CN103180464B - 实时切割分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于切割的实时PCR分析方法。一般而言，所述分析方法包括：使包括a）扩增核酸靶的PCR试剂和b）在扩增的靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂的反应混合物经受两组热循环条件。所述第一和第二组循环之间不向反应加入额外的试剂，并且，第二组循环的每个循环中，测量活瓣探针的切割。

Description

实时切割分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946，737的申请日的优先权，该申请公开的内容通过引入的方式并入本文。
背景
人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如，发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(Schubbert等人.Nat.Genet.200638:331-6)和心-面-皮肤综合征(Niihori等人.Nat.Genet.200638:294-6)相关联。同样，发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(Burmer等人.Proc.Natl.Acad.Sci.198986:2403-7)、胰腺癌(Almoguera等人.CeIl198853:549-54)和肺癌(Tam等人.Clin.Cancer ReS.200612:1647-53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。
点突变的检测方法可用于，例如，提供与点突变相关联的疾病的诊断。
概述
本发明提供基于切割的实时PCR分析方法。在某些实施方案中，所述分析方法包括使包括a)扩增核酸靶的PCR试剂、和b)对所扩增的核酸靶进行活瓣(flap)切割分析的活瓣切割试剂的反应混合物经受两组热循环条件。第一组热循环条件包括一组5-15个以下循环:i.至少90℃的第一温度;ii.范围为60℃-75℃的第二温度;iii.范围为65℃-75℃的第三温度。所述第二温度和第三温度可以相同。第二组热循环条件包括一组20-50个以下循环:i.至少90℃的第四温度;ii.比第二温度低至少l0℃的第五温度;iii.范围为65℃-75℃的第六温度。在某些情况下，第一组和第二组循环之间不向反应加入额外的试剂，并且，在第二组循环的每个循环中，测定活瓣探针的切割。
附图简述
图1示意性说明了活瓣分析的一些一般原则。
图2显示使用单阶段热循环完成的分析的结果。野生型中存在的KRASG35T突变序列水平的检测和定量如图所示。动力学曲线显示突变体与野生型的所有比例除了1:l0和1:100之外的是无法区分的。
图3显示使用两个阶段热循环完成的分析的结果。野生型中存在的KRALSG35T突变序列水平的检测和定量如图所示。动力学曲线显示比例从1:10至1:10，000的分辨率。
定义
本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常情况下，尽管这不是必须的，以液体形式，含有一种或多种感兴趣的分析物。
术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰，例如，一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。
术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，用于描述任意长度的聚合物，例如，长于大约2个碱基，长于大约10个碱基，长于大约100个碱基，长于大约500个碱基，长于大约1000个碱基，长达大约10，000个或更多碱基组成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成法制备(例如，PNA记载于美国专利号5，948，902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。
本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。
本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中，靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。
本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备，并且，在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60。61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。
本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸，即，杂交在一起。
本文使用的术语“引物”指这样的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸的一个区域互补的核苷酸序列。在引物延伸条件下，使用靶核酸作为模板，引物结合至所述互补区域并延伸。引物可为大约15至大约50个核苷酸范围内，但也可使用在上述长度范围之外的引物。引物可通过聚合酶的作用从引物的3'末端开始延伸。不能通过聚合酶的作用从其3，末端开始延伸的寡核苷酸不是引物。
本文使用的术语“延伸”指向核酸末端添加一个或更多的核苷酸，例如通过寡核苷酸的连接或通过使用聚合酶。
本文使用的术语“扩增”指使用靶核酸作为模板产生一个或更多拷贝的靶核酸。
本文使用的术语“变性”指核酸双链体分开为两条单链。
本文的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(evaluating)”、“评估(assessing)”、“分析(assaying)”、“检测(detecting)”、“分析(analyzing)”可以互换使用，指任何形式的测量，并包括测定一种成分(element)存在与否。这些属于包括定性和/或定量测定。评估可为相对或绝对。“评估其存在”包括测定存在的某种物质的量，以及测定其存在或不存在。
术语“使用”有其常规含义，因此，是指采用，例如，将方法或组合物付诸运行至结束。
本文使用的术语“Tm”指寡核苷酸双链体的解链温度，在该温度，一半的双链体保持杂交而一半的双链体解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下述公式预测:Tm=81.5+16.6(1og10[Na+])+0.41(部分G+C)-(60/N)，其中N是链长且[Na+]小于lM。参见Sambrook和Russell(200l;Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3rded.，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarborN.Y.，ch.l0)。还有其他预测寡核苷酸双链体的Tm的公式并且一个公式可以或多或少地适用于给定的条件或一组条件。
本文使用的术语“Tm-匹配的”指多个核酸双链体有在定义范围内的Tm，例如，在互相的5℃或l0℃范围内。
本文使用的术语“反应混合物”指试剂的混合物，所述试剂能够在能够在适当的外部条件下经过一段时间一起反应产生产物。反应混合物可以包含PCR试剂和活瓣切割试剂，例如，各自在本领域已知的配方。
本文使用的术语“混合物”指成分的组合，所述成分是散在的并没有任何特定顺序。混合物是异质的且没有在空间上分离成其不同成分。混合物成分的实施例包括大量不同的溶解于相同水溶液的成分，或大量不同的附着到固相载体的成分或在没有特定顺序上不同成分在空间上没有不同。混合物是无法定位的(addressable)。举例说明，作为本领域中通常已知的，空间上分离的表面结合多核苷酸的阵列不是表面结合多核苷酸的混合物，因为此类表面结合多核苷酸空间上不同且所述阵列是可以定位的。
本文使用的术语“PCR试剂”指对摸板进行聚合酶链式反应(PCR)所必需的所有试剂。正如本领域中已知的，PCR试剂基本上包括第一引物、第二引物、热稳定聚合酶和核苷酸。取决于所使用的聚合酶，也可存在离子(例如，Mg2+)。PCR试剂可以任选地包含可扩增靶序列的模板。
本文使用的术语“活瓣分析”指一种分析，其中活瓣寡核苷酸以重叠依赖的方式通过活瓣核酸内切酶切割从而释放随后被检测到的活瓣。活瓣分析的原理众所周知并且记载于，例如，Lyamichev等人(Nat.Biotechnol.199917:292-296)、Ryan等人(Mol.Diagn.19994:135-44)和Allawi等人(JClin Microbio1.200644:3443-3447)。为了清楚，某些应用于活瓣分析的试剂记载如下。活瓣分析的原理如图1所示。如图1所示的活瓣分析，侵入寡核苷酸2和活瓣寡核苷酸4与靶6杂交产生包含在位置10处有一个核苷酸重叠的第一复合体8。第一复合体8是活瓣核酸内切酶的底物。活瓣核酸内切酶12切割活瓣寡核苷酸4从而释放活瓣14，活瓣14与FRET盒16杂交，FRET盒16包含猝灭剂“Q”和附近的淬灭荧光基团“R”，“R”被猝灭剂Q淬灭。活瓣14与FRET盒16的杂交产生包含在位置20处有一个核苷酸重叠的第二复合体18。第二复合体也是活瓣核酸内切酶的底物。活瓣核酸内切酶12切割FRET盒16导致荧光基团22的释放，这产生荧光信号。这些成分在下面进行更详细的记载。
本文使用的术语“侵入寡核苷酸”指一种与靶核苷酸的一个区域互补的寡核苷酸。侵入寡核苷酸的3'末端核苷酸可以与靶的核苷酸碱基配对，也可以不配对(例如，其可为SNP的位点或例如突变)。
本文使用的术语“活瓣寡核苷酸”指一种包含活瓣区域和与靶核酸的区域互补的区域的寡核苷酸。侵入寡核苷酸上的靶互补区域和活瓣寡核苷酸重叠单个核苷酸。正如已知的，如果侵入核苷酸的3'末端核苷酸和活瓣寡核苷酸中的那个核苷酸重叠的核苷酸二者均与靶核酸中的核苷酸碱基配对，那么形成一种特殊结构。这种结构是酶的底物，所述酶如下定义为活瓣核酸内切酶，其从活瓣寡核苷酸的靶互补区域切割活瓣。如果侵入寡核苷酸的3'末端核苷酸没有与靶核酸中的核苷酸碱基配对，或如果活瓣寡核苷酸中的重叠核苷酸没有与靶核酸中的核苷酸碱基配对，复合体不是所述酶的底物并只有很少或者没有切割。
本文使用的术语“活瓣核酸内切酶”或简称“FEN”指一类核苷酸分解酶，其作为结构特异性核酸内切酶作用于DNA结构，所述DNA结构于一条链上包含单链5'突出端或活瓣，该条链被核酸的另一条链取代，即，使得在单链和双链DNA之间的交界处有重叠核苷酸。FEN催化单链和双链DNA交界处的磷酸二酯键水解断裂，释放所述突出端，或所述活瓣。活瓣核酸内切酶由Ceska和SaverS(Trends Biochem.Sci.l99823:331-336)及Liu等(Annu.Rev.Biochem.200473:589-615)综述。FEN可以是单独的酶、多亚基酶或作为其它酶或者蛋白复合体的活性存在，例如，DNA聚合酶。活瓣核酸内切酶可以是热稳定的。
本文使用的术语“切割的活瓣”指活瓣分析的切割产物的单链寡核苷酸。
本文使用的术语“FRET盒”指包含荧光基团和附近的淬灭所述荧光基团的猝灭剂基团的发夹寡核苷酸。切割的活瓣与FRET盒的杂交产生活瓣核酸内切酶所需的二级底物。一旦形成该底物，包含5’荧光基团的碱基从盒切割出，从而产生荧光信号。
本文使用的术语“活瓣分析试剂”指对底物进行活瓣分析所需的所有试剂。正如本领域已知的，活瓣分析包括如上所述的侵入寡核苷酸、活瓣寡核苷酸、活瓣核酸内切酶和FRET盒。活瓣分析试剂可以任选地包含所述侵入寡核苷酸和活瓣寡核苷酸结合的靶。
具体实施方式
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明并不局限于所描述的特定实施方案，当然，因而可以发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅为了用于描述特定实施方案，并没有意图是限制性的，因为在本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。
当提供范围值时，应当理解，每个间值，除非上下文明确指出否则到下限单位的十分之一，在范围的上限和下限之间和任何其他规定的或在指定范围内的间值，包含于本发明。这些更小范围的上限和下限可独立地被包含于所述更小的范围并也包含于本发明，受所述规定的范围中任何明确排除的限制。当所述规定的范围包括一个或二者限制时，排除那些所包括的限制之一或二者的范围也包含于本发明。
除非另外定义，本发明使用的所有技术和科学术语对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说具有通常理解的相同含义。尽管与本文记载的那些方法和材料相似或相同的任何方法和材料也能够用于本发明的实践或检测，现在记载优选的方法和材料。
本说明书引用的所有出版物和专利在此通过引用并入本发明，就像每个单独的出版物或专利具体地和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本发明并公开和记载出版物所引用的方法和/材料。任何出版物的引用是在申请日前为了公开并不应当解释为承认本发明无权凭借着在先发明早于这种公开。此外，所提供的出版物的日期可不同于实际公开日期，其可能需要单独确认。
必须注意如本发明使用的和所附权利要求使用的，除非上下文明确指出否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数对象。还注意权利要求可撰写成排除任何可选成份。正因为如此，该声明旨在作为使用这些排他性术语如“仅仅”、“仅”和权利要求成份的记载的类似的术语或使用“否定性”限制的先行基础。
正如对于本领域技术人员阅读该公开明显的，本发明记载的和示例的每个单独的实施方案有分立的组成和特征，其可以很容易地与任何其它几种实施方案的特征分开或组合而不脱离本发明的范围或精神。任何记载的方法可以记载的事件顺序进行或逻辑上可能的任何其它顺序进行。
本发明记载的是基于切割的实时PCR分析方法。一般而言，所述分析方法包括使包括a)扩增核酸靶的PCR试剂、和b)对所扩增的核酸靶进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂的反应混合物经受两组热循环条件。在某些情况下，第一组和第二组循环之间不向反应加入额外的试剂并且，第二组循环的每个循环中，测定活瓣探针的切割。进一步记载所述方法，用于所述方法的所述反应混合物将先记载，随后记载用于所述方法的热循环条件。
在下面的记载中，本领域技术人员将理解大量的聚合酶和活瓣核酸内切酶的任何一个可用于所述方法，包括但不限于，那些从热稳定的或超热稳定的原核生物、真核生物或古细菌生物分离出的。本领域技术人员也将理解用于所述方法的酶，例如，聚合酶和活瓣核酸内切酶，不仅包括天然存在的酶，而且包括重组酶，所述重组酶包括野生型酶的酶活性片段、切割产物、突变体和变体。
反应混合物
如上指出的，用于所述方法的反应混合物包含至少用于扩增核酸靶的PCR试剂和对所扩增的核酸进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂。应用于所述方法的反应混合物可因此包含一对引物和反应缓冲液(其可以是缓冲pH的并可包括盐，例如，MgC12和其他PCR必需成份)，核苷酸，例如，dGTP、dATP、dTTP和dCTP以及热稳定DNA聚合酶，还有活瓣寡核苷酸，活瓣核酸内切酶以及FRET盒，如上定义的。根据所述分析如何进行(即，取决于PCR引物之一是否在所述活瓣分析中用作侵入寡核苷酸)，反应混合物可额外包含与所述PCR引物不同的侵入寡核苷酸。反应混合物还可包含核酸靶。
存在于反应混合物的试剂的确切的性质和浓度可与独立地应用于PCR和活瓣切割分析的试剂相似或相同，例外的是反应混合物包含Mg2+的浓度高于应用于常规PCR反应混合物(其包含Mg2+浓度在大约1.8mM与3mM之间)。在某些实施方案中，本发明记载的反应混合物包含Mg2+浓度范围为4mM至l0mM，例如，6mM至gmM。可用于所述反应混合物的示例性的反应缓冲液和DNA聚合酶包括那些记载于多种出版物的(例如，AuSubel，等人。ShortProtocolSinMolecular Biology，3rd ed.，Wiley&SonSl995和Sambrook等人.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Third Edition，2001ColdSpring Harbor,N.Y.)。适于PCR的反应缓冲液和DNA聚合酶可从多种供应商处购买，例如，Invitrogen(CarlSbad，CA)，Qiagen(Valencia,CA)和Stratagene(La Jolla，CA)。尽管许多其它聚合酶可应用于某些实施方案，示例性聚合酶包括Taq,Pfu，Pwo，UlTma和Vent。与聚合酶一同适合使用的反应成份以及适合使用的条件的指引，可在聚合酶提供的文献中发现。引物设计记载于多种出版物，例如，Diffenbach和Dveksler(PCR Primer，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press 1995);R.Rapley(The Nucleic Acid ProtocolsHandbook(2000)，HumanaPress,Totowa,N.J.);Schena和Kwok等(Nucl.Acid ReS.199018:999-1005)。引物和探针设计软件程序也有市售的，包括但不限于，Primer Detective(ClonTech，Palo Alto，Calif.)，Lasergene，(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.);和Oligo软件(NationalBiosciences,Inc.,Plymouth，Minn)以及iOligo(CaeSar Software，PortSmouth，N.H)。
示例性的活瓣切割分析试剂见于Lyamichev等(Nat.Biotechnol.199917:292-296)，Ryan等(Mol.Diagn.19994:135-44)和Allawi等(JClin Microbio1.200644:3443-3447)。活瓣核酸内切酶的合适条件或者是已知的，或者可使用本领域已知的方法容易测定(参见，例如，Kaiser等J.Biol.Chem.274:21387-94，1999)。可用于所述方法的示例性的活瓣核酸内切酶包括但不限于，水生栖热菌(Thermus aquaticis)DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I、哺乳动物FEN-1、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)FEN-1、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)FEN-l、嗜热碱、甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)FEN-l、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)FEN-l、CLEAVASETM(Third Wave，Inc.，Madison，Wis.)、酿酒酵母(S.cerevisiae)RTHl，酿酒酵母(S.cerevisiae)RAD27、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)rad2、噬菌体T55′-3′核酸外切酶、Pyroccus horikoshii FEN-1、人类核酸外切酶1、小牛胸腺5′-3′核酸外切酶，包括其真细菌、真核生物和古细菌同源物，例如II类结构特异性酶家族成员，以及酶活性突变体或其变体。切割酶的说明可见于，在其它地方中，Lyamichev等，Science260:778-83，1993;Eis等，Nat.Biotechnol.19:673-76，200l;Shen等，Trends in Bio.Sci.23:171-73，1998;Kaiser等J.Biol.Chem.274:21387-94，1999;Ma等，J.Biol.Chem.275:24693-700，2000;Allawi等，J.Mol.Bio1.328:537-54，2003;Sharma等，J.Biol.Chem.278:23487-96，2003;和Feng等，Nat.Struct.Mol.Biol.11:450-56，2004。
在具体实施方案中，反应混合物可包含用于分析多个(例如，至少2、3、4或更多)不同平行靶序列的试剂。在这些情况下，反应混合物可包含多对PCR引物，具有不同活瓣的多个不同的活瓣寡核苷酸，和一旦它们切割了用于检测不同活瓣的多个不同FRET盒。在一个实施方案中，混合物中的寡核苷酸可具有共同的活瓣但不同的结合序列，以允许，例如，一组突变切割共同的FRET盒并报告信号，其中单个荧光基团指示突变的存在。在这个实施方案中，哪个突变存在于样品中可在鉴定突变的存在之后进行测定。任选地，如果PCR引物之一没有用作侵入寡核苷酸，反应可以包含多个侵入寡核苷酸。FRET盒切割后，可观察到多个可明显区分的荧光信号。尽管可应用许多其它的荧光基团，荧光基团可选自，例如，6-羧基荧光素(FAM)，其激发和发射波长分别为485nm和520nm，雷德蒙红(Redmond Red)，其激发和发射波长分别为578nm和650nm以及雅基马黄(YakimaYellow)，其激发和发射波长分别为532nm和569nm，以及Quasor670其激发和发射波长分别为644nm和670nm。在某些情况下，至少PCR引物对之一、活瓣寡核苷酸和FRET盒可用于检测内参。
正如将是明显的，设计用于所述方法的多种寡核苷酸使其互不干扰。例如，在具体的实施方案中，活瓣寡核苷酸可在其3'末端加帽，从而阻止其延伸。同样，在某些实施方案中，如果不用作PCR引物之一，侵入寡核苷酸可在其3'末端加帽。在具体的实施方案中，如果侵入寡核苷酸不用作PCR引物之一，那么侵入寡核苷酸的浓度可以在PCR引物浓度的5%至50%范围内，例如，10%至40%。此外，在某些情形下，活瓣部分和活瓣寡核苷酸的靶互补区域的Tm可独立地比PCR引物的Tm低至少l0℃(例如，低10-20℃)，这导致a)活瓣寡核苷酸与靶核酸在更高温度(60℃至75℃)更少的杂交以及b)任何切割的活瓣与FRET盒在更高温度(60℃至75℃)更少的杂交。较低的第五温度利于用于活瓣分析的寡核苷酸的杂交，并利于活瓣核酸内切酶的活性。
在一个多重反应中,引物设计成有类似的热力学性质，例如，相似的Tm、G/C含量、发夹稳定性，并且在某些实施方案中可以全部有相似的长度，例如，从18至30nt，例如，20-25nt长。用于反应混合物的其它试剂也可为Tm匹配的。
所述分析混合物可以存在于容器中，包括但不限于，试管;多孔板，例如96孔、384孔、1536孔板;和徵流控装置。在某些实施方案中，多个多重反应在同一反应容器中进行。取决于反应如何进行，反应混合物体积可为5u1至200ul，例如，l0μl至100μl，尽管可以预见此范围之外的体积。
在某些实施方案中，所述反应混合物还可以包含核酸样品。在具体的实施方案中，样品可以含有基因组DNA或其扩增产物(例如，使用Lage等GenomeRes.200313:294-307或例如公开的专利申请US20040241658的方法扩增的基因组DNA)。在示例性的实施方案中，基因组样品可以含有从哺乳动物细胞例如人、小鼠、大鼠或猴子细胞而来的基因组DNA。所述样品可由培养的细胞或临床样品的细胞制备，所述临床样品例如，组织活检、刮或灌洗或法医样品细胞(即，在犯罪现场收集的样品细胞)。在具体的实施方案中,基因组样品可来自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。
在具体的实施方案中，核酸样品可获取自生物样品，例如细胞、组织、体液和粪便。感兴趣的体液包括但不限于，血液，血清，血浆，唾液，黏液，痰(phlegm)，脑脊髓液(cerebral spinal fluid)，胸腔积液，眼泪，阴道管液(lactal ductfluid)，淋巴液，痰液(sputum)，脑脊液(cerebrospinal fluid)，关节液，尿液，羊水和精液。在具体的实施方案中，样品可获取自个体，例如人类，并可在用于个体分析之前处理。例如核酸可在用之前从样品提取，方法是已知的。
例如，DNA可通过任何不同的方法从粪便中提取，包括记载于，例如Col1等(J.of Clinical Microbiology 198927:2245-2248)，Sidransky等(Sciencel992256:102-105)，Villa(Gastroenterology1996110:1346-1353)和Nollau(BioTechniquesl99620:784-788)，和美国专利5463782、7005266、6303304和5741650。用于从粪便中提取DNA的商业化DNA提取试剂盒包括QIAamp粪便迷你试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)，Instagene Matrix(Bio-Rad，Hercules，Calif.)，和RapidPrep徵基因组DNA分离试剂盒(Pharmacia BiotechInc.,Piscataway，N.J.)，等等。
样品分析的方法
在进行所述方法时，所述反应混合物通常经受下列热循环条件:第一组5至15(例如，8至12)个循环:i.至少90℃的第一温度;ii.60℃-75℃范围(例如，65℃至75℃)的第二温度;iii.65℃-75℃范围的第三温度;随后:第二组的20-50个循环:i.至少90℃的第四温度;ii.比第二温度低至少l0℃的第五温度(例如，50℃至55℃的范围);以及iii.65℃-75℃范围的第六温度。在热循环过程中，例如，在第一组和第二组循环之间，没有额外的试剂需要加到反应混合物中。在具体的实施方案中，热稳定聚合酶在第一组和第二组条件之间不是失活的，因此允许靶在第二组循环的每个循环过程中扩增。在具体的实施方案中，第二和第三温度可以是相同的温度，这样进行“两步”热循环条件。每个循环可独立地持续10秒至3分钟的范围，尽管很容易采用此范围之外的持续时间。
在第二组循环的每个循环中(例如，当反应处于第五温度)，活瓣探针切割产生的信号可被测定从而提供样品中靶核酸的量的实时检测(其中术语“实时”旨在指在反应进行和产物积累时进行检测)。当用样品中的参照核酸进行标准化时检测可以表示为拷贝的绝对数量或相对量。
不限制于任何特定理论，第一组循环较高的反应温度被认为可以运行靶核酸通过PCR引物对有效扩增而不被任何活瓣分析试剂或它们的反应产物显著干扰。用于第二组循环的较低的反应温度(即，第五温度)对于用于PCR的聚合酶不是最佳的，但允许活瓣寡核苷酸与靶核酸有效杂交并且更接近于活瓣核酸内切酶的最佳温度。用于第二组循环的较低的反应温度还适于随后被切割的活瓣与FRET盒的杂交。因此，在较低的温度，靶核酸可不受PCR试剂的显著干扰而被检测到。
在某些情形下，指示被切割的活瓣的量的荧光可通过自动荧光计检测，设计成进行实时PCR，具备如下特征:激发FRET盒的荧光基团的光源，加热和冷却反应混合物的系统以及检测FRET盒的荧光的荧光计。这些特征的组合，允许实时检测被切割的活瓣，因而允许样品中的靶核酸的量得到定量。运行实时PCR反应的自动荧光计是本领域已知的并且可以适用于该具体分析，例如，Bio-Rad Laboratories的ICYCLERTM(HerculeS，Calif.)，Stratagene的Mx3000PTM，MX3005PTM和MX4000TM，ABIPRISMTM7300、7500、7700和7900TaqMan(Applied Biosystems,FosterCity,Calif.)，SMARTCYCLERTM，ROTORGENE2000TM(CorbettResearch，Sydney，Australia)和GENE XPERTTM系统(Cepheid，Sunnyvale，Calif.)以及LIGHTCYCLERTM(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，Ind.)。不同反应温度之间的升温速度并不是决定性的，并且，在某些实施方案中，可应用预设于热循环仪上的默认升温速度。
在某些情形下，所述方法可进一步包括对第二组每个循环切割的量进行制图，从而提供靶核酸丰度的评价(estimate)。预测可通过测定临界循环(即，该荧光增至预定的阈值之上的循环;“Ct”值或“Cp”值)来计算。该预测可与对照进行比较(对照可在同一反应混合物作为感兴趣的基因座进行分析)以提供标准化的预测。热循环仪也可以包含测定每个样品的临界循环的应用软件。测定临界循环的示例性方法见于，例如，Luu-The等(Biotechniques200538:287-293)。
还提供了进行样品分析的装置。在某些实施方案中，所述装置包括:a)被编排用于进行上述的热循环仪和b)容器，所述容器包括:扩增核酸靶的PCR试剂，以及在核酸靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂。
实用性
所记载的方法在多种应用中可用，这些应用通常包括样品分析应用，其中在给定的样品中检测靶核酸序列的存在。
特别地，上述方法可用于诊断，预测治疗的反应，或研究癌性病症或其他哺乳动物疾病，包括但不限于，白血病，乳腺癌，前列腺癌，阿尔兹海默症，帕金森症，癫痫，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化，中风，孤独症，智力迟钝和发育障碍。许多核苷酸多态性与这些障碍有关并被认为是产生这些障碍的因素。已知核苷酸多态性的类型和定位可对多种哺乳动物疾病的诊断、预后和理解有相当大的帮助。此外，本文中记载的分析条件可用于其它核酸检测应用包括，例如，用于检测感染性疾病，病毒载量监测，病毒基因分型，环境检测，食品检测，法医学、流行病学和其它用于检测具体核酸序列的领域。
在一些实施方案中，生物样品可获取自患者，并且样品可使用所述方法分析。在具体的实施方案中，所述方法可用于鉴定和/或评价生物样品中基因组座位的突变体拷贝的量，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝具有与基因组座位的野生型拷贝相关的点突变。在这个实施例中，样品可包含基因组座位的野生型拷贝比突变体拷贝至少多100倍(例如，至少1，000倍，至少5，000倍，至少10，000倍，至少50，000倍或至少100，000倍)。
在这些实施方案中，所述方法可应用于检测癌基因突变(其可以是体细胞突变)，例如，PIK3CA、NRAS、KRAS、JAK2、HRAS、FGFR3、FGFRl、EGFR、CDK4、BRAF、RET、PGDFRA、KIT或ERBB2，所述突变可与乳腺癌、黑色素瘤、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、白血病、大肠癌、前列腺癌、间皮瘤、神经胶质瘤、meullobastoma、红细胞增多症、淋巴瘤、肉瘤或多发性骨髓瘤相关(参见，例如，Chia12008Proto-oncogenes to oncogenes to cancer.NatureEducationl:1)。
在这些实施方案中，所述反应混合物可包含第一引物和第二引物，其中第一引物包括与点突变碱基配对的3'末端核苷酸。第一引物可用作第二组循环中的侵入寡核苷酸，或者，在某些情形下，在反应混合物中可以有分开的也与点突变碱基配对的3'末端核苷酸的侵入寡核苷酸。由于基因组座位中的点突变可直接与癌症(例如，结直肠癌)相关联，所述方法可用于诊断患有癌症的患者，单独地，或与其他临床技术(例如，物理检查如结肠镜检查或免疫组化分析)或分子生物学技术结合。例如，获取自所述分析的结果可与其他信息结合，例如，其他基因座甲基化状态信息，相同基因座或不同基因座的信息，细胞遗传学信息，重排信息，基因表达信息或端粒(telemerers)长度的信息，来提供癌症或其他疾病的整体诊断。
在一个实施方案中，样品可收集自第一位置的患者，例如在临床环境，如在医院或在医生办公室，以及所述样品可转至第二位置，例如，处理样品和进行上述方法产生报告的实验室。本发明所述“报告”是电子的或有形的文件，包括提供检测结果的报告元素，检测结果可包括Ct或Cp值或者类似的指示样品中基因组座位的突变拷贝存在的结果。一旦生成，所述报告可转至其他位置(可为与第一位置相同的位置)，可由健康专家(例如，临床医生，实验室技术人员，或如肿瘤科医生、外科医生、病理学家的医生)作为临床诊断的一部分进行解读。
试剂盒
还提供实践如上所述方法的试剂盒。试剂盒的成份可置于分开的容器，或多种成份可置于单一容器。
除了上述成份，试剂盒还可包括使用试剂盒成份实践所述方法的说明书。实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如说明书可以打印于例如纸或塑料等的基质上。这样，说明书可作为包装附页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其成份的容器的标签(即，与包装或者子包装结合)等。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，例如CD-ROM、磁盘等。又在其它实施方案中，实际说明书不在试剂盒中，而是以从远程资源获取说明书的方式例如通过因特网提供。这个实施方案的例子是包括网址的试剂盒，通过该网址可查看说明书和/或下载说明书。获取说明书的这种方式与说明书一起记录于合适的基质。
除了所述说明书，试剂盒还可包括一种或多种对照样品，例如，用于测试试剂盒的阳性或阴性对照分析物。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用的方式并入本文，就像每个单独的出版物或专利申请具体地和单独地通过引用的方式并入。任何出版物的引用是在申请日前为了公开，不应当被解释为承认本发明无权凭借着在先发明早于这种公开。
尽管上述发明通过示例和实施例的方式为了清楚理解的目的已详细描述，对本技术领域的普通技术人员明显的是，在不脱离所附的权利要求书的精神或范围的情况下，可对本发明进行某种改变和修改。
实施例1
KRLSG35T分析
下述分析设计用于在野生型序列背景下检测包含KRAS G35T突变的核酸序列。如下显示的KRAS的野生型和G35T突变体等位基因的部分核苷酸序列作为参考。
KRAS野生型的扩增区域的部分序列(位置35以下划线标示):
ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGC一GTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGG(SEQ ID NO：1)
KRAS突变体G35T的扩增区域的部分序列(位置35以下划线标示)：
ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGG(SEQ ID NO：2)
通过两种不同热循环方案来在野生型KRAS位置35为G的背景下检测突变体KRAS位置35为T的能力，其中一种方案使用单阶段循环而另一个使用两个阶段循环(见表1)。在两种方案中，以所有稀释度，存在野生型序列的大约100，000个拷贝(即，100，000双链质粒)。向野生型的100，000个拷贝，加入突变体靶基因的大约10，000、1000、100和10个拷贝。包含突变体序列的100，000个拷贝的样品用作对照。
表1概括了用于单阶段热循环和两个阶段热循环的基于切割的分析的循环条件。采集发生在53℃温度的荧光信号，所述温度有利于活瓣探针从靶的切割反应和由释放的活瓣介导的荧光基团从FRET盒切割。
表1.与2-阶段(Headstart)相比的单阶段循环方案
KRAS G35T突变的PCR扩增的引物是作为反向引物的5'-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3'(SEQIDNO:3)和作为正向引物的5'-ACTTGTGGTAGT TGGAGCTCT-3'(SEQ ID NO:4)。注意在正向引物中3'T碱基(以下划线标示)对应于突变休位置35。位于位置34的倒数第二位的C也与突变体和野生型序列均为错配，并且其是设计用来增强与野生型靶3'碱基的区别。
KRAS G35T突变的均相检测是通过使用核酸内切酶可切割的活瓣探针、可切割的FRET盒和热稳定活瓣核酸内切酶来完成的。为了检测G35T突变，活瓣探针序列是5'-GACGCGGAGTTGGCGTAGGCA-3'/3C6(SEQ ID NO:5)，其中突变体碱基以下划线标示并且为了抑制延伸3'末端用己二醇基团封闭。被切割的活瓣部分，其随后与FRET盒结合，并随后从它的猝灭剂释放荧光基团，包括5'末段的所有碱基至突变特异的T。引物和活瓣探针作为非目录产品由Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville，Iowa)提供。
使用的FRET盒是5，-FAM/TCT/猝灭剂/AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACTCCGCGTCCGT-3'/3C6(SEQ ID NO:6)，其中FAM是荧光素，猝灭剂是Dark猝灭剂，并且为了抑制延伸3'末端用己二醇基团封闭。FRET盒由Hologic(Madison，Wisconsin)提供。
PCR反应在480Multiwel196Plates(Roche，Indianapolis)中、于含有7.5mMMgCl2和250uMdNTPs(Promega,Madison，Wisconsin)的l0mMMOPS pH7.5中完成。Taq聚合酶是iTaq酶(BioRad，HerculeS，California)，切割酶是Cleavase2.0(Hologic，Madison，Wisconsin)。正向引物浓度是50nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，并且FRET盒以终浓度200nM使用。所有的扩增和检测在LightCycler480光学热循环仪(Roche，Indianapolis，Indiana)上进行。
LightCycler产生的原始数据和动力学曲线，对于这两种不同循环条件，概括于表1,显示于图2和3。显示2-阶段循环方案的改善的线性定量反应的结果描述于表2。
表2显示，比较两种不同循环方案，如所示，在各水平的野生型序列的存在下KRASG35T突变的检测和定量。样品的荧光超出背景荧光的点称为样品的“交叉点(crossing point)(Cp)”(RocheLightCycler480手册，Imdiamapolis,IN)，并且在这些分析中作为荧光上升至最大荧光的18%的点进行计算。40个循环以上的Cp水平显示无可检测的剂量反应。
表2KRASG35T突变的检测和定量

Claims (9)

1.一种样品分析的方法，包括：
使包括以下的反应混合物：
用于扩增核酸靶的PCR试剂，以及
于所述核酸靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂，
经受如下热循环条件：
第一组5～15个循环：
(i)至少90℃的第一温度；
(ii)范围为60℃～75℃的第二温度；
(iii)范围为65℃～75℃的第三温度；随后是：
第二组20～50个循环：
(i)至少90℃的第四温度；
(ii)比所述第二温度低至少10℃的第五温度；
(iii)范围为65℃～75℃的第六温度；
其中第一和第二组循环之间不向所述反应加入额外的试剂，并且，在第二组循环的每个循环中，测量活瓣探针的切割；
其中所述方法不用于疾病的诊断或治疗目的；
其中所述方法包括在所述反应混合物处于所述第五温度时测定所述活瓣探针的切割；
其中在所述20～50个循环的每个循环期间通过检测所述反应混合物的荧光测量所述活瓣探针的切割；且
其中：
所述PCR试剂包括：核酸模板，第一PCR引物，第二PCR引物，热稳定的聚合酶，和核苷酸；以及
所述活瓣切割试剂包括：侵入寡核苷酸，活瓣探针，活瓣核酸内切酶和FRET盒，
其中所述第一PCR引物和所述侵入寡核苷酸具有相同的核苷酸序列。
2.权利要求1的方法，其中：
所述PCR试剂包括：核酸模板；第一PCR引物，第二PCR引物，热稳定的聚合酶，和核苷酸；以及
所述活瓣切割试剂包括：侵入寡核苷酸，活瓣探针，热稳定的活瓣核酸内切酶和FRET盒，
其中所述第一PCR引物和所述侵入寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述第一PCR引物和第二PCR引物以相同的浓度存在于所述反应混合物。
4.权利要求1～3任一项的方法，其中所述第五温度为50℃～55℃。
5.权利要求1～3任一项的方法，其中所述热循环条件包括第一组8～12个循环。
6.权利要求1～3任一项的方法，其中
所述反应混合物体积为5μl至50μl，并且
所述第一至第六温度的每一个独立地持续10秒至3分钟。
7.权利要求1～3任一项的方法，其中所述第二和第三温度是相同的温度。
8.权利要求1～3任一项的方法，其中所述方法还包括对所述第二组每个循环发生的切割的量进行制图，从而提供所述核酸靶中的突变丰度的评价。
9.权利要求1～3任一项的方法，其中所述活瓣切割分析检测所述核酸靶中的突变。
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