CN105039321B

CN105039321B - 一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用

Info

Publication number: CN105039321B
Application number: CN201510383439.1A
Authority: CN
Inventors: 戴宗; 陈俊; 邹小勇
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2035-07-01
Also published as: CN105039321A

Abstract

本发明公开了一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用。本发明通过在常规指数扩增模板的5’端与引物互补的区域内的一碱基上修饰一生物素来调节引物与扩增模板3’端和5’端的杂交速度，建立了改进型恒温指数扩增方法。该方法较常规恒温指数扩增方法，具有扩增效率更高，速度更快的优点，而且标准曲线的线性范围更宽，特异性更好，灵敏度更高。本方法具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。

Description

一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用。

背景技术

恒温指数扩增反应（Isothermal Exponential Amplification Reaction，EXPAR）技术是由D.J.Galas等在2003年建立起来的一种基于DNA聚合酶和切口酶设计的高效核酸扩增技术。该技术的原理如图1所示：应用一条中间包含切口酶识别序列，3′端与5′端序列完全相同的模板，当引物与模板的3’端杂交后，在聚合酶的作用下进行线型扩增。扩增后，内切酶识别并切割5’端扩增出来的片段，该片段在DNA聚合酶的链置换作用下被释放出来，进一步与另一条模板的3’端进行杂交和扩增，形成指数形式的扩增。该方法可以在恒温条件下对短链核酸（10-25 碱基）进行高效、快速的指数扩增，一般在几分钟内可对目标核酸放大 10⁶-10⁹倍。与PCR扩增技术相比，恒温指数扩增方法所需时间短，不需要精确的热循环装置，其扩增倍数足以与PCR技术媲美。因此，恒温指数扩增反应技术已被广泛应用于短核酸的检测，特别是对microRNA（miRNA）的定量分析。

MiRNA是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA（18-24碱基）。它在动植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30% 的基因受miRNA调控，且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。由于miRNA的序列短，在细胞或者体液内的表达水平非常低、易降解且同源miRNA之间仅相差1-2个碱基，一般方法难以实现检测。Northern 印迹技术是当前分析miRNA的标准方法，但该方法操作繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对RNase污染非常敏感，实验中任何一步操作不当都会影响分析结果。Microarray方法可实现高通量、多组分miRNA同时检测，但该方法的特异性和灵敏度较低，并且微阵列芯片的制备和检测成本很高。RT-PCR是灵敏检测miRNA的有效方法，但由于miRNA序列短，不适合直接使用PCR扩增，需要依赖多种技术先将miRNA转录成cDNA再进行扩增，导致方法操作复杂，耗时长；另外该方法需要精确的控温仪器，增加测定成本。恒温扩增检测miRNA的方法如滚环扩增（RCA）、线性扩增、指数扩增（EXPAR）等由于能在恒温条件下获得高效的扩增，成为研究和应用热点。

发明内容

由于现有的恒温指数扩增反应中的扩增模板的5’端和3’端的序列完全相同，引物在两端杂交的几率和速率也相同。杂交在3’端的引物能够正常扩增，而杂交在5’端的引物无法扩增，因此，常规的恒温指数扩增反应损失了50%的扩增效率。本发明通过对现有指数扩增技术进行改进，抑制引物在扩增模板5’端的杂交，从而提高恒温指数扩增反应的扩增效率，目标建立一种更为快速、高效和灵敏的恒温指数扩增技术并应用于短链核酸的灵敏检测。

本发明所采取的技术方案是：

一种改进型恒温指数扩增模板，其包括3’端序列、5’端序列，以及3’端序列和5’端序列之间的切口酶识别序列；所述3’端序列和5’端序列相同，均与待检核酸序列互补；5’端序列至少有一个碱基上修饰有biotin。

进一步地，优选在5’端序列1-10bp的至少一个碱基上修饰biotin。

更进一步地，优选在5’端序列第2个碱基上修饰biotin。

一种用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其序列为：

5’-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’，其第1-23 bp至少有一个碱基修饰有biotin。

进一步地，优选在其序列的第1-10 bp的至少一个碱基上修饰biotin。

更进一步地，优选在5’端序列第2个碱基上修饰biotin。

一种改进型恒温指数扩增试剂盒，其包括：

（1）恒温指数扩增模板；

（2）DNA聚合酶；

（3）内切酶；

（4）链酶亲和素。

进一步优选地，所述试剂盒中还包括：dNTP、SYBR Green I荧光染料、酶缓冲液。

一种改进型恒温指数扩增技术，包括如下步骤：

（1）将恒温指数扩增模板、dNTP、RNase抑制剂、待检样品和链酶亲和素混合制成A反应液；

（2）将DNA聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料混合制成B反应液；

（3）将A反应液和B反应液混合后进行指数扩增反应；

（4）PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，根据建立的标准曲线求得目标核酸序列的浓度。

指数扩增反应体系含有：0.5×Nt.BstNBI缓冲液、0.1 μM恒温指数扩增模板、250μMdNTP、0.8 U/μL RNase抑制剂、待检样品、0.2 μM链酶亲和素SA、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液、0.05 U/μL Vent(exo-)聚合酶、0.4 U/μL切口酶、0.4×SYBR Green I荧光染料、DEPC水；所述0.5×Nt.BstNBI缓冲液含有：25 mMtris-HCl,pH 7.90,50 mM NaCl,5 mMMgCl,0.5 mM EDTA；所述1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液含有：10mMKCl,10 mM (NH₄)₂SO₄,20mMTris-HCl pH 8.8,2 mM MgSO₄,0.1% Triton X-100。

本发明的技术原理为：

根据待测miRNA序列设计扩增模板（如图2所示）。该模板包含三段序列：序列1和序列3完全相同，且与目标miRNA序列互补；序列2为切口酶的识别序列；另外：在靠近模板5’端的碱基上修饰一个生物素（biotin），当溶液中加入链霉亲和素（SA）时，SA与biotin结合可使扩增模板5’端的Tm值降低，在恒温指数扩增条件下，能提高目标miRNA序列与模板3’端的结合效率，同时加速被切口酶剪切后的DNA片段从模板5’端离去的速度，从而提高了指数扩增技术的扩增效率与灵敏度。其具体步骤如图3所示。

本发明的有益效果是：

本发明通过在常规指数扩增模板的5’端与引物互补的区域内的一碱基上修饰一生物素来调节引物与扩增模板3’端和5’端的杂交速度，建立了改进型恒温指数扩增方法。该方法较常规恒温指数扩增方法，具有以下优点：

1、扩增效率更高，速度更快，缩短分析时间；

2、标准曲线的线性范围更宽，特异性更好，灵敏度更高；

3、方法具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。

附图说明

图1 为恒温指数扩增反应原理图。

图2为改进型恒温指数扩增方法模板设计示意图。

图3为改进型恒温指数扩增方法示意图。

图4为不同位点扩增曲线图。

图 5为不同聚合酶量（A）和不同内切酶量（B）条件下let-7a扩增反应POI值与空白实验POI值之差；（C）-（F）扩增反应在不同模板量条件下对let-7a和空白的扩增曲线图。

图 6为标准曲线图。

图 7为方法特异性分析图。

具体实施方式

下面以检测miRNA let-7家族中let-7a为例，对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 一种用于检测miRNA let-7a的改进型恒温指数扩增模板的设计

miRNA let-7a的序列为：5'-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGUU-3'（SEQ ID NO.1）。

根据miRNA let-7a 的序列，并以Nt.BstNBI为切口酶设计扩增模板如下：

5’端互补序列切口酶识别序列3’端互补序列

5’-AA(biotin)CTATACAACCTACTACCTCAA—ACAGACTCA—AACTATACAA

CCTACTACCTCAA-3’（SEQ ID NO.2）

模板5’端的第二个A碱基上修饰有biotin。

实施例2恒温指数扩增方法检测条件的优化

（1）最佳修饰biotin位点的选择

制备不同标记的扩增模板如下：

Site0:5’-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’

Site2:5’-AA(biotin)CTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’

Site6:5’-AACTAT(biotin)ACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’

Site9:5’-AACTATACA(biotin)ACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’

Site14:5’-AACTATACAACCTA(biotin)CTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’

Site18:5’-AACTATACAACCTACTAC(biotin)CTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’

在冰上配制A和B反应液：

A反应液包含：Nt.BstNBI缓冲液、site 2模板、dNTP、RNase抑制剂、let-7a、链酶亲和素，其中链酶亲和素SA可与扩增模板上的biotin结合。

B反应液包含：聚合酶缓冲溶液、Vent (exo-)聚合酶、Nt.BstNBI切口酶、SYBRGreen I荧光染料，其中Nt.BstNBI切口酶可识别DNA双链中的切口酶识别序列，并在该位点剪切形成一个切口。

将AB反应液混合后在55℃进行扩增反应，并用stepone plus 荧光定量PCR检测扩增曲线。如图4所示，site 2模板的扩增曲线对应的POI值最小，说明使用site 2模板进行扩增的反应最灵敏，最迅速，故选择site 2 模板作为最佳反应模板。

（2）miRNA测定条件优化

在冰上配制A和B反应液，A反应液包含Nt.BstNBI缓冲液、模板、dNTP、RNase抑制剂、let-7a、链酶亲和素；B反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent (exo-)聚合酶、内切酶、SYBRGreen I荧光染料。将AB反应液混合后在55℃进行扩增反应，并用stepone plus 荧光定量PCR检测扩增曲线。如图5所示，当聚合酶含量为0.05 U/μL，内切酶含量为0.4 U/μL时，let-7a与空白的POI差值最大，背景值最小，指数扩增反应的最佳条件。当模板量为0.1μM时，扩增效率以及背景影响都较好，故选择模板量为0.1 μM作为最优指数扩增模板量。

实施例3miRNA含量的测定

（1）标准曲线的获得

在冰上配制一系列不同浓度的let-7a待测溶液；根据最佳反应条件配制A和B溶液，A溶液包含Nt.BstNBI缓冲液、site 2模板、dNTP、RNase抑制剂、let-7a、链酶亲和素；B溶液包含聚合酶缓冲溶液、Vent (exo-) 聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料。将A和B溶液混合后定容至20 μL，所得最佳恒温指数扩增体系的组成为：0.5×Nt.BstNBI缓冲液（25mMtris-HCl,pH 7.90,50 mM NaCl,5 mM MgCl,0.5 mM EDTA）、模板site 2(0.1 μM)、dNTP（250 μM）、RNase抑制剂（0.8 U/μL）、let-7a、链酶亲和素SA（0.2 μM）、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液(10mMKCl,10 mM (NH₄)₂SO₄,20 mMTris-HCl pH 8.8,2 mM MgSO₄,0.1% TritonX-100)、Vent(exo-)聚合酶(0.05 U/μL)、内切酶(0.4 U/μL)、0.4×SYBR Green I荧光染料、DEPC水。然后在55℃进行指数扩增反应，在定量PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，得到let-7a浓度测定标准曲线。在1pmol-1 fmol之间，POI =–2.879logc _let-7a– 32.29，R²=0.9996；在1 fmol至0.001 zmol之间，POI = –1.934logc _let-7a – 18.20，R²= 0.9985。

（2）特异性验证

为了验证该改进指数扩增方法的特异性，配制一定浓度的let-7家族的其他miRNA（let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7g）溶液；在最佳反应条件下，在定量PCR仪上监控扩增曲线（图7），求得POI值。

let-7a: 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'（SEQ ID NO.1）

let-7b: 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3'（SEQ ID NO.3）

let-7c: 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3'（SEQ ID NO.4）

let-7d: 5'-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU-3'（SEQ ID NO.5）

let-7e: 5'-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU-3'（SEQ ID NO.6）

let-7g: 5'-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU-3'（SEQ ID NO.7）

根据特异性计算公式，该方法对同族miRNA的特异性为：

（3）目标样品含量的测定

在一定量样品中提取出目标物后，在最佳反应条件下，在冰上分别配制A和B溶液。混合A和B溶液后，立即在定量PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，根据此POI值，在标准曲线上查出相应的的浓度。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 中山大学

<120> 一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> let-7a

<400> 1

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactatacaa cctactacct caaacagact caaactatac aacctactac ctcaa 55

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> let-7b

<400> 3

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> let-7c

<400> 4

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> let-7d

<400> 5

agagguagua gguugcauag u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> let-7e

<400> 6

ugagguagga gguuguauag u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> let-7g

<400> 7

ugagguagua guuuguacag u 21

Claims

1.一种改进型恒温指数扩增模板，其包括3’端序列、5’端序列，以及3’端序列和5’端序列之间的切口酶识别序列；所述3’端序列和5’端序列相同，均与待检核酸序列互补；5’端序列至少有一个碱基上修饰有biotin。

2.根据权利要求1所述的改进型恒温指数扩增模板，其特征在于，优选在5’端序列1-10bp的至少一个碱基上修饰biotin。

3.根据权利要求1所述的改进型恒温指数扩增模板，其特征在于，优选在5’端序列第2个碱基上修饰biotin。

4.一种用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其序列为：

5’-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3’，其第1-23bp至少有一个碱基修饰有biotin。

5.根据权利要求4所述的用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其特征在于，优选在其序列的第1-10bp的至少一个碱基上修饰biotin。

6.根据权利要求4所述的用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其特征在于，优选在5’端序列第2个碱基上修饰biotin。

7.一种改进型恒温指数扩增试剂盒，其包括：

(1)恒温指数扩增模板：如权利要求1-6任一项所述；

(2)DNA聚合酶；

(3)内切酶；

(4)链酶亲和素。

8.根据权利要求7所述的改进型恒温指数扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：dNTP、SYBR Green I荧光染料、酶缓冲液。

9.一种改进型恒温指数扩增方法，包括如下步骤：

(1)将恒温指数扩增模板、dNTP、RNase抑制剂、待检样品和链酶亲和素混合制成A反应液；

(2)将DNA聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料混合制成B反应液；

(3)将A反应液和B反应液混合后进行指数扩增反应；

(4)PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，根据建立的标准曲线求得目标核酸序列的浓度；

所述恒温指数扩增模板如权利要求1所述。

10.根据权利要求9所述的改进型恒温指数扩增方法，其特征在于，指数扩增反应体系含有：

0.5×Nt.BstNBI缓冲液、0.1μM恒温指数扩增模板、250μM dNTP、0.8U/μL RNase抑制剂、待检样品、0.2μM链酶亲和素SA、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液、0.05U/μL Vent(exo-)聚合酶、0.4U/μL切口酶、0.4×SYBR Green I荧光染料、DEPC水；所述0.5×Nt.BstNBI缓冲液含有：25mM Tris-HCl pH 7.90，50mM NaCl，5mM MgCl₂，0.5mM EDTA；所述1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液含有：10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，20mM Tris-HCl pH 8.8，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100。