CN1934131B

CN1934131B - Hpv52l1在酵母中的优化表达

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Publication number: CN1934131B
Application number: CN2005800095956A
Authority: CN
Inventors: J·T·布赖; M·K·布朗劳; L·D·舒茨; K·U·詹森
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2025-03-18
Also published as: IL178140A; ES2343255T3; RU2006137363A; EP1730175B1; WO2005097821A1; US20080226660A1; CA2560487C; JP4833962B2; PT1730175E; FR15C0085I2; IL178140A0; KR101203403B1; AU2005230907C1; NO2017005I1; ZA200607575B; HUS1500062I1; BRPI0509079B8; BRPI0509079B1; AU2005230907A1; US7700103B2

Abstract

本发明提供了编码HPV 52 L1蛋白的合成DNA分子。具体而言，本发明提供了编码HPV 52 L1蛋白的多核苷酸，其中，针对在酵母细胞中的表达水平对所述多核苷酸进行了密码子优化。在本发明的一种替代性实施方式中，合成分子的核苷酸序列被改造，去掉被酵母识别的转录终止信号。合成分子可被用于制造HPV 52病毒样颗粒(VLPs)，以及制造包含HPV 52 VLP的药物组合物和疫苗。本发明的疫苗提供了针对乳头瘤病毒感染的有效免疫预防，这是通过中和抗体和细胞介导的免疫来实现的，本发明的疫苗还可用于治疗已存在的HPV感染。

Description

HPV52L1在酵母中的优化表达

技术领域

一般而言，本发明涉及对人乳头瘤病毒(HPV)感染的预防和/或治疗。更具体地，本发明涉及编码HPV 52L1蛋白的合成多核苷酸，涉及包含所述多核苷酸的重组载体和宿主。本发明还涉及HPV 52病毒样颗粒(VLPs)，其中，所述VLPs是通过将重组HPV 52 L1或L1+L2在酵母细胞中表达来产生的，本发明还涉及所述颗粒在用于预防和治疗HPV感染的疫苗或药物组合物中的用途。

发明背景

目前有超过80种的人乳头瘤病毒(HPV)，其中很多与多种不同的生物表型相关，从良性增生疣到恶性癌症(综述参见，McMurray etal.，Int.J.Exp.Pathol.82(1)：15-33(2001))。HPV6和HPV11是与良性疣、非恶性尖锐湿疣和/或生殖器或呼吸道粘膜的低危性异常(low-grade dysplasia)最常见相关的种类。HPV16和HPV18则是与宫颈、阴道、外阴、肛管的原位和侵入性癌症最频繁相关的高风险种类。宫颈癌中超过90％都与HPV16、HPV18或较少流行的致癌(oncogenic)种类HPV 31、33、45、52和58相关(Schiffman et al.，J.Natl.CancerInst.85(12)：958-64(1993))。在90-100％的宫颈癌中检测到HPVDNA这一现象，为HPV导致宫颈癌提供了强有力的流行病学证据(见，Bosch et al.，J.Clin.Pathol.55：244-265(2002))。

乳头瘤病毒是小的(50-60nm)、无包被的、二十面体DNA病毒，其编码多达八个早期基因和两个晚期基因。病毒基因组的开放读码框(ORFs)被命名为E1至E7以及L1和L2，其中，“E”指早期，“L”指晚期。L1和L2编码病毒衣壳蛋白，而E基因则与病毒复制和细胞转化等功能相关。

L1蛋白是主要的衣壳蛋白，其分子量为55-60kDa。L2蛋白是次要的衣壳蛋白。免疫学数据表明，在病毒衣壳中，L2蛋白的大多数在L1蛋白内部。不同乳头瘤病毒中，L1和L2蛋白都是高度保守的。

L1蛋白或L1和L2蛋白的组合在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中的表达导致了病毒样颗粒(VLPs)的自装配(综述参见Schillerand Roden，in Papillomavirus Reviews：current Research onPapillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UK：Leeds Medical Information，pp101-12(1996))。VLPs在形态上与真的病毒类似，施予动物或人时，其能诱导高效价的中和抗体。因为VLPs不含可能致瘤的病毒基因组，它们能安全地替代在HPV疫苗开发中使用活病毒的方法(综述参见，Schiller and Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000))。就该理由而言，L1和L2基因已被鉴定为用于开发针对HPV感染和疾病的预防和治疗用疫苗的免疫目标。

HPV疫苗的开发和商业化被下述困难所阻碍，所述困难与在成功转化的宿主生物中获得衣壳蛋白的高表达水平相关，这限制了对纯化蛋白的生产。因此，虽然鉴定出了编码HPV L1蛋白(例如，HPV 52L1蛋白)的野生型核苷酸序列，但人们仍非常需要开发出容易更新的粗制HPV L1蛋白来源，其能利用在目标宿主细胞中的表达被优化的、编码HPV 52L1蛋白的核苷酸序列。此外，制造出大量HPV 52L1VLPs用于疫苗开发也将是有用的，所述VLPs具有天然蛋白赋予免疫的性质。

发明内容

本发明涉及组合物和方法，用于诱导出或增强对HPV 52L1基因表达的蛋白产物的免疫性。具体而言，本发明提供了编码HPV 52L1蛋白的多核苷酸，其中，已针对在酵母细胞中高水平的表达对所述多核苷酸进行了密码子优化。在本发明的替代性实施方式中，该多核苷酸的核酸序列被改造，去掉了被酵母识别的转录终止信号。本发明还提供了HPV 52病毒样颗粒(VLPs)，其中，所述VLPs是通过在酵母细胞中表达重组HPV 52L1或L1+L2来制造的，本发明还公开了HPV 52VLPs在用于预防和/或治疗HPV疾病和HPV相关癌症的免疫原性组合物和疫苗中的用途。

本发明涉及编码HPV 52L1蛋白的合成DNA分子。合成分子的密码子被设计以使用酵母细胞优选的密码子。在本发明的一种替代性实施方式中，合成分子的核苷酸序列被改造，去掉了被酵母识别的转录终止信号。合成分子可被用作为HPV 52L1蛋白的来源，其可以自装配为VLPs。所述VLPs可被用于基于VLP的疫苗。

本发明的一种示例性实施方式包含：编码如SEQ ID NO：2所示的HPV 52 L1蛋白的合成核酸分子，所述核酸分子包含核苷酸序列，已针对在酵母细胞中的高水平表达对所述序列进行了密码子优化。

本发明还提供了重组载体和原核及真核的重组宿主细胞，其中含有本说明书公开的核酸分子。在本发明的一种优选的实施方式中，宿主细胞是酵母细胞。

本发明还涉及一种在重组宿主细胞中表达HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含编码HPV 52 L1蛋白的核酸的载体引入到酵母宿主细胞中；以及(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表达的条件下培养所述酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及一种在重组宿主细胞中表达HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含编码HPV 52 L1蛋白的核酸的载体引入到酵母宿主细胞中；其中，已针对在酵母宿主细胞中的最优表达对所述核酸分子进行了密码子优化；(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表达的条件下培养所述酵母宿主细胞。

在优选的实施方式中，核酸分子包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(在本文中被称为“52 L1R序列”)。

本发明还涉及HPV 52病毒样颗粒(VLPs)，其被制造于酵母细胞中，本发明还涉及制造HPV 42VLPs的方法以及使用HPV 52VLPs的方法。

在本发明的一种优选的实施方式中，酵母选自由Saccharomycescerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermycesfragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomyces pombe所构成的组。

本发明的另一方面是HPV 52VLP，其中，所述VLP是通过在酵母细胞中对HPV 52L1或HPV 52L1+L2进行重组表达来制造的。

本发明的又一方面是HPV 52VLP，其包含由经过密码子优化的HPV 52L1基因生产的HPV 52L1蛋白。在本发明的这方面的一种示例性实施方式中，经过密码子优化的HPV 52L1基因包含如SEQ ID

NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种方法，用于在动物中诱导免疫应答，所述方法包括将HPV 52病毒样颗粒施予动物。在一种优选的实施方式中，HPV 52VLPs是通过经过密码子优化的基因制造的。

本发明的又一个方面是预防或治疗HPV相关宫颈癌的方法，所述方法包括，向哺乳动物施予包含HPV 52VLPs的疫苗。在本发明的这方面的一种优选实施方式中，HPV 52VLPs是在酵母中制造的。

本发明还涉及一种疫苗，其中包含HPV 52病毒样颗粒(VLPs)，其中，所述HPV 52VLPs是在酵母中制造的。

在本发明的这方面的一种替代性实施方式中，所述疫苗还包含至少一种其它HPV类型的VLPs。所述至少一种其它HPV类型可以是任何感兴趣的HPV类型，包括本领域中已描述的或今后鉴定出来的任何HPV类型。在一种优选的实施方式中，HPV类型是临床表型，例如疣或宫颈癌相关的类型。在另一种优选的实施方式中，所述至少一种其它HPV类型选自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所构成的组。

本发明还涉及包含HPV 52病毒样颗粒的药物组合物，其中，HPV52VLPs是在酵母中制造的。此外，本发明涉及包含HPV 52VLPs和至少一种其它HPV类型的VLPs的药物组合物。在一种优选的实施方式中，所述至少一种其它HPV类型选自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所构成的组。

如无其它明确说明，本说明书和所附权利要求中使用的单数形式的词语“a”、“an”和“the”包括复数形式。

在本说明书和所附权利要求中，应用了下述定义和缩写：

术语“启动子”指，DNA链上结合RNA聚合酶的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成起始复合体，用于起始并驱动转录活性。通过称为“增强子”或“上游激活序列”的激活序列，或称为“沉默子”的抑制序列，可对该复合体加以修饰。

术语“载体”指一些工具(means)，通过其可将DNA片段引入到宿主生物或宿主组织中。有多种类型的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、细菌噬菌体和粘粒。

术语“盒”指，将从载体中表达的核苷酸或基因序列，例如，编码HPV 52L1蛋白的核苷酸或基因序列。通常，所述的盒包含插入到载体中的基因序列，在一些实施方式中，所述载体提供用于表达核苷酸或基因序列的调控序列。在其它实施方式中，所述核苷酸或基因序列为其自己的表达提供调控序列。在另外的实施方式中，载体提供一些调控序列，所述核苷酸或基因序列提供其它调控序列。例如，载体可以提供用于转录核苷酸或基因序列的启动子，所述核苷酸或基因序列提供转录终止序列。可由载体提供的调控序列包括但不限于，增强子、转录终止序列、剪接受体和供体序列、内含子、核糖体结合序列和poly(A)添加序列。

名称“52L1野生型序列”和“52L1wt序列”指本文中作为SEQID NO：3公开的HPV 52L1序列。虽然HPV 52L1野生型序列以前已被描述过，但是发现从临床分离物中获得的DNA之间的细微序列差异并不罕见。因此，从以前显示含有HPV 52DNA的临床样品中分离出了具有代表性的HPV 52L1野生型序列(见实施例1)。HPV 52L1野生型序列被用作为对照序列，以对本文公开的经过密码子优化的HPV 52L1序列加以比较(见图1)。

名称“HPV 52L1R”和“52L1R”指，本文公开的示例性的合成HPV52L1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其中，所述序列被重构(rebuilt)，使得其中包含酵母细胞高水平表达所优选的密码子。

术语“有效量”指，足够的疫苗组合物被引入，以产生足够水平的多肽，使得产生免疫应答。本领域技术人员知道，该水平是可以变化的。

“保守氨基酸序列”指，一个氨基酸残基被另一个化学上相近的氨基酸残基代替。此类保守取代的例子是：一个疏水残基(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸)取代另一个；一个极性残基取代另一个具有相同电荷的极性残基(例如，精氨酸取代赖氨酸；谷氨酸取代天冬氨酸)。

术语“哺乳动物”指，任何哺乳动物，包括人。

“VLP”或“VLPs”指病毒样颗粒或多种病毒样颗粒。

“合成”指，制造HPV 52L1基因，使得其含有的核苷酸序列与指定的天然存在的野生型HPV 52L基因(52L1wt，SEQ ID NO：3)中存在的核苷酸序列不相同。如上所述，本文中提供了合成分子，其中包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含针对酵母细胞表达优选的密码子。本文提供的合成分子编码与野生型HPV 52L1基因(SEQ ID

NO：2)相同的氨基酸序列。

附图说明

图1展示了序列比对情况，其中比较了本发明的合成HPV 52L1基因(SEQ ID NO：1，被表示为“52L1R”)(见实施例2)中改变的核苷酸。对照序列是52L1野生型序列(SEQ ID NO：3，被表示为“52L1wt”，见实施例1)。被改变的核苷酸在其相应位置被示出。圆括号中包含了核苷酸编号。在52L1重构序列中相同的核苷酸以圆点表示。

图2展示了重构的合成HPV 52L1双链核酸(SEQ ID NO：1和7)和单字母密码氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。核苷酸编号被表示在左边。

图3展示了HPV 52L1wt和HPV 52L1R转录子的Northern杂交印迹(见实施例4)。该印记是用针对52L1wt和52L1R序列制造的DNA探针来检测的。右边的箭头显示了全长52L1转录子的预测位置。在52L1wt RNA的5和10μg泳道上，没有探测到任何长度的转录子。全长转录子在5和10μg泳道的52 L1 R上是明显的。

图4展示了HPV 52 L1wt(52wt)和52L1 R(52R)白的Western杂交印迹。HPV 16 L1被包括进去，用作为对照(16)。使10、5和2.5微克的总酵母蛋白提取物变性，将其应用到10％SDS-PAGE凝胶上。蛋白是通过Western转移的。用酵母吸收的(yeast-absorbed)抗-trpE-HPV 31L1山羊多克隆抗血清(与HPV 52 L1和HPV 16L1交叉反应)，在得到的杂交印迹上探测到了HPV 52 L1蛋白。分子量标记以kDa表示在左边。箭头表示了～55kDa的HPV 52L1蛋白的位置。

图5展示了本文所述的HPV 52 L1 R蛋白分子组成的HPV 52VLPs代表性样品，可通过透射电子显微镜(见实施例7)看到。该粗制样品中球形颗粒的直径在40至70nm的范围内，一些颗粒展示出衣壳体的有序排列。横线代表大约0.1μm。

发明详述

大部分宫颈癌与人乳头瘤病毒(HPV)的特定致癌类型的感染相关。本发明涉及组合物和方法，用于诱导出或增强对致癌HPV类型的基因表达的蛋白产物的免疫性。具体而言，本发明提供了编码HPV 52

L1的多核苷酸，其中，已针对在酵母细胞中高水平的表达对所述多核苷酸进行了密码子优化。本发明还提供了HPV 52病毒样颗粒(VLPs)，其是在酵母中制造的，本发明公开了所述多核苷酸和VLPs在用于预防和/或治疗HPV相关癌症的免疫原性组合物和疫苗中的用途。

野生型HPV 52 L1核苷酸序列已被报道过(Genbank编号NC001592)。本发明提供了编码HPV 52L1蛋白的合成DNA分子。在本发明的一个方面，合成分子包含密码子序列，其中，对密码子中的至少一些进行了改造，使用了酵母细胞高水平表达的优选密码子。在本发明的另一方面，合成分子的核苷酸序列被改造，去掉了被酵母细胞识别的转录终止信号。合成分子可被用作为编码序列，用于表达HPV52 L1蛋白，所述蛋白可以自装配为VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗，以通过中和抗体和细胞介导的免疫性，提供针对乳头瘤病毒感染的有效免疫预防。此类基于VLP的疫苗还可用于治疗已经发生的HPV感染。

HPV VLPs在酵母细胞中的表达提供了如下优点：具有成本效益，并且容易在发酵罐中进行大规模培养。此外，可以容易地对酵母基因组加以改造，以确保选出生长和表达潜能被提高的重组转化酵母。但是，很多HPV L1蛋白，包括HPV 52L1，在酵母细胞中表达的水平低于商业规模需要的水平(见实施例2)。

因此，本发明涉及针对在酵母细胞内环境高水平表达“优化”过的HPV 52L1基因序列。

四种可能的核苷酸碱基的“三联”密码子可以以超过60种不同的形式存在。因为这些密码子仅针对20种不同的氨基酸(以及转录起始和终止)提供信息，一些氨基酸可被超过一种密码子所编码，这种现象被称为密码子冗余。因为未能完全理解的原因，在不同种类细胞的内源DNA中，可互相代替的密码子却不是呈平均状态存在的。事实上，在某些类型的细胞中存在对某些密码子不同的自然序位(hierarchy)或“偏好”。例如，氨基酸亮氨酸就可由六种DNA密码子所代表，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG。对微生物基因组密码子使用频率的详细分析揭示，E.coli的内源DNA最通常含有CTG亮氨酸指定密码子，而酵母和粘菌的DNA则最通常包括TTA亮氨酸指定密码子。从该序位的角度，通常相信，通过E.coli宿主获得富含亮氨酸的多肽的高水平表达的可能性将在一定程度上取决于密码子使用频率。例如，富含TTA密码子的基因可能在E.coli中很少表达，而富含CTG的基因将可能在该宿主中高度表达。类似地，用于在酵母宿主细胞中表达富含亮氨酸的多肽的优选密码子是TTA。

密码子偏爱现象对于重组DNA技术的意义是明显的，该现象可以用于解释以前在成功转化的宿主生物中获得高水平表达的外源基因的很多失败--“优选”程度更低的密码子可能重复出现于插入基因之中，而宿主细胞用于表达的机制却可能无法有效操作。该现象暗示，对于重组蛋白质表达的实践来说，被设计为包括进预计宿主细胞的优选密码子的合成基因提供了外源遗传材料的最优形式。因此，本发明的一个方面是针对在酵母细胞中高水平表达进行过密码子优化的HPV52L1基因。在本发明的一种优选实施方式中，已经发现，使用编码相同蛋白序列的替代性密码，可以去除通过酵母细胞表达HPV 52L1蛋白的障碍。

根据本发明，HPV 52L1基因片断被转化为：具有相同翻译后序列，但是具有如Sharp and Cowe(synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae.Yeast 7：657-678(1991))所述的替代性密码子使用的序列，该文献通过引用并入本文。该方法通常包括：鉴定出野生型序列中通常与高度表达的酵母基因不相关的密码子，用用于在酵母细胞中高度表达的优化密码子代替它们。然后针对这些密码子替换产生的不想要序列，对新的基因序列加以检查(例如，“ATTTA”序列，无意中产生的内含子剪接识别位点，不想要的限制性酶位点，高GC含量，被酵母识别的转录终止信号的存在等)。通过用编码同样氨基酸的不同密码子去取代现有的密码子，来去除不想要的序列。然后针对表达的增加对合成基因片断加以检验。

上述方法被用于制造HPV 52L1的合成基因片断，得到了包含针对高水平表达优化过的密码子的基因。虽然上述方法提供了对我们所用的、设计用于HPV疫苗的密码子优化基因的方法的概述，但是本领域技术人员应当理解，对该过程的小改动或序列的小改动，也能获得类似的疫苗效果或增加的基因表达。

因此，本发明涉及一种合成多核苷酸，其中包含编码HPV 52L1蛋白或者HPV 52L1蛋白的具有生物活性的片段或突变形式的核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含针对在酵母宿主细胞中表达进行过优化的密码子。HPV 52L1蛋白的所述突变形式包括但不限于，保守氨基酸取代、氨基末端截短、羧基末端截短、删除或添加。任何此类具有生物活性的片段和/或突变都能编码下述蛋白或蛋白片段，所述蛋白或片段至少能基本模拟如SEQ ID NO：2示出的HPV 52L1蛋白的免疫性质。本发明的合成多核苷酸编码表达功能性HPV 52L1蛋白的mRNA分子，因此可用于开发治疗或预防用的HPV疫苗。

本发明的一个方面是经过密码子优化的核酸分子，其编码如SEQID NO：2所示的HPV 52L1蛋白，所述核酸分子包含针对在酵母细胞中高水平表达进行过密码子优化的核苷酸序列。在本发明的这方面的一种优选的实施方式中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还涉及重组载体和原核及真核重组宿主细胞，其中含有本说明书公开的核酸分子。在本发明的一种优选的实施方式中，宿主细胞是酵母宿主细胞。

通过本文所述的方法构建的合成HPV 52L1DNA、其功能等同物及其片段可以重组表达，这是通过分子克隆进表达载体来实现的，所述表达载体中含有合适的启动子和其它合适的转录调控元件。所述表达载体可以被转移到原核或真核宿主细胞中，产生重组的HPV 52L1蛋白。用于此类操作的技术在本领域内有完善的描述(Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel et al，Green Pub.Associates and Wiley-Interseience，New york(1988)；Yeast Genetics：A Laboratory CourseManual，Rose et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，(1990)，上述文献通过引用被全部并入本文)。

因此，本发明涉及在重组宿主细胞中表达HPV 52L1蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含编码HPV 52L1蛋白的核酸的载体引入到酵母宿主细胞中；以及(b)在能使所述HPV 52L1蛋白表达的条件下培养所述酵母宿主细胞。

本发明还涉及一种在重组宿主细胞中表达HPV 52L1蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含编码HPV 52L1蛋白的核酸的载体引入到酵母宿主细胞中；其中，已针对在酵母宿主细胞中的最优表达对所述核酸进行了密码子优化；(b)在能使所述HPV 52L1蛋白表达的条件下培养所述酵母宿主细胞。

本发明还涉及一种在重组宿主细胞中表达HPV 52L1蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含如SEQ ID NO：1所示的核酸的载体引入到酵母宿主细胞中；以及(b)在能使所述HPV 52L1蛋白表达的条件下培养所述酵母宿主细胞。

本发明的合成基因可被装配进包含下述序列的表达盒，所述序列被设计为：能提供宿主细胞中HPV 52L1蛋白的高效表达。所述的盒优选含有合成基因，以及与其可操作地相连的转录和翻译控制序列，例如，启动子和终止序列。在一种优选的实施方式中，启动子是S.cerevisiae GAL1启动子，虽然本领域技术人员将知道，大量的其它已知酵母启动子(例如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK启动子)或其它真核基因启动子中的任何启动子都可以使用。一种优选的转录终止子是S.cerevisiae ADH1启动子，虽然其它已知的转录终止子也可以使用。GAL1启动子-ADH1终止子的组合是特别优选的。

本发明的另一方面是HPV 52病毒样颗粒(VLP)、制造HPV 52VLPs的方法以及使用HPV 52VLPs的方法，所述颗粒是通过在酵母细胞中重组表达HPV 52L1或L1+L2基因来制造的。当L1，人和动物乳头瘤病毒的主要衣壳蛋白在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中表达时，VLPs可以自装配(综述参见，Schiller and Roden，inPapillomavirus Reviews：Current Research on Papillomaviruses；Laceyed.Leeds，UK：Leeds Medical Information，pp 101-12(1996))。形态上无区别的(morphologically indistinct)HPV VLPs还可以通过表达L1和L2衣壳蛋白的组合来制造。VLPs由72个L1的五聚体组成，是T＝7的二十面体结构(Baker et al.，Biophys.J.60(6)：1445-56(1991))。

VLPs在形态上与真的病毒例子相近，施予动物时，其能诱导高效价的中和抗体。用VLPs对兔(Breitburd et al.，J.Virol.69(6)：3959-63(1995))和狗(Suzich et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(25)：11553-57(1995))免疫显示，其既能诱导中和抗体，又能提供针对实验性乳头瘤病毒感染的保护。此外，用HPV 16VLPs对成年女性进行的免疫显示出，其能提供对于抵抗HPV感染和HPV 16宫颈上皮内瘤形成的保护(Koutsky et al. N.Engl.J.Med.347：1645-51(2002))。因为VLPs不含可能致癌的病毒基因组，并能在从单基因表达的时候自装配，因此，它们成为使用活病毒开发HPV疫苗的安全替代(综述参见Schillerand Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000))。

因此，本发明涉及由HPV 52的重组L1蛋白或重组L1+L2蛋白组成的病毒样颗粒，其中，所述重组蛋白在酵母细胞中表达。

如上所述，在本发明的一种优选的实施方式中，HPV 52VLPs是在酵母中制造的。在另一种优选的实施方式中，酵母选自由Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermyces fragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomycespombe构成的组。

本发明的另一方面是包含HPV 52L1蛋白的HPV 52VLP，所述蛋白是由经过密码子优化的HPV 52L1基因制造的。在本发明的这方面的一种优选的实施方式中，经过密码子优化的HPV 52L1基因包含SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列。

本发明的另一方面是生产HPV 52VLPs的方法，所述方法包括：

(a)用编码HPV 52L1蛋白或HPV 52L1+L2蛋白的重组DNA分子去转化酵母；(b)在允许所述重组DNA分子表达的条件下培养经过转化的酵母，生产重组HPV 52蛋白；以及(c)分离出重组HPV 52蛋白，制造HPV 52VLPs。

在本发明的这方面的一种优选的实施方式中，酵母是用经过密码子优化的HPV 52L1基因转化的，以生产HPV 52VLPs。在一种特别优选的实施方式中，经过密码子优化的HPV 52L1基因包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种方法，用于在动物中诱导免疫应答，所述方法包括将HPV 52病毒样颗粒施予动物。在一种优选的实施方式中，HPV 52VLPs是通过重组表达经过密码子优化的基因来制造的，所述基因编码HPV 52L1或HPV 52L1+L2。

本发明的另一方面是预防和/或治疗HPV相关宫颈癌的方法，所述方法包括向哺乳动物施予包含HPV 52VLPs的疫苗。在本发明的这方面的一种优选的实施方式中，HPV 52VLPs是在酵母中制造的。

本发明还涉及包含HPV 52病毒样颗粒(VLPs)的疫苗。

在本发明的这方面的一种替代性实施方式中，疫苗还包含至少一种其它HPV类型的VLPs。在一种优选的实施方式中，所述至少一种其它HPV类型选自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所构成的组。

在本发明的这方面的一种优选的实施方式中，所述疫苗还包含HPV 16VLPs。

在本发明的另一种优选的实施方式中，所述疫苗还包含HPV 16VLPs和HPV 18VLPs。

在本发明的又一种优选的实施方式中，所述疫苗还包含HPV 6VLPs、HPV 11VLPs、HPV 16VLPs和HPV 18VLPs。

本发明还涉及包含HPV 52病毒样颗粒的药物组合物。此外，本发明涉及包含HPV 52VLPs和至少一种其它HPV类型的VLPs的药物组合物。在一种优选的实施方式中，所述至少一种其它HPV类型选自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所构成的组。

本发明的疫苗组合物可以以合适的剂量单独使用，该剂量是允许用最小的可能毒性进行对HPV感染的最优抑制的剂量。此外，与其它试剂共同施予或者按照顺序施予也是令人期望的。

将被引入到疫苗接受者中的病毒样颗粒的量将取决于被表达的基因产物的免疫原性。通常，大约10μg至100μg的免疫或预防有效剂量，优选为大约20μg至60μg的VLPs被直接施予肌肉组织中。皮下注射、皮内导入、通过皮肤压入(impression)和其它施予方式，例如腹膜内、静脉内或吸入运送方式都可包括进来。可以提供强化免疫，这也包括进本发明。非肠道施予，例如静脉内、肌肉内、皮下或用其它方式与佐剂例如明矾或Merck明矾佐剂一同施用，在非肠道引入本发明的疫苗之后或同时，也是有好处的。

为了描述和公开与本发明的方法相关的方法和材料，本文提到的所有公开文献都通过引用被并入本文。本文中无任何一处能被解释为：本发明不能通过发明在先而早于此类公开。

已经参考附图对本发明的优选实施方式进行了描述，但是应当理解，本发明并不局限于这些细致的实施方式，在不超出所附权利要求确定的本发明的范围或原则的情况下，本领域技术人员可以做出多种改变和改动。

下述实施例用于描述而非限制本发明。

实施例1

确定有代表性的HPV 52L1序列

此前已有对HPV 52L1序列的描述(Genbank编号NC 001592)。但是，人们经常发现从临床分离物中获得的DNA之间的细微序列差别。为确定具有代表性的HPV 52L1野生型序列，从以前显示出含有HPV 52DNA的三份临床样品中分离出DNA。用Taq DNA聚合酶和以下引物：5′L15’-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT-3’(SEQ ID NO：4)和3′52 Bgl II5’-GAGATCTCAATTACACAAAGTG-3’(SEQ ID NO：5)，以聚合酶链式反应(PCR)对HPV 52L1序列进行扩增。在琼脂糖凝胶上对扩增产物进行电泳，通过溴化乙啶染色进行观察。切下大约1500bp的L1条带，用Geneclean Spin Kit(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)对DNA进行纯化。然后将DNA连接到TA克隆载体，pCR 2.1(Invitrogen)上。用连接混合物转化TOP10F’E.coli细胞，涂布到具有卡纳霉素加IPTG和X-gal(用于蓝/白菌落选择)的LB琼脂平板上。将平板倒转，在37℃培养16小时。

针对从扩增的三份临床分离物的每份获得的五个白色菌落，进行菌落PCR。5’L1和3’52 Bgl II引物被用于两步PCR，其中，第一步包含10个循环，每个循环包括在96℃15秒(变性)、55℃30秒(退火)和68℃2分钟(延伸)，第二步包含35个循环，每个循环采用基本相似的程序，除了退火步骤是在50℃进行30秒。在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳，通过溴化乙啶染色进行观察。来自每份临床分离物的若干菌落都含有大约1500bp条带的扩增产物。将这些菌落在具有卡纳霉素的LB培养基中于37℃振荡下培养16小时。用Minipreps提取质粒DNA，用限制性内切酶对其进行消化，展示出质粒中L1基因的存在。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色对得到的限制性片段加以观察。

对含有来自三份临床分离物中每份的克隆的L1插入物的质粒进行DNA测序。将DNA与翻译的氨基酸序列互相比较，以及与之前公开的Genbank HPV 52L1序列进行比较。对三份临床分离物的序列分析揭示，没有序列与Genbank序列(编号NC 001592)相同。pCR2.1HPV

52L1克隆#2C被选为代表性HPV 52L1序列，在本文中其被称为“52L1野生型序列”(SEQ ID NO：3，见图1)。被选作为52L1野生型(wt)的序列较之Genbank序列含有一处点突变，其由核苷酸1308位的沉默突变(腺苷酸→鸟嘌呤)组成。HPV 52L1wt序列的氨基酸序列与52L1Genbank序列相同。

用前文所述3’52 Bgl II引物和5’L1 Bgl II引物(5’-GAGATCTCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3’(SEQ ID NO：6))，对HPV 52L1野生型序列进行扩增，以加上Bgl II延伸。用Taq聚合酶进行PCR。在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳，通过溴化乙啶染色进行观察。切下大约1500bp的L1条带，用Geneclean Spin Kit(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)对DNA进行纯化。然后将PCR产物连接到pCR 2.1载体上，用连接混合物转化TOP10F’细胞。在具有卡纳霉素的LB培养基中，于37℃振荡下对白色菌落进行16小时的培养。用Minipreps来提取质粒DNA。用Bgl II限制性内切酶消化，从载体序列中释放出HPV 52L1基因。用经过消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，通过溴化乙啶染色进行观察。用GeneClean试剂盒来纯化L1条带，将其连接到去磷酸化的、BamHI消化过的pGAL110载体上。用连接混合物转化TOP10F’E.coli细胞。为筛选出以正确方向定位的HPV 52L1插入，对来自菌落的质粒DNA进行PCR扩增。进行DNA测序，以验证插入物的序列和定位方向。选出的克隆被命名为pGAL110-HPV 52L1#5。制备来自选出的克隆的Maxiprep DNA。通过用glusulase原生质球化将Saccharomyces cerevisiae细胞制备为感受态的，用pGAL110-HPV52L1 #5进行转化。将酵母转化混合物涂布到Leu^-山梨糖醇平板上的Leu^-山梨糖醇顶部琼脂上，在30℃倒转培养3-5天。捡出菌落，在Leu^-山梨糖醇平板划线进行分离。随后，在30℃将经过分离的菌落培养于旋转试管培养(rotating tube cultures)中的5ml 5X Leu^-Ade^-山梨糖醇中，其中含有1.6％葡萄糖和4％半乳糖，用于诱导HPV 2L1转录和蛋白质表达。

实施例2

酵母密码子优化

已有对酵母偏爱的密码子的描述(Sharp，Paul M and Cowe，Elizabeth.Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiaeYEAST 7：657-678(1991))。可探测到HPV 52L1wt蛋白的表达，但是其转录水平非常之低，无法通过Northern杂交印迹探测到。假定，不成熟的转录终止可能导致了HPV 52L1基因的低水平表达。为增加该基因的转录以及确保全长转录子产生，用酵母偏爱的密码子对HPV52L1基因加以重构。针对是否存在能被酵母识别的酵母转录终止信号，对序列加以检查，通过用替代性密码子进行取代，除去这些序列，同时保留了相同的氨基酸序列。包含经过酵母密码子优化序列的重构HPV 52L1序列较之HPV 52L1wt序列含有379处核苷酸改变。得到的序列在本文中被称为“52L1R”(R＝重构，见图1)。52L1wt(SEQ ID NO：3)和52L1R(SEQ ID NO：1)序列之间的核苷酸改变被展示于图1中。58L1R的翻译氨基酸序列并无改变(SEQ ID NO：2，见图2)。该重构序列提供了增加的HPV 52L1蛋白表达，在疫苗开发中，这相对野生型来说具有明显的优点。

用于制造优化基因的策略是，设计出覆盖基因的长的重叠正义和反义寡聚物，用酵母偏爱的密码子序列取代核苷酸，同时保持氨基酸序列不变。这些寡聚物被用作为模板DNA，用于用Pfu DNA聚合酶进行的PCR反应。设计额外的扩增引物，将它们用于从模板寡聚物扩增重构序列。

用于扩增的最佳条件是片段特异性的(section-specific)；但是，大多数反应都采用如下类似程序，94℃5分钟(变性)之后是25个循环，每个循环包括95℃30秒(变性)、50-55℃30秒(退火)、72℃1.5分钟(延伸)，接着是72℃7分钟最终延伸，以及4℃的保持。通过琼脂糖凝胶电泳来检查PCR产物。具有合适大小的条带被切下，从凝胶切片来纯化DNA。然后将扩增片段用作为模板，装配1512nt的重构HPV 52L1基因。

重构之后，对1512nt的条带进行凝胶纯化，连接至pCR4平末端载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。连接之后，用连接混合物来转化感受态E.coli TOP10细胞。在4ml含有氨苄青霉素的LB中培养菌落，通过微量制备(miniprep)技术从菌落提取质粒DNA。对质粒DNA加以测序，验证想要的HPV 52L1重构改变的存在。为将BamHI延伸加入到两个末端，从pCR4Blunt-52L1R重新扩增52L1R(重构)。按照上文所述对扩增片段进行克隆，对得到的质粒DNA进行测序。用BamHI去消化质粒pCR4Blunt-52L1R(Bam)，在琼脂糖凝胶上对得到的DNA片段插入物进行电泳。对大约1530bp的HPV 52L1R(Bam)片段进行凝胶纯化，并将其连接到用BamHI消化过的pGAL110上。用连接混合物转化TOP10F’E.coli(Invitrogen)细胞。

通过PCR，对得到的菌落加以筛选，选出以正确方向定位的HPV52L1R。通过DNA测序来验证序列和定向。制备Maxiprep质粒DNA。通过原生质球化将S.cerevisiae细胞制备为感受态，并对其进行转化。酵母转化物被涂布到Leu^-山梨糖醇琼脂平板的Leu^-山梨糖醇顶部琼脂上，倒转培养7天。捡出菌落，在Leu^-山梨糖醇琼脂平板划线用于克隆分离。随后在30℃，将分离的菌落培养于旋转试管培养中、具有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5X Leu^-Ade^-山梨糖醇中，以诱导L1转录和蛋白质表达。48和/或72小时后，对等同于OD₆₀₀＝10的培养物体积进行沉淀，移走上清液，将沉淀冷冻，贮藏于-70℃。

实施例3

RNA制备

将通过半乳糖诱导，被诱导为表达HPV 52L1的转化酵母细胞的沉淀在冰上解冻，悬浮于0.8ml Trizol试剂(Life Technologies，GibcoBRL)中，在室温培养5分钟，将1/5体积的氯仿加入到小管中。然后剧烈震荡15秒以混合，并在室温下培养3分钟。在13krpm下进行5分钟离心之后，收集上层，并将其转移到新的小管中。向小管中加入0.4ml异丙醇。在室温下对混合物进行10分钟的培养。为沉淀RNA，在13krpm下进行10分钟的离心。轻轻倒出上清液，用75％EtOH来洗RNA沉淀，重复离心步骤。轻轻倒出上清液，令RNA沉淀空气干燥15分钟，然后悬浮在不含RNase的水中。用分光光度法来测定样品中RNA的浓度，其中利用下述假设：当A_260/280为1.7-2.0时，A₂₆₀读数为1＝40μg/ml RNA。

实施例4

Northern杂交印迹分析

制备(cast)1.1％的琼脂糖甲醛凝胶。将5和10微克的RNA与变性缓冲液(终浓度：6％甲醛、50％甲酰胺和0.1x MOPS)组合，加热至65℃，10分钟。加入1/10体积的凝胶上样缓冲液，将样品上样至凝胶。在75伏下，1xMOPS缓冲液中进行大约3小时的电泳。在10x SSC中对凝胶进行60分钟的漂洗。

通过毛细作用，在10x SSC中进行16小时，将RNA转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上。然后使用Stratagene UV Stratalinker自动交联功能(Stratagene，LA Jolla，CA)，通过交联将RNA固定到尼龙膜上。固定之后，令尼龙膜空气干燥。

Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I(Hoffmann-La Roche Ltd.，Basel，Switzerland)被用于标记52L1wt和52L1R DNA序列，而DIG将被用作为探针在Northern杂交印迹中探测52L1wt和52L1R RNA。按照厂商推荐，进行预杂交、杂交以及用抗DIG碱性磷酸酶缀合的抗体进行的免疫显色。简言之，在轻微震荡下，于37℃对杂交印迹进行30分钟的预杂交。通过加热到95℃5分钟对探针进行变性，随后在冰上淬火(quench)。将探针加入到杂交溶液中，在轻微震荡下于44.6℃应用到膜上，4小时。然后移出杂交溶液，在室温下，用含有0.1％SDS的2x SSC冲洗两次杂交印迹，每次5分钟，接着在65℃用0.5x SSC和0.1％SDS再洗一次。然后对杂交印迹进行30分钟的封闭，并将抗-DIG碱性磷酸酶缀合的抗体以1∶5000的稀释率应用30分钟。洗杂交印迹，通过用NBT/BCIP底物探测碱性磷酸酶缀合的抗-DIG结合抗体，来测定与探针结合的RNA的存在。

对表达HPV 52L1wt的酵母的最初分析表明，HPV 52L1蛋白被表达；但是，其水平很低。对来自被诱导表达HPV 52L1wt的培养物的酵母提取物的RNA进行的Northern杂交印迹分析没有揭示任何可被探测到的HPV 52L1RNA。因为探测到了一些合适大小的蛋白质，所以清楚知道制造出了一些全长RNA转录子。用酵母优选密码子序列重构了HPV 52L1基因，将其工程改造为：省略了任何可能的成熟前转录终止位点，以确保高强度的转录。对HPV 52L1R转录子的Northern杂交印迹分析揭示，全长转录子产生，并可被Northern杂交印迹分析探测到(图3)。

实施例5

HPV 52L1蛋白表达

将等同于OD₆₀₀＝10的半乳糖诱导的培养物的冷冻酵母细胞沉淀在冰上解冻，并悬浮于300μl含有2mM PMSF的PC缓冲液(100mMNa₂HPO₄和0.5M NaCl，pH 7.0)中。加入浓度为大约0.5g/管的用酸洗过的0.5mm玻璃珠。在4℃下对管进行3个循环的涡旋(vortex)，每个循环5分钟，之间间隔1分钟。加入7.5μl 20％TritonX100，在4℃重复5分钟的涡旋步骤。将管放置到冰上，15分钟，接着在4℃离心10分钟。将上清液转移到灭菌的微离心管中，其被标记为总酵母蛋白提取物，写上日期，贮藏于-70℃。

实施例6

Western杂交印迹分析

通过Western杂交印迹，对来自每个HPV 52L1构建体的20个分离的酵母菌落的总酵母蛋白提取物进行分析，以验证半乳糖诱导后HPV 52L1蛋白的表达。

将10、5、2.5微克总酵母蛋白提取物与SDS-PAGE上样缓冲液组合，加热至95℃，10分钟。将大约55kDa的HPV 16L1蛋白包括进去，作为阳性对照，用不含HPV L1的总酵母蛋白提取物作为阴性对照(数据未示出)。将蛋白质上样至10％SDS-PAGE凝胶上，在Tris-甘氨酸缓冲液中进行电泳。蛋白质分离之后，将蛋白质通过Western从凝胶转移到硝酸纤维素上，将得到的杂交印迹在1x稀释缓冲液(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)中于室温摇晃下封闭1小时。对杂交印迹洗三次，在室温下应用能与HPV 16和HPV 52L1蛋白交叉反应的酵母吸收的山羊抗trpE-HPV 31L1血清，16小时。然后再洗三次杂交印迹，与1∶2500稀释的抗山羊HRP缀合的抗体孵育1小时。再对杂交印迹洗三次，应用NBT/BCIP探测底物(Kirkegaard and Perry Laboratories)。免疫反应性蛋白质作为杂交印迹上的紫色条带被探测到。

在所有情况下，都探测到了HPV 52 L1蛋白，其出现为硝酸纤维素上相应于大约55kDa的明显免疫反应条带。(图4)HPV 52L1R条带(2.5μg道)的强度明显高于HPV 52 L1wt条带(10μg)。这清楚表明，重构之后，经过密码子优化的HPV 52 L1 R的表达水平增加到超过四倍，这是Western杂交印迹上直接比较的界限。

实施例7

透射电子显微镜

为展示出52L1蛋白实际上能自装配形成五聚L1衣壳再随后自装配为病毒样颗粒，用部分纯化的HPV 52 L1 R蛋白提取物进行透射电子显微镜试验(TEM)。

小规模发酵培养酵母，并进行沉淀。对得到的沉淀进行纯化处理。通过免疫杂交印迹来分析沉淀和澄清的酵母提取物，以显示纯化过程期间HPV 52L1蛋白的表达和驻留。然后在45％蔗糖垫(cushion)下对澄清的酵母提取物进行离心，将得到的沉淀悬浮于缓冲液中，用于通过TEM对HPV 52L1VLPs进行分析。

图5展示了制造的HPV 52 L1 R VLPs的代表性样品。该粗制样品中球形颗粒的直径在40至70nm之间，一些颗粒展示出衣壳体的有序排列。

序列表

<110>Merck & Co.，Inc.

<120>HPV 52L1在酵母中的优化表达.

<130>21571PCT

<150>60/555926

<151>2004-03-24

<160>7

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1512

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV52L1R

<400>1

atgtccgtct ggagaccatc cgaagctact gtctacttgc caccagttcc agtctctaag 60

gttgtctcta ccgacgaata cgtctccaga acctccatct actactacgc tggttcctct 120

agattgttga ctgtcggtca cccatacttc tctatcaaga acacctcctc cggtaacggt 180

aagaaggtct tggttccaaa ggtctctggt ttgcaataca gagtcttcag aatcaagttg 240

ccagacccaa acaagttcgg tttcccagac actagtttct acaacccaga aactcaaaga 300

ttggtctggg cttgtactgg tttggaaatc ggtagaggtc aaccattggg tgtcggtatc 360

tctggtcacc cattgttgaa caagttcgac gacactgaaa cctctaacaa gtacgctggt 420

aagccaggta tcgataacag agaatgtttg tctatggact acaagcaaac tcaattgtgt 480

atcttgggtt gtaagccacc aatcggtgaa cactggggta agggtactcc atgtaacaac 540

aactctggta acccaggtga ctgtccacca ttgcaattga tcaactccgt catccaagac 600

ggtgacatgg tcgacactgg tttcggttgt atggacttca acaccttgca agcttctaag 660

tccgacgtcc caatcgacat ctgttcctct gtctgtaagt acccagacta cttgcaaatg 720

gcttctgaac catacggtga ctccttgttc ttcttcttga gaagagaaca aatgttcgtc 780

agacacttct tcaacagagc tggtaccttg ggtgacccag ttccaggtga cttgtacatc 840

caaggttcca actctggtaa cactgctact gtccaatcct ctgctttctt cccaactcca 900

tctggttcca tggtcacctc cgaatcccaa ttgttcaaca agccatactg gttgcaaaga 960

gctcaaggtc acaacaacgg tatctgttgg ggtaaccaat tgttcgtcac cgtcgtcgac 1020

actactagat ctactaacat gaccttgtgt gctgaagtca agaaggaatc cacctacaag 1080

aacgaaaact tcaaggaata cttgagacac ggtgaagaat tcgacttgca attcatcttc 1140

caattgtgta agatcacctt gaccgctgac gtcatgactt acatccacaa gatggacgct 1200

actatcttgg aagactggca attcggtttg actccaccac catccgcttc cttggaagac 1260

acttacagat tcgtcacttc cactgctatc acctgtcaaa agaacactcc accaaagggt 1320

aaggaagacc cattgaagga ctacatgttc tgggaagtcg acttgaagga aaagttctct 1380

gctgacttgg accaattccc attgggtaga aagttcttgt tgcaagctgg tttgcaagct 1440

agaccaaagt tgaagagacc agctagctct gctccaagaa cttccaccaa gaagaagaag 1500

gtcaagagat aa 1512

<210>2

<211>503

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒，52型

<400>2

Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Gly Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro

35 40 45

Tyr Phe Ser Ile Lys Asn Thr Ser Ser Gly Asn Gly Lys Lys Val Leu

50 55 60

Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile Lys Leu

65 70 75 80

Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro

85 90 95

Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Ile Gly Arg

100 105 110

Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys

115 120 125

Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile

130 135 140

Asp Asn Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys

145 150 155 160

Ile Leu Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr

165 170 175

Pro Cys Asn Asn Asn Ser Gly Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Gln

180 185 190

Leu Ile Ash Ser Val Ile G1n Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe

195 200 205

Gly Cys Met Asp Phe Asn Thr Leu Gln Ala Ser Lys Ser Asp Val Pro

210 215 220

Ile Asp Ile Cys Ser Ser Val Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met

225 230 235 240

Ala Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu

245 250 255

Gln Met Phe Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Thr Leu Gly Asp

260 265 270

Pro Val Pro Gly Asp Leu Tyr Ile Gln Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr

275 280 285

Ala Thr Val Gln Ser Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met

290 295 300

Val Thr Ser Glu Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg

305 310 315 320

Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val

325 330 335

Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Ala Glu

340 345 350

Val Lys Lys Glu Ser Thr Tyr Lys Asn Glu Asn Phe Lys Glu Tyr Leu

355 360 365

Arg His Gly Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys

370 375 380

Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Lys Met Asp Ala

385 390 395 400

Thr Ile Leu Glu Asp Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala

405 410 415

Ser Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Thr Ala Ile Thr Cys

420 425 430

Gln Lys Asn Thr Pro Pro Lys Gly Lys Glu Asp Pro Leu Lys Asp Tyr

435 440 445

Met Phe Trp Glu Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp

450 455 460

Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Gln Ala

465 470 475 480

Arg Pro Lys Leu Lys Arg Pro Ala Ser Ser Ala Pro Arg Thr Ser Thr

485 490 495

Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg

500

<210>3

<211>1512

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒，52型

<400>3

atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtacc tgtctctaag 60

gttgtaagca ctgatgagta tgtgtctcgc acaagcatct attattatgc aggcagttct 120

cgattactaa cagtaggaca tccctatttt tctattaaaa acaccagtag tggtaatggt 180

aaaaaagttt tagttcccaa ggtgtctggc ctgcaataca gggtatttag aattaaattg 240

ccggacccta ataaatttgg ttttccagat acatcttttt ataacccaga aacccaaagg 300

ttggtgtggg cctgtacagg cttggaaatt ggtaggggac agcctttagg tgtgggtatt 360

agtgggcatc ctttattaaa caagtttgat gatactgaaa ccagtaacaa atatgctggt 420

aaacctggta tagataatag ggaatgttta tctatggatt ataagcagac tcagttatgc 480

attttaggat gcaaacctcc tataggtgaa cattggggta agggaacccc ttgtaataat 540

aattcaggaa atcctgggga ttgtcctccc ctacagctca ttaacagtgt aatacaggat 600

ggggacatgg tagatacagg atttggttgc atggatttta ataccttgca agctagtaaa 660

agtgatgtgc ccattgatat atgtagcagt gtatgtaagt atccagatta tttgcaaatg 720

gctagcgagc catatggtga cagtttgttc ttttttctta gacgtgagca aatgtttgtt 780

agacactttt ttaatagggc cggtacctta ggtgaccctg tgccaggtga tttatatata 840

caagggtcta actctggcaa tactgccact gtacaaagca gtgctttttt tcctactcct 900

agtggttcta tggtaacctc agaatcccaa ttatttaata aaccgtactg gttacaacgt 960

gcgcagggcc acaataatgg catatgttgg ggcaatcagt tgtttgtcac agttgtggat 1020

accactcgta gcactaacat gactttatgt gctgaggtta aaaaggaaag cacatataaa 1080

aatgaaaatt ttaaggaata ccttcgtcat ggcgaggaat ttgatttaca atttattttt 1140

caattgtgca aaattacatt aacagctgat gttatgacat acattcataa gatggatgcc 1200

actattttag aggactggca atttggcctt accccaccac cgtctgcatc tttggaggac 1260

acatacagat ttgtcacttc tactgctata acttgtcaaa aaaacacgcc acctaaagga 1320

aaggaagatc ctttaaagga ctatatgttt tgggaggtgg atttaaaaga aaagttttct 1380

gcagatttag atcagtttcc tttaggtagg aagtttttgt tacaggcagg gctacaggct 1440

aggcccaaac taaaacgccc tgcatcatcg gccccacgta cctccacaaa gaagaaaaag 1500

gttaaaaggt aa 1512

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

atgtccgtgt ggcggcctag t 21

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gagatctcaa ttacacaaag tg 22

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

gagatctcac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31

<210>7

<211>1512

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>52L1R反义

<400>7

tacaggcaga cctctggtag gcttcgatga cagatgaacg gtggtcaagg tcagagattc 60

caacagagat ggctgcttat gcagaggtct tggaggtaga tgatgatgcg accaaggaga 120

tctaacaact gacagccagt gggtatgaag agatagttct tgtggaggag gccattgcca 180

ttcttccaga accaaggttt ccagagacca aacgttatgt ctcagaagtc ttagttcaac 240

ggtctgggtt tgttcaagcc aaagggtctg tgatcaaaga tgttgggtct ttgagtttct 300

aaccagaccc gaacatgacc aaacctttag ccatctccag ttggtaaccc acagccatag 360

agaccagtgg gtaacaactt gttcaagctg ctgtgacttt ggagattgtt catgcgacca 420

ttcggtccat agctattgtc tcttacaaac agatacctga tgttcgtttg agttaacaca 480

tagaacccaa cattcggtgg ttagccactt gtgaccccat tcccatgagg tacattgttg 540

ttgagaccat tgggtccact gacaggtggt aacgttaact agttgaggca gtaggttctg 600

ccactgtacc agctgtgacc aaagccaaca tacctgaagt tgtggaacgt tcgaagattc 660

aggctgcagg gttagctgta gacaaggaga cagacattca tgggtctgat gaacgtttac 720

cgaagacttg gtatgccact gaggaacaag aagaagaact cttctcttgt ttacaagcag 780

tctgtgaaga agttgtctcg accatggaac ccactgggtc aaggtccact gaacatgtag 840

gttccaaggt tgagaccatt gtgacgatga caggttagga gacgaaagaa gggttgaggt 900

agaccaaggt accagtggag gcttagggtt aacaagttgt tcggtatgac caacgtttct 960

cgagttccag tgttgttgcc atagacaacc ccattggtta acaagcagtg gcagcagctg 1020

tgatgatcta gatgattgta ctggaacaca cgacttcagt tcttccttag gtggatgttc 1080

ttgcttttga agttccttat gaactctgtg ccacttctta agctgaacgt taagtagaag 1140

gttaacacat tctagtggaa ctggcgactg cagtactgaa tgtaggtgtt ctacctgcga 1200

tgatagaacc ttctgaccgt taagccaaac tgaggtggtg gtaggcgaag gaaccttctg 1260

tgaatgtcta agcagtgaag gtgacgatag tggacagttt tcttgtgagg tggtttccca 1320

ttccttctgg gtaacttcct gatgtacaag acccttcagc tgaacttcct tttcaagaga 1380

cgactgaacc tggttaaggg taacccatct ttcaagaaca acgttcgacc aaacgttcga 1440

tctggtttca acttctctgg tcgatcgaga cgaggttctt gaaggtggtt cttcttcttc 1500

cagttctcta tt 1512

Claims

1.一种核酸分子，其由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成，其中已针对在酵母细胞中高水平表达对所述核酸序列进行了密码子优化。

2.包含如权利要求1所述的核酸分子的载体。

3.包含如权利要求2所述的载体的宿主细胞。

4.如权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞选自由Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermyces fragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomyces pombe所构成的组。

6.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae。

7.一种生产HPV52病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括：

(a)用权利要求1的核酸分子转化酵母细胞；

(b)在允许所述经过密码子优化的核酸分子表达的条件下培养所述经过转化的酵母细胞，生产重组HPV52乳头瘤病毒蛋白；以及

(c)分离出所述重组乳头瘤病毒蛋白，生产HPV52 VLP。

8.如权利要求1所述的核酸分子在制备用于在动物中诱导抗HPV52的免疫应答的药物中的用途。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述酵母细胞选自由Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermyces fragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomyces pombe所构成的组。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae。