CN112899349B - 同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法及其应用 - Google Patents

同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：1)制备反应混合物，其中所述反应混合物包含一种或多种模板DNA、DNA聚合酶、DNA切刻酶1、DNA切刻酶2和一种或多种探针；2)将步骤1)获得的反应混合物置于恒定温度下，进行恒温指数扩增反应；3)制备胶体金检测缓冲液；4)使步骤2)的反应产物与步骤3)的缓冲液混合，放入胶体金试纸条检测，并根据检测条带解读结果。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的方法采用试纸条目视读取，操作简单，对专业技能要求低，不需要专门的技术培训，极大地扩展其应用范围；并大幅降低了检测成本。

Description

同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种同时检测一种或多种靶标核酸的 可视化核酸检测方法及其应用。
背景技术
随着分子生物学技术的迅速发展，核酸已经成为生物学研究和疾病诊断 中的重要生物标志物，并已建立起大量基于核酸检测的分析方法。体外核酸 扩增是核酸分析中的一个重要环节，也是方法灵敏度、特异性等重要技术参 数指标的保证。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是目前最常见的核 酸扩增技术，已成为分子生物学、基因组学、疾病诊断等领域的基本研究手 段。PCR反应过程包括变性、退火和延伸三个阶段，因此该技术依赖于特殊 精密的热循环设备，对操作要求高且耗时可长达2-3小时，从而限制了该技 术在资源有限或实地分析中的应用。
恒温指数扩增反应(Exponential Amplification Reaction，EXPAR)是由D.J.Galas等在2003年建立起来的一种基于DNA聚合酶和切口酶设计的 高效核酸扩增技术。该技术的原理为：应用一条中间包含切口酶识别序列， 3’端与5’端序列完全相同的模板，当引物与模板的3’端杂交后，在聚合酶 的作用下进行线型扩增。扩增后，内切酶识别并切割5’端扩增出来的片段， 该片段在DNA聚合酶的链置换作用下被释放出来，进一步与另一条模板 的3’端进行杂交和扩增，形成指数形式的扩增。该方法可以在恒温条件下 对短链核酸(10-25碱基)进行高效、快速的指数扩增，一般在几分钟内 可对目标核酸放大106-109倍。与PCR扩增技术相比，恒温指数扩增方法 所需时间短，不需要精确的热循环装置，其扩增倍数足以与PCR技术媲美。 因此，恒温扩增EXPAR已经成功用于核酸、蛋白、酶活性和金属离子检测。
然而，当前EXPAR技术中，相应的信号读取方法有荧光法、比色法、 化学发光法，拉曼光谱检测法和电化学法等。这些方法的最终读取都要有相 应的特殊仪器，比如，荧光定量PCR仪、荧光光谱仪、酶标仪、拉曼光谱 仪和电化学工作站等。
现有文献教导了恒温指数扩增反应技术，其中所述模板DNA含两段待 检测microRNA的互补序列，两段序列之间用DNA切刻酶识别序列连接。 当microRNA与模板结合后，进行EXPAR扩增反应，然后通过qPCR仪或 荧光光谱仪实时检测syber Green 1信号读取扩增结果(Jia H,Li Z,Liu C, Cheng Y.Ultrasensitive detection of microRNAs byexponential isothermal amplification.Angew Chem Int Ed Engl.2010；49(32):5498-5501. doi:10.1002/anie.201001375)。或者，在使用恒温指数扩增反应的检测体系中 端粒酶底物TS的5’端有DNA切刻酶识别位点，还有一个带发卡结构的 taqman探针。端粒酶延伸TS后，taqman探针结合到延伸产物上，经过DNA 切刻-延伸-链置换循环，taqman探针上的荧光信号被释放。通过qPCR仪或 荧光光谱仪实时检测荧光信号读取扩增结果(Tian L,Weizmann Y.Real-time detection of telomerase activity using the exponentialisothermal amplification of telomere repeat assay.J Am Chem Soc.2013；135(5):1661-1664. doi:10.1021/ja309198j)。
CN104278088A公开了一种基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测 的miRNA检测方法及其应用，该方法结合恒温指数扩增反应(EXPAR)和 表面增强拉曼光谱(SERS)技术，包括如下步骤：通过恒温指数扩增反应 扩增待测miRNA；将扩增产物、捕获探针-金属纳米颗粒复合物以及报告探 针进行混合杂交，再将杂交产物转移到硅片上，进行SERS检测。
