的证据。
妊娠期妇女因要满足胎儿生长发育的需要，VD的需求量较非妊娠期将增加4～5倍。但是我国膳食结构中缺少富含VD的食物且未普及食品VD强化，再加上城市大气污染、孕期外出活动的减少、遮蔽阳光的行为等因素，我国妊娠期妇女成为了VD缺乏的高危人群。最近有学者对2000年1月至2012年11月期间的中国大陆地区VD状况的相关研究进行了系统综述，采用国际骨质疏松症基金会推荐的诊断标准，即VD缺乏、不足和充足水平分别以血25(OH)D浓度25、50和75 nmol/L为诊断界值，结果表明VD缺乏及不足普遍存在于各年龄段的中国人群（>90 %）；其中在成年人群，VD缺乏在妊娠期妇女和GDM妇女最为严重。
由于妊娠妇女处在身体的特殊时期，体内各种激素水平以及VD和钙磷代谢都发生着变化，所以VD与GDM的相关性有着它的特殊性。经最新文献检索，目前国内外关于VD与GDM的研究局限于妊娠期低25(OH)D状态是否会引发GDM，并由此试图寻找GDM的防治途径，但研究结果呈现出不一致性。具体如下：
a）观察性研究：①一些横断面研究发现GDM患者的VD水平显著低于糖耐量正常（normalglucose tolerance, NGT）妊娠妇女；同时也有较多研究发现GDM患者的VD水平与NGT妊娠妇女相比并无统计学差异。②由于横断面研究只能提供病因线索，研究者通过前瞻性质的病例对照研究进一步进行因果分析。这些研究校正了种族、糖尿病家族史、年龄、孕龄、季节、BMI、产次、孕前VD状态等混杂因素，然而结果仍然存在不一致性。部分病例对照研究发现孕早期低血25(OH)D水平使未来患GDM的风险增加，但另外一些研究发现孕早期VD不足和VD充足的妊娠妇女相比，发生GDM的风险并无统计学差异。
b）干预性研究：目前已有研究者采用判断因果关系的金标准——孕期随机对照干预研究来进一步论证补充VD是否可以降低妊娠期妇女发生GDM的风险或对已患GDM的妊娠妇女糖代谢异常是否具有改善作用。①给平均孕龄为14周的VD缺乏妊娠期妇女口服补充VD3（400 IU/天和5000 IU/天两个剂量），结果表明两剂量组均未降低妊娠期妇女在孕26-28周发生GDM的风险。②一项针对VD缺乏GDM妇女的研究发现：按2g/m2静脉注射1,25(OH)2D3，2小时后发现其血1,25(OH)2D3水平上升，而空腹血糖和胰岛素水平都较干预前下降；但是这些GDM妇女口服活性VD3（0.25g/天）14天后其血1,25(OH)2D3和空腹血糖水平与未干预时相比并未发生改变。③而口服补充高剂量VD3的干预实验，剂量分别为50000 IU/次（共2次）和4000 IU/天（共12.5天），表明：VD缺乏GDM妇女经VD3的干预血25(OH)D、空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数均得到显著改善。
以上这些不一致性的研究结果可能与研究的样本量、GDM诊断标准、25(OH)D浓度分级和测量方法等因素有一定关系，同时也提示我们：
a）这些研究都是以25(OH)D作为评价妊娠期VD水平的唯一指标可能并不合适。在正常生理状态下，循环系统中的VD活性形式1,25(OH)2D受其自身水平的精确调控，具体表现为，低1,25(OH)2D水平可刺激甲状旁腺素（parathyroid hormone, PTH）的分泌，后者可上调肾脏1α-羟化酶（基因型CYP27b1）的表达，从而促进25(OH)D向1,25(OH)2D活化；而高1,25(OH)2D水平可激活VDR，后者可上调24-羟化酶（基因型CYP24a1）的表达，从而将1,25(OH)2D分解失去活性。妊娠期母亲的生理状况随着胎儿的需求发生了变化：母亲循环系统中1,25(OH)2D水平不再受其自身水平的精确调控，而是从妊娠早期就升高了数倍，且这一浓度一直维持到分娩结束；游离钙离子和25(OH)D的水平在整个孕期却并无显著变化；同时，伴随着母亲1,25(OH)2D水平的增高，PTH保持低浓度的状态。以上这些妊娠期VD代谢的变化给妊娠期VD检测指标的确定带来了挑战。如果VD存在代谢异常，那么即使25(OH)D处于充足状态，也可能造成VD的活性形式1,25(OH)2D的缺乏。因此，有必要进一步选用1,25(OH)2D、DBP、碱性磷酸酶、PTH、钙、磷水平等指标。
b）这些研究并未进一步探索VD代谢通路，特别是胎盘中相关通路与GDM的关系。如前所述，胎盘在GDM的发生发展过程中具有重要作用。同时，妊娠状态下，人胎盘可以表达VDR、1α-羟化酶（基因型CYP27b1）、24-羟化酶（基因型CYP24a1）等VD系统代谢和作用所必须的分子。啮齿类动物妊娠模型的研究表明：1,25(OH)2D水平在孕期的升高主要归因于肾脏和肾外组织中1α-羟化酶（基因型CYP27b1）表达量和活性的升高促进了VD由25(OH)D向1,25(OH)2D活化。另外，CYP24a1在胎盘特异性高甲基化状态也可能是导致1,25(OH)2D水平升高的原因。因此，有必要进一步以CYP24a1和CYP27b1为靶点来探讨妊娠状态下胎盘中VD代谢通路与GDM发生发展的关系。
c）妊娠妇女低血VD水平可能并不是GDM的直接致病因素，而是伴随GDM的发生发展而出现。VD是一种脂溶性维生素，脂肪对其有储留作用。正常妊娠妇女有较多的脂肪沉积作为储备的能源，使得脂肪储留的VD增多，而释放到血循环的VD减少。较多的研究表明GDM的发病率与孕前肥胖和孕期体重增长过快有一定的相关性，因此我们假设GDM状态下过度的脂肪沉积可能是造成妊娠妇女低血VD水平的原因之一。但目前为止，GDM是否会加重妊娠妇女VD缺乏，GDM状态下糖代谢异常是否会影响妊娠妇女VD代谢，这些问题尚不明确。但这对于进一步确定VD与GDM发生发展的因果关系至关重要，值得深入研究探讨。
发明内容
针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种妊娠期糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法。
本发明的糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法，它的检测方法为：
1) 研究对象的选择：
随机选取妇产科住院的正常妊娠妇女、GDM患者各100例；所有患者均接受基本情况调查和常规实验室检查，平衡所有入选者的个体状况如年龄、收入情况、民族、文化程度、家族性糖尿病史、个人史及孕产史等。选择进入研究的研究对象，在进入研究前签署知情同意书；
a) 接受受试对象的条件：妊娠达37孕龄的妇女，年龄22-40岁，汉族，经济状况相当，无吸烟及饮酒史；
b) 除外受试对象的条件：孕前有糖尿病史、多囊卵巢综合症、肝病、孕前及孕期有高血压病、类风湿病、甲状腺及内分泌类相关疾病，孕前及孕期使用皮质激素类药物的孕妇，多胎或死胎的孕妇；
c) 受试对象分组：所有孕妇于孕24至28周行75 g OGTT，空腹、餐后1 h和餐后2 h血糖分别以5.1、10.0和8.5 mmol/L为诊断界值；具体做法：孕妇试验前3天未服用利尿剂、激素等影响糖代谢的药物；实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次，测空腹血糖后，将75 g葡萄糖粉溶于250 ml水中，5 min内口服完；从服糖水第一口开始计时，分别于l h、2 h抽取肘静脉血测血糖；任何一项血糖水平异常者，即诊断为GDM；按此标准，GDM组和正常孕妇组均为100例。所有孕妇均未出现胃肠道不良反应，受试过程中未服用饮料、茶及咖啡，未做剧烈运动；
2) 研究资料的收集：
随访期间，进行孕产期母婴健康调查问卷收集信息，信息包括孕妇的实足年龄、孕妇身高、孕前体重、职业、文化程度、既往妊娠史及疾病史、末次月经时间、本次妊娠意愿、孕早期心理健康状况、孕妇家庭经济收入情况、孕期营养及生活方式、孕前半年至今环境有害物质的接触情况等。根据孕妇身高、孕前体重、孕期各个阶段的体重，计算各个阶段的BMI；并在孕中期和孕晚期两个时间段平卧位测量上肢血压；新生儿出生相关信息由专业医生填写并记录，主要信息有出生日期、性别、分娩孕周、分娩方式、新生儿并发症、出生体重、身长、头围、1’-Apgar评分、5’-Apgar评分、胎盘重量、羊水及出血量；
3) 样本的收集：
a) 孕妇血液标本的采集与处理：在整个研究中，每位孕妇需在孕中期和孕晚期两个时间段共采血2次；各受试者于实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次；一部分血液使用不加抗凝剂的10ml真空玻璃试管，新采集的血样于室温放置30 min，然后于4℃、3000转/min共离心15 min；取血清置于血清管中，保存于-80 ℃直到分析；另一部分全血样品加于含EDTA作为抗凝剂的真空采血管中，2-8 ℃下可保存7天；
b) 脐血和胎盘标本的采集与处理：胎儿分娩后，采集脐血和胎盘组织；脐血的处理同a）孕妇血液标本的采集与处理；胎盘娩出后，由专业医生采集，立即在胎盘的中央取长2cm、宽2 cm、包括胎盘母体面和胎儿面标本2块；1块标本固定于4 %多聚甲醛溶液中，用于HE和免疫组化染色。另外1块标本浸入2.5 %戊二醛（pH 7.4）中过夜固定，用于后续的电镜观察。余下胎盘中选择相同部位的组织块储存于-80 ℃冰箱；
4) 血液糖代谢相关指标的测定：
a)、快速血糖仪测定血糖水平；
b)、亲和层析法测定EDTA抗凝血浆中HbA1c水平；
c)、全自动生化分析仪测定TG、CHO、LDL和HDL水平；放射免疫法测定胰岛素和C肽水平；
d)、并用稳态模式评估法（Homoeostasis model assessment, HOMA）计算IR指数（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能（HOMA-B），即HOMA-IR =[血糖水平（mmol/l）×胰岛素水平（μIU/ml）]/22.5；HOMA-B =[20×胰岛素水平（μIU/ml）]/[血糖水平（mmol/l）-3.5]。
5) 血液VD代谢相关指标的测定：
ELISA法检测25(OH)D、1,25(OH)2D、DBP、PTH、钙水平。实验前从冰箱取出ELISA试剂盒以平衡至室温。设立标准孔以建立标准曲线。待测样品孔中每孔各加入已稀释的待测样品，将反应板置于37 ℃恒温箱120 min。然后用洗涤液将反应板充分洗涤并印干。每孔再加入第一抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min。反应板取出后充分洗涤并印干。每孔加酶标抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min。反应板取出后充分洗涤并印干。每孔加入底物液避光置37 ℃暗处反应5-10 min。每孔迅速加入终止液并混匀。使用酶标仪，在450 nm处尽快测OD值。根据所测样品OD值在标准曲线上査出血清相关指标的浓度。
6) 胎盘形态学观察：
胎盘样本制作成石蜡切片进行光学显微镜观察细胞形态；并制作超薄切片进行电子显微镜观察其超微结构；
a) 光学显微镜观察：组织经4 %多聚甲醛溶液固定后，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋，并制成7 μm厚度的切片。石蜡切片经常规HE染色后，在光学显微镜下以×100到×400的放大倍数进行形态学观察；
b) 电子显微镜观察：组织经2.5 %戊二醛溶液固定后，在0.1 mol/l PBS中充分洗涤。小样组织块用1 %锇酸固定液固定，逐级乙醇脱水，纯丙酮置换，Epon 812包埋。选择合适的区域用于超微结构的观察。超薄切片机切片制作显微切片，包埋于铜载网上。切片经4 %醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，在电子显微镜下以×4000到×12000的放大倍数进行细胞超微结构的观察。
7) 脂肪细胞因子检测：
ELISA法检测血清和胎盘瘦素、脂连素和抵抗素水平，具体操作同4）血液VD代谢相关指标的测定。
8) 胎盘胰岛素信号通路相关指标检测：
免疫组化和western blot法测定胎盘PI3k-Akt通路中相关分子PI3k、p-PI3k、Akt、p-Akt的蛋白表达水平。
a) 免疫组化法：石蜡切片常规脱蜡，经枸橼酸钠缓冲液高压进行抗原修复；自然冷却后经3 % H2O2阻断内源性过氧化物酶；山羊血清封闭后，滴加一抗于4 ℃过夜孵育；而后滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，37 ℃孵育；DAB显色，镜下观察染色，自来水冲洗；苏木素染色液进行复染；盐酸酒精分化液分化；自来水冲洗后，更换双蒸水清洗，使其返蓝；逐级常规乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。将切片置于显微镜下以×100到×400的放大倍数观察阳性染色表达部位及数量，并拍照。结果判定：有棕黄色颗粒，且染色强度高于背景非特异性染色者为抗原阳性细胞。胞浆内棕黄色颗粒多呈弥散状分布，少数成团块状或颗粒状。采用Image-Pro Plus 6.0 软件计算积分光密度值为免疫组化结果进行半定量分析；
b) Western blot法：从-80 ℃低温冰箱中取出胎盘组织，称重后，加入冰预冷的组织裂解液（50 mmol/l Tris-HCl，150 mmol/l NaCl，0.1 % Triton X-100，2 mmol/lNa2EDTA，0.5 mmol/l EGTA，1 mmol/l Na4P2O7，1 mmol/l Na3VO4，50 mmol/l NaF，10 μg/ml苯甲基磺酰氟化物和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物），置于冰上用匀浆器匀浆裂解。于4℃、12000 ×g离心15 min，收集上清。用BCA法定量蛋白浓度。等量样品中加入十二烷基硫酸钠样品缓冲液，煮沸变性。蛋白后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，被转到PVDF膜上。PVDF膜经含有吐温的Tris缓冲液（Tris-buffered saline plus Tween, TBST）（10 mmol/l Tris，pH 7.5，100 mmol/l NaCl和0.1 % Tween 20）漂洗后，用含5 %脱脂奶粉的TBST液室温封闭2 h。加入一抗抗体4 ℃过夜杂交。洗膜后再以IgG辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。膜经清洗后，用ECL化学发光试剂盒进行自显影。以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析。
9) 胎盘VD代谢通路相关指标检测：
Real-time PCR法、免疫组化法和Western blot法分别检测胎盘VDR、CYP24a1、CYP27b1mRNA和蛋白表达水平；亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平。
a) Real-time PCR法：TRIzol法进行总RNA提取，通过测定260 nm波长下样品的吸光度值确定样品中总RNA含量，同时测定280 nm波长下样品的吸光度值，用OD260/OD280比值反映RNA的纯度，并用琼酯糖凝胶电泳技术检测RNA的完整性。再用0.1 ‰ DEPC水将所有总RNA样品稀释定量至0.5µg/µl分装总RNA样品-80 ℃冰箱保存。根据试剂盒说明配制DNA消化反应体系和逆转录反应体系，将RNA逆转录成cDNA，并保存于-20 ℃冰箱。而后进行PCR。20µl的PCR反应体系中含1µl cDNA、10 µl PCR反应Mix、0.5 µM正向引物 1 µl、0.5 µM逆向引物1µl和7µl的无酶水。PCR扩增反应在95 ℃预变性5 min启动热启动酶，按95 ℃变性15sec，60 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec三步法循环扩增50次，末次循环后进行溶解曲线分析以检测PCR扩增产物质量。以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析；
b) 免疫组化法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
c) Western blot法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
d) 亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平：采用Promega公司的Wizard○R Genomic DNA Purification Kit提取基因组DNA，具体操作过程按照试剂盒说明进行。取1.5µl基因组DNA，用NanoDrop 100检测DNA浓度及纯度。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段的完整性。采用Chemicon公司的CpGenomeTM DNA Modification Kit将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的原理为：基因组DNA在亚硫酸氢盐的作用下，所有未被甲基化的胞嘧啶均脱氨磺化转变为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。根据这一特征性变化，可针对甲基化和未甲基化的等位基因设计特异性引物对目的序列进行扩增，根据扩增产物的有无即可确定有无CpG岛甲基化。二次巢式MSP扩增：第一次反应扩增一段CYP24a1启动子区富含CG的序列，第二次巢式MSP反应时，将第一次扩增后的产物稀释20倍作为模板，并使用甲基化和非甲基化特异性引物。反应体系中同时设有阴性、阳性和空白对照：正常人外周血淋巴细胞DNA作为阴性对照，经SssI甲基转移酶处理过的正常人外周血淋巴细胞DNA作为阳性对照，ddH2O作为空白对照。取5µl PCR终产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果认定需符合琼脂糖凝胶上可观测到与预期片断大小一致的PCR产物，而且条带单一；可观察到与预期片断大小一致的u_CYP24a1或/和m_CYP24a1条带；有相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。符合这些条件的样本可根据观测到的条带分为CYP24a1启动子甲基化和CYP24a1启动子未甲基化两类。修饰的DNA进行荧光定量PCR，PCR扩增反应按95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 sec，60 ℃退火延伸1 min三步法循环扩增40次。用SDS 1.2分析软件，计算出扩增曲线与阈值交叉的横坐标值，即是Ct值。为了计算目的基因的拷贝数，我们将已知浓度的经亚硫酸氢盐修饰过的质粒DNA做梯度稀释以绘制的标准曲线，根据标准曲线的Ct值确定样本中的待测基因的拷贝数。经内参和目的基因最低拷贝数检测确定DNA的浓度和纯度符合检测标准。为弥补由于样本体积、样本处理、DNA抽提导致的拷贝数的差异，将每个样本的m_CYP24a1除以相对应的ACTB拷贝数，然后乘以1000以便于操作，我们将得到的结果称为该样本的比例值。将比例值求log2对数后进行统计学分析。把截距代入到上述比例值中即可确定样本是否发生甲基化。高斯混合数据模型用于复孔求均值后的log2（1000×m_CYP24a1/ACTB）。该值大于3则认定为甲基化阳性。
10) 质量控制：
制定统一的调查表及填表说明，由专人负责对测量仪器进行定期校正；所有调査员在调查之前均由本课题组进行统一严格的专业培训；由专人对填写的调查表回收统计，回收问卷时确认问卷的完整性，避免漏项和错误的填写，并由专业人员对调查表的问卷的完整性、一致性和逻辑性进行逐项审核。实验过程中严格遵守各项实验操作规程。对标本的采集进行严格的操作培训，保证样品不被污染。对主观判定指标严格按照盲法由两位研究者同时进行，保证判定结果不受人主观因素的影响。同一石蜡块尽可能包括两组的组织样品，尽可能保证两组别的相关操作在同一时间内完成。对同一指标采用相同检测方法，严格遵守同样的实验条件，使用同一厂家和批号的试剂。
11) 统计分析：
采用SPSS17.0统计软件进行基础统计学分析。符合正态分布的定量试验资料除特殊说明均采用均数±标准差表示，卡方检验及两样本t检验或近似t检验分析两组之间统计学差异，方差不齐用Mann-Whitney U检验，计数资料采用卡方检验或者Fisher精确检验法分析两组之间统计学差异。采用直线相关及多因素非条件logistic回归进行关联性和相关影响因素的横断面分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：胎盘可通过多种途径促进GDM的发生发展，还可表达VD系统代谢所必须的分子，使得妊娠期VD代谢发生变化，有别于非妊娠状态；进一步明确VD与GDM发生发展关系及VD对GDM防治作用提供新证据，对减少妊娠不良结局和提高人口健康素质。
附图说明
为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中示出的具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
如图1所示，本具体实施方式采用以下技术方案：它的检测方法为：
1) 研究对象的选择：
随机选取妇产科住院的正常妊娠妇女、GDM患者各100例。所有患者均接受基本情况调查和常规实验室检查，平衡所有入选者的个体状况如年龄、收入情况、民族、文化程度、家族性糖尿病史、个人史及孕产史等。选择进入研究的研究对象，在进入研究前签署知情同意书：
a) 接受受试对象的条件：妊娠达37孕龄的妇女，年龄22-40岁，汉族，经济状况相当，无吸烟及饮酒史；
b) 除外受试对象的条件：孕前有糖尿病史、多囊卵巢综合症、肝病、孕前及孕期有高血压病、类风湿病、甲状腺及内分泌类相关疾病，孕前及孕期使用皮质激素类药物的孕妇，多胎或死胎的孕妇；
c) 受试对象分组：所有孕妇于孕24至28周行75 g OGTT，空腹、餐后1 h和餐后2 h血糖分别以5.1、10.0和8.5 mmol/L为诊断界值。具体做法：孕妇试验前3天未服用利尿剂、激素等影响糖代谢的药物。实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次，测空腹血糖后，将75 g葡萄糖粉溶于250 ml水中，5 min内口服完。从服糖水第一口开始计时，分别于l h、2 h抽取肘静脉血测血糖。任何一项血糖水平异常者，即诊断为GDM。按此标准，GDM组和正常孕妇组均为100例。所有孕妇均未出现胃肠道不良反应，受试过程中未服用饮料、茶及咖啡，未做剧烈运动。
研究资料的收集：
随访期间，进行孕产期母婴健康调查问卷收集信息，信息包括孕妇的实足年龄（需提供身份证号证明）、孕妇身高、孕前体重、职业、文化程度、既往妊娠史及疾病史（心脏病、高血压、糖尿病等）、末次月经时间、本次妊娠意愿、孕早期心理健康状况、孕妇家庭经济收入情况、孕期营养及生活方式、孕前半年至今环境有害物质的接触情况等。根据孕妇身高、孕前体重、孕期各个阶段的体重，计算各个阶段的BMI；并在孕中期和孕晚期两个时间段平卧位测量上肢血压。新生儿出生相关信息由专业医生填写并记录，主要信息有出生日期、性别、分娩孕周、分娩方式、新生儿并发症、出生体重、身长、头围、1’-Apgar评分、5’-Apgar评分、胎盘重量、羊水及出血量。
样本的收集：
a) 孕妇血液标本的采集与处理：在整个研究中，每位孕妇需在孕中期和孕晚期两个时间段共采血2次。各受试者于实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次。一部分血液使用不加抗凝剂的10ml真空玻璃试管，新采集的血样于室温放置30 min，然后于4℃、3000转/min共离心15 min。取血清置于血清管中，保存于-80 ℃直到分析。另一部分全血样品加于含EDTA作为抗凝剂的真空采血管中，2-8 ℃下可保存7天；
b) 脐血和胎盘标本的采集与处理：胎儿分娩后，采集脐血和胎盘组织。脐血的处理同a）孕妇血液标本的采集与处理；胎盘娩出后，由专业医生采集，立即在胎盘的中央取长2cm、宽2 cm、包括胎盘母体面和胎儿面标本2块。1块标本固定于4 %多聚甲醛溶液中，用于HE和免疫组化染色。另外1块标本浸入2.5 %戊二醛（pH 7.4）中过夜固定，用于后续的电镜观察。余下胎盘中选择相同部位的组织块储存于-80 ℃冰箱。
血液糖代谢相关指标的测定
a) 快速血糖仪测定血糖水平；
b) 亲和层析法测定EDTA抗凝血浆中HbA1c水平；
c) 全自动生化分析仪测定TG、CHO、LDL和HDL水平；放射免疫法测定胰岛素和C肽水平；
d) 并用稳态模式评估法（Homoeostasis model assessment, HOMA）计算IR指数（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能（HOMA-B），即HOMA-IR =[血糖水平（mmol/l）×胰岛素水平（μIU/ml）]/22.5；HOMA-B =[20×胰岛素水平（μIU/ml）]/[血糖水平（mmol/l）-3.5]。
血液VD代谢相关指标的测定：
ELISA法检测25(OH)D、1,25(OH)2D、DBP、PTH、钙水平。实验前从冰箱取出ELISA试剂盒以平衡至室温。设立标准孔以建立标准曲线。待测样品孔中每孔各加入已稀释的待测样品，将反应板置于37 ℃恒温箱120 min。然后用洗涤液将反应板充分洗涤并印干。每孔再加入第一抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min。反应板取出后充分洗涤并印干。每孔加酶标抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min。反应板取出后充分洗涤并印干。每孔加入底物液避光置37 ℃暗处反应5-10 min。每孔迅速加入终止液并混匀。使用酶标仪，在450 nm处尽快测OD值。根据所测样品OD值在标准曲线上査出血清相关指标的浓度。
胎盘形态学观察：
胎盘样本制作成石蜡切片进行光学显微镜观察细胞形态；并制作超薄切片进行电子显微镜观察其超微结构。
a) 光学显微镜观察：组织经4 %多聚甲醛溶液固定后，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋，并制成7μm厚度的切片。石蜡切片经常规HE染色后，在光学显微镜下以×100到×400的放大倍数进行形态学观察；
b) 电子显微镜观察：组织经2.5 %戊二醛溶液固定后，在0.1 mol/l PBS中充分洗涤。小样组织块用1 %锇酸固定液固定，逐级乙醇脱水，纯丙酮置换，Epon 812包埋。选择合适的区域用于超微结构的观察。超薄切片机切片制作显微切片，包埋于铜载网上。切片经4 %醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，在电子显微镜下以×4000到×12000的放大倍数进行细胞超微结构的观察。
脂肪细胞因子检测：
ELISA法检测血清和胎盘瘦素、脂连素和抵抗素水平，具体操作同4）血液VD代谢相关指标的测定。
胎盘胰岛素信号通路相关指标检测：
免疫组化和western blot法测定胎盘PI3k-Akt通路中相关分子PI3k、p-PI3k、Akt、p-Akt的蛋白表达水平。
a) 免疫组化法：石蜡切片常规脱蜡，经枸橼酸钠缓冲液高压进行抗原修复；自然冷却后经3 % H2O2阻断内源性过氧化物酶；山羊血清封闭后，滴加一抗于4 ℃过夜孵育；而后滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，37 ℃孵育；DAB显色，镜下观察染色，自来水冲洗；苏木素染色液进行复染；盐酸酒精分化液分化；自来水冲洗后，更换双蒸水清洗，使其返蓝；逐级常规乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。将切片置于显微镜下以×100到×400的放大倍数观察阳性染色表达部位及数量，并拍照。结果判定：有棕黄色颗粒，且染色强度高于背景非特异性染色者为抗原阳性细胞。胞浆内棕黄色颗粒多呈弥散状分布，少数成团块状或颗粒状。采用Image-Pro Plus 6.0 软件计算积分光密度值为免疫组化结果进行半定量分析；
b) Western blot法：从-80 ℃低温冰箱中取出胎盘组织，称重后，加入冰预冷的组织裂解液（50 mmol/l Tris-HCl，150 mmol/l NaCl，0.1 % Triton X-100，2 mmol/lNa2EDTA，0.5 mmol/l EGTA，1 mmol/l Na4P2O7，1 mmol/l Na3VO4，50 mmol/l NaF，10 μg/ml苯甲基磺酰氟化物和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物），置于冰上用匀浆器匀浆裂解。于4℃、12000 ×g离心15 min，收集上清。用BCA法定量蛋白浓度。等量样品中加入十二烷基硫酸钠样品缓冲液，煮沸变性。蛋白后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，被转到PVDF膜上。PVDF膜经含有吐温的Tris缓冲液（Tris-buffered saline plus Tween, TBST）（10 mmol/l Tris，pH 7.5，100 mmol/l NaCl和0.1 % Tween 20）漂洗后，用含5 %脱脂奶粉的TBST液室温封闭2 h。加入一抗抗体4 ℃过夜杂交。洗膜后再以IgG辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。膜经清洗后，用ECL化学发光试剂盒进行自显影。以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析。
胎盘VD代谢通路相关指标检测
Real-time PCR法、免疫组化法和Western blot法分别检测胎盘VDR、CYP24a1、CYP27b1mRNA和蛋白表达水平；亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平。
表1 PCR引物序列
a)Real-time PCR法：TRIzol法进行总RNA提取，通过测定260 nm波长下样品的吸光度值确定样品中总RNA含量，同时测定280 nm波长下样品的吸光度值，用OD260/OD280比值反映RNA的纯度，并用琼酯糖凝胶电泳技术检测RNA的完整性。再用0.1 ‰ DEPC水将所有总RNA样品稀释定量至0.5µg/µl分装总RNA样品-80 ℃冰箱保存。根据试剂盒说明配制DNA消化反应体系和逆转录反应体系，将RNA逆转录成cDNA，并保存于-20 ℃冰箱。而后进行PCR。20µl的PCR反应体系中含1µl cDNA、10 µl PCR反应Mix、0.5 µM正向引物 1 µl、0.5 µM逆向引物1µl和7µl的无酶水（各基因引物序列见表1）。PCR扩增反应在95 ℃预变性5 min启动热启动酶，按95 ℃变性15 sec，60 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec三步法循环扩增50次，末次循环后进行溶解曲线分析以检测PCR扩增产物质量。以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析；
b)免疫组化法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
c)Western blot法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
d)亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平：采用Promega公司的Wizard○R Genomic DNA Purification Kit提取基因组DNA，具体操作过程按照试剂盒说明进行。取1.5µl基因组DNA，用NanoDrop 100检测DNA浓度及纯度。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段的完整性。采用Chemicon公司的CpGenomeTM DNA Modification Kit将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的原理为：基因组DNA在亚硫酸氢盐的作用下，所有未被甲基化的胞嘧啶均脱氨磺化转变为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。根据这一特征性变化，可针对甲基化和未甲基化的等位基因设计特异性引物对目的序列进行扩增，根据扩增产物的有无即可确定有无CpG岛甲基化。二次巢式MSP扩增：第一次反应扩增一段CYP24a1启动子区富含CG的序列，第二次巢式MSP反应时，将第一次扩增后的产物稀释20倍作为模板，并使用甲基化和非甲基化特异性引物。反应体系中同时设有阴性、阳性和空白对照：正常人外周血淋巴细胞DNA作为阴性对照，经SssI甲基转移酶处理过的正常人外周血淋巴细胞DNA作为阳性对照，ddH2O作为空白对照。取5µl PCR终产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果认定需符合琼脂糖凝胶上可观测到与预期片断大小一致的PCR产物，而且条带单一；可观察到与预期片断大小一致的u_CYP24a1或/和m_CYP24a1条带；有相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。符合这些条件的样本可根据观测到的条带分为CYP24a1启动子甲基化和CYP24a1启动子未甲基化两类。修饰的DNA进行荧光定量PCR（引物见表2），PCR扩增反应按95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 sec，60 ℃退火延伸1 min三步法循环扩增40次。用SDS 1.2分析软件，计算出扩增曲线与阈值交叉的横坐标值，即是Ct值。为了计算目的基因的拷贝数，我们将已知浓度的经亚硫酸氢盐修饰过的质粒DNA做梯度稀释以绘制的标准曲线，根据标准曲线的Ct值确定样本中的待测基因的拷贝数。经内参和目的基因最低拷贝数检测确定DNA的浓度和纯度符合检测标准。为弥补由于样本体积、样本处理、DNA抽提导致的拷贝数的差异，将每个样本的m_CYP24a1除以相对应的ACTB拷贝数，然后乘以1000以便于操作，我们将得到的结果称为该样本的比例值。将比例值求log2对数后进行统计学分析。把截距代入到上述比例值中即可确定样本是否发生甲基化。高斯混合数据模型用于复孔求均值后的log2（1000×m_CYP24a1/ACTB）。该值大于3则认定为甲基化阳性。
表2 CYP24a1 引物序列
指标 序列
CYP24BisF1 5’-TAGTTGTAGTTTGTAGGAGGAGGG-3’
CYP24BisR1 5’-AAACATACTAAAATAACCAATAAACAC-3’
CYP24BisF2 5’- TGGTTAGTTTAGGGTAGAAATTAG-3’
CYP24BisR2 5’- ACAAAAAAACACCTCTTTTAAAAC-3’
10) 质量控制：
制定统一的调查表及填表说明，由专人负责对测量仪器进行定期校正；所有调査员在调查之前均由本课题组进行统一严格的专业培训；由专人对填写的调查表回收统计，回收问卷时确认问卷的完整性，避免漏项和错误的填写，并由专业人员对调查表的问卷的完整性、一致性和逻辑性进行逐项审核。实验过程中严格遵守各项实验操作规程。对标本的采集进行严格的操作培训，保证样品不被污染。对主观判定指标严格按照盲法由两位研究者同时进行，保证判定结果不受人主观因素的影响。同一石蜡块尽可能包括两组的组织样品，尽可能保证两组别的相关操作在同一时间内完成。对同一指标采用相同检测方法，严格遵守同样的实验条件，使用同一厂家和批号的试剂。
统计分析：
采用SPSS17.0统计软件进行基础统计学分析。符合正态分布的定量试验资料除特殊说明均采用均数±标准差表示，卡方检验及两样本t检验或近似t检验分析两组之间统计学差异，方差不齐用Mann-Whitney U检验，计数资料采用卡方检验或者Fisher精确检验法分析两组之间统计学差异。采用直线相关及多因素非条件logistic回归进行关联性和相关影响因素的横断面分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
本具体实施方式的工作原理为：随机选取正常健康孕妇和GDM孕妇各100例。通过于孕24至28周行75 g口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）确定GDM。在孕期多个时间点初步探讨血清和脐血中VD代谢与糖代谢的相关性，并以胎盘为靶器官，重点研究健康妊娠状态和GDM状态下胎盘的形态学、脂肪细胞因子、胰岛素信号通路和VD代谢相关通路的改变情况。
主要观察指标包括：孕妇年龄、身高、体重、职业、文化程度、既往妊娠史及疾病史、孕妇家庭经济收入情况、孕期营养及生活方式、孕期增重、BMI、血压等指标；新生儿性别、分娩孕周、分娩方式、新生儿并发症、出生体重、身长、头围等指标；孕妇血清和脐血中糖代谢相关指标：血糖、HbA1c、甘油三酯（triglyceride, TG）、胆固醇（cholesterol, CHO）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）、胰岛素和C肽；孕妇血清和脐血中VD代谢相关指标：25(OH)D、1,25(OH)2D、DBP、PTH、钙水平；胎盘形态学观察：光学显微镜观察细胞形态，电子显微镜观察其超微结构；血清和胎盘瘦素、脂连素和抵抗素水平；胎盘磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3k）-蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/Akt）通路中相关分子PI3k、p-PI3k、Akt、p-Akt的蛋白表达水平；胎盘VDR、CYP24a1、CYP27b1 mRNA和蛋白表达水平；胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.糖尿病孕妇维生素D代谢与糖代谢相关性及胎盘检测方法，其特征在于：它的检测方法为：
1) 研究对象的选择：
随机选取妇产科住院的正常妊娠妇女、GDM患者各100例；所有患者均接受基本情况调查和常规实验室检查，平衡所有入选者的个体状况如年龄、收入情况、民族、文化程度、家族性糖尿病史、个人史及孕产史；选择进入研究的研究对象，在进入研究前签署知情同意书；
a、接受受试对象的条件：妊娠达37孕龄的妇女，年龄22-40岁，汉族，经济状况相当，无吸烟及饮酒史；
b)、除外受试对象的条件：孕前有糖尿病史、多囊卵巢综合症、肝病、孕前及孕期有高血压病、类风湿病、甲状腺及内分泌类相关疾病，孕前及孕期使用皮质激素类药物的孕妇，多胎或死胎的孕妇；
c)、受试对象分组：所有孕妇于孕24至28周行75 g OGTT，空腹、餐后1 h和餐后2 h血糖分别以5.1、10.0和8.5 mmol/L为诊断界值；具体做法：孕妇试验前3天未服用利尿剂、激素影响糖代谢的药物；实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次，测空腹血糖后，将75 g葡萄糖粉溶于250 ml水中，5 min内口服完；从服糖水第一口开始计时，分别于lh、2 h抽取肘静脉血测血糖；任何一项血糖水平异常者，即诊断为GDM；按此标准，GDM组和正常孕妇组均为100例；所有孕妇均未出现胃肠道不良反应，受试过程中未服用饮料、茶及咖啡，未做剧烈运动；
2) 研究资料的收集：
随访期间，进行孕产期母婴健康调查问卷收集信息，信息包括孕妇的实足年龄、孕妇身高、孕前体重、职业、文化程度、既往妊娠史及疾病史、末次月经时间、本次妊娠意愿、孕早期心理健康状况、孕妇家庭经济收入情况、孕期营养及生活方式、孕前半年至今环境有害物质的接触情况；根据孕妇身高、孕前体重、孕期各个阶段的体重，计算各个阶段的BMI；并在孕中期和孕晚期两个时间段平卧位测量上肢血压；新生儿出生相关信息由专业医生填写并记录，主要信息有出生日期、性别、分娩孕周、分娩方式、新生儿并发症、出生体重、身长、头围、1’-Apgar评分、5’-Apgar评分、胎盘重量、羊水及出血量；
3)样本的收集：
a)孕妇血液标本的采集与处理：在整个研究中，每位孕妇需在孕中期和孕晚期两个时间段共采血2次；各受试者于实验前一晚9点后不再进食，于第二天7点抽肘静脉血一次；一部分血液使用不加抗凝剂的10ml真空玻璃试管，新采集的血样于室温放置30 min，然后于4℃、3000转/min共离心15 min；取血清置于血清管中，保存于-80 ℃直到分析；另一部分全血样品加于含EDTA作为抗凝剂的真空采血管中，2-8 ℃下可保存7天；
b) 脐血和胎盘标本的采集与处理：胎儿分娩后，采集脐血和胎盘组织；脐血的处理同a）孕妇血液标本的采集与处理；胎盘娩出后，由专业医生采集，立即在胎盘的中央取长2cm、宽2 cm、包括胎盘母体面和胎儿面标本2块；1块标本固定于4 %多聚甲醛溶液中，用于HE和免疫组化染色；另外1块标本浸入2.5 %戊二醛中过夜固定，用于后续的电镜观察；余下胎盘中选择相同部位的组织块储存于-80 ℃冰箱；
4) 血液糖代谢相关指标的测定：
a)、快速血糖仪测定血糖水平；
b)、亲和层析法测定EDTA抗凝血浆中HbA1c水平；
c)、全自动生化分析仪测定TG、CHO、LDL和HDL水平；放射免疫法测定胰岛素和C肽水平；
d)、并用稳态模式评估法计算IR指数（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能，即HOMA-IR =[血糖水平（mmol/l）×胰岛素水平（μIU/ml）]/22.5；HOMA-B =[20×胰岛素水平（μIU/ml）]/[血糖水平（mmol/l）-3.5]；
5)、血液VD代谢相关指标的测定：
ELISA法检测25(OH)D、1,25(OH)2D、DBP、PTH、钙水平；实验前从冰箱取出ELISA试剂盒以平衡至室温；设立标准孔以建立标准曲线；待测样品孔中每孔各加入已稀释的待测样品，将反应板置于37 ℃恒温箱120 min；然后用洗涤液将反应板充分洗涤并印干；每孔再加入第一抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min；反应板取出后充分洗涤并印干；每孔加酶标抗体工作液，将反应板置于37 ℃恒温箱60 min；反应板取出后充分洗涤并印干；每孔加入底物液避光置37 ℃暗处反应5-10 min；每孔迅速加入终止液并混匀；使用酶标仪，在450 nm处尽快测OD值；根据所测样品OD值在标准曲线上査出血清相关指标的浓度；
6)、胎盘形态学观察：
胎盘样本制作成石蜡切片进行光学显微镜观察细胞形态；并制作超薄切片进行电子显微镜观察其超微结构；
a)光学显微镜观察：组织经4%多聚甲醛溶液固定后，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋，并制成7 μm厚度的切片；石蜡切片经常规HE染色后，在光学显微镜下以×100到×400的放大倍数进行形态学观察；
b)电子显微镜观察：组织经2.5%戊二醛溶液固定后，在0.1 mol/l PBS中充分洗涤；小样组织块用1 %锇酸固定液固定，逐级乙醇脱水，纯丙酮置换，Epon 812包埋；选择合适的区域用于超微结构的观察；超薄切片机切片制作显微切片，包埋于铜载网上；切片经4 %醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，在电子显微镜下以×4000到×12000的放大倍数进行细胞超微结构的观察；
7)、脂肪细胞因子检测：
ELISA法检测血清和胎盘瘦素、脂连素和抵抗素水平，具体操作同4）血液VD代谢相关指标的测定；
8)、胎盘胰岛素信号通路相关指标检测：
免疫组化和western blot法测定胎盘PI3k-Akt通路中相关分子PI3k、p-PI3k、Akt、p-Akt的蛋白表达水平；
a)免疫组化法：石蜡切片常规脱蜡，经枸橼酸钠缓冲液高压进行抗原修复；自然冷却后经3 % H2O2阻断内源性过氧化物酶；山羊血清封闭后，滴加一抗于4 ℃过夜孵育；而后滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，37 ℃孵育；DAB显色，镜下观察染色，自来水冲洗；苏木素染色液进行复染；盐酸酒精分化液分化；自来水冲洗后，更换双蒸水清洗，使其返蓝；逐级常规乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固；将切片置于显微镜下以×100到×400的放大倍数观察阳性染色表达部位及数量，并拍照；结果判定：有棕黄色颗粒，且染色强度高于背景非特异性染色者为抗原阳性细胞；胞浆内棕黄色颗粒多呈弥散状分布，少数成团块状或颗粒状；采用Image-Pro Plus 6.0 软件计算积分光密度值为免疫组化结果进行半定量分析；
b)Western blot法：从-80 ℃低温冰箱中取出胎盘组织，称重后，加入冰预冷的组织裂解液（50 mmol/l Tris-HCl，150 mmol/l NaCl，0.1 % Triton X-100，2 mmol/l Na2EDTA，0.5 mmol/l EGTA，1 mmol/l Na4P2O7，1 mmol/l Na3VO4，50 mmol/l NaF，10 μg/ml苯甲基磺酰氟化物和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物），置于冰上用匀浆器匀浆裂解；于4 ℃、12000×g离心15 min，收集上清；用BCA法定量蛋白浓度；等量样品中加入十二烷基硫酸钠样品缓冲液，煮沸变性；蛋白后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，被转到PVDF膜上；PVDF膜经含有吐温的Tris缓冲液（Tris-buffered saline plus Tween, TBST）（10 mmol/lTris，pH 7.5，100 mmol/l NaCl和0.1 % Tween 20）漂洗后，用含5 %脱脂奶粉的TBST液室温封闭2 h；加入一抗抗体4 ℃过夜杂交；洗膜后再以IgG辣根过氧化物酶标记的二抗孵育；膜经清洗后，用ECL化学发光试剂盒进行自显影；以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析；
9)、胎盘VD代谢通路相关指标检测：
Real-time PCR法、免疫组化法和Western blot法分别检测胎盘VDR、CYP24a1、CYP27b1mRNA和蛋白表达水平；亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平；
a) Real-time PCR法：TRIzol法进行总RNA提取，通过测定260 nm波长下样品的吸光度值确定样品中总RNA含量，同时测定280 nm波长下样品的吸光度值，用OD260/OD280比值反映RNA的纯度，并用琼酯糖凝胶电泳技术检测RNA的完整性；再用0.1 ‰ DEPC水将所有总RNA样品稀释定量至0.5µg/µl分装总RNA样品-80 ℃冰箱保存；根据试剂盒说明配制DNA消化反应体系和逆转录反应体系，将RNA逆转录成cDNA，并保存于-20 ℃冰箱；而后进行PCR；20µl的PCR反应体系中含1µl cDNA、10 µl PCR反应Mix、0.5 µM正向引物 1 µl、0.5 µM逆向引物1µl和7µl的无酶水；PCR扩增反应在95 ℃预变性5 min启动热启动酶，按95 ℃变性15 sec，60 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec三步法循环扩增50次，末次循环后进行溶解曲线分析以检测PCR扩增产物质量；以GAPDH为内对照，用Quantity One软件对条带进行分析；
b) 免疫组化法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
c) Western blot法同7）胎盘胰岛素信号通路相关指标检测；
d) 亚硫酸氢盐测序法检测胎盘CYP24a1启动子区甲基化水平：采用Promega公司的Wizard○R Genomic DNA Purification Kit提取基因组DNA，具体操作过程按照试剂盒说明进行；取1.5µl基因组DNA，用NanoDrop 100检测DNA浓度及纯度；琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段的完整性；采用Chemicon公司的CpGenomeTM DNA Modification Kit将提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰；亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的原理为：基因组DNA在亚硫酸氢盐的作用下，所有未被甲基化的胞嘧啶均脱氨磺化转变为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变；根据这一特征性变化，可针对甲基化和未甲基化的等位基因设计特异性引物对目的序列进行扩增，根据扩增产物的有无即可确定有无CpG岛甲基化；二次巢式MSP扩增：第一次反应扩增一段CYP24a1启动子区富含CG的序列，第二次巢式MSP反应时，将第一次扩增后的产物稀释20倍作为模板，并使用甲基化和非甲基化特异性引物；反应体系中同时设有阴性、阳性和空白对照：正常人外周血淋巴细胞DNA作为阴性对照，经SssI甲基转移酶处理过的正常人外周血淋巴细胞DNA作为阳性对照，ddH2O作为空白对照；取5µl PCR终产物进行琼脂糖凝胶电泳；结果认定需符合琼脂糖凝胶上可观测到与预期片断大小一致的PCR产物，而且条带单一；可观察到与预期片断大小一致的u_CYP24a1或/和m_CYP24a1条带；有相应的阳性对照、阴性对照和空白对照；符合这些条件的样本可根据观测到的条带分为CYP24a1启动子甲基化和CYP24a1启动子未甲基化两类；修饰的DNA进行荧光定量PCR，PCR扩增反应按95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 sec，60 ℃退火延伸1 min三步法循环扩增40次；用SDS 1.2分析软件，计算出扩增曲线与阈值交叉的横坐标值，即是Ct值；为了计算目的基因的拷贝数，我们将已知浓度的经亚硫酸氢盐修饰过的质粒DNA做梯度稀释以绘制的标准曲线，根据标准曲线的Ct值确定样本中的待测基因的拷贝数；经内参和目的基因最低拷贝数检测确定DNA的浓度和纯度符合检测标准；为弥补由于样本体积、样本处理、DNA抽提导致的拷贝数的差异，将每个样本的m_CYP24a1除以相对应的ACTB拷贝数，然后乘以1000以便于操作，我们将得到的结果称为该样本的比例值；将比例值求log2对数后进行统计学分析；把截距代入到上述比例值中即可确定样本是否发生甲基化；高斯混合数据模型用于复孔求均值后的log2（1000×m_CYP24a1/ACTB）；该值大于3则认定为甲基化阳性；
10)、质量控制：
制定统一的调查表及填表说明，由专人负责对测量仪器进行定期校正；所有调査员在调查之前均由本课题组进行统一严格的专业培训；由专人对填写的调查表回收统计，回收问卷时确认问卷的完整性，避免漏项和错误的填写，并由专业人员对调查表的问卷的完整性、一致性和逻辑性进行逐项审核；实验过程中严格遵守各项实验操作规程；对标本的采集进行严格的操作培训，保证样品不被污染；对主观判定指标严格按照盲法由两位研究者同时进行，保证判定结果不受人主观因素的影响；同一石蜡块尽可能包括两组的组织样品，尽可能保证两组别的相关操作在同一时间内完成；对同一指标采用相同检测方法，严格遵守同样的实验条件，使用同一厂家和批号的试剂；
11)、统计分析：
采用SPSS17.0统计软件进行基础统计学分析；符合正态分布的定量试验资料除特殊说明均采用均数±标准差表示，卡方检验及两样本t检验或近似t检验分析两组之间统计学差异，方差不齐用Mann-Whitney U检验，计数资料采用卡方检验或者Fisher精确检验法分析两组之间统计学差异；采用直线相关及多因素非条件logistic回归进行关联性和相关影响因素的横断面分析。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110619927A (zh) * 2019-03-27 2019-12-27 北京中科生仪科技有限公司 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法

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