JP5564795B2 - Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 - Google Patents
Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5564795B2 JP5564795B2 JP2009001116A JP2009001116A JP5564795B2 JP 5564795 B2 JP5564795 B2 JP 5564795B2 JP 2009001116 A JP2009001116 A JP 2009001116A JP 2009001116 A JP2009001116 A JP 2009001116A JP 5564795 B2 JP5564795 B2 JP 5564795B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- reaction
- invader
- target dna
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Description
本発明は、サンプル中のDNAを定量するDNA定量方法、及びそれを利用した遺伝子解析方法に関する。
遺伝子多型とは、遺伝子を構成しているDNA配列の個体差であり、一般には集団の１％以上の頻度で出現するものと定義されている。遺伝子多型の代表的なものとして、DNA塩基配列の一塩基のみが変異する一塩基多型（SNP:single nucleotide polymorphism）がある。一塩基多型には、病気の罹り易さや薬物代謝等に影響を及ぼすものがあることが知られており、病気罹患率の診断や投与薬物の効果、副作用の予測等のためにSNP部位の塩基の判別が行われている。
一塩基多型を判定する方法の一つにインベーダー反応を用いた方法がある。インベーダー反応では、一塩基多型が生じている部位（SNP部位）の塩基配列を認識する２種類のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ）、SNP部位においてハイブリダイズしたシグナルプローブの下に侵入するオリゴヌクレオチド（インベーダーオリゴ）、オリゴヌクレオチドが重なり合った構造（侵入構造）を認識して切断する酵素（クリベース：登録商標）、前記各シグナルプローブに対応した異なる蛍光物質を含む２種類のフレットプローブ（FRETプローブ）を含む反応試薬が用いられる。
前記反応試薬を判定対象のSNPを含むDNAと混合してインベーダー反応を実行させると、各シグナルプローブに対応するSNPの有無に応じて蛍光信号が発生する。この蛍光信号の強度を蛍光検出器によって検出することにより、各シグナルプローブに対応したSNPの有無や、そのSNPがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判定することができる（特許文献１、特許文献２参照）。
反応試薬には過剰なシグナルプローブやフレットプローブが含まれており、過剰なシグナルプローブ等によってインベーダー反応が繰り返され、これにより蛍光信号が増幅される。このため、インベーダー法は検出感度が高く、ゲノムDNAからでもPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）等によるDNA増幅無しに判定を行うことが可能である。
しかしながら、DNA増幅無しでインベーダー反応を行った場合、ゲノムDNAの濃度にもよるが、判定に十分な信号強度を得るまでに４〜８時間程度、場合によっては１０時間以上を要する場合がある。一方、予めPCR等によってDNA増幅を行った場合には、インベーダー反応の反応時間を１０分以下と著しく短縮することができる。
そこで、近年では上記のインベーダー法とPCR法とを組み合わせたインベーダープラス法と呼ばれる手法が開発されている。インベーダープラス法では、予め反応容器にPCR反応用の試薬類とインベーダー反応用の試薬類とを全て収容し、まずインベーダー反応用のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ及びインベーダーオリゴ）がアニールしない条件でPCR反応を行い、Taqポリメラーゼを高温（約99℃）で失活させた後、一定時間の間、インベーダー反応の至適温度（約63℃）に維持することによりインベーダー反応を行う（非特許文献１参照）。このようなインベーダープラス法によれば、PCR反応の後、反応容器の蓋を開けて増幅産物を取り出したり、容器中に試薬を追加したりする必要がないため、簡便且つ迅速に高感度な分析を行うことができる。
ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J. Clin. Microbiol.)、(米国)、2006年、第44巻、第9号、pp.3443-3447
上記のようなSNP判定において正確な判定を行うためには、反応系におけるDNA濃度を適当な範囲とする必要がある。例えばサンプル中のDNA量が多すぎる場合には、上記インベーダー反応において非特異的な反応が起こり、本来シグナルが検出されないはずのネガティブなアレルに対応する蛍光信号が上昇して誤判定を引き起こす場合がある。一方、DNA量が少なすぎる場合には、インベーダー反応が進まないか、あるいは間違った反応が進む場合がある。特に上記のインベーダープラス法のように、PCR反応とインベーダー反応とを組み合わせる場合にDNA量が少ないことが問題となる。
例えば、２種類のアレルを持ったゲノムに対してそれぞれのSNPに対応したシグナルプローブを用いてインベーダープラス法を実施した場合、本来ならば両アレルに対応する蛍光信号の上昇速度は一致するはずである。ところが、DNA量が少ない場合には、両者の蛍光信号の上昇速度が必ずしも一致せず、まれに片側の蛍光信号のみが非常に早い時期に上昇し、他方の蛍光信号が通常の検出時間内に検出されない場合がある。この場合、ヘテロ接合体のサンプルであるにもかかわらず、ホモ接合体であると誤判定される恐れがある。
これは、ごく微量のDNAを増幅することができるPCR法と、ゲノムDNAから直接検出できる程の感度を持ったインベーダー法とを同一容器内で連続して行うことによって生じる問題であると考えられる。すなわち、PCR反応において鋳型となるDNA量が少なすぎることで両アレルの増幅量に偏りが生じ、更に、これらのPCR産物をそのままインベーダー反応に用いることでPCR産物量の偏りによるシグナルの差が増幅されたものと推定される。
このため、従来こうしたインベーダープラス法を利用したSNP解析等を行う場合には、反応前に予めサンプル中のDNA量を測定し、必要に応じてサンプルの希釈又はエタノール沈殿等によるサンプル濃縮を行ってDNA濃度が所定の範囲内になるよう調節した上で、インベーダープラス法による解析に供するのが一般的である。しかしながら、こうしたDNAの濃度測定や濃度調節には多くの手間とコストが掛かり、作業効率を低下させると共に、解析のスループット向上の妨げとなっていた。
また、近年では血液等の生体試料からDNA抽出を行うことなく直接PCR増幅を行う手法が開発されている（特許文献３、４参照）。このような手法を上記インベーダープラス法に適用すれば、血液等を直接反応液に添加してPCR反応及びインベーダー反応を行うことができるため、より簡便且つ迅速な解析を実現することができる。しかしながら、このような血液直接分析によるインベーダープラス法では反応系に持ち込まれるDNAの絶対量が不明であるため、上述のようにサンプル中のDNA量が少なすぎたことにより誤反応が生じたとしても問題の発見が困難な場合がある。
本願発明は上記のような課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、インベーダープラス法を利用した遺伝子解析等において、事前に特別な装置を用いてDNA量を測定することなしに、反応に持ち込まれたDNA量を推定することのできる方法を提供することである。
上記課題を解決するために成された本発明に係るDNA定量方法は、
a) 標的DNAを含むサンプルと、該標的DNA上の所定領域を増幅するためのプライマー対を含むPCR反応液と、上記プライマー対によって増幅可能且つ該プライマー対によって増幅される領域内に前記標的DNAと区別可能な配列を持つ既知量の競合DNAと、前記標的DNA由来のPCR産物と前記競合DNA由来のPCR産物とをインベーダー反応によって各々特異的に検出するためのインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する調製工程と、
b) 前記混合液の温度を制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記標的DNA由来のPCR産物と競合DNA由来のPCR産物の検出結果に基づいて前記PCR反応前の混合液における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有することを特徴としている。
a) 標的DNAを含むサンプルと、該標的DNA上の所定領域を増幅するためのプライマー対を含むPCR反応液と、上記プライマー対によって増幅可能且つ該プライマー対によって増幅される領域内に前記標的DNAと区別可能な配列を持つ既知量の競合DNAと、前記標的DNA由来のPCR産物と前記競合DNA由来のPCR産物とをインベーダー反応によって各々特異的に検出するためのインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する調製工程と、
b) 前記混合液の温度を制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記標的DNA由来のPCR産物と競合DNA由来のPCR産物の検出結果に基づいて前記PCR反応前の混合液における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有することを特徴としている。
ここで、上記DNA量推定工程は、例えば、前記インベーダー反応における標的DNA由来のPCR産物の検出信号と競合DNA由来のPCR産物の検出信号に基づいて、所定時点における各信号の強度比又は各信号強度の上昇速度の比から前記標的DNA量を推定するものなどとすることができる。
上記構成から成る本発明のDNA定量方法は、標的DNAを定量の内部標準となる競合DNAと共にPCR反応させ、各々に由来するPCR産物をインベーダー反応によって検出した結果から初期の標的DNA量を推定するものである。上記のPCR反応では、標的DNAと競合DNAとが共通のプライマーを奪い合って増幅するため、互いのDNA増幅が競合することとなる（競合PCR）。そのため、得られる各PCR産物の量は初期の標的DNA及び競合DNAの存在量を反映したものとなる。また、競合DNAは、そのPCR産物をインベーダー反応によって標的DNA由来のPCR産物と区別して検出できるよう設計されている。従って、上記の混合物をPCR反応及びインベーダー反応させ、インベーダー反応によって生じる２種類の蛍光信号を検出することにより、その信号比からPCR反応前の混合液における標的DNAの量を推定することができる。
なお、本発明において、上記混合液中に存在する標的DNAの量が著しく少ない場合には、上述の競合PCRにおいて内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅され、その後のインベーダー反応によって得られる蛍光シグナルが初期の標的DNAと競合DNAの比率を反映したものとならないことがある。
そこで、上記本発明に係るDNA定量方法は、上記の混合液が更に、上記プライマー対によって増幅可能且つ上記のインベーダー反応液によって検出されない配列から成る第２の競合DNAを含むものとすることが望ましい。
上記のような第２の競合DNAを混合液に加えることにより、上述のPCR反応において内部標準の競合DNAと前記第２の競合DNAとの間で競合関係が生じる。そのため、標準DNAの量が著しく少ない場合であっても、内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅されるのを防止することができ、適切な定量を行うことができる。
また、本発明はインベーダープラス法による遺伝子解析（例えばSNP判定）において、反応系に持ち込まれたDNA（標的DNA）の量が適切であったか否かを判定し、これにより該遺伝子解析の結果の信頼性を評価するために利用することができる。
すなわち、本発明に係る遺伝子解析方法は、標的DNAを含むサンプルを複数の反応容器に分注し、前記複数の反応容器のうちの一部の反応容器においてインベーダープラス法による該標的DNAの遺伝子解析を行うと共に、前記複数の反応容器のうちの他の反応容器において上記のDNA定量方法による標的DNAの定量を行い、該定量結果に基づいて前記遺伝子解析の信頼性を評価することを特徴とするものである。
なお、上記本発明に係る遺伝子解析方法は、上記一部の反応容器と前記他の反応容器とを同時に温度制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行うものとすることが望ましい。
以上説明したように、本発明のDNA定量方法及び遺伝子解析方法によれば、事前に特別な装置を用いてサンプル中のDNA量を測定することなしに、インベーダープラス法の手法の中で標的DNA量が適切か否かを知ることができ、信頼性の高い遺伝子解析を簡便且つ迅速に行うことが可能となる。
以下、本発明の一実施態様におけるDNA定量方法について、図面を参照しながら説明する。図１は本実施態様のDNA定量方法におけるPCR反応及びインベーダー反応の様子を示す概念図である。
＜混合液の調製＞
本方法では、まず、反応容器に定量対象とする標的DNA１０を含むサンプル、定量の内部標準となる既知量の競合DNA２０、PCR反応液、及びインベーダー反応液を所定量ずつ添加し、これらを混合した混合液を調製する。
本方法では、まず、反応容器に定量対象とする標的DNA１０を含むサンプル、定量の内部標準となる既知量の競合DNA２０、PCR反応液、及びインベーダー反応液を所定量ずつ添加し、これらを混合した混合液を調製する。
上記標的DNA１０は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトやその他の生物のゲノムDNAなどとすることができる。また、こうした標的DNA１０を含むサンプルとしては、体液や動植物組織などの生体試料から抽出したDNAを含んだDNA溶液のほか、DNA抽出操作を施していない生体試料を用いることもできる。なお、後者の場合には、予め界面活性剤処理等の前処理を行って生体試料を均質化しておくことが望ましい（特許文献３、４参照）。
PCR反応液は、上記標的DNA１０の所定領域を増幅するためのプライマー対（フォワードプライマー３１及びリバースプライマー３２）と、Taqポリメラーゼ等のDNA合成酵素、及び４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）を少なくとも含んでいる。
競合DNA２０は、定量の内部標準となるものであり、その全体又は一部を上記のプライマー対３１、３２によって増幅でき、なお且つそのPCR産物をインベーダー反応によって標的DNA１０（及びそのPCR産物）と区別して検出できるようにデザインされている。すなわち、図１に示すように、競合DNA２０は標的DNA１０のプライマーアニーリング部位ａ，ｂと同一配列から成る２つの領域ａ，ｂを有しており、更に、この領域ａと領域ｂとの間に標的DNA１０には含まれない配列から成る領域ｄを有している。こうした競合DNA２０は例えば人工合成によって得ることができる。なお、領域ｄについては、標的DNA１０上のプライマーアニーリング部位ａ，ｂに挟まれた領域ｃと全く異なる配列としてもよく、領域ｃにおいてインベーダー反応によって認識される部位に変位を導入したものであってもよい。
インベーダー反応液は、上記標的DNA由来のPCR産物１１と競合DNA由来のPCR産物２１とをそれぞれ特異的に検出するための各種オリゴヌクレオチド、及び酵素クリベース（Cleavase:構造特異的DNA分解酵素）を含んでいる。ここで、各種オリゴヌクレオチドとは上記各PCR産物１１、２１に特異的にハイブリダイズする２種類のシグナルプローブ４１ａ、ｂと、該シグナルプローブ４１ａ、ｂの下に侵入するようにして上記各PCR産物１１、２１にハイブリダイズするインベーダーオリゴ５１ａ、ｂ、及び前記２種類のシグナルプローブ４１ａ、ｂに対応した異なる蛍光を発する２種類のフレット（FRET）プローブ６１ａ、ｂである。
シグナルプローブ４１ａ、ｂは３’末端側に検出しようとする配列に相補的な領域を有し、５’末端側に検出しようとする配列とは無関係な配列から成るフラップ（flap）領域４２ａ，ｂを有している。また、フレットプローブ６１ａ、ｂは各シグナルプローブ４１ａ、ｂのフラップ領域４２ａ，ｂと相補的な配列から成る領域を有しており、蛍光色素Ｆ（FAM）又はＲ（RED）と消光剤（クエンチャー）Ｑが結合している。なお、競合DNA２０の配列によってはインベーダーオリゴ５１ａ、ｂは標的DNA１０と競合DNA２０とで共通のものを用いることができる。また、上記PCR反応のプライマー３１にインベーダーオリゴ５１ａ、ｂの役割を兼ねさせるようにしてもよい（非特許文献１を参照）。この場合、インベーダー反応液には別途インベーダーオリゴを含める必要はない。
シグナルプローブ４１ａ、ｂは３’末端側に検出しようとする配列に相補的な領域を有し、５’末端側に検出しようとする配列とは無関係な配列から成るフラップ（flap）領域４２ａ，ｂを有している。また、フレットプローブ６１ａ、ｂは各シグナルプローブ４１ａ、ｂのフラップ領域４２ａ，ｂと相補的な配列から成る領域を有しており、蛍光色素Ｆ（FAM）又はＲ（RED）と消光剤（クエンチャー）Ｑが結合している。なお、競合DNA２０の配列によってはインベーダーオリゴ５１ａ、ｂは標的DNA１０と競合DNA２０とで共通のものを用いることができる。また、上記PCR反応のプライマー３１にインベーダーオリゴ５１ａ、ｂの役割を兼ねさせるようにしてもよい（非特許文献１を参照）。この場合、インベーダー反応液には別途インベーダーオリゴを含める必要はない。
続いて、上記混合液を適切に温度制御することによって、PCR反応とインベーダー反応を連続的に実施する。
＜PCR反応＞
まず、インベーダー反応用のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ４１ａ、ｂ及びインベーダーオリゴ５１ａ、ｂ）がアニールしない条件でPCR反応を行う。PCRの温度サイクルは、変性工程、プライマー付着（アニーリング）工程、及びプライマー伸長工程の３工程、又は変性工程と、プライマー付着及びプライマー伸長を同時に行うプライマー付着・伸長工程との２工程を含み、例えば、変性工程が94℃で1分間、プライマー付着工程が65℃で1分間、プライマー伸長工程が72℃で1分間、もしくは変性工程が94℃で1分間、プライマー付着・伸長工程が68℃で1分間などとすることができる。このようなサイクルを所定の回数繰り返すことによって標的DNA１０及び競合DNA２０を増幅する。このとき、標的DNA１０と競合DNA２０とは同一の反応系中で共通のプライマー対３１、３２によって増幅されるため、互いのDNA増幅が競合する（競合PCR）。すなわち、混合液中において標的DNA１０に比べて競合DNA２０が多い場合には、競合DNA由来のDNA断片が優先的に増幅され、逆に標的DNA１０の方が多い場合には、標的DNA由来のDNA断片が優先的に増幅される。また、標的DNA１０と競合DNA２０の量が同じ場合には、PCR産物の量は等しくなる。従って、このような競合PCRにおいて得られるPCR産物１１、２１の量は初期の標的DNA１０及び競合DNA２０の量を反映したものとなる。
まず、インベーダー反応用のオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ４１ａ、ｂ及びインベーダーオリゴ５１ａ、ｂ）がアニールしない条件でPCR反応を行う。PCRの温度サイクルは、変性工程、プライマー付着（アニーリング）工程、及びプライマー伸長工程の３工程、又は変性工程と、プライマー付着及びプライマー伸長を同時に行うプライマー付着・伸長工程との２工程を含み、例えば、変性工程が94℃で1分間、プライマー付着工程が65℃で1分間、プライマー伸長工程が72℃で1分間、もしくは変性工程が94℃で1分間、プライマー付着・伸長工程が68℃で1分間などとすることができる。このようなサイクルを所定の回数繰り返すことによって標的DNA１０及び競合DNA２０を増幅する。このとき、標的DNA１０と競合DNA２０とは同一の反応系中で共通のプライマー対３１、３２によって増幅されるため、互いのDNA増幅が競合する（競合PCR）。すなわち、混合液中において標的DNA１０に比べて競合DNA２０が多い場合には、競合DNA由来のDNA断片が優先的に増幅され、逆に標的DNA１０の方が多い場合には、標的DNA由来のDNA断片が優先的に増幅される。また、標的DNA１０と競合DNA２０の量が同じ場合には、PCR産物の量は等しくなる。従って、このような競合PCRにおいて得られるPCR産物１１、２１の量は初期の標的DNA１０及び競合DNA２０の量を反映したものとなる。
＜インベーダー反応＞
続いて、反応容器を高温（例えば99℃）で加熱することによってポリメラーゼを失活させた後、一定時間の間、インベーダー反応の至適温度（例えば63℃）に維持することによってインベーダー反応を行う。
続いて、反応容器を高温（例えば99℃）で加熱することによってポリメラーゼを失活させた後、一定時間の間、インベーダー反応の至適温度（例えば63℃）に維持することによってインベーダー反応を行う。
この反応では、標的DNA用に設計されたシグナルプローブ４１ａ及び競合DNA用に設計されたシグナルプローブ４１ｂが標的DNA由来のPCR産物１１及び競合DNA由来のPCR産物２１にそれぞれハイブリダイズする。また、このときインベーダーオリゴ５１ａ、ｂも各DNA１１、２１にハイブリダイズし、各シグナルプローブ４１ａ、ｂと１塩基がオーバーラップした構造をとる。
これにより形成される三塩基重複構造を酵素クリベースが構造特異的に認識してシグナルプローブ４１ａ、ｂのフラップ領域４２ａ，ｂを切断する（以上、第１反応）。
これにより形成される三塩基重複構造を酵素クリベースが構造特異的に認識してシグナルプローブ４１ａ、ｂのフラップ領域４２ａ，ｂを切断する（以上、第１反応）。
上記第１反応によって遊離したフラップ断片４２ａ、ｂは対応するフレットプローブ６１ａ又は６１ｂにハイブリダイズして再び三塩基の重複構造を形成する。この構造を再び酵素クリベースが認識してフレットプローブ６１ａ、ｂを所定の位置で切断する（以上、第２反応）。フレットプローブ６１ａ、ｂ上では蛍光色素Ｆ又はＲと消光剤Ｑとが近接しており、消光剤Ｑによって蛍光が抑制された状態になっているが、クリベースによってフレットプローブ６１ａ、ｂが切断されると蛍光色素Ｆ又はＲが消光剤Ｑから離れて蛍光シグナルを生じるようになる。
なお、上記の第１反応においてフラップ領域４２ａ、ｂが切断されたシグナルプローブ４１ａ、ｂは各PCR産物１１、２１から遊離し、そこに新たなシグナルプローブ４１ａ、ｂがハイブリダイズして同様の反応が繰り返される。これにより、フラップ断片４２ａ、ｂが経時的に蓄積されて蛍光シグナルが増幅される。
ここで、標的DNA検出用のフレットプローブ６１ａと競合DNA検出用のフレットプローブ６１ｂは、それぞれ異なる蛍光物質Ｆ又は蛍光物質Ｒを有しているため、蛍光波長の違いによって標的DNA由来のPCR産物１１に起因する蛍光シグナルと競合DNA由来のPCR産物２１に起因する蛍光シグナルとを区別して検出することができる。
以上の通り、競合PCRによるPCR産物１１、２１の存在比は初期のDNA存在比を反映しており、標的DNA由来のPCR産物１１と競合DNA由来のPCR産物２１とはインベーダー反応によってそれぞれ異なる蛍光シグナルとして検出することができる。従って、インベーダー反応によって生じる２種類の蛍光シグナルを測定して所定の時点における両シグナルの強度比や両シグナルの上昇速度比を算出し、予め作成された検量線を利用することで混合液中の標的DNA１０の初期濃度（コピー数）を推定することができる。なお、このような検量線は、例えば、予め様々な量の標的DNA１０と一定量の競合DNA２０を用いて上記のようなPCR反応及びインベーダー反応を行い、所定の時点における両シグナルの強度比や両シグナルの上昇速度比と標的DNA量との関係とをプロットすることにより作成することができる。
上記のようなDNA定量方法によれば、インベーダープラス法を利用したSNP判定等において、事前にサンプル中のDNA量を測定すること無しに、反応系に持ち込まれたDNA量が適切であったか否かを判定することができる。
具体的には、SNP判定の対象とする単一のサンプル（例えば血液等の生体試料やそこから単離したDNAの溶液）を複数の反応容器（複数の反応チューブ又はマイクロプレート上の複数のウェル）に分注し、その内少なくとも１つの反応容器に上記DNA定量方法のための競合DNA２０、PCR反応液、及びインベーダー反応液を添加し、他の反応容器には目的とするSNPを判定するためのPCR反応液及びインベーダー反応液を添加する。これらの反応容器を所定の装置によって同時に温度調節することによってPCR反応及びインベーダー反応を行い、各反応容器から発生する蛍光シグナルを測定する。その後、DNA定量のための混合液を収容した反応容器についての測定結果から初期の標的DNA量、すなわち各反応容器に持ち込まれたSNP判定の対象であるDNAの量を推定し、その結果に基づいて、他の各反応容器からの蛍光シグナルに基づくSNP判定の信頼性を評価する。例えば、標的DNA量について所定の閾値を設定し、上記DNA定量による濃度推定の結果がこの閾値よりも低かった場合には、同じサンプルを用いて得られたSNP判定の結果を破棄するようにすることで誤った判定結果の利用を防止することができる。
なお、本発明のDNA定量方法は、上記のSNP判定のみならず、インベーダープラス法を用いた遺伝子解析全般に適用可能であり、例えば、インベーダープラス法による細菌やウイルスの同定、検出等にも利用することができる。
以上の通り、本実施形態に係るDNA定量方法によれば、遺伝子解析のためのインベーダープラス法の操作の中でサンプル中のDNAを定量し、反応に持ち込まれたDNA量が適切であったか否かを知ることができる。そのため、予め特別な装置を用いてDNA濃度を測定する必要がなく、簡便且つ迅速に信頼性の高い遺伝子解析を行うことができる。
なお、上記のPCR反応、インベーダー反応、及び蛍光検出は個別の装置で行ってもよく、あるいは、サーマルサイクラーと蛍光検出器の機能を兼ね備えた一台の装置（例えば、温調機能付きマイクロプレートリーダ等）で行ってもよい。また、上記のインベーダープラス法による遺伝子解析及びDNA定量を行う際の反応容器としては、汎用的なPCR用のシングルチューブや連結チューブ、又はマイクロプレート等を用いることができるほか、基板上に多数のウェルを形成して成るマイクロチップ（例えば特開2003-070456、WO/2008/053751）を利用することもできる。
以下、従来技術が有する課題及び本発明の作用効果を検証するために行った実験例について説明する。
［実験例１］
本実験例は、合成オリゴヌクレオチド（以下、「合成オリゴ」と略称する）をテンプレートにインベーダープラス法の検出感度を調べたものである。
本実験例は、合成オリゴヌクレオチド（以下、「合成オリゴ」と略称する）をテンプレートにインベーダープラス法の検出感度を調べたものである。
（サンプルの準備）
まず、インベーダープラス法における標的DNAとするため、以下の配列１、２から成る２種類の合成オリゴからPCRによって２本鎖のDNAを合成した。
配列１：AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列２：AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
PCRは、10mM Tris-HCl、50mM KCl、5mM MgCl2、各0.8μMの合成オリゴ、各160μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2.5 unitsのHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）を含む反応液を使用し、94℃で1分間のプレヒーティングの後、94℃で5秒間、59℃で5秒間、72℃で5秒間の条件で20サイクル、最後に72℃で1分間のポリメライゼーションを行った。上記２種類の合成オリゴの3'端側には、相補的な配列が含まれており、PCR反応によって、互いを鋳型及びプライマーとしたDNA合成が行われ、反応液中の合成オリゴの数だけ２本鎖のPCR産物が得られる。
以上により得られたPCR産物をDW（蒸留水）で10の10乗倍希釈及び10の11乗倍希釈したものを、それぞれ後述のインベーダープラス法におけるPCR反応及びインベーダー反応（以下、インベーダープラス反応と呼ぶ）のサンプルとした。
まず、インベーダープラス法における標的DNAとするため、以下の配列１、２から成る２種類の合成オリゴからPCRによって２本鎖のDNAを合成した。
配列１：AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列２：AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
PCRは、10mM Tris-HCl、50mM KCl、5mM MgCl2、各0.8μMの合成オリゴ、各160μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2.5 unitsのHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）を含む反応液を使用し、94℃で1分間のプレヒーティングの後、94℃で5秒間、59℃で5秒間、72℃で5秒間の条件で20サイクル、最後に72℃で1分間のポリメライゼーションを行った。上記２種類の合成オリゴの3'端側には、相補的な配列が含まれており、PCR反応によって、互いを鋳型及びプライマーとしたDNA合成が行われ、反応液中の合成オリゴの数だけ２本鎖のPCR産物が得られる。
以上により得られたPCR産物をDW（蒸留水）で10の10乗倍希釈及び10の11乗倍希釈したものを、それぞれ後述のインベーダープラス法におけるPCR反応及びインベーダー反応（以下、インベーダープラス反応と呼ぶ）のサンプルとした。
（反応液の調製）
反応液は、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのシグナルプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、0.3 unitsのHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）、90unitsのCleavase、FRETプローブ（Third Wave Technologies社）を含んだ反応液（2.5μl）を用いた。なお、FRETプローブは蛍光色素（FAM）で標識されている。
プライマーは、それぞれ以下の配列３，４のものを合成して使用した。
配列３：AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
配列４：AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCA
上記プライマーによるPCR産物を検出するためのシグナルプローブ、インベーダーオリゴとしては、Universal Invader（Third Wave Technologies社、米国）プログラムにて設計したものをそれぞれ使用した。
反応液は、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのシグナルプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、0.3 unitsのHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）、90unitsのCleavase、FRETプローブ（Third Wave Technologies社）を含んだ反応液（2.5μl）を用いた。なお、FRETプローブは蛍光色素（FAM）で標識されている。
プライマーは、それぞれ以下の配列３，４のものを合成して使用した。
配列３：AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
配列４：AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCA
上記プライマーによるPCR産物を検出するためのシグナルプローブ、インベーダーオリゴとしては、Universal Invader（Third Wave Technologies社、米国）プログラムにて設計したものをそれぞれ使用した。
（インベーダープラス反応）
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、95℃、1分間のプレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で32サイクルでPCR反応を行った。その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応させた。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定には、MX3000P（ストラタジーン社）を使用した。
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、95℃、1分間のプレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で32サイクルでPCR反応を行った。その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応させた。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定には、MX3000P（ストラタジーン社）を使用した。
表１に上記のインベーダー反応開始後、0秒、150秒、300秒の3点におけるFAMシグナルの測光結果を示す。なおテスト1〜12はマイクロプレートの各ウェルに収容された各混合液に相当し、サンプルの希釈倍率以外の組成はいずれも同一となっている。表中では、3000以上のシグナル上昇が認められたものを増幅有（○）とした。
10乗希釈の反応系（表中のテスト1, 2）では、2つのウェルで共にシグナル上昇が認められ、11乗希釈の反応系（表中のテスト3〜12）では10ウェル中4ウェルでシグナルの上昇が認められた。本例において各混合液中に存在する標的DNAの個数は、10乗希釈の反応系で推定6個、11乗希釈の反応系で0.6個となる。従って、11乗希釈の反応系に着目すると、反応液中に標的DNAが1個あるかないかの反応系において10ウェル中4ウェルで標的DNAを検出できたこととなる。
本発明のDNA定量方法もこうしたインベーダープラス法を利用するものであることから、同程度の検出感度が得られると考えられる。すなわち、本発明の方法は混合液中に1個でも標的DNAが含まれていればそれを検出できる感度を持ち、例えば、感染症の原因菌判定等における微量な標的核酸の定量にも有効であると考えられる。
［実験例２］
本実験例は、インベーダープラス反応によるSNP判定において標的DNAが低濃度の場合に、サンプルがヘテロ接合体であるのに一方のシグナルしか上がらず、ホモ接合体のようになる現象が起こることを示したものである。
本実験例は、インベーダープラス反応によるSNP判定において標的DNAが低濃度の場合に、サンプルがヘテロ接合体であるのに一方のシグナルしか上がらず、ホモ接合体のようになる現象が起こることを示したものである。
（サンプルの準備）
サンプルには、コリエル研究所のDNAパネルのうち、PD35、PD18を選択して使用した。前者はCYP2C9の*2アレルを、後者はCYP2C9の*3アレルをそれぞれへテロで持つものである。各サンプルの吸光度を測定してDNA濃度がそれぞれ1.9ng/μl、及び7.8ng/μlであることを確認し、これらをそれぞれ５倍ずつ段階希釈したものをインベーダープラス反応のサンプルとして使用した。
サンプルには、コリエル研究所のDNAパネルのうち、PD35、PD18を選択して使用した。前者はCYP2C9の*2アレルを、後者はCYP2C9の*3アレルをそれぞれへテロで持つものである。各サンプルの吸光度を測定してDNA濃度がそれぞれ1.9ng/μl、及び7.8ng/μlであることを確認し、これらをそれぞれ５倍ずつ段階希釈したものをインベーダープラス反応のサンプルとして使用した。
（反応液の調製）
本実験例では１つのウェルで2種類の塩基配列（すなわち、各SNP部位の野生型と変異型）を同時に検出できるよう、各反応液には、2種類のシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴと、各シグナルプローブに対応した異なる蛍光物質（FAM、RED）を含む2種類のFRETプローブとを添加した。それ以外の点は、実験例１と同様にして反応液を調製した。
プライマーは、CYP2C9*2の検出用として以下の配列５、６のものを、CYP2C9*3の検出用として以下の配列７、８のものをそれぞれ合成して使用した。
配列５：TCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAA
配列６：AGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG
配列７：GGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGA
配列８：TGGGGACTTCGAAAACATGGAGTTGCAG
CYP2C9*2検出用、及びCYP2C9*3の検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
本実験例では１つのウェルで2種類の塩基配列（すなわち、各SNP部位の野生型と変異型）を同時に検出できるよう、各反応液には、2種類のシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴと、各シグナルプローブに対応した異なる蛍光物質（FAM、RED）を含む2種類のFRETプローブとを添加した。それ以外の点は、実験例１と同様にして反応液を調製した。
プライマーは、CYP2C9*2の検出用として以下の配列５、６のものを、CYP2C9*3の検出用として以下の配列７、８のものをそれぞれ合成して使用した。
配列５：TCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAA
配列６：AGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG
配列７：GGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGA
配列８：TGGGGACTTCGAAAACATGGAGTTGCAG
CYP2C9*2検出用、及びCYP2C9*3の検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
（インベーダープラス反応）
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とした。インベーダープラス反応は、95℃、10秒間のプレヒーティングの後、94℃ 1秒間、68℃ 1秒間の条件で32サイクルのPCR反応を行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応を行った。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定は実験例１と同様の装置にて行った。
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とした。インベーダープラス反応は、95℃、10秒間のプレヒーティングの後、94℃ 1秒間、68℃ 1秒間の条件で32サイクルのPCR反応を行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応を行った。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定は実験例１と同様の装置にて行った。
表２に、インベーダー反応開始後、0秒、150秒、300秒、450秒の4点におけるFAMシグナル（野生型に相当）及びREDシグナル（変異型に相当）の測光結果を示す。ここでは段階的な蛍光強度の上昇が認められたものを、シグナル有りと判断した。なお、表中の「2C9*2」、「2C9*3」はそれぞれCYP2C9*2、CYP2C9*3を意味している。また、表中の「Both Signals」は、FAM及びREDが共にシグナル有りと判断されたことを意味し、「Grey（Both Signals）」は両シグナルともその有無が不明であったことを、「No Signals」は両方ともシグナル無しと判断されたことを意味している。
表２から明らかなように、本例ではいずれのウェルにおいてもFAM及びREDの両方のシグナルが立ち上がらなければならないにも関わらず、希釈倍率が上がるに従って一方のシグナルのみが上昇する頻度が高くなっている。ここで、CYP2C9*2のサンプル濃度0.12pg/μlのケースのように、両方のシグナルが立ち上がらない場合は反応に何らかの不具合が生じたことが明らかであるため誤判定を招くおそれはないが、一方のシグナルのみが立ち上がった場合には、そのサンプルはヘテロ接合体であると誤判定されることになる。
［実験例３］
本実験例では、インベーダープラス反応を利用したSNP判定において、PCRによるDNA増幅が多すぎる場合に正しい判定が困難になる例を示す。
本実験例では、インベーダープラス反応を利用したSNP判定において、PCRによるDNA増幅が多すぎる場合に正しい判定が困難になる例を示す。
（サンプルの準備）
血液10μlを界面活性剤を含む前処理液100μlと混合することによって前処理（詳細は特開2001-299356号を参照）を行い、これを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、本例では、後述の各SNP部位が野生型のホモ接合体である２名のボランティアの血液を使用した。
血液10μlを界面活性剤を含む前処理液100μlと混合することによって前処理（詳細は特開2001-299356号を参照）を行い、これを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、本例では、後述の各SNP部位が野生型のホモ接合体である２名のボランティアの血液を使用した。
（反応液の調製）
本実験例ではサンプルとして上記のような血液の希釈液を使用するため、反応液としては、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2 、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μM のdATP、dCTP、dGTPｍ及びdTTP、0.3 units のHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）、90 unitsのCleavase、FRETプローブ（Third Wave Technologies社）に加え、ポリアミン、硫酸化多糖、界面活性剤、及びDTTを含む反応液を使用した。
本実験例ではサンプルとして上記のような血液の希釈液を使用するため、反応液としては、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2 、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μM のdATP、dCTP、dGTPｍ及びdTTP、0.3 units のHybriPol DNA Polymerase（バイオライン社、英国）、90 unitsのCleavase、FRETプローブ（Third Wave Technologies社）に加え、ポリアミン、硫酸化多糖、界面活性剤、及びDTTを含む反応液を使用した。
判定対象とする標的SNPとしては、前述のCYP2C9の二つのSNPに加えてVKORC1のSNP（rs9934438）を用いた。CYP2C9の二つのSNP部位を増幅、又は検出するためのプライマー、シグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、実験例２と同様のものを使用した。
VKORC1のSNP部位（rs9934438）を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列９、１０のものを合成して使用した。
配列９：TGGACCCTGCCCGAGAAAGGTGATT
配列１０：CATGGAATCCTGACGTGGCCAAAGG
また、このSNP部位（rs9934438）を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
VKORC1のSNP部位（rs9934438）を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列９、１０のものを合成して使用した。
配列９：TGGACCCTGCCCGAGAAAGGTGATT
配列１０：CATGGAATCCTGACGTGGCCAAAGG
また、このSNP部位（rs9934438）を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
（インベーダープラス反応）
上記の反応液にサンプル1μlを加えて全量2.5μlとし、実験例１に準じてインベーダープラス反応及び測光を行った。
上記の反応液にサンプル1μlを加えて全量2.5μlとし、実験例１に準じてインベーダープラス反応及び測光を行った。
表３にインベーダー反応開始後、0秒、150秒、300秒の3点におけるFAM及びREDシグナルの強度、及び各シグナルの上昇割合を示す。表中の「2C9*2」、「2C9*3」はそれぞれCYP2C9*2、CYP2C9*3を意味している。なお、CYP2C9の*2, *3は、いずれもFAMが野生型、REDが変異型に相当し、VKORC1はREDが野生型、FAMが変異型に相当する。表中の150/0、300/0、300/150は、各測光時点におけるシグナルの上昇割合を表しており、例えば「150/0」の列は、反応開始後0秒と150秒とにおけるシグナル強度の比率を表している。また、表中のSample1、2はそれぞれ各血液提供者の血液を用いた試行を表している。
この表から、CYP2C9の2つのSNP（*2, *3）については、野生型に対応するFAMのシグナルのみが上昇し、変異型に対応するREDのシグナル上昇はわずかであることが認められるが、VKORC1（rs9934438）については、Sample1の150/0比及びSample2の300/0比から明らかなように、野生型に対応するREDのシグナルだけでなく、本来シグナルが上がらないはずのFAMについてもシグナルの上昇が認められる。
上記のようなバックグラウンドの上昇はPCRのサイクル数が多いことに起因するものと考えられる。なお、通常のインベーダープラス反応ではPCRのサイクル数が30回であるところ、本例では32回としている（実験例１、２でもPCRのサイクル数は32回であるが、これは低濃度のサンプルを使用しているためである）。なお、同様の現象は、混合液中の当初のDNA量が多い場合にも観察される。
［実験例４］
本実験例では、インベーダープラス法における標的DNA量と反応液量の関係に着目した試験を行った。サンプルとしては前述のPD35を使用し、CYP2C9*2を標的SNPとした。
本実験例では、インベーダープラス法における標的DNA量と反応液量の関係に着目した試験を行った。サンプルとしては前述のPD35を使用し、CYP2C9*2を標的SNPとした。
実験条件は実験例２に準じるが、上記混合液の総量を、2.5、7.5、15μlの３通りに変化させた。また、サンプルは希釈せずに添加量を２通り（上記各混合液の総量の1/25量、又は1/125量）設定し、合計６通りの条件で４回の試行（n1〜n4）を行った。
図２に、本実験例におけるFAM及びREDシグナルの測定値の経時変化を示す。各グラフ中の黒色の線がFAMシグナルを、灰色の線がREDシグナルを表している。混合液の液量が2.5μlの場合（左端の２列）には、サンプル濃度が高いもの（25倍希釈：左側の列）でも高頻度で誤反応が観察された（すなわち、本来ならFAMとREDの両方のシグナルが立ち上がるべきところ、一方のシグナルのみが上昇していた）。また、混合液の液量が7.5μlの場合（中央の２列）には、サンプル濃度が低いもの（125倍希釈：右側の列）で誤反応が見られた。一方、混合液の液量が15μlのもの（右端の２列）では、全試行中1試行のみ（n4：一番下の行）で誤反応があったものの、その頻度は著しく低かった。
このことから、サンプルのDNA濃度が低くても反応系全体の液量が多ければ、標的DNAの絶対量が稼げるために反応時の問題が起こりにくく、液量が少ない場合には、標的DNAの絶対量が少なくなるために誤反応が起こりやすくなると考えられる。
［実験例５］
本実験例では、標的DNAの濃度によって、インベーダープラス法の反応速度が変化する例を示す。
本実験例では、標的DNAの濃度によって、インベーダープラス法の反応速度が変化する例を示す。
（サンプルの準備）
界面活性剤を含む前処理液100μlに血液を5μl、3μl又は、1μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、血液は実験例３の２名のボランティアのうちの１名のものを使用した。
界面活性剤を含む前処理液100μlに血液を5μl、3μl又は、1μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、血液は実験例３の２名のボランティアのうちの１名のものを使用した。
（反応液の調整）
反応液は実験例３に準じて調製した。標的SNPとしては、VKORC1のSNP（rs9923231）と上述のCYP2C9*3を使用し、CYP2C9*3部位を増幅、又は検出するためのプライマー、シグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、実験例２と同様のものを使用した。
VKORC1のSNP部位（rs9923231）を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列１１と配列１２のものを合成して使用した。
配列１１：CACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGG
配列１２：GGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAA
また、このSNP部位（rs9923231）を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
反応液は実験例３に準じて調製した。標的SNPとしては、VKORC1のSNP（rs9923231）と上述のCYP2C9*3を使用し、CYP2C9*3部位を増幅、又は検出するためのプライマー、シグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、実験例２と同様のものを使用した。
VKORC1のSNP部位（rs9923231）を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列１１と配列１２のものを合成して使用した。
配列１１：CACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGG
配列１２：GGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAA
また、このSNP部位（rs9923231）を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
（インベーダープラス反応）
上記の反応液にサンプル1μlを加えて総量2.5μlの混合液とし、インベーダープラス反応を行った。インベーダープラス反応は、まずPCRとして、95℃ 10秒間プレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で30サイクル行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃ 3分間処理した後、63℃でインベーダー反応させた。測光は、実験例１に準じて行った。
上記の反応液にサンプル1μlを加えて総量2.5μlの混合液とし、インベーダープラス反応を行った。インベーダープラス反応は、まずPCRとして、95℃ 10秒間プレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で30サイクル行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃ 3分間処理した後、63℃でインベーダー反応させた。測光は、実験例１に準じて行った。
図３に、インベーダー反応開始後の各時刻における蛍光強度を示す。図中の「2C9*3」、「VK4」は、それぞれCYP2C9*3、VKORC1（rs9923231）を意味している。CYP2C9*3は反応開始後、0秒、150秒、及び300秒の3点で測光し（図３（ａ）の0、15、30のグラフ）、VKORC1（rs9923231）は、反応開始後、0秒、100秒、及び200秒の3点で測光を行った（図３（ｂ）の0、10、20のグラフ）。
図から明らかなように、血液量が少なくなるに従って各測光タイミングでの蛍光強度が低下していることが観察された。
以上の結果から、インベーダープラス法におけるインベーダー反応の速度は、血液量、すなわちサンプル中のDNA濃度に依存して変化するものと考えられる。
［実験例６］
本実験例は、実験例５と同様の実験をサンプルの濃度を変えて行ったものである。なお、ここでは標的SNPとして、VKORC1の2種類のSNP（rs9923231及びrs9934438）を使用した。
本実験例は、実験例５と同様の実験をサンプルの濃度を変えて行ったものである。なお、ここでは標的SNPとして、VKORC1の2種類のSNP（rs9923231及びrs9934438）を使用した。
（サンプルの準備）
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例５と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの（これを「基本サンプル」と呼ぶ）、及びこれを更に、2、10、40倍に希釈したものをサンプルとした。
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例５と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの（これを「基本サンプル」と呼ぶ）、及びこれを更に、2、10、40倍に希釈したものをサンプルとした。
（反応液の調整及びインベーダープラス反応）
反応液の調製及びインベーダープラス反応は実験例５に準じて行った。但し、上記２つの標的SNPの領域を増幅するためのプライマー、及びこれらを検出するためのシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、それぞれ実験例３、５に記載のものを使用した。
反応液の調製及びインベーダープラス反応は実験例５に準じて行った。但し、上記２つの標的SNPの領域を増幅するためのプライマー、及びこれらを検出するためのシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、それぞれ実験例３、５に記載のものを使用した。
図４に本実験例におけるインベーダー反応開始から0、150、300秒後の蛍光強度を示す。なお、図中ではVKORC1（rs9934438）を「VK1」、VKORC1（rs9923231）を「VK4」と表記している。図４（ａ）はVKORC1（rs9934438）を、図４（ｂ）はVKORC1（rs9923231）を標的とした際の結果を示しており、図中の*1, *1/2, *1/10, *1/40は、それぞれ上記の基本サンプル、及び該基本サンプルを2倍、10倍、40倍に希釈したサンプルに相当する。
この図から明らかなように、希釈倍率を大きくした場合でも、実験例５と同様にDNA濃度に依存して反応速度が変化していることが確認できた。すなわち、インベーダープラス法の反応速度は、所定のDNA濃度範囲においてはその濃度に依存して変化するが（実験例５、６）、極端にDNA量が少ない場合には、意図しないシグナルが上昇する場合がある（実験例２、４）。
［実験例７］
本実験例は本発明に係るDNA定量方法の作用効果を検証するために行ったものであり、合成オリゴ（競合DNA）を内部標準として添加することによって濃度変化を検出する例を示す。
本実験例は本発明に係るDNA定量方法の作用効果を検証するために行ったものであり、合成オリゴ（競合DNA）を内部標準として添加することによって濃度変化を検出する例を示す。
（標的DNA及び競合DNAの準備）
上述のPD35を標的DNAとし、これを200pg/μl、50pg/μl、20pg/μl、10pg/μlの各濃度に希釈したものをサンプルとして使用した。
また、以下の配列１３，１４から成る合成オリゴからPCRによって2本鎖のDNAを合成し、得られたPCR産物を10の8乗倍希釈及び10の9乗倍希釈したものをそれぞれ濃度測定用の競合DNAとした。なお、PCR反応は実験例１に準じて行った。
配列１３：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCATGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列１４：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
上述のPD35を標的DNAとし、これを200pg/μl、50pg/μl、20pg/μl、10pg/μlの各濃度に希釈したものをサンプルとして使用した。
また、以下の配列１３，１４から成る合成オリゴからPCRによって2本鎖のDNAを合成し、得られたPCR産物を10の8乗倍希釈及び10の9乗倍希釈したものをそれぞれ濃度測定用の競合DNAとした。なお、PCR反応は実験例１に準じて行った。
配列１３：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCATGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列１４：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
（反応液の調製）
反応液の組成は実験例３と同様とした。なお、本実験例では、DNA濃度測定用の標的領域としてβ-グロビン遺伝子を利用するものとし、この領域を増幅するためのプライマーとして以下の配列１５，１６のものを合成して使用した。
配列１５：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCA
配列１６：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACC
また、標的DNA検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
反応液の組成は実験例３と同様とした。なお、本実験例では、DNA濃度測定用の標的領域としてβ-グロビン遺伝子を利用するものとし、この領域を増幅するためのプライマーとして以下の配列１５，１６のものを合成して使用した。
配列１５：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCA
配列１６：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACC
また、標的DNA検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例１と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
（インベーダープラス反応）
上記反応液にサンプル1μl及び競合DNA溶液0.3μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例１に準じてインベーダープラス反応を行った。
上記反応液にサンプル1μl及び競合DNA溶液0.3μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例１に準じてインベーダープラス反応を行った。
図５（ａ）に本実験例におけるシグナル測定値の経時変化（反応曲線）を示す。測光は10秒おきに行い、競合DNAの反応シグナルであるFAMの蛍光変化量（前後の測定点間における蛍光強度の差分）の最大値と、同じタイミングにおけるβ-グロビンの反応シグナルであるREDの蛍光変化量、及びその比（FAM/RED）を算出した。図５（ｂ）に各サンプルについての前記の差分最大値の比（FAM/RED）を示す。なお、図５（ｂ）中の200、50、20、10は、サンプルのDNA濃度を表しており、それぞれ200pg/μl、50pg/μl、20pg/μl、10pg/μlに対応している。図５（ｂ）から明らかなようにDNA濃度の減少に従って、FAM／RED比が増加しており、競合DNAと標的DNAのシグナル比がインベーダープラス反応を行う前の標的DNA量に依存していることが分かる。従って、所定の閾値（例えば20）を定めておき、FAM/RED比がこの閾値以上の値を示した場合に標的DNA量が少ないと判定することができる。
［実験例８］
本発明によるDNA定量を行う際に検体（サンプル）のDNAが著しく少ない場合には、上述の競合PCRにおいて内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅され、その後のインベーダー反応によって得られる蛍光シグナルが初期の標的DNAと競合DNAの比率を反映したものとならないことがある。そこで、本実験例では、このような事態を回避するために内部標準となる競合DNAとは別の競合DNA（以下、第２競合DNAと呼ぶ）を更に添加する例を示す。
本発明によるDNA定量を行う際に検体（サンプル）のDNAが著しく少ない場合には、上述の競合PCRにおいて内部標準の競合DNAばかりが偏って増幅され、その後のインベーダー反応によって得られる蛍光シグナルが初期の標的DNAと競合DNAの比率を反映したものとならないことがある。そこで、本実験例では、このような事態を回避するために内部標準となる競合DNAとは別の競合DNA（以下、第２競合DNAと呼ぶ）を更に添加する例を示す。
（サンプルの準備）
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例５と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの（これを「基本サンプル」と呼ぶ）、及びこれを更に、3、10、20倍に希釈したものをサンプルとした。
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例５と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの（これを「基本サンプル」と呼ぶ）、及びこれを更に、3、10、20倍に希釈したものをサンプルとした。
（第２競合DNAの準備）
以下の配列１７、１８から成る合成オリゴからPCRによって２本鎖のDNAを合成し、得られたPCR産物を10の7乗倍希釈したものを上記第２競合DNAとした。なお、PCR反応は実験例１に準じて行った。
配列１７：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACATTGCGACTCGTAGCTCCTGAGGAGAAGT
配列１８：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGCTACG
以下の配列１７、１８から成る合成オリゴからPCRによって２本鎖のDNAを合成し、得られたPCR産物を10の7乗倍希釈したものを上記第２競合DNAとした。なお、PCR反応は実験例１に準じて行った。
配列１７：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACATTGCGACTCGTAGCTCCTGAGGAGAAGT
配列１８：CACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGCTACG
（反応液の調整及びインベーダープラス反応）
反応液としては実験例７と同様のものを使用した。なお、内部標準の競合DNAとしては実験例７で得られた配列１５、１６のPCR産物を10の6乗倍希釈したものを使用した。
上記サンプル1μl、上記競合DNA及び第２競合DNA各0.15μlずつを前記反応液に加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例７と同様の反応条件にてインベーダープラス反応及び測光を行った。
反応液としては実験例７と同様のものを使用した。なお、内部標準の競合DNAとしては実験例７で得られた配列１５、１６のPCR産物を10の6乗倍希釈したものを使用した。
上記サンプル1μl、上記競合DNA及び第２競合DNA各0.15μlずつを前記反応液に加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例７と同様の反応条件にてインベーダープラス反応及び測光を行った。
実験例７と同様にして求められた本実験例におけるFAM及びREDの蛍光変化量（差分）の最大値、およびその比（RED／FAM）を表４に示す。本例では、REDが内部標準である競合DNAの反応シグナルであり、FAMが標的DNA（βグロビン）の反応シグナルである。
表４から明らかなように、サンプル（血液）の濃度が低くなるに従い、RED／FAM比が増加しており、標的DNAと内部標準の競合DNAのシグナル比がインベーダープラス反応を行う前の標的DNA量に依存していることが分かる。表４のデータに基づいてFAM及びREDの蛍光変化量の最大値の比（RED／FAM）と反応前の標的DNA量との関係を表した検量線を図６に示す。なお、同図におけるDNA濃度は、血液中のDNA濃度が平均35ng/μlであることに基づいて算出した概算値である。ここでは、目安としてRED／FAM＝1.0を閾値とし、この値を上回る場合にはSNP検出に適した濃度でないと判断することができる。なお、前記1.0という閾値はあくまで今回の実験条件によるものであり、こうした閾値は装置の感度や試薬組成に応じて適宜に定められるべきものである。
１０…標的DNA
２０…競合DNA
３１、３２…プライマー
４１ａ，ｂ…シグナルプローブ
４２ａ…フラップ断片
５１ａ、ｂ…インベーダーオリゴ
６１ａ、ｂ…フレットプローブ
Ｆ、Ｒ…蛍光物質
Ｑ…消光剤
２０…競合DNA
３１、３２…プライマー
４１ａ，ｂ…シグナルプローブ
４２ａ…フラップ断片
５１ａ、ｂ…インベーダーオリゴ
６１ａ、ｂ…フレットプローブ
Ｆ、Ｒ…蛍光物質
Ｑ…消光剤
配列１：合成オリゴヌクレオチド
配列２：合成オリゴヌクレオチド
配列３：PCRプライマー
配列４：PCRプライマー
配列５：PCRプライマー
配列６：PCRプライマー
配列７：PCRプライマー
配列８：PCRプライマー
配列９：PCRプライマー
配列１０：PCRプライマー
配列１１：PCRプライマー
配列１２：PCRプライマー
配列１３：合成オリゴヌクレオチド
配列１４：合成オリゴヌクレオチド
配列１５：PCRプライマー
配列１６：PCRプライマー
配列１７：合成オリゴヌクレオチド
配列１８：合成オリゴヌクレオチド
配列２：合成オリゴヌクレオチド
配列３：PCRプライマー
配列４：PCRプライマー
配列５：PCRプライマー
配列６：PCRプライマー
配列７：PCRプライマー
配列８：PCRプライマー
配列９：PCRプライマー
配列１０：PCRプライマー
配列１１：PCRプライマー
配列１２：PCRプライマー
配列１３：合成オリゴヌクレオチド
配列１４：合成オリゴヌクレオチド
配列１５：PCRプライマー
配列１６：PCRプライマー
配列１７：合成オリゴヌクレオチド
配列１８：合成オリゴヌクレオチド
Claims (4)
- a) 標的DNAを含むサンプルと、該標的DNA上の所定領域を増幅するためのプライマー対を含むPCR反応液と、上記プライマー対によって増幅可能且つ該プライマー対によって増幅される領域内に前記標的DNAと区別可能な配列を持つ既知量の競合DNAと、前記標的DNA由来のPCR産物と前記競合DNA由来のPCR産物とをインベーダー反応によって各々特異的に検出するためのインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する調製工程と、
b) 前記混合液の温度を制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記標的DNA由来のPCR産物と競合DNA由来のPCR産物の検出結果に基づいて前記PCR反応前の混合液における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有するDNA定量方法であって、
前記混合液が更に、前記プライマー対によって増幅可能且つ前記のインベーダー反応液によって検出されない配列から成る第２の競合DNAを含むことを特徴とするDNA定量方法。 - 上記DNA量推定工程が、前記インベーダー反応における標的DNA由来のPCR産物の検出信号と競合DNA由来のPCR産物の検出信号に基づいて、所定時点における各信号の強度比又は各信号強度の上昇速度の比から前記標的DNA量を推定するものであることを特徴とする請求項１に記載のDNA定量方法。
- 標的DNAを含むサンプルを複数の反応容器に分注し、一部の反応容器においてインベーダープラス法による該標的DNAの遺伝子解析を行うと共に、他の反応容器において請求項１又は２に記載のDNA定量方法による標的DNAの定量を行い、該定量結果に基づいて前記遺伝子解析の信頼性を評価することを特徴とする遺伝子解析方法。
- 上記一部の反応容器と前記他の反応容器とを同時に温度制御することによりPCR反応及びインベーダー反応を行うことを特徴とする請求項３に記載の遺伝子解析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009001116A JP5564795B2 (ja) | 2009-01-06 | 2009-01-06 | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009001116A JP5564795B2 (ja) | 2009-01-06 | 2009-01-06 | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010158182A JP2010158182A (ja) | 2010-07-22 |
| JP5564795B2 true JP5564795B2 (ja) | 2014-08-06 |
Family
ID=42575840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009001116A Active JP5564795B2 (ja) | 2009-01-06 | 2009-01-06 | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5564795B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3101115B1 (en) * | 2014-01-31 | 2020-10-21 | Toppan Printing Co., Ltd. | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| CN113046471B (zh) * | 2021-05-17 | 2023-10-31 | 西北大学 | 一种基于竞争型pcr技术鉴定单拷贝转基因植株的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5219727A (en) * | 1989-08-21 | 1993-06-15 | Hoffmann-Laroche Inc. | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
| WO1995002067A1 (en) * | 1993-07-09 | 1995-01-19 | Akzo Nobel N.V. | Improved method for the quantification of nucleic acid |
| CA2159044A1 (en) * | 1994-09-26 | 1996-03-27 | Falko-Guenter Falkner | Method of quantitating nucleic acids |
| CA2497988C (en) * | 2002-09-06 | 2011-03-29 | The Trustees Of Boston University | Quantification of gene expression |
| US20060147955A1 (en) * | 2004-11-03 | 2006-07-06 | Third Wave Technologies, Inc. | Single step detection assay |
-
2009
- 2009-01-06 JP JP2009001116A patent/JP5564795B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2010158182A (ja) | 2010-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kadri | Polymerase chain reaction (PCR): Principle and applications | |
| CN103180464B (zh) | 实时切割分析 | |
| JP4814479B2 (ja) | リアルタイムで内部標準を用いて遺伝子を定量する方法 | |
| CN103201394B (zh) | 突变检测分析 | |
| Fraga et al. | Real‐time PCR | |
| US10978173B2 (en) | Method for reducing noise level of data set for a target analyte | |
| US20110151461A1 (en) | Detection algorithm for pcr assay | |
| Rocha et al. | Real time PCR: the use of reference genes and essential rules required to obtain normalisation data reliable to quantitative gene expression | |
| CN101886117A (zh) | 用以鉴别目标核酸的单核苷酸多态性的检验套组 | |
| CN105385684A (zh) | 用于为核酸扩增作对照的寡核苷酸 | |
| EP3538670B1 (en) | Detection of sequence variants | |
| JP5564795B2 (ja) | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 | |
| KR102084965B1 (ko) | 정성적 또는 정량적 돌연변이 유전형 분석방법 및 이 방법을 수행하기 위한 실시간 pcr 키트 | |
| JP5532713B2 (ja) | 遺伝子多型判定方法 | |
| US20220025449A1 (en) | Method for detecting a target analyte in a sample using an s-shaped function for a slope data set | |
| KR102270849B1 (ko) | 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널 | |
| EP2418289B1 (en) | Method of distinguishing genotypes | |
| JP2010158183A (ja) | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 | |
| JP6468555B2 (ja) | 検出キット，及び検出方法 | |
| JP6673832B2 (ja) | アッセイ認識のための多重ｐｃｒ反応のコード化法 | |
| WO2023052622A1 (en) | Method of examining a nucleic acid amplification product | |
| US20160273031A1 (en) | Method, kit and premix for quantitative and discriminative determination of nucleic acids, qdpcr; in vitro method for the quantitative and discriminative diagnosis of biological entities | |
| Bustin et al. | Real‐Time Quantitative RT‐PCR for mRNA Profiling | |
| JP2018102252A (ja) | 検出キット，及び検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111128 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20111128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131029 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131227 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140520 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140602 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5564795 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |