CN116200473A - 检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光pcr检测方法及其应用 - Google Patents
检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光pcr检测方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及核酸体外扩增检测的技术领域，具体提供了一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，该检测方法利用非特异性荧光染料和特异性探针在不同温度下发出荧光信号不一样的原理，实现了能够利用较少的荧光通道数检测更多的靶点，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。
Description
技术领域
本发明涉及核酸体外扩增检测的技术领域，具体涉及一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法及其应用。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该技术具有操作简便、快速高效、高敏感性等特点，已广泛用于分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等诸多研究领域，是快速检测的现代方法之一。
目前常用的荧光PCR仪，主要提供2-5种荧光通道，一般情况下，荧光定量PCR检测时可以利用一个荧光通道作为内参，其余荧光通道用于检测待测标本。现有的实时荧光定量PCR技术存在检测靶点数量有限的缺陷，例如在2通道仪器中，现有技术中一般只能检测1个靶点，另1个用于检测内参；即使在4通道仪器中，现有技术中最高检测3-4个靶点。而荧光PCR仪价格昂贵，荧光通道数越多，价格越贵。因此，如何利用较少的荧光通道数检测更多的靶点对于快速检测领域的技术人员来说是一直面临的难题。
因此，研发一种能够实现检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述问题，提供一种能够实现检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)当荧光通道数为m，检测n个靶序列，且n>m时，根据n个靶序列分别设计n对特异性引物和m个荧光探针；其中，m为≥1的正整数，n为≥2的正整数；
(2)配制PCR体系，所述PCR体系包括n对特异性引物、m个荧光探针和n-m个荧光染料；m个靶序列分别采用第一、第二、......第m荧光探针检测，n-m个靶序列分别采用第一、第二、......第n-m荧光染料检测；
其中，检测荧光染料的荧光通道与至少一种检测荧光探针的荧光通道相同；
(3)设定PCR程序，设定预变性的第一温度和第一时间，变性的第二温度和第二时间，退火延伸的第三温度和第三时间，循环次数：
其中，在PCR扩增的整个循环过程中，在第二温度时采集荧光探针的荧光信号，以及在第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，分别记录荧光信号强度；
(4)依据步骤(3)记录的荧光信号强度，计算n-m个靶序列的荧光信号强度差异值；若差异值大于阈值，则判定n-m个靶序列有扩增产物；若差异值小于阈值，则判定n-m个靶序列没有扩增产物。
需要说明的是，本发明中“第一”、“第二”等数字表示方式仅仅用于区分不同的物质或使用方式，不代表顺序的区别。
所述步骤(1)中，荧光通道数m代表荧光PCR仪中能够检测的不同荧光颜色的检测器数目，此处限定m为≥1的正整数，m的最大取值与使用的荧光PCR仪型号参数直接相关，在此处对m的最大取值不作具体限定。
优选地，所述m为1、2、3、4、5、6、7或8，更优选m为2、3、4、5或6，对m的取值进一步限定，使其与目前常用的荧光PCR仪的荧光通道数目相符。
靶序列个数n的取值与荧光通道数m直接相关，只要满足n为≥2的正整数，n>m的条件即可。
优选地，所述n为2、3、4、5、6、7、8或9，更优选n为3、4、5、6或7。
本发明的发明人发现，当n>m时，使用荧光通道数为m的荧光PCR仪检测n个靶序列时，由于通常情况下一个荧光通道只能检测一个靶序列，因此会出现荧光通道数不能满足检测靶序列数目的情况，为了使检测靶序列数多于荧光通道数，本发明利用非特异性荧光染料和特异性探针在不同温度下发出荧光信号不一样的基础上，开发出了本发明的检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。
所述步骤(1)中，根据n个靶序列分别设计n对特异性引物，在构建PCR体系时将靶序列的模板和对应的特异性引物同时加入，以保证靶序列能够顺利的进行PCR扩增。
所述步骤(1)中，根据n个靶序列分别设计m个荧光探针，其含义是指有其中n-m个靶序列是无需设计荧光探针的，因为荧光通道数m的取值有限，最多只能检测m个不同的荧光探针发出的荧光信号，因此只需设计m个探针对应m个靶序列进行标记即可。
所述步骤(2)中，配制的PCR体系包括n对特异性引物、m个荧光探针和n-m个荧光染料。
上述荧光探针为特异性结合靶序列的一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，荧光报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时(在延伸阶段)，荧光探针和各自目的模板结合，Taq酶的5’-3’外切酶活性将荧光探针酶切降解，使报告荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光PCR仪的荧光监测系统可接收到荧光信号。随着反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。荧光探针一旦被酶切降解，其发出的荧光信号一直存在，与温度变化无关，无论是低温(例如退火延伸的温度)或高温(例如变性的温度)，荧光PCR仪都能够检测到荧光探针发出的荧光信号。
对于荧光探针的选择不做具体限定，可以选择本领域常规使用的荧光探针，例如所述荧光探针可以为TaqMan探针。
优选地，所述TaqMan探针选自FAM探针、ROX探针、Cy3探针、Cy5探针、TET探针、HEX探针、JOE探针和TAMRA探针中的一种或多种。
本发明中，所述荧光染料是指直接与双链DNA(dsDNA)结合的荧光染料，其能够与所有的PCR产物(dsDNA)结合，而不能特异性区分是何种靶序列，即荧光染料是非特异性结合。PCR产物在低温时(例如退火延伸的温度)呈双链结构，结合的荧光染料能被荧光PCR仪检测到荧光信号，而PCR产物处于高温时(例如变性的温度)呈解链状态，荧光染料无法结合，因此此时荧光PCR仪无法检测到荧光染料的荧光信号。
优选地，所述荧光染料选自SYBR GreenⅠ、Eva Green和LC Green中的一种或多种，更优选SYBR GreenⅠ。
除此之外，步骤(2)中的PCR体系还包括荧光PCR扩增过程中通常加入的不可或缺的组分，例如模板、酶、缓冲液等。
所述步骤(2)中，m个靶序列分别采用第一、第二、......第m荧光探针检测，PCR扩增过程中，m个荧光通道能够分别检测m个荧光探针发出的荧光，依据特异性荧光探针发出的荧光信号记录m个靶序列的PCR扩增情况。
所述步骤(2)中，n-m个靶序列分别采用第一、第二、......第n-m荧光染料检测。但为了避免非特异性荧光染料叠加使用可能会影响靶序列定量检测的准确性，优选n-m＝1，即优选检测靶序列数比荧光通道数多1，在PCR扩增过程中只加入一种非特异性荧光染料。
为了实现m个荧光通道检测n个靶序列，且n>m，则需要保证检测荧光染料的荧光通道与至少一种检测荧光探针的荧光通道相同，如此荧光PCR仪才能顺利检测到荧光染料发出的荧光信号。例如，使用2个荧光通道检测3个靶序列，加入的荧光探针为FAM探针和ROX探针，荧光染料为SYBR GreenⅠ时，则FAM探针发出的荧光信号和SYBR GreenⅠ发出的荧光信号被同一个荧光通道检测。
所述步骤(3)中，设定PCR程序可以依据本领域常规使用的荧光PCR扩增的参数进行设定，在此不作具体限定。
在本发明一种实施方式中，所述PCR程序的条件包括：第一温度为94-97℃，第一时间为2-10min；第二温度为94-97℃，第二时间为5-30s；第三温度为45-75℃，第三时间为10-60s；循环次数为30-50次。
在本发明一种实施方式中，在变性阶段的第二温度采集荧光探针的荧光信号时，采集时间小于等于第二时间，优选采集时间在变性的末端时间段，以获得稳定的荧光信号。
在本发明一种实施方式中，在退火延伸的第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号时，采集时间小于等于第三时间，优选采集时间在退火延伸的末端时间段，以获得稳定的荧光信号。
正常的PCR扩增过程中，每个循环后荧光信号强度都在增加，后面循环采集的荧光信号强度高于前面循环的荧光信号强度。所述步骤(3)中，可以在整个循环过程的第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，获得最后一个循环后的荧光信号强度去进行后续荧光信号强度差异值的计算。
在本发明一种实施方式中，在前2-15个和后2-15个循环的第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，计算荧光强度均值，更优选在前2-5个和后2-5个循环的第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，计算荧光强度均值。在第三温度采集荧光信号时，无需在整个循环过程中进行荧光信号的采集，只需在前几个和后几个循环检测即可。
所述步骤(4)中，理论上讲，第三温度时采集的荧光探针和荧光染料的总荧光强度增量是所有待检测靶序列(n个)扩增的PCR产物的总荧光强度增量，由于部分靶序列(m个，对应荧光通道数)使用特异性的荧光探针标记，因此这部分靶序列能够在第二温度采集到特异性荧光探针的荧光强度增量，并分别代表其对应标记的靶序列扩增的PCR产物的荧光强度增量。因此，n-m个靶序列的荧光信号强度增量＝待检测n个靶序列扩增的PCR产物的总荧光强度增量-m个靶序列扩增的PCR产物的荧光强度增量。
本发明主要通过PCR扩增前后的荧光强度差值判断n-m个靶序列是否存在扩增产物，由于本身基底荧光波动以及其它因素带来的影响，因此需要设定一个阈值。阈值设定原则如下：前2-15个循环荧光信号标准差的10倍。
若差异值大于阈值，则代表荧光强度信号的增量能够表示有PCR扩增产物的累积，则判定n-m个靶序列有扩增产物，结果显示阳性；若差异值小于阈值，则代表荧光强度信号的增量变化不大，没有PCR扩增产物的累积，则判定n-m个靶序列没有扩增产物，结果显示阴性。
在本发明一种实施方式中，当荧光通道数为m，检测n个靶序列，且n-m＝1时，靶序列n的荧光强度增量＝(第三温度时采集的第一荧光染料的总荧光强度增量A)-(第三温度时采集的靶序列1的第一荧光染料的荧光强度增量A1+第三温度时采集的靶序列2的第一荧光染料的荧光增量A2+......+第三温度时采集的靶序列m的第一荧光染料的荧光强度增量Am)。
需要说的是，当n-m＝1时，此处“靶序列n”是指第n个靶序列，即比荧光通道数多出的那条靶序列。
第一荧光染料在低温下(例如退火延伸的第三温度)会与扩增后所有的DNA双链小沟结合发光，因此第三温度时采集的第一荧光染料的总荧光强度增量A是所有n个靶序列扩增的总荧光强度增量，为了获得靶序列n单独的荧光强度增量以便于判定其是否扩增，因此理论上只需用第三温度时采集的第一荧光染料的总荧光强度增量A减掉m个靶序列的第一荧光染料的荧光强度增量即可。但实际上，第一荧光染料的荧光信号只能被一个荧光通道接收，并不能反映出每个靶序列结合的第一荧光染料的信号强度，因此需要借助每个靶序列结合的特异性探针的荧光信号以体现其单独扩增的荧光强度增量，才能通过计算荧光信号强度差异值来获得靶序列n单独的荧光强度增量。
在本发明一种实施方式中，当m＝2，n＝3，检测第一荧光染料和检测靶序列1的第一荧光探针的荧光通道相同时，所述第三温度时采集的第一荧光染料的荧光强度增量A’＝第三温度时采集第一荧光染料的总荧光强度增量A-第二温度时采集的靶序列1的第一荧光探针的荧光强度增量a1*α；其中，所述α为第一荧光探针在第二温度和第三温度时显示荧光强度有差异的关系系数。
需要说明的是，此处“α”是指第一荧光探针在第二温度(94-97℃)和第三温度(45-75℃)时显示荧光强度有差异的关系系数。例如第一荧光探针为FAM探针时，FAM探针发出的荧光点相同时，在温度高的时候荧光点发出的荧光信号光强一些，温度低的时候荧光点发出的荧光信号光弱一些，因此需要消除或减小温度对荧光探针的荧光信号强度变化的影响，计算荧光探针的荧光强度增量时需要乘以系数α。
在本发明一种实施方式中，所述第三温度时采集的靶序列1的第一荧光染料的荧光强度增量A1＝第二温度时采集的靶序列1的第一荧光探针的荧光强度增量a1*β，所述β为第一荧光探针在第二温度时与第一荧光染料在第三温度时显示荧光强度有差异的关系系数。
需要说明的是，此处“β”是指第一荧光探针在第二温度(94-97℃)和第一荧光染料在第三温度(45-75℃)时显示荧光强度比例关系系数。对于两份完全相同的PCR扩增产物，分别用第一荧光探针和第一荧光染料结合测试荧光强度，经过多次测试发现虽然PCR产物完全相同，但测试的荧光强度不同，因此需要测试系数β，通过第一荧光探针的荧光强度和β换算出第一荧光染料的荧光强度。例如第一荧光探针为FAM探针，第一荧光染料为SYBRGreenⅠ时，第三温度时采集的第一荧光染料的荧光强度增量A’减掉靶序列1的PCR产物(dsDNA)与荧光染料结合产生的荧光和靶序列2的PCR产物(dsDNA)与荧光染料结合产生的荧光后，才得到靶序列3的荧光强度，而且在荧光采集过程中，只有荧光探针在第二温度(94-97℃)发出荧光为单纯探针发出的荧光，因此可通过β和第一荧光探针在第二温度(94-97℃)荧光计算靶序列1的PCR产物(dsDNA)与荧光染料结合产生的荧光。
在本发明一种实施方式中，所述第三温度时采集的靶序列2的第一荧光染料的荧光强度增量A2＝第二温度时采集的靶序列2的第二荧光探针的荧光强度增量a2*η，所述η为第二荧光探针在第二温度时与第一荧光染料在第三温度时显示荧光强度有差异的关系系数。
需要说明的是，此处“η”是指第二荧光探针在第二温度(94-97℃)和第一荧光染料在第三温度(45-75℃)时显示荧光强度比例关系系数，原理与系数β相同。例如第二荧光探针为ROX探针，第一荧光染料为SYBR GreenⅠ时，第三温度时采集的第一荧光染料的荧光强度增量A’减掉靶序列1的PCR产物(dsDNA)与荧光染料结合产生的荧光和靶序列2的PCR产物(dsDNA)与荧光染料结合产生的荧光后，才得到靶序列3的荧光强度，而且在荧光采集过程中，只有荧光探针在第二温度(94-97℃)发出荧光为单纯探针发出的荧光，因此可通过η和第二荧光探针在第二温度(94-97℃)荧光计算靶序列2的PCR产物(dsDNA)与荧光染料结合产生的荧光。
在本发明一种实施方式中，当荧光通道数m＝2，检测n＝3个靶序列时，所述靶序列3的荧光强度增量＝(第三温度时采集的第一荧光染料的总荧光强度增量A)-(第二温度时采集的第一荧光探针的荧光强度增量a1*α+第二温度时采集的第一荧光探针的荧光强度增量a1*β+第二温度采集的第二荧光探针的荧光强度增量a2*η)。
在本发明一种具体实施方式中，一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)当荧光通道数为2(FAM通道和ROX通道)，检测3个靶序列时(分别编号靶序列1、2、3)，根据3个靶序列分别设计3对特异性引物和2个荧光探针；
(2)配制PCR体系，所述PCR体系包括3对特异性引物、2个荧光探针FAM和ROX，1个荧光染料SYBR GREEN；
靶序列1和2分别采用FAM和ROX荧光探针检测，靶序列3采用SYBR GREEN荧光染料检测；
其中，检测SYBR GREEN荧光染料的荧光通道与检测荧光探针FAM的荧光通道相同；
(3)设定PCR程序，设定预变性的第一温度为95℃和第一时间为3min，变性的第二温度为95℃和第二时间为10s，退火延伸的第三温度为60℃和第三时间为15s，循环次数40：
其中，在PCR扩增的整个循环过程中，在95℃时采集荧光探针FAM和ROX的荧光信号，以及在60℃时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号(只在前3个循环和后3个循环进行采集荧光)，分别记录荧光信号强度；
目标靶序列1的FAM探针产生的荧光强度＝95℃下FAM通道检测荧光强度；
目标靶序列2的ROX探针产生的荧光强度＝95℃下ROX通道检测荧光强度；
(4)依据步骤(3)记录的荧光信号强度，计算靶序列3的荧光信号强度差异值＝60℃总SYBR GREEN荧光增量-60℃目标靶序列1双链DNA的SYBR GREEN荧光增量-60℃目标靶序列2双链DNA的SYBR GREEN荧光增量；
其中，60℃总SYBR GREEN荧光增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃目标靶序列1的FAM探针荧光增量*α；
60℃目标靶序列1的SYBR GREEN荧光增量＝95℃目标靶序列1的FAM探针荧光强度增量*β；
60℃目标靶序列2的SYBR GREEN荧光增量＝95℃目标靶序列2的ROX探针荧光强度增量*η；
进一步，目标靶序列3荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃目标靶序列1的FAM探针荧光增量*α-95℃目标靶序列1FAM探针荧光强度增量*β-95℃目标靶序列2ROX探针荧光强度增量*η
最后，若差异值大于阈值，则判靶序列3有扩增产物；若差异值小于阈值，则判定靶序列3没有扩增产物。
本发明第二方面提供了第一方面所述的检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法在人致病性病原体、水产生物致病性病原体、农牧养殖业中病原体、植物病源微生物、动植物转基因和食品安全领域中检测特异性核酸的应用。
需要说明的是，此处“特异性核酸”是指某种病原体、病原微生物或动植物中某段保守区基因的核酸序列或某个样品中独有的特异性核酸序列。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明提供的检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，能够利用较少的荧光通道数检测更多的靶点，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
确定系数α、β、γ、η和δ的取值，现进行以下实验：
不同温度下SYBR GREEN I染料与FAM、ROX探针确定荧光强度系数试验。
以疱疹病毒设计的FAM、VIC、ROX、CY5探针和SYBR GREEN I为例。
试验见表1：
表1
每个试验进行两个平行试验，并进行多次重复。
荧光强度系数试验反应程序见表2。
表2
测试统计后荧光强度数据见表3。
表3
分别计算α、β、γ、η和δ的关系系数的取值：
(i)α代表95℃FAM探针与60℃FAM探针关系系数，α＝60℃FAM探针光强/95℃FAM探针光强。
根据表3的数据计算，α＝(α1+α2)/2＝(1773/1160+2007/1292)/2≈1.54。
(ii)β代表95℃FAM探针与60℃荧光染料关系系数，β＝60℃荧光染料光强/95℃FAM探针光强；
根据表3的数据计算，β＝[(314+405)/2]/[(1160+1292)/2]≈0.29。
(iii)γ代表95℃VIC探针与60℃荧光染料关系系数，γ＝60℃荧光染料光强/95℃VIC探针光强；
γ＝[(314+405)/2]/[(1213+1153)/2]≈0.33。
(iiii)η代表95℃ROX探针与60℃荧光染料关系系数，η＝60℃荧光染料光强/95℃ROX探针光强；
根据表3的数据计算，η＝[(314+405)/2]/[(1653+1490)/2]≈0.23。
(iiiii)δ代表95℃CY5探针与60℃荧光染料关系系数，δ＝60℃荧光染料光强/95℃CY5探针光强；
根据表3的数据计算，δ＝[(314+405)/2]/[(1580+1681)/2]≈0.22。
通过上述试验多次验证，最终确定了系数α、β、γ、η和δ的取值，可以直接用于后续实施例中。
实施例1
一种基于双通道检测三靶点的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)使用Applied Biosystems 7500型定量PCR仪，检测疱疹病thymidine kinase基因和杯状病毒衣壳蛋白ORF2基因和衣原体ompA基因的高度保守区序列，用Primerexpress3.0.1设计引物探针如下表4。
表4
(2)配制PCR体系，荧光定量PCR反应体系如下表5。
表5
| 体积(uL) | 终浓度 | |
| 4×Hifair V Lyo-Buffer | 6 | 1x |
| MgCl2 | 2.5 | 1mM |
| 10×Hifair V Lyo-Enzyme | 0.1 | |
| 杯状-F | 1 | 0.4μM |
| 杯状-R | 1 | 0.4μM |
| 杯状-P | 0.5 | 0.2μM |
| 疱疹-F | 1 | 0.4μM |
| 疱疹-R | 1 | 0.4μM |
| 疱疹-P | 0.5 | 0.2μM |
| 衣原体-F | 1 | 0.4μM |
| 衣原体-R | 1 | 0.4μM |
| SYBR GREEN I | 2 | 0.5× |
| 模板 | 2 | |
| RNase Free H2O | 5.4 | |
| 25 |
(3)设定PCR程序，荧光定量PCR反应体系如下表6。
表6
(4)衣原体扩增后结果。
表7
衣原体的荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃FAM探针荧光增量*α-95℃FAM探针荧光强度增量*β-95℃ROX探针荧光强度增量*η。
最后，衣原体的荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃FAM探针荧光增量*1.54-95℃FAM探针荧光强度增量*0.29-95℃ROX探针荧光强度增量*0.23。
根据表7的荧光强度结果，并依据上述公式计算获得下表8中的数据。
表8
设定荧光信号强度差异值的阈值为205.26，衣原体荧光强度增量＝1117.11＞205.26，则衣原体判断结果为：阳性。
实施例2
一种基于三通道检测四靶点的实时荧光PCR检测方法，
参照实施例1的方法进行，不同的是检测疱疹病毒thymidine kinase基因、杯状病毒衣壳蛋白ORF2基因、衣原体ompA基因和支原体16S ribosomal RNA的高度保守区序列，用Primer express3.0.1设计引物探针如下表9。
表9
(2)配制PCR体系，荧光定量PCR反应体系如下表10。
表10
| 体积(uL) | 终浓度 | |
| 4×Hifair V Lyo-Buffer | 6 | 1x |
| MgCl2 | 2.5 | 1mM |
| 10×Hifair V Lyo-Enzyme | 0.1 | |
| 杯状-F | 1 | 0.4μM |
| 杯状-R | 1 | 0.4μM |
| 杯状-P | 0.5 | 0.2μM |
| 疱疹-F | 1 | 0.4μM |
| 疱疹-R | 1 | 0.4μM |
| 疱疹-P | 0.5 | 0.2μM |
| 衣原体-F | 1 | 0.4μM |
| 衣原体-R | 1 | 0.4μM |
| 衣原体-P | 0.5 | 0.2μM |
| 支原体-F | 1 | 0.4μM |
| 支原体-R | 1 | 0.4μM |
| SYBR GREEN I | 2 | 0.5× |
| 模板 | 2 | |
| RNase Free H2O | 2.9 | |
| 25 |
(3)设定PCR程序，荧光定量PCR反应体系如下表11。
表11
(4)支原体扩增后结果。
表12
支原体的荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃FAM探针荧光增量*α-95℃FAM探针荧光强度增量*β-95℃ROX探针荧光强度增量*η-95℃CY5探针荧光强度增量*δ。
最后，支原体的荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃FAM探针荧光增量*1.54-95℃FAM探针荧光强度增量*0.29-95℃ROX探针荧光强度增量*0.23-95℃CY5探针荧光强度增量*0.22。
根据表12的荧光强度结果，并依据上述公式计算获得下表13中的数据。
表13
设定荧光信号强度差异值的阈值为316.6，支原体荧光强度增量＝2100.707＞316.6，则支原体判断结果为：阳性。
实施例3
一种基于四通道检测五靶点的实时荧光PCR检测方法，
参照实施例2的方法进行，不同的是检测疱疹病毒thymidine kinase基因、杯状病毒衣壳蛋白ORF2基因、衣原体ompA基因和支原体16S ribosomal RNA和支气管败血波氏杆菌(Bb)的高度保守区序列，用Primer express3.0.1设计引物探针如下表14。
表14
(2)配制PCR体系，荧光定量PCR反应体系如下表15。
表15
| 体积(uL) | 终浓度 | |
| 4×Hifair V Lyo-Buffer | 6 | 1x |
| MgCl2 | 2.5 | 1mM |
| 10×Hifair V Lyo-Enzyme | 0.1 | |
| 杯状-F | 1 | 0.4μM |
| 杯状-R | 1 | 0.4μM |
| 杯状-P | 0.5 | 0.2μM |
| 疱疹-F | 1 | 0.4μM |
| 疱疹-R | 1 | 0.4μM |
| 疱疹-P | 0.5 | 0.2μM |
| 衣原体-F | 1 | 0.4μM |
| 衣原体-R | 1 | 0.4μM |
| 衣原体-P | 0.5 | 0.2μM |
| 支原体-F | 1 | 0.4μM |
| 支原体-R | 1 | 0.4μM |
| 支原体-P | 0.5 | 0.2μM |
| Bb-F | 1 | 0.4μM |
| Bb-R | 1 | 0.4μM |
| SYBR GREEN I | 2 | 0.5× |
| 模板 | 2 | |
| RNase Free H2O | 0.4 | |
| 25 |
(3)设定PCR程序，荧光定量PCR反应体系如下表16。
表16
(4)Bb扩增后结果。
表17
Bb的荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃FAM探针荧光增量*α-95℃FAM探针荧光强度增量*β-95℃ROX探针荧光强度增量*η-95℃CY5探针荧光强度增量*δ-95℃VIC探针荧光强度增量*γ。
最后，Bb的荧光强度增量＝60℃FAM通道总荧光增量-95℃FAM探针荧光增量*1.54-95℃FAM探针荧光强度增量*0.29-95℃ROX探针荧光强度增量*0.23-95℃CY5探针荧光强度增量*0.22-95℃VIC探针荧光强度增量*0.33。
根据表17的荧光强度结果，并依据上述公式计算获得下表18中的数据。
表18
设定荧光信号强度差异值的阈值为452.1，Bb荧光强度增量＝2513.387＞452.1，则Bb判断结果为：阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津微纳芯科技有限公司 微纳芯（苏州）科技有限公司
<120> 检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法及其应用
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 杯状病毒的上游引物
<400> 1
tgatgtgttc gaagtttgag c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 杯状病毒的下游引物
<400> 2
ggggtcccaa tcatagtatt taa 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ROX探针
<400> 3
tgtgctcaac ctgcgctaac gtg 23
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 杯状病毒的扩增片段
<400> 4
tgatgtgttc gaagtttgag catgtgctca acctgcgcta acgtgcttaa atactatggt 60
tgggatcccc 70
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 疱疹病毒的上游引物
<400> 5
ccacaataac aggatatcag aaagttg 27
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 疱疹病毒的下游引物
<400> 6
ggcgagaggg tgtctatcta tga 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAM探针
<400> 7
atgtgaggaa caccccgacg tgacc 25
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 疱疹病毒的扩增片段
<400> 8
ccacaataac aggatatcag aaagttgtat gtgaggaaca ccccgacgtg accc 54
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衣原体的上游引物
<400> 9
gaactgcaag caacaccact g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衣原体的下游引物
<400> 10
ccattcggca tcttgaagat g 21
<210> 11
<211> 170
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 衣原体的扩增片段
<400> 11
gaactgcaag caacaccact gtcgctgccg acagatcaaa ttttgcctac ggcaaacatc 60
ttcaagatgc cgaatggtgc accaatgctg cttacttagc attaaatatt tgggatcgtt 120
ttgatgtttt ctgcacgcta ggagcgtcta atggttactt caaagcaagt 170
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CY5探针
<400> 12
cgctgccgac agatcaaatt ttgcc 25
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 支原体的上游引物
<400> 13
gcgaaagcct gatggag 17
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 支原体的下游引物
<400> 14
gccgttgctt tctgataag 19
<210> 15
<211> 159
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 支原体的扩增片段
<400> 15
gcgaaagcct gatggagcga cacagcgtgc aggatgaagg ccttcgggtt gtaaactgct 60
gttataaggg aagatcaaat attataagaa aagataatat cttgacggta ccttatcaga 120
aagcaacggc taactatgtg ccagcagccg cggtaatac 159
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VIC探针
<400> 16
acacagcgtg caggatgaag gc 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bb高度保守区的上游引物
<400> 17
cgtcgtccac ctgctcaag 19
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bb高度保守区的下游引物
<400> 18
gcgaacatgg ttttgtctca gatcga 26
<210> 19
<211> 213
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bb高度保守区的扩增片段
<400> 19
gagatacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga attttccaca atgggcgaaa 60
gcctgatgga gcgacacagc gtgcaggatg aaggccttcg ggttgtaaac tgctgttata 120
agggaagatc aaatattata agaaaagata atatcttgac ggtaccttat cagaaagcaa 180
cggctaacta tgtgccagca gccgcggtaa tac 213
Claims (10)
1.一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)当荧光通道数为m，检测n个靶序列，且n>m时，根据n个靶序列分别设计n对特异性引物和m个荧光探针；其中，m为≥1的正整数，n为≥2的正整数；
(2)配制PCR体系，所述PCR体系包括n对特异性引物、m个荧光探针和n-m个荧光染料；m个靶序列分别采用第一、第二、......第m荧光探针检测，n-m个靶序列分别采用第一、第二、......第n-m荧光染料检测；
其中，检测荧光染料的荧光通道与至少一种检测荧光探针的荧光通道相同；
(3)设定PCR程序，设定预变性的第一温度和第一时间，变性的第二温度和第二时间，退火延伸的第三温度和第三时间，循环次数：
其中，在PCR扩增的整个循环过程中，在第二温度时采集荧光探针的荧光信号，以及在第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，分别记录荧光信号强度；
(4)依据步骤(3)记录的荧光信号强度，计算n-m个靶序列的荧光信号强度差异值；若差异值大于阈值，则判定n-m个靶序列有扩增产物；若差异值小于阈值，则判定n-m个靶序列没有扩增产物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述m为1、2、3、4、5、6、7或8，所述n为2、3、4、5、6、7、8或9；
优选地，所述m为2、3、4、5或6，所述n为3、4、5、6或7；
优选地，n-m＝1。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述PCR程序的条件包括：第一温度为94-97℃，第一时间为2-10min；第二温度为94-97℃，第二时间为5-30s；第三温度为45-75℃，第三时间为10-60s；循环次数为30-50次。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述步骤(3)中，在前2-15个和后2-15个循环的第三温度时采集荧光信号；
优选地，所述步骤(3)中，在前2-5个和后2-5个循环的第三温度时采集荧光信号。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其中，当n-m＝1时，靶序列n的荧光强度增量＝(第三温度时采集的第一荧光染料的总荧光强度增量A)-(第三温度时采集的靶序列1的第一荧光染料的荧光强度增量A1+第三温度时采集的靶序列2的第一荧光染料的荧光增量A2+......+第三温度时采集的靶序列m的第一荧光染料的荧光强度增量Am)。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，当m＝2，n＝3，检测第一荧光染料和检测靶序列1的第一荧光探针的荧光通道相同时，所述第三温度时采集的第一荧光染料的荧光强度增量A’＝第三温度时采集第一荧光染料的总荧光强度增量A-第二温度时采集的靶序列1的第一荧光探针的荧光强度增量a1*α；其中，所述α为第一荧光探针在第二温度和第三温度时显示荧光强度有差异的关系系数。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其中，所述第三温度时采集的靶序列1的第一荧光染料的荧光强度增量A1＝第二温度时采集的靶序列1的第一荧光探针的荧光强度增量a1*β，所述β为第一荧光探针在第二温度时与第一荧光染料在第三温度时显示荧光强度有差异的关系系数；
优选地，所述第三温度时采集的靶序列2的第一荧光染料的荧光强度增量A2＝第二温度时采集的靶序列2的第二荧光探针的荧光强度增量a2*η，所述η为第二荧光探针在第二温度时与第一荧光染料在第三温度时显示荧光强度有差异的关系系数。
8.根据权利要求5-7任一项所述的检测方法，其中，当m＝2，n＝3时，所述靶序列3的荧光强度增量＝(第三温度时采集的第一荧光染料的总荧光强度增量A)-(第二温度时采集的第一荧光探针的荧光强度增量a1*α+第二温度时采集的第一荧光探针的荧光强度增量a1*β+第二温度采集的第二荧光探针的荧光强度增量a2*η)。
9.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其中，所述荧光探针为TaqMan探针；
优选地，所述TaqMan探针选自FAM探针、ROX探针、Cy3探针、Cy5探针、TET探针、HEX探针、JOE探针和TAMRA探针中的一种或多种；
优选地，所述荧光染料选自SYBR Green Ⅰ、Eva Green和LC Green中的一种或多种。
10.权利要求1-9任一项所述的检测方法在人致病性病原体、水产生物致病性病原体、农牧养殖业中病原体、植物病源微生物、动植物转基因和食品安全领域中检测特异性核酸的应用。
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