FI112094B - Parannettu menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi - Google Patents
Parannettu menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI112094B FI112094B FI951082A FI951082A FI112094B FI 112094 B FI112094 B FI 112094B FI 951082 A FI951082 A FI 951082A FI 951082 A FI951082 A FI 951082A FI 112094 B FI112094 B FI 112094B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sample
- analyzed
- amount
- rna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
, 112094
Parannettu menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi
Esillä oleva keksintö koskee parannettua menetelmää nukleiinihapon kvantitoimiseksi. Nukleiinihapon kvanti-5 tointi voi olla erittäin tärkeää eri tutkimus- ja diagnostiikka-aloilla. Nukleiinihapon kvantitointi voi olla tärkeä työväline geenin säätelyn ymmärtämisessä ja sitä voidaan käyttää myös hoidon vaikutusten monitoroinnissa. Näytteessä, kuten esimerkiksi ihmisen veressä tai muissa 10 kehon nesteissä, olevien spesifisten nukleiinihapposek-venssien määrä saattaa myös antaa käyttöön arvokasta informaatiota sellaisten henkilöiden sairauden asteesta, joilla on esimerkiksi tietty virusinfektio, ja tietyillä lääkkeillä tehdyn hoidon tehosta.
15 On kuvattu erilaisia menetelmiä nukleiinihapon kvantitatiiviseksi amplifioimiseksi. Julkaisussa WO 91/ 02 817 kuvataan menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) amplifikaatiotek-niikkana. Tämä menetelmä sisältää sellaisen standardin 20 nukleiinihapposegmentin lisäämisen näytteeseen, joka voi . . reagoida samojen alukkeiden kanssa, joita käytetään ampli- * * · ; / fioitaessa näytteessä olevaa tuntematonta määrää kohdenuk- i · » ‘·*·“ leiinihappoa. Amplif ioinnin jälkeen kunkin kahden PCR- tuotteen määrä mitataan ja kohdesegmentin määrä alkuperät-*·"· 25 sessä näytteessä kvantitoidaan ekstrapoloimalla standardi- |^· I käyrälle. Standardikäyrä muodostetaan piirtämällä polyme- raasiketjureaktiossa tuotetun standardisegmentin määrä ennen amplifikaatiota olleita vaihtelevia, mutta tunnettu-ja nukleiinihappomääriä vastaan.
,*··. 30 Muiden sekvenssien lisäämisen analysoitavan nuk- ·’ leiinihapon sisältävään näytteeseen, jotka voivat ampli- » · « fioitua yhdessä analysoitavan nukleiinihapon kanssa, ovat ·...* myös kuvanneet Becker ja Hahlbrock (Nucleic Acids Re- .:. search, voi. 17, numero 22, 1989). Beckerin ja Hahlbrockin .···, 35 kuvaama menetelmä on menetelmä nukleiinihapon kvantitoimi- 112094 2 seksi, jossa erilaiset tunnetut määrät sisäistä standardia, joka sisältää nukleiinihapposekvenssin, joka eroaa analysoitavasta nukleiinihaposta vain yhdellä nukleotidilla (pistemutaatio), lisätään tilavuudeltaan tunnettuihin 5 näytefraktioihin, jotka sisältävät tuntemattoman määrän analysoitavaa nukleiinihappoa ja amplifioidaan PCR:llä yhdessä analysoitavan nukleiinihapon kanssa. Identtiset kokonais-RNA-osuudet "terästetään" näin alenevilla tunnetuilla määrillä sisäistä standardi-RNA:ta. Tekemällä yhden 10 emäksen muutos sisäisen standardin sekvenssiin, muodostuu spesifinen restriktiokohta ja mutanttisekvenssi leikataan sopivalla restriktioentsyymillä, ennen kuin amplifioidun nukleiinihapon sisältävä näyte pannaan elektroforeesigee-liin. Nukleiinihappo kvantitoidaan vertaamalla geelin juo-15 via, jotka edustavat mutanttisekvenssiä (osaa siitä) ja analysoitavaa nukleiinihappoa. Eräs tämän menetelmän haitoista on se, että sisäisen standardin epätäydellinen pilkkoutuminen restriktioentsyymillä saattaisi aiheuttaa epätäsmällisyyksiä näytteessä olevan nukleiinihapon mää-20 rän määrittämisessä. Becker ja Hahlbrock käyttävät sisäis- . . tä standardia merkkiaineena kvantitointimenetelmässään, • · · 112094 3 yhtä hyvin kohdesekvenssiin kuin mutanttisekvenssiinkin. Julkaisussa EP 525 882 kuvattu kompetitiivinen amplifikaa-tio voidaan suorittaa vakiomäärällä näytettä ja mutantti-sekvenssin laimennossarjalla tai päinvastoin.
5 Edellä kuvatut menetelmät sisältävät tarkoin määrä tyn standardisekvenssin lisäämisen amplifikaatioseokseen. Jotta voidaan saada tarkka ja luotettava mittaus edellä kuvatulla menetelmällä, tulee suorittaa useita amplifikaa-tioreaktioita: Näyte täytyy jakaa erilaisiin eriin, joissa 10 määrät ovat tunnetut, joihin kuhunkin täytyy lisätä erilainen, tunnettu määrä standardinukleiinihppoa. Tai julkaisussa W0 91/02 817 kuvatulla menetelmällä standardikäy-rä täytyy muodostaa laimennossarjoista, mikä on melko työlästä ja saattaa myös johtaa epätäsmällisiin arvioihin 15 näytteessä olevasta nukleiinihappomäärästä, koska varsinainen amplifikaatio, joka koskee kohdenukleiinihappoa, ja amplifikaatiot, jotka koskevat standardikäyrää, suoritetaan erikseen.
Edellä kuvatut menetelmät ovat erittäin työläitä ja 20 aikaavieviä niiden lukuisien amplifikaatioreaktioiden takia, joita täytyy tehdä, jotta voidaan määrittää nukleii- • * · nihapon määrä täsmällisellä ja luotettavalla tavalla. Tä- • | män vuoksi tarvitaan menetelmä nukleiinihapon kvantitoimi-·,,,· seksi, joka on vähemmän työläs ja aikaavievä. Esillä oleva 25 keksintö antaa käyttöön tällaisen menetelmän.
J : : Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän analysoitavan nukleiinihapon kvantitoimiseksi näytteestä ja se sisältää vaiheet: :v, - eri nukleiinihapporakenteiden erilaisten vastaavien mää- ,' 't 30 rien lisäämisen näytteeseen kunkin rakenteen ollessa ero-tettavissa analysoitavasta nukleiinihaposta ja kykenevä amplifioitumaan analysoitavan nukleiinihapon kanssa, - näytteen saattamisen nukleiinihappoamplifikaatioprose-duuriin käyttäen amplifikaatioreagensseja, jotka kykenevät 112094 4 reagoimaan sekä analysoitavan nukleiinihapon että nukleii-nihapporakenteiden kanssa, - analysoitavasta nukleiinihaposta ja kustakin nukleiini-happorakenteesta peräisin olevien amplifioitujen molekyy- 5 lien suhteellisten määrien osoittamisen, - analysoitavan nukleiinihapon määrän laskemisen mainituista suhteellisista määristä.
Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä eri nuk-leiinihapporakenteet lisätään näytteeseen.
10 Kukin nukleiinihapporakenne on erilainen; nukleii- nihapporakenteet voidaan erottaa toisistaan ja analysoitavasta nukleiinihaposta. Nukleiinihapporakenteet muistuttavat toisiaan ja analysoitavaa nukleiinihappoa siinä, että ne kykenevät kaikki reagoimaan samojen amplifikaatiorea-15 genssien kanssa. Amplifikaatioreagensseilla muun muassa tarkoitetaan yhtä tai useampia amplifikaatioalukkeita, jotka voivat hybridisoitua analysoitavaan nukleiinihappoon ja nukleiinihapporakenteisiin. Muita amplifikaatioreagens-seja ovat yleensä amplifikaatioproseduureissa käytetyt 20 reagenssit, kuten välttämättömät entsyymit, nukleiinihap-popolymeraasit, joita käytetään alalla tunnetuissa eri ’· " amplifikaatiotekniikoissa. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää minkä tahansa tyyppisen amplifikaatiopro-seduurin kanssa, esimerkiksi niin kutsutun polymeraasiket-25 jureaktion (PCR) kanssa, joka on kuvattu US-patenttijul- : kaisuissa 4 683 195 ja 4 683 202. Toinen menetelmä nuk- s * f · leiinihapon amplifioimiseksi on "nukleiinihapposekvenssiin perustuva amplifikaatio (NASBA)", joka on esitetty EP-pa-tenttihakemuksessa 0 329 822.
30 Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä * · käytetyt nukleiinihapporakenteet ovat nukleiinihapposek-v\: venssejä, jotka muistuttavat analysoitavaa nukleiinihappoa :tii! siinä, että ne kykenevät reagoimaan samojen amplifikaatio- reagenssien kanssa. Kunkin nukleiinihapporakenteen tulisi 35 sen vuoksi sisältää ainakin se sekvenssi, johon käytetyt 112094 5 nukleiinihappoamplifikaatioalukkeet voivat hybridisoitua, joka sekvenssi on myös analysoitavassa nukleiinihapossa. Nukleiinihapporakenteet, joita käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä, voidaan erottaa analysoitavasta nuk-5 leiinihaposta ja toisistaan. Tämä voidaan saavuttaa rakentamalla nukleiinihapporakenteet siten, että kukin rakenne sisältää ainutlaatuisen erotettavissa olevan sekvenssin, jota ei ole muissa käytetyissä nukleiinihapporakenteissa eikä analysoitavassa nukleiinihapossa. Edullisesti nuk-10 leiinihapporakenteita käytetään, kun yksilöllisesti erotettavissa oleva sekvenssi on satunnainen sekvenssi, joka sisältää esim. noin 20 nukleotidiä, jolloin rakenteiden ja analysoitavan nukleiinihapon pituus ja nukleotidikokoonpa-no pysyy samana. Näytteessä olevan analysoitavan nukleii-15 nihapon ja nukleiinihapporakenteiden amplifikaation jälkeen voidaan osoitettaessa eri nukleiinihapporakenteet mitata erikseen käyttäen eri osoituskoettimia, joista kukin kykenee tunnistamaan vain yhden nukleiinihapporakenteissa olevista yksilöllisistä sekvensseistä. On tietenkin 20 muita tapoja, joilla nukleiinihapporakenteet voidaan rakentaa, jotka tekevät niistä yksilöllisiä. Edullisesti » » * '1 nukleiinihapporakenteita ei kuitenkaan pitäisi mutatoida siten, että amplifikaatio vaikeutuu. Edullisesti keksinnön mukaisella menetelmällä käytetään nukleiinihapporakentei-25 ta, jotka kykenevät amplifioitumaan samalla teholla kuin : analysoitava nukleiinihappo, muutoin on vaikeaa tehdä täs- iti | mällistä laskelmaa, joka perustuu näytteessä olevan analysoitavan aineen ja nukleiinihapporakenteen määriin ampli-fikaation jälkeen.
I · 30 Nukleiinihapporakenteet ovat polynukleotideja, jot- i · ka voidaan valmistaa erilaisilla alalla tunnetuilla mene-V,·* telmillä. Nukleiinihapporakenteet voidaan esimerkiksi val- : ’ : mistaa erilaisilla yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Esimerkiksi si uusia sekvenssejä voidaan viedä analysoitavaan sekvens si! 35 siin leikkaamalla analysoitavan sekvenssin sisältämä plas- 112094 6 midi restriktioentsyymeillä, jolloin alkuperäinen sekvenssi poistuu, ja panemalla sisään uusi sekvenssi, joka on voitu valmistaa nukleiinihapposyntetisaattorilla tai sub-kloonattu eri plasmidista. Täydellisiä nukleiinihappora-5 kenteita voidaan myös valmistaa käyttäen nukleiinihappo-syntetisaattoria .
Nukleiinihapporakenteet tulisi lisätä näytteeseen, joka sisältää tuntemattoman määrän analysoitavaa nukleiinihappoa, ennen näytteen saattamista amplifikaatioprose-10 duuriin. Näyteellä, johon tunnettu määrä eri nukleiinihap-porakenteita lisätään, tulisi tietenkin olla ennalta määritetty tilavuus, jotta voitaisiin laskea näytteessä olevan nukleiinihapon pitoisuus myöhemmin. Näytteen täytyy sisältää tunnettu tilavuus tai määrä materiaalia, joka on 15 otettu materiaalista, josta nukleiinihapon määrä tulisi määrittää. Kun tietyssä testinesteessä olevan nukleiinihapon pitoisuus on määritettävä, näytteen tulisi sisältää kaikki se nukleiinihappo, joka on eristetty tunnetusta määrästä tutkittavaa testimateriaalia.
20 Nukleiinihapporakenteet voidaan lisätä ennen tutki muksen kohteena olevan testinesteen (esimerkiksi ihmisen veren seerumi) saattamista nukleiinihappoeristysproseduu- *‘,V riin tai sen jälkeen. Menetelmiä nukleiinihapon eristämi- seksi on kuvattu ja ne ovat tunnettuja kenelle tahansa ':··· 25 alan ammattimiehelle. Nukleiinihaponeristysmenetelmät, • joita voidaan käyttää sellaisen näytteen valmistamiseksi, * * * » .‘j·. joka on määrä saattaa esillä olevan keksinnön menetelmään, on kuvattu esimerkiksi teoksessa Maniatis et ai., Molecu-lar Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab-
» I
30 oratory. Erään toisen menetelmän nukleiinihappoa sisältä- t » vien näytteiden prosessoimiseksi ovat kuvanneet Boom et ; ai., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495 - 503.
: Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa nukleiini- happorakenteita lisätään ennen nukleiinihappojen eristä-35 mistä testinestemäärästä. Tällä tavoin nukleiinihappohä- » 1 112094 7 vikki, jota saattaisi mahdollisesti tapahtua eristysmene-telmän aikana, heijastuu sekä näytteestä tuloksena olevan analysoitavan nukleiinihapon että nukleiinihapporakentei-den määriin. Alkuperäisessä tutkittavassa testinesteessä 5 olevan analysoitavan nukleiinihapon määrä voidaan laskea suoraan saaduista tuloksista.
Kun nukleiinihapporakenteita lisätään tunnettuun määrään testinestettä ennen testinesteen saattamista nuk-leiinihappoeristysproseduuriin, eristyskontrol 1 inukleiini-10 happorakenne voidaan lisätä näytteeseen sen jälkeen kun nukleiinihapon eristysmenetelmä on suoritettu. Lisäämällä IC (eristyskontrolli) -sekvenssi on mahdollista määrittää nukleiinihappoeristysproseduurin tehokkuus. Näin kullekin näytteelle voidaan säätää kynnysarvo eristyksen teholle. 15 Eristyskontrollirakenne voi olla sekvenssi, joka eroaa analysoitavasta rakenteesta ja muista nukleiinihapporaken-teista, esimerkiksi koska se sisältää yksilöllisen sekvenssin, mutta amplifioituu edullisesti samalla teholla. IC:tä voidaan pitää toisena "nukleiinihapporakenteena" 20 eron ollessa siinä, että IC-molekyylejä lisätään nukleii- . , nihappoeristysproseduurin jälkeen, kun taas tässä edulli- * · sessa keksinnön suoritusmuodossa nukleiinihapporakenteet • * · · ·' lisätään ennen testinesteen saattamista nukleiinihappo- eristysproseduuriin. Eristysproseduurin teho voidaan las-25 kea, koska tarkoin määrätty määrä kunkin nukleiinihappora-j : : kenteen molekyylejä lisättiin ennen testinesteen saatta- mistä nukleiinihappoeristysproseduuriin, ja tarkoin määrätty määrä IC-molekyylejä lisättiin nukleiinihapon eris-tysproseduurin suorittamisen jälkeen. Kun esimerkiksi 100 I · 30 molekyyliä tiettyä nukleiinihapporakennetta lisättiin ja *·’ sama määrä IC-molekyylejä lisättiin, 100 %:n eristysteho * t \v johtaisi samaan signaaliin (amplifikaation jälkeen) molem- • » « mille nukleiinihapporakenteille ja lC:lle. Mikäli saatu IC-signaali olisi kaksi kertaa niin korkea kuin signaali, ,·*, 35 joka on saatu nukleiinihapporakenteelle, nukleiinihappo- 112094 8 eristysproseduurin teho olisi vain 50 % (tarkoittaen sitä, että puolet alunperin olevista nukleiinihappomolekyyleistä olisi hävinnyt eristysproseduurissa). Kynnysarvo voidaan nyt säätää sen mukaisesti näin alentaen riskiä saada vää-5 riä negatiivisia testituloksia.
Useampi kuin yksi nukleiinihapporakenne lisätään, kukin nukleiinihapporakenne erilaisena tunnettuna määränä. Edullisesti nukleiinihapporakenteet lisätään määräalueina, jotka eroavat toisistaan vakiokertoimella (esimerkiksi 10 kertoimella 10). Esimerkiksi, kun käytetään kolmea nuk-leiinihapporakennetta, QA, QB ja QC, 102 molekyyliä QA:ta, 103 molekyyliä QB:tä ja 104 molekyyliä QC:tä voidaan lisätä näytteeseen.
Näyte voidaan myös jakaa eriin useampiin kuin yh-15 teen reaktioerään, joista kullakin on tunnettu tilavuus, joihin kuhunkin lisätään nukleiinihapporakenteita eri määräalueina. Edullisesti siinä tapauksessa kuhunkin reaktio-tilavuuteen lisätään samoja nukleiinihapporakenteita. Jos esimerkiksi käytetään kahta reaktiota, voidaan tehdä "ma-20 taian alueen" -reaktio ja "korkean alueen" -reaktio. Esi-. . merkiksi, kun nukleiinihapporakenteiden alueet menisivät *; ’· päällekkäin, matalan alueen reaktiotilavuuteen voidaan '·*·* lisätä QA, QB ja QC edellä mainituissa määrissä, kun taas • ♦ » '...· korkean alueen reaktiotilavuuteen lisätään ΙΟ4, 105 ja 106 •25 molekyyliä QA:ta, QB:tä ja QC:tä tässä järjestyksessä.
: Nukleiinihapporakenteiden määräalueet saattavat mennä päällekkäin, mutta voi olla myös väli nukleiinihapporakenteiden määrien välillä matalalla alueella ja korkealla alueella erikseen. Vaikka useamman kuin yhden reaktiotila- * · .**·, 30 vuuden käyttö tarkoittaa sitä, että tulee suorittaa useam- '·* pia amplifikaatioreaktioita kuin yksi, työn ja ajan säästö verrattuna tunnetun tekniikan menetelmiin nukleiinihapon kvanti toimi seksi, on vielä oleellinen koska minimimäärällä reaktioita voidaan kattaa laaja alue analysoitavan aineen » > * » 35 pitoisuuksia.
112094 9
Etu käyttää nukleiinihappojen rakenteiden määrissä määräalueita, jotka eivät mene päällekkäin, on se että käytettyjen rakenteiden lukumäärää voidaan laskea, kun kuitenkin voidaan kattaa laaja pitoisuusalue. Kun analy-5 soitavaa ainetta on näytteessä sellainen määrä, että se osuu nukleiinihapporakenteiden määräalueiden väliseen väliin, mikään suora vertailu signaalialueeseen, joka on peräisin näytteessä tai reaktioerässä olevista nukleiini-happorakenteista, ei ole mahdollinen. Kuitenkin analysoi-10 tavan nukleiinihapon määrä voidaan vielä määrittää, koska analysoitavan nukleiinihapon signaali on voimakkampi kuin matalan alueen signaalit ja heikompi kuin korkean alueen signaalit, ja pitoisuus voidaan laskea näistä tiedoista.
Kun keksinnön mukaisella menetelmällä lisätään eri-15 laisia alueita nukleiinihapporakenteita useampaan kuin yhteen reaktiotilavuuteen, näyte, josta analysoitavan nukleiinihapon pitoisuus on määritettävä, voidaan jakaa eri tilavuuksiin ja nukleiinihapporakenteet voidaan lisätä näihin tilavuuksiin, ennen kuin kullekin tilavuudelle teh-20 dään nukleiinihappoeristysproseduuri. Vaikka kukin tila-. . vuus tulee käsitellä erikseen eristysproseduurissa, ei ’· '· mitään korjauksia tarvitse tehdä analysoitavan nukleiini- • · » ’·'·* hapon mahdollisten hävikkien takia eristyksen aikana, kos- ka suorituksen vaihtelut korjataan lisäämällä nukleiini-: 25 happorakenteita, jotka käyvät läpi täsmälleen saman käsit- : : : telyn ja kärsivät samoista vaihteluista. Tietenkin voidaan myös saattaa koko tilavuus nukleiinihappoeristysproseduu-riin ja jakaa se eri tilavuuksiin, joihin sen jälkeen li-sätään sarja rakenteita jälkeenpäin.
30 Ongelma, joka saattaa nousta, kun suoritetaan amp- • · lifikaatioreaktioita, on se, että näytteet saattavat kon-*.·,* taminoitua nukleiinihappomolekyyleillä, jotka ovat peräi- sin muista näytteistä, joita esimerkiksi testattiin aikai-semmin samassa laboratoriossa. Tämä saattaa johtaa vääriin ,···_ 35 positiivisiin testituloksiin tai kvantitatiivisten mit- 112094 10 tausten tapauksessa väärään tulokseen laskettaessa näytteessä olevien nukleiinihappomolekyylien lukumäärää. Kontaminaatiot näytteistä, jotka on testattu esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä, alueella 10 - 100 mole-5 kyyliä eivät muuta sisäistä kalibraatiosuoraa ja vaikuttavat vain analysoitavan nukleiinihapon molekyylien laskettuun määrään, mikäli kontaminaatio suuresti koostuu analysoitavista molekyyleistä ja analysoitavan nukleiinihapon testattava määrä näytteessä on vähemmän kuin 100 molekyy-10 liä. Noin 100 - 1 000 molekyylin kontaminaatiot vaikuttavat vähän sisäiseen kalibrointisuoraan ja vaikuttavat vain näytteessä olevien analysoitavien nukleiinihappomolekyylien määrän laskemiseen, jos näytteessä olevien analysoitavien molekyylien määrä on alle 1 000 molekyyliä. Konta-15 minaatiot, joissa on yli 1 000 molekyyliä, muuttavat kalibraatiosuoraa ja laskun tulosta. Esillä olevan keksinnön edullisella suoritusmuodolla näytteiden kontaminaatio nuk-leiinihappomolekyyleillä, jotka ovat peräisin aikaisemmin testatuista tai muista näytteistä, voidaan osoittaa.
20 Kontaminaatio voidaan osoittaa, kun keksinnön mu- . , kaista menetelmää käytetään testaamaan useampia kuin yhtä ’· '· näytettä, samoja nukleiinihapporakenteita käytetään kai- *.*.* kissa näytteissä ja kunkin tietyn nukleiinihapporakenteen ·...· määriä vaihdellaan. Esimerkiksi, kun käytetään kolmea nuk- "“· 25 leiinihapporakennetta (Qa, Qb ja Qc), näytteeseen "A" voi- j I : daan lisätä näitä rakenteita seuraavina määrinä: Qakorkea, :T: Qbkeski ja Qcnatala Näytteeseen "B" voidaan nyt lisätä samoja rakenteita määrinä: Qamatala, Qbkorkea, Qckeski, kun taas näyt-teisiin "C" lisätään seuraavat määrät: Qakeskl, Qbnatala ja ,···, 30 QCkorkea/ jne· Tietenkin samaa nukleiinihapporakenteiden for- mulaatiota voidaan myös käyttää useampaan kuin yhteen • > V.· näytteeseen, esimerkiksi kymmenen näytteen sarjaan, ennen kuin kytketään toisen formulaation käyttö.
Kuusi variaatiota voidaan tehdä, kun käytetään kol-,···_ 35 mea rakennetta, ennen kuin samaa nukleiinihapporakenteiden 112094 11 formulaatiota täytyy jälleen käyttää. Kun käytetään neljää rakennetta, voidaan tehdä 24 variaatiota jne. Nukleiini-happorakenteiden eri formulaatioiden käyttö eri näytteissä tekee kontaminaatiosta osoitettavan nukleiinihappomate-5 riaalilla, joka on peräisin näytteestä, johon käytettiin eri formulaatiota. Kontaminaatio muuttaa sisäistä kalib-raatiosuoraa tutkittavassa näytteessä; kalibraatiosuoralla on toinen kulmakerroin ja matala korrelaatiokerroin verrattuna normaaleihin tuloksiin ja on siksi erotettavissa 10 kontaminaationa. Mikäli kussakin näytteessä käytetään nol-latasoa yhdestä rakenteesta (ja rakenne, josta käytetään nollatasoa, vaihtelee näytteiden välillä), voidaan jopa erittäin pienet määrät kontaminoivia molekyylejä osoittaa. On ilmeistä, että osoitettava määrä tiettyä rakennetta, 15 josta lisättiin nolla-määrä, osoittaa, että tämä tietty näyte oli kontaminoitunut materiaalilla, joka oli näytteestä, jolle on valittu eri formulaatio.
Nukleiinihapporakenteiden ja analysoitavan nukleiinihapon osoittaminen amplifikaation jälkeen voidaan suo-20 rittaa eri tavoin. Voidaan käyttää monia osoitusmenetel- , , miä, jotka ovat alalla tunnettuja niin kauan kuin muodos- • · · '· " tuu mitattavissa oleva signaali, joka eroaa sen amplifioi- • * * ‘•V dun nukleiinihapon määrän mukaan (rakenne tai analysoitava ·...· aine), jota signaali edustaa. Osoitusmenetelmiä, joita 25 voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä, ovat « » j menetelmät, jotka perustuvat entsymaattiseen ja luminomet- riseen ilmiöön (fluoresenssi, elektrokemiluminesenssi, fosforesenssi) sekä osoitusmenetelmät, joissa käytetään kiinteitä leimoja, kuten esimerkiksi kulta- tai värisoo- * · • · ,···. 30 lia ja osoitusmenetelmät, jotka perustuvat agglutinaa- '! ’ tioon.
\V Näytteessä olevan analysoitavan nukleiinihapon pi- :,,,· toisuus voidaan laskea analysoitavan nukleiinihapon ja nukleiinihapporakenteiden suhteellisista määristä, joita .···, 35 edustavat osoitusreaktion aikana muodostuneet signaalit.
112094 12
Esimerkiksi sellaisten signaalien välisen suhteen logaritmi, jotka edustavat rakennesekvenssiä (Q) ja analysoitavaa sekvenssiä (A), log (Q/A), on näytteeseen lisätyn rakenteen määrän logaritmin lineaarinen funktio, log (Q-lähtö-5 arvo). Kun log (Q/A) piirretään Q(lähtöarvo):n funktiona, tulisi saada lineaarinen suora, josta analysoitavan nukleiinihapon määrä voidaan helposti saada suoran ja X-akse-lin leikkauskohdasta. (Edellyttäen, että analysoitavan nukleiinihapon määrä osuu lähelle lisättyjen nukleiinihap-10 porakenteiden määräaluetta).
Esillä olevan keksinnön toinen suoritusmuoto sisältää menetelmän analysoitavan nukleiinihapon kvantitoimi-seksi joukosta testinesteitä, mikä sisältää mainittujen testinesteiden määrän laimentamisen tunnetulla kertoimel-15 la. Näytteet voidaan nyt ottaa mainituista laimennetuista testinesteistä, jotka sisältävät sellaisen määrän analysoitavaa nukleiinihappoa, jonka otaksutaan sisältyvän tiettyihin rajoihin. Kun tulee määrittää analysoitavan nukleiinihapon määrä kustakin testinestepaneelista, koko 20 paneeli voidaan esilaimentaa pitoisuuteen, jonka otaksu taan olevan näissä rajoissa. Esilaimennos tulisi suorittaa • · · *· sellaisella tavalla, että suurin osa näytteistä osuu mai-
• I
*.*.· nitulle alueelle, kun taas kaikkien jäljelle jäävien näyt- * · » ·...· teiden pitoisuudet jäävät alle tai ylittävät mainitun 25 alueen. Laimennosvaiheen jälkeen täydelliselle paneelille i voidaan tehdä edellä kuvattu keksinnön mukainen menetelmä, • * · · jossa näytteisiin lisättyjen nukleiinihapporakenteiden määrät ovat mainitulla alueella.
Jäljelle jäävät paneelista peräisin olevat testi- ( *'t 30 nesteet, jotka osuvat mainitun alueen alapuolelle (tai » » yläpuolelle), voidaan testata jälleen toisella säädetyllä laimennoksella tai laimentamattomilla näytteillä. Tämän menetelmän etu on se, että tarvitaan vähemmän amplifikaa-tioreaktioita kuin edellä kuvatulla korkea/matala-alue-35 eristyksellä.
13 112094
Eräässä toisessa menetelmän suoritusmuodossa analysoitavan nukleiinihapon kvantitoimiseksi näytteestä keksinnön mukaisesti näytteeseen voidaan lisätä jokin määrä nukleiinihapporakennetta, jolloin mainitun määrän otaksu-5 taan olevan samoissa rajoissa kuin näytteessä olevan analysoitavan nukleiinihapon määrän, näytteelle tehdään nuk-leiinihappoamplifikaatioproseduuri käyttäen amplifikaatio-reagensseja, jotka voivat reagoida sekä analysoitavan nukleiinihapon että nukleiinihapporakenteen kanssa, osoite-10 taan analysoitavasta nukleiinihaposta ja nukleiinihappora-kenteesta peräisin olevien amplifioitujen molekyylien suhteellinen määrä ja arvioidaan mainitussa näytteessä olevan analysoitavan nukleiinihapon määrä mainitusta suhteellisesta määrästä. Tämän arvioinnin jälkeen toiselle näyt-15 teelle samasta testinesteestä voidaan tehdä edellä kuvattu keksinnön mukainen menetelmä, jolloin lisättyjen nukleii-nihapporakenteiden määrät osuvat samoihin rajoihin kuin arvioitu analysoitavan nukleiinihapon määrä ensimmäisessä näytteessä.
20 Tämän proseduurin etu on se, että käytettyjen ra kenteiden määrien raja-arvot voidaan valita melko lähek- * · ·. *: käin toisiaan, mikä lisää menetelmän tarkkuutta, ja voi t * *V,: edelleen vähentää tehtävien amplifikaatioreaktioiden mää- • * * •.,, * rää· *;* ·: 25 Piirustusten kuvaus
Kuvio IA: Sekä nukleiinihapporakenteiden että näyt- * I t · teen (analysoitavan) nukleiinihapon lähtöarvo ja ampli- • · · fioidut määrät kokeeseen 1, kuten esimerkissä 1 on ku- :# vattu.
» i 30 Kuvio IB: Rakennesignaalin ja näytesignaalin suhde ·;* piirrettynä logaritmiseen skaalaan rakennekopioiden lähtö- määriä vastaan, kuten on käytetty kokeessa 1, joka on ku-vattu esimerkissä 1. Analysoitavan nukleiinihapon määrä osoitetaan X-akselilla pystysuoralla viivalla kuviossa.
112094 14
Kuvio 2A: Sekä nukleiinihapporakenteiden että näytteen (analysoitavan) nukleiinihapon lähtöarvo ja ampli-fioidut määrät kokeeseen 2, kuten esimerkissä 1 on kuvattu.
5 Kuvio 2B: Rakennesignaalin ja näytesignaalin suhde piirrettynä logaritmiseen skaalaan rakennekopioiden lähtö-määriä vastaan, kuten on käytetty kokeessa 2, joka on kuvattu esimerkissä 1. Analysoitavan nukleiinihapon määrä osoitetaan X-akselilla pystysuoralla viivalla kuviossa.
10 Kuvio 3A: Sekä nukleiinihapporakenteiden että näyt teen (analysoitavan) nukleiinihapon lähtöarvo ja ampli-fioidut määrät kokeeseen 3, kuten esimerkissä 1 on kuvattu .
Kuvio 3B: Rakennesignaalin ja näytesignaalin suhde 15 piirrettynä logaritmiseen skaalaan rakennekopioiden lähtö-määriä vastaan, kuten on käytetty kokeessa 3, joka on kuvattu esimerkissä 1. Analysoitavan nukleiinihapon määrä osoitetaan X-akselilla pystysuoralla viivalla kuviossa.
Kuvio 4A: Sekä nukleiinihapporakenteiden että näyt-20 teen (analysoitavan) nukleiinihapon lähtöarvo ja ampli- fioidut määrät kokeeseen 4, kuten esimerkissä 1 on ku- » · ' '· " vattu.
f I
Kuvio 4B: Rakennesignaalin ja näytesignaalin suhde piirrettynä logaritmiseen skaalaan rakennekopioiden lähtö-25 määriä vastaan, kuten on käytetty kokeessa 4, joka on ku- • vattu esimerkissä 1. Analysoitavan nukleiinihapon määrä osoitetaan X-akselilla pystysuoralla viivalla kuviossa.
Kuvio 5A: Sekä nukleiinihapporakenteiden että näyt- ;· ·_ teen (analysoitavan) nukleiinihapon lähtöarvo ja ampli- 30 fioidut määrät kokeeseen 5, kuten esimerkissä 1 on ku- * | '!1 vattu.
V/ Kuvio 5B: Rakennesignaalin ja näytesignaalin suhde : piirrettynä logaritmiseen skaalaan rakennekopioiden lähtö- I;, määriä vastaan, kuten on käytetty kokeessa 5, joka on ku- t »
» I
112094 15 vattu esimerkissä 1. Analysoitavan nukleiinihapon määrä osoitetaan X-akselilla pystysuoralla viivalla kuviossa.
Kuvio 6: Yhden putken Q-NASBA:n dynaaminen alue. Kvantitoinnin lähtöarvoina käytettiin ΙΟ1-44, 102'83, 104'23 ja 5 104'83 in vitro -muodostunutta WT-RNA-molekyyliä. Jokaisen WT-RNA-määrän kvantitointi suoritettiin 8-10 kertaa. QÄ-, QB- Ja Qc-RNA:ta käytettiin määrinä ΙΟ4, 103 ja 102 RNA-molekyyliä, tässä järjestyksessä.
Kuvio 7: Kaavamainen virtauskaavio yhden putken 10 Q-NASBA:sta lisäämällä QÄ-, QB- ja Qc-sisäisiä standardi-RNAiita lyysipuskurissa ennen nukleiinihappoeristystä.
Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen seuraa-vin esimerkein.
Esimerkit 15 Esimerkki 1
Seuraavat esimerkit ovat teoreettisia esimerkkejä kvantitatiivisesta määritysmenetelmästä ja sitä seuraavas-ta osoituksesta suoritettuna esillä olevan keksinnön menetelmän mukaisesti. Näistä esimerkeistä voidaan nähdä, mi-20 ten esillä olevan keksinnön mukainen määritys voidaan suorittaa, sekä tulokset, jotka muodostuisivat.
* * · ’· '· Viisi esimerkkiä, jotka voidaan suorittaa esillä » φ olevan keksinnön mukaisella menetelmällä, esitetään pää- « * t ·...· piirteittäin jäljempänä. Esimerkit eroavat analysoitavien 25 nukleiinihappomolekyylien lähtömäärän suhteen ja ennen j j : amplifikaatiota lisättyjen nukleiinihapporakenteiden mää- räalueiden suhteen. Analysoitavien molekyylien ja rakenteiden lähtömäärät osoitetaan jäljempänä olevassa taulu-kossa (taulukko 1): * »
* ♦ I
* * » * * t • ·
* I
< I · * » « » * » Il
I
* · ie 112094
Taulukko 1
Analysoitavan aineen ja nukleiinihapporakenteen lähtömäärä kokeissa 1-5
Analysoitava Matalan tason Q Korkean tason Q 5 Lähtömäärä Lähtöarvo Lähtöarvo
Koe 1: 150 QA: 100 QA: 10000 QB: 1000 QB: 100000 QC: 10000 QC: 1000000 10 Koe 2: 2000 QA: 100 QA: 10000 QB: 1000 QB: 100000 QC: 10000 QC: 1000000
Koe 3: 300.000 QA: 100 QA: 10000 15 QB: 1000 QB: 100000 QC: 10000 QC: 1000000
Koe 4: 5000 QA: 100 QA: 10000 QB: 1000 QB: 100000 20
Koe 5: 5000 QA: 100 QA: 100000 i.> . QB: 1000 QB: 1000000 * ♦ i
Kuten tästä taulukosta voidaan nähdä, kolmessa en-:simmäisessä teoreettisessa kokeessa lisätään kolme raken-
* f I
‘I*·j 25 netta (QA, QB ja QC, tässä järjestyksessä) ja kaksi ampli- : fikaatioreaktiota suoritetaan "matalan alueen" rakennemää- < · ·
4 * » I
rillä ja "korkean alueen" rakennemäärillä. Näissä esimer- * * · keissä matala alue ja korkea alue menevät osittain pääl-,, , lekkäin. Näiden kahden alueen päällekkäin menevää pistettä • » t • ·* 30 voidaan käyttää amplifikaatioiden vertaamiseen. (Mikäli
« I
'···’ amplifikaatiot suoritetaan samalla tavalla, muodostuneiden signaalien tulisi olla samat päällekkäisellä rakenteen määrällä molemmilla alueilla). Kokeessa neljä ja viisi 1 I i käytetään myös kahta rakennemääräaluetta, mutta matala 35 alue ja korkea alue eivät mene päällekkäin. Näin käytetty-
1 I
t > } 112094 17 jen rakenteiden määrää amplifikaatioreaktiota kohden voidaan vähentää sillä aikaa, kun sama määrällinen kokonais-alue tulee edelleen katetuksi.
Q-RNA:iden (rakenteiden) ja villityypin RNA:n amp-5 lifikaationopeus on sama, koska RNA:t ovat samankokoisia, eroten toisistaan vain 20 satunnaisen nukleotidin sekvenssin osalta, ja samoja alukkeita ja entsyymejä käytetään amplifikaatioon. Siksi kunkin rakenne-RNA:n ja villityypin RNA:n määrien alkuperäinen suhde ei muutu amplifikaation 10 aikana. Amplifikaation jälkeisessä osoitusmenetelmässä kukin amplifioitava seos jaetaan neljään määritykseen vil-lityyppi-, QA-, QB- tai QC-RNA-amplifioidun aineen osoittamiseksi. (Kokeen neljä ja viisi amplifioitavat seokset pitää jakaa vain kolmeen määritykseen.) 15 Mikäli rakennesignaalin ja villityyppisignaalin log-suhde ilmaistaan rakenne-RNA:n lähtömäärän logaritmin funktiona, otaksutaan saatavan suora. Villityypin RNA:n määrä voidaan laskea tältä suoralta. Tulokset, joita voidaan saada edellä kuvatuilla kokeilla, on esitetty ku-20 vioissa 1-5. Kunkin kuvion ensimmäisessä kuvassa (a) on . . esitetty erilaisten rakenteiden määrät, ennen ja jälkeen » · · '· amplifikaation, jolloin analysoitavan nukleiinihapon määrä osoitetaan myös.
• * * *...· Kunkin kuvion toisessa kuvassa (b) nähdään kuvaaja, 25 jossa odotettujen rakennesignaalien ja analyyttisignaalin : j (näytesignaali) logaritminen suhde esitetään rakenteiden lähtömäärien logaritmin funktiona. Analysoitavien nukleii- nihappomolekyylien lähtömäärä voidaan johtaa näistä kuvaa- :v. jista ja se on seurausta lähtöarvon logaritmista (kuten .··. 30 vaaka-akselilla on kuvattu), joka sopii pisteeseen pysty- • > akselilla, jossa suhde on yksi.
Esimerkki 2
Tehtiin seos kvantitoiduista määristä HIV-1 gagl -RNA-transkriptirakennetta, joka sisältää tässä järjestyk-, ··, 35 sessä 200, 2 000 ja 20 000 kopiota kolmea nukleiinihappo- 112094 18 rakennetta, QA, QB ja QC. Kvantitoidut määrät viittä eri villityypin HIV-1 gagl - transkriptiä, 200 000, 20 000, 2 000, 200 ja 20 kopiota ja nolla, sekoitettiin Q-rakenne-RNA:iden seokseen.
5 Kuusi amplifikaatioreaktiota, yksi kullekin mää rälle villityypin-RNA:ta, suoritettiin standardiprotokol-lan mukaan (T. Kievits et ai.). Kustakin amplifioidusta näytteestä 5 μΐ laimennettiin 100 μΙ-.αΆη TBE-puskurilla (90 mM Tris-boraatti, 1 mM EDTA, pH 8,4). Kustakin laimen-10 noksesta 5 μΐ lisättiin putkeen, joka sisälsi 15 μΐ seosta, joka sisälsi 3 pmol biotiinioligoseosta, kaikkien amplif ioituj en molekyylien sieppaamiseksi, 3 pmol erilaisia tris (2,2'-bipyridiini)rutenium(II)kelaatilla leimattuja oligonukleotideja, joista kukin sisältää spesifisen sek-15 venssin joko villityypin RNA-amplifikaateille tai yhdelle rakenneamplifikaateista (QA, QB tai QC) ja 20 μg strepta-vidiinilla päällystettyjä Dynal®-magneettihelmiä M280 6,67 x SSC-puskurissa (0,75 M NaCl, 0,075 M natriumsitraatti, pH 7 - 8) . Yhdelle amplifioidulle näytteelle tehtiin neljä 20 hybridisaatiomääritystä WT:n, QA:n, QB:n tai QC:n osoitta-miseksi. Seoksia hybridisoitiin 30 minuuttia 41 °C:ssa ja niitä sekoitettiin joka kymmenes minuutti. 300 μΐ määri- .**·. tyspuskuria lisättiin elektrokemiluminesenssi-ECL-osoi- tusta varten käyttäen IGEN'n ORIGEN® 1,5 -osoitusjär- * · ; 25 jestelmää, ja sekoitettiin. Varsinainen osoitus ORIGEN® • · · 1,5 -osoitusjärjestelmässä suoritettiin valmistajan ohjeen * · · • mukaan.
Esimerkki 3 • · · .* ·" Tässä esimerkissä kuvataan Q-NASBA-määritys, jossa 30 kolme Q-RNA-sisäistä standardia lisätään WT-RNA-näyt tee-seen määrinä 104, 103 ja 102 molekyyliä. Kolme sisäisen * · .···. standardin RNA-molekyyliä erotettiin käyttäen spesifisiä • · • ECL-leimattuja koettimia 20 nukleotidin satunnaiselle sek- venssille (Van Gemen et ai., J. Virol. Methods 43 (1993) 35 177 - 188), spesifisiä kullekin sisäiselle standardille.
112094 19 NASBA:11a amplifioitujen sisäisten standardien ja WT-RNA:n suhteet mitattiin käyttäen ECL-osoitusinstrumenttia.
ECL perustuu kerniluminesenssileimoihin, jotka emittoivat valoa elektrodin pinnalla (Blackburn et ai., Clin 5 Chem. 37 (1991) 1534 - 1539). Signaalin osoitus voidaan kvantitoida yli viiden kertaluvun dynaamisella alueella käyttäen spesifisesti kehitettyä osoitusinstrumenttia. ECL-teknologiaa on sovellettu amplifioidun nukleiinihapon osoittamiseen käyttämällä ECL-leimattuja oligonukleotideja 10 hybridisaatiomäärityksissä (Kenten, J.H. et ai., Clin Chem. 38 (1992) 873 - 879). Koska WT-, QÄ-, QB- ja Qc-ECL-koettimien spesifiset aktiivisuudet tunnetaan, WT-, QÄ-, QB- Ja Qc-NASBA-amplifioitujen RNA:iden suhteet voitiin määrittää vastaavien koettimien signaalien suhteista.
15 Alkuperäinen WT-RNA:n lähtömäärä luettiin WT-sig- naalin suhteesta QA-, QB- ja Qc-signaaleihin ECL-helmiin perustuvassa määrityksessä.
Tapa, jolla Q-rakenteet valmistettiin ja määritys suoritettiin, kuvataan "materiaalit ja menetelmät" -osas-20 sa, tässä kappaleessa.
. . Yhden putken Q-NASBA-protokollaa ECL-osoituksella • » · j * käytettiin kvantitoimaan eri määriä in vitro -muodostunut- ta WT-RNA:ta. Suoritettiin kolme eri määritystä käyttäen ΙΟ1,44, ΙΟ2-83, 104,23 ja 104'83 lähtö-WT-RNA-molekyyliä lähtöta-: * 25 soina, tässä järjestyksessä. Q-NASBA käyttäen ECL-helmiin ·,· j perustuvaa määritystä suoritettiin 8-10 kertaa kullekin : kvantitoidulle WT-RNA-määrälle sekoittamalla WT-RNA 104 QÄ-RNA-molekyylillä, 103 QB-RNA-molekyylillä ja 102 QC-RNA-molekyylillä yhdessä NASBA-amplifikaatiossa. Tulokset ,**·. 30 (keskiarvo ± SD) suoritetuista kvantitoinneista olivat *;* 101.54±0.23^ 1Q2.68±0.21^ 1C)4.16±0.20 ja 104.81±0.23 K)1'44, v.: ΙΟ2'83, 104'23 ja ΙΟ4-83 lähtö-WT-RNA-molekyyliä lähtöarvona tässä järjestyksessä.
Suoritettujen määritysten tulokset on kuvattu ku-. · . 35 viossa 6. Kuten tästä kuvasta voidaan nähdä, WT-RNA-määrä 112094 20 voidaan kvantitoida luotettavasti 1/10:aan matalimmasta käytetystä Q-RNA-määrästä yhden putken kvantitointiproto-kollassa.
Materiaalit ja menetelmät 5 Plasmidit ja RNA-synteesi
Geeni- ja rekombinantti-DNA-tekniikat noudattivat standardimenetelmiä (Sambrook, J. et ai., Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Lab., 1989. 2. painos). pGEM3RAN-plasmidia 10 (Van Gemen et al., 1993), jossa on 22 nukleotidin satunnainen sekvenssi (positio 1 429 - 1 451 HIV-1 pv22 -sekvenssi, Muesing, M.A. et ai., Nature 313 (1985) 450 - 458), käytettiin deletoimaan ACC I -kohta monikloonaus-kohdassa ja osa HIV-1:n kloonattua sekvenssiä (positio 15 1 691 - 2 105 HIV-1 pv22) syistä, jotka eivät liity kvan titatiiviseen NASBA-amplifikaatioon. Satunnainen sekvenssi korvattiin tässä plasmidissa sekvensseillä 5'ATG.CAA.GGT.CGC.ATA.TGA.GTA.A3' tai 5'ATA.AGC.ACG.TGA.CTG.AGT.ATG.A3' 20 pGEM3QB6gag3: n ja pGEMQc6gag3: n muodostamiseksi, tässä . . järjestyksessä. pGEM3RAN-plasmidi nimettiin uudelleen ; / pGEM3QÄ:ksi. In vitro -RNA muodostettiin pGEM3p24:stä (WT- RNA), pGEM3QÄ:sta (QÄ-RNA), pGEM3QB6gag3: sta (QB-RNA) ja * * *·..* pGEM3Qc6gag3: sta (QC-RNA) käyttäen SP6-RNA-polymeraasia 25 (Sambrook, 1989). Kloonatut pGEM3p24- ja pGEM3QÄ- insert it •J j kloonattiin uudelleen pGEM4-vektoriin, jolloin muodostui : : : pGEM4p24 ja pGEM4QÄ. Näitä plasmideja käyttämällä tehtiin in vitro -RNA:ta T7-RNA-polymeraasilla (Sambrook, 1989). I'.'; In vitro -RNA:n pituus on 1 514 nukleotidia plasmideille .···. 30 pGEM3p24 (WT-RNA) ja pGEM3QÄ (QÄ-RNA) ja 1 090 nukleotidia plasmideille pGEM3QB6gag3 (QB-RNA) ja pGEMQc6gag3 (QC-RNA). ·'>’ RNA:ta käsiteltiin DNAasilla plasmidi-DNA:n poistamiseksi ja puhdistettiin anioninvaihtopylväässä (Qiagen). In vitro -RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti ja laimennettiin 112094 21 haluttuihin pitoisuuksiin vedellä. Kaikkia RNA-liuoksia säilytettiin -20 °C:ssa.
Nukleiinihapon eristys
Nukleiinihapot eristettiin plasmasta Boomin et ai. 5 menetelmän mukaan (Boom, R., et ai., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495 - 503, Van Gemen et ai., 1993). Nukleiinihappo 100 pl:sta plasmaa suspendoitiin lopuksi uudelleen 100 pl:aan vettä ja sitä säilytettiin -70 °C:ssa.
NASBA
10 Kaikki entsyymit ostettiin Pharmacialta, paitsi AMV-käänteistranskriptaasi, joka ostettiin Seikagakulta. BSA ostettiin Boehringer Mannheimilta. 23 μΐ NASBA-reak-tioseoksia (lopullinen pitoisuus 25 pl:ssa reaktioseosta: 40 mM Tris, pH 8,5, 12 mM MgCl2, 42 mM KC1, 15-%:inen t/t 15 DMSO, 1 mM kutakin dNTPrtä, 2 mM kutakin NTP:tä, 0,2 pm aluketta 1: 5'AAT.TCT.AAT.ACG.ACT.CAC. TAT.AGG.GTG.CTA.TGT.CAC. TTC.CCC. TTG.GTT.CTG.TGA, 0,2 pm aluketta 2: 20 5 ' AGT. GGG. GGG. ACA. TCA. AGC. AGC. CAT. GCA. AA, 0,2 - 2 pl villityypin RNA:ta ja 2 pi in vitro -Q-RNA:ta); ; / (Kievits, T. et ai., J. Virol. Methods. 35 (1991) 273 - '·”·* 286; Van Gemen et ai., 1993) inkuboitiin 65 °C:ssa 5 mi- • · ♦ • · nuuttia RNA:n sekundaarirakenteiden destabilisoimiseksi ja * 25 sen jälkeen jäähdytettiin 41 °C:seen, jotta alukkeiden »,· · hybridisaatio tapahtuisi. Amplifikaatio aloitettiin lisää- mällä 2 pl entsyymi seosta (0,1 pg/pl BSA: ta, 0,1 yksikköä RNaasi H:ta, 40 yksikköä T7 RNA-polymeraasia ja 8 yksik-köä AMV-käänteistranskriptaasia). Reaktioita inkuboitiin 30 41 °C:ssa 90 minuuttia. Jokaiseen kvantitaatioon lisättiin kaksi negatiivista kontrollia.
Entsymaattinen helmiin perustuva osoitus :...· NASBA-amplifioidun WT- ja QÄ-RNA:n suhteen osoitta- miseksi ja määrittämiseksi aikaisemmin kuvatussa kvanti-,··*, 35 tointiprotokollassa (Van Gemen et ai., 1993) kehitettiin 112094 22 helmiin perustuva entsymaattinen määritys. 100 μΐ 2,8 pm:n streptavidiinilla päällystettyjä paramagneettisia polysty-reenihelmiä (Dynal Inc., Great Neck, N.Y., USA) pestiin kaksi kertaa 200 plrlla 1 x PBS:ää, 0,l-%:ista BSA:ta ja 5 suspendoitiin uudelleen 100 pl:aan 1 x PBS:ää, 0,l-%:ista BSA:ta. Pestyjä helmiä inkuboitiin yksi tunti huoneenlämpötilassa 300 pmol:lla HIV-l-spesifistä, biotinyloitua sieppauskoetinta (5'TGT.TAA.AAG.AGA.CCA.TCA.ATG.AGG.A) 10 ja pestiin edelleen kerran 200 pl:lla 5 x SSPE:tä, 0,l-%:ista SDS:ää ja kerran 200 pl:lla 1 x PBSrää, 0,l-%:ista BSArta. Helmet suspendoitiin uudelleen 100 pl:aan 1 x PBS:ää, 0,l-%:ista BSA:ta. 5 μΐ helmiä, 5 μΐ NASBA-reaktioseosta ja 50 μΐ hybridisaatiopuskuria (5 x 15 SSPE, 0,l-%:inen SDS, 0,l-%:inen blokkausreagenssi, 10 pg/ ml lohen sperman DNA) inkuboitiin 30 minuuttia 45 °C:ssa. Helmet pestiin kaksi kertaa 100 pl:lla 2 x SSC:tä, 0,l-%:ista BSA:ta, jonka jälkeen inkuboitiin 5 x 10-7 pmoo-lilla WT- tai Q-osoitusoligonukleotidikoetinta, josta 10 % 20 oli HRP-leimattua, 50 pl:ssa hybridisaatiopuskuria 30 mi-. , nuuttia 45 °C:ssa. Helmisieppausoligonukleotidi-NASBA:11a · amplifioitu WT- tai QÄ-RNA-osoituskoetinkompleksi pestiin '·** kerran 100 pl:lla 2 x SSC:tä, 0,l-%:ista BSA:ta, kerran ·...· 100 pl:lla TBSTrtä ja kaksi kertaa 100 pl:lla TBS:ää. Seu- ‘“ί 25 raavaksi lisättiin 100 μΐ värisubstraattia (TMB/peroksidi- : : : liuosta) helmiin ja inkuboitiin 3 minuuttia huoneenlämpö-
:‘j‘: tilassa. Värireaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 250 mM
oksalaattia. 150 μ1:η värireaktion absorbanssi luettiin 450 nmrssä mikrolevylukijassa (Mikro SLT 510, Organon ,···. 30 Teknika, Boxtel, Alankomaat). Absorbanssiarvot korjattiin T taustasignaalin suhteen (ts. negatiivisten kontrollien \V suhteen), ja signaali laskettiin prosenttina saadusta sig- naalista itsenäisesti amplifioiduilla WT- ja QÄ-RNA:illa.
ECL helmiin perustuva osoitus 35 5 μΐ NASBA:lla amplifioitua RNA:ta (WT, QÄ, Q„ ja
Qc) 20-kertaisesti laimennettuna veteen inkuboitiin 20 μ1:η 112094 23
kanssa (3,3 pmoolia) HIV-l-spesifistä, biotinyloitua siep-pauskoetinta (katso entsymaattinen helmiin perustuva osoitus) , 3,3 pmoolin kanssa ECL:llä (tris[2,2-bipyridiini]ru-tenium(II)kompleksi) leimattua oligonukleotidikoetinta, 5 joka on spesifinen joko WT-, QÄ-, Qb- tai Qc-NASBA-amp-lifioidulle RNA:lle ja 20 ^g:n kanssa (2 μΐ) streptavidii-nilla päällystettyjä magneettihelmiä 5 x SSC:ssä 30 minuuttia 41 °C:ssa. Inkuboinnin aikana putkia sekoitettiin joka kymmenes minuutti Vortex-sekoittajalla. Tämän jälkeen 10 lisättiin 300 μΐ TPA-liuosta (100 mM tripropyyliamiini, pH = 7,5) ja hybridisaatioseos pantiin Origen® 1,5 ECL
-osoituslaitteeseen (Organon Teknika, Boxtel, Alankomaat).
Esimerkki 4
Nukleiinihapon eristyksen tehokkuus voi vaikuttaa 15 WT-RNA-kvantitaation tulokseen. Eristyksessä tapahtuvan nukleiinihapon hävikin vaikutuksen kiertämiseksi Qa-, Qb-ja Qc-RNA:t voidaan lisätä ennen nukleiinihapon eristyksen ensimmäistä vaihetta tai sen aikana (kuvio 7) . Tämä periaate testattiin käyttäen 104 molekyyliä in vitro 20 muodostettua WT-RNA:ta ja HIV-1 RNA:ta, joka oli eristetty in vitro -viljellystä viruskantaliuoksesta. In vitro - • · •V. muodostunut WT-RNA ja HIV-1-viruskanta-RNA eristettiin uu- • · ,···. delleen lisäämällä Qa-, Qb- ja Qc-RNA:ta ja lisäämättä nii- • « tä nukleiinihapon eristyksen ensimmäisessä vaiheessa (ts.
• · . . 25 lyysipuskurissa). Käytetyt menetelmät kuvataan "materiaa- • * · lit ja menetelmät" -osassa esimerkissä 3.
* · » * Kun alunperin eristetty WT-RNA ja HIV-1-viruskan ta-RNA kvantitoitiin lisäämällä QÄ:ta, QB:tä ja Qc:tä amp-: lifikaation aikana (ts. kontrollikvantitaatiot) , tulos oli ·...· 30 3,3 x 104 ja 2,1 x 104 in vitro muodostuneelle WT-RNA:lie ja HIV-1-viruskanta-RNA: lie, tässä järjestyksessä. Uudel- ,··, leeneristetyn RNA:n kvantitointi lisäämällä Qa-, Qb- ja Qc- * » *·' RNA:ta ennen uudelleeneristysproseduuria osoitti 2,5 x 104 ja 1,5 x 104 in vitro -muodostuneelle WT-RNA:lle ja HIV-1-35 viruskanta-RNA: lie, tässä järjestyksessä. Kuitenkin, kun 112094 24 uudelleeneristettyä RNA:ta kvantitoitiin lisäämällä QÄ-, QB- Ja Qc-HNA:ta uudelleenerisämisproseduurin jälkeen, tulos oli 4,7 x 103 ja 2,0 x 103 in vitro -muodostuneelle WT-RNA:lie ja HIV-l-viruskanta-RNA:lie, tässä järjestyksessä. 5 Tämä osoittaa, että RNA:n uudelleeneristyksen teho oli noin 10 %. Kuitenkin QÄ:n, QB:n ja Qc:n lisäys ennen uudel-leeneristystä johti RNA-kvantitaatioihin, jotka olivat samat kuin kontrollikvantitaatiot WT-RNA :QÄ-RNA:QB-RNA:QC-RNA-vakiollisen suhteen takia, joka ei riipu eristetyn 10 nukleiinihapon absoluuttisesta määrästä.
Tulokset on kuvattu taulukossa 2.
Taulukko 2 104 in vitro -muodostuneen WT-RNA-molekyylin ja HIV-1-vi-15 ruskantaliuos-RNA:n uudelleeneristämisen vertailu lisää mällä Qa— , Qb- ja Qc-RNA:ta nukleiinihapon eristämisen ensimmäisen vaiheen aikana ja nukleiinihapon eristämisen jälkeen 20 Lisäykset NH- Lisäykset” NH- Kvantitoitu
, , eristyksen jälkeen eristyksen jälkeen WT-RNA
• · · / 104 WT-RNA + QÄ, Qb, Qcb 3,3 x 104 104 WT-RNA QÄ, QÄ, Qc 4,7 X 103 « · · 104 WT-RNA + QÄ, Qb, Qc 2,5 x 104 * 25 Viruskantaliuos-RNA + : QÄ, 0bf Qcb 2,1 x 104
Viruskantaliuos-RNA QÄ, QB, Qc 2,0 χ 103
Viruskantaliuos-RNA + 1,5 χ 104 ; ·*; Qä' Qb' Qc 30 i · ·* a. QÄ:ta, QB:tä ja Qc:tä lisättiin ΙΟ2, 103 ja 104 RNA-mole- * ? * kyyliä, tässä järjestyksessä.
b. Kontrolliamplifikaatiot ilman nukleiinihapon uudelleen-eristystä.
* s » # 25 112094
Esimerkki 5
Keksinnön mukaista menetelmää verrattiin aikaisemmin kuvattuihin Q-NASBA-protokolliin (Van Gemen et ai., 1993; Jurriaans et ai., submittoitu, 1993), joissa käyte-5 tään vain yhtä Q-RNA:ta ja mikäli 5 log:n dynaaminen alue on saavutettava, ainakin 6 amplifikaatioreaktiota kliinistä näytettä kohden (villityyppi) on tarpeellista, ts. yksi positiivinen WT-kontrolli ilman sisäisen standardin lisäystä ja viisi reaktiota kasvavalla määrällä sisäistä 10 standardi-RNA-molekyyliä (102 - 106).
Amplifikaatioreaktioiden lukumäärää voidaan laskea keksinnön mukaisella menetelmällä, jossa useita erotettavissa olevia sisäisiä standardeja pannaan yhteen amplifi-kaatioon.
15 Sitä vastoin, kun käytetään vain yhtä 0-RNA:ta (QA) yhdessä entsyymillä leimattujen koettimien kanssa, alkuperäinen WT-RNA-pitoisuus täytyy johtaa WT-signaalin ja Q-signaalin suhteesta käyttämällä eri Q-RNA-pitoisuuksia erillisissä amplifikaatioissa.
20 Näitä kahta menetelmää verrattiin käyttäen malli- , . järjestelmiä ja HIV-l-infektoitujen yksilöiden plasmanäyt- • » · ; t* teitä.
* · «
Yhden putken Q-NASBA:a, käyttäen QÄ-, QB- ja Qc-*.·.* RNAtta, verrattiin aikaisemmin kuvattuun Q-NASBA-protokol- *“· 25 laan (Van Gemen et ai., 1993), jossa käytetään 6 amplifi- ·,· · kaatiota kvantitaatiota kohden analysoimalla 0,1 ml kolmen :Y: oireettoman HIV-l-infektoidun yksilön plasmanäytteitä.
Samassa kokeessa ero QA:n, QB:n ja Qc:n lisäämisen välillä ennen ja jälkeen nukleiinihappoeristyksen tutkittiin taas .··. 30 (taulukko 3). Tapauksissa, joissa WT-RNA kvantitoidaan t · yhden putken Q-NASBA-protokollalla, WT-RNA-määrästä voi- « * > daan kvantitoida luotettavasti 1/10 matalimmasta käytetys-tä Q-RNA-määrästä yhden putken kvantitointiprotokollassa. j. Koska QÄ:n, QB:n ja Qc:n lisäys ( 6 x 105, 6 x 104 ja ,*··, 35 6 x 103, tässä järjestyksessä) tapahtuu 0,1 ml:aan plasmaa, 112094 26 kun ne lisätään lyysipuskuriin, matalampi luotettava kvan-titointiraja on 6 x 102 RNA-kopiota 0,1 ml:ssa plasmaa. QÄ: n, QB:n ja Qc:n lisäys ( ΙΟ4, 103 ja 102, tässä järjestyksessä) eristettyyn nukleiinihappoon antaa luotettavan al-5 haisemman kvantitointirajan, 103 RNA-kopiota 0,1 ml:ssa plasmaa, kun 1 μΐ nukleiinihapon plasmaekvivalentteja käytetään amplif ikaatioon. Molemmissa tapauksissa WT-RNA-mää-rää voidaan kvantitoida luotettavasti 1/10:aan matalammasta käytetystä Q-RNA-määrästä yhden putken kvantitaatiopro-10 tokollassa. Protokollassa, jossa käytetään kuutta amplifi-kaatioreaktiota kvantitaatiota kohden 102:n ollessa matalin sisäinen Q-RNA-standardin määrä, on luotettava alhaisempi kvantitointiraja 104 RNA-kopiota 0,1 ml:ssa plasmaa, kun 1 μ1:η nukleiinihapon plasmaekvivalentteja käytetään amp-15 lifikaatioon. Tulokset osoittavat, että tässä erityisessä kokeessa nukleiinihapon eristyksen teho vaihteli 100 %:n (potilas 1) ja 50 %:n (potilas 2) välillä. Potilas 3 oli aina alle luotettavan kvantitointirajan, vaikka tämä raja oli tarkin (ts. matalin) yhden putken Q-NASBA-määritykses-20 sä lisäämällä QA, QB ja Qc lyysipuskuriin ennen nukleiiniha- , , pon eristystä (taulukko 3).
* · · * « · * ♦ • « ♦ • · * t t ♦ » t , • t 27 112 0 9 4
Taulukko 3:
Yhden putken Q-NASBA:n vertailu kvantitaatioprotokollaan, jossa käytetään kuutta amplifikaatiota kvantitaatiota kohden 1 ml:n plasmanäytteille kolmesta HIV-l-infektoidusta 5 potilaasta
Potilas ABC
1 <1,0X104 1,5Χ103 Ι,ΙχΙΟ3 10 2 Ι,ΟχΙΟ4 5 r 6xl03 1,3xl04 3 <1,ΟΧΙΟ4 <1,0x103 <6,OxlO2 A: Q-NASBA, jossa 6 amplifikaatiota kvantitaatiota kohden 15 B: Yhden putken Q-NASBA; QAB c lisätty nukleiinihappoeris-tyksen jälkeen.
C: Yhden putken Q-NASBA; QA B c lisätty ennen nukleiinihap-poeristystä.
20 Esimerkki 6
Lopuksi testasimme yhden putken Q-NASBA:n toistet-\ tavuuden lisäämällä QA:ta, Q„:tä ja Qc:tä lyysipuskuriin en- ·,·,· nen nukleiinihappoeristystä käyttäen in vitro -viljeltyä : HIV-l-viruskantaliuosta, jossa viruspartikkelien määrä *;·! 25 kvantitoitiin elektronimikroskopialla (Layne, S.P. et ai., • Virology 189 (1992) 695 - 714). HIV-l-viruskantaliuos,
II· I
.*;*. joka sisältää 2,9 x 101 viruspartikkelia millilitrassa, laimennettiin 10 000 kertaa veteen ja QÄ, QB ja Qc (6 x 105, 6 x 104 ja 6 x 103, tässä järjestyksessä) lisättiin 100 • · 30 ui:aan laimennettua viruskantaliuosta, mistä seuraa 4,35 x 1 RNA-molekyylin mittaus millilitraa kohden. Tulokset • ·
V,' kuvataan taulukossa 4. RNA-kvantitaation keskiarvo ± SD
^ *: oli 101'64 4 ° 05, osoittaen että yhden putken Q-NASBA:n \ tarkkuus on 0,1 log:n sisällä, kun kvantitoidaan tätä in • · 28 112094 vitro -viljeltyä viruskantaliuosta. (Käytetyt proseduurit kuvataan esimerkin 3 "Materiaalit ja menetelmät" -osassa).
Taulukosta 4 voidaan nähdä, että määrityksen tarkkuus 0,1 log:n sisällä, kun kvantitoidaan HIV-l-RNA:ta in 5 vitro -viljellystä viruskantaliuoksesta, voidaan saavuttaa keksinnön mukaisella menetelmällä. Tämä tulos mahdollistaa erojen luotettavat mittaukset 0,4 log:n ja sitä suuremmalla HIV-l-RNA-sisällöllä.
10 Taulukko 4:
Yhden putken Q-NASBA:n toistettavuus. In vitro -viljelty HIV-l-viruskantaliuos sisältää 2,9 (± 1,6) x 1010 viruspar-tikkelia ml:ssa 15 Nukleiinihapon RNA-molekyylit/ml eristys_(ka ± SD)_ 1 lo10,69i0,16 a 1 lo10f53+0,03 a 20 1 lo10,6110,03 a 2 lo10,6410,05 a . . 2 lo10,6510,01 a 2 lo10,6810,02 a 3 lo10,64!0,05 b 4 lo10,6710,06 b ·;·· ^5 5 10^,6510,07 b • » * * · QÄ, Qb ja Qc (6 x 105, 6 x 104 ja 6 x 103, tässä järjestyk- » » · • ’ sessä) lisättiin 100 plraan vedellä 10 000-kertaisesti laimennettua viruskantaliuosta.
i * t * * » • *’ 30 a. Kaksi rinnakkaista amplifikaatiota
I < I
b. Kolme rinnakkaista amplif ikaatiota
Kaikkien kvantitaatioiden keskiarvo ± SD on 1010’64 1 0 05 * · · ,···, (4,35 x 1010) RNA-molekyyliä millilitrassa.
• » »Iti
Claims (17)
1. Menetelmä analysoitavan nukleiinihapon kvanti-toimiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että siinä 5 on vaiheet: lisätään ennalta määritettyyn näytetilavuuteen erilaisia vastaavia määriä tunnettuja eri nukleiinihappo-rakenteita kunkin rakenteen ollessa erotettavissa toisista nukleiinihapporakenteista ja analysoitavasta nukleiiniha-10 posta saatetaan näyte nukleiinihappoamplifikaatioon käyttäen amplifikaatioreagensseja, jotka kykenevät reagoimaan samalla teholla sekä analysoitavan nukleiinihapon että nukleiinihapporakenteiden kanssa, 15. osoitetaan amplifioitujen molekyylien, jotka ovat peräisin analysoitavasta nukleiinihaposta ja kustakin nukleiinihapporakenteesta, suhteelliset määrät, lasketaan analysoitavan nukleiinihapon määrä mainituista suhteellisista määristä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihapporakenteilla on • ·, sama sekvenssi kuin analysoitavalla nukleiinihapolla, paitsi että kussakin nukleiinihapporakenteessa on yksilöllisesti erotettavissa oleva sekvenssi. t 25
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksilöllisesti erotettavissa oleva sekvenssi on satunnainen sekvenssi, joka käsittää noin 20 nukleotidia.
• 4. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mu-30 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiini- » » » t.|.( happorakenteita lisätään määräalueina, jotka eroavat toi- sistaa vakiokertoimella. • * • » Ί*
5. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mu- ..!· kainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiini- : : 35 happorakenteita lisätään määräalueina, jotka eroavat toi sistaan kertoimella 10. 112094 30
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte valmistetaan saattamalla tunnettu määrä testinestettä nukleiinihappoeristyspro-seduuriin, jolloin nukleiinihapporakenteet lisätään tes- 5 tinesteeseen ennen mainitun testinesteen saattamista nukleiinihapon eristysproseduuriin.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tunnettu määrä eristyskont-rollisekvenssiä lisätään näytteeseen sen jälkeen kun tes- 10 tineste on saatettu nukleiinihappoeristysproseduuriin.
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte jaetaan useampaan kuin yhteen reaktiotilavuuteen, joihin kuhunkin lisätään nukleiinihapporakenteita eri määräalueina.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuhunkin reaktiotilavuuteen lisätään samat nukleiinihapporakenteet.
10. Patenttivaatimusten 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määräalueet eivät mene 20 päällekkäin. .•. j
11. Menetelmä analysoitavan nukleiinihapon kvanti- ,V. toimiseksi useammassa kuin yhdessä näytteessä, t u n - » · · n e t t u siitä, että kukin näyte saatetaan patenttivaatimuksen 1 menetelmään, jolloin samoja nukleiinihappora- , 25 kenteita käytetään kaikissa näytteissä ja kunkin tietyn ·'· · nukleiinihapporakenteen määrät vaihtelevat.
·' ’ 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kussakin näytteessä käytetään ; V nollamäärää yhtä nukleiinihapporakennetta.
13. Menetelmä analysoitavan nukleiinihapon kvanti- .·[·, toimiseksi testinestepaneelista, tunnettu siitä, !.! että siinä on vaiheet: • » *1’ - laimennetaan määrä mainittuja testinesteitä tun- netulla kertoimella ja otetaan näytteet mainituista lai-i 35 mennetuista testinesteistä, jotka sisältävät sellaisen 112094 31 määrän analysoitavaa nukleiinihappoa, jonka otaksutaan olevan tietyllä alueella, - tehdään näytteille patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin näytteisiin lisättyjen nukleiini- 5 happorakenteiden määrät ovat mainitun alueen sisällä.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä on lisävaiheet: tunnistetaan näytteet, jotka sisältävät analysoitavan nukleiinihappomäärän, joka on alle mainittujen 10 määräalueiden, - tehdään testinesteille, joista mainitut näytteet ovat peräisin, patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jolloin mainitut määrät laimennetaan pienemmällä kertoimella .
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä on lisävaiheet: tunnistetaan näytteet, jotka sisältävät analysoitavan nukleiinihappomäärän, joka on yli mainittujen määräalueiden, 20. tehdään testinesteille, joista mainitut näytteet .·. : ovat peräisin, patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, • I · >·#·, jolloin mainitut määrät laimennetaan suuremmalla kertoi- • » · mella. • · • ·
16. Menetelmä analysoitavan nukleiinihapon kvanti-25 toimiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että siinä : on vaiheet: » 4 f ·.· · - lisätään näytteeseen määrä nukleiinihapporaken- netta, jolloin mainitun määrän otaksutaan olevan samalla • alueella kuin otaksuttu mainitussa näytteessä oleva ana-i 30 lysoitava nukleiinihappomäärä, - saatetaan näyte nukleiinihappoamplifikaatiopro-seduuriin käyttäen amplifikaatioreagensseja, jotka kykenevät reagoimaan sekä analysoitavan nukleiinihapon että nuk-leiinihapporakenteiden kanssa, • * » 112094 32 osoitetaan amplifioitujen molekyylien, jotka ovat peräisin analysoitavasta nukleiinihaposta ja nukle-iinihapporakenteesta, suhteellinen määrä, arvioidaan analysoitavan nukleiinihapon määrä 5 mainitussa näytteessä mainitusta suhteellisesta määrästä - saatetaan toinen näyte samasta testinesteestä patenttivaatimuksen 1 menetelmään, jolloin lisättyjen nuk-leiinihapporakenteiden määrät ovat samalla alueella kuin arvioitu ensimmäisessä näytteessä oleva analysoitava nuk-10 leiinihappomäärä.
17. Testikitti nukleiinihapon kvantitoimiseksi näytteestä patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että se sisältää eri nukleiinihap-porakenteet, amplifikaatioreagenssit, jotka kykenevät rea-15 goimaan nukleiinihapporakenteiden ja analysoitavan nukleiinihapon kanssa, osoituskoetin amplifioidulle analysoitavalle nukleiinihapolle ja eri osoituskoettimet, jotka ovat spesifisiä eri amplifioiduille nukleiinihapporakenteille erikseen. 20 • » · • · · • | » I · ' ♦ · 1 1 1 * I · 112094
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93202015 | 1993-07-09 | ||
| EP93202015 | 1993-07-09 | ||
| EP93203424 | 1993-12-06 | ||
| EP93203424 | 1993-12-06 | ||
| EP9402295 | 1994-07-08 | ||
| PCT/EP1994/002295 WO1995002067A1 (en) | 1993-07-09 | 1994-07-08 | Improved method for the quantification of nucleic acid |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI951082A FI951082A (fi) | 1995-03-08 |
| FI951082A0 FI951082A0 (fi) | 1995-03-08 |
| FI112094B true FI112094B (fi) | 2003-10-31 |
Family
ID=26133903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI951082A FI112094B (fi) | 1993-07-09 | 1995-03-08 | Parannettu menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3594598B2 (fi) |
| KR (1) | KR100312800B1 (fi) |
| AT (1) | ATE178946T1 (fi) |
| AU (1) | AU668659B2 (fi) |
| CA (1) | CA2143857C (fi) |
| DE (1) | DE69417863T2 (fi) |
| DK (1) | DK0662156T3 (fi) |
| ES (1) | ES2131699T3 (fi) |
| FI (1) | FI112094B (fi) |
| WO (1) | WO1995002067A1 (fi) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69432419T2 (de) * | 1993-09-22 | 2004-01-08 | Igen International, Inc. | Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation |
| CA2159044A1 (en) * | 1994-09-26 | 1996-03-27 | Falko-Guenter Falkner | Method of quantitating nucleic acids |
| US5705365A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Gen-Probe Incorporated | Kits for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| US5710029A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-20 | Gen-Probe Incorporated | Methods for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| JP3996639B2 (ja) * | 1995-06-07 | 2007-10-24 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 生成物の増幅後レベルから核酸標的配列の増幅前レベルを決定するための方法とキット |
| GB9519638D0 (en) * | 1995-09-26 | 1995-11-29 | Dynal As | Method |
| US5795722A (en) * | 1997-03-18 | 1998-08-18 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample |
| US5677124A (en) * | 1996-07-03 | 1997-10-14 | Ambion, Inc. | Ribonuclease resistant viral RNA standards |
| US5939262A (en) | 1996-07-03 | 1999-08-17 | Ambion, Inc. | Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization |
| US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| FR2765590B1 (fr) * | 1997-07-01 | 2002-08-09 | Pasteur Institut | Methode de semi-quantification d'alleles |
| AU4515699A (en) * | 1998-06-26 | 2000-01-17 | Akzo Nobel N.V. | Tagging of rna amplicons generated by transcription-based amplification |
| EP1013776A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-28 | Universiteit van Amsterdam | A sensitive assay for the detection or quantitation of human cytomegalovirus nucleic acid |
| GB9902422D0 (en) * | 1999-02-03 | 1999-03-24 | Lgc Teddington Limited | Reference material for nucleic acid amplification |
| DE60022541T2 (de) * | 1999-07-23 | 2006-06-14 | Gen Probe Inc | Polynukleotid- amplifikationsverfahren |
| AT409383B (de) * | 1999-12-22 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Verfahren zur detektion und quantifizierung von nukleinsäuren in einer probe |
| WO2002024949A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Hitachi, Ltd. | Procede d'analyse d'acide nucleique |
| US6312929B1 (en) * | 2000-12-22 | 2001-11-06 | Cepheid | Compositions and methods enabling a totally internally controlled amplification reaction |
| JP5564795B2 (ja) * | 2009-01-06 | 2014-08-06 | 株式会社島津製作所 | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 |
| JP2011062119A (ja) | 2009-09-16 | 2011-03-31 | Seiko Epson Corp | 生体試料定量用チップ |
| KR20140006963A (ko) * | 2011-02-25 | 2014-01-16 | 노파르티스 아게 | 외래 내부 양성 대조군 |
| KR102108855B1 (ko) | 2017-10-30 | 2020-05-12 | 한국표준과학연구원 | 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4942124A (en) * | 1987-08-11 | 1990-07-17 | President And Fellows Of Harvard College | Multiplex sequencing |
| DE69233285T2 (de) * | 1991-08-02 | 2004-11-25 | bioMérieux B.V. | Quantifikation von Nukleinsäuren |
| FR2683827B1 (fr) * | 1991-11-15 | 1994-03-04 | Institut Nal Sante Recherc Medic | Procede de determination de la quantite d'un fragment d'adn d'interet par une methode d'amplification enzymatique. |
-
1994
- 1994-07-08 CA CA002143857A patent/CA2143857C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 DK DK94924750T patent/DK0662156T3/da active
- 1994-07-08 ES ES94924750T patent/ES2131699T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 JP JP50383695A patent/JP3594598B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 AT AT94924750T patent/ATE178946T1/de active
- 1994-07-08 AU AU74928/94A patent/AU668659B2/en not_active Expired
- 1994-07-08 DE DE69417863T patent/DE69417863T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 WO PCT/EP1994/002295 patent/WO1995002067A1/en active IP Right Grant
- 1994-07-08 KR KR1019950700919A patent/KR100312800B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-08 FI FI951082A patent/FI112094B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU668659B2 (en) | 1996-05-09 |
| JPH08501222A (ja) | 1996-02-13 |
| DK0662156T3 (da) | 1999-10-25 |
| FI951082A (fi) | 1995-03-08 |
| CA2143857A1 (en) | 1995-01-19 |
| CA2143857C (en) | 2005-09-20 |
| KR100312800B1 (ko) | 2002-02-28 |
| FI951082A0 (fi) | 1995-03-08 |
| JP3594598B2 (ja) | 2004-12-02 |
| ES2131699T3 (es) | 1999-08-01 |
| AU7492894A (en) | 1995-02-06 |
| DE69417863T2 (de) | 1999-10-07 |
| ATE178946T1 (de) | 1999-04-15 |
| DE69417863D1 (de) | 1999-05-20 |
| WO1995002067A1 (en) | 1995-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI112094B (fi) | Parannettu menetelmä nukleiinihapon kvantitoimiseksi | |
| US5837501A (en) | Nucleic acid quantitation by co-amplification of target with multiple internal controls | |
| Mulder et al. | Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection | |
| JP4022600B2 (ja) | 核酸増幅効率の決定方法 | |
| Brechtbuehl et al. | A rapid real-time quantitative polymerase chain reaction for hepatitis B virus | |
| EP3594360A1 (en) | Colorimetric detection of nucleic acid amplification | |
| US20030157499A1 (en) | Method of assessing the amount of nucleic acid in a sample | |
| Cheesman et al. | Real-time quantitative PCR for analysis of genetically mixed infections of malaria parasites: technique validation and applications | |
| JP6126381B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
| JP2002530090A (ja) | 核酸の定量的検出方法 | |
| EP3018218B1 (en) | Methods for detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range | |
| US20020137039A1 (en) | 5' Nuclease nucleic acid amplification assay having an improved internal control | |
| JP3224566B2 (ja) | Ｄｎａポリメラーゼの定量方法およびそれに有用な試験キット | |
| Kellner et al. | Scalable, rapid and highly sensitive isothermal detection of SARS-CoV-2 for laboratory and home testing | |
| WO1993002215A1 (en) | Quantitative nucleic acid amplification | |
| JP4559074B2 (ja) | 複数分析物の測定方法 | |
| Lu et al. | Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP) | |
| JP2010017127A (ja) | 標的核酸比率推定方法 | |
| CN111254224A (zh) | 一种定量检测人类嗜t淋巴细胞病毒前病毒的方法 | |
| CN110241264A (zh) | 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 | |
| Young et al. | A reverse-transcription competitive PCR assay based on chemiluminescence hybridization for detection and quantification of hepatitis C virus RNA | |
| CN112899349B (zh) | 同时检测一种或多种靶标核酸的可视化核酸检测方法及其应用 | |
| CN114085926A (zh) | Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN106868177B (zh) | 一种新型核酸荧光定量检测方法 | |
| JP5481841B2 (ja) | サイトケラチン１９ｍＲＮＡの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |