JP4563582B2 - ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子を使用するタンパク質送達系 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質を修飾パピローマウイルスL2タンパク質に融合させ該融合タンパク質をウイルス様粒子内で発現させることにより、該タンパク質を細胞に送達する方法に関する。本発明はまた、該タンパク質をコードする修飾遺伝子、該修飾ウイルス様粒子、および該ウイルス様粒子を含有する宿主細胞に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ヒトパピローマウイルス（HPV）は生殖管に感染し、種々の癌および他の疾患に関連づけられている。組換え的に産生したL1タンパク質およびL1 + L2タンパク質は自己集合して、ウイルス様粒子（VLP）を形成しうる。これらのVLPは免疫原性であり、ワクチンの基礎となりうる。
【０００３】
しかし、現在、HPVにより引き起こされる疾患に対する公知の予防ワクチンも、理想的な治療方法も存在しない。VLPの環境中で共送達される他のHPVタンパク質、例えばHPV初期タンパク質または遺伝子に対する免疫応答は、ワクチンの防御効果を増強しうる。完全長L2とHPV E2またはE7との融合タンパク質を産生するようL2タンパク質が修飾されているVLPが、最近、Greenstoneらの文献において報告された（Greenstoneら, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805）。該融合タンパク質はL1と共集合してVLPとなり、これは、形態学的にも中和抗体惹起能力においてもL1 VLPから区別できないようであった。さらに、腫瘍攻撃モデルにおいて、キメラL1 + L2:E7融合体VLPでワクチン接種されたマウスはE7発現腫瘍からマウスを防御することが判明した。
【０００４】
しかしながら、融合相手として完全長L2を使用することには、いくつかの潜在的な問題を伴う。第1に、サイズ上の制限のため、融合相手としての全L2は、大きな融合タンパク質を受容する限られた能力しか有していない。例えば、CRPVの無傷L2とE1との融合は、形態学的に異常なVLPを与える。さらに、完全長L2の発現は、十中八九、酵素的に活性なタンパク質の活性に影響を及ぼし、したがって、機能的タンパク質を細胞内に送達するその有用性を制限するであろう。L1と共集合してVLPを与えうるL2の最小配列要件は不明であり、L1と集合する能力を保有させたままでL2の有意な部分を欠失させることが可能なのかに関しても明らかでない。
【０００５】
完全長L2のタンパク質送達機能を依然として保持すると同時に、より大きく機能的に活性なタンパク質を送達しうる、最小L2融合タンパク質を提供することが望ましいであろう。
【０００６】
（発明の記載）
本発明は、ペプチドまたはタンパク質を細胞に送達する方法であって、a）送達するペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を、修飾されたパピローマウイルス（PV）L2遺伝子に融合させて、融合タンパク質遺伝子を得（該L2遺伝子は、完全長より小さく、少なくとも、L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）のコード配列を含む）、b）該融合タンパク質遺伝子を宿主細胞内で発現させて、融合タンパク質を得、c）該融合タンパク質とPV L1タンパク質とを、該融合タンパク質および該L1タンパク質が自発的に合体してウイルス様粒子（VLP）を形成する条件下で接触させ、d）該VLPを細胞に送達する工程を含んでなる方法に関する。
【０００７】
本発明はまた、関心のあるペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子に融合した、完全長未満のL2タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸、およびこれらの融合タンパク質に関する。特に、本発明は、L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸を少なくとも含み完全長未満のL2を含むL2融合タンパク質に関する。また、本発明は、該融合タンパク質を含有するウイルス様粒子（VLP）、およびこれらのVLPを含有する細胞宿主に関する。
【０００８】
（図面の簡単な説明）
図1は、天然HPV16 L2由来の最小L2 DNA構築物の集合体を示す。小文字のイタリック体で示されているHPV16 L2のコード配列を、PCR増幅用の鋳型として使用した。開始コドンおよび終結コドンは大文字で示されている。センスプライマーIおよびAは該鋳型の上に示されており、アンチセンスプライマーCおよびDは該鋳型の下に示されている。PCR増幅により導入された新たな配列情報が大文字で示されている。プライマーAおよびC中の相補的配列には下線が付されている。
【０００９】
図2は、HPV 16最小L2遺伝子のアミノ酸の翻訳である。唯一の制限部位NotI、SacIおよびXhoIを含有するポリリンカーの導入により生じたアミノ酸変化が、イタリック体で示されている。アミノ酸1〜69は、L2のアミノ末端から与えられたものである。グルタミン酸残基が70位に付加されている。アミノ酸71〜154は、L2のカルボキシル末端から与えられたものである。72位においては、完全長野生型L2中に存在するセリンがグルタミン酸残基で置換されている。
【００１０】
図3は、免疫沈降酵母ライセートのウエスタンブロットであり、これは、L2-Eキメラタンパク質とHPV16 L1 VLP特異的Mab H16:V5との共免疫沈降を示している。左パネルは、最小L2:E1融合体（mL2:E1）クローンE1-121〜E1-124の抗E1染色免疫ブロットを示し、mL2:E2サンプルE2-23およびライセート無しのサンプルは特異性対照である。中央パネルは、最小L2:E7融合体（mL2:E7）クローンE7-125〜E7-127およびE7-31の抗E7染色免疫ブロットを示し、mL2:E2サンプルE2-23およびライセート無しのサンプルは特異的対照である。右パネルは、mL2:E2融合体クローンE2-33a、E2-33bの抗E2染色免疫ブロットを示し、また、サンプルE2-33b（H16:V5捕捉抗体無し）が対照として示されており、YP3#1（Eタンパク質無し）対照がmL2ベクターとして示されている。
【００１１】
図4は、一過性にトランスフェクトされた細胞ライセートのβ-ガラクトシダーゼ活性の一覧表である。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
本発明の方法は、実質的に任意のパピローマウイルス株に関して用いることができる。好ましい実施形態においては、該HPVは、性器いぼ及び／又は性器癌に関連した株の1つであり、特に、HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52およびHPV56よりなる群から選ばれうる。
【００１３】
野生型ウイルス様粒子は、少量のL2タンパク質を含有するものの、主としてL1タンパク質から構成される。本発明においては、該VLPは、野生型L1タンパク質を尚も含有するが野生型L2ではなく欠失L2融合タンパク質を含有するように修飾されている。該融合タンパク質のL2セグメントは、完全長L2タンパク質より実質的に小さく、それは、L1タンパク質との会合およびVLP内への取込みに必要なアミノ末端由来およびカルボキシル末端由来のペプチドドメイン [HPV 16型の場合には、少なくとも、L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）のコード配列] を含有する。該L2配列は、野生型より小さい限り、これより大きくてもよい。好ましくは、存在するL2アミノ酸の全量は、野生型の約60％未満、より好ましくは、野生型の約50％未満であり、より一層好ましくは、野生型の約35％未満である。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、この修飾L2を「最小L2」遺伝子およびタンパク質と称することにする。
【００１４】
実質的に任意のタンパク質またはペプチドを最小L2タンパク質に融合させて、該融合タンパク質を得ることができる。目的が、野生型VLPと比較して増強した免疫応答を誘導するVLPを得ることにある場合には、通常はVLPの一部でないHPVタンパク質が好ましい。この適用の場合、これらのタンパク質には、HPV: E1、E2、E3、E4、E5、E6および／またはE7、HIV TATおよび／またはβ-ラクタマーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいタンパク質としては、E1、E2およびE7が挙げられる。これらの融合タンパク質、およびそれらをコードする核酸は、本発明のもう1つの態様を構成する。
【００１５】
本発明の利点の1つは、融合相手が大きなタンパク質であってもよいことである。例えば、融合相手は、50kD以上、60kD以上、さらには70kD以上であってもよい。この増加したサイズは、ほとんどの公知タンパク質の導入を可能にし、この送達系を、前記のHPV関連タンパク質に関してだけではなく、HPV疾患の治療に関連しないタンパク質に関しても特に有用なものにする。
【００１６】
したがって、本発明は、実質的に任意の所望のタンパク質またはペプチドを細胞内に送達するように導く、汎用輸送体としての修飾VLPの使用方法を含む。1つの実施形態においては、細胞によるVLPの取込みの尺度として、レポーターまたは調節タンパク質を細胞に送達する。融合候補体の一例としては、TATとして公知のHIV調節タンパク質が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。最小L2とTATとの融合体はタンパク質機能を保有し、L1と共にVLPを形成することが示されている。これは、中和アッセイの確立において有用である。
【００１７】
該融合タンパク質およびL1タンパク質は、それらの2つの遺伝子の発現を可能にする条件下、選択した宿主細胞を該タンパク質コード化遺伝子で形質転換することにより、同時に産生させることができる。一般的な技術、L1およびL2の遺伝子、ならびにL1およびL2タンパク質を発現する組換え発現のための方法は、当技術分野において公知であり、使用可能である。好ましい宿主細胞には、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞および大腸菌（E. coli）が含まれる。
【００１８】
本発明の1つの好ましい実施形態においては、公知酵母プロモーター（例えば、酵母Gal 1およびGal 10プロモーター）の制御下でL1およびL2融合体をコードする遺伝子を含有するプラスミドDNAで酵母を形質転換する。増殖培地にガラクトースを加えることにより各遺伝子産物の発現を誘導し、該誘導細胞ライセートからVLPを単離する。
【００１９】
別法として、L1タンパク質のみを発現させるために1組の宿主細胞を形質転換し、本発明のL2融合タンパク質を発現させるためにもう1組の宿主細胞を形質転換することができる。それぞれのタンパク質を集め、所望により精製工程に付し、該融合タンパク質を含有するVLPが形成されるように接触させる。
【００２０】
該修飾VLPは、本発明の更にもう1つの態様を構成する。これらのVLPは、ワクチンとして又は治療法の一部として投与することができる。本発明の治療用または診断用組成物は、PV感染症を治療または診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢などの種々の要因に応じて様々となりうる。他の要因には投与方法が含まれる。一般に、該組成物は、約1mcg〜約1mgの投与量で投与されるであろう。
【００２１】
該医薬組成物は、種々の経路（例えば、皮下、局所、経口、粘膜、静脈内および筋肉内）により個体に投与することができる。
【００２２】
本発明のワクチンは、DNA、RNA、またはL2のアミノ末端およびカルボキシル末端部分（それに融合したタンパク質がVLP内に取込まれるのを可能にするもの）を含有する該DNAにコードされるタンパク質を含む。また、そのようなワクチンは、臨床的な感染の危険性を伴わずに投与するのに十分な程度に安全であり、毒性の副作用を有さず、有効な経路により投与可能であり、安定であり、ワクチン担体に適合性である。
【００２３】
該ワクチンは、種々の経路（例えば、経口、非経口、皮下、粘膜、静脈内または筋肉内）により投与することができる。投与量は、個体の状態、性別、体重および年齢；投与経路；ならびに該ワクチンのPVの型に応じて様々となりうる。該ワクチンは、カプセル剤、懸濁剤、エリキシル剤、液剤などの剤形として使用することができる。該ワクチンは、免疫学的に許容される担体またはアジュバントまたは他の賦形剤で製剤化することができる。
【００２４】
該ワクチンは、治療的に有効な量（すなわち、免疫学的な防御応答をもたらすのに十分な量）で投与する。その治療的に有効な量は、PVの型に応じて様々となりうる。該ワクチンは、単回または複数回で投与することができる。
【００２５】
本発明の精製タンパク質は、免疫原性組成物の製剤中で使用することができる。そのような組成物は、適当な宿主内に導入されると、該宿主内で免疫応答を誘導しうる。
【００２６】
以下に記載の非限定的な実施例は、本発明を更に例示するものである。
【００２７】
実施例 1
修飾 L2 遺伝子の構築
唯一のNotI、SacIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し1つのグルタミン酸残基の挿入とセリンからグルタミン酸へ突然変異とをもたらす合成ポリリンカーによりインフレームで融合したHPV16 L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）のコード配列から、修飾HPV16 L2遺伝子を構築した（図1）。
【００２８】
HPV16 L1 + L2をコードする遺伝子が挿入されたベクターpGal110（Hofmann, Kら1995 Virology 209:506-518）内に含まれる天然L2遺伝子からL2配列を増幅するようなPCRプライマー（Midland Certified Reagents; Midland, TX）を設計した（図1を参照されたい）。
【００２９】
プライマーI（5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; 配列番号1）およびC（5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; 配列番号2）は、アミノ末端の69アミノ酸および23bpの上流非翻訳配列（SmaI制限酵素部位を含む）をコードする265塩基対（bp）の配列を増幅した。プライマーCは、L2アミノ末端コード領域と、該L2コード配列の下流の追加的なNotI、SacIおよびXhoI制限酵素部位とを修飾し伸長した。
【００３０】
プライマーA（5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; 配列番号3）、CおよびD（5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; 配列番号4）は、L2のカルボキシ末端の84アミノ酸をコードする285bpの配列と、BglII制限酵素部位を付加する6bpとを増幅した。また、プライマーAは、L2コード配列の上流のNotI、SacIおよびXhoI部位を含有する17bpの配列を付加した。
【００３１】
最小L2発現構築物を、プライマーAおよびCにより付加された相補的配列を介して集合させた。前記のI/CおよびA/D増幅反応の単離されたDNA産物を共に、IおよびDプライマーを用いるPCR反応において使用した。それらの断片がそれらの17bpの相補的配列を介して結合するのを促進するために、3サイクルのPCRを37℃のアニーリング温度で行い、ついで15サイクルのPCRを57℃の温度で行った。得られた増幅産物を平滑末端化し、pcrScript（Stratagene, LaJolla、 CA）内に連結し、XL-1 Blue MRF'細胞（Stratagene）内に形質転換した。陽性クローンを、プライマーIおよびDを使用するPCRにより同定し、制限消化分析により確認した。ついで該構築物を自動配列分析（Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA）により確認した。
【００３２】
ついで適当な単離物からのプラスミドDNAをSmaIおよびBalIIで消化した。約0.5キロベースペア（kb）の断片をゲル精製し、GAL1プロモーターの隣にHPV16L1遺伝子が挿入されているpGAL110の14kb SmaI-BalIIベクター断片に連結した。コンピテントDH5大腸菌（E. coli）細胞（Gibco BRL, Rockville, MD）を該連結混合物で形質転換し、形質転換体をLBアンピシリンプレート（Remel, Lenexa, KS）上で選択した。L2の部分を増幅するためにプライマーDおよびIを使用するPCRにより、クローンを初期スクリーニングした。候補クローンYP3#1の配列決定は、該配列が図2に示すとおりの配列であることを証明した。
【００３３】
ついで、HPV16 E1、E2、E7またはTatオープンリーディングフレームをコードする遺伝子が挿入されたバックボーン構築物として、YP3#1を使用した。
【００３４】
実施例 2
HPV E タンパク質および Tat をコードする遺伝子の挿入
HPV 16 E2をコードする遺伝子をHPV16陽性臨床サンプルのPCR増幅により得、ついでそれをサブクローニングベクターpCRII（Stratagene）内に直接挿入し、前記のとおりに配列を確認した。ついでE2遺伝子配列を、以下のとおりに修飾した。
【００３５】
1）インフレームXhoI、NaeI、NotI含有DNA配列をE2のアミノ末端部分に付加した。また、NotI、NaeIおよびXhoI含有配列をE2のカルボキシル末端部分に付加して、E2内のNotI、XhoI部位への挿入を容易にした。
【００３６】
2）グルタミン酸39およびイソロイシン73の残基がアラニン残基をコードするよう、該DNA配列をPCR突然変異誘発により改変した。これは、E2タンパク質の機能を不活性化するように設計された。
【００３７】
前記の修飾HPV16 E2遺伝子をNotI、XhoIで消化し、同様に消化されたYP3#1ベクターに連結した。適切に挿入されたE2配列を含有する形質転換体をPCRにより選択し、配列を確認し、YP3-E2と命名した。
【００３８】
同様のアプローチを用いて、HPV16 E1、HPV16 E7およびHIV Tatをコードする遺伝子を挿入して、それぞれYP3-E1、YP3-E7およびYP3-Tatを得た。最小L2のカルボキシ末端にTatが挿入されている構築物を、YP3-cTatと命名した。E1では、グリシン482をアスパラギン酸に変化させ、E7では、システイン24およびグルタミン酸26を共にグリシンに変化させてタンパク質機能を不活性化した。ついで、得られた構築物を酵母の形質転換に使用した。
【００３９】
実施例 3
キメラ VLP を発現する酵母の同定および増殖
YP3#1および前記誘導体のプラスミドDNAを使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（MATa, leu2-04, prb::HIS3, mnn9::URA3, cir0）をセフェロプラスト法（Hinnenら, 1978, Proc. Natl. Acad. USA 75:1929-1933）により形質転換した。形質転換されたセフェロプラストを選択（ロイシン-）培地（Remel, Lenexa, KS）上にプレーティングした。2ラウンドの単コロニー選択により、クローンを単離した。候補クローンの小さな液体培養物を、ガラクトース含有培地内で高い細胞密度にまで増殖させた。粗抽出物を、ガラスビーズでの激しい攪拌により調製し、ついで遠心分離した。L1、またはL2、またはL2のアミノもしくはカルボキシ末端、またはL1 VLP、またはE1、またはE2、またはE7、または該修飾L2と融合した他の任意のタンパク質もしくはペプチドを認識するモノクローナル抗体または単特異性ポリクローナル抗血清を使用するSDS PAGE、ELISA、免疫ブロットおよびEIAを含む種々の方法により、該清澄化抽出物をL1、L2成分およびVLPの発現に関して分析した。L2成分を発現しVLPを形成したクローンを、さらなる特徴づけのために選択した。選択したクローンの培養物1リットルまたは16リットルを、キメラVLPの大規模生産のためにガラクトース含有培地内で増殖させた。
【００４０】
実施例 4
HPV 16 型 L1/L2 mini /E2 キメラ VLP の精製
エス・セレビシエ（S. cerivesiae）の発酵物16リットルからの細胞ペレットを-70℃で凍結保存した。凍結細胞に「破砕バッファー（Breaking Buffer）」（200mM MOPS、pH7、1mM CaCl2）を加えて、約20％（w/v）のスラリーを得た。BENZONASE（登録商標）（Nycomed Pharma）を、湿潤細胞重量1g当たり750単位まで加えた。該細胞スラリーを、M110-Y-Microfluidizer（Microfluidics Corp., Newton, MA）に5回付すことにより約19,000psiの圧力で破壊した。該細胞ライセートを、0.65ミクロンの孔径の中空繊維カートリッジに通過させる精密濾過により清澄化し、ついで3容積の0.25Mクエン酸ナトリウム、0.2M MOPS（pH7.0）でのダイアフィルトレーションに付した。透過物を、200mM MOPS、pH7、250mMクエン酸ナトリウムで平衡化されたPOROS（登録商標）50HS樹脂（Perseptive Biosystems, Cambridge, MA）上にローディングした。該カラムを50mM MOPS、0.5M NaCl、5mMリン酸ナトリウム（pH 7）で洗浄し、同じバッファー中の0.5〜1.5M NaClの直線勾配で溶出した。カラム画分を免疫ブロット法およびSDS-PAGE（コロイドクーマシーブルーで検出）により分析した。
【００４１】
該50HSプールを0.22mmフィルターで濾過し、セラミックヒドロキシアパタイト（HA）II型（Bio-Rad）カラムにアプライした。該カラムを50mM MOPS（pH 7）、1.25M NaCl、5mMリン酸ナトリウムで洗浄し、1.25M NaCl中の5〜200mMリン酸ナトリウム（pH 7）の直線勾配で溶出した。ウエスタンブロットおよびSDS-PAGEにより画分を分析した。L1タンパク質の比較しうる純度および含量を示す画分をプールした。それらのプールした画分を0.22mm膜で無菌的に濾過し、電子顕微鏡検査に付した。
【００４２】
実施例 5
電子顕微鏡検査による VLP の検出
透過型電子顕微鏡検査をEMBS（Elkridge, MD）により行った。適切に希釈されたサンプルを300メッシュの炭素被覆銅上に配置し、風乾した。グリッドをリンタングステン酸で染色した。すべての顕微鏡検査を、JEOL 1200 EX透過型顕微鏡を使用して行った。得られた顕微鏡写真は138,000倍の最終倍率を有していた。電子顕微鏡検査は、32nmの平均径を有する無傷VLP粒子の存在を証明した。これらの粒子は、酵母で発現されたL1またはL1 + L2粒子から形態学的に区別できなかった。該VLP内のL2融合体の存在の確認は、加工画分の免疫ブロット分析により示された（実施例6を参照されたい）。
【００４３】
実施例 6
L1 特異的抗 VLP 抗体での L2 融合タンパク質の共免疫沈降
該L2融合体が該VLPの構成成分であることを示すために、VLPをHPV16 L1 VLP特異的モノクローナル抗体（mAb）H16:V5（Wang, Dら, 1997 J. General Virology, 78:2209-2215）により捕捉し、十分に洗浄し、維持された産物を免疫ブロット法により検出した。簡単に説明すると、ヒツジ抗マウスIgG（Dynabeads M-280; Dynal, Oslo）で予めコートされた磁気ビーズを、5％脱脂乾燥乳を含有するTMOPSバッファー（0.05M MOPS、pH7.0、0.4M NaCl、0.1％ Tween-80）で洗浄した。その洗浄されたビーズを、同じ溶液中、H16:V5 mAbと共に4℃で一晩インキュベートした。TMOPSでの洗浄により未結合mAbを除去した。ついでビーズを対照またはVLP含有粗酵母エキス（実施例3を参照されたい）または部分精製VLP調製物（実施例4を参照されたい）と共にインキュベートした。100〜400μgの全タンパク質を含有する抽出物を0.2M MOPS（pH 7.0）、2mM MgCl2で希釈し、ビーズと共に4℃で4時間インキュベートした。ついでビーズをTMOPSで十分に洗浄した。結合タンパク質を、Laemmliサンプルバッファー中で該ビーズを95℃で加熱することにより回収し、SDS-PAGEにより分離し、免疫ブロット法により同定した。
【００４４】
L2融合タンパク質の同定は、該タンパク質のL2部分を認識する抗体、およびL2に融合した関心のあるタンパク質（例えば、E1、E2またはE7）を認識する抗体で行った。対照酵母エキスを含めることに加えて、他の対照として、1）H16:V5と共にインキュベートしていないビーズ、および2）酵母エキスと共にインキュベートしていないビーズを含めた。図3は、H16:V5 Mabにより捕捉され前記のとおりに免疫ブロット法に付され次いで抗E1、抗E7または抗E2抗血清で染色されたVLPの免疫ブロットの結果を示す。複数の単離物に関するそれぞれの場合において、適当な抗体を使用してEタンパク質:L2融合体が検出され、捕捉され精製された（VLP）が、ライセートの不存在下ではそうではなく、また、該検出抗血清とは異なるEタンパク質を含有する精製キメラVLPを使用した場合においてもそうではなかった。
【００４５】
L1 VLPに特異的なモノクローナル抗体を使用するL1と該L2との融合タンパク質の共沈降は、該L2融合タンパク質が該VLPと会合していることを示すものであるとみなされた。
【００４６】
実施例 7
哺乳類細胞内での Tat/ 最小 L2 融合体における Tat 活性の証明
Tat/L2融合体がTat活性を保有することを証明するために、HIV Tat遺伝子をコードするDNAが該翻訳産物中のL2のカルボキシル末端に結合するように最小L2遺伝子の下流に挿入された発現プラスミドを構築した。このDNAカセットをBglIIで消化し、CMVプロモーターに隣接する哺乳類発現ベクターV1Jp（Montgomery, Dら1993 DNA ＆ Cell Biol. 12:777）のBglII部位内に挿入した。オリゴマー：5'-TCC CCC GGG AGA TCT GCC ACC ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA C-3'（プライマーW; 配列番号5）および5'-GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'（プライマーX; 配列番号6）を使用する最小L2（翻訳終結シグナルを欠く）のPCRにより、L2/Tat融合体を作製した。オリゴマー5'-CAG ATG TCT CTT TGG CTG CCA TGG AGC CAG TAG ATC CTA GAC-3'（プライマーY; 配列番号7）および5'-CTC GTA AGA TCT CTA TTC CTT CGG GCC TGT C-3'（プライマーZ; 配列番号8）を使用して、完全なTatオープンリーディングフレームを増幅し、L2に対する配列相補性を導入した。両方のPCR反応からの産物をアガロースゲルで単離し、ついで第2 PCR反応において一緒にした。このPCR反応においては、相補的配列の重複を介してL2/Tat融合体を与えるプライマーWおよびZを加えた。また、これらのプライマーは、BglII部位（この部位は、V1Jp-L2cTatの形成のためのV1Jp内への挿入を促進するよう消化される）を付加した。
【００４７】
リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Gibco BRL, Rockville, MDから入手可能）を該製造業者の推奨に従い使用してP4R5細胞内にV1Jp-L2cTatをトランスフェクトすることにより、L2/Tat融合体の活性を測定した。P4R5細胞は、HIV LTRの制御下でβ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の組込みコピーを含有する。導入されたTat遺伝子が機能的に活性なTatをコードする場合には、発現されたTatはLTRに結合し、β-ガラクトシダーゼの発現をもたらすであろう。トランスフェクションの48時間後の培養物からライセートを調製し、Galactostar（登録商標）試薬（Tropix, Bedford, MS）を使用してβ-ガラクトシダーゼ活性を評価した。結果を図4に要約する。図4は、V1Jp-L2cTatでトランスフェクトされた細胞において、非融合陽性対照pD5-Tatプラスミドでトランスフェクトされた細胞の場合と同様の量（235対175）のβ-ガラクトシダーゼが産生されたことを示している。Tat DNA無しの対照は0.462の値を有していた。したがって、完全なTat活性がL2/Tat融合体内に保有されていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 天然HPV16 L2由来の最小L2 DNA構築物の集合体を示す。
【図２】 HPV 16最小L2遺伝子のアミノ酸の翻訳である。
【図３】 免疫沈降酵母ライセートのウエスタンブロットであり、これは、L2-Eキメラタンパク質とHPV16 L1 VLP特異的Mab H16:V5との共免疫沈降を示している。
【図４】 一過性にトランスフェクトされた細胞ライセートのβ-ガラクトシダーゼ活性の一覧表である。
【配列表】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質を修飾パピローマウイルスL2タンパク質に融合させ該融合タンパク質をウイルス様粒子内で発現させることにより、該タンパク質を細胞に送達する方法に関する。本発明はまた、該タンパク質をコードする修飾遺伝子、該修飾ウイルス様粒子、および該ウイルス様粒子を含有する宿主細胞に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ヒトパピローマウイルス（HPV）は生殖管に感染し、種々の癌および他の疾患に関連づけられている。組換え的に産生したL1タンパク質およびL1 + L2タンパク質は自己集合して、ウイルス様粒子（VLP）を形成しうる。これらのVLPは免疫原性であり、ワクチンの基礎となりうる。
【０００３】
しかし、現在、HPVにより引き起こされる疾患に対する公知の予防ワクチンも、理想的な治療方法も存在しない。VLPの環境中で共送達される他のHPVタンパク質、例えばHPV初期タンパク質または遺伝子に対する免疫応答は、ワクチンの防御効果を増強しうる。完全長L2とHPV E2またはE7との融合タンパク質を産生するようL2タンパク質が修飾されているVLPが、最近、Greenstoneらの文献において報告された（Greenstoneら, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805）。該融合タンパク質はL1と共集合してVLPとなり、これは、形態学的にも中和抗体惹起能力においてもL1 VLPから区別できないようであった。さらに、腫瘍攻撃モデルにおいて、キメラL1 + L2:E7融合体VLPでワクチン接種されたマウスはE7発現腫瘍からマウスを防御することが判明した。
【０００４】
しかしながら、融合相手として完全長L2を使用することには、いくつかの潜在的な問題を伴う。第1に、サイズ上の制限のため、融合相手としての全L2は、大きな融合タンパク質を受容する限られた能力しか有していない。例えば、CRPVの無傷L2とE1との融合は、形態学的に異常なVLPを与える。さらに、完全長L2の発現は、十中八九、酵素的に活性なタンパク質の活性に影響を及ぼし、したがって、機能的タンパク質を細胞内に送達するその有用性を制限するであろう。L1と共集合してVLPを与えうるL2の最小配列要件は不明であり、L1と集合する能力を保有させたままでL2の有意な部分を欠失させることが可能なのかに関しても明らかでない。
【０００５】
完全長L2のタンパク質送達機能を依然として保持すると同時に、より大きく機能的に活性なタンパク質を送達しうる、最小L2融合タンパク質を提供することが望ましいであろう。
【０００６】
（発明の記載）
本発明は、ペプチドまたはタンパク質を細胞に送達する方法であって、a）送達するペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を、修飾されたパピローマウイルス（PV）L2遺伝子に融合させて、融合タンパク質遺伝子を得（該L2遺伝子は、完全長より小さく、少なくとも、L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）のコード配列を含む）、b）該融合タンパク質遺伝子を宿主細胞内で発現させて、融合タンパク質を得、c）該融合タンパク質とPV L1タンパク質とを、該融合タンパク質および該L1タンパク質が自発的に合体してウイルス様粒子（VLP）を形成する条件下で接触させ、d）該VLPを細胞に送達する工程を含んでなる方法に関する。
【０００７】
本発明はまた、関心のあるペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子に融合した、完全長未満のL2タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸、およびこれらの融合タンパク質に関する。特に、本発明は、L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸を少なくとも含み完全長未満のL2を含むL2融合タンパク質に関する。また、本発明は、該融合タンパク質を含有するウイルス様粒子（VLP）、およびこれらのVLPを含有する細胞宿主に関する。
【０００８】
（図面の簡単な説明）
図1は、天然HPV16 L2由来の最小L2 DNA構築物の集合体を示す。小文字のイタリック体で示されているHPV16 L2のコード配列を、PCR増幅用の鋳型として使用した。開始コドンおよび終結コドンは大文字で示されている。センスプライマーIおよびAは該鋳型の上に示されており、アンチセンスプライマーCおよびDは該鋳型の下に示されている。PCR増幅により導入された新たな配列情報が大文字で示されている。プライマーAおよびC中の相補的配列には下線が付されている。
【０００９】
図2は、HPV 16最小L2遺伝子のアミノ酸の翻訳である。唯一の制限部位NotI、SacIおよびXhoIを含有するポリリンカーの導入により生じたアミノ酸変化が、イタリック体で示されている。アミノ酸1〜69は、L2のアミノ末端から与えられたものである。グルタミン酸残基が70位に付加されている。アミノ酸71〜154は、L2のカルボキシル末端から与えられたものである。72位においては、完全長野生型L2中に存在するセリンがグルタミン酸残基で置換されている。
【００１０】
図3は、免疫沈降酵母ライセートのウエスタンブロットであり、これは、L2-Eキメラタンパク質とHPV16 L1 VLP特異的Mab H16:V5との共免疫沈降を示している。左パネルは、最小L2:E1融合体（mL2:E1）クローンE1-121〜E1-124の抗E1染色免疫ブロットを示し、mL2:E2サンプルE2-23およびライセート無しのサンプルは特異性対照である。中央パネルは、最小L2:E7融合体（mL2:E7）クローンE7-125〜E7-127およびE7-31の抗E7染色免疫ブロットを示し、mL2:E2サンプルE2-23およびライセート無しのサンプルは特異的対照である。右パネルは、mL2:E2融合体クローンE2-33a、E2-33bの抗E2染色免疫ブロットを示し、また、サンプルE2-33b（H16:V5捕捉抗体無し）が対照として示されており、YP3#1（Eタンパク質無し）対照がmL2ベクターとして示されている。
【００１１】
図4は、一過性にトランスフェクトされた細胞ライセートのβ-ガラクトシダーゼ活性の一覧表である。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
本発明の方法は、実質的に任意のパピローマウイルス株に関して用いることができる。好ましい実施形態においては、該HPVは、性器いぼ及び／又は性器癌に関連した株の1つであり、特に、HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52およびHPV56よりなる群から選ばれうる。
【００１３】
野生型ウイルス様粒子は、少量のL2タンパク質を含有するものの、主としてL1タンパク質から構成される。本発明においては、該VLPは、野生型L1タンパク質を尚も含有するが野生型L2ではなく欠失L2融合タンパク質を含有するように修飾されている。該融合タンパク質のL2セグメントは、完全長L2タンパク質より実質的に小さく、それは、L1タンパク質との会合およびVLP内への取込みに必要なアミノ末端由来およびカルボキシル末端由来のペプチドドメイン [HPV 16型の場合には、少なくとも、L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）のコード配列] を含有する。該L2配列は、野生型より小さい限り、これより大きくてもよい。好ましくは、存在するL2アミノ酸の全量は、野生型の約60％未満、より好ましくは、野生型の約50％未満であり、より一層好ましくは、野生型の約35％未満である。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、この修飾L2を「最小L2」遺伝子およびタンパク質と称することにする。
【００１４】
実質的に任意のタンパク質またはペプチドを最小L2タンパク質に融合させて、該融合タンパク質を得ることができる。目的が、野生型VLPと比較して増強した免疫応答を誘導するVLPを得ることにある場合には、通常はVLPの一部でないHPVタンパク質が好ましい。この適用の場合、これらのタンパク質には、HPV: E1、E2、E3、E4、E5、E6および／またはE7、HIV TATおよび／またはβ-ラクタマーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいタンパク質としては、E1、E2およびE7が挙げられる。これらの融合タンパク質、およびそれらをコードする核酸は、本発明のもう1つの態様を構成する。
【００１５】
本発明の利点の1つは、融合相手が大きなタンパク質であってもよいことである。例えば、融合相手は、50kD以上、60kD以上、さらには70kD以上であってもよい。この増加したサイズは、ほとんどの公知タンパク質の導入を可能にし、この送達系を、前記のHPV関連タンパク質に関してだけではなく、HPV疾患の治療に関連しないタンパク質に関しても特に有用なものにする。
【００１６】
したがって、本発明は、実質的に任意の所望のタンパク質またはペプチドを細胞内に送達するように導く、汎用輸送体としての修飾VLPの使用方法を含む。1つの実施形態においては、細胞によるVLPの取込みの尺度として、レポーターまたは調節タンパク質を細胞に送達する。融合候補体の一例としては、TATとして公知のHIV調節タンパク質が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。最小L2とTATとの融合体はタンパク質機能を保有し、L1と共にVLPを形成することが示されている。これは、中和アッセイの確立において有用である。
【００１７】
該融合タンパク質およびL1タンパク質は、それらの2つの遺伝子の発現を可能にする条件下、選択した宿主細胞を該タンパク質コード化遺伝子で形質転換することにより、同時に産生させることができる。一般的な技術、L1およびL2の遺伝子、ならびにL1およびL2タンパク質を発現する組換え発現のための方法は、当技術分野において公知であり、使用可能である。好ましい宿主細胞には、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞および大腸菌（E. coli）が含まれる。
【００１８】
本発明の1つの好ましい実施形態においては、公知酵母プロモーター（例えば、酵母Gal 1およびGal 10プロモーター）の制御下でL1およびL2融合体をコードする遺伝子を含有するプラスミドDNAで酵母を形質転換する。増殖培地にガラクトースを加えることにより各遺伝子産物の発現を誘導し、該誘導細胞ライセートからVLPを単離する。
【００１９】
別法として、L1タンパク質のみを発現させるために1組の宿主細胞を形質転換し、本発明のL2融合タンパク質を発現させるためにもう1組の宿主細胞を形質転換することができる。それぞれのタンパク質を集め、所望により精製工程に付し、該融合タンパク質を含有するVLPが形成されるように接触させる。
【００２０】
該修飾VLPは、本発明の更にもう1つの態様を構成する。これらのVLPは、ワクチンとして又は治療法の一部として投与することができる。本発明の治療用または診断用組成物は、PV感染症を治療または診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢などの種々の要因に応じて様々となりうる。他の要因には投与方法が含まれる。一般に、該組成物は、約1mcg〜約1mgの投与量で投与されるであろう。
【００２１】
該医薬組成物は、種々の経路（例えば、皮下、局所、経口、粘膜、静脈内および筋肉内）により個体に投与することができる。
【００２２】
本発明のワクチンは、DNA、RNA、またはL2のアミノ末端およびカルボキシル末端部分（それに融合したタンパク質がVLP内に取込まれるのを可能にするもの）を含有する該DNAにコードされるタンパク質を含む。また、そのようなワクチンは、臨床的な感染の危険性を伴わずに投与するのに十分な程度に安全であり、毒性の副作用を有さず、有効な経路により投与可能であり、安定であり、ワクチン担体に適合性である。
【００２３】
該ワクチンは、種々の経路（例えば、経口、非経口、皮下、粘膜、静脈内または筋肉内）により投与することができる。投与量は、個体の状態、性別、体重および年齢；投与経路；ならびに該ワクチンのPVの型に応じて様々となりうる。該ワクチンは、カプセル剤、懸濁剤、エリキシル剤、液剤などの剤形として使用することができる。該ワクチンは、免疫学的に許容される担体またはアジュバントまたは他の賦形剤で製剤化することができる。
【００２４】
該ワクチンは、治療的に有効な量（すなわち、免疫学的な防御応答をもたらすのに十分な量）で投与する。その治療的に有効な量は、PVの型に応じて様々となりうる。該ワクチンは、単回または複数回で投与することができる。
【００２５】
本発明の精製タンパク質は、免疫原性組成物の製剤中で使用することができる。そのような組成物は、適当な宿主内に導入されると、該宿主内で免疫応答を誘導しうる。
【００２６】
以下に記載の非限定的な実施例は、本発明を更に例示するものである。
【００２７】
実施例 1
修飾 L2 遺伝子の構築
唯一のNotI、SacIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し1つのグルタミン酸残基の挿入とセリンからグルタミン酸へ突然変異とをもたらす合成ポリリンカーによりインフレームで融合したHPV16 L2のアミノ末端の69アミノ酸およびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）のコード配列から、修飾HPV16 L2遺伝子を構築した（図1）。
【００２８】
HPV16 L1 + L2をコードする遺伝子が挿入されたベクターpGal110（Hofmann, Kら1995 Virology 209:506-518）内に含まれる天然L2遺伝子からL2配列を増幅するようなPCRプライマー（Midland Certified Reagents; Midland, TX）を設計した（図1を参照されたい）。
【００２９】
プライマーI（5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; 配列番号1）およびC（5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; 配列番号2）は、アミノ末端の69アミノ酸および23bpの上流非翻訳配列（SmaI制限酵素部位を含む）をコードする265塩基対（bp）の配列を増幅した。プライマーCは、L2アミノ末端コード領域と、該L2コード配列の下流の追加的なNotI、SacIおよびXhoI制限酵素部位とを修飾し伸長した。
【００３０】
プライマーA（5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; 配列番号3）、CおよびD（5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; 配列番号4）は、L2のカルボキシ末端の84アミノ酸をコードする285bpの配列と、BglII制限酵素部位を付加する6bpとを増幅した。また、プライマーAは、L2コード配列の上流のNotI、SacIおよびXhoI部位を含有する17bpの配列を付加した。
【００３１】
最小L2発現構築物を、プライマーAおよびCにより付加された相補的配列を介して集合させた。前記のI/CおよびA/D増幅反応の単離されたDNA産物を共に、IおよびDプライマーを用いるPCR反応において使用した。それらの断片がそれらの17bpの相補的配列を介して結合するのを促進するために、3サイクルのPCRを37℃のアニーリング温度で行い、ついで15サイクルのPCRを57℃の温度で行った。得られた増幅産物を平滑末端化し、pcrScript（Stratagene, LaJolla、 CA）内に連結し、XL-1 Blue MRF'細胞（Stratagene）内に形質転換した。陽性クローンを、プライマーIおよびDを使用するPCRにより同定し、制限消化分析により確認した。ついで該構築物を自動配列分析（Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA）により確認した。
【００３２】
ついで適当な単離物からのプラスミドDNAをSmaIおよびBalIIで消化した。約0.5キロベースペア（kb）の断片をゲル精製し、GAL1プロモーターの隣にHPV16L1遺伝子が挿入されているpGAL110の14kb SmaI-BalIIベクター断片に連結した。コンピテントDH5大腸菌（E. coli）細胞（Gibco BRL, Rockville, MD）を該連結混合物で形質転換し、形質転換体をLBアンピシリンプレート（Remel, Lenexa, KS）上で選択した。L2の部分を増幅するためにプライマーDおよびIを使用するPCRにより、クローンを初期スクリーニングした。候補クローンYP3#1の配列決定は、該配列が図2に示すとおりの配列であることを証明した。
【００３３】
ついで、HPV16 E1、E2、E7またはTatオープンリーディングフレームをコードする遺伝子が挿入されたバックボーン構築物として、YP3#1を使用した。
【００３４】
実施例 2
HPV E タンパク質および Tat をコードする遺伝子の挿入
HPV 16 E2をコードする遺伝子をHPV16陽性臨床サンプルのPCR増幅により得、ついでそれをサブクローニングベクターpCRII（Stratagene）内に直接挿入し、前記のとおりに配列を確認した。ついでE2遺伝子配列を、以下のとおりに修飾した。
【００３５】
1）インフレームXhoI、NaeI、NotI含有DNA配列をE2のアミノ末端部分に付加した。また、NotI、NaeIおよびXhoI含有配列をE2のカルボキシル末端部分に付加して、E2内のNotI、XhoI部位への挿入を容易にした。
【００３６】
2）グルタミン酸39およびイソロイシン73の残基がアラニン残基をコードするよう、該DNA配列をPCR突然変異誘発により改変した。これは、E2タンパク質の機能を不活性化するように設計された。
【００３７】
前記の修飾HPV16 E2遺伝子をNotI、XhoIで消化し、同様に消化されたYP3#1ベクターに連結した。適切に挿入されたE2配列を含有する形質転換体をPCRにより選択し、配列を確認し、YP3-E2と命名した。
【００３８】
同様のアプローチを用いて、HPV16 E1、HPV16 E7およびHIV Tatをコードする遺伝子を挿入して、それぞれYP3-E1、YP3-E7およびYP3-Tatを得た。最小L2のカルボキシ末端にTatが挿入されている構築物を、YP3-cTatと命名した。E1では、グリシン482をアスパラギン酸に変化させ、E7では、システイン24およびグルタミン酸26を共にグリシンに変化させてタンパク質機能を不活性化した。ついで、得られた構築物を酵母の形質転換に使用した。
【００３９】
実施例 3
キメラ VLP を発現する酵母の同定および増殖
YP3#1および前記誘導体のプラスミドDNAを使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（MATa, leu2-04, prb::HIS3, mnn9::URA3, cir0）をセフェロプラスト法（Hinnenら, 1978, Proc. Natl. Acad. USA 75:1929-1933）により形質転換した。形質転換されたセフェロプラストを選択（ロイシン-）培地（Remel, Lenexa, KS）上にプレーティングした。2ラウンドの単コロニー選択により、クローンを単離した。候補クローンの小さな液体培養物を、ガラクトース含有培地内で高い細胞密度にまで増殖させた。粗抽出物を、ガラスビーズでの激しい攪拌により調製し、ついで遠心分離した。L1、またはL2、またはL2のアミノもしくはカルボキシ末端、またはL1 VLP、またはE1、またはE2、またはE7、または該修飾L2と融合した他の任意のタンパク質もしくはペプチドを認識するモノクローナル抗体または単特異性ポリクローナル抗血清を使用するSDS PAGE、ELISA、免疫ブロットおよびEIAを含む種々の方法により、該清澄化抽出物をL1、L2成分およびVLPの発現に関して分析した。L2成分を発現しVLPを形成したクローンを、さらなる特徴づけのために選択した。選択したクローンの培養物1リットルまたは16リットルを、キメラVLPの大規模生産のためにガラクトース含有培地内で増殖させた。
【００４０】
実施例 4
HPV 16 型 L1/L2 mini /E2 キメラ VLP の精製
エス・セレビシエ（S. cerivesiae）の発酵物16リットルからの細胞ペレットを-70℃で凍結保存した。凍結細胞に「破砕バッファー（Breaking Buffer）」（200mM MOPS、pH7、1mM CaCl2）を加えて、約20％（w/v）のスラリーを得た。BENZONASE（登録商標）（Nycomed Pharma）を、湿潤細胞重量1g当たり750単位まで加えた。該細胞スラリーを、M110-Y-Microfluidizer（Microfluidics Corp., Newton, MA）に5回付すことにより約19,000psiの圧力で破壊した。該細胞ライセートを、0.65ミクロンの孔径の中空繊維カートリッジに通過させる精密濾過により清澄化し、ついで3容積の0.25Mクエン酸ナトリウム、0.2M MOPS（pH7.0）でのダイアフィルトレーションに付した。透過物を、200mM MOPS、pH7、250mMクエン酸ナトリウムで平衡化されたPOROS（登録商標）50HS樹脂（Perseptive Biosystems, Cambridge, MA）上にローディングした。該カラムを50mM MOPS、0.5M NaCl、5mMリン酸ナトリウム（pH 7）で洗浄し、同じバッファー中の0.5〜1.5M NaClの直線勾配で溶出した。カラム画分を免疫ブロット法およびSDS-PAGE（コロイドクーマシーブルーで検出）により分析した。
【００４１】
該50HSプールを0.22mmフィルターで濾過し、セラミックヒドロキシアパタイト（HA）II型（Bio-Rad）カラムにアプライした。該カラムを50mM MOPS（pH 7）、1.25M NaCl、5mMリン酸ナトリウムで洗浄し、1.25M NaCl中の5〜200mMリン酸ナトリウム（pH 7）の直線勾配で溶出した。ウエスタンブロットおよびSDS-PAGEにより画分を分析した。L1タンパク質の比較しうる純度および含量を示す画分をプールした。それらのプールした画分を0.22mm膜で無菌的に濾過し、電子顕微鏡検査に付した。
【００４２】
実施例 5
電子顕微鏡検査による VLP の検出
透過型電子顕微鏡検査をEMBS（Elkridge, MD）により行った。適切に希釈されたサンプルを300メッシュの炭素被覆銅上に配置し、風乾した。グリッドをリンタングステン酸で染色した。すべての顕微鏡検査を、JEOL 1200 EX透過型顕微鏡を使用して行った。得られた顕微鏡写真は138,000倍の最終倍率を有していた。電子顕微鏡検査は、32nmの平均径を有する無傷VLP粒子の存在を証明した。これらの粒子は、酵母で発現されたL1またはL1 + L2粒子から形態学的に区別できなかった。該VLP内のL2融合体の存在の確認は、加工画分の免疫ブロット分析により示された（実施例6を参照されたい）。
【００４３】
実施例 6
L1 特異的抗 VLP 抗体での L2 融合タンパク質の共免疫沈降
該L2融合体が該VLPの構成成分であることを示すために、VLPをHPV16 L1 VLP特異的モノクローナル抗体（mAb）H16:V5（Wang, Dら, 1997 J. General Virology, 78:2209-2215）により捕捉し、十分に洗浄し、維持された産物を免疫ブロット法により検出した。簡単に説明すると、ヒツジ抗マウスIgG（Dynabeads M-280; Dynal, Oslo）で予めコートされた磁気ビーズを、5％脱脂乾燥乳を含有するTMOPSバッファー（0.05M MOPS、pH7.0、0.4M NaCl、0.1％ Tween-80）で洗浄した。その洗浄されたビーズを、同じ溶液中、H16:V5 mAbと共に4℃で一晩インキュベートした。TMOPSでの洗浄により未結合mAbを除去した。ついでビーズを対照またはVLP含有粗酵母エキス（実施例3を参照されたい）または部分精製VLP調製物（実施例4を参照されたい）と共にインキュベートした。100〜400μgの全タンパク質を含有する抽出物を0.2M MOPS（pH 7.0）、2mM MgCl2で希釈し、ビーズと共に4℃で4時間インキュベートした。ついでビーズをTMOPSで十分に洗浄した。結合タンパク質を、Laemmliサンプルバッファー中で該ビーズを95℃で加熱することにより回収し、SDS-PAGEにより分離し、免疫ブロット法により同定した。
【００４４】
L2融合タンパク質の同定は、該タンパク質のL2部分を認識する抗体、およびL2に融合した関心のあるタンパク質（例えば、E1、E2またはE7）を認識する抗体で行った。対照酵母エキスを含めることに加えて、他の対照として、1）H16:V5と共にインキュベートしていないビーズ、および2）酵母エキスと共にインキュベートしていないビーズを含めた。図3は、H16:V5 Mabにより捕捉され前記のとおりに免疫ブロット法に付され次いで抗E1、抗E7または抗E2抗血清で染色されたVLPの免疫ブロットの結果を示す。複数の単離物に関するそれぞれの場合において、適当な抗体を使用してEタンパク質:L2融合体が検出され、捕捉され精製された（VLP）が、ライセートの不存在下ではそうではなく、また、該検出抗血清とは異なるEタンパク質を含有する精製キメラVLPを使用した場合においてもそうではなかった。
【００４５】
L1 VLPに特異的なモノクローナル抗体を使用するL1と該L2との融合タンパク質の共沈降は、該L2融合タンパク質が該VLPと会合していることを示すものであるとみなされた。
【００４６】
実施例 7
哺乳類細胞内での Tat/ 最小 L2 融合体における Tat 活性の証明
Tat/L2融合体がTat活性を保有することを証明するために、HIV Tat遺伝子をコードするDNAが該翻訳産物中のL2のカルボキシル末端に結合するように最小L2遺伝子の下流に挿入された発現プラスミドを構築した。このDNAカセットをBglIIで消化し、CMVプロモーターに隣接する哺乳類発現ベクターV1Jp（Montgomery, Dら1993 DNA ＆ Cell Biol. 12:777）のBglII部位内に挿入した。オリゴマー：5'-TCC CCC GGG AGA TCT GCC ACC ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA C-3'（プライマーW; 配列番号5）および5'-GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'（プライマーX; 配列番号6）を使用する最小L2（翻訳終結シグナルを欠く）のPCRにより、L2/Tat融合体を作製した。オリゴマー5'-CAG ATG TCT CTT TGG CTG CCA TGG AGC CAG TAG ATC CTA GAC-3'（プライマーY; 配列番号7）および5'-CTC GTA AGA TCT CTA TTC CTT CGG GCC TGT C-3'（プライマーZ; 配列番号8）を使用して、完全なTatオープンリーディングフレームを増幅し、L2に対する配列相補性を導入した。両方のPCR反応からの産物をアガロースゲルで単離し、ついで第2 PCR反応において一緒にした。このPCR反応においては、相補的配列の重複を介してL2/Tat融合体を与えるプライマーWおよびZを加えた。また、これらのプライマーは、BglII部位（この部位は、V1Jp-L2cTatの形成のためのV1Jp内への挿入を促進するよう消化される）を付加した。
【００４７】
リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Gibco BRL, Rockville, MDから入手可能）を該製造業者の推奨に従い使用してP4R5細胞内にV1Jp-L2cTatをトランスフェクトすることにより、L2/Tat融合体の活性を測定した。P4R5細胞は、HIV LTRの制御下でβ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の組込みコピーを含有する。導入されたTat遺伝子が機能的に活性なTatをコードする場合には、発現されたTatはLTRに結合し、β-ガラクトシダーゼの発現をもたらすであろう。トランスフェクションの48時間後の培養物からライセートを調製し、Galactostar（登録商標）試薬（Tropix, Bedford, MS）を使用してβ-ガラクトシダーゼ活性を評価した。結果を図4に要約する。図4は、V1Jp-L2cTatでトランスフェクトされた細胞において、非融合陽性対照pD5-Tatプラスミドでトランスフェクトされた細胞の場合と同様の量（235対175）のβ-ガラクトシダーゼが産生されたことを示している。Tat DNA無しの対照は0.462の値を有していた。したがって、完全なTat活性がL2/Tat融合体内に保有されていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 天然HPV16 L2由来の最小L2 DNA構築物の集合体を示す。
【図２】 HPV 16最小L2遺伝子のアミノ酸の翻訳である。
【図３】 免疫沈降酵母ライセートのウエスタンブロットであり、これは、L2-Eキメラタンパク質とHPV16 L1 VLP特異的Mab H16:V5との共免疫沈降を示している。
【図４】 一過性にトランスフェクトされた細胞ライセートのβ-ガラクトシダーゼ活性の一覧表である。
【配列表】
Claims (10)
- ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ペプチドまたはタンパク質を細胞に送達する方法であって、
ａ）該ペプチドまたはタンパク質をコードする第１核酸を、修飾されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ２をコードする第２核酸に融合させて、融合タンパク質遺伝子を得（該融合タンパク質遺伝子のＬ２部分は、完全長のＬ２遺伝子より小さく、少なくともアミノ末端の６９アミノ酸およびカルボキシ末端の８４アミノ酸をコードする配列を含むが、野生型Ｌ２タンパク質の５０％未満をコードする）、
ｂ）該融合タンパク質遺伝子を宿主細胞内で発現させて、融合タンパク質を得、
ｃ）該融合タンパク質とＨＰＶ Ｌ１タンパク質とを、該融合タンパク質および該Ｌ１タンパク質が自発的に合体してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する条件下で接触させ、及び
ｄ）該ＶＬＰを該細胞に送達することを含んでなる方法。 - 該ＨＰＶが、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５６よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
- 送達するペプチドまたはタンパク質が、ＨＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ３、ＨＰＶ Ｅ４、ＨＰＶ Ｅ５、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＨＩＶ Ｔａｔおよびβ−ラクタマーゼよりなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
- 完全長配列より小さいＨＰＶ Ｌ２タンパク質の部分をコードする核酸を含み、少なくともアミノ末端の６９アミノ酸およびカルボキシ末端の８４アミノ酸をコードする配列を含むが、野生型Ｌ２タンパク質の５０％未満をコードする核酸を含む第１セグメントとペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含む第２セグメントを含んでなる、融合ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸。
- 該第１セグメントが、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５６よりなる群から選ばれるＨＰＶに由来する、請求項４に記載の核酸。
- 該第２セグメントが、ＨＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ３、ＨＰＶ Ｅ４、ＨＰＶ Ｅ５、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＨＩＶ Ｔａｔおよびβ−ラクタマーゼよりなる群から選ばれるタンパク質をコードする、請求項５に記載の核酸。
- ＨＰＶ Ｌ１タンパク質と融合タンパク質とを含んでなるＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、該融合タンパク質が、
野生型の５０％未満であって、少なくともアミノ末端の６９アミノ酸およびカルボキシ末端の８４アミノ酸を含むＨＰＶ Ｌ２タンパク質である第１タンパク質、および
第２のタンパク質またはペプチドを含むことを特徴とするＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）。 - 該ＨＰＶが、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５６よりなる群から選ばれる、請求項７に記載のＶＬＰ。
- 請求項７に記載のＶＬＰを含んでなる宿主細胞。
- 請求項８に記載のＶＬＰをコードする核酸。
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