显然地，现有技术中基于EXPAR的检测方法均受到检测仪器的限制， 因此，当前对操作更简单的检测方法存在需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种同时检测一种或多种靶 标核酸的可视化核酸检测方法，本发明的方法将恒温指数扩增反应与胶体金 检测技术相结合，从而实现了核酸的可视化检测。本发明提供的方法通过肉 眼观察即可以实现快速、高效、高灵敏且高特异的检测一种或多种靶标核酸， 在疾病的生物标志物检测中有广阔的应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一方面，本发明提供了一种同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸 检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备反应混合物，其中所述反应混合物包含一种或多种模板DNA、 DNA聚合酶、DNA切刻酶1、DNA切刻酶2和一种或多种探针；
其中，所述一种或多种模板DNA的5’端含两段触发序列的互补序列(T’)，所述互补序列之间用DNA切刻酶1识别序列连接，而所述互补序列 中包含DNA切刻酶2识别位点，该位点被修饰；所述一种或多种模板DNA 的3’端是一种或多种靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种探针为包含触发序列或部分触发序列的一种或多种荧 光探针或taqman探针；
(2)将步骤(1)获得的反应混合物置于恒定温度下，进行恒温指数扩 增反应；
(3)制备胶体金检测缓冲液；
(4)使步骤(2)的反应产物与步骤(3)的缓冲液混合，放入胶体金 试纸条检测，并根据检测条带解读结果。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，其中，在步骤1)中，所述反应混合物还包含反应缓冲液和dNTPs。
在一个优选的实施方案中，所述反应混合物包含1×缓冲液1.1、0.25 mM dNTPs、10nM模板DNA和1μM探针。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，其中，在步骤1)中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶、bsm DNA 聚合酶、Bsu DNA聚合酶、VentExo-DNA聚合酶或Klenow Exo-DNA聚合 酶。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，其中，所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2相同或不同；优选地，所 述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2选自Nb.BtsI切刻酶、Nb.BbvCI切刻酶、 Nb.Bpu10I切刻酶、Nb.Mva1269I切刻酶、Nt.BstNBI切刻酶、Nb.BssSI切刻 酶、Nb.BsrDI切刻酶、Nt.BspQI切刻酶、Nt.BsmAI切刻酶、Nb.BsmI切刻酶和Nt.AlwI切刻酶中的一种或两种。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，其中，在步骤1)中，所述一种或多种探针为一种或多种荧光探针， 所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和生物素基团，或者所述探针序列 的两端分别修饰荧光基团和地高辛基团，或者所述探针序列的两端分别修饰 荧光基团和5-溴脱氧尿嘧啶核苷，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基 团和胆固醇。
优选地，所述探针序列的一端标记生物素，另一端标记异硫氰酸荧光 素(FITC)或6-羧基荧光素(6-FAM)；或者所述探针序列的一端标记地 高辛，另一端标记异硫氰酸荧光素(FITC)或6-羧基荧光素(6-FAM)； 或者所述探针序列的一端标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)，另一端标记 6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记胆固醇(cholesterol)，另一 端标记6-羧基荧光素。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，在步骤1)中，所述互补序列中包含的DNA切刻酶2的识别位点被修 饰以抑制切刻酶活性；优选地，所述修饰为硫代修饰或甲基化修饰。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，其中，所述温度为22℃～65℃；优选为55℃。
根据本发明所述的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方 法，其中，在步骤1)中，
所述一种或多种模板DNA是一种模板DNA，其3’端是所述靶标核酸的 互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是两种模板DNA，其3’端分别是两种靶标核 酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是三种模板DNA，其3’端分别是三种靶标核 酸的互补或部分互补序列；或
所述一种或多种模板DNA是四种模板DNA，其3’端分别是四种靶标核 酸的互补或部分互补序列；
以此类推。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒包含反应混合物， 所述反应混合物包含一种或多种模板DNA、DNA聚合酶、DNA切刻酶1、 DNA切刻酶2和一种或多种探针；
其中，所述一种或多种模板DNA的5’端含两段触发序列的互补序列 (T’)，所述互补序列之间用DNA切刻酶1识别序列连接，而所述互补序列 中包含DNA切刻酶2识别位点，该位点被修饰；所述一种或多种模板DNA 的3’端是一种或多种靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种探针为包含触发序列或部分触发序列的一种或多种荧 光探针或taqman探针；
所述试剂盒还包含胶体金检测缓冲液和胶体金试纸条。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述反应混合物还包含反应缓冲液 和dNTPs。
在一个优选的实施方案中，所述反应缓冲液包含1×缓冲液1.1、0.25 mM dNTPs、10nM模板DNA和1μM探针。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶、 bsm DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Vent Exo-DNA聚合酶或Klenow Exo-DNA聚合酶。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2 相同或不同；优选地，所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2选自Nb.BtsI切 刻酶、Nb.BbvCI切刻酶、Nb.Bpu10I切刻酶、Nb.Mva1269I切刻酶、Nt.BstNBI 切刻酶、Nb.BssSI切刻酶、Nb.BsrDI切刻酶、Nt.BspQI切刻酶、Nt.BsmAI 切刻酶、Nb.BsmI切刻酶和Nt.AlwI切刻酶中的一种或两种。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述一种或多种探针为一种或多种荧 光探针，所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和生物素基团，或者所述 探针序列的两端分别修饰荧光基团和地高辛基团，或者所述探针序列的两 端分别修饰荧光基团和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)，或者所述探针序列的 两端分别修饰荧光基团和胆固醇。
优选地，所述探针序列的一端标记生物素，另一端标记异硫氰酸荧光 素(FITC)或6-羧基荧光素(6-FAM)；或者所述探针序列的一端标记地 高辛，另一端标记异硫氰酸荧光素(FITC)或6-羧基荧光素(6-FAM)； 或者所述探针序列的一端标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷，另一端标记6-羧基荧 光素；或者所述探针序列的一端标记胆固醇(cholesterol)，另一端标记6- 羧基荧光素。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述互补序列中包含的DNA切刻酶 2识别位点被修饰以抑制切刻酶活性；优选地，所述修饰为硫代修饰或甲基 化修饰。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述一种或多种模板DNA是一种模 板DNA，其3’端是所述靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是两种模板DNA，其3’端分别是两种靶标核 酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是三种模板DNA，其3’端分别是三种靶标核 酸的互补或部分互补序列；或
所述一种或多种模板DNA是四种模板DNA，其3’端分别是四种靶标核 酸的互补或部分互补序列，以此类推。
再一方面，本发明提供了所述方法或所述试剂盒用于检测可以产生已知 核酸序列的游离3’末端的检测物的用途；。
优选地，所述检测物为以microRNA为代表的微小RNA、端粒酶、核 酸特异切刻酶或改变核酸结构的金属离子。
结合说明书附图1，根据本发明所述的恒温指数扩增的反应机制简述如 下：模板DNA 5’端含两段触发序列的互补序列(T’)，两段序列之间用DNA 切刻酶1识别序列连接，而T’序列含特殊修饰的DNA切刻酶2识别位点。 模板DNA 3’端是靶标核酸的互补或部分互补序列，所述模板DNA 3’末端是 磷酸基团；探针序列是触发序列的互补或部分互补序列，两端分别由荧光基 团和生物素基团修饰，或者两端分别由荧光基团和地高辛基团修饰。
当靶标核酸与模板结合后，靶标核酸被DNA聚合酶沿模板延伸，延伸 出来的双链DNA在DNA切刻酶1识别位点被切开形成一个切口，切口的3’ 端继续被延伸，同时DNA聚合酶的链置换活性释放新合成的触发序列，触 发序列结合到新的模板DNA上进行新一轮的扩增，而原来靶标核酸会持续 进行着切割-延伸-链置换释放的循环，最终实现恒温指数扩增反应。EXPAR 产生大量触发序列单链DNA，触发序列与报告探针结合后，DNA切刻酶2 切断报告探针。整个反应在55℃反应完毕后，在反应体系中加入胶体金检测 试纸条检测缓冲液，混匀后放入试纸条，室温放置3分钟，等检测物在试纸 条扩散稳定后，通过试纸条上的检测条带信号判断目标检测物。整个检测过 程中只用到恒温加热仪、移液器等简易的仪器。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的方法采用试纸条目视读取，操作简单，对专业技能要求低， 不需要专门的技术培训，极大地扩展其应用范围；
2.本发明可以同时检测多个核酸靶标；
3.并且可以检测低至pM浓度的核酸靶标，结果灵敏，准确，可信度高；
4.本发明的方法不再依赖qPCR仪、荧光光谱仪、拉曼光谱仪等昂贵的 仪器，大幅降低了检测成本；
5.本发明的方法应用于包括肿瘤、心血管疾病等疾病早期诊断，以及核 酸的及时检测等领域，应用广泛。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为根据本发明的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测 方法的原理图；
图2为根据本发明的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测 方法的流程图和使用的仪器和试剂的图片；
图3为根据本发明的方法，在一个示例性实施方案中检测一种靶标核 酸时的结果示意图；其中，
图3A的凝胶电泳结果表明，在有靶标时，检测探针被特异的切割；
图3B是根据本发明的方法检测一种靶标核酸时的原理，如图所示， 当没有靶标的时候，完整的探针被试纸条位置被覆的链酶亲和素捕获，形 成明显的胶体金信号条带(c)；当有靶标时，探针被切割，FAM标记的一 端同胶体金一起被释放，继续迁移到抗体区域被捕获，形成特异的检测条 带(t)；
图3C是用试纸条读取的信号，当有靶标时试纸条检测到特异的检测 条带；
图4为根据本发明的方法，在一个示例性实施方案中检测端粒酶的延 伸产物的结果；其中，
图4A是一次实验的结果，t指示的检测信号带，c指示质控带；试纸条 从左到右的编号1、2、3、4、5、6分别代表空白组，1nM TS、100pM TS-1、 100pM TS-2、100pM TS-3、100pMTS-4；
图4B是对三次实验的统计结果，将检测信号带的强度(It)与检测信号 带和质控带(Ic)的总强度(It+Ic)的比值作为靶标信号值；结果显示，以 人工合成的端粒酶延伸产物为例，使用本发明的方法可以检测到TS延伸了 一至四段重复序列度的产物(TS-1、TS-2、TS-3、TS-4)；
图5为根据本发明的方法，在一个示例性实施方案中检测不同浓度 TS-3的结果；其中，
图5A试纸条从左到右的编号1、2、3、4、5分别代表空白组、1pM TS-3、 10pM TS-3、100pM TS-3、1nM TS-3；
图5B是对三次实验的统计结果，结果显示，本发明方法最低可以检测 到1pM TS-3。
图6为根据本发明的方法，在一个示例性实施方案中检测microRNA let-7a的结果；其中，
图6A试纸条从左到右的编号1、2、3、4、5、6分别代表空白组、1nM 随机序列对照(NC)、1pM let-7a、10pM let-7a、100pM let-7a、1nM let-7a；
图6B是对三次实验的统计结果，结果显示，本发明方法最低可以检测 到10pMlet-7a。
图7为根据本发明的方法，在一个示例性实施方案中同时检测 microRNA let-7a、microRNA let-7b的结果；其中，
图7A是根据本发明的方法，同时检测microRNA let-7a、microRNA let-7b的原理示意图，如图所示，当没有靶标时，一端标记地高辛，另一 端标记FAM的let-7a检测探针被地高辛抗体捕获，而一端标记生物素，另 一端标记FAM的let-7b检测探针被链酶亲和素捕获。当有靶标时，探针 被切割，FAM标记的一端同胶体金一起被释放，继续迁移到抗体捕获区域 形成特异的条带；图7B试纸条从左到右的编号1、2、3、4、5分别代表靶 标microRNAlet-7a、靶标microRNA let-7b、靶标microRNA let-7a与 microRNA let-7b、1nM随机序列对照(NC)、空白组。
具体实施方式
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。应当理解，实施例仅用于进 一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术 人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述 相似或相同的方法和材料，但本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在 相冲突的情况下，以本说明书包括其中的定义为准。另外，材料、方法和例 子仅供说明，而不具限制性。
实施例1：本发明的实验材料和方法步骤
本发明中所使用的材料和引物序列如表1和表2所示；其中，所述DNA 和RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
其中，Bst DNA聚合酶(M0275S)、Nb.BbvCI(R0631S)、Nb.BtsI(R0707S)、 10Xbuffer 1.1(100mM Bis-Tris-HCl pH7、100mM MgCl2、1mg/mL BSA) 等购自NEB。HybriDetect试纸条检测试剂盒(MGHD 1，MGHD 2)购自 Milenia Biotec GmbH公司(德国)。
表1使用的引物以及序列
Figure BDA0002815459900000091
*代表硫代修饰
结合图1和图2详细地描述了本发明的示例性实验步骤，具体如下：
1.引物用DEPC水溶解，再用nanodrop测得OD260值，根据公式A＝εbc (A为OD260nm的吸光值，ε是摩尔吸消光系数，b是光程，c是物质的量 浓度)算出引物的物质的量浓度。
2.EXPAR反应组分
在配置样品时分成A、B管，每个反应总体积10μL，配置过程保持样 品在4℃左右。在200μL PCR管中依次按顺序加入表2所述的试剂为A管， 在200μL PCR管中依次按顺序加入表3所述的试剂为B管：
表2 A管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
100nM模板DNA 1
10μM报告探针 1
2.5mM dNTP 1
待检测核酸 1
表3 B管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
10U/μL Nb.BbvCI 0.25
8U/μL Bst DNA聚合酶 0.125
10U/μL Nb.BtsI 0.25
500ng/μL ET SSB 0.1
水 4.275
将A、B管中的组分混匀之后，放置于55℃孵育。
3.胶体金试纸检测
取出4℃保存的Hybri Detect试纸条检测试剂盒，让检测缓冲液恢复到 室温。EXPAR反应结束之后，每个样品加入100μL检测缓冲液，混匀后放 入试纸条。室温放置3分钟，待检测物在试纸条扩散稳定后通过试纸条上的 检测条带信号判断目标检测核酸。
实施例2：本发明的方法原理验证
根据图1原理，模板DNA为Pre-TrigTel，如SEQ ID NO:1所示，其中 3’端序列为:CTAACCCTAACCCTAACCCTAA。配置反应样品时按次序加入 如下组分：
表4 A管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
100nM TrigTel 1
10μM MB-TrigTel 1
2.5mM dNTP 1
100nM TS-3 1
表5 B管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
10U/μL Nb.BbvCI 0.25
8U/μL Bst DNA聚合酶 0.125
10U/μL Nb.BtsI 0.25
500ng/μL ET SSB 0.1
水 4.275
每个反应总体积10μL，配置样品过程中保持样品在4℃左右。为了验 证本发明方案的原理，控制依次加入的切刻酶，将A、B混匀后放于55℃下 孵育35分钟，加EDTA终止反应，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。实验 结果表明，当只有切刻酶Nb.BbvCI时EXPAR反应产生大量触发序列(图 3A样品4、5)。而再加入切刻酶Nb.BtsI与报告探针后，靶标扩增产生的触 发序列诱导报告探针被切割(图3A样品6、7)，并被试纸条所检测(图3C)。
实施例3：使用本发明的方法检测端粒酶延伸产物
根据图1原理，模板DNA为Pre-TrigTel，如SEQ ID NO:1所示，其中 3’端序列为:CTAACCCTAACCCTAACCCTAA。配置反应样品时按次序加入 如下组分：
表6 A管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
100nM TrigTel 1
10μM MB-TrigTel 1
2.5mM dNTP 1
TS/TS-1/TS-2/TS-3/TS-4 1
表7 B管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
10U/μL Nb.BbvCI 0.25
8U/μL Bst DNA聚合酶 0.125
10U/μL Nb.BtsI 0.25
500ng/μL ET SSB 0.1
水 4.275
每个反应总体积10μL，配置样品过程中保持样品在4℃左右。在测试 检测端粒酶延伸产物实验中，TS浓度为1nM，TS延伸1至4段TTAGGG 重复序列对应的产物TS-1、TS-2、TS-3和TS-4浓度为100pM，将A、B 混匀后放于55℃下孵育35分钟，反应结束后加入100μL检测缓冲液，充分 混匀放入HybriDetect试纸条检测。样品孵育3分钟，充分扩散稳定，通过 试纸条上的检测条带信号判断目标检测结果。
结果如图4所示。图4A是一次实验的结果，t指示的检测信号带，c指 示质控带。试纸条从左到右的编号1、2、3、4、5、6分别代表空白组、1nM TS、100pM TS-1、100pM TS-2、100pM TS-3、100pM TS-4；图4B是对 三次实验的统计结果，将检测信号带的强度(It)与检测信号带和质控带(Ic) 的总强度(It+Ic)的比值作为靶标信号值。结果显示，以人工合成的端粒酶 延伸产物为例，使用本发明的方法可以检测到TS延伸了一至四段重复序列 度的产物(TS-1，TS-2，TS-3，TS-4)。
实施例4：使用本发明的方法检测端粒酶延伸产物TS-3的灵敏性
根据实施例3的方法，使用实施例3中的反应体系，在测试检测极限试 验中，将TS-3浓度依次稀释为1pM、10pM、100pM、1nM每个浓度靶标 做三个平行样品，将A、B混匀后放于55℃下孵育35分钟，反应结束后加 入100μL检测缓冲液，充分混匀放入HybriDetect试纸条检测。样品孵育3 分钟，充分扩散稳定，通过试纸条上的检测条带信号判断目标检测结果。
结果如图5所示，表明根据本发明的方法检测端粒延伸产物TS-3的灵 敏性，其中图5A是一次实验的结果，t指示的检测信号带，c指示质控带； 试纸条从左到右的编号1、2、3、4、5分别代表空白组、1pM TS-3、10pM TS-3、100pM TS-3、1nM TS-3。图5B是对三次试验的统计结果，将检测 信号带的强度(It)与检测信号带和质控带(Ic)的总强度(It+Ic)的比值作 为靶标信号值。结果显示，使用本发明的方法，最低可以检测到1pM的TS-3。
实施例5：使用本发明的方法检测microRNA let-7a
根据图1原理设计，模板DNA为Pre-TrigL7a，如SEQ ID NO:2所示， 其中3’端序列为let-7a的互补序列AACTATACAACCTACTACCTCA。配置 反应样品时按次序加入如下组分：
表8 A管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
100nM TrigL7a 1
10μM MB-TrigTel 1
2.5mM dNTP 1
Let-7a 1
RiboLock RNase抑制剂(40U/μL) 0.25
表9 B管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
10U/μL Nb.BbvCI 0.25
8U/μL Bst DNA聚合酶 0.125
10U/μL Nb.BtsI 0.25
500ng/μL ET SSB 0.1
水 4.025
每个反应总体积10μL，配置样品过程保持样品在4℃左右。将A、B 混匀后放于55℃下孵育35分钟，反应结束后加入100μL检测缓冲液，充分 混匀放入HybriDetect试纸条检测，样品孵育3分钟，待产物充分扩散稳定， 通过试纸条上的检测条带信号判断目标检测结果。结果图显示本方法能检测 到10pM的let-7a，如图6A和图5B所示。
图6为根据本发明的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化检测 microRNA let-7a的结果。其中，图6A试纸条从左到右的编号1、2、3、4、 5、6分别代表空白组、1nM随机序列对照(NC)、1pM let-7a、10pM let-7a、 100pM let-7a、1nM let-7a；图6B是对三次实验的统计结果。
实施例6：使用本发明的方法同时检测microRNA let-7a和microRNA let-7b
根据图7A原理设计，模板DNA为Pre-L7a2T和Pre-TrigL7b，如SEQ ID NO:3和4所示，其中Pre-L7a2T的3’端序列为let-7a的互补序列 AACTATACAACCTACTACCTCA。其中Pre-TrigL7b的3’端序列为let-7b的 互补序列AACCACACAACCTACTACCTCA。配置反应样品时按次序加入如 下组分：
表10 A管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
100nM Pre-L7a2T 1
100nM Pre-TrigL7b 1
1μM MB-TrigTel 1
2μM MB-Trig2T 1
2.5mM dNTP 1
检测靶标(1nM) 1
RiboLock RNase抑制剂(40U/μL) 0.25
表11 B管反应体系的试剂
所添加试剂 μL/反应
10X Buffer 1.1 0.5
10U/μL Nb.BbvCI 0.25
8U/μL Bst DNA聚合酶 0.125
10U/μL Nb.BtsI 0.25
500ng/μL ET SSB 0.1
水 2.025
每个反应总体积10μL，配置样品过程保持样品在4℃左右。将A、B 混匀后放于55℃下孵育25分钟，反应结束后加入100μL检测缓冲液，充分 混匀放入HybriDetect 2T试纸条检测，样品孵育3分钟，待产物充分扩散稳 定，通过试纸条上的检测条带信号判断目标检测结果。结果图显示本方法能 同时检测到100pM的let-7a和let-7b，如图7A和图7B所示。
图7为根据本发明的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化同时检测 microRNAlet-7a和let-7b的结果。其中，
图7A是胶体金试纸条同时检测microRNAlet-7a、let-7b的原理示意图。 检测let-7a和let-7b的探针结合了胶体金颗粒分别被地高辛的抗体和链酶 亲核素捕获，在试纸条上显示指示带。当靶标经过等温扩增产生的触发序 列与检测探针结合并被DNA切刻酶2识别并切割，胶体金颗粒继续往前 移动，在最前端形成明显指示带；
图7B试纸条从左到右的编号1、2、3、4、5分别代表只有靶标microRNA let-7a、只有靶标microRNA let-7b、靶标microRNA let-7a与let-7b、1nM 随机序列对照(NC)、空白组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛大学附属医院
<120> 同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法及其应用
<130> DIC20110065
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcacactgc ctcagcacct cacactgcct cactaaccct aaccctaacc ctaa 54
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcacactgc ctcagcacct cacactgcct caaactatac aacctactac ctca 54
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatcactgc ctcagcacgc atcactgcct caaactatac aacctactac ctca 54
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcacactgc ctcagcacct cacactgcct caaaccacac aacctactac ctca 54
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcacactgcc tca 13
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcacactgcc tca 13
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatccgtcga gcagagtt 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatccgtcga gcagagttag gg 22
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatccgtcga gcagagttag ggttaggg 28
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatccgtcga gcagagttag ggttagggtt aggg 34
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatccgtcga gcagagttag ggttagggtt agggttaggg 40
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uucuccgaac gugucacgut t 21

Claims (20)

1.一种用于非疾病诊断目的的同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备反应混合物，其中所述反应混合物包含一种或多种模板DNA、DNA聚合酶、DNA切刻酶1、DNA切刻酶2和一种或多种探针；
其中，所述一种或多种模板DNA的5’端含两段触发序列的互补序列，所述互补序列之间用DNA切刻酶1识别序列连接，而所述互补序列中包含DNA切刻酶2识别位点，该位点被修饰以抑制切刻酶活性；所述一种或多种模板DNA的3’端是一种或多种靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2不同；
所述一种或多种探针为包含触发序列的互补或部分互补序列的一种或多种荧光探针；并且
所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和生物素基团，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和地高辛基团，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和5-溴脱氧尿嘧啶核苷，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和胆固醇；
(2)将步骤(1)获得的反应混合物置于恒定温度下，进行恒温指数扩增反应；
(3)制备胶体金检测缓冲液；
(4)使步骤(2)的反应产物与步骤(3)的缓冲液混合，放入胶体金试纸条检测，并根据检测条带解读结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，所述反应混合物还包含反应缓冲液、dNTPs。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、bsm DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Vent Exo-DNA聚合酶或Klenow Exo-DNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2选自Nb.BtsI切刻酶、Nb.BbvCI切刻酶、Nb.Bpu10I切刻酶、Nb.Mva1269I切刻酶、Nt.BstNBI切刻酶、Nb.BssSI切刻酶、Nb.BsrDI切刻酶、Nt.BspQI切刻酶、Nt.BsmAI切刻酶、Nb.BsmI切刻酶和Nt.AlwI切刻酶的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光探针为taqman探针。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述探针序列的一端标记生物素，另一端标记异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记地高辛，另一端标记异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷，另一端标记6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记胆固醇，另一端标记6-羧基荧光素。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰为硫代修饰或甲基化修饰。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述温度为22℃～65℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述温度为55℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，所述一种或多种模板DNA是一种模板DNA，其3’端是所述靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是两种模板DNA，其3’端分别是两种靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是三种模板DNA，其3’端分别是三种靶标核酸的互补或部分互补序列；或
所述一种或多种模板DNA是四种模板DNA，其3’端分别是四种靶标核酸的互补或部分互补序列。
11.同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测试剂盒，其中，所述试剂盒包含反应混合物，所述反应混合物包含一种或多种模板DNA、DNA聚合酶、DNA切刻酶1、DNA切刻酶2和一种或多种探针；
其中，所述一种或多种模板DNA的5’端含两段触发序列的互补序列，所述互补序列之间用DNA切刻酶1识别序列连接，而所述互补序列中包含DNA切刻酶2识别位点，该位点被修饰以抑制切刻酶活性；所述一种或多种模板DNA的3’端是一种或多种靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2不同；
所述一种或多种探针为包含触发序列的互补或部分互补序列的一种或多种荧光探针；
所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和生物素基团，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和地高辛基团，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和5-溴脱氧尿嘧啶核苷，或者所述探针序列的两端分别修饰荧光基团和胆固醇；和
所述试剂盒还包含胶体金检测缓冲液和胶体金试纸条。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述反应混合物还包含反应缓冲液和dNTPs。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶、bsm DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Vent Exo-DNA聚合酶或Klenow Exo-DNA聚合酶。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述DNA切刻酶1和DNA切刻酶2选自Nb.BtsI切刻酶、Nb.BbvCI切刻酶、Nb.Bpu10I切刻酶、Nb.Mva1269I切刻酶、Nt.BstNBI切刻酶、Nb.BssSI切刻酶、Nb.BsrDI切刻酶、Nt.BspQI切刻酶、Nt.BsmAI切刻酶、Nb.BsmI切刻酶和Nt.AlwI切刻酶中的一种或两种。
15.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述荧光探针为taqman探针。
16.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述探针序列的一端标记生物素，另一端标记异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记地高辛，另一端标记异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷，另一端标记6-羧基荧光素；或者所述探针序列的一端标记胆固醇，另一端标记6-羧基荧光素。
17.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述修饰为硫代修饰或甲基化修饰。
18.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述一种或多种模板DNA是一种模板DNA，其3’端是所述靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是两种模板DNA，其3’端分别是两种靶标核酸的互补或部分互补序列；
所述一种或多种模板DNA是三种模板DNA，其3’端分别是三种靶标核酸的互补或部分互补序列；或
所述一种或多种模板DNA是四种模板DNA，其3’端分别是四种靶标核酸的互补或部分互补序列。
19.如权利要求1至10中任一项所述的方法或如权利要求11至18中任一项所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的检测可以产生已知核酸序列的游离3’末端的检测物的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中，所述检测物为微小RNA、核酸特异切刻酶或改变核酸结构的金属离子。
